用于诊断阿扎胞苷耐药性的试验 |
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| 申请号 | CN201380013105.4 | 申请日 | 2013-02-28 | 公开(公告)号 | CN104321649A | 公开(公告)日 | 2015-01-28 |
| 申请人 | 尼斯-索菲亚·安蒂波利斯大学; 尼斯大学中心医院; 国家健康和医学研究院; | 发明人 | 托马斯·克鲁塞奥; 帕特里克·奥伯格; 基洛姆·罗伯特; 弗雷德里克·卢西亚诺; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及使用包含在取自患者 生物 流体 样品中的BCL2L10 蛋白质 ，预测所述患者对阿扎胞 治疗 苷治疗的耐药性的体外分析方法以及特异性结合BCL2L10蛋白质的生物分子。其特征在于从患者中取出生物流体样品；计算所述生物流体样品中表达BCL2L10蛋白质的总细胞的百分比；将该计算的百分比与参比 阈值 进行比较，该阈值介于20％和60％之间；并所述生物流体中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比大于所述参比值的患者被诊断为对阿扎胞苷治疗有耐药性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种使用包含在取自患者的生物流体样品中的BCL2L10蛋白质以及特异性结合BCL2L10蛋白质的生物分子，使得可诊断所述患者的阿扎胞苷治疗耐药性的体外分析方法，其特征在于： |
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| 说明书全文 | 用于诊断阿扎胞苷耐药性的试验技术领域背景技术[0002] [0003] 具有上式的阿扎胞苷是目前患有不适于造血干细胞移植的骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓细胞白血病(AML)的患者的唯一被认可的治疗。阿扎胞苷还使用的名称销售用于治疗这些疾病。 [0004] 阿扎胞苷(AZA)是一种在这两种疾病中产生40％-60％反应的低甲基化剂(hypomethylating agent)。 [0005] 骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓细胞白血病(AML)是发生于骨髓干细胞的髓系血液病，骨髓干细胞包含相当于白细胞的粒细胞系的前体、相当于红细胞的成红细胞系的前体、相当于血小板的巨核细胞系的前体和组织-单核细胞系的前体。MDS的特征在于粒细胞、红细胞和巨核细胞骨髓细胞系的一种或所有三种的严重成熟障碍(其是引起血细胞减少症的原因)。DMS可发展成为急性白血病(AL)。传统上，诊断以血液和骨髓的细胞学研究、细胞遗传学和分子生物学为基础。DMS包括各种类型的贫血或难治性血细胞减少症以及5q-综合征。 [0006] AML的特征在于粒细胞、红细胞和巨核细胞系三种的骨髓前体的快速增殖，导致不成熟细胞在血液和骨髓中蓄积，破坏了正常的血细胞生成。其诊断基于与用于MDS的相同技术。AML包括未分化型AML、极低分化型AML、髓细胞性白血病、单核细胞性白血病、粒-单核细胞性白血病以及急性红细胞性白血病和急性成巨核细胞性白血病。原发性或继发性AML可能是在各种器官或组织(皮肤、神经节、乳腺、消化道、脾等)中形成肿瘤的原因，产生了髓系肉瘤，亦称绿色瘤或粒细胞肉瘤。AML可表现为急性白血病，并且与恶性淋巴瘤一起提出了诊断难题。 [0007] 用阿扎胞苷治疗的MDS或AML患者对阿扎胞苷有耐药性(“AZA耐药”)或对阿扎胞苷敏感(“AZA敏感”)。然而，甚至“AZA敏感”患者在差不多的一段时间过去后，似乎都遭到全身性复发。 [0008] 换句话说，即使40％用阿扎胞苷治疗的患者立即有耐药性，且约60％的患者在最初数月对所述治疗敏感，全部患者在短期或中期都将发生对这种治疗的耐药性。这种现象在传统上被称为复发，是指对患者以前对之敏感的治疗产生耐药性。 [0009] 现行的预后评级系统使得可能预测和预计用低甲基化剂治疗的患者的总体生存。这些系统基于患者亚群中所评价的预后评分。这些是由患者的核型研究和某些临床特征限定的风险群。然而，与这些评级系统有关的结果是不可靠的反应预测因子。 [0010] MDS患者中有一半具有正常核型，并且具有相同染色体异常的患者常常在临床上是异质的。体细胞点突变常见于MDS。基因TP53、EZH2、ETV6、RUNX1和ASXL1的突变是MDS患者中总体生存率低的预测因子，其独立于其它已确立的危险因子。 [0011] 然而，现有系统不提供在不给予患者所述治疗的情况下能够诊断患者对阿扎胞苷的敏感性的合适结果。 [0012] 目前，用于测定患者是否对阿扎胞苷治疗有耐药性的唯一的已知方法是将所述治疗给予患者至少6个月，并确定所述治疗是否有效果。 [0013] 使用该相同方法来鉴定患者的复发。实际上，目前已知的鉴定患者复发的唯一方法是确定阿扎胞苷治疗对患者不再有效的时间。不存在在相关症状出现之前能够预测这种复发的时间的方法。 [0014] 当被建议用于MDS和/或AML患者时，阿扎胞苷治疗是每日皮下注射至上臂、大腿或腹部7天，接着21天的休息期。可能产生多种较严重或不太严重的不良反应，例如颅内出血、败血症、血压变化、嗜睡、全身不适感和脱发。另外，阿扎胞苷治疗的费用相当可观。每年治疗约为80,000欧元。因此目前没有可靠且便宜地诊断患者对阿扎胞苷治疗是敏感还是耐药的方法。 [0015] 另外，目前需要预测患者对阿扎胞苷治疗的耐药性以避免将阿扎胞苷给予该治疗对其无效的患者，不论是从其给药开始无效，还是在所述患者产生耐药性的数月之后无效。实际上，将这类治疗给予耐药患者是强制性的，对患者可能是有危险的，并且还可产生相当大的不必要的费用。这适用于建议MDS和/或AML患者阿扎胞苷治疗的两种情况，并适用于所有治疗性阿扎胞苷治疗。实际上，阿扎胞苷耐药性与阿扎胞苷分子有关，而非其给予的方式。 [0016] 更快地鉴定立即产生耐药性的患者以及最初是敏感的患者的复发时间的能力也是有利的，因为它使得可能在所述患者的临床病况恶化之前提供其它的临床试验。 [0017] 因此能够尽早诊断是必要的，不论患者将对阿扎胞苷治疗敏感，还是能够预测患者的复发时间。 [0020] BCL2L10基因是具有体外促凋亡作用的Bcl-2家族的成员。BCL2L10蛋白质与Bcl-2蛋白家族都具有BH1、BH4和BH2结构域。作为Bcl-2家族促凋亡因子特有的BH3结构域不存在于BCL2L10蛋白质中。然而，在有关BCL2L10的促凋亡或抗凋亡性质的文献中仍然有相互矛盾的结果，特别是因为其在小鼠中的假定的直向同源物(ortholog)也被描述为具有促凋亡活性。 [0021] BCL2L10可与Bcl-2家族的成员，特别是Bcl-2、Bcl-xL和Bax相互作用，以调节不同情况下的细胞凋亡。某些出版物例如论文“Loss of BCL2L10 protein expression as prognostic predictor for poor clinical outcome in gastric carcinoma(BCL2L10蛋白质表达丧失作为胃癌中临床结局差的预后预测因子),Histopathology2010,57,814-82”提出BCL2L10是一种抗凋亡基因。 [0022] BCL2L10的过量表达被描述为通过抑制由线粒体释放的细胞色素C遏制细胞凋亡。 [0023] 最近表明，低甲基化剂地西他滨引发细胞凋亡和许多基因(包括BCL2L10)的正调节，亦称“增量调节”。现今，已表明患者对某些抗癌治疗的抗性和BCL2L10基因的表达之间有关系，特别在专利申请JP2010162031(A)中，该申请描述了这样的事实，即BCL2L10基因的扩增使得能够检测对基于喜树碱的治疗有耐药性的癌细胞。同样，专利申请US2009143236(A1)描述了通过研究某些基因(特别包括BCL2L10)的扩增来检测某些药物耐药性获得的方法。然而，在这两项专利申请中，对其耐药性进行了评价的抗癌剂不包括阿扎胞苷。 [0024] 专利申请US2011/0129833表明患者中Bcl-2家族基因表达的增加与将响应化疗治疗的患者的可能性降低关联。然而，该专利申请中丝毫未提到这个结论适用于基于阿扎胞苷的治疗。 [0025] 论 文“Role of BCL2L10 methylation and TET2 mutations in higher risk myelodysplastic(较高危骨髓增生异常中BCL2L10甲基化和TET2突变的作用),Leukemia.2011 Dec；25(12)”描述了阿扎胞苷耐药性的现象。该文件描述了BCL2L10基因启动子的甲基化和阿扎胞苷耐药性之间的关联的存在。具体地讲，BCL2L10基因启动子过度甲基化与患有胃癌的患者的低生存率关联。该出版物教导了具有高甲基化的BCL2L10启动子的患者患MDS的风险高和响应外遗传治疗(例如阿扎胞苷治疗)的机会小。然而，该出版物丝毫未教导BCL2L10蛋白质的高水平表达能够得出相同结论。 [0026] 取而代之的是，该出版物提出正是BCL2L10表达的低水平与响应阿扎胞苷的机会小有关。