本发明涉及一种利用激光控制对物质分类的系统和方法，尤其是利 用全息光学捕获的系统和方法。
在符合本发明的一个实施例中，使用光学捕获，其是已经用作为控 制微观对象的工具的技术。一个可接收的效果描述是，轻微聚焦光线， 例如由高数值孔径显微透镜聚焦的光线，具有陡的强度梯度。根据其介 电常数，光学陷阱使用光束的梯度强度来捕获粒子。为了最小化其能量， 具有大于周围介质介电常数的粒子将移动到电场为最高的光学陷阱的区 域。
本发明的光学捕获被使用以几种方法解决细胞分类和提纯。例如， 在物质上由光学陷阱所施加的力，对在物质中介电常数的精确分布是敏 感的——光学强度因此依赖于对象的组成和形状。
而且，对象上的其它力对对象与周围流体之间的流体动力交互作用 是敏感的——控制流体流探测物质形状、大小以及例如表面粗糙度的特 征。
进一步地，将对象定位在已知位置允许自动问询的附加方法，例如 高速成像以及粒子专用散射测量。
在符合本发明的一个实施例中，在实现多陷阱的系统过程中，衍射 光学元件(DOE，即，使用透射或反射几何学的相位偏移全息图)用于 改变单独激光束波阵面。该波阵面被改变，从而下游的激光束实际上变 成了大量独立的激光束，这些激光束具有由该衍射光学元件的精确性质 固定的传播方向和相对位置。
本发明通过用一透镜聚焦激光束提供光学捕获，以创建光学陷阱， 其中透镜具有小于0.9的数值孔径，并且最好减小至小于0.1。
利用全息激光控制的分类包括建立将被分类的对象的身份类别，将 被分类的对象引入一个分类区域，并且根据其身份类别，以受控激光束 来控制对象。该控制可能是以基于其身份类别而不同的方式保持，移动， 旋转，标记或毁坏对象。因此，本发明提供一种利用全息光学捕获进行 细胞分类的并行方案。
在本发明的一个实施例中，生物物质样本的光谱可以由成像照明源 完成，该成像照明源适用于不弯曲的光谱或者偏振光线背发散，前者适 用于评定化学身份，而后者适用于测量内部结构的尺寸，例如细胞核的 大小。利用这样的光谱学方法，在一些实施例中，细胞被询问。这些具 有肯定结果的细胞(即，这些与标记反应或者结合的这些细胞)的频谱 可以通过使用这样的成像照明而获得。
计算机程序可以分析光谱数据，以识别期望的目标(即，具有X或 Y染色体的细胞，或者疑似癌症，癌症前期和/或非癌症细胞类型，等等)， 然后可以应用该信息以引导相位构图光学元件(即，光学陷阱)以分离 或者包含这些期望或者选择的目标(即，细胞类型)。所包含的细胞可以 根据与化学品反应或结合而被识别，或者通过使用对象的自然荧光，或 者与对象相关联的衬底的荧光，作为识别标记或者背景标记而被识别。 当化验完成时，将通过计算机和/或操作者选择哪些细胞被放弃以及哪些 细胞被收集。
通常通过使多条光束可用，来使细胞的控制更安全。类似钉床，多 个镊子保证在细胞中任何特定点引入尽量少的能量。这消除了热点，并 减少了破坏的危险。由于吸收与激光能量的平方成比例，任何破坏性的 双光子处理有很大好处。正是增加第二镊子将特定点的双光子吸收降低 了4倍。大的细胞例如四膜虫包括大量激光能量用于有效捕获。将能量 置入单独陷阱可以导致细胞立即毁坏。
通过例如使用全息光学捕获，甚至仅一个单独的细胞的控制明显增 强。一个单独的颊上皮细胞可以由一行镊子控制，该行镊子将细胞沿着 一侧面的周边升高。该导致的旋转允许360度的细胞视图。除了生物样 本可视的优点之外，也具有能力稳定定向样本的能力，其具有对研究这 样的对样本定位有强依靠的散射实验清楚的好处。
具有宽视野的分类具有许多好处，例如较高的产量。但是，在WFOV 中的标准镊取由于过多的辐射压力而可能失败。使用全息光学捕获的具 有宽视野的镊取可以允许形成光线的异常模式的能力，其明显地减小光 束的辐射压力。例如，漩涡捕获具有黑的中心，因为光线的不同相位在 陷阱的中心取消。该黑的中心表示穿过光束中心的大部分光线不再存在。 实际上这些隐藏了光的大部分辐射压力的光束，因此它们的去除明显地 减轻在轴向捕获的难度。其它模式，例如，圆环圈模式，具有相同的优 点。
在符合本发明的一个实施例中，方法和系统导致其本身半自动或自 动处理，用于跟踪每一个光学陷阱的移动和内容。在符合本发明的一个 实施例中，移动可以通过能够被看到的光学数据流来监视，或者转换成 视频信号，或者通过操作者可视化检查光谱地，和/或通过视频监视而被 监视或分析。该光学数据流也可以由光检测器进行处理以监视强度或者 任何合适的设备处理，以将光学数据流转换为适应于计算机和程序的数 字数据流。该计算机程序控制细胞的选择以及光学陷阱的产生。
在符合本发明的另一个实施例中，根据通过对相位构图光学元件编 码而导致的每一个光学陷阱预定的移动来跟踪细胞的移动。此外，在一 些实施例中，计算机程序包括包含在每一个光学陷阱中每一个细胞的记 录。
在符合本发明的一个实施例中，执行用于动物饲养的X和Y精子 的细胞分类。
在肉牛工业中，将后代的雄/雌比率从当前的50％∶50％混合比改变 到85％∶15％混合比的能力，将显著地增加每年的后代数量。类似地， 在乳品业上也会出现数量的增加，尽管相对较小些。
在符合本发明的一个实施例中，对象分类的方法包括有步骤：以预 定的流率将对象引入输入通道；利用光束控制装置汇集(funnel)对象； 评价对象以确定哪些符合预定标准；以及将不符合所述标准的对象和符 合所述标准的对象进行分类。
在符合本发明的另一个实施例中，对象分类的方法包括有步骤：在 一结构的表面上分配对象；以及根据预定的标准，利用光束控制装置， 评价所述结构中的对象。
