[0001] 本发明涉及诊断方法和工具。特别地，本发明涉及诊断怀孕受试者是否有在短期内患先兆子痫的风险的方法，所述方法包括：(a)在所述受试者的第一和第二样品中，确定生物标志物sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量，其中，所述的第一样品在所述第二样品之前获得，(b)由在所述第一样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第一比例，以及由在所述第二样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第二比例，和(c)比较所述第一比例和第二比例的值，如果与所述第一比例的值相比，所述第二比例的值增长了至少约3倍，即诊断受试者有在短期内患先兆子痫的风险。本发明还涉及区分有患早期发作先兆子痫(early-onset-preeclampsia)风险的孕妇和没有患早期发作先兆子痫风险的孕妇的方法。此外，本发明还包含实施所述方法的设备和试剂盒。并涉及如本文中所述执行优化的患先兆子痫风险评估的系统，以及实施本文中所述方法所用的试剂和试剂盒。

[0002] 妊娠可能具有不同的并发症，其一方面，与怀孕妇女的妊娠相关死亡率有关，另一方面，也与新生儿的发病率和死亡率上升相联系。每100000个活产(live births)14.5人次的母亲死亡率，在39岁以上的怀孕妇女中更为常见，其可能是由于出血、血栓形成性肺栓塞(thrombotic pulmonary embolism)、感染、心肌病、心血管和非心血管病，以及高血压疾病所导致，其中，先兆子痫最为常见(Berg2010,Obstretics and Gynecology:116:1302–1309)。

[0003] 先兆子痫与大约2％到8％的妊娠妇女并发，并且是世界范围内导致母亲和胎儿死亡的主要原因(Duley2009,Semin Perinatol:33:130–37)。先兆子痫一般被定义为妊娠相关或诱导的高血压，以高血压和蛋白尿为特征。此处的高血压定义为，在两次独立测量中的血压为140mmHg(收缩期的)到90mmHg(舒张期的)或以上，其中所述的两次测量间隔至少6小时。蛋白尿显示为24小时尿样中蛋白质在300mg/dL或以上。但是，先兆子痫的定义容易产生争议，在不同的专业学会中有所不同。详细内容可参见标准的医学教科书以及各种临床学会指南，例如ACOG Practice Bulletin,Clinical Management Guidelines for Obstetrician-Gynecologists,no.:33,January2002；或Leitlinien,Empfehlungen,Stellungnahmen of the Deutschen Gesellschaft für und Geburtshilfe e.V.,August2008。

[0004] 先兆子痫的发病机理在很大程度上还是未知的。但是，据信其是由与螺旋动脉(spiral artery)的受损重塑相关的胎盘功能紊乱引起。先兆子痫发展过程中出现的流动性缺陷(flow defects)与缺血相关，其最终导致sFlt-1和Endoglin之类的抗血管生成因子(anti-angiogenic factor)释放到血液循环中。

[0005] 迄今为止，治疗先兆子痫的唯一方法是通过阴道产或剖腹产方式分娩早产儿终止妊娠。如上述讨论的，在妊娠第34周之前发生先兆子痫将严重地威胁母亲以及胎儿的成活力。因此，应当努力延迟生产并提高新生儿的存活率。

[0006] 对先兆子痫，尤其是早在妊娠第20到34周出现的早期发作型先兆子痫，早期的、可信赖的诊断对于这种疾病的临床控制是非常关键的。显然，患有先兆子痫的怀孕妇女需要特别的护理，例如密切地观察，帮助性的治疗手段，以及一旦发展成严重的先兆子痫时在具有母婴加护病房(MFICUs)的专门医院住院治疗。特别地，早期发作先兆子痫，由于其严重的副作用以及通常与之相关的不利结果，对于临床医师而言是很棘手的。此外，对于先兆子痫早期的、可信赖的诊断以及预测对于计划预防和治疗性介入研究也是关键性的(Ohkuchi2011,Hypertension58:859-866)。

[0007] 最近，有人提出血管生成因子及其拮抗物是先兆子痫的指示物。具体而言，有报道称在患有先兆子痫的患者中，胎盘生长因子(PlGF),Endoglin和可溶性的fsm-样酪氨酸激酶1(sFlt-1)发生了改变。除所述的有关单独的因子的报道及其关于所述因子在健康个体和患有先兆子痫或者有患先兆子痫风险的患者中的改变(参见，例如Rana2007,Hypertension50:137-142；WO2004/008946)的报道之外，也有将sFlt-1和PlGF的比例或Endoglin和PlGF的比例作为诊断的或预后的参数的报道。

[0008] 已有将sFlt-1和PlGF的单一比例作为早期妊娠时的先兆子痫预后因子的报道(Crispi2008,Ultrasound Obstet Gynecol31:303-309)。另外，有人展示了妊娠期不同时间点sFlt-1和PlGF各自的比例分别与先兆子痫风险的相关性(DeVivo2008,Acta Obstetricia et Gynecologica87:837-842；Ohkuchi2011,loc cit.；Kusanovic2009,J of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine22(11):1021-1038)。还有人对先兆子痫预后的改变程度进行了探索(Kusanovic2009,见上文)。

[0009] 但是，迄今为止所研究的比例还不能区分早期-发作型和晚期-发作型先兆子痫(DeVivo2008,见上文)。即使有报道称妊娠中期的三个月中确定的Endoglin和PlGF的比例通常与早期-发作型先兆子痫相关，但是，在现有技术中并没有针对表面看来健康的怀孕女性中危急先兆子痫指示物的报道。

[0010] 因而，目前还没有但迫切需要可靠的、用于鉴别表面看来健康但却有患危急先兆子痫，尤其是危急的早期发作先兆子痫的怀孕女性的验定法。

[0011] 本发明所针对的技术问题可视为提供服务于上述需求的手段和方法。所述技术问题通过权利要求中以及下文中所描述的具体实施方案得以解决。

[0012] 因此，本发明涉及诊断怀孕受试者是否有在短期内患先兆子痫的风险的方法，所述方法包括：

[0013] a)在所述受试者的第一和第二样品中，确定生物标志物sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量，其中，所述的第一样品在所述第二样品之前获得；

[0014] b)由在所述第一样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第一比例，以及由在所述第二样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第二比例，和

[0015] c)比较所述第一比例和第二比例的值，如果与所述第一比例的值相比，所述第二比例的值增长了至少3倍，即诊断受试者有在短期内患先兆子痫的风险。

[0016] 本发明的方法，优选地，是离体(ex vivo)方法。而且，还可以包含除上述已被明确阐述的步骤之外的步骤。例如，附加的步骤可以是关于样品预处理，或者对所述方法获得的结果的评估。所述的方法可以是人工实施，也可以通过自动化辅助实施。优选地，步骤(a)、(b)和/或(c)可全部或部分地通过自动化辅助实施，例如利用合适的机器人和传感器材(sensory equipment)用于步骤(a)中的确定，数据处理装置中的计算机执行的算法用于步骤(b)，或者数据处理设备中的比较和/或诊断算法用于步骤(c)。

[0017] 因此，本发明还优选地涉及优化风险评估的系统，所述的风险评估基于对怀孕受试者进行分类的临床预测规则，所述系统包括：

[0018] a)分析仪单元，其配置为使包含对sFlt-1和/或Endoglin具有特异的结合亲和力的配体与一部分来自怀孕受试者的第二样品在体外接触，并配置为使包含对PlGF具有特异的结合亲和力的配体与一部分来自怀孕受试者的样品在体外接触，

[0019] b)分析仪单元，其配置为检测接触了所述配体的、来自受试者的所述一部分样品的信号，

[0020] c)计算设备，其具有处理器并与所述分析仪单元处于可操作地通信状态，[0021] d)非瞬时机器可读介质，其包括多个处理器可执行指令，执行所述指令时计算sFlt-1和/或Endoglin的量，计算PlGF的量，由在样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算第二比例，并将所计算出的比例与由第一样品获得的第一比例相比较，由此基于对怀孕受试者进行分类的临床预测规则优化风险评估。