另外，即使高水平的BCL2L10甲基化确实与对阿扎胞苷治疗的耐药性有关，这个数据也不会与BCL2L10蛋白质的表达水平相关联。实际上，基因的甲基化水平不必与产生自所述基因的蛋白质的表达有关。特别是在BCL2L10的情况下。 [0027] 另外，鉴于上述先有技术，丝毫未提出在BCL2L10蛋白质的表达水平和阿扎胞苷耐药性现象之间存在联系。并且更加丝毫未提出在BCL2L10蛋白质的高表达水平和阿扎胞苷耐药性之间存在关系。 发明内容[0028] 所述问题的解决办法涉及使用包含在取自所述患者的生物流体样品中的BCL2L10蛋白质以及特异性结合BCL2L10蛋白质的生物分子，使得可诊断患者的阿扎胞苷治疗耐药性的体外分析方法，其特征在于： [0029] -从患者中取得生物流体样品； [0030] -计算所述生物流体中表达BCL2L10蛋白质的总细胞的百分比； [0031] -将所述计算的百分比与参比阈值进行比较，所述阈值介于20％和60％之间；和[0032] -所述生物流体中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比高于所述参比值的患者被诊断为对阿扎胞苷治疗有耐药性。 [0033] 出乎意料的是，本申请人表明在表达BCL2L10蛋白质的患者生物流体细胞的百分比和阿扎胞苷耐药性之间关系的存在。 [0034] 以前从未提出用于该百分比的参比阈值的测定，超出该参比阈值，便可断定患者对阿扎胞苷耐药。 [0035] 这种方法使得可能在给予患者所述阿扎胞苷分子之前诊断出患者的阿扎胞苷耐药性。这种方法还使得可能有利地预测之前对阿扎胞苷治疗敏感的患者的复发。 [0036] 本发明的分析方法使得可避免用阿扎胞苷对患者的任何不必要的治疗。因此就患者的健康和适当治疗而言，以及经济观点来看，这是有利的。本发明的第二个目的涉及能够进行本发明的体外分析方法的用于体外分析的试剂盒，所述试剂盒包括特异性结合从取自患者的生物流体获取的细胞中的BCL2L10蛋白质的生物分子。 [0037] 最后，本发明的第三个目的涉及本发明的体外分析试剂盒用于实施监测阿扎胞苷治疗以预测复发的方法中的用途。 [0039] 在阅读下列有关附图给出的非限制性描述，将更好地理解本发明，其中： [0040] 图1显示筛选获自表达Bcl-2蛋白的SKMl细胞系的细胞的结果。SKMl-S和SKMl-R细胞用1μΜ阿扎胞苷处理24小时。然后进行蛋白质印迹实验以评价Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xl和BCL2L10蛋白质的量。抗HSP60抗体用作加载对照。 [0041] 图2-6显示患AML的SKMl-S和SKMl-R细胞系中BCL2L10蛋白质的表达。 [0042] 在图2、3和4中，通过流式细胞术，定量测定SKMl-S和SKMl-R细胞中的BCL2L10蛋白质水平。 [0043] 图5显示通过逆转录酶聚合链式反应(称为RT-PCR)进行的SKMl-S和SKMl-R细胞的mRNA分析。 [0044] 图6显示能够观察SKMl-S和SKMl-R细胞中BCL2L10蛋白质水平的蛋白质印迹结果。 [0045] 图7-10显示SKMl-R细胞对阿扎胞苷重新敏感，接着消除BCL2L10基因表达。BCL2L10基因表达的消除通常称为“敲减”，在这种情况下为BCL2L10敲减。 [0046] SKMl-S和SKMl-R细胞用以下干扰RNA转染：Luc siRNA、BCL2L10siRNA或Bcl-2 siRNA。转染72小时后，细胞用1μM阿扎胞苷刺激。 [0047] 图7中，通过XTT试验(木糖耐量试验)，在刺激24小时后测量细胞代谢。所示结果等于进行了4次的3个独立实验的平均值的平均标准误差(±SEM)。 [0048] 图8显示在加入1μM阿扎胞苷后24小时通过流式细胞术观察到的胱天蛋白酶-3标记的结果。 [0049] 图9显示在加入1μM阿扎胞苷后24小时通过流式细胞术所得的碘化丙锭(PI)标记的结果。 [0050] 图10显示为了测定BCL2L10和Bcl-2表达的抑制在加入1μM阿扎胞苷后24小时进行的蛋白质印迹的结果。 [0051] 图11、12和13中，显示了BCL2L10的蛋白质表达在阿扎胞苷耐药患者中特异性增加。 [0052] 图11显示通过对7名健康患者、7名阿扎胞苷敏感患者和5名阿扎胞苷耐药患者的“新鲜”骨髓样品进行蛋白质印迹检出的BCL2L10、Bcl-2和ERK蛋白质的表达。显示了各亚群中两名患者的蛋白质印迹结果。 [0053] 图12显 示 借 助 ImageJ软 件 程 序(ImageJ是 由 National Institute of Health(NIH)编写于Java中的用于图像处理的免费软件程序)分析的BCL2L10和ERK蛋白质表达及BCL2L10表达与ERK表达的比率的定量测定。 [0054] 图13显示借助ImageJ软件程序分析的BCL2L10和ERK蛋白质表达的定量测定及BCL2L10表达与ERK表达的比率的定量测定。 [0055] 图14-17显示阿扎胞苷耐药MDS或AML患者中，骨髓中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比增加的事实。 [0056] 图14中，在患有32名患MDS或AML并正进行阿扎胞苷治疗的患者中和在8名健康患者(全部来自组群1)中，通过流式细胞术，定量测定表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比。 [0057] 图15中，通过流式细胞术，定量测定冷冻于DMSO的样品中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比，所述样品来自14名患有低危MDS的患者、31名患有高危MDS或AML且用阿扎胞苷治疗的患者(全部来自组群2)。 [0058] 通过流式细胞术，定量测定冷冻于DMSO的样品中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比，所述样品来自16名患有高危MDS的患者或诊断中的患者，如图16所示。 [0059] 通过流式细胞术，定量测定冷冻于DMSO的样品中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比，所述样品来自15名全都正在进行阿扎胞苷治疗的患有高危MDS或AML的患者，如图17所示。 [0060] 图18a和18b显示表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比和接受治疗的MDS或AML患者的总体生存之间的相关性。 [0061] 按照Kaplan-Meier，检查了用AZA治疗的MDS或AML患者的具有 移植(transplantation)的总体生存的比较，以及其骨髓中表达BCL2L10的细胞的百分比。 [0062] 图19-22使得可证实通过流式细胞术进行的BCL2L10蛋白质定量技术。 [0063] 图19中，HEK293系的细胞用以下转染：并入BCL2L10的Myc表位标签N端部分的pcDNA3表达质粒或并入仅Myc表位标签的N端部分的pcDNA3表达质粒。通过流式细胞术定量测定BCL2L10蛋白质表达水平。该实验的结果见图19。 [0064] 图20中，HEK293系的细胞用干扰siLuc RNA或干扰si-BCL2L10 RNA转染。通过流式细胞术定量测定BCL2L10蛋白质表达水平。该实验的结果见图20。 [0065] 图21和22显示通过蛋白质印迹检测的BCL2L10蛋白质水平。抗HSP60抗体用作加载对照。 具体实施方式[0066] 本发明涉及分析尤其通过对生物流体总细胞的BCL2L10蛋白质表达进行定量测定能够体外诊断患者对阿扎胞苷治疗耐药性的方法。 [0067] 按照本发明，患者是人类。有利的是，该分析方法特别适于恶性血液病(例如髓系血液病)的患者。再准确地说，患者患有AML或MDS。 [0068] 按照本发明，生物流体是从人体获得的流体。作为生物流体的非限制性实例，可提及骨髓、血液、脑脊液和尿液。优选本发明的生物流体是骨髓。 [0069] 按照本发明，术语“总细胞”涵盖存在于所采集的生物流体中的全部细胞。如果所采集的生物流体是骨髓，总细胞特别包括造血干细胞(HSC)和骨髓间质细胞，它们是造血细胞。 [0070] 按照本发明，特异性结合BCL2L10蛋白质的生物分子是能够特异性结合BCL2L10蛋白质的分子。有利的是，这些是单克隆或多克隆抗体、可溶性受体或适配体，优选单克隆或多克隆抗体。还优选特异性结合BCL2L10蛋白质的生物分子为单克隆抗体。作为特异性结合BCL2L10蛋白质的生物分子的非限制性实例，可提及“Cell Signaling Technologies”公司参考号为“#3869”的抗BCL2L10蛋白质。 [0071] 按照本发明，参比阈值，亦称“截止”值，相当于生物流体中BCL2L10阳性细胞的百分比，即表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比。 [0072] 当所获得的生物流体总细胞中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比值大于该“截止”值时，受测试的患者可诊断为对阿扎胞苷耐药。相反地，当所获得的值低于该“截止”值时，受测试的患者可诊断为对阿扎胞苷敏感。 [0073] 按照本发明，参比阈值介于20％和60％之间，优选介于30％和55％，更优选该参比阈值等于50％。 [0074] 本发明的分析方法使得可诊断患者对阿扎胞苷治疗有耐药性。所述用阿扎胞苷治疗的患者在其治疗期间每1、3和6个月然后在之后每3个月通常必须进行骨髓抽吸。因此，所采集的作为阿扎胞苷治疗传统监测一部分的骨髓样品还可用于本发明的分析方法。因此就这种对阿扎胞苷治疗有耐药性的诊断而言，不一定在患者中进行特定的骨髓抽吸。 [0075] 换句话说，鉴于所述体外分析方法能够诊断患者的阿扎胞苷耐药性，因此不必进行在传统治疗情况下对所抽吸的骨髓样品进行的额外检查，这对患者是有利的。 [0076] 按照本发明，生物流体中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比的测量通过流式细胞术(免疫分型)、疏水作用色谱法(HIC)或定量聚合酶链式反应(qPCR)进行。优选这种测量通过流式细胞术(免疫分型)进行。 [0077] 本发明还涉及通过检测包含在取自所述患者的生物流体样品中的BCL2L10基因的过量表达，能够诊断患者的阿扎胞苷治疗耐药性的体外分析方法，其特征在于： [0078] -从患者中取得生物流体样品； [0079] -通过检测BCL2L10基因的过量表达，计算所述生物流体中表达BCL2L10的总细胞的百分比； [0080] -将所述计算的百分比与参比阈值进行比较，所述阈值介于20％和60％之间；和[0081] -所述生物流体中表达BCL2L10的细胞的百分比大于所述参比阈值的患者被诊断为对阿扎胞苷治疗有耐药性。 [0082] BCL2L10基因过量表达的检测优先通过比较基因组杂交CGH方法、流式细胞术方法、ELISA方法、DNA芯片方法或定量聚合链式反应(quantitative polymerization chain reaction)(qPCR)进行。BCL2L10基因过量表达的检测更优先通过比较基因组杂交CGH方法、DNA芯片方法或定量聚合链式反应(qPCR)进行。BCL2L10基因过量表达的检测还更优先通过DNA芯片方法或定量聚合链式反应(qPCR)进行。 [0083] 本发明还涉及包含特异性结合取自患者的生物流体样品的细胞中的BCL2L10蛋白质的生物分子的体外分析试剂盒，所述试剂盒使得可预测所述生物流体中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比大于介于20％和60％之间的参比阈值的患者对阿扎胞苷治疗有耐药性。 [0084] 还涉及包含选自以下的至少一种试剂的体外分析试剂盒： [0085] -能够扩增BCL2L10片段的一对引物，和 [0086] -能够检测BCL2L10存在的探针， [0087] 所述试剂盒使得可预测所述生物流体中表达BCL2L10的细胞的百分比大于介于20％和60％之间的参比阈值的患者对阿扎胞苷治疗有耐药性。 [0088] 本发明的另一个目的涉及本发明的试剂盒或方法在实施监测阿扎胞苷治疗以预测复发的方法中的用途。 [0090] 按照本发明的一个具体实施方案，当患者特别是患有骨髓增生异常综合征和/或急性髓细胞白血病的患者诊断出阿扎胞苷治疗耐药性时，将包括至少一种抗肿瘤药和/或抗炎药在内的替代治疗给予所述患者。 [0092] 作为可按照本发明使用的抗肿瘤药的非限制性实例，特别可提及阿卡地新(亦称AICAR，为5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-呋喃核糖苷的简称)、阿卡地新的衍生物、放线菌素D、安吖啶、蒽环类例如多柔比星或柔红霉素、阿糖胞苷(aracytin)、ATRA(全反式维甲酸)、博来霉素、硼替佐米、白消安、喜树碱的衍生物、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、地西他滨、德巴金(depakine)、多西他赛、表鬼臼毒素的衍生物、埃罗替尼、依托泊苷、5-氟尿嘧啶(5FU)、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、来那度胺、甲氨蝶呤、丝裂霉素C、紫杉醇、普卡霉素、巯基嘌呤、塞替派、长春新碱、长春碱和长春瑞滨。还可提及用于不同肿瘤病理学的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，例如伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼和舒尼替尼。 [0093] 可以使用的阿卡地新的衍生物、其外消旋体、对映体和非对映体及其混合物、其互变异构体及其药学上可接受的盐优选具有以下通式： [0094] [0095] 其中： [0096] -R1选自 [0098] --呈吡喃形式具有是游离的或被一磷酸基、二磷酸基或三磷酸基的一个或多个任选取代的OH基团的己糖基团(或其前药)或乙酰基， [0099] --被一个或多个具有1-4个碳原子的取代的烷基或氨基任选取代的萘基，[0100] --被一个或多个具有1-4个碳原子的取代的烷基或氨基任选取代的苄基，[0101] --苯基、联苯基和杂芳基； [0102] -R2选自： [0103] --酰胺基-CONH2、-CONHMe、-CONHEt、-CON(Me)2、-CON(Et)2， [0104] --酸基或酯基-CO2H、CO2Me、CO2Et、氰基或脒基-CN、-C(NH2)NH、-C(NHMe)NH、-C(NHEt)NH， [0105] --被选自Cl、Br、I和F的卤素任选取代的苯基， [0106] --噻吩基团， [0107] --具有3-10个碳原子的直链或支链碳链，或 [0109] -R3选自： [0110] --卤素基团， [0111] --呋喃或-CO-呋喃基团， [0112] --噻吩或-CO-噻吩或-C≡C-噻吩基团， [0113] --甲苯甲酰基， [0114] --炔烃基团， [0115] ---CO-(CH2)n-CH3基团，其中n介于2和9之间， [0116] --被卤素任选取代的苯基或-C≡C-苯基， [0117] ---C≡C-CO2Me、-C≡C-CO2Et、-C≡C-CONH2基团， [0118] ---C≡C-(CH2)6CH3基团，或 [0119] ---C≡C-2-甲氧基萘基。 [0120] 阿卡地新衍生物更优先为具有以下通式的化合物、其外消旋体、对映体和非对映异构体及其混合物、其互变异构体及其药学上可接受的盐： [0121] [0122] 其中R1为 [0123] [0124] 或 [0125] [0126] 或 [0127] [0128] 或 [0129] [0130] 和 [0131] -当R1为β-D-核糖基团时，则： [0132] --R2＝CONH2，R3＝Cl、CO-呋喃、CO-噻吩或甲苯甲酰基； [0133] 或 [0134] --R2＝CO2Me，R3＝I或炔烃； [0135] 或 [0136] --R2＝苯基，R3＝I； [0137] -当R1为三-O-乙酰基-β-D-核糖基团时，则： [0138] --R2＝CO2Et，R3＝CO-(CH2)5-CH3、CO-呋喃、甲苯甲酰基、-C≡C-CO2Et、噻吩或苯基； [0139] 或 [0140] --R2＝苯基，R3＝-C≡C-苯基； [0141] 或 [0142] --R2＝噻吩，R3＝-C≡C-噻吩； [0143] 或 [0144] --R2＝(CH2)6CH3，R3＝-C≡C-(CH2)6CH3； [0145] 或 [0146] --R2＝对氟苯基，R3＝-C≡C-对氟苯基； [0147] 或 [0148] --R2＝2-甲氧基萘，R3＝-C≡C-2-甲氧基萘； [0149] -当R1为4-甲基苄基时，则： [0150] --R2＝CO2Et，R3＝-C≡C-CO2Et； [0151] 或 [0152] --R2＝苯基，R3＝-C≡C-苯基； [0153] -当R1为2-萘基(萘-2-基-甲基)基团时，则： [0154] --R2＝CO2Et，R3＝I； [0155] 或 [0156] --R2＝CO2Et，R3＝-C≡C-CO2Et； [0157] 或 [0158] --R2＝苯基，R3＝-C≡C-苯基。 [0159] 作为可以使用的阿卡地新衍生物的非限制性实例，可提及下列化合物： [0160] -1'-(4-乙氧 羰 基-5-碘-[1,2,3]-三 唑-1-基)-2',3',5'- 三-O-乙 酰基-β-D-呋喃核糖； [0161] -1'-(4-氨甲酰基-5-碘-[1,2,3]-三唑-1-基)-β-D-呋喃核糖； [0162] -1'-(4-甲氧羰基-5-乙炔基-[1,2,3]-三唑-1-基)-β-D-呋喃核糖； [0163] -1-(萘基-2-甲基)-4-乙氧羰基-5-碘-1,2,3-三唑； [0164] -1-(萘基-2-甲基)-4-乙氧羰基-5-乙基丙炔酸-1,2,3-三唑； [0165] -1'-(4-乙氧羰基-5-乙基丙炔酸-[1,2,3]-三唑-1-基)-2',3',5'-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖； [0166] -1'-(4-乙氧羰基-5-(2-噻吩基)-[1,2,3]-三唑-1-基)-2',3',5'-