在符合本发明的又一个实施例中，对象分类的方法包括有步骤：在 胶体中分布对象；检测符合预定的标准的对象；以及将符合所述标准的 对象和不符合所述标准的对象进行分类。
在符合本发明的又一个实施例中，用于分类对象的装置包括利用光 学捕获装置形成的多个光学陷阱；一个输入通道，对象以预定的流率被 引入其中；以及至少一个输出通道；其中在进入所述输出通道之前，根 据预定的标准，使用所述光学陷阱，在分类区域分类对象。
在符合本发明的又一个实施例中，用于分类对象的装置包括一个光 束控制装置；以及具有其上面分布了对象的一表面的结构；其中根据对 象是否符合预定标准对象利用光束控制装置分类对象。
在符合本发明的又一个实施例中，用于分类对象的装置包括以预定 的流体速率将对象引导进入输入通道的装置；用于汇集对象的装置；用 于评价对象以判断哪些对象符合预定标准的装置；以及用于对符合所述 标准的对象和不符合所述标准的对象进行分类的装置。
在符合本发明的又一个实施例中，用于分类对象的装置包括一个用 于在一结构表面分布对象的装置；以及根据预定的标准，使用光束控制 装置评价在所述的结构中的对象的装置。
在符合本发明的又一个实施例中，用于分类对象的装置包括一个用 于在胶体中分布对象的装置；用于检测符合预定标准的对象的装置；以 及用于将符合所述标准的对象和不符合标准的对象进行分类的装置。
在符合本发明的又一个实施例中，分类对象的方法包括有步骤：利 用光学陷阱访问对象的步骤；检查所述对象以确定其身份；以及根据预 定的标准将所述确定身份的对象分类。
在符合本发明的又一个实施例中，用于分类对象的装置包括用于利 用光学陷阱访问对象的装置；用于检查所述对象以确定其身份的装置； 以及用于根据预定标准将所述确定身份的对象分类的装置。
在符合本发明的又一个实施例中，用于分类对象的装置包括光束控 制装置，其包括：激光器，其提供用于照明的激光束；衍射光学元件， 其将所述光束衍射为多条细光束；以及物镜，其会聚这些细光束，因此 产生导致光学数据流以形成光学陷阱的光学梯度条件；以及样本腔，对 象被引入其中，捕获以及分类。
在符合本发明的又一个实施例中，控制对象的方法包括将对象引入 一个评价系统；利用光束控制装置，根据预定标准评价对象；以及根据 所述预定标准，利用所述光束控制装置控制对象。
在符合本发明的又一个实施例中，破坏对象的方法包括利用光束控 制装置访问对象；检查所述对象以确定其身份；根据预定标准将所述确 定身份的对象分类，以及当所述对象符合所述预定标准时，破坏所述确 定身份的对象。
最后，在符合本发明的又一个实施例中，用于破坏对象的装置包括 用于利用光束控制装置访问对象的装置；用于检查所述对象以确定其身 份的装置；用于根据预定标准将所述确定身份的对象分类的装置；以及 用于当所述对象符合所述预定标准时，破坏所述确定身份的对象的装置。
上面已经进宽泛地概述了一些符合本发明的特征，以使更好地理解 下面的详细描述，及更好地认识对现有技术的贡献。当然，下面将详细 描述的符合本发明的附加特征，并且将形成这里要求保护的主题。
出于此，在详细说明符合本发明的至少一个实施例之前，应当理解 本发明不限于在下面的描述或附图说明中应用的详细结构，以及组件的 设置。符合本发明的方法和装置适合其它实施例，并且可以通过不同的 方式实践和执行。同时，应当理解，这里所使用的措辞和术语，以及下 面所包括的摘要，是为描述发明的目的而不能认为是限制。
这样，熟知本技术的人员将认识到，发明所公开的概念可以容易地 用作其它用于执行本发明几个目的的结构、方法和系统的设计的基础。 因此，重要的是权利要求被认为包括这样的等价物结构，它们由不脱离 本发明的精神实质和范围的方法和本发明的装置构成。

图1概括地表示了根据符合本发明的一个实施例的全息光学捕获系 统。
图2A和2B是根据符合本发明的一个实施例的侧视概略图和顶视 概略图，表示被引导进入样本保持器中的样本。
图3描述了根据符合本发明的一个实施例的样本腔的扫描电子显微 照片。
图4表示根据符合本发明的一个实施例的样本腔的工作区域的放大 视图。
图5是根据符合本发明的一个实施例用于分类对象的全息光学捕获 系统的概略图。
图6表示根据符合本发明的一个实施例的用于分类的横向偏转的例 子。
图7A和7B分别表示根据符合本发明的一个实施例的汇集陷阱的 概略正视图和侧视图。
图8表示根据符合本发明的一个实施例的基于旋转盘(disk-based) 的分类的细胞。
图9表示根据符合本发明的一个实施例的光学蠕动(peristalsis)。

在如图1所示的全息光学捕获装置或系统100中，光线从激光系统 入射，并且如向下箭头所表示，以驱动系统100。
相位构图光学元件101最好是动态光学元件(DOE)，其具有动态 表面，其也是纯相位空间光调制(SLM)，例如“PAL-SLM series X7665”， 由日本Hamamatsu制造，“SLM 512SA7”或“SLM 512SA15”，都是由 美国科罗拉多Boulder Nonlinear System of Lafayette制造。这些动态相位 构图光学元件101被计算机控制以通过在介质中编码的全息图来生成细 光束，其可以变化以产生细光束以及选择细光束的形式。在图1的左下 方生成的相位构图102产生右下方示出的陷阱103，其填有在水105中悬 浮着的1μm直径硅石球体104。因此，该系统100由左下方动态全息控 制。