[0022] 本申请中所用的术语“先兆子痫”，指以高血压和蛋白尿症为特征的病理状况。“先兆子痫”出现于怀孕的女性受试者中，其中的高血压也被称作妊娠诱导的高血压。优选地，通过两次血压测定为140mmHg(收缩期的)到90mmHg(舒张期的)或更高，鉴定出受试者存在妊娠诱导的高血压，其中，所述的两次测定之间间隔至少6小时。优选地，通过在24小时尿样中蛋白质为300mg/dL或以上鉴定出受试者存在蛋白尿症。先兆子痫可发展成子痫，一种危及生命的病症，其特征是强直阵挛发作或昏迷。严重的先兆子痫相关的综合征是24小时内少于500ml的少尿，大脑或视觉失常，肺水肿或发绀，上腹部或右上四分之一处疼痛，肝功能受损，凝血细胞减少，胎儿生长受限。患有涉及肝的先兆子痫的患者可能进一步患HELLP综合征。因此，根据本发明处于患先兆子痫风险的患者，优选地，也具有患HELLP综合征的潜在风险。HELLP综合征与具有高风险性的不良后果，例如胎盘早剥，肾衰竭，肝被膜下出血，复发先兆子痫，早产，或甚至母亲和/或胎儿死亡。有关先兆子痫和伴随的综合症，以及HELLP或子痫之类的后续疾病的详细内容，可见于标准的医学教科书以及相关医学学会的指南。详见，例如ACOG Practice Bulletin，Clinical Management Guidelines for Obstetrician-Gynecologists,no.:33,January2002或Leitlinien,Empfehlungen,Stellungnahmen of the Deutschen Gesellschaft für und Geburtshilfe 
e.V.,August2008。先兆子痫出现于多达10％的妊娠中，通常在第二或第三个妊娠期三个月中。但是，也有一些女性早在妊娠的第20周即患上先兆子痫。

[0023] 在妊娠第20到34周内，先兆子痫也被称作早期发作先兆子痫，晚于妊娠34周出现的先兆子痫也被称作晚期发作先兆子痫。已知通常早期发作先兆子痫与通常相对温和的晚期发作先兆子痫相比伴随更严重的副作用和不利结果。

[0024] “有患先兆子痫的风险”指，与没有患先兆子痫风险的怀孕受试者相比，该怀孕受试者具有统计学意义上显著提高的在未来的预后时窗内会患先兆子痫的可能性。优选地，所述的可能性是至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少98％，至少99％或高达100％。更详细的统计资料请参见本申请中的其它部分。

[0025] 本申请中所用的术语“受试者”涉及动物，优选哺乳动物，更优选人。本发明中的受试者需为怀孕受试者，即怀孕的女性。优选地，本发明的受试者应不表现先兆子痫症状。这种先兆子痫症状优选地是本申请其它部分中具体描述的临床症状。更优选地，所述症状包含选自下述的至少一种症状：上腹部疼痛，头痛，视觉障碍，水肿。但是，本发明的受试者也可以表现上述的至少一种症状，因而已经疑似患上先兆子痫。

[0026] 更优选地，本发明的怀孕受试者处于妊娠约第15周到约第34周之间，优选地，处于妊娠约第15周到约第30周之间。

[0027] 本发明的方法可用于看上去健康的怀孕受试者的常规的筛选方式。但是，本发明预计的怀孕受试者也可能属于具有更高先兆子痫发病率的风险群体。一般而言，患有肥胖症，高血压，自身免疫病，例如红斑狼疮，血栓形成倾向或糖尿病(diabetes mellitus)的怀孕受试者具有更高先兆子痫发病率。其也适用于在前次妊娠中患先兆子痫，子痫和/或HELLP综合征的受试者。而且，首次怀孕的大龄女性也显示患先兆子痫的倾向。但是，患先兆子痫的可能性随怀孕次数而降低。

[0028] 本申请中所用术语“诊断”是指判定受试者是否有在短期内患先兆子痫的风险。优选地，所述的短期内是小于4周的时间，优选在约2到约3周之间，更优选地，所述时间段是大约16天。本领域技术人员可以了解，此种判定通常并非旨在对于被诊断的受试者100％的正确。但是，该术语要求所述的判定对统计学意义上显著部分的受试者(例如群组研究中的一群)是正确的。本领域技术人员可即刻通过使用多种已知的统计评价工具，例如置信区间的确定，p-值的确定，Student′s t-检验，Mann-Whitney检验等等，确定某一部分是否具有统计学意义上的显著性。详细内容参见Dowdy and Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York1983。优选的置信区间是至少90％，至少95％，至少97％，至少98％或至少99％。所述的p-值，优选为0.1，0.05，0.01，0.005，或0.0001。

[0029] 术语“样品”指体液样品，分离的细胞样品，或来自组织或器官的样品。可由公知的技术获得体液样品，且优选地包括血液，血浆，血清或尿液样品，更优选血液，血浆或血清样品。可由任意的组织或器官通过，例如活组织检查，获取组织或器官样品。可通过分离技术，例如离心或者细胞分选，由体液、组织或器官获取分离的细胞。优选地，细胞的、组织的、或器官的样品由表达或产生本申请所述的肽的那些细胞、组织或器官获取。

[0030] 本发明的方法中的“第一样品”在所述“第二样品”之前获得。可以理解所述的第一样品和第二样品是同种类型样品材料的样品，即，均来自同种类型的体液，细胞，组织或器官。而且，所述的第一样品先于第二样品，优选地，来自妊娠期间先后两次常规医学检查，其中所述的第一样品于在先的检查中获取，所述第二样品于在后的检查中获取。

[0031] 优选地，所述第一样品已在所述第二样品之前的约1周到约15周，优选约2周到约6周，更优选约4周到约5周获得。

[0032] 本申请中所用的术语“sFlt-1”指多肽，其是fms-样酪氨酸激酶1的可溶形式。所述多肽在本领域中也被称为可溶性VEGF受体1(sVEGF R1)(参见，例如Sunderji2010,Am J Obstet Gynecol202:40e1-7)。其是在人脐静脉内皮细胞条件培养基中被鉴定出来的。所述的内源sFlt1受体层析地且免疫地类似于人sFlt1，并以类似的高亲和力结合[125I]VEGF。人sFlt1在体外表现为与KDR/Flk-1的胞外结构域形成VEGF-稳定化的复合物。优选地，sFlt1指如Kendall1996,Biochem Biophs Res Commun226(2):324-328中所述的人sFlt1；
其氨基酸序列参见，例如人sFlt-1序列Genebank登录号P17948,GI:125361，小鼠sFlt-1序列BAA24499.1,GI:2809071(Genebank可由NCBI,USA网址："http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)获得。该术语还涵盖了上述的人sFlt1多肽的变体。所述变体至少具有与前述sFlt1多肽相同的基本生物和免疫学特性。具体而言，如果它们可被本说明书中提及的相同特定试验，例如应用特异性识别所述sFlt1多肽的多克隆或单克隆抗体的ELISA，测定试验检测出来，则它们具有相同的基本生物和免疫学特性。此外，可以理解本发明所指的变体的氨基酸序列可因至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而区别于特定的sFlt1多肽序列，其中，所述变体的氨基酸序列与特定的sFlt1多肽序列，优选人sFlt1全长序列，仍然分别具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％，或99％的同一性。两条氨基酸序列之间的同一性程度可由本领域公知的算法确定。优选地，通过比较窗比较两条最优比对的序列，由此确定所述的同一性程度，其中，与用于最优比对的参照序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗中的氨基酸序列片段可包含添加或缺失(例如缺口或悬突)。通过确定两条氨基酸序列中相同的氨基酸残基的位置的数量获得匹配的位置的数量，用匹配的位置的数量除以比较窗中的总位置的数量，将所得结果再乘以100，由此计算出序列同一性百分比。相比较序列的最优比对可通过Smith1981,Add.APL.Math.2:482公开的局部同源性算法，Needleman1970,J.Mol.Biol.48:443所述的同源性比对算法，Pearson1988,Proc.Natl.Acad Sci.(USA)85:2444所述的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP,BESTFIT,BLAST,FAST,PASTA,和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.,Madison,WI)，或通过目测检查实施。在鉴定出用于比较的两条序列后，优选应用GAP和BESTFIT确定其最优比对并由此确定其同一性程度。优选地，使用缺口权重默认值为5.00，缺口权重长度默认值为
0.30。上述的变体可以是等位基因变体，或者任何其它的物种特异性同源物，侧向同源物，或直向同源物。上述的变体可以是等位基因变体，或者任何其它的物种特异性同源物，侧向同源物，直向同源物。此外，本申请中所述的变体包括特定的sFlt-1多肽或上述的变体类型的片段或亚单位，条件是这些片段具有上述的基本生物和免疫学特性。此种片段可以是，例如sFlt-1多肽的降解产物。如果所述的变体可被本说明书中提及的相同特定测定法，例如应用特异性识别所述sFlt1多肽的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定法检测出来，则认为它们具有相同的基本生物和免疫学特性。优选的测定法描述于后附的实施例中。那些由于翻译后修饰，例如磷酸化，十四烷基化，而产生差异的变体也包括在本申请所述的变体中。可以以结合或游离形式，或者作为样品中的总sFlt-1量检测sFlt-1。

