用于诊断和监测猫科动物的甲状腺功能亢进的组合物和方法 |
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| 申请号 | CN201280029497.9 | 申请日 | 2012-06-14 | 公开(公告)号 | CN103597097B | 公开(公告)日 | 2016-08-17 |
| 申请人 | 希尔氏宠物营养品公司; | 发明人 | S.阿尔-穆拉尼; 高向明; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供诊断猫科动物的甲状腺功能亢进的存在或 风 险的方法，所述方法包括测量在来自猫科动物的 生物 样品中的选自以下的一种或多种生物标志物的表达 水 平：例如IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1、DUOX2 (ThOX)、TGFB1、CSTD、DCN和SEPP1及其表达产物，其中相对于来自正常猫科动物或猫科动物群体的样品中的表达对照值或猫科动物的基线值，样品中一种或多种生物标志物表达的升高表明甲状腺功能亢进的存在或风险； 治疗 经所述诊断的猫科动物的方法；和用于实施所述方法的组合物、 试剂 和 试剂盒 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.试剂在制备用于诊断猫科动物中甲状腺功能亢进的存在或高风险的试剂盒中的用途，所述诊断包括测量在猫科动物的生物样品中的IYD生物标志物的表达水平；并且任选测量IYD和选自以下的一种或多种生物标志物的表达：CHI3L1、PDZK1IP1、MAPK13、PGD、MBOAT7、CTSD、CYP4F3、TGFB1、C20orf3、ACAA2、HTATIP2、RHOC、G6PD、GSTP1、CAPG、AP1S1、ATP6V1D、CAPN1、LASS4、PDCL、HSD3B7、LRPAP1、PARP3、ATP6AP1、B3GNT8、SORT1、C13orf27、GP1BB、IGLL1、LRRC4B、MALT1、REV3L、GNL3、RNPC3、LMO4、RFXAP、MPP6、DTWD1、MYC、TCEA3、RPAP2、ZNF292、CSGALNACT1、ZFP37、IGJ、LTBP1、ABCA5、GPRASP2、ARMCX1、SEPP1、DCN；TG、SLC5A5 (NIS)、TPO、TSHR和DUOX2 (ThOX)中的任一种；及其表达产物，其中相对于来自正常猫科动物或猫科动物群体的样品中的表达对照值和/或相对于来自猫科动物之前的各个基线值，样品中IYD、CHI3L1、PDZK1IP1、MAPK13、PGD、MBOAT7、CTSD、CYP4F3、TGFB1、C20orf3、ACAA2、HTATIP2、RHOC、G6PD、GSTP1、CAPG、AP1S1、ATP6V1D、CAPN1、LASS4、PDCL、HSD3B7、LRPAP1、PARP3、ATP6AP1、B3GNT8、SORT1、TG、SLC5A5 (NIS)、TPO、TSHR和DUOX2 (ThOX)表达增加，和/或C13orf27、GP1BB、IGLL1、LRRC4B、MALT1、REV3L、GNL3、RNPC3、LMO4、RFXAP、MPP6、DTWD1、MYC、TCEA3、RPAP2、ZNF292、CSGALNACT1、ZFP37、IGJ、LTBP1、ABCA5、GPRASP2、ARMCX1、SEPP1、DCN表达降低表明甲状腺功能亢进的存在或高风险。 |
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| 说明书全文 | 用于诊断和监测猫科动物的甲状腺功能亢进的组合物和方法发明领域 [0001] 本发明涉及用于诊断和/或监测猫科动物的甲状腺功能亢进和与甲状腺功能亢进有关或由甲状腺功能亢进引起的猫科动物疾病和病症的组合物、材料和方法。 [0002] 发明背景 [0003] 甲状腺功能亢进是猫科动物中最常见的激素异常。它最常见于老年猫科动物，在雌性中略微比雄性中更常见。甲状腺功能亢进是因甲状腺激素、特别是甲状腺素或T-4过量产生引起。T-4的过量产生显著提高动物的基础代谢率，导致体重减轻、食欲增加、烦燥、皮毛差、心动过速、饮水和排尿增加、呕吐、腹泻、气促、呼吸困难、发热、血压升高和最终的衰弱、精神萎靡、肌肉震颤、消瘦和死亡。晚期甲状腺功能亢进常与肾脏问题和心脏问题有关。有效治疗包括使用抑制甲状腺激素产生的药物(例如甲巯咪唑或卡比马唑)、破坏过度活跃的甲状腺细胞的放射性碘疗法和外科甲状腺切除术。然而，如果疾病发现得太晚，损害则可能是不可逆的。因此，早期诊断至关重要。 [0004] 用于诊断甲状腺功能亢进最常见的试验是针对T-4的血液检验，其中T-4水平显著升高表明甲状腺功能亢进；或者T-3抑制试验，其测量T-4在响应给予T-3时的抑制，其中缺乏抑制表明甲状腺功能亢进状态。然而，猫科动物的T-3和T-4水平在每日过程中可波动，使得试验不可靠，而且还存在可能人为降低T-4水平的各种疾病，因此掩蔽了甲状腺功能亢进状态。使用锝的甲状腺放射性成像是可行的，并且可用于检测肿瘤或异常的甲状腺组织，但它却是昂贵的。 [0005] 因此，需要检测猫科动物甲状腺功能亢进的高效且有效的备选方法。 [0006] 已开发出研究差异基因表达的多种方法，例如DNA微阵列、表达标签测序(EST)、基因表达连续分析(SAGE)、扣除杂交、扣除克隆和mRNA差别显示(DD)、RNA任意引物PCR (RAP-PCR)、实时PCR (RT-PCR)、代表性差别分析(RDA)、二维凝胶电泳、质谱法和针对蛋白质的基于蛋白质微阵列的抗体结合。 [0007] 由于参与甲状腺功能亢进的生物学途径和内在分子相互作用以及胞间信号转导过程的复杂性，十分需要了解遗传水平上发生的相互作用。猫科动物中甲状腺功能亢进早期阶段失调基因的检测有助于在全基因组基础上了解猫科动物甲状腺功能亢进的生物学，这将有助于设计用于确定甲状腺功能亢进的发展风险、确定甲状腺功能亢进的诱因、诊断甲状腺功能亢进以及设计和监测甲状腺功能亢进的治疗方案的方法。 [0008] 更详细地了解涉及整个基因表达概况的生物学途径可有助于开发诊断程序、试剂和检验试剂盒以及疾病途径中的有益药物、营养药和营养品(膳食)的干预。这些方法能够早期检出并可能预防或治疗潜在的病症。参与甲状腺病症病理学的失调基因可用作重要的生物标志物，用于诊断和可能预防或治疗所述病症，并且优化合适药物、营养药和营养品(膳食)干预的选择。 [0009] 可利用猫科动物中基因表达的水平和/或所表达的基因产物起作用的水平测定以选择用于治疗或预防用途的合适药剂。通过基因表达概况，技术人员可在选择作为预防或治疗猫科动物的肾病的药剂的合适药物时利用该数据。基因表达数据和分析还可用于通过利用指示肾功能健康状态的生物标志物，选择对促进正常甲状腺功能表现具有有益作用的营养组合物、膳食补充剂和营养药。 [0010] 迄今在针对与猫科动物疾病诊断有关的基因表达概况筛选猫科动物基因组方面只进行了极有限的工作。尚未广泛进行在猫科动物健康群体相对于患有疾病(例如本说明书所述甲状腺功能亢进)的群体方面的研究。很少可获得有关猫科动物基因组表达概况、尤其有关猫科动物的肾病随时间推移而发展的数据。 [0011] 甲状腺功能亢进是猫科动物死亡的主要原因。为了有效治疗甲状腺功能亢进，在对心脏和/或肾存在不可逆的损害之前，早期诊断和治疗是必要的。因此，需要更好的方法以鉴定患有甲状腺功能亢进或甲状腺功能亢进风险升高的动物，使得它们可被适当治疗。 [0012] 发明概述 [0013] 本发明人研究了患甲状腺功能亢进的猫科动物的甲状腺组织和全血中的基因表达。在组织研究中，在甲状腺功能亢进的猫科动物和无甲状腺功能亢进的猫科动物之间发现1308个显著差异表达基因，其FDR (假发现率) = 0.1，表达的倍数变化>= +/-1.25。在全血研究中，在甲状腺功能亢进的猫科动物和无甲状腺功能亢进的猫科动物间发现了1094个显著基因，具有与上文所示的相同的截止值(cutoff)。在组织研究中，发现已知参与导致甲状腺激素产生的途径的所有基因在甲状腺功能亢进的猫科动物中上调。这些基因的表达增加显然促进猫科动物机体中的高T4产生。在全血研究中，发现60个基因与从实质组织材料中发现的那些基因重叠，其表现在与在组织研究中观察到的相同的方向上调节。如在全血以及在组织中的试验，通过使用这60个基因，可将甲状腺功能亢进的猫科动物与正常猫科动物区别开来。列于下表A和表B的这60个基因，可允许检测猫科动物甲状腺功能亢进。 [0014] 因此，本发明提供用于诊断和/或监测猫科动物的甲状腺功能亢进和与甲状腺功能亢进有关或由甲状腺功能亢进引起的猫科动物疾病和病症的组合物、材料和方法，包括用于以下的组合物和方法：测定猫科动物的甲状腺功能亢进的发展风险、鉴定猫科动物的甲状腺功能亢进的诱因、诊断猫科动物的甲状腺功能亢进、设计和监测猫科动物的甲状腺功能亢进的治疗方案和监测猫科动物的甲状腺功能亢进的状态，其中通过利用从获自所述猫科动物的生物试验样品中分离和测量的至少一种相关生物标志物，可检出甲状腺功能亢进，其中所述生物标志物的表达与所述疾病正相关或负相关。