激光束传播通过透镜106，107，到达分色镜108。该分束器108由 分色镜，光子带隙镜，全向反射镜，或者其它类似设备构成。该分束器 108有选择地反射用于形成光学陷阱103的光波长，并且透射其它波长。 从分束器108区域反射的部分光然后通过一个编码的相位构图光学元件 的区域，该光学元件基本上配置在与一聚焦透镜(物镜)109的平的后孔 径共轭的平面中。
在本发明之前，已经构思过在单独光束光学捕获(也称为激光或光 学镊取)中，高数值孔径透镜对于可接受的光学陷阱是需要的。这一想 法的基础是，对于光学捕获，使用在入射光的电场中的梯度以捕获粒子。 为了具有大的捕获力，人们想到在电场已经必须具有大的梯度(或者光 线强度数值)。通常完成该方案的作法是通过高数值孔径透镜来通过该光 场。
涉及在大的视野中观察和样本捕获是这样的观察和捕获将包括具 有低数值孔径的物镜。与现有教导相反，例如，本发明提供低数值孔径 透镜，例如作为图1中的物镜109。在这种情况下观察和捕获的能力在从 通过低放大率透镜给出大的视野中获得好处的任何应用中是有用的，例 如放置微观制造的部分或者与大量对象，例如细胞进行工作。
根据本发明的一个实例，3微米硅石球体104在水105中悬着，被 具有空前低数值孔径的透镜109捕获。所使用的该透镜109由Nikon制 造：
(a)具有0.10NA的Plan 4x；以及
(b)具有0.25NA的Plan 10x。
合适的相位构图光学元件特征在于依赖于它们如何引导聚焦光束 或者其它能量源的透射性或者反射性。透射性衍射光学元件传送光束或 者其它能量源，而反射性衍射光学元件则反射光束。
相位构图光学元件101也可以分类为具有静态或者动态表面。合适 的静态相位构图光学元件的例子包括那些具有一个或多个固定表面区 域，例如光栅，包括衍射光栅，反射光栅，以及透射光栅，全息图，包 括多色全息图，模板，光线整形全息氯光器，多色全息图，透镜，反射 镜，棱镜，波片以及类似物。该静态的透射性的相位构图光学元件特征 在于固定表面。
但是，在一些实施例中，相位构图光学元件101本身是可移动的， 因此允许用于通过相对激光束移动相位构图光学元件101以选择合适的 区域来选择一个或多个固定的表面区域。
静态相位构图光学元件可以被附加在一轴上以及一通过一受控电 机(未示出)被旋转。该静态相位构图光学元件具有固定表面以及离散 区域。在其它静态相位构图光学元件的实施例中，或者透射性或反射性， 该固定表面具有不同类的表面，实际上包含连续变化的区域，或者离散 区域的组合，以及实际上连续改变的区域。
合适的动态相位构图光学元件的例子对于它们的功能具有时间相 关方面，这些例子包括计算机产生的衍射图形，相位偏移物质，液晶相 位偏移阵列，微镜阵列，包括活塞模式的微镜阵列，空间光调制器，光 电偏转器，声光调制器，可变形反射镜，反射性MEMS阵列以及类似物。 具有动态相位构图光学元件101，包括相位构图光学元件101的介质105 编码可以改变的全息图，以将一构图的相位偏移施加给聚焦光束，导致 在聚焦的光束的相位轮廓的对应改变，例如衍射或者会聚。因此，介质 105可以改变以产生光学陷阱103的位置改变。动态相位构图光学元件 101的优点在于介质105可以改变以独立地移动每一个光学陷阱103。
在这些实施例中，其中细光束的相位轮廓，在外围不强烈而在从外 围向内的区域中更强烈，将背孔径通过填充小于约15％对于形成比没有 过填充背孔径形成的光学陷阱相比在外围具有更大强度的光学陷阱。
在一些实施例中，光学陷阱的形式可以从其原始形式改变为一点的 光学陷阱，光学漩涡，贝塞耳光束，光学瓶子，光学旋转器或者光笼子。 该光学陷阱可以在两维或三维上移动。在相位构图光学元件也用于将一 特定的拓扑模式施加至激光，例如，通过将高斯模转换为高斯一拉塞尔 腔模。因此，一条细光束可以形成高斯—拉塞尔腔模，而其它细光束可 以形成高斯模。高斯—拉塞尔腔模的使用通过减小辐射压力明显地增强 了捕获。
1.成像系统
当前的工具设计使用高分辨率的CCD摄像机，用于初级成像系统 110。由于该技术是一项成熟的技术，CCD摄像机(见图5中的参考标记 511)的主要优点是有利的性价比。CCD摄像机的其它优点是它们的广泛 动态范围以及容易产生数字输出。
在计算机屏幕(见图5中的参考标记510)上看到图像以提供用于 选择陷阱位置的参考帧，以及将操作者不小心暴露于激光下的可能性最 小化。
2.用户界面
a.对象显示
用户界面包括计算机屏幕，其显示由CCD摄像机采集到的视野。用 户利用鼠标指明陷阱的位置。还具有删除位置的选项。
下面将更详细的描述，用户也能够指定每一个陷阱的能量，从而能 够避免样本被破坏。除此之外，期望能够改变陷阱的能量，因为捕获依 赖于样本的折射率与悬浮介质之间的差别，该悬浮介质对于不同样本是 不同的。
b.全息图
指明陷阱的位置的目的是提供全息图计算的输入。全息图实际上是 傅立叶变换产生期望的陷阱阵列的功能。但是在液晶显示的情况下，该 功能是相位对象(即，改变波阵面相位而不吸收任何能量的对象)。
c.选择陷阱组的方法
当需要大量的陷阱时，利用计算机鼠标指明其位置的时间可能很长。 因此，有几个选项可以减小需要的时间。
通常人们希望使用陷阱在一个特定的方向上移动对象。这可以通过 使用鼠标创建一条线(通过拖拽)来实现。该计算机程序将一条线解释 为要求一系列待被序列地部署的陷阱，并且充分接近到一起，从而以小 步幅移动目标，而不失去对目标的锁定。