[0033] 本申请中的术语“Endoglin”指一种多肽，其未还原时分子量为180kDa，还原后分子量为95kDa，还原且N-去糖基化形式分子量为66kDa。所述多肽能形成二聚体并与TGF-β和TGF-β受体结合。优选地，Endoglin指人Endoglin。更优选地，人Endoglin具有Genebank登录号AAC63386.1,GI:3201489所示的氨基酸序列。已描述了两种Endoglin，S-Endoglin和L-Endoglin。L-Endoglin总共由633个氨基酸组成，含47个氨基酸的胞质尾区，而S-Endoglin总共由600个氨基酸组成，含14个氨基酸的胞质尾区。优选地，本申请中使用的Endoglin是可溶性的Endoglin。本文中所述的可溶性的Endoglin优选地如EP1804836B1中所述。此外，可以理解本发明所指的变体的氨基酸序列可以由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而有所差异，其中，所述变体的氨基酸序列与特定的Endoglin的氨基酸序列仍然具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％，或99％的同一性。上述的变体可以是等位基因变体，剪接变体，或者任何其它的物种特异性同源物，侧向同源物，或直向同源物。而且，本申请中所述的变体包括特定的Endoglin或上述的变体类型的片段或亚单位，条件是这些片段具有上述的基本免疫学和生物特性。此种片段可以是，例如Endoglin的降解产物。如果所述的变体可被本说明书中提及的相同特定测定法，例如应用特异性识别所述Endoglin多肽的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定法检测出来，则认为它们具有相同的基本生物和免疫学特性。优选的测定法描述于后附的实施例中。由于翻译后修饰，例如磷酸化，十四烷基化，而产生差异的变体也包括在本申请所述的变体中。可以以结合或游离形式，或者作为样品中的总Endoglin量检测Endoglin。

[0034] 本申请中所用的术语“PlGF(胎盘生长因子)”指来自胎盘的生长因子，其是具有149个氨基酸长度，并与人血管内皮细胞生长因子(VEGF)的血小板衍生生长因子-样区域高度同源的多肽。与VEGF一样，PlGF在体外、在体内都具有血管生成活性。例如，来自转染的COS-1细胞的PlGF的生化和功能特征揭示出，其是一种在体外能刺激内皮细胞生长的糖基化二聚体分泌蛋白(Maqlione1993,Oncogene8(4):925-31)。优选地，PlGF指人PlGF，更优选地指具有如Genebank登录号P49763,GI:17380553所示氨基酸序列的人PlGF。该术语涵盖所述特定人PlGF的变体。所述变体至少具有与前述特定PlGF相同的基本生物和免疫学特性。
如果所述变体可被本说明书中提及的相同特定测定法，例如应用特异性识别所述特定PlGF多肽的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定法检测出来，则认为它们具有相同的基本生物和免疫学特性。优选的测定法描述于后附的实施例中。此外，可以理解本发明所指的变体的氨基酸序列可以由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而有所差异，其中，所述变体的氨基酸序列与特定的PlGF多肽序列仍然具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％，92％，
95％，97％，98％，或99％的同一性。两条氨基酸序列之间的同一性程度可由本领域公知的以及本申请中他处所描述的算法确定。上述的变体可以是等位基因变体，或者任何其它的物种特异性同源物，侧向同源物，或直向同源物。此外，本申请中所述的变体包括特定的PLGF多肽或上述的变体类型的片段，条件是这些片段具有上述的基本生物和免疫学特性。
此种片段可以是，例如PLGF多肽的剪接变体或降解产物。再有，那些由于翻译后修饰，例如磷酸化，十四烷基化，而产生差异的变体也包括在本申请所述的变体中。可以以结合或游离形式，或者作为样品中的总PIGF量检测PlGF。

[0035] 确定本说明书中所指任何肽或多肽的量涉及数量或浓度的测量，优选半定量或定量。可直接或间接地进行测量。直接测量涉及基于由肽或多肽自身获得的信号、以及与样品中所述肽的分子数量直接相关的信号强度，测量肽或多肽的数量或浓度。此种信号，在本申请中有时指强度信号，可例如通过测量所述肽或多肽的特定物理或化学特性的强度值获得。间接测量包括测量由次级组分(即:非所述肽或多肽自身的组分)或者生物读出系统(a biological read out system)，例如可测量的细胞应答，配体，标签或酶反应产物获得的信号。

[0036] 根据本发明，确定所述肽或多肽的量可通过所有已知的用于确定样品中肽的量的手段实现。所述手段包括应用标记分子的，以各种不同的夹层法、竞争法，或其它测定法形式进行的免疫测量设备和方法，。所述的测定法将产生表明是否存在所述肽或多肽的信号。而且，所述信号的强度，优选地与样品中多肽的量直接或间接相关(例如，成反比)。其它适合的方法包括测量特异于所述肽或多肽的物理或化学特性，例如其精确的分子量或NMR谱。
所述方法包括，优选生物传感器，与免疫分析偶联的光学设备，生物芯片，分析设备，例如质谱仪，NMR-分析仪，或色谱设备。另外的方法包括基于微盘ELISA的方法，全自动或机器人免疫分析(例如可通过ElecsysTM分析仪进行)，CBA(酶促钴结合测定法，例如可通过Roche-HitachiTM分析仪进行)和乳胶凝集试验测定法(例如可通过Roche-HitachiTM分析仪进行)。

[0037] 优选地，确定肽或多肽的量包括下述步骤：(a)使所述肽或多肽与能引发细胞应答的细胞接触足够长的一段时间，所述的细胞应答强度指示所述肽或多肽的量，(b)测量所述的细胞应答。为测量细胞应答，优选地，将所述样品或经处理的样品加入到细胞培养物中，并测量内部或外部的细胞应答。所述细胞应答可包括可测量的报告基因表达或物质分泌，例如肽、多肽和小分子的分泌。所述的表达或物质将产生与所述肽或多肽的量相关的强度信号。在优选的具体实施方案中，所述的接触、去除和测量步骤可由本申请中公开的系统的分析仪单元执行。根据一些实施方案，所述步骤可由所述系统的单个分析仪单元，或由一个以上彼此之间可操作通讯的多个分析仪单元执行。例如，根据一个具体实施方案，本申请中公开的系统可包括用于执行所述接触和去除步骤的第一分析仪单元，以及通过运送单元(例如机械手)与第一分析仪单元可操作连接的第二分析仪单元，所述第二分析仪单元执行测量步骤。