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖； [0167] -1'-(4-乙氧羰基-5-苯基-[1,2,3]-三唑-1-基)-2',3',5'-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖； [0168] -1-(4-甲基苄基)-4-乙氧羰基-5-乙基丙炔酸-1,2,3-三唑； [0169] -1'-(4-庚基-5-(壬-1-炔-1-基)-[1,2,3]-三唑-1-基)-2',3',5'-三-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖； [0170] -1'-(4-乙氧羰基-5-乙基丙炔酸-[1,2,3]-三唑-1-基)-2',3',5'-三-O-苯甲酰基-β-L-呋喃核糖； [0171] -2'- 脱 氧 -1'-(4- 乙 氧 羰 基 -5- 乙 基 丙 炔 酸 -[1,2,3]- 三唑-1-基)-3',5'-二-O-(对甲苯甲酰基)-α-D-呋喃核糖； [0173] -1'-(4-乙氧羰基-5-乙基丙炔酸-[1,2,3]-三唑-1-基)-2',3'-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖； [0174] -1'-(4-乙氧羰基-5-乙基丙炔酸-[1,2,3]-三唑-1-基)-2',3'-O-异亚丙基-5'-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖； [0175] -1'-(4-乙氧羰基-5-(2-噻吩基)-[1,2,3]-三唑-1-基)-2',3'-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖；和 [0176] -1'-(4-乙氧羰基-5-(2-噻吩基)-[1,2,3]-三唑-1-基)-2',3'-O-异亚丙基-5'-O-乙酰基-β-D-呋喃核糖。 [0177] 进行了研究以证实本发明的某些优势。在下面的实施例中提供了这些研究的结果： [0178] 实施例1：用于检测BCL2L10的血细胞计数技术的验证。 [0179] 产生了细胞凋亡和自噬过程两个方面有缺陷的对阿扎胞苷(AZA)耐药的SKMl细胞，称为“SKMl-R”。与其AZA敏感同源物(称为“SKMl-S”)相比较，SKMl-R细胞显示BCL2L10蛋白质(Bcl-B)的表达增加，除SKMl-R和SKMl-S细胞以外，Bcl-2家族的抗凋亡成员显示同等水平的Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1蛋白质，如图1所示。 [0180] BCL2L10蛋白质表达的增加还存在于有限稀释前的SKMl-R细胞团中，表明了BCL2L10的过量表达与阿扎胞苷(AZA)耐药性有关，并且不是克隆作用引起的。为了分析BCL2L10的蛋白质表达，开发出对HEK293细胞的血细胞计数试验。 [0181] 为此，HEK293细胞先用带Myc标签的BCL2L10构建体“Myc-BCL2L10”转染，并使用抗Myc抗体评价转染的效能，如图19所示。使用抗BCL2L10单克隆抗体，通过蛋白质印迹证实了BCL2L10蛋白质的表达，如图21所示。 [0182] 为了证实流式细胞术实验，使用了一种特殊的siRNA，以消除HEK293细胞中BCL2L10基因的表达。 [0183] 在这种情况下，分别通过蛋白质印迹或流式细胞术，均检不出BCL2L10蛋白质的表达和标记的BCL2L10，分别如图22和20所示。这证实了我们的基于BCL2L10蛋白质的检测的血细胞计数实验。 [0184] 实施例2：涉及SKMl细胞的阿扎胞苷耐药性的BCL2L10的过量表达。 [0185] 采用图19-22中描述的测定法，证实了与仅39％的SKMl-S细胞相比，73％的SKMl-R细胞表达BCL2L10蛋白质，如图2-4所示。通过RT-PCR和蛋白质印迹，在SKMl-R细胞中检出BCL2L10 mRNA和BCL2L10蛋白质表达的增加，分别如图5和6所示。 [0186] 为了确定BCL2L10的过量表达是原因而非阿扎胞苷耐药性的结果，SKMl-S和SKMl-R细胞用对照siRNA或针对BCL2L10或Bcl-2蛋白的一种或另一种的siRNA转染，然后用或不用阿扎胞苷处理24小时后，测定细胞存活力和细胞凋亡。图7显示阿扎胞苷在SKMl-S细胞中，而非SKMl-R细胞中导致细胞代谢损失，如图5所示。BCL2L10基因的表达的消除能够恢复SKMl-R细胞的阿扎胞苷敏感性，表明了BCL2L10在阿扎胞苷耐药性现象中的重要作用。