用于本发明的组合物和方法的实践的相关生物标志物包括存在于所述猫科动物的所述生物试验样品中的多核苷酸或蛋白质。用于本发明方法的实践的生物试验样品可包括例如来自所述猫科动物的组织样品。还可根据所进行的分泌，选择生物标志物，使得它们可在血清或血浆中或在尿液中检出。因此生物试验样品还可以是获自所述猫科动物的生物流体的样品，例如血液或尿液。 [0015] 发现在甲状腺激素过量产生中特别上调的基因包括： [0016] IYD (增加4.55倍)：该基因编码催化一碘酪氨酸和二碘酪氨酸(其是甲状腺激素产生的卤化副产物)的氧化NADPH依赖性脱碘的酶。该蛋白质的N端起膜锚着点的作用。该基因的突变由于激素生成异常4型(其亦称为脱碘酶缺乏或碘酪氨酸脱卤素酶缺乏或甲状腺激素生成4型)所致，引起先天性甲状腺功能减退。 [0017] TG (增加2.02倍)：甲状腺球蛋白(Tg)是一种主要由甲状腺产生的糖蛋白同二聚体。它起甲状腺素和三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine)的合成底物以及无活性形式的甲状腺激素和碘的储存的作用。甲状腺球蛋白自内质网分泌至其碘化部位，随后在滤泡腔中进行甲状腺素生物合成。该基因的突变引起甲状腺激素生成异常(表现为甲状腺肿)，并且与中度至重度先天性甲状腺功能减退有关。 [0018] SLC5A5，NIS (增加4.6倍)：该基因编码钠葡萄糖协同转运蛋白家族的成员。编码的蛋白质负责组织(例如甲状腺和分泌乳汁的乳房组织)中碘的摄取。被甲状腺摄入的碘被掺入代谢调节剂三碘甲腺原氨酸(T3)和四碘甲腺原氨酸(T4)中。该基因的突变与甲状腺激素生成异常1有关。 [0019] TPO (增加4.06倍)：该基因编码一种膜结合糖蛋白。编码的蛋白质起酶的作用，并且在甲状腺功能中起重要作用。该蛋白质在甲状腺球蛋白的酪氨酸残基的碘化和碘化酪氨酸对之间形成苯氧基酯中起作用以产生甲状腺激素、甲状腺素和三碘甲腺原氨酸。该基因的突变与甲状腺激素生成的几种病症有关，包括先天性甲状腺功能减退、先天性甲状腺肿和甲状腺激素有机化缺陷IIA。 [0020] TSHR (增加2.2倍)：由该基因编码的蛋白质是一种膜蛋白，并且是甲状腺细胞代谢的主要控制器。编码的蛋白质是促甲状腺素(thyrothropin)和甲状腺刺激素(thyrostimulin)的受体，并且其活性受腺苷酸环化酶介导。该基因的缺陷是几种类型的甲状腺功能亢进的原因。 [0021] DUOX2，ThOX (增加1.55倍)：由该基因编码的蛋白质是一种糖蛋白和NADPH氧化酶家族的成员。甲状腺激素的合成被位于甲状腺滤泡细胞顶端膜上的蛋白质复合物催化。该复合物含有碘化物转运蛋白、甲状腺过氧化物酶和包括该编码的蛋白质和DUOX1的过氧化物产生系统。已知该蛋白质为双重氧化酶，因为它具有过氧化物酶同源结构域和gp91phox结构域两者。 [0022] 在甲状腺功能亢进的猫科动物的血液和甲状腺组织两者中上调的其它基因包括下列基因： [0023] 表A [0024] [0025] 因此，例如该表A中基因的上调可用作甲状腺功能亢进的生物标志物。之前并不知道这些基因参与甲状腺功能亢进。例如，TGFB1编码细胞因子的转化生长因子β (TGFB)家族的成员，所述细胞因子是在许多细胞类型中调节增殖、分化、粘附、迁移和其它功能的多功能肽。该蛋白质正调节和负调节许多其它的生长因子。该分泌的蛋白质被切割成潜伏状态相关肽(LAP)和成熟TGFB1肽。该成熟肽还可与其它TGFB家族成员一起形成异二聚体。该基因常常在肿瘤细胞中上调，且该基因的突变导致卡-恩二氏病(Camurati-Engelmann disease)。之前不知道它涉及甲状腺功能。CSTD编码溶酶体天冬氨酰蛋白酶。该蛋白水解酶(其是肽酶C1家族的成员)具有类似于胃蛋白酶A但比胃蛋白酶A窄的特异性。该基因的转录自数个位点开始，包括其是雌激素调节转录物起始位点的一个位点。该基因的突变涉及数种疾病的发病机制，所述疾病包括乳腺癌，并可能包括阿尔茨海默病(Alzheimer disease)。之前不知道该基因涉及甲状腺功能。 [0026] 在甲状腺功能亢进的猫科动物的血液和甲状腺组织两者中下调的基因包括： [0027] 表B： [0028] [0029] 因此，例如该表B中基因的下调可用作甲状腺功能亢进的生物标志物。例如，由DCN基因编码的蛋白质是一种小的细胞基质或细胞周围基质蛋白聚糖，其在结构上与二聚糖蛋白紧密相关。它是结缔组织的组分，与I型胶原原纤维结合，并且在基质装配中起作用。它能够抑制各种肿瘤细胞系的生长。该基因是马方(Marfan)综合征的候选基因。之前不知道它涉及甲状腺功能。SEPP1是一种分泌的蛋白质，并不常见，因为它含有每多肽10个硒代半胱氨酸残基，构成血浆中的大部分硒。它牵涉到作为胞外抗氧化剂，并牵涉硒的转运，但之前不知道它涉及甲状腺功能。 [0030] 因此，本发明提供通过测量猫科动物的一种或多种生物标志物的表达水平来诊断所述猫科动物的甲状腺功能亢进或测量所述猫科动物的甲状腺功能亢进的风险或诱因的方法(方法1)，所述一种或多种生物标志物选自表A所列基因 (例如TGFB1和/或CSTD)和表B 所列基因(例如DCN和/或SEPP1)或以下基因中的任一种：IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1和DUOX2 (ThOX)；这些基因的表达产物；及其任何组合，其中例如按照下列任一方法，相对于正常群体，一种或多种、例如至少3种、例如5种或更多种、例如至少10种所述生物标志物表达发生改变或者相对于猫科动物个体基线表达发生改变表明甲状腺功能亢进或甲状腺功能亢进的风险增加或有甲状腺功能亢进的诱因： [0031] 1.1. 方法1，其中采用(i)包含与对应于待测量的一种或多种标志物基因的mRNA或cDNA互补的一种或多种寡核苷酸的DNA微阵列，或(ii)用对应于待测量的一种或多种标志物基因的mRNA或cDNA的寡核苷酸引物的定量聚合酶链式反应，测定一种或多种生物标志物的表达水平，例如 [0032] a. 前述方法，其中测量一种或多种生物标志物的基因表达的步骤包括：(i)从组织样品中分离RNA，(ii)反转录RNA，获得相应的cDNA，(iii)分离由此获得的cDNA并使之片段化，(iv)使cDNA片段与DNA微阵列接触，所述微阵列包含与对应于待测量的一种或多种生物标志物的cDNA互补的一种或多种寡核苷酸，和(v)检测cDNA片段和DNA微阵列中的一种或多种寡核苷酸之间的杂交。 [0033] b. 涉及检测杂交的前述方法中的任一种，其中cDNA片段和DNA微阵列中的一种或多种寡核苷酸之间的杂交在严格条件下进行。 [0034] 1.2. 方法1，其中通过表达的蛋白质的抗体，检测生物标志物的表达水平。 [0035] a. 方法1.2，其中生物标志物通过选自以下的免疫测定法检测：竞争结合测定法、非竞争结合测定法、放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、夹心测定法、沉淀素反应、凝胶扩散免疫扩散测定法、凝集测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法、免疫PCR免疫测定法、蛋白A或蛋白G免疫测定法和免疫电泳测定法。 [0036] b. 前述方法，其为酶联免疫吸附测定法(ELISA)。 [0037] c. 方法1.2，其中测定法是侧向流动免疫色谱测定法。 [0038] d. 方法1.2，其中生物样品是血液或尿液。 [0039] 1.3. 方法1，其中通过定量质谱法测量生物样品中表达的蛋白质，来检测生物标志物的表达水平，例如，其中生物样品是血液或尿液。 [0040] 1.4. 方法1，其中通过识别表达的蛋白质的适配体来检测生物标志物的表达水平。 [0041] a. 方法1.4，其中适配体是寡核苷酸。 [0042] b. 方法1.4，其中适配体是肽。 [0043] c. 方法1.4，其中生物样品是血液或尿液。 [0044] 1.5. 前述方法中的任一种，其中相对于正常样品中表达的对照值，生物样品中一种或多种生物标志物的表达水平大于1.25倍，例如至少30%变化。 [0045] 1.6. 前述方法中的任一种，其中使生物样品中一种或多种生物标志物的表达水平相对于已知具有相对稳定表达的一种或多种基因的表达归一化。 [0046] 1.7. 前述方法中的任一种，其中生物样品是甲状腺组织的样品。 [0047] 1.8. 前述方法中的任一种，其中生物样品是血液。 [0048] 1.9. 前述方法中的任一种，还包括向诊断患有甲状腺功能亢进或甲状腺功能亢进的风险增加或有甲状腺功能亢进的诱因的猫科动物提供受限于碘、硒或花生四烯酸中的一种或多种的饮食，例如以下饮食，其中碘的水平小于0.35 mg/kg，例如0.01-0.25 mg/kg；硒的水平小于0.1 mg/kg，例如0.01-0.05 mg/kg；和/或花生四烯酸的水平小于或等于 0.02%，例如0.005-0.01%。 [0049] 1.10. 前述方法中的任一种，还包括给予诊断患有甲状腺功能亢进或甲状腺功能亢进的风险增加或有甲状腺功能亢进的诱因的猫科动物治疗以降低甲状腺激素产生，例如给予有效量的抑制T-4产生的药物(例如甲巯咪唑或卡比马唑)和/或给予放射性碘疗法和/或施行外科甲状腺切除术。 [0050] 在又一个实施方案中，本发明提供任选标记的试剂，所述试剂用于检测一种或多种生物标志物的表达水平，所述生物标志物选自：IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1或DUOX2 (ThOX)，或者来自表A或表B (例如TGFB1、CSTD、DCN或SEPP1)，及其表达产物，例如，[0051] a. 抗体，例如单克隆抗体、单链抗体和功能性抗体片段，其识别选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1或DUOX2 (ThOX)或者来自表A或表B的基因(例如TGFB1、CSTD、DCN或SEPP1)的表达产物的猫科动物蛋白质。 [0052] b. 适配体，例如核酸或肽适配体，其识别选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1或DUOX2 (ThOX)或者来自表A或表B的基因(例如TGFB1、CSTD、DCN或SEPP1)的表达产物的猫科动物蛋白质。 [0053] c. 选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1或DUOX2 (ThOX)或者来自表A或表B的基因(例如TGFB1、CSTD、DCN或SEPP1)的表达产物的分离和纯化的或重组的猫科动物蛋白质。 [0054] d. 能够与选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1或DUOX2 (ThOX)或者来自表A或表B的基因(例如TGFB1、CSTD、DCN或SEPP1)的猫科动物基因杂交的寡核苷酸探针。 [0055] e. 在又一个实施方案中，本发明提供用于诊断、预后或监测猫科动物的甲状腺病症的试剂盒(试剂盒1)，其包含 [0056] i. 测量猫科动物生物样品中选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1或DUOX2 (ThOX)或者选自表A或表B (例如TGFB1、CSTD、DCN或SEPP1)的一种或多种生物标志物的基因表达及其表达产物的工具，和 [0057] ii. 使用所述工具测量猫科动物生物样品中的一种或多种生物标志物的表达，并评价导致猫科动物的甲状腺病症的过程的风险、诱因或存在情况的使用说明，例如[0058] 1.1 试剂盒1，其中用于测量一种或多种生物标志物的工具是能够检测一种或多种生物标志物的基因表达的一种或多种核酸探针； [0059] 1.2 前述试剂盒中的任何一种，其包含DNA微阵列，所述DNA微阵列包含能够检测一种或多种生物标志物的基因表达的一种或多种核酸探针。 [0060] 1.3 试剂盒1，其中用于测量一种或多种生物标志物的工具是能够通过识别表达的蛋白质来检测一种或多种生物标志物的基因表达的一种或多种抗体。 [0061] 1.4 ELISA形式的试剂盒1.3，其包含能够检测一种或多种生物标志物的抗体；对应于表达的蛋白质的分离、纯化或重组的蛋白质；和缓冲液。 [0062] 1.5 试剂盒1，其中用于测量一种或多种生物标志物的工具是例如上文所述的一种或多种适配体，所述适配体能够通过识别表达的蛋白质检测一种或多种生物标志物的基因表达。 [0063] 1.6 前述试剂盒中的任何一种，其适用于任何前述方法1以及以下方法。 [0064] 本发明还提供以下方面在方法1的方法及以下方法中或在制备试剂盒1的试剂盒以及下试剂盒中的用途： [0065] 对应于IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1或DUOX2 (ThOX)或者来自表A或表B (例如TGFB1、CSTD、DCN或SEPP1)的基因或与之互补的核苷酸序列， [0066] 或者选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1或DUOX2 (ThOX)或者来自表A或表B (例如TGFB1、CSTD、DCN或SEPP1)的蛋白质的抗体，或 [0067] 选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1或DUOX2 (ThOX)或者来自表A或表B (例如TGFB1、CSTD、DCN或SEPP1)的蛋白质的适配体，或 [0068] 选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1或DUOX2 (ThOX)或者来自表A或表B (例如TGFB1、CSTD、DCN或SEPP1)的分离的、纯化的或重组的猫科动物蛋白质。 [0069] 本发明的其他适用领域从下文提供的详述来看将是显而易见的。应理解，详述和具体的实施例虽然说明本发明的优选实施方案，但仅意指用于举例说明的目的，并无意限制本发明的范围。 [0070] 发明详述 [0071] 下列优选实施方案的描述在性质上只是例证性的，绝不意指限制本发明、其应用或用途。 [0072] 某些定义 [0073] 术语“抗体”意指与特定抗原结合的任何免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE抗体。该术语包括多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、人源化抗体、异型缀合(heteroconjugate)抗体、具有多表位特异性的抗体组合物、嵌合抗体、双特异性抗体、双抗体、单链抗体和抗体片段例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv或其它抗原结合片段。 [0074] 术语“阵列”意指基质上至少两种探针的有序排列。探针中的至少一种是对照或标准，并且探针中的至少一种是诊断探针。基质上约2-约40,000种探针的排列确保了探针与样品多核苷酸或多肽之间形成的各个标记复合物的大小和信号强度是各自可区分的。可以合成方法或以生物合成方法制备置于阵列上的分子集合。阵列可呈各种形式，包括可溶分子文库、与树脂珠粒连接的化合物文库，二氧化硅芯片或其它固相支持体。核酸阵列可包括核酸文库，其可通过将基本上任何长度(例如长为1-约1,000个核苷酸)的核酸点样在基质上来制备。核酸探针阵列优选包含在已知位置上与基质结合的核酸。在其它实施方案中，该系统可包括固相支持体或基质，例如膜、滤器、显微镜载玻片、微孔、样品管、珠粒、珠粒阵列等。固相支持体可由各种材料制成，包括纸、纤维素、尼龙、聚苯乙烯、聚碳酸酯、塑料、琉璃、陶瓷、不锈钢等。固相支持体可优选具有刚性或半刚性表面，并可优选为球形(例如珠粒)或基本平面的(例如平坦表面)，具有合适的孔、凸起区、蚀刻槽等。固相支持体还可包括核酸可包埋在其中的凝胶或基质。 [0075] 术语“生物标志物”是指基因和由本发明的基因或其同源物(尤其是其猫科动物同源物)编码的基因产物，其中所述基因已被测定为由于疾病、病况、病症或给予物质、药物、营养物或膳食组分或其组合而差异表达。生物标志物可以是多核苷酸、多肽、蛋白质、RNA (包括RNA转录物或其翻译产物)、DNA、cDNA、前述分子中的一种或多种的代谢产物或前述分子中任一种的有用变体，其差异表达与甲状腺病症有关，且其中获自试验动物的样品与获自对照动物的样品中的所述差异表达的相关性可用于诊断、预后、监测或治疗有其需要的动物的病况、疾病或病症。另外，例如在本发明的测定法或其它方法中，生物标志物通常可用来指所述基因或蛋白质的任何部分或区段，其可鉴定全长基因或蛋白质或者与之关联。还可通过检测生物标志物翻译(即检测样品中的生物标志物蛋白质)，来鉴定生物标志物表达。适于生物标志物蛋白质检测的方法包括用于检测和/或测量来自细胞或细胞提取物的蛋白质的任何合适方法。这样的方法包括但不限于免疫印迹(例如蛋白质印迹)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、免疫沉淀法、免疫组织化学和免疫荧光。用于检测蛋白质的特别优选的方法包括任何单细胞测定法，其包括免疫组织化学测定法和免疫荧光测定法。这类方法是本领域众所周知的。此外，针对本文所述某些生物标志物的抗体是本领域已知的，并描述于公开的文献中，并且其制备方法为本领域技术人员所熟知。 [0076] 在用比较试验样品与对照样品的表达时，术语“可比较的”应指相似性质和量的表示，并且应包括而不限于进行所述比较的平均值附近标准偏差为1的范围内的值，大以及包含试验样品和对照样品之间差异表达的值。 [0077] 可互换使用的术语“差异表达基因”、“差异基因表达”、“差异表达”或“差异表达的”及其同义词是指这样的基因，与其在正常或对照受试者中的表达相比，在患有疾病、病况或病症的受试者中，或由于受试者被给予物质、药物、营养物或膳食组分或其组合，所述基因的表达被激活到较高或较低的水平。该术语还包括在相同疾病的不同阶段其表达被激活至较高或较低水平的基因。还应理解的是，差异表达的基因可在核酸水平或蛋白质水平上被激活或抑制，或可进行可变剪接以产生不同的多肽产物。可通过在例如mRNA水平、多肽的表面表达、分泌或其它分配上的变化来证实所述差异。差异基因表达可包括两种或更多种基因或其基因产物间的表达比较，或两种或更多种基因或其基因产物间的表达比率比较，或者甚至相同基因的两种不同加工产物的比较，其在正常受试者和患有疾病、病况或病症的受试者之间，或者由于受试者被给予物质、药物、营养物或膳食组分或其组合，或在相同疾病、病况或病症的不同阶段之间，或者由于受试者被给予不同量的物质、药物、营养物或膳食组分或其组合而不同。差异表达包括在例如正常和患病细胞中，或者在经历不同疾病事件或疾病阶段的细胞中，在基因或其表达产物的时序表达模式或细胞表达模式上定量以及定性两者的差异。对于本发明的目的，当样品中转录的多核苷酸或翻译的蛋白质的量上有至少约2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1或1.0倍，优选至少约2倍或更高，更优选至少约2.5、3或4或更高倍的变化时，视为存在“差异基因表达”。 [0078] 术语“倍”当用作差异基因表达的度量时，意指猫科动物中基因表达的量是与比较的猫科动物(例如患有与甲状腺功能亢进相关的症状、有甲状腺功能亢进的风险或患有甲状腺功能亢进的猫科动物与未显示这类病况的动物相比较)中基因表达的量相比的基因表达的倍数或分数。例如，在动物中的表达是比较动物的2倍的基因具有2倍的差异基因表达，在动物中的表达是比较动物的1/2的基因亦具有2倍的差异基因表达。 [0079] 术语“片段”意指(1)是完整序列的一部分且对于特定用途具有与完整的多核苷酸序列相同或类似的活性的寡核苷酸或多核苷酸序列，或(2)是完整序列的一部分且对于特定用途具有与完整的多肽序列相同或类似的活性的肽或多肽序列。这样的片段可包含被视为适于特定用途的任何数目的核苷酸或氨基酸。通常，寡核苷酸或多核苷酸片段含有来自完整序列的至少约10、50、100或1000个核苷酸，多肽片段含有至少约4、10、20或50个连续氨基酸。该术语包括片段的多核苷酸和多肽变体。例如，多核苷酸可分解或片段化成多个区段。 [0080] 使核酸片段化的各种方法是本领域众所周知的。这些方法在性质上可为例如化学或物理的。化学片段化可包括用DNA酶部分降解；用酸部分脱嘌呤；使用限制性内切酶；内含子编码的内切核酸酶；基于DNA的切割方法，例如三链体和杂合体形成方法，这取决于将切割剂(cleavage agent)定位于核酸分子的特定位置的核酸区段的特异性杂交；或在已知或未知位置上切割DNA的其它酶或化合物。物理片段化方法可包括使DNA遭受高剪切速率。例如，可通过使DNA通过具有凹陷或尖头的室或通道移动，或迫使DNA样品通过大小受限的流道(例如具有微米或亚微米范围的横截面尺寸的孔)，来产生高剪切速率。其它物理方法包括超声处理和雾化。同样可采用物理和化学片段化方法的组合，例如通过热和离子介导的水解的片段化。参见例如Sambrook等，“Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) (“Sambrook等)，其通过引用结合到本文中用于所有目的。可优化这些方法以将核酸消化成为选定尺寸范围的片段。有用的尺寸范围可为100、200、400、700或1000至500、800、1500、2000、4000或10,000个碱基对。然而，较大的尺寸范围例如4000、10,000或20,000至10,000、 20,000或500,000个碱基对也可以是有用的。 [0081] 术语“基因”或“多个基因”意指参与产生多肽的DNA的全部或部分区段，包括在编码区之前和之后的区域(前导序列和尾随序列)及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。该术语包括与基因编码序列的互补序列杂交的任何DNA序列。 [0082] 术语“同源物”意指(1)多核苷酸，包括来自相同或不同动物物种的多核苷酸，其与某一多核苷酸具有大于30%、50%、70%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相似性，且具有与完整多核苷酸相同或基本相同的性质和进行相同或基本相同的功能，或具有在严格条件下与多核苷酸特异性杂交的能力，或(2)多肽，包括来自相同或不同动物物种的多肽，其与通过多核苷酸表达所鉴定的多肽具有大于30%、50%、70%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列相似性，且具有与完整多肽相同或基本相同的性质和进行相同或基本相同的功能，或具有与通过多核苷酸的表达所鉴定的多肽特异性结合的能力。 两个多肽序列或两个多核苷酸序列的序列相似性采用本领域技术人员已知方法确定，例如Karlin和Altschul的算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (1990))。这类算法并入Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))。为了获得用于比较目的的空位化比对，可按Altschul等(Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))的描述使用Gapped Blast。当运用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。 [0083] 术语“杂交”是指其中两个单链多核苷酸非共价结合以形成稳定的双链多核苷酸的过程。术语“杂交”也可指三链杂交。所得(通常)双链多核苷酸为“杂合体”。形成稳定杂合体的多核苷酸群的比例在本文称为“杂交度”。 [0084] 杂交反应可以绝对或差别杂交形式进行。在绝对杂交形式中，来源于一个样品的多核苷酸在核酸阵列上与探针杂交。在形成杂交复合物后检出的信号与样品中的多核苷酸水平相关。在差别杂交形式中，来源于两个样品的多核苷酸用不同的标记部分标记。将这些不同标记的多核苷酸的混合物加入核酸阵列中。然后在其中来自两种不同标记的发射可各自检出的条件下检查核酸阵列。在一个实施方案中，使用荧光团Cy3和Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，N.J.)作为用于差别杂交形式的标记部分。 [0085] 可应用市售可获得的软件，例如由Affymetrix或Agilent Technologies提供的软件，对自核酸阵列采集的信号进行分析。杂交实验中优选包括例如用于扫描灵敏度、探针标记和cDNA或cRNA量化的对照。在进行进一步分析之前，可对杂交信号定标或归一化。例如，当在类似试验条件下使用超过一个阵列时，可将每个单独探针的杂交信号归一化以考虑杂交强度的变化。还可使用来自各个阵列中所含的内部归一化对照的强度使杂交信号归一化。另外，可以使用样品间具有相对一致表达水平的基因使其它基因的表达水平归一化。在一个实施方案中，本发明的核酸阵列中包括某些维持基因的探针。选择这些基因是因为它们在不同组的组织间显示稳定的表达水平。可根据这些维持基因的表达水平，使杂交信号归一化和/或定标。 [0086] 术语“杂交复合物”意指当一个多核苷酸的嘌呤与互补多核苷酸的嘧啶氢键键合(例如5’-A-G-T-C-3’碱基与3’-T-C-A-G-5’配对)时，样品多核苷酸之间形成的复合物。互补的程度和核苷酸类似物的使用影响杂交反应的效率和严格性。 [0087] 术语“杂交探针”包括能够以碱基特异性方式与核酸的互补链结合的核酸(例如寡核苷酸)。这类探针包括描述于Nielsen等，Science 254:1497-1500 (1991), Nielsen Curr. Opin. Biotechnol., 10:71-75 (1999)的肽核酸，及其它核酸类似物和核酸模拟物。参见1996年4月3日提交的美国专利号6,156,501。 [0088] “核酸序列”意指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，以及可以是单链或双链的并且代表有义链或反义链的基因组或合成来源的DNA或RNA。 [0089] 术语“多核苷酸”或“寡核苷酸”意指核苷酸的聚合物。该术语包括单链或双链的DNA和RNA (包括cDNA和mRNA)分子，如果是单链的，则其互补序列呈线性或环状形式。该术语还包括适当时具有与原始序列相同或基本相同的性质并进行与原始序列相同或基本相同的功能的序列的片段、变体、同源物和等位基因。