[0038] 优选地，确定肽或多肽的量包括，测量可由样品中的肽或多肽获得的特定强度信号的步骤。如上所述，所述的信号可以是在特异于所述肽或多肽的质谱或NMR谱中，在特异于所述肽或多肽的m/z变量处所观察到的信号强度。

[0039] 确定肽或多肽的量可优选地包括下述步骤：(a)使所述的肽与特定的配体接触，(b)优选地去除未结合的配体，(c)测量结合配体的量。所述的结合配体将产生强度信号。本发明中的结合包括共价和非共价结合。本发明中的配体可以是与本申请中的肽或多肽结合的任意化合物，例如肽，多肽，核酸或小分子。优选的配体包括抗体，核酸，肽或多肽，例如所述肽或多肽、及其包含所述肽的结合结构域的片段的受体或结合配偶体，以及适体，例如核酸或肽适体。制备此类配体的方法是本领域共知的。例如适合的抗体和适体的鉴定和生产可由供应商提供。本领域的普通技术人员通晓研发具有更高亲和力及特异性的上述配体的衍生物的方法。例如可以向所述核酸、肽或多肽中引入随机突变。然后通过本领域已知的筛选程序，例如噬菌体展示，测试所得衍生物的结合力。本申请中所指的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体以及它们的片段，例如能结合抗原或半抗原的Fv，Fab和F(ab)2片段。本发明还包括单链抗体，以及人源化杂合抗体，其中显示所需抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的氨基酸序列结合。所述的供体序列通常至少包括所述供体的抗原结合氨基酸残基，但也可包含所述供体抗体的其它结构和/或功能相关氨基酸残基。所述的杂合体可通过本领域已知的若干种方法制备。优选地，所述配体或试剂与所述肽或多肽特异性地结合。根据本发明的特异性结合指，所述配体或试剂基本上不与存在于待分析样品中的其它肽、多肽或物质结合，即：发生交叉反应。优选地，所述特异性结合肽或多肽具有比任何其他相关的肽或多肽强达至少3倍，更优选至少10倍，和甚至更优选至少50倍的结合亲和力。如果例如根据其在Western Blot上的大小，或通过其在样品中相对更高的丰度，仍然可以明确地区分和测量，那么所述非特异性结合有可能是可容忍的。所述配体的结合可通过本领域任何已知的方法进行测量。优选地，所述方法是半定量或定量的。进一步适合的确定所述多肽或肽的方法在后续部分描述。

[0040] 首先，配体的结合可通过，例如NMR或表面等离振子共振直接测量。配体结合的测量，根据优选的具体实施方案，通过本申请所述系统的分析仪单元执行。此后，测量的结合量可通过本申请所述系统的计算设备进行计算。第二，如果所述配体还作为感兴趣的肽或多肽的酶促活性底物，还可测量酶促反应产物(例如通过测量，例如在Western Blot上经切割的底物的量测量蛋白酶的量)。或者，配体本身可能显示酶促特性，可使“配体/肽或多肽”复合物或所述肽或多肽所结合的配体分别与合适的底物接触，通过其所产生的强度信号使得能够检测。对于酶促反应产物的测量，优选底物的量是饱和的。所述底物也可以在反应之前用可检测的标记物标记。优选地，样品与底物接触足够长的一段时间。足够长的一段时间指产生可检测量的，优选可测量量的产物所必需的时间。可测量出现给定(例如可检测的)量的产物所必需的时间，而不必测量产物的量。第三，所述配体可与允许所述配体被检测和测量的标记物共价或非共价偶联。标记可通过直接或间接的方法进行。直接标记包括将标记物直接(共价或非共价地)偶联到配体上。间接标记包括将第二配体与所述第一配体(共价或非共价地)结合。所述的第二配体应特异地结合于所述第一配体。所述第二配体可以与合适的标记物偶联和/或作为结合于所述第二配体的第三配体的靶(受体)。第二，第三或甚至更高级别的配体的作用通常是用来增强信号。合适的第二配体或更高级别的配体可以包括抗体，第二抗体，以及公知的链霉抗生物素蛋白-生物素系统(Vector Laboratories,Inc.)。所述的配体或底物也可以用本领域已知的一个或以上的标签“加上标签”。此种标签可从而作为更高级别配体的靶。合适的标签包括生物素，地高辛配基，His-Tag，谷胱甘肽S转移酶，FLAG，GFP，myc-标签，甲型流感病毒血凝素(HA)，麦芽糖结合蛋白，等等。对于肽或多肽，所述的标签优选位于N-末端和/或C-末端。适合的标记物是任何可通过适当的检测方法检测的标记物。通常的标记物包括金颗粒、乳胶珠、9,10-二氢化吖啶酯、鲁米诺、钌、酶促活性的标记物、放射性标记物、磁性标记物(例如“磁性珠子”，包括顺磁性或超顺磁性标记物)，以及荧光标记物。酶促活性标记物包括，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶及其衍生物。用于检测的合适的底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3,3'-5,5'-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(氯化4-硝基四氮唑蓝和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸，现成的储液Roche Diagnostics有售)、CDP-StarTM(Amersham Biosciences)，ECFTM(Amersham Biosciences)。合适的酶-底物组合可产生着色的反应产物、荧光或化学发光，其可以根据本领域已知的方法进行测量(例如使用光敏胶片或合适的照相系统)。对于酶促反应的测量，类似地应用上述标准。通常的荧光标记物包括荧光蛋白(如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红、荧光素和Alexa染料(如Alexa568)。更多的荧光标记物可购自如Molecular Probes(Oregon)。还可考虑用量子点作为荧光标记物。常用的放射性标记物包括35S，125I，32P、33P等等。放射性标记物可以通过任意已知的适当方法检测，例如光敏胶片或磷光显影仪(phosphorimager)。本发明的适当测量方法还包括沉淀法(尤其是免疫沉淀法)、电化学发光法(电促化学发光，electro-generated chemiluminescence)、RIA(放射免疫分析)、ELISA(酶联免疫吸附分析)、夹层酶免疫试验(sandwich enzyme immune tests)、电化学发光夹层免疫分析(ECLIA)、解离-增强的镧系元素荧光免疫分析(dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay，DELFIA)、闪烁亲近测定法(scintillation proximity assay，SPA)、比浊法、浊度法、乳胶-增强的比浊法或浊度法，或者固相免疫试验。本领域已知的其它方法(如凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western印迹法和质谱法)可单独使用，或与标记或者上述其它检测方法组合使用。

[0041] 所述肽或多肽的量也可以，优选地依照下述步骤确定：(a)使包含所述肽或多肽的样品与含上述肽或多肽的配体的固体支持物接触，(b)优选地，去除未结合的肽或多肽以及剩余的样品材料，和(c)测量与所述支持物结合的肽或多肽的量。优选地，所述配体选自核酸，肽，多肽，抗体和适体，并优选地以固定化的形式存在于所述固体支持物上。制备固体载体的材料是本领域公知的，除其它已知材料外，包括可商购的柱材料，聚苯乙烯珠，乳胶珠，磁性珠，胶体金属颗粒，玻璃和/或硅芯片或表面，硝酸纤维素条，膜，片，Duracyte，反应盘的孔和壁，塑料管，等等。所述的配体或试剂可以与很多不同的载体结合。公知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然或经修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。依照本发明的目的所述载体的性质可以是可溶性的或不溶性的。固定(fixing)/固定化(immobilizing)所述载体适当方法是本领域所公知的，包括但不限于离子的、疏水的、共价的相互作用等等。还可以考虑使用“悬浮阵列”作为根据本发明的阵列(Nolan2002,Trends Biotechnol.20(1):9-12)。在此种悬浮阵列中，所述的载体，例如微珠或微球以悬浮状态存在。所述的阵列由不同的微珠或微球组成，所述的微珠或微球可能是经标记的，载有不同的配体。制备此种阵列的方法，例如基于固相化学或对光不稳定的保护基团，是本领域公知的(US5,744,305)。