本发明还包括改变陷阱高度的能力。如果激光束平行于物镜109的 光轴，则陷阱形成在相同的高度上作为透镜109的焦平面。改变陷阱的 高度通过调节全息图来完成，从而当其进入显微镜的物镜109时，形成 陷阱的光束轻微会聚(或分散)。使用透镜调节陷阱的高度是可能的，但 是仅一个全息光学捕获(HOT)允许每一个独立的陷阱的高度被调节而 与任何一个其它陷阱无关。这是通过液晶全息图引致的调节相位调制的 计算机程序所实现。
3.样本保持器
a.概述
本发明的样本腔200(见图2A和2B)是便宜的并且可以任意使用 的。尽管下面描述本发明的样本腔200，本发明的其它目的是用于创建弹 性设计，其可以针对不同的应用而改变。
样本腔200位于显微镜滑块201表面。样本腔200包括一系列通道 203，用于引入样本或者对象。通道203通过薄管204(商业上可购得) 连接至提供和搜集库。样本或者对象将悬浮在流体介质中，并且将通过 通道203被引入工作区域。样本腔200由覆盖片205覆盖。
b.样本腔制造
在符合本发明的一个实施例中，聚乙稀(二甲基硅氧烷)(PDMS) 树脂用于制造样本腔200。该处理包括利用标准的CAD/CAM方法在计 算机上创建期望的通道203的图形，以及利用传统的光阻/蚀刻技术将图 形转换为光掩模。该光掩模然后用作为负掩模以创建通道的反向图形， 这些通道被蚀刻在硅晶片上。通道203的深度由蚀刻时间控制。硅晶片 是实际的样本腔200的负向复制品。最后的步骤包括通过在晶片上传布 PDMS并且聚合创建正向样本腔200。这导致与玻璃滑块201结合的 PDMS模，并且由覆盖片205覆盖。玻璃与PDMA结合由氧蚀刻产生， 氧蚀刻激活暴露的表面。
为保证组成质量，需要一些附加步骤。例如，为了防止形成气泡， PDMS溶液/硬度在真空下被保持。硅晶片被硅烷化，以防止PDMS与晶 片粘接。有不同的步骤，包括清洗复制品，并且保持适当的环境控制。 这些表示的是标准的技术。
通道203连接到微孔管204，使用由胶水214保持的小的注射器针 206，通道203通过PDMS模被插入小的圆形井207，圆形井207与每一 个通道203连接。利用微型泵208，样本溶液被引入到通道203。
图2B表示在210通过注射器泵208引入样本的典型的设置图。介质 在211处被引入，并且在21处收集废弃物，而期望收集在213。
图3是表示作为从上述方法实际创建的图2B中的图的扫描电子显微 图。通道大约50微米宽，50微米深。图4是表示“工作”容积的扫描电 子显微图，其中将发生样本的控制。图形清楚地表示通道203是平滑而 且清洁的。尽管通道203是矩形的截面，也可以设计其它形状。通道203 被设计为允许样本流入“工作区域”，工作区域的形状可以是根据实验需 求所定制的设计。
c.全息光学陷阱
与序列定址多个捕获点，并且因此时间共享的扫描的光学陷阱不同， 全息光学陷阱连续照明它们的陷阱中的每一个。对于一个已经扫描的光 学陷阱，为了获得与连续照明的陷阱同样的捕获力，其必须提供至少相 同时间平均的强度。这意味着扫描的陷阱必须通过与至少捕获区域的数 量成比例的因子具有较高的峰值强度。该较高峰值强度增加了在捕获的 物质中光学引入破坏的机会。该破坏可能由至少三个机理引起：(1)单 个光子吸收导致的局部发热，(2)单个光子吸收导致的光化学转换，以 及(3)多个光子吸收导致的光化学转换。事件(1)和(2)可能通过选 择被捕获物质弱吸收的光波长，以及通过周围流体介质而被减轻。事件 (3)是一个更常见的问题，其通过利用较长的波长光而被部分地减轻。 因此，通过在一个对象的多个点中连续分布较小数量的力，全息光学陷 阱可以更缓和地控制精细的物质，具有明显效果，而不是通过将全部力 施加在一个单独的点上或者对于一个时期以较高强度来潜在地破坏该对 象。
在符合本发明的实施例中，设计是弹性的，其中可以用标准的 CAD/CAM计算机程序设计通道203任何希望的图形。图形的复杂度不 是一个因数，只要通道203分离得足够远从而彼此不互相撞击就可以。 由于可以在图2B和3中看到，多组通道203可以容易地被容纳，从而单 个芯片可以用于多个实验。此外，一旦制作了模子，可以用于制作数以 千计个样本腔，所以该方法容易地适用于大批量生产的技术。估计当批 量生产时单个腔的相关成本将达到百分之几的量级。
4.光学系统
a.合成全息图
全息光学陷阱的早期版本使用自不同的物质制做的固定的全息图制 造。这些足以证明使用全息图创建几百个陷阱的原理。但是这些全息图 的主要缺点是，它们是静态的，并且花费几个小时来制作单个全息图。 随着硬件的进步，生产的计算机驱动的液晶显示器每秒钟能够形成多次 全息图，使用光学陷阱作为动态设备已经变得切实可行。下面将描述计 算全息图的原理。
b.显微镜
光学系统110包括标准的高质量光线显微镜。物镜是高数值孔径的 透镜109，其与长工作距离聚光透镜相耦合。高数值孔径物镜109用于进 行捕获。而长工作距离聚光透镜可能多少会降低图像的分辨率，不损害 捕获，并提供外部空间，靠近样本滑片以容纳波导设备和容器。对象可 以通过陷阱保持它们，以及垂直或者横向地移动显微镜台而被移动。
在符合本发明的一个实施例中，大约2mW的激光能量被采用以在陷 阱中产生200微瓦。来自2W激光的可用的功率级适于创建大约1000个 陷阱。绿激光(532nm)被使用，但是也可以使用其它波长，包括，例如， 远红激光与吸收大约532nm数值的物质工作。
捕获依靠折射率梯度，从而具有接近周围介质的折射率的材料需要 具有较高功率级的陷阱。此外，物质被破坏的容限将随着陷阱能量而变 化，因此对于用户希望能够控制该参数。用户可以利用图形界面上显示 的“能量滑块器”在任意特定的陷阱中增加功率级。