当比对时，序列可以是完全互补的(无错配)，或可具有至多约30%序列错配。对于多核苷酸，优选所述链含有约20-10,000个核苷酸，更优选约150-3,500个核苷酸。对于寡核苷酸，优选所述链含有约2-100个核苷酸，更优选约6-30个核苷酸。多核苷酸或寡核苷酸的确切大小将取决于不同因素，并且取决于多核苷酸或寡核苷酸的特定应用和用途。该术语包括合成的和从天然来源分离和纯化的核苷酸聚合物。术语“多核苷酸”包括“寡核苷酸”。 [0090] 术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”意指氨基酸的聚合物。该术语包括天然存在的和非天然存在的(合成的)聚合物和其中人工化学模拟物取代一个或多个氨基酸的聚合物。该术语还包括具有与原始序列相同或基本相同的性质并执行与原始序列相同或基本相同的功能的片段、变体和同源物。该术语包括任何长度的聚合物，优选含有约2-1000个氨基酸的聚合物，更优选约5-500个氨基酸的聚合物。该术语包括合成的和从天然来源分离和纯化的氨基酸聚合物。 [0091] 术语“探针”意指(1)能够与具有与探针互补的序列的多核苷酸退火或特异性杂交的寡核苷酸或多核苷酸，其为RNA或DNA，不论是以在纯化的限制性内切酶消化物中天然存在的还是以合成方法产生的，或(2)能够特异性结合特定蛋白质或蛋白质片段以基本排除其它蛋白质或蛋白质片段的肽或多肽。寡核苷酸或多核苷酸探针可以是单链的或双链的。探针的确切长度取决于许多因素，包括温度、来源和用途。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性。寡核苷酸探针通常含有约10-100、15-50或15-25个核苷酸。在某些诊断应用中，多核苷酸探针含有约100-1000、300-600个核苷酸，优选约300个核苷酸。本文选择与特定靶序列的不同链“基本”互补的探针。这意味着探针在一组预定的条件下必需具有足够的互补性以便与其各自的靶序列特异性杂交或退火。因此，探针序列不必反映靶的确切互补序列。例如，非互补核苷酸片段可与探针的5’或3’末端连接，探针序列的其余部分与靶序列互补。或者，可将非互补碱基或较长的序列散布在探针中，只要探针序列与靶多核苷酸序列具有足够的互补性以与靶多核苷酸特异性退火。肽或多肽探针可以是蛋白质或肽与之特异性结合的任何分子，包括DNA (对于DNA结合蛋白)、抗体、细胞膜受体、肽、辅因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜、细胞器和细胞器膜。 [0092] 术语“样品”和“样本”意指含有多核苷酸的任何动物组织或流体，包括含有DNA和RNA的细胞和其它组织。实例包括：血液、肾、结缔组织、上皮、淋巴、肌肉、神经、痰等。样品可以是固体或液体，并且可含有DNA、RNA、cDNA，例如，体液例如血液或尿液、细胞、细胞制备物或其可溶部分或培养基等分部分、染色体、细胞器等。 [0093] 术语“特异性结合”意指两个分子间的特异而精确的相互作用，这取决于它们的结构，特别是它们的分子侧基。例如，调节蛋白插入到DNA分子的大沟中、沿两个单链核酸间的主链的氢键键合或蛋白质的表位与激动剂、拮抗剂或抗体之间的结合。 [0094] 术语“特异性杂交”意指充分互补序列的两个单链多核苷酸之间的缔合以允许在本领域常用的预定条件下进行所述杂交(有时称“基本互补”)。例如，按照本发明的一个方面，该术语可指多核苷酸探针与单链DNA或RNA分子中所包含的基本互补序列杂交，基本排除多核苷酸探针与非互补序列的单链多核苷酸的杂交。 [0095] 术语“严格条件”意指(1)在含0.1%牛血清白蛋白、0.1% Ficoll、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、50 mM磷酸钠缓冲液pH 6.5 (含750 mM NaCl、75 mM柠檬酸钠)的50% (vol/vol)甲酰胺中于42℃杂交，(2)在50%甲酰胺、5x SSC (0.75 M NaCl、0.075 M柠檬酸钠)、50 mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声处理的鲑精DNA (50 mg/ml)、0.1% SDS和10%硫酸葡聚糖中于42℃杂交；在42℃下在0.2x SSC和0.1% SDS中洗涤，或在50℃下用0.015 M NaCl、0.0015 M柠檬酸钠、0.1% Na2SO4洗涤，或使用类似低离子强度和高温洗涤剂和类似变性剂的类似的本领域公认的程序。 [0096] 术语“有用变异(useful variations)”意指(1)对于多核苷酸，为多核苷酸的互补序列；多核苷酸的同源物及其互补序列；多核苷酸的变体、其互补序列及其同源物；和多核苷酸的片段、其互补序列、其同源物及其变体，和(2)对于多肽，为多肽的同源物；多肽的变体及其同源物；和多肽(polynucleotide)的片段、其同源物及其变体。 [0097] 术语“变体”意指(1)含有从多核苷酸序列或对多核苷酸序列的一个或多个核苷酸上的任何取代、变异、修饰、置换、缺失或添加并且具有与原始序列相同或基本相同的性质并且进行与原始序列相同或基本相同的功能的多核苷酸序列，和(2)含有从多肽序列或对多肽序列的一个或多个氨基酸的任何取代、变异、修饰、置换、缺失或添加并且具有与原始序列相同或基本相同的性质并且执行与原始序列相同或基本相同的功能的多肽序列。因此该术语包括单核苷酸多态性(SNP)和等位基因变体，并且包括在多肽中的保守和非保守氨基酸取代。适当时，该术语还包括多核苷酸或多肽的化学衍生化和核苷酸或氨基酸被不是天然存在的核苷酸或氨基酸取代。 [0098] 除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语和任何首字母缩略词具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。 [0099] 探针 [0100] 可用于本发明实践并且用于鉴定猫科动物样品中的猫科动物生物标志物的探针对应于用于由Affymetrix制造的、标识为Affymetrix Feline GeneChip®的专有猫科动物基因芯片的下列探针标识号，如本说明书中更充分地描述。 [0101] 本发明的其它和进一步的目标、特征和优势对本领域技术人员而言将是易于显而易见的。 [0102] 在整个本公开内容中，本发明的各个方面可用范围形式表示。应理解的是，以范围形式的描述只是出于方便和简明，不应解释为对本发明范围的不可变更的限制。因此，范围的描述应视为已明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围例如1-5的描述应视为已明确公开了子范围例如1-3、1-4、2-4、2-5、3-5等，以及该范围内的各个数值，例如1、2、3、4和5。不论范围的宽度都适用。 [0103] 除非另有说明，否则本发明的实践可应用本领域技术范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接和使用标记的杂交检测。可参照下文的实施例对合适技术进行具体说明。然而，当然也可使用其它等同的常规程序。这样的常规技术和描述可见于标准实验室手册，例如Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (第I-IV卷)；Using Antibodies: A Laboratory Manual；Cells: A Laboratory Manual；PCR Primer: A Laboratory Manual；和Molecular Cloning: A Laboratory Manual (全部均来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Stryer, L. (1995) Biochemistry (第4版) Freeman, New York；Gait, “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000)；Lehninger, Principles of Biochemistry 第3版, W.H. Freeman Pub., New York, N.Y；以及Berg等(2002) Biochemistry, 第5版, W.H. Freeman Pub., New York, N.Y.，它们所有将通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。 [0104] 可用于本发明的核酸阵列包括从Affymetrix (Santa Clara，Calif.)的商标名GeneChip®下市售可得的核酸阵列。实例阵显示于affymetrix.com网站。 [0105] 本发明还考虑与固体基质连接的聚合物的许多用途。这些用途包括基因表达监测、概况分析、文库筛选、基因分型和诊断学。