[0042] 本申请所用的术语“量”包括所述肽或多肽的绝对量，所述肽或多肽的相对量或浓度，以及与之相关或者由其衍生的值或参数。这些值或参数包括来自通过直接测量由所述肽所获得的的全部特有物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值。此外，还包括本说明书其它部分所描述的、通过间接测量所获得的全部值或参数，例如在所述肽的应答中由生物读出系统确定的应答水平，或者由特异性结合配体获得的强度信号。可以理解，与前述的量或参数相关的值也可以通过所有的标准化数学运算获得。根据本发明的优选实施方案，所述“量”的确定通过本申请所公开的系统执行，其中基于由所述系统的一个或以上的分析仪单元执行的接触和测量步骤，计算设备确定上述的“量”。

[0043] 本申请中的术语“计算第一比例”或“计算第二比例”指，通过将sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量相除，或任何其它类似的使sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量相联系的数学运算，计算sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量的比例。优选地，通过用sFlt-1或Endoglin的量除以PlGF的量计算所述的比例。对在所述第一和第二样品中确定的各自的值进行所述计算，以分别获得所述第一和第二比例。

[0044] 本申请中的术语“比较”包括比较上述定义的第一比例和第二比例。可以理解本申请中使用的比较指计算出的第一比例值和计算出的第二比例值之间任何方式的比较。在贯穿本发明的研究中已发现，增加的患先兆子痫的风险与所述第一比例的值比所述第二比例的值增加约3倍或以上相关。本发明的方法中所指的比较可通过人工或计算设备(本申请所公开的系统)进行。

[0045] 在本发明的方法的步骤(c)中所指的比较可通过人工或计算机辅助完成。可将所述比例的值，例如相互比较并且所述比较通过执行用于所述比较的算法的计算机程序自动进行。作为对所述的值进行比较的结果，获得的斜率值指示所述第二比例值与所述第一比例值相差的倍数。在进一步的比较步骤中，确定了所述的斜率值是等于，大于或小于3倍。如果所述的斜率值约为3或更大(即，在观察到约200％或以上的增长时)，将做出在短期内有患先兆子痫风险的诊断(“确认可能性”("rule-in"))。类似地，斜率值低于倍数3(即：所观察到的增长低于200％，所述的值基本上没有变化或降低)时，将做出在短期内没有患先兆子痫风险的诊断(“排除可能性”("rule-out"))。对所述第一和第二比例值比较结果的所述评估也可以自动执行。执行所述评估的计算机程序将以适当的输出格式提供所需的评价。例如比较结果以原始数据(绝对或相对量)的形式给出，有些情况下给出代表具体诊断结果的文字，短语，符号或数值的形式的指示。可由本申请所公开的系统的计算设备，基于本文中所述的所计算的第一比例和第二比例之间的比较，提供所述的“确认可能性”和/或“排除可能性”的诊断。例如，系统的计算设备可提供文字，短语，符号或数值的形式的、代表“确认可能性”诊断或“排除可能性”诊断之一的指示。

[0046] 本发明中所用的术语“约”指所指示参数或值的+/-20％，+/-10％，+/-5％，+/-2％或+/-1％。这也将由于测量技术等所造成的惯常偏差考虑在内。

[0047] 有利地，在贯穿本发明的研究中已发现，在采集研究样品时不表现、或仅表现出有限的临床明显的先兆子痫症状的怀孕受试者中，sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量之间的比例(sFlt1/PlGF或Endoglin/PlGF的比例)剧烈增高，是危急先兆子痫，即在几周的短期内发展为先兆子痫和/或危急的HELLP综合征的指示。此外，也已发现处于风险中的所述受试者所患的先兆子痫通常是更为严重的早期发作先兆子痫类型。具体而言，发现3倍或以上的增长是上述危急的先兆子痫的一种可靠的预示性指示，在实践中具有较好的灵敏度和高于98％的特异性。而较弱的增长与发展为危急的先兆子痫之间没有表现出紧密的相关性。显然，无论是生物标志物的绝对量本身还是比例发生上述的剧烈增长都具有预测性。

[0048] 由于本发明，可以根据可靠的指示更可靠地诊断出危急先兆子痫，尤其是危急的早期发作先兆子痫的风险，所述的指示看来独立于在受试者中发现的上述生物标志物的绝对量本身。而且，若以本发明的方法作为诊断的辅助手段，可以避免诸如目前的评分系统这样的耗时、昂贵且繁琐的诊断方式。因为可对患先兆子痫的怀孕女性所需的密切的观察和特别的护理进行更好的评估，并纳入医疗服务管理的考虑范围，因此，医疗服务管理将在很大程度上受益于本发明的方法。

[0049] 可以理解上文和下文中对相关术语的定义和解释适用于本说明书中所述的所有实施方案以及后附的权利要求。

[0050] 在本发明的方法的优选实施方案中，所述的先兆子痫是早期发作先兆子痫。

[0051] 因此，本发明的方法可用来诊断受试者是否有在短期内患早期发作先兆子痫的风险，特别是对处于妊娠第15周到第30周之间的所述怀孕受试者。如之前所讨论的，早期发作先兆子痫通常比晚期发作先兆子痫具有更严重的后果，因此患者需要帮助性措施来改善所述先兆子痫所带来的后果。例如可使处于风险中的患者在早期阶段进入带有母婴加护病房的医院。

[0052] 在本发明的方法的另一个优选的实施方案中，所述的方法还包括如果诊断出受试者有在短期内有增加的患先兆子痫的风险，则推荐至少一种针对先兆子痫的帮助性措施。

[0053] 此处所用的术语“推荐”指提出有关可应用于受试者的帮助性措施或措施组合的建议。但是应理解该术语一定不涵盖实施治疗本身。

[0054] 如之前所讨论的，患先兆子痫的受试者需要特别的医疗护理。因此，如果诊断出受试者有患先兆子痫的风险，这种诊断有助于提前，即在所述先兆子痫开始在临床上显而易见之前，对受试者建立适当的帮助性措施。优选地，所述至少一种帮助性措施选自下组：密切监控，住院，施用降血压药剂，和/或生活方式推荐。关于胎儿，或可建议施用倍他米松，以备之后提前分娩中改善新生儿的呼吸功能。

[0055] 本发明还涉及区分有患早期发作先兆子痫风险的怀孕受试者和没有患早期发作先兆子痫风险的怀孕受试者的方法，所述方法包括：

[0056] a)在所述受试者的第一和第二样品中，确定生物标志物sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量，其中，所述的第一样品在所述第二样品之前获得；

[0057] b)由在所述第一样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第一比例，以及由在所述第二样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第二比例；

[0058] c)比较所述第一比例和第二比例的值，其中如果与所述第一比例的值相比，所述第二比例的值增长了至少3倍，即诊断受试者有患早期发作先兆子痫的风险。

[0059] 优选地，如在本申请其它部分中所详细阐述的，所述早期发作先兆子痫在短期内发作。

[0060] 还优选所述第二样品在不晚于妊娠第30周，即在妊娠第30周之前已获取。

[0061] 如上述已经讨论的，对有患早期发作先兆子痫风险的受试者的可靠鉴定是健康管理中的一项决定性的任务。具体而言，患先兆子痫的怀孕女性需要特别护理，本发明可使得所述的护理需求得到更好的评估，并纳入医疗服务管理的考虑范围。尤其是，如果所述的第二样品在妊娠第30周前后获得，上述的方法甚至可以发现早期-发作型先兆子痫。可以理解如果受试者直至妊娠第30周，即已获取了第二样品后，仍然没有先兆子痫症状或者只表现出有限的先兆子痫症状，将几乎可被诊断为非早期发作先兆子痫，因为临床显著的先兆子痫通常出现在妊娠第34周之后。由于上述的方法已经考虑到生物标志物的动态变化，其能更可靠地诊断正确的先兆子痫类型。

