一种等离子体微生物诱变育种设备 |
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| 申请号 | CN201110339695.2 | 申请日 | 2011-12-20 | 公开(公告)号 | CN102382763A | 公开(公告)日 | 2012-03-21 |
| 申请人 | 北京思清源生物科技有限公司; | 发明人 | 毕鲜荣; 冯权; 葛楠; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了属于常压 等离子体 技术处理设备领域的一种等离子体 微 生物 诱变育种设备。包括壳体和设置在壳体内的处理样品的 等离子体发生器 ；在壳体内的左边为操作室，操作室内设置一放置样品的载物平台，与等离子体发生器连接的 喷嘴 ， 温度 传感器 和 位置 传感器 固定在操作室内壁上，育种样品放置在载物平台上；在壳体内右边，操作室外面放置等离子体发生器、射频电源和 控制器 。本发明中的等离子体发生器采用在 大气压 、 低 电压 条件下产生的等离子体射流对生物样品进行诱变育种，其均匀性高，温度低，避免了射流温度过高而引起大量微生物样品致死的现象，本设备功能完善、方法操作简易，在生物技术领域有良好的应用前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种等离子体微生物诱变育种设备，所述等离子体微生物诱变育种设备包括壳体和设置在壳体内的处理样品的等离子体发生器；其特征在于，在壳体（1）内的左边为操作室（2），操作室（2）内设置一放置样品的载物平台（10），与等离子体发生器（7）连接的喷嘴（12）穿过操作室的侧壁伸进操作室内，温度传感器（13）和位置传感器（11）固定在操作室（2）内壁上，育种样品（14）放置在载物平台（10）上；在壳体内右边，操作室外面放置等离子体发生器（7）、射频电源（8）和控制器（9）；所述控制器（9）分别连接射频电源（8）、气体流量控制模块（16）、温度传感器（13）、位置传感器（11）、载物平台（10）、冷却器（5）和触摸屏控制板（4）；等离子体发生器（7）和射频电源（8）之间通过射频电源匹配模块（15）连接；气体流量控制模块（16）与等离子体发生器（7）连接。 |
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| 说明书全文 | 一种等离子体微生物诱变育种设备技术领域[0001] 本发明属于常压等离子体技术处理设备领域，特别涉及用于微生物诱变育种的一种等离子体微生物诱变育种设备。 背景技术[0002] 微生物菌种是发酵工业的基础和关键，一株好的微生物菌种能提高发酵工业效率、降低产品成本，因此微生物育种工作变得越来越重要。随着研究的不断进展，目前已有很多不同水平的微生物诱变技术出现并逐步成熟。诱变育种已经在改造微生物菌种、解决育种工作某些特殊问题及开发新产品等领域中取得了快速的进展，不仅可以克服常规育种周期长、进程慢、难以获得高效变异品种的缺点，而且与基因工程相比，诱变育种操作简单，尤其对于改造那些具有复杂代谢网络的菌种来说，更具有效率和成本优势，因此，诱变育种一直是发酵工业中一种很重要的育种手段。 [0003] 近年来等离子体应用于微生物诱变育种的研究也开始起步。等离子体是与物质的固态、液态和气态并存的物质第四态，是一种正离子和电子的密度大致相等的部分电离气体。等离子体具有特殊的光、热、声、电等物理性质和化学性质，已经在臭氧合成、紫外光源的制备、高功率CO2激光器的制造等很多领域得到了广泛的应用。在以往文献和产品中，等离子体通常作为一种物理灭菌手段，具有快速、低温、操作简便、无毒性以及杀灭效果好等优点，但将等离子体用于生物诱变育种还是一个崭新的技术，相关报道较少，市场上还没有一种利用等离子体技术研制开发的生物诱变育种设备。 [0004]表1 各种诱变方法比较 目前，应用等离子体技术对固体表面进行处理的设备较多，而对微生物诱变育种的研究一直处于实验室阶段，还没有成熟的产品可以使用。由于等离子体物理过程较为复杂，并具有非线性、强耦合、变负载等特点，在实际应用中需要采用一套完善的自动化系统对其进行监测和控制，尤其是对于在常压条件下产生的低温等离子体的产品，因而限制了该技术在微生物育种领域的应用推广。目前随着等离子体技术的应用领域的不断扩展，特别是常压低温等离子体的出现和技术进步，大大克服了常规冷等离子体需要真空装置的缺点，将大力推动其在微生物育种、消毒、化学反应、材料处理等领域的应用、发展。因此，开发一种常压等离子体微生物育种设备的需求变得越来越急迫。