基因表达监测和概况分析方法可显示于美国专利号5,800,992、6,013,449、6,020,135、6,033,860、6,040,138、6,177,248、6,309,822和6,344,316。基因型分型及其用途显示于美国序号60/319,253、10/013,598和美国专利号5, 856,092、6,300,063、5,858,659、6,284,460、6,361,947、6,368,799和6,333,179。美国专利号5,871,928、5,902,723、6,045,996、5,541,061和6,197,506中包括了其它用途。 [0106] 本领域技术人员应认识到本发明所包括的产品和方法可应用于多种系统中，包括市售可获得的基因表达监测系统，其包括采用本领域已知的各种方法用各种材料构建的核酸探针阵列、膜印迹(membrane blot)、微孔、珠粒和样品管。因此，本发明不限于任何特定环境，并且本发明具体实施方案的下列描述仅用于说明目的。 [0107] 在一个优选的实施方案中，基因表达监测系统可包括核酸探针阵列(包括寡核苷酸阵列、cDNA阵列、斑点阵列(spotted array)等)、膜印迹(例如用于例如RNA杂交、DNA杂交、点杂交等的杂交分析)、或微孔、样品管、珠粒或纤维(或包含结合核酸的任何固相支持体)。参见美国专利号5,770,722、5,744,305、5,677,195、5,445,934和6,040,193，其通过引用结合到本文中。基因表达监测系统还可包括溶液中的核酸探针。 [0108] 本发明还考虑涉及扩增的样品制备。基因组样品可通过各种机制扩增，其中的一些可采用PCR。参见例如PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (编辑H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992)；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (编辑Innis等, Academic Press, San Diego, Calif., 1990)；Mattila等, Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991)；Eckert等, PCR Methods and Applications 1, 17 (1991)；PCR (编辑McPherson等, IRL Press, Oxford)；及美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159、4,965,188和5,333,675，它们每一个均通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。样品可在阵列上扩增。 参见例如美国专利号6,300,070和美国专利申请序号09/513,300，其通过引用结合到本文中。 [0109] 其它合适的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR) (例如Wu和Wallace, Genomics 4, 560 (1989)；Landegren等, Science 241, 1077 (1988)和Barringer等, Gene 89:117 (1990))；转录扩增(Kwoh等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)和WO88/ 10315)；自身维持的序列复制(Guatelli等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)和WO90/06995)；靶多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利号6,410,276)；共有序列引物聚合酶链式反应(CP-PCR) (美国专利号4,437,975)；任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR) (美国专利号5,413,909，5,861,245)和基于核酸的序列扩增(NABSA)。(参见美国专利号5,409,818、5,554,517和6,063,603，它们每一个均通过引用结合到本文中)。可采用的其它扩增方法描述于美国专利号5,242,794、5,494,810、4,988,617、6,344,316和美国序号 09/854,317，它们每一个均通过引用结合到本文中。 [0110] 样品制备的其它方法和技术描述于Dong等, Genome Research 11, 1418 (2001)；美国专利号6,361,947、6,391,592和美国专利申请序号09/916,135、09/920,491、09/910,292和10/013,598。 [0111] 可采用本发明的基因表达监测系统以利于不同细胞或组织、相同细胞或组织的不同亚群、相同细胞或组织的不同生理状态、相同细胞或组织的不同发育阶段或相同组织的不同细胞群的表达的比较分析。在一个优选的实施方案中，本发明的比例扩增方法可提供足以利于所测样品中的定量以及定性差异测量的可再现结果(即在有统计显著性的误差幅度或置信度以内)。 [0112] 多核苷酸杂交测定法是本领域众所周知的。杂交测定程序和条件将随应用而变化，并按照已知的通用结合方法选择，其包括以下文献提及的方法：Maniatis等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor, N.Y, 1989)；Berger和Kimmel, Methods in Enzymology, 第152卷, Guide to Molecular Cloning Techniques (Academic Press, Inc., San Diego, Calif., 1987)；Young和Davis, P.N.A.S, 80: 1194 (1983)。用于进行重复和受控的杂交反应的方法和装置描述于美国专利号5,871,928、5,874,219、6,045,996、6,386,749和6,391,623，它们每一个通过引用结合到本文中。配体间杂交的信号检测在某些优选的实施方案中。参见美国专利号5, 143,854、5,578,832、5,631,734、5,834,758、5,936,324、5,981,956、6,025,601、6,141, 096、6,185,030、6,201,639、6,218,803和6,225,625、美国专利申请60/364,731和PCT申请PCT/US99/06097 (以WO99/47964公布)，它们每一个同样通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。用于信号检测和强度数据处理的方法和装置公开于例如美国专利号5,143, 854、5,547,839、5,578,832、5,631,734、5,800,992、5,834,758；5,856,092、5,902,723、5, 936,324、5,981,956、6,025,601、6,090,555、6,141,096、6,185,030、6,201,639、6,218,803和6,225,625、美国专利申请60/364,731和PCT申请PCT/US99/06097 (以WO99/47964公布)，它们每一个同样通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。 [0113] 本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以改变。此外，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并无意限制本发明的范围。 [0114] 在一个实施方案中，本发明包括与正常动物相比，在异常动物中为差异表达的一个或多个基因或基因区段(“基因”如本文定义)。本发明基于与正常动物相比，在异常动物中差异表达的多核苷酸的发现。采用Affymetrix GeneChip®技术，通过比较获自诊断为异常的动物的组织样品中的基因与得自诊断为正常的动物的组织样品中的基因的表达，来鉴定基因。 [0115] 通过测量获自诊断为异常并患有甲状腺病症的猫科动物的组织样品中的基因表达与得自诊断为正常的猫科动物的组织样品中的基因表达的差异，来鉴定多核苷酸和基因。可通过技术人员已知的任何方法测定基因表达的改变。通常，通过测量转录(测定由基因产生的mRNA的量)或测量翻译(测定由基因产生的蛋白质的量)测定基因表达的变化。可采用技术人员已知的用于定量测定多核苷酸和蛋白质的任何方法来测定由基因产生的RNA或蛋白质的量。 [0116] 通常，采用聚合酶链式反应(PCR) (包括而不限于逆转录-PCR (RT-PCR)和定量实时PCR (qPCR))、短或长寡核苷酸阵列、cDNA阵列、EST测序、RNA印迹、SAGE、MPSS、MS、珠粒阵列和其它杂交方法，来测定mRNA表达。所测的RNA通常为mRNA或逆转录mRNA的形式。 [0117] 采用各种比色和光谱测定法以及例如定量蛋白质印迹法、ELISA、2D-凝胶、气相或液相色谱法、质谱法、lowry测定法、双缩脲测定法、荧光测定法、比浊方法、二喹啉甲酸测定法(bicinchoninic assay)、蛋白质芯片技术、红外线吸收、茚三酮、Bradford测定法和紫外线吸收等方法，来测定蛋白质或多肽表达。 [0118] 基因芯片允许大规模研究生物过程和测量某个时间点细胞内的活性。微阵列分析允许在大规模遗传基础上说明表型的差异。基因表达产物的实际测量是比测定序列本身更准确的基因功能的指示剂。微阵列分析以在指定时间定量测定细胞内基因mRNA转录物的浓度为基础。将DNA固定在介质上，并使标记的靶mRNA与阵列上的探针杂交。通过激光分析测量标记mRNA与探针的结合。测量值是所发射的光子的计数。对整个芯片进行扫描并进行数字成像。对图像进行处理以定位探针，并将强度测量结果分配给各探针。按这种方式，可测定上调和下调的基因。分析使技术人员能够找到具有类似表达概况的基因组别，并确定具有类似表达概况的组织。按这种方式，可以鉴定出解释在组织样品中观察到的差异的基因。 [0119] Affymetrix基因芯片通常利用对应于特定基因或EST的25bp的探针和11-20种探针的探针组。构建具有各为25bp的完全匹配和错配探针的芯片，前者与基因的特定区域完全互补，后者的第13个bp被取代以生成错配。应用探针求和算法(probe summarization algorithm)以确定本底校正、归一化和探针求和，这就将探针值转换成探针组表达值。RMA是可用于该目的的算法之一。该算法执行分析的最后两个步骤，探针-水平强度测量结果的归一化和求和。因此，完全匹配值经本底校正、归一化和求和成一组表达测量结果。 [0120] 原始数据应用GeneSpring 7.0版(GS)软件(Agilent Corporation)进行分析，并应用R-Bioconductor (RB)免费软件验证。应用两个软件包计算来自通过Affymetrix仪器生成的CEL文件的探针强度。分别应用R-Bioconductor和GeneSpring软件，计算每探针的Present/Absent/Marginal calls和P-值。 [0121] 通常通过测量至少一种基因的表达，来测定异常动物与正常动物相比的差异基因表达。优选测量两种或更多种差异表达基因的表达以提供基因表达模式或基因表达概况。更优选测量多种差异表达基因的表达以提供更重要的基因表达模式或概况的额外信息。 [0122] 本发明提供共同或单独用作或可能用作肾病标志物的多种标志物。在本发明特别有用的实施方案中，可选择多种这些标志物，并且可同时测量其mRNA表达以提供用于本申请描述的本发明的各个方面的表达概况。 [0123] 另一方面，本发明提供适于检测与正常猫科动物相比在异常猫科动物中差异表达的多种基因表达的装置。该装置包含基质，所述基质具有本发明的多种寡核苷酸或多核苷酸探针，所述探针在已知位置上与基质连接。该装置基本上是本文所述寡核苷酸或多核苷酸探针的固定形式。该装置可用于快速特异性地检测基因和多核苷酸及其表达模式和概况。通常使所述探针与基质或类似的固相支持体连接，并使含有一种或多种多核苷酸(例如基因、PCR产物、连接酶链式反应(LCR)产物、使用扩增技术合成的DNA序列或其混合物)的样品暴露于探针中，使得样品多核苷酸可与探针杂交。探针、样品多核苷酸或两者通常用荧光团或其它标签(例如链霉抗生物素)标记，并采用技术人员已知的方法检测。如果样品多核苷酸被标记，则可通过检测结合的荧光来检测杂交。如果探针被标记，则通常通过标记猝灭检测杂交。如果探针和样品多核苷酸两者均被标记，则通常通过监测由于两个结合标记接近所引起的颜色转变，来检测杂交。各种标记策略和标记为技术人员所知，特别是荧光标记。优选将探针固定在适于形成与本领域已知阵列可比较的阵列(已知为数个名称，包括DNA微阵列、基因芯片、生物芯片、DNA芯片和基因阵列)的基质上。 [0124] 用于测定样品中蛋白质的量或浓度的方法为技术人员所知。这样的方法包括放射免疫测定法、竞争结合测定法、蛋白质印迹分析和ELISA测定法。对于使用抗体的方法，多克隆和单克隆抗体是合适的。这类抗体可以是对蛋白质、蛋白质表位或蛋白质片段有免疫特异性的。 [0125] 本发明的一些实施方案利用抗体以检测和定量测定由本发明多核苷酸表达产生的蛋白质。虽然可通过免疫沉淀反应、亲和分离、蛋白质印迹分析、蛋白质阵列等检测蛋白质，但是优选的方法利用ELISA技术，其中将抗体固定在固相支持体上，并将靶蛋白质或肽暴露于固定的抗体中。探针或靶或两者可采用已知方法标记。 [0126] 在又一个方面，本发明提供用于检测与正常猫科动物相比在异常猫科动物样品中差异表达的一种或多种基因的差异表达的方法。所述方法包括(a)使包含与正常猫科动物相比在异常猫科动物中差异表达的多种多核苷酸探针的组合与样品中的多核苷酸杂交形成一种或多种杂交复合物；(b)任选使包含与正常猫科动物相比在异常猫科动物中差异表达的多种多核苷酸探针的组合与标准物中的多核苷酸杂交以形成一种或多种杂交复合物；(c)检测得自样品和任选得自步骤(b)的标准物的杂交复合物；和(d)比较得自样品的杂交复合物与得自标准物的杂交复合物，其中标准物和样品之间杂交复合物的量的差异表明样品中与正常动物相比在异常动物中差异表达的基因的差异表达。 [0127] 步骤(b)和部分步骤(c)是任选的，如果要进行两个或更多个试验系统的相对同期比较则采用。然而，在一个优选的实施方案中，用于比较的标准基于之前采用该方法获得的数据。 [0128] 将这些探针暴露于样品中形成杂交复合物，对其进行检测并与标准物的杂交复合物进行比较。得自样品和标准物的杂交复合物之间的差异表明样品中与正常猫科动物相比在异常猫科动物中差异表达的多核苷酸和由此基因的差异表达。在一个优选的实施方案中，制备探针以特异性地检测由自本发明鉴定的一种或多种基因或基因片段产生的多核苷酸或其片段。用于检测杂交复合物的方法为技术人员所已知。 [0129] 另一方面，本发明提供用于检测样品中与正常猫科动物相比在异常猫科动物中差异表达的基因的差异表达的方法。所述方法包括(a)使包含多种多肽探针的组合与样品中的蛋白质在允许发生探针和蛋白质特异性结合的条件下反应，其中与正常猫科动物相比在异常猫科动物中被探针结合的蛋白质差异表达；(b)任选使包含多种多肽探针的组合与标准物中的蛋白质在允许发生探针和蛋白质特异性结合的条件下反应，其中与正常猫科动物相比在异常猫科动物中被探针结合的蛋白质差异表达；(c)检测样品和任选来自步骤(b)的标准物中的特异性结合；和(d)对样品中的特异性结合与标准物中的特异性结合进行比较，其中标准物和样品中的特异性结合之间的差异表明样品中与正常猫科动物相比在异常猫科动物中差异表达的基因的差异表达。 [0130] 将这些探针暴露于样品中形成特异性结合，对其进行待检测并与标准物的特异性结合进行比较。来自样品和标准物的特异性结合间的差异表明样品中与正常猫科动物相比在异常猫科动物中差异表达的蛋白质和由此基因(特别是异常相关基因)的差异表达。在一个优选的实施方案中，制备探针以特异性检测由自本发明鉴定的一种或多种基因或基因片段产生的蛋白质或其片段。 [0131] 在一个实施方案中，方法还包括在多肽与蛋白质反应之前将猫科动物或样品暴露于试验物质。因此，比较表明试验物质是否改变样品中与正常猫科动物相比在异常猫科动物中差异表达的基因(特别是异常相关基因)的表达。 [0132] 如全文中所用，范围用作描述在该范围内的每个值和所有值的简写。可以选择范围内的任何值作为该范围的端值。另外，本文引用的全部参考文献均通过引用以其整体结合到本文中。在本公开内容的定义与所引用的参考文献中的定义有冲突的情况下，以本公开内容为准。 [0133] 实施例1—甲状腺功能亢进的猫科动物中的基因表达 [0134] 该研究致力于患甲状腺功能亢进的猫科动物的甲状腺组织和全血中的基因表达。由兽医根据临床迹象和升高的T4浓度对所有甲状腺功能亢进的猫科动物作出诊断。在组织研究中，发现在甲状腺功能亢进的猫科动物和无甲状腺功能亢进的猫科动物间有1308个显著差异表达基因，其FDR=0.1，倍数变化>= +/-1.25。在全血研究中，发现在甲状腺功能亢进的猫科动物和无甲状腺功能亢进的猫科动物间有1094个显著基因，具有与上所示相同的截止值。在组织研究中，发现在甲状腺功能亢进的猫科动物中，已知参与导致产生甲状腺激素的途径的所有基因均上调。这些基因的表达增加显然促进猫科动物机体中高的T4产生。在全血研究中，发现60个基因与在实质组织材料中发现的那些基因重叠，其表现出在与组织研究中所观察到的相同的方向上调节。通过使用这60个基因，按在全血以及在组织中的试验，可将甲状腺功能亢进的猫科动物与正常猫科动物区别开来。 [0135] 将猫科动物分成两组。