[0062] 总体而言，本发明包括在怀孕受试者的第一和第二样品中的生物标志物sFlt-1或Endoglin和PlGF，或者与所述生物标志物特异结合的检测试剂在诊断所述受试者是否有在短期内患先兆子痫的风险中的用途。

[0063] 因此，优选如上述方法中所显示的，所述生物标志物或其检测试剂可用于在怀孕受试者中诊断所述受试者是否有在短期内患先兆子痫的风险。更优选地，计算第一样品和第二样品中sFlt-1或Endoglin和PlGF的比例，接下来将所得的比例相比较，确定所得的两个比例之间增长或改变的倍数，其中增长达约3倍或以上用作受试者有在短期内患先兆子痫的风险的指示。

[0064] 此外，总的来说，本发明还涉及在怀孕受试者的第一和第二样品中的生物标志物sFlt-1或Endoglin和PlGF，或者与所述生物标志物特异结合的检测试剂在区分有患早期发作先兆子痫风险的怀孕受试者和没有患早期发作先兆子痫风险的怀孕受试者中的用途。

[0065] 优选如上述方法中所显示的，所述生物标志物或其检测试剂可用于区分有患早期发作先兆子痫风险的怀孕受试者和没有患早期发作先兆子痫风险的怀孕受试者。更优选地，计算第一样品和第二样品中sFlt-1或Endoglin和PlGF的比例，接下来将所得的比例相比较，以确定所得的两个比例之间增长或改变的倍数，其中增长达约3倍或以上用作受试者有在短期内患早期发作先兆子痫的风险的指示。

[0066] 本发明的一个方面涉及一种方法，其用于建立优化基于对怀孕受试者进行分类的临床预测规则的风险评估的辅助手段(aid)，该方法包括：

[0067] a)通过

[0068] (i)使第一样品与特异性结合sFlt-1，Endoglin，和/或PlGF的检测试剂接触一段时间，所述时间足以使得所述检测试剂与样品中的上述标志物形成复合物，

[0069] (ii)测量所形成的复合物的量，其中所述的形成的复合物的量与存在于所述样品中的上述标志物的量成比例，

[0070] (iii)将所形成的复合物的量换算为标志物的量，其反映存在于所述样品中的标志物的量，和

[0071] (iv)由在所述第一样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第一比例，

[0072] 由此获得第一比例；

[0073] b)通过

[0074] (i)使第二样品与特异性结合sFlt-1，Endoglin，和/或PlGF的检测试剂接触一段时间，所述时间足以使得所述检测试剂与样品中的上述标志物形成复合物，

[0075] (ii)测量所形成的复合物的量，其中所述的形成的复合物的量与存在于所述样品中的上述标志物的量成比例，

[0076] (iii)将所形成的复合物的量换算为标志物的量，其反映存在于所述样品中的标志物的量，和

[0077] (iv)由在所述第二样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第二比例，

[0078] 由此获得第二比例；

[0079] c)将所述的第一比例和第二比例相比较；和

[0080] d)基于根据步骤c)中得出的比较结果对怀孕受试者进行分类的临床预测规则，建立优化风险评估的辅助手段。

[0081] 本发明的又一方面涉及一种系统，其用于建立优化基于对怀孕受试者进行分类的临床预测规则的风险评估的辅助手段，该系统包括：

[0082] a)分析仪单元，其配置为使包含对sFlt-1和/或Endoglin具有特异的结合亲和力的配体与一部分来自怀孕受试者的第二样品在体外接触，并配置为使包含对PlGF具有特异的结合亲和力的配体与一部分来自怀孕受试者的样品在体外接触，

[0083] b)分析仪单元，配置为检测来自接触了所述配体的受试者的所述部分样品的信号，

[0084] c)计算设备，其具有处理器并且与所述分析仪单元处于可操作地通信状态，和[0085] d)非瞬时机器可读介质，其包括多个处理器可执行指令，所述指令执行时计算sFlt-1和/或Endoglin的量，计算PlGF的量，由在样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算第二比例，并将所计算出的比例与由第一样品获得的第一比例相比较，由此优化基于对怀孕受试者进行分类的临床预测规则的风险评估。

[0086] 合适的检测试剂，一方面可以是，与有待通过本发明的方法研究的受试者样品中的至少一种标志物特异性结合的抗体，即与sFlt-1，Endoglin或PlGF结合的检测试剂。在一个方面，另一种可应用的检测试剂可以是与所述样品中的至少一种标志物特异性结合的适体(aptamere)。另一方面，在测量所述检测试剂和所述的至少一种标志物之间形成的复合物的量之前，使所述的样品与所述复合物分离。因此，一方面所述检测试剂可以固定化于固体支持物上。仍另一方面可通过施用清洗溶液使所述的样品与在固体支持物上形成的复合物分离。所形成的复合物与存在于样品中的至少一种标志物的量是成比例的。可以理解待应用的检测试剂的特异性和/或灵敏度决定了样品中包含的可被特异性结合的至少一种标志物的比例程度。在本申请的其它部分还有关于如何实施所述的确定的更详细内容描述。所形成的复合物的量将被换算为至少一种标志物的量，其反映实际存在于样品中标志物的量。该量一方面可能基本上就是存在于样品中的量，另一方面也可能是由于所形成的复合物与原始样品中的量的关系所呈现出的某种比例。

[0087] 上述方法的又一方面，步骤a)可通过分析仪单元实施，在一方面，所述的分析仪单元如本申请其它部分所定义的。

[0088] 基于在步骤d)中，通过如本申请其它部分所述的、将受试者划归具有提高的风险的受试者组或者具有降低的风险的受试者组所进行的比较，建立优化风险评估的辅助手段。如上述已经讨论过的，在所研究的病例中，对于待研究的受试者的划分一定不是100％正确的。而且，待研究的受试者所归入的受试者组是人为的组，这是因为这些组是基于统计学意义上的考虑建立的，即本发明的方法是基于预先选择的某种可能性程度来操作的。本发明的一个方面，所述用于优化风险评估的辅助手段是自动建立的，例如，通过如本申请所公开和描述的计算设备辅助。

[0089] 本发明的方法的一个方面中，所述方法还包括根据如本申请其它部分详细列举的在步骤d)中建立的结果建议或管理受试者的步骤，和/或调整疾病监控的集中度。

[0090] 本发明的又一方面，包括一种系统，其用于建立优化基于对患有肺炎的受试者进行分类的临床预测规则的风险评估的辅助手段，所述系统包括：

[0091] a)分析仪单元，其配置为使包含对sFlt-1和/或Endoglin具有特异的结合亲和力的配体与一部分来自怀孕受试者的第二样品在体外接触，并配置为使包含对PlGF具有特异的结合亲和力的配体与一部分来自怀孕受试者的样品在体外接触，

[0092] b)分析仪单元，其配置为检测来自接触了所述配体的受试者的所述部分样品的信号，

[0093] c)计算设备，其具有处理器并且与所述分析仪单元处于可操作地通信状态，和[0094] d)非瞬时机器可读介质，其包括多个处理器可执行指令，所述指令执行时计算sFlt-1和/或Endoglin的量，计算PlGF的量，由在样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算第二比例，并将所计算出的比例与由第一样品获得的第一比例相比较，由此优化基于对怀孕受试者进行分类的临床预测规则的风险评估。