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种等离子体微生物诱变育种设备，所述等离子体微生物诱变育种设备包括壳体和设置在壳体内的处理样品的等离子体发生器；其特征在于，在壳体内的左边为操作室2，操作室2内设置一放置样品的载物平台10，与等离子体发生器7连接的喷嘴12穿过操作室的侧壁伸进操作室内，温度传感器13和位置传感器11固定在操作室2内壁上，育种样品14放置在载物平台10上；在壳体内右边，操作室外面放置等离子体发生器7、射频电源8和控制器9；所述控制器9分别连接射频电源8、气体流量控制模块16、温度传感器13、位置传感器11、载物平台10、冷却器5和触摸屏控制板4；等离子体发生器7和射频电源8之间通过射频电源匹配模块15连接；气体流量控制模块16与等离子体发生器7连接。 [0007] 所述等离子体发生器的参数及其运行状态参量的反馈由所述射频电源8、射频电源匹配模块15及气体流量控制模块16分别进行自动或手动控制；自动或手动调节所述等离子体发生器喷嘴提供的工作气体的流量；自动或手动调节的射频电源匹配模块是用于优化等离子体发生器所在控制电路的工作参数，增大入射功率降低反射功率，提高能量利用效率；所述喷嘴与载物平台的距离由温度传感器13和位置传感器11将采集的载物平台的温度、位置信号反馈给控制器，由控制器编程控制载物平台的升降和控制冷却器的启动和停止，以及冷却液循环速度，对等离子体发生器冷却，保证稳定放电，且使产生的等离子体射流温度低于微生物的耐受温度，从而调节载物平台附近的温度；达到控制育种环境温度。 [0008] 所述冷却器安装设置在壳体内的任意位置，只要能实现其对等离子体发生器的冷却功能即可。 [0009] 所述壳体的壁上设置有用户调控所述控制器的触摸屏控制板和电源控制按钮。 [0010] 所述壳体的底部设置至少4个地脚螺栓，从而可以控制壳体保持平衡。 [0011] 本发明的有益效果是提供的一种常压等离子体微生物育种设备具有如下几个显著的特点和效果：可以精确的控制处理时间、处理功率和处理所需的工作气体流量，并通过调节加载到所述等离子体发生器上的射频电源功率控制等离子体射流温度。可以在室温、常压的条件下对微生物进行诱变，不需要将操作室抽真空，也不需要对操作室进行灭菌处理。照射过程中直接将菌液、平板上的菌落或者冻干粉直接放在载物平台上，通过旋转和升降操作可以将菌体和等离子体发生器的发射部位进行接触，即可完成照射。附图说明 [0012] 图1为等离子体微生物育种设备的整体示意图。 [0013] 图2为操作室内部结构示意图。 [0014] 图3为等离子体微生物育种设备的控制结构图。 [0015] 图4为等离子体微生物育种设备的典型工作流程图。 [0016] 图5为输入功率与等离子体温度关系曲线图，其中温度探头距发生器出口2 mm，氦气流量10升/分钟，处理时间1 min。 [0017] 图6处理时间与等离子体温度关系曲线图，其中温度探头距发生器出口2 mm，氦气流量10升/分钟，射频电源输入功率100 W。 具体实施方式[0018] 本发明提供一种等离子体微生物诱变育种设备，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。 [0019] 在图1-3所示的等离子体微生物诱变育种设备示意图中，该育种设备包括壳体和设置在壳体内的处理样品的等离子体发生器。在壳体1内的左边为操作室2，操作室2内设置一放置样品的载物平台10，与等离子体发生器7连接的喷嘴12穿过操作室的侧壁伸进操作室内，温度传感器13和位置传感器11固定在操作室2内壁上，育种样品14放置在载物平台10上；在壳体内右边，操作室外面放置等离子体发生器7、射频电源8和控制器9；所述控制器9分别连接射频电源8、气体流量控制模块16、温度传感器13、位置传感器11、载物平台10、冷却器5和触摸屏控制板4；等离子体发生器7和射频电源8之间通过射频电源匹配模块15连接；气体流量控制模块16与等离子体发生器7连接。所述冷却器5安装设置在壳体1内的任意位置，只要能实现对等离子体发生器7的冷却功能即可。所述壳体1的壁上设置有用户调控所述控制器的触摸屏控制板4和电源控制按钮3。所述壳体1的底部设置至少4个地脚螺栓6，从而可以控制壳体保持平衡。 [0020] 所述控制器为可编程控制器，通过串行电缆或现场总线与触摸屏控制板4进行实时通信，用于执行由触摸屏控制板4输入的操作指令、控制诱变育种流程并根据等离子体工作状态调整、输送控制参量。 [0021] 所述等离子体发生器的参数及其运行状态参量的反馈由所述射频电源8、射频电源匹配模块15及气体流量控制模块16分别进行自动或手动控制；自动或手动调节所述等离子体发生器喷嘴提供的工作气体的流量；控制射频电源8的开和停和功率，从而控制等离子发生器7是否工作以及运行功率，自动或手动调节的射频电源匹配模块，优化等离子体发生器所在控制电路的工作参数，增大入射功率降低反射功率，提高能量利用效率；所述喷嘴与载物平台的距离由温度传感器13和位置传感器11将采集的载物平台的温度、位置信号反馈给控制器，由控制器编程控制载物平台的升降，或通过手动控制升降载物平台10，以调节其与等离子体发生器7的喷嘴12的竖直距离。和控制冷却器的启动和停止，以及冷却液循环速度，在等离子体发生器7外部设置有冷却夹套。冷却器采用冷却液的冷却方式，冷却液在等离子体发生器的夹套中循环，对等离子体发生器进行冷却。冷却液在运行过程中不需要更换。控制器9还包括控制冷却器起停的模块。冷却器可以对等离子体发生器冷却，保证稳定放电且使产生的等离子体射流温度低于微生物的耐受温度，从而调节载物平台附近的温度；达到控制育种环境温度的目的。 [0022] 本发明中的等离子体发生器7采用在大气压、低电压条件下产生的等离子体射流对生物样品进行诱变育种，其均匀性高，温度低，避免了射流温度过高而引起大量微生物样品致死的现象；本发明方法中所使用的放电气体种类多，大大丰富了激发态活性粒子的种类，因其具有更为丰富的物理和化学效应，所以可以获得更为丰富的突变株。等离子体发生器7可以采用现有技术制造。 [0023] 图4所示为等离子体微生物育种设备的操作流程示意图。典型育种样品的完整操作流程如下：第一步 菌株优选操作 根据育种样品14的种类优选相应种类的菌株，按照出发菌株所需的目标产物量作为筛选菌株依据进行菌株的后期筛选，本发明以模式菌株大肠杆菌Escherichia coli DH5α（从中科院微生物所购买）进行诱变育种； 第二步 待处理样品载片的制备 （1）对菌体大肠杆菌Escherichia coli DH5α或者孢子进行处理：a. 菌悬液制备：将培养至对数期的菌液离心收集，生理盐水洗涤2-3次后，用生理盐水适量稀释制成菌悬液（OD600=0.8-1）； b. 孢子悬浮液制备：挑取固体培养基上的孢子菌落至装有适量生理盐水的试管中，振荡分散孢子制备孢子悬浮液，或者在斜面试管中生理盐水，振荡分散孢子制备 6 孢子悬浮液（显微镜下10 个）； （2）育种样品14的制备：在无菌条件下，将上述 a 或 b 中制得的菌悬液或者孢子液，滴加在菌物载片上，滴加量为20 μL； （3）育种样品14的风干处理：在无菌条件下，将上述步骤二（2）所制得的液体载片置于冷风下风干20min，至表面湿润且无明显液滴为最佳。 [0024] 第三步 诱变操作（1）将所制得育种样品14用镊子放置于载物平台10上的定位凹陷处，调节载物平台 10的位置和高度，使待处理样品位于等离子体发生器7的喷嘴12出口正下方，并且距离合适（参考距离为2- 3 mm）。根据预实验结果在触摸屏控制板4中设定处理时间（细菌参考处理时间1-3 min）、温度传感器探头距发生器出口2 mm，氦气流量10升/分钟，处理时间 1 min；按下触摸屏控制板4的“开始处理”按钮，开始自动处理，触摸屏控制板4以黄-黑闪烁指示灯提示“正在处理”，触摸屏控制板4上时间栏会显示剩余时间；测试等离子体输入功率与等离子体射流温度的关系（如图5所示）； （2）计时结束后（或点击触摸屏控制板4 “中断处理”按钮后），等离子体发生器7自动停止放电；打开操作室门将载片台降下，用镊子将样品载片取出，放置于准备好的装有适量灭菌生理盐水的具塞试管或者离心管中。 [0025] （3）强烈振荡具塞试管或者离心管3次，每次2分钟，间隔5分钟。将载片上的菌体彻底洗下并悬浮于生理盐水中。 [0026] 图5为所述设备输入功率与等离子体射流温度的关系图。测试条件：温度传感器探头距发生器出口2 mm，氦气流量10升/分钟，处理时间1 min。 [0027] 图6为所述设备处理时间与等离子体射流温度的关系图。测试条件：温度传感器探头距发生器出口2 mm，氦气流量10升/分钟，射频电源输入功率100 W。 [0028] 表2 为所述设备对模式菌株大肠杆菌Escherichia coli DH5α（从中科院微生物所购买）进行诱变育种的致死率实验数据（样品载片距离等离子体发生器出口2 mm，氦气流量10升/分钟，射频电源输入功率100 W）表2等离子体微生物育种试验结果 处理时间 未处理 10s 30s 60s 120s 180s 菌落数(×107) 560 389 156 88 0.8 0.06 致死率 0% 30.54% 72.14% 84.29% 99.86% 99.99% 本设备功能完善、方法操作简易，可以在常压的条件下将气体激发，产生出等离子体，在生物技术领域有良好的应用前景。 |
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