c.液晶全息图(也称为空间光调制器或SLM)
空间光调制108实际上是由静电场控制，进而可以由计算机程序控 制的液晶阵列。液晶显示阵列具有根据所施加的电场的强度，将光线的 相位延迟不同量的特性。
向列性液晶设备用于显示或用于需要大的纯相位调制深度(2II或者 更大)的应用。向列性液晶分子通常在设备表面排列，由于液晶双折射 而给出最大的延迟。当施加电场时，分子平行于电场发生倾斜。当电压 增大时，沿着非常轴的折射率，且因此该双折射被有效降低，致使设备 的延迟的减少。
d.激光
可用的激光包括固态激光，二极管抽运激光，气体激光，染料激光， 变石激光，自由电子激光，VCSEL激光，二极管激光，Ti-蓝宝石激光， 掺杂YAG激光，掺杂YLF激光，二极管抽运YAG激光，以及闪光灯抽 运YAG激光。工作在10mW和5W之间的二极管抽运Nd:YAG激光是 较佳的。该较佳的用于形成研究生物物质的激光束波长包括红外线，近 红外线，可见红光，绿光，以及可见蓝光波长，具有从400nm到1060nm 的波长是最好的。
5.操作方法
在符合本发明的一个实施例中，光学捕获系统500(见图5)(例如 由Arryx，Inc.销售的BioRYx系统，芝加哥，伊利诺依州)包括Nixon TE2000系列显微镜501，用于使用全息光学捕获单元505形成光学陷阱 的机座放置其中。附加了一个外壳的换镜旋转盘502，通过该机座直接安 装进显微镜501。对于成像，一个照明源503设置在物镜504之上，以照 明样本506。
在本发明的一个实施例中，光学陷阱系统100(见图1和5)包括一 个第一光通道的一端，其接近到光学元件，和第一光通道的另一端，该 另一端同与其垂直形成的第二光通道相交叉并通信。第二光通道在显微 镜透镜安装转台或“换镜旋转盘”的基座中形成。该换镜旋转盘适合于 安装入Nixon TE200系列显微镜。第二光通道与第三光通道通信，第二 光通道也是与第二光通道垂直。通过换镜旋转盘的底座，第三光通道从 换镜旋转盘的顶表面横穿，并且与物镜聚焦透镜109平行。聚焦透镜109 具有顶部和底部，形成一背孔径。在第二光通道与聚焦透镜背孔径之间 的第三光通道中放置的是分色镜分束器108。
用于形成光学陷阱的光学陷阱系统中的其它组件包括第一反射镜， 其通过第一光通道，反射从相位构图光学元件101中散发的细光束；第 一组转移光学装置106，设置在第一光通道中，被对准以接收由第一反射 镜反射的细光束；第二组转移光学装置107，设置在第一光通道中，被对 准以接收通过第一组转移透镜的细光束；以及第二镜反射镜108，定位于 与第一光通道和第二光通道交叉的位置，被对准以反射通过第二组转移 光学装置以及通过第三光学通道的细光束。
为了产生光学陷阱，激光束引导来自激光器507(见图5)，通过校 准仪以及通过光纤端508以及反射离开衍射光学元件509的动态表面。 离开校准仪和光纤端的光束被衍射光学元件的动态表面衍射为多条细光 束。每一条细光束的数量，类型和方向可以通过改变在动态表面介质中 编码的全息图被控制和改变。然后细光束反射离开第一反射镜通过第一 组转移光学装置下至该第一光通道，通过第二组转移光学装置至第二反 射镜；并且在分色镜509向上引导至物镜504的背孔径，通过物镜504 被会聚，因此产生形成光学陷阱必须的光学梯度条件。通过分色镜509 分裂的用于成像的光线的部分，通过第三光通道的较低部分形成光学 数据流(见图1)。
生物物质样本的光谱可以采用成像照明源503被实现，该照明源503 适合光谱或者偏振的光背散射，前者用于评价化学身份，后者适用于测 量内部结构的尺度，例如细胞核大小。在一些实施例中使用这样的光谱 学方法，细胞被问询。计算机510可以用于分析光谱数据，并且识别具 有X或Y染色体的细胞，或者疑似癌症，癌症前期和/或非癌症细胞类型。 计算机程序则可以采用该信息以引导光学陷阱来容纳所选择的细胞类 型。所容纳的细胞则可以根据所容纳的细胞与化学品反应或结合而被识 别。
当前的方法和系统使适于用于跟踪每一个光学陷阱的运动和内容的 半自动或自动化处理。该运动可以通过视频摄像机511，光谱，或者光学 数据流被监视，以及其提供计算机程序，控制细胞的选择和光学陷阱的 产生。
在其它实施例中，根据由编码相位构图光学元件产生的每一个光学 陷阱预定运动，跟踪细胞的运动。此外，在一些实施例中，计算机程序 被用于保持容纳在每一个光学陷阱中的每一个细胞的记录。
然后通过操作者的可视化检查，光谱地，和/或视频监视可以看到光 学数据流，被转换为视频信号，被监视，或者被分析。光学数据流也可 以通过光检测器处理以监视强度，或者任何适当的设备以将光学数据流 转换为适合计算机使用的数字数据流。
在不使用SLM的解决方案中，运动通过将对象从第一组光学陷阱转 移至第二，第三，然后第四，等等而实现。为了将对象从第一位置移动 到第二位置，静态相位构图光学元件围绕一主轴被旋转，以将激光束与 第二区域对准，第二区域在对应的第二组预定位置产生第二组光学陷阱。 通过在接近于第一位置构建第二组光学陷阱，探针可以从第一组光学陷 阱传递至第二组光学陷阱。该序列可以通过旋转相位构图光学元件从第 二组预定位置不断传递探针至第三组预定位置，从第三组位置至第四组 预定位置，并且从第四组预定位置，等等，以对准对应于期望位置的适 当区域。在一组光学陷阱结束与下一组光学陷阱产生之间的时间间隔是 一段保证探针在漂走之前转移至下一组光学陷阱的持续时间。