[0095] 本申请的一个优选的实施方案包括一种基于对怀孕进行分类的临床预测规则优化风险评估的系统。所述系统的实例包括用于检测化学或生物反应结果或者监控化学或生物反应进程的，临床化学分析仪，凝聚化学分析仪(coagulation chemistry analyzers)，免疫化学分析仪，尿分析仪，核酸分析仪。更具体而言，本申请的示例性系统包括Roche ElecsysTM Systems和 e Immunoassay分析仪，Abbott ArchitectTM和AxsymTM分析仪，Siemens CentaurTM和ImmuliteTM分析仪，以及Beckman Coulter UniCelTM和AcessTTM分析仪，等等。

[0096] 所述系统的实施方案可包括一个或以上的用于实践本申请的主题的分析仪单元。本申请中所公开的系统的分析仪单元可通过已知的任何有线连接，蓝牙，LANS，或无线信号与本申请所公开的计算设备可操作地通讯。此外，根据本申请，分析仪单元可以包括较大设备中用于诊断目的的样品检测，例如定性和/或定量评估之一或两者的独立的装置或元件。
例如，分析仪单元可以执行或辅助样品和/或试剂的移液，计量(dosing)，混合。分析仪单元可包括用来夹持试剂以进行测定的试剂夹持单元。试剂的安排可以是，例如在盛有单独的试剂或一组试剂的容器或匣子(cassettes)里，置于储藏室或输送器中合适的托座或位置之中。检测试剂还可以固定在与样品相接触的固体支持物上。分析仪单元还可以包括对于特定的分析最优化的处理和/或检测组件。

[0097] 根据一些实施方案，分析仪单元可配置为对样品中的分析物，例如标志物，进行光学检测。用于光学检测的分析仪单元的示例包括配置为将电磁能转化成电信号的设备，其包括单一的和多元件或阵列光学探测器。根据本公开，光学探测器能监控光电磁信号并提供代表置于光路中的样品内分析物的存在和/或浓度的电输出信号，或与相对于基线信号的应答信号。所述设备还可以包括，例如光电二极管，包括雪崩光电二极管(avalanche photodiodes)，光电晶体管，光电导检测器，线性传感器阵列，CCD检测器，CMOS检测器，包括CMOS阵列检测器，光电倍增管，以及光电倍增管阵列。根据某些实施方案，光学检测器，例如光电二极管或光电倍增管可包括附加的信号调节或处理电器元件。例如光学检测器可包括至少一个预放大器，电子过滤器，或集成电路。合适的预放大器包括，例如集成、跨阻抗，和电流增益(电流反射镜)预放大器。

[0098] 此外，本申请的一个或以上的分析仪单元可包含用于发射光的光源。例如，分析仪单元的光源可以由至少一个光发射元件(例如，发光二极管，电力发射源如白炽灯，电致发光灯，气体放电灯，高强度放电灯，激光)组成，用于测量待测样品中分析物的浓度，或使得能够能量转换(例如，通过荧光共振能量转移或催化酶)。

[0099] 此外，所述系统的分析仪单元可包括一个或以上的温育单元(例如用于将样品或试剂保持在特定的温度或温度范围)。在一些实施方案中，分析仪单元可包括用于使样品处于重复的温度循环中并监测样品中扩增产物量的变化的热循环仪，包括实时热循环仪。

[0100] 本文中公开的系统的分析仪单元还可包括或可操作地连接于反应容器或小杯(cuvette)输送单元。输送单元的示例包括液体加工单元，例如移液单元，用来将样品和/或试剂递送到反应容器。所述移液单元可包含可重复使用的耐洗针，例如钢针，或者一次性的移液头。所述的分析仪单元还可包括一个或以上的混合单元，例如用于振荡含液体的小杯的振荡器，或用来混合小杯或试剂容器中的液体的搅拌桨。

[0101] 本发明还涉及适于通过实施上述的方法诊断怀孕受试者是否有在短期内患先兆子痫的风险的设备，其包括：

[0102] a)分析仪单元，其包含特异性地结合sFlt-1和/或Endoglin的检测试剂和特异性结合PlGF的检测试剂，所述单元适合于确定怀孕受试者的第一样品和第二样品中sFlt-1和/或Endoglin的量以及PlGF的量；和

[0103] b)含数据处理器的评估单元，所述数据处理器具有用于实施下述步骤的执行算法：

[0104] i)由在所述第一样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第一比例，由在所述第二样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第二比例；和

[0105] ii)比较上述第一比例和第二比例的值，其中如果与所述第一比例的值相比，所述第二比例的值增长达至少3倍，即诊断受试者有在短期内患先兆子痫的风险。

[0106] 本申请中使用的术语“设备”涉及包含彼此可操作地连接的上述单元的系统，其使得可根据本发明的方法进行诊断。可用于所述分析单元的优选检测试剂在本申请的其它部分公开。分析单元(或分析仪单元)优选地包括处于固体支持物上的固定形式的检测试剂，其将与包含待确定其数量的生物标志物的样品相接触。此外，所述分析单元还可以包含检测器，其用于确定与所述生物标志物特异性结合的检测试剂的量。可将经确定的量转移到所述评估单元。所述评估单元包括带有执行算法的数据处理元件，例如计算机，所述数据处理元件通过执行基于计算机的算法实施本发明的方法的步骤，由此实施比例计算，比较计算出的比例，和评估比较结果，其中所述本发明的方法的步骤已在本申请的其他部分详细阐述。所述结果可作为参数化的诊断原始数据输出而给出。可以理解这些数据通常需要经过医生的解读。但是也可以预计专家系统设备，其中上述的输出包含无需专业医生进行解读的、经处理的诊断原始数据。

[0107] 根据本申请的一些实施方案，用于比较本申请中公开的第一比例和第二比例的算法通过执行指令实现和运行。所述结果可作为参数化的诊断原始数据输出，或者作为绝对或相对量给出。根据本申请中公开的所述系统的不同实施方案，通过本文中公开的系统的所述计算设备基于所述计算出的比例的比较来提供“诊断”。例如系统的计算设备可提供代表特定诊断的文字、符号、或数值形式的指示。

[0108] 本发明还涉及适于通过实施上述的方法区分有患早期发作先兆子痫风险的怀孕受试者和没有患早期发作先兆子痫的怀孕受试者的装置，其包括：

[0109] a)分析单元，其包含特异性地结合sFlt-1和/或Endoglin的检测试剂和特异性结合PlGF的检测试剂，所述单元适合于确定怀孕受试者的第一样品和第二样品中sFlt-1和/或Endoglin的量以及PlGF的量；和

[0110] b)含数据处理器的评估单元，所述数据处理器执行用于实施下述步骤的算法：

[0111] i)由在所述第一样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第一比例，和由在所述第二样品中确定的sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量计算出第二比例；和

[0112] ii)比较上述第一比例和第二比例的值，其中如果与所述第一比例的值相比，所述第二比例的值增长达至少3倍，即诊断受试者有患早期发作先兆子痫的风险。

[0113] 此外，本发明还包括适于实施上述的方法以诊断怀孕受试者是否有在短期内患先兆子痫风险的试剂盒，其包含用于确定生物标志物sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量的检测试剂，以及实施所述方法的操作指南。

[0114] 本申请中使用的术语“试剂盒”指上述组分的集合，优选地，其单独地或在单一的容器内提供。所述的容器内还包括实施本发明的方法的操作指南。这些操作指南可以是使用手册的形式，也可以通过计算机程序代码提供，当在计算机或数据处理设备上运行所述计算机程序代码时，其能够执行本发明的方法中的计算和比较，并相应地建立诊断。所述的计算机程序代码可以是在数据存储介质或设备上，例如光学存储介质(例如光盘)，或者直接在计算机或数据处理设备上提供。而且，所述的试剂盒可优选地包含用于校准目的的标准量的生物标志物，所述生物标志物在本申请的其他部分阐述。