另外，细胞凋亡是消除BCL2L10基因的表达能够通过增加活性胱天蛋白酶-3的量使阿扎胞苷敏化的主要机制。 [0187] 另外，在用BCL2L10 siRNA处理的SKMl-R细胞中，检出标记的碘化丙锭(PI)，如图8和9所示。这种作用对于BCL2L10是特异性的，因为针对Bcl-1蛋白质的siRNA在相同条件下不能检出，如图8和9所示。最后，在图10中，通过蛋白质印迹验证了两种siRNA在阻断其相应靶的表达方面是非常有效的。我们的数据一旦汇总，便可证实，BCL2L10蛋白质的过量表达是引起SKMl-R细胞的阿扎胞苷耐药性的原因。 [0188] 实施例3：BCL2L10的过量表达能够预测MDS患者的阿扎胞苷耐药性。 [0189] 当待分析的材料的量足够时，通过蛋白质印迹，还分析了患者样品的BCL2L10表达。图11-13中所呈现的结果表明，BCL2L10水平/BCL-2水平是可根据患者而变化的。ERK蛋白质用作各患者样品的内部对照。这使得可表明BCL2L10相对于ERK的蛋白质表达在健康患者中非常低，如图12所示。相反地，Bcl-2蛋白的表达在3组患者中无显著不同，如图13所示。结果表明，BCL2L10的表达能够预测MDS患者的阿扎胞苷耐药性。 [0190] 实施例4：BCL2L10蛋白质的表达是MDS患者阿扎胞苷耐药性的生物标志物。 [0191] 对于组群1，采用流式细胞术实验，测定了8名健康患者、24名阿扎胞苷敏感患者和8名阿扎胞苷耐药患者的骨髓中表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比。下表1、2A和2B中提供各患者的临床特征。 [0192] 表1(敏感患者)： [0193] [0194] [0195] 表2A(耐药患者)： [0196] [0197] 表2B(健康患者)： [0198] [0199] 如图14所示，健康患者和阿扎胞苷敏感患者新分离的骨髓样品中表达BCL2L10蛋白质的细胞的平均值分别为0％(其值的范围为0-18％)和8％(其值的范围为0-40％)，而阿扎胞苷耐药患者骨髓细胞中表达BCL2L10蛋白质的细胞的平均值为85％(其值的范围为57％-99％)，其中p值<0.0001，如图11所示。当将14名患有低危MDS的患者的样品分别与21名阿扎胞苷敏感患者和10名阿扎胞苷耐药患者(全部来自组群2)的样品比较时，发现患有低危MDS的患者表达BCL2L10的细胞的中位值为0％，极端值为0％和11％。图15还显示与敏感患者的10％相比，阿扎胞苷耐药患者具有较高百分比的表达BCL2L10蛋白质的细胞，等于33％(p<0.0001)。另外，根据图8所述患者组，产生分析亚群。10名“最初”对阿扎胞苷不应的受测试患者表达BCL2L10的细胞的百分比等于29％，大于6名在诊断时对阿扎胞苷敏感的受测试患者的百分比，其为10％。这些结果见图16(p＝0.023)。在复发时，4名“最初”对阿扎胞苷敏感的受测试患者显示表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比等于23％，因此比11名进行治疗的对阿扎胞苷敏感的受测试患者(其表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比等于14％)的高，如图17所示(p＝0.0002)。 [0200] 实施例5：表达BCL2L10蛋白质的细胞的百分比预测MDS患者和AML的总体生存。 [0201] 对于参比阈值，亦称“截止”值，等于生物流体总细胞中50％的细胞表达BCL2L10蛋白质，该试验使得可获得优异的阳性和阴性预测。总的来讲，试验的灵敏度和特异度分别为80％和85％。 [0202] 根据BCL2L10的定量数据，监测时间中位值为4个月，极端值为0.1个月和7.5个月，比起强表达BCL2L10的亚群，弱表达BCL2L10的亚群中组群1的总体生存(OS)显著较好(p＝0.0016)，如图18a所示。图18b所示曲线显示在较长的一段时间内(约15个月，相对于约6个月)，在用阿扎胞苷治疗的患有MDS或AM的患者中表达BCL2L10的细胞的百分比和总体生存(OS)的相关性。该图18b显示两组其骨髓中具有大约50％表达BCL2L10的细胞、用AZA治疗的MDS或AML患者的Kaplan-Meier总体生存曲线。 [0203] 与强表达BCL2L10的亚群的51％相比，弱表达BCL2L10的亚群3个月的总体生存率估计为95％。对于强表达BCL2L10的亚群的全部患者，疾病发展。 |
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