在对象从宽至窄接近性的交叉运动中，以类似的方式出现细胞的交 叉运动。但是，当对象从第一组光学陷阱传递到第二组，并且移动至第 二组以及后来的位置时，陷阱的交叉排列允许对象被紧凑地打包，而不 放置一组光学陷阱以同时非常接近两个对象，将导致这些对象被错误的 光学陷阱容纳。
一旦一个对象或细胞与陷阱相互作用，光谱方法可以用于询问细胞。 通过使用成像照明，例如适用于不弯曲的光谱或者偏振的光背散射，可 能获得这些具有正向结果的细胞(即，与标记反应或者结合的这些细胞) 的光谱。计算机可以分析光谱数据以识别期望目标，并且引导相位构图 光学元件将期望目标分离。当实验完成时，可以通过计算机和/或操作者 进行选择被抛弃的细胞和被收集的细胞。
光学蠕动(见图9)是一个现有的处理，在设置的微流体通道401 采用平行的若干行陷阱400，当第一行陷阱被关闭时，这些行之间的间隔 允许一行中捕获的粒子402被推入另一行中的陷阱中。光学蠕动可以用 作为替换方案并且与荧光标记结合(后面将结合应用描述)。该处理通过 对若干行陷阱的消失进行定时而操作，从而粒子以这些行陷阱的设置指 定的期望的方向移动。通过选择一行陷阱是否在一侧或者其它粒子开或 关，粒子将在一个方向上向前或者向后移动。通过使用大量的陷阱，因 此大量的粒子可能沿着给定的方向一致运动。因此，附着在陷阱上的粒 子可以移动到给定的区域，并且如果需要，在那里聚集。
类似地，通过逐渐地朝着一给定方向减小这些行中的陷阱之间的间 隔，和/或改变这些陷阱行的曲率，粒子可能被扫入聚焦图形以将它们集 中。将这样的图形反向将使这些粒子分散。
陷阱行之间的间隔可以相对较大以加速粒子的运动，或者相对较窄 使它们慢下来。类似地，改变所选择的陷阱或行的强度，并且增强它们 对粒子的影响，也可以被采用。通过会聚或者发散流，粒子可以被结合 或者分离。此外，例如光学蠕动也可以与不同的粘滞拖拽效果或者电场 结合，以产生复杂的和特定参数值的组，用于更好地分离物质。通过将 捕获和其它力反向，两个力平衡点确定粒子是否以陷阱或其它的力运动。
在符合本发明的一个实施例中，利用全息系统可以实现光学蠕动， 其通过一序列相位图形循环，以实现一个对应序列的全息光学捕获图形。 这样的图形可以在安装在棱镜表面的减轻反射衍射光学元件的表面中被 编码，其中每一个图形通过马达旋转入位。类似地，透射衍射光学元件 可以被放置在盘的周边上并旋转通过这些图形循环。也可以使用可切换 的在膜上编码的相位全息图和相位光栅。
对于通过外部偏置力驱动通过直线阵列的粒子，例如流体流，其中 捕获力被认为大于外部驱动力，该些粒子被捕获。在偏置力更大处，粒 子流通过阵列。在这些极限值之间，偏置力超过捕获力，超过的程度对 于不同部分的粒子是不同的，导致粒子沿着阵列的主轴方向从陷阱跳跃 到陷阱。可以观察到零网(zero network)偏转，此处阵列被旋转到45°， 因为(1)正向和负向位移以相等的概率发生；或者(2)粒子变得被锁 进了[11]方向，通过阵列对角跳跃。
通过一阵列被影响到一更大程度的粒子比通过偏置力影响到一更大 程度的粒子，可被偏转到更大的角度。在粒子上施加的光学梯度力大致 以a3变化，其中a＝半径。在粒子上的斯托克斯拖拽以a变化。因此，较 大的粒子受到陷阱阵列的不成比例的影响，而较小的粒子经历较小的偏 转。取向该阵列到接近最佳偏转角度，并且调整强度以在跳跃条件下放 置最大的粒子，且因此比较小的粒子更大的偏转。通过第一行下游的附 加阵列，不同偏转的粒子可以被收集，或者进一步被分级(fractionation)。
用于分级的一些常规技术实现一施加力方向上的分离。但是这样的 技术在成批样本上而非连续地操作。
用于微分级的其它传统的技术采用构成障碍物的二维格子的微制作 的筛。例如，障碍物的不对称的放置调整通过筛的粒子的布朗运动，导 致粒子流过依赖于粒子的扩散系数的路径。但是，微制作的格子的使用 产生妨碍，并且对粒子大小和类型是不可调整的。
图6中给出了根据本发明的粒子分类的一个实例。尽管所阐述的例 子仅仅是示例了横向偏转，可以在同样的系统中获得光学蠕动。视频图 像的表示给出了基于光的物质分离，在这一情况下，协调以根据粒子大 小分离对象。左上方通道中流包括1、2.25和4.5μm粒子，另一流从左 下方进入。重叠线表示当系统激光能量关闭时的各通道流。当激光能量 打开时，交互区域(由重叠的绿色框指失)中的光线，从上面的流提取 4.5μm粒子，并将它们传递到由重叠的白色路径表明的右下方通道。
6.在精子分类上的应用
a.背景
在符合本发明的一个实施例中，通过使用光学捕获技术已经实现高 分辨率，高产量细胞分类器。通过传统的串流细胞仪的失败，证明了需 要实现该技术作为新的分类基础，从而执行在许多分类问题中需要的细 胞特性高分辨率确定。在本例中，在养牛业，区分含有X-和Y-染色体的 精子，流率实际上从当今的技术状态系统的速率被换算回来(scaled back)。原因在于传统串流细胞仪计数在进行荧光/非荧光确定中是最好 的，在该模式下，可以实现30,000细胞/秒的速率操作。由于问题变成一 个在不同荧光级别(例如在精子分离问题中)之间的鉴别，这些方法变 得非常没有效果。在精子分离问题上，具有X-和Y-染色体的精子在荧光 上差异约为4％，该速率降低到每秒4,000输出细胞。(见J.L.Schenk，et al..，Proceedings，The Range Beef Cow Symposium XVI，1999.)