[0115] 本发明还涉及适于通过实施上述的方法以区分有患早期发作先兆子痫风险的怀孕受试者和没有患早期发作先兆子痫的怀孕受试者的试剂盒，其包含确定生物标志物sFlt-1或Endoglin的量以及PlGF的量的检测试剂，以及实施所述方法的操作指南。

[0116] 本说明书中引用的全部参考文献通过参考其所公开的全部内容以及本说明书中特别引用的内容的形式并入本申请。附图说明

[0117] 图1：显示本研究中，结果为先兆子痫(PE)的患者组和健康对照组中个体受试者妊娠周数分布。第一次访问，第二次访问以及以日数计的时间差(tine difference)均示于盒形图中。

[0118] 图2：在不同次访问时，通常的和对数标尺下显示的PE组和健康对照组的sFlt-1/PlGF比例。

[0119] 图3：显示相对于孕龄和测量时间点的不同sFlt-1/PlGF比例。

[0120] 图4：显示至诊断为PE/HELLP的时间段对sFlt-1/PlGF比例值两者的图(左)，和PE/HELLP组的患者sFlt-1/PlGF比例在第一次和第二次访问间的斜率。

[0121] 图5：显示在不同妊娠周数的sFlt-1/PlGF比例(A)，和在不同妊娠周数的Endoglin(sEng)/PlGF比例(B)。

[0122] 图6：在不同次访问时，通常的和对数标尺下显示的PE组和健康对照组的sEng/PlGF比例。

[0123] 图7：显示相对于孕龄和测量时间点的不同sEng/PlGF比例

[0124] 图8：显示至诊断为PE/HELLP的时间段对sEng/PlGF比例值两者的图(左)，和PE/HELLP组的患者sEng/PlGF比例在第一次和第二次访问间的斜率。实施例

[0125] 下述的实施例仅用来解释本发明。它们不以任何形式限制本发明的范围。

[0126] 实施例1：PlGF，sFLT1和Endoglin血液水平的测量

[0127] 应用市售的免疫分析确定PlGF，sFLT1和Endoglin的血液水平。具体而言，应用了下述的测定法。

[0128] 利用Roche公司的ElecsysTM-或cobas eTM-系列分析仪通过夹层免疫分析确定sFlt1。所述的测定法包括特异于相应多肽的两种单克隆抗体。第一种抗体是生物素化的，第二种抗体利用三(2,2’-联吡啶)钌(II)-复合物进行标记。在第一个温育步骤中，将两种抗体和样品一起温育。形成含有待确定的肽以及两种不同的抗体的夹层复合物。在下一个温育步骤中，向所述复合物中添加链霉抗生物素蛋白包被的小珠。所述的小珠结合于所述的夹层复合物。然后将反应混合物抽吸到测量小室中，在测量小室中所述的小珠被磁性捕获于电极表面。然后施加电压诱导来自钌复合物的化学发光发射，其由光电倍增管测量。所发射的光的量依赖于电极上的夹层复合物的量。所述的sFlt-1试验可由Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国商购得。有关所述测定法的更详细内容可参见产品说明书。sFlt1的测量范围包括10到85000pg/ml之间的量。

[0129] Endoglin的测量利用可商购自R&D Systems,Inc,Minneapolis，美国的QuantikineTM人Endoglin/CD105免疫分析进行。该测定法应用定量夹层酶联免疫分析技术。
特异于Endoglin的单克隆抗体已预先包被到微孔板。将标样和样品移液到孔中，其中存在的任何Endoglin即结合到固定的抗体上。洗去所有未结合的物质后，将特异于Endoglin的酶联单克隆抗体加到孔中。再洗去所有未结合的抗体-酶试剂之后，将底物溶液加入孔中，即可与起始步骤中的Endoglin结合量成比例地进行显色。终止显色并测量颜色的强度。有关所述测定法的更详细内容可参见产品说明书。Endoglin的测量范围包括0.001ng/L到
10ng/ml的量。

[0130] 在ElecsysTM-或cobas eTM-系列分析仪通过夹层免疫分析(详见上文)中使用两种PlGF特异性抗体测试PlGF。PlGF测试由Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国商购得。有关所述测定法的更详细内容可参见产品说明书。PlGF的测量范围包括3到10000pg/ml范围的量。

[0131] 实施例2：结果患上先兆子痫的患者和健康对照中生物标志物sFlt-1和PlGF的分析

[0132] 对在欧洲不同地点招募的总计286名患者进行了研究。所述研究中包括孕龄至少15+0周至最多30+0周的怀孕妇女。直到约第28周为止，sFlt-1/PlGF比例参考值通常逐渐略有下降，因此在这一时段内不会期待所述数值有生理性增高。本研究中包括的每次患者访问时的诊断为"无先兆子痫或HELLP(PE/HELLP)"或者"疑似PE/HELLP"。这些患者的诊断结果可能是PE/HELLP，并且本研究对升高的数值是否PE/HELLP的危急诊断指示物的情况进行了分析。对每个妇女进行了两次访问：在第30+0周之前的最后一次访问(访问2)，和一次之前的访问(访问1)。如果对于访问1有一个以上的选择的话，则选择最接近在访问2之前3周时进行的。

[0133] 如上述实施例1所述的，确定并评估PlGF和sFlt-1的血液水平。其结果总结于下述表1-11中：

[0134]

[0135] 表1：对最终结果的诊断

[0136]

[0137] 表2：第一次访问时的孕龄

[0138]

[0139] 表3：第二次访问时的孕龄

[0140]

[0141] 表4：访问之间的天数

[0142]

[0143] 表5：第一次访问时的sFlt-1/PlGF比例

[0144]

[0145] 表6：第二次访问时的sFlt-1/PlGF比例

[0146]

[0147] 表7：两次访问间的sFlt-1/PlGF比例的绝对变化

[0148]

[0149] 表8：sFlt-1/PlGF比例的增益百分比

[0150]

[0151] 表9：sFlt-1/PlGF比例的增益在100％或以上的患者列表

[0152]

[0153] 表10：sFlt-1/PlGF比例的增益分组对最终结果

[0154]

[0155] 表11：依赖于作为截取值的增益的Sens/Spec

[0156] 由这一欧洲PE研究可见，sFlt-1/PlGF比例的剧烈升高(如本申请所提出的3倍或以上)看来是危急PE/HELLP的明确指示。

[0157] 实施例3：在结果患上先兆子痫的患者和健康对照中对生物标志物Endoglin和PlGF的分析

[0158] 研究并评估与实施例2中类似的患者样品的PlGF和Endoglin(s-Eng)血液水平。结果如下：

[0159]

[0160] 表12：第一次访问时的sEng/PlGF比例

[0161]

[0162] 表13：第一次访问时的sEng/PlGF比例

[0163]

[0164] 表14：sEng/PlGF比例在访问之间的绝对变化

[0165]

[0166] 表15：sEng/PlGF比例的百分比增益

[0167]

[0168] 表16：sEng/PlGF比例增益在100％或以上的患者列表

[0169]

[0170] 表17：分组的sEng/PlGF比例增益对最终结果

[0171] 以100％/200％增益作为截取值，其可换算为临床敏感性/特异性：

[0172]

[0173] 表18：依赖于作为分界线的增益的Sens/Spec

[0174] 健康对照和患有先兆子痫的患者在妊娠不同时间点，针对sFlt-1和PlGF确定的不同比例也以图表的形式示于图5A。针对Endoglin/PlGF比例的相同图表示于图5B。显而易见，sFlt-1/PlGF的比例和Endoglin/PlGF的比例呈现类似的分布，因此，它们是患先兆子痫的类似预示物。