b.利用全息光学陷阱分类
本发明的高分辨率，高产量(throughout)细胞分类的方法，具有下 面的组件：微流体显影(development)，光学陷阱系统显影(用于运送系 统的捕获组件，以及用于分离系统的陷阱组件)，高分辨率荧光测量，系 统控制(包括全息图计算)，以及机械设计。
第一组件是流单元，其具有流体输入通道，运送输入样本，以及两 条输出通道，运送从输入通道分离出来的细胞。第二组件是一组陷阱， 它们执行“汇集”功能(这里的“汇集”功能是传统的流动血细胞计数 器中形成小滴流的喷嘴等价物)。第三组件是检测系统，以及最后，第四 组件是分类系统。图7A-7B表示了这四个组件之间的关系。
在本例中，精子用作为分离的样本目标。传统的方法中使用 Hoechst33342区分具有X-和Y-染色体的精子，特定地结合至DNA的染 色，以这样的方式全部荧光表示是在全部DNA表示的测量。该荧光的测 量实现了基础染色体负载的性质的评价。(Schenk，1999；以及，Erik B.van Munster，Cytometry，volume 47，page 192，2002)。
许该本发明的该建议的实施例实现高产量的实际的特性是其内在的 在平行线上同时运行物质的能力，而且相互之间接近。对于该最初的实 现，创建具有10条输入线300的流系统，每一条线300隔开10微米。 这设置了从输入库到该流的110微米的整体宽度。该输出通道302，303 为与输入通道301相同的110微米的宽度，并且它们与输入通道301平 行运行，如图7A和7B所示。引入“输出通道”302，303的是缓冲液， 其以保持在输入通道301中相同的流率被馈入这些通道。所有这三个通 道301，302，303被设计为在感兴趣的流范围上的。在分类区域中，特 定的细胞从输入通道301被转移至输出通道302，303中的一条，所有的 三条流是相邻的，它们之间没有机械分离。层流在它们的各自流中保持 任何物质，除非特定的外部力被引入以将物质从一条流通道到另一条流 通道。
汇集陷阱305作用于输入细胞306，因此它们都穿入到严格意义的 流线中，并且因此这些输入细胞306彼此分离一个由操作者设置的最小 距离306。在通道301，302，303中的流率通过该最小距离306，通过执行 分离功能的设备的“更新”率，并且通过期望的所有的细胞处理速率而 被设置。假设在我们的样本情况下的最小距离为20微米(足够完全分开 精子头部，但是是允许尾部的无序重叠的距离)，和1,500细胞/秒的处理 速率，该系统使用3mm/秒的流率，[(15,000细胞/秒)×(20微米/细胞 -线)÷(10线)]。
汇集系统由低强度陷阱305的图形构成该图形由一组静态全息图 构成，其安装在旋转轮中，从而图形作为旋转图形的函数而变化。大部 分下游的陷阱是固定的强度以及位置，仅用于保持流细胞线之间的分离。 上游的陷阱305被允许随时间改变强度以及位置，以在团集的细胞上分 配流，并通过独立的或者不团集的细胞。
分类确定时的测量可能在汇集陷阱305的下游区域发生，或者其可 能在汇集系统之外的区域发生。对于该初始系统，测量将包括高分辨率 的荧光检测。但是将来可以实现其他的主动分类标准，例如散射测量， 或者可以使用被动技术，例如先前所说的那些使用光学偏转的技术。
设备最后的组件是分离系统，其中分类标准被利用以将细胞传递至 输出通道302，303中的一条，或者允许它们保持在输入通道301的流中。 对于该组件的重要参数是用于实现驱动分离的动态陷阱305阵列的高数 值孔径物镜304的视野。该视野的宽度是110微米，与独立通道的宽度 相同。但是其长度取决于通道深度和用于控制这些陷阱的光学设备的更 新率。
当前，符合本发明的一个实施例，包括空间光调制器，其创建相位 掩模，在驱动光学捕获系统时是高度有效的。这些设备具有30Hz的更新 率或者更高。估计具有10微米的通道深度，并且假设精子细胞应该在1 微米的步幅运动，使用空间光调制器的10次更新，以将细胞从输入通道 301中心移动至输出通道302或303的中心。具有30Hz的更新数值，这 些10步幅的实现将在1/3秒之内发生。这些10步幅在流的方向上在1mm 的长度上以3mm/秒的流率实现。用于分离组件的该物镜304将因此具有 110微米×1000微米的工作区域。该方案的一个重要的开发区域实际上 是透镜组件的设计。透镜设计的折中通常是视野和数值孔径之间的。也 就是说，对于一特定复杂性的透镜组件，在这些区域中的一个的明显的 性能改善将伴随另一个区域中性能的下降。由于这个原因，在区域中使 用的高性能透镜例如集成电路电子产品的高分辨率，平板印刷是相当复 杂的。但是本发明明显地在这些透镜组中的性能水平之下。
7.宽场漩涡镊取的公开
具有宽场视野的镊取包括显微镜物镜，其具有一个相对低的数值孔 径。在轴向的光学捕获对象的能力依赖于以将在轴向具有最大梯度的方 式将光束向下聚焦。这暗示了光锥将形成具有最宽可能半径。该锥体的 半径直接由物镜的数值孔径确定，即高数值孔径意味着宽锥体半径。这 直接与宽场视野的需求相冲突。按照传统进行的镊取难于具有轴向宽视 野。轴向镊取的难度的主要原因之一是被聚焦光束的辐射压力。尤其对 于与周围介质在强度上良好匹配的粒子，例如，聚苯乙稀微球体，辐射 压力可以将粒子吹出陷阱。由于低数值孔径物镜，难于在轴向上以足够 的镊取力来克服辐射压力。但是，全息光学陷阱具有形成光异常(exotic) 模式的能力，其明显地减小了光束的辐射压力。例如漩涡陷阱，具有黑 中心，因为光的改变相位在陷阱的中心消失。该黑中心表示向下行至光 束中心的大部分光线不再存在。实际上这些光束，隐藏了光的大部分辐 射压力，因此它们的去除明显地减弱轴向捕获的难度。其它模式，例如 圆环圈模式具有同样的优点。
通常，通过具有多条可利用的光束，对象或细胞的控制(推压，引 导，分类)被使得更安全。类似于钉床，多个镊子保证低在细胞中任何 特定的点被引入较少能量。这消除了热点并减低破坏的风险。任何破坏 性的双光子处理明显有益，因为吸收是与激光能量的平方成比例的。仅 增加了第二镊子将特定点的双光子吸收降低了4倍。大的细胞例如四膜 虫，其通过镊子阵列保持在一个位置，包括大量激光能量用于有效捕获。 将能量置于一个单独的陷阱中将导致对细胞的立即破坏。
最后，通过利用全息光学捕获，即使仅单个细胞的控制明显增强。 由一行镊子可控制一个单独的颊上皮细胞，其沿着一侧的周边提升该细 胞。该产生的旋转允许360度观察该细胞。除了观察生物样本的这一优 点之外，还具有稳定地定向样本的能力，对于对样本定向有很强依赖性 的研究，例如散射实验，其具有明显的好处。
8.基于旋转盘的细胞分类器
由于大量的精子是典型的突然射出，在精子变得不再有功能之前仅 小量的时间可用，每秒大量的精子(以百万数量级)被分类用于商业上 可存活的精子分类器。由于具有并行处理大量细胞的能力，采用全息光 学陷阱的分类体现出非常大的优点。
使用激光快速访问大量点的技术已经以旋转激光盘，CD播放器，或 者DVD播放器的形式存在了。这些设备组合了盘的旋转运动和激光的径 向运动，以不可思议的高速访问点。例如，典型的DVD播放器可以在两 个小时左右访问盘上近4千兆个分离的“位”。将该旋转盘方案与光学捕 获(见图8)相组合允许以类似的速度访问细胞，并且全息光学捕获将这 些速度提高了大约100倍甚至更高。
如图8所示，对象或者细胞被引入样本入口700，并且使用适当的 样本传送系统701，这些细胞被提供至由马达控制旋转的样本分配盘702。 该成像和捕获系统703，与控制和分析系统704连接，将细胞分类，并且 它们被收集进样本腔705和706。
有很多在盘的表面上分配细胞的机理。流体腔，其外壳与细胞相独 立；胶体，其粘滞细胞；粘的或者蜡质表面，其结合细胞；或者甚至将 细胞冷冻为固体状态，都是可以使用的方法。一旦细胞被定位，从而它 们保持它们的相对位置，它们可以被准确地测量。然后光学捕获可以从 表面或者容积中释放希望或者不想要的细胞。在期望分类为两组以上的 情况下，每一组可以在单独通过中被释放，并且可以执行多个通过。
9.利用可融衬底的细胞和非生物物质分类
例如荧光激活的细胞分类(FACS)的技术，尽管已经很好地建立， 实际上它们是一系列的处理方法。因为在生物学中普遍存在标记染色， 根据这些染色进行分类成为可能。这些染色经常在染色和未染色的精子 之间创建一些波长或者波长范围的吸收的差别，假设将被分类的组本质 上尚未表现出这一吸收差别。全息光学陷阱则可以被使用以加热和控制 精子进入衬底，该衬底由于精子升高的温度而融化。随着明显的温度升 高，该嵌入的精子可以后来被释放。此外，较快，甚至并行处理方法成 为可能，该方法中细胞由宽带的高能量光源照明，其同时处理整个精子 阵列。同样一组方法可以应用在非生物样本中，这些非生物样本在吸收 光谱上不同，或者也可以有选择地这样做。
10.基于胶体的分类
全息光学激光陷阱在对象的控制方向方面具有明显的优点，其中它 们能够访问并在三个方向移动对象。由于生物分类应用变得更加先进， 经常以少量的时间，大量的精子需要分类。全息光学陷阱三维访问意味 着这些分类应用可被实现。很麻烦或不可能进行系列分类或在两维衬底 上进行分类的感兴趣的大量细胞和其他生物样本可以被有效地分类。
这样的三维分类的一中实现依赖于可逆的胶体处理。细胞在一网络 上被粘滞，然后希望或不希望的细胞利用全息光学陷阱被从胶体中抽取 出来。来自陷阱的热量可以用于融化胶体并提供出口路径。
可选地，采用全息光学激光陷阱，根据一些标准有选择地被杀死细 胞。整个胶体然后被融化，并且活的细胞与死细胞分离。与仅仅杀死不 同，可以产生更加具有破坏性的热爆炸，它使细胞分解为更小的部分， 然后根据大小进行分类，分组或者将某些细胞再连接在一起。
11.生物样本的杀死
选择性地杀死生物样本的能力有大量的应用的好处。一个这样的应 用是将病原体从血液中去除。另一个应用是细胞分类。细胞被识别，一 组或多组细胞被杀死，然后死细胞被去除。该杀死通过来自激光本身的 光能量执行，不需要光学陷阱执行这一功能。
实际上，通过激光束，细胞被加热或者细胞周围的介质被加热，破 坏和杀死了细胞。全息光学陷阱，因为它们的通用性和三维控制，允许 选择性的，大量并行杀死细胞。
12.固定电子组件
注意到上述许多技术能够用于移动小的电子组件或者将电子组件固 定就位。
参考上面的实施例已经具体描述了本发明，那些本领域的熟练技术 人员应当理解可以进行的各种其它的形式以及细节上的改变，而不脱离 本发明的精神实质和范围。
本发明要求美国临时专利申请：2002年7月31日提交的 No.60/399,386以及2002年12月20日提交的No.60/435,541的优先权， 其内容在此引用以作参考。