一组包括无疾病迹象的猫科动物，另一组包括患甲状腺功能亢进的猫科动物。收获组织和全血两者用于基因表达分析。 [0136] 自实质组织分离RNA： [0137] 使用Ultra-Turrax T25 Power匀浆器，将组织样品匀浆。RNA采用SOP# LAB-LS-028.3概述的方案分离。按照生产商的说明书，使用Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)测定RNA的性质和数量。应用RNA integrity number (RIN；Agilent 2100 RIN Βeta Version软件)，测定RNA完整性。将纯化的RNA样品保存在-70℃下。 [0138] 自全血制备样品： [0139] 按照生产商的说明书，在PAXgene RNA血液管中收集并加工血液。在分离RNA前，将PAXgene RNA血液管保存在-20℃下(短期保存，<6个月)和-70℃ (> 6个月)。 [0140] 自全血分离RNA： [0141] 按照生产商的说明书(Qiagen，p/n 762164)，用PAXgene Blood RNA分离试剂盒分离RNA。按照生产商的说明书，使用Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)测定RNA的性质和数量。应用RNA integrity number (RIN；Agilent 2100 RIN Βeta Version软件)，测定RNA完整性。将纯化的RNA样品保存在-70℃下。 [0142] 全血探针制备： [0143] 标记和扩增试剂获自NuGEN Technologies，Inc (San Carlos，CA，USA)，按照生产商说明书制备生物素化cDNA靶。从约75 ng的总RNA合成双链cDNA，接着线性等温扩增(SPIA Amplification™ )步骤以产生单链cDNA。片段化后是使生物素与扩增的探针连接的直接标记过程。探针纯化使用DNA Clean and Concentrator-25 (Zymo Research，Orange，CA，USA)进行。 [0144] 实质组织探针制备： [0145] 标记和扩增试剂获自Affymetrix (3420 Central Expressway，Santa Clara，CA 95051)。使用一次循环cDNA合成试剂盒(One-cycle cDNA Synthesis Kit) (p/n 900431)和3’IVT标记试剂盒(3’IVT Labeling Kit) (p/n 900449)进行合成、片段化和标记各cDNA靶。所有cDNA靶按照生产商的说明书制备。使用GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix p/n 900371)进行探针纯化。重要的是注意，Affymetrix本身不再出售这些确切的产品，因为他们重新制成并重新命名了他们的标记和扩增产品系列，但是可获得等同产品。 [0146] 阵列杂交和处理(全血)： [0147] 在45℃下预杂交20分钟后，将1.5 μg的各靶cDNA与Affymetrix杂交对照在杂交缓冲液中混合，并用Feline-2 GeneChip®在45℃下杂交16小时。在除去杂交混合物后，将芯片在具有低严格性缓冲液(6 X含EDTA、0.01% Tween 20的标准磷酸盐水)和高严格性缓冲液(100 mM N-吗啉代-乙磺酸(MES)、0.1 M NaCl和0.01% Tween 20)的流体台(fluidics station)上洗涤，并用SAPE (链霉抗生物素藻红蛋白)染色。该过程之后是与正常山羊IgG和生物素化小鼠抗链霉抗生物素抗体(Vector Lab，BA-0500)一起温育，接着用SAPE再染色。将芯片在GeneChip® Scanner 3000 7G (Affymetrix Inc，Santa Clara，CA)中扫描以检测杂交信号。在每次扫描后立即手工进行图像检查(GeneChip® Expression Analysis Technical Manual. P/N 702232 Rev. 3，第II章和III章)。 [0148] 阵列杂交和处理(实体组织)： [0149] 在45℃下预杂交10分钟后，将4.4 μg的各靶cDNA与Affymetrix杂交对照在杂交缓冲液中混合，并用Feline-2 GeneChip®在45℃下杂交16-18小时。在除去杂交混合物后，将芯片在具有低严格性缓冲液(6 X含EDTA、0.01% Tween 20的标准磷酸盐水)和高严格性缓冲液(100 mM N-吗啉代-乙磺酸(MES)、0.1 M NaCl和0.01% Tween 20)的流体台上洗涤，并用SAPE (链霉抗生物素藻红蛋白)染色。该过程之后是与正常山羊IgG和生物素化小鼠抗链霉抗生物素抗体(Vector Lab，BA-0500)一起温育，接着用SAPE再染色。将芯片在GeneChip® Scanner 3000 7G (Affymetrix Inc，Santa Clara，CA)中扫描以检测杂交信号。在每次扫描后立即手工进行图像检查(GeneChip® Expression Analysis Technical Manual. P/N 702232 Rev. 3，第II章和III章)。 [0150] 数据分析： [0151] 应用用于基因表达数据软件(Partek Incorporated, 12747 Olive Blvd., Suite 205, St. Louis, Missouri 63141, U.S.A. http://www.partek.com/partekgs_geneexpression)的Partek® GS (Partek Inc., St. Charles, MO)进行数据分析。应用Robust Multichip Average (RMA)算法(Rafael. A. Irizarry, Benjamin M. Bolstad, Francois Collin, Leslie M. Cope, Bridget Hobbs和Terence P. Speed (2003), Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data (Affymetrix GeneChip探针水平数据求和) Nucleic Acids Research 31(4):e15)进行GeneChip®样品的背景调整、归一化和探针水平求和。进行ANOVA分析以找出任两组间的显著差异表达的基因，其最小FDR控制在0.1，各方向的倍数变化为1.25。我们的实证研究显示，Feline-2 GeneChip®的相关背景噪声水平为1.3倍。因此，该报告中提供的所有分析采用+/- 1.25倍截止值(以更具包容性)。此外，选择0.1的假发现率阈值(意味着观察数据的10%出于偶然)作为可接受的统计显著性的最低水平。 [0152] 该研究致力于在甲状腺组织和全血中有关猫科动物甲状腺功能亢进的基因表达。在组织研究中，发现1308个基因在甲状腺功能亢进的猫科动物和无甲状腺功能亢进的猫科动物之间显著差异表达，其FDR=0.1，倍数变化>=+/-1.25。在全血研究中，使用相同截止值，鉴定出1094个显著基因。 [0153] 两项研究的PCA分析表明，根据差异基因表达，甲状腺功能亢进的猫科动物群集在一起，并与无甲状腺功能亢进的猫科动物分隔开。 [0154] 猫科动物甲状腺功能亢进是内分泌病症，其与甲状腺产生的太多甲状腺激素有关。这种病况趋于影响中老年猫科动物，雄性和雌性两者有同等发生该病症的风险。甲状腺功能亢进影响猫科动物机体的每个器官和细胞(1)。 [0155] 测量了血液中的甲状腺激素甲状腺素(T4)水平。该激素的高水平特别表示有甲状腺功能亢进。在患有这种内分泌病症的大多数猫科动物中，T4水平非常高，使得甲状腺功能亢进毫无疑问是问题所在。然而，在某些情况下，猫科动物的激素水平将落入正常范围的上部水平之内。在这种情况下，可进行称为Free T4 (FT4)的进一步检验。在大多数情况下，这种第二甲状腺检验足以证实甲状腺功能亢进的诊断。 [0156] 此外，血液检验将显示高水平的红细胞和白细胞以及低水平的淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。此外，一些患甲状腺功能亢进的猫科动物可具有高水平的ALT。其它物质也可呈现高水平，例如其它酶、化学物质肌酸酐、磷和胆色素胆红素。高于正常水平的这些物质中的一些由自甲状腺功能亢进引起的生理性并发症引发。 [0157] 猫科动物的甲状腺是位于其颈部的蝴蝶形腺体。该腺体负责产生激素甲状腺素(T4)，该激素在调节机体代谢率中起重要作用。所有器官和生理系统都受甲状腺功能亢进影响，并引起典型症状，例如体重减轻、机能亢进、血压升高和心率加快。 [0158] 在组织研究中，发现参与导致产生甲状腺激素的途径的所有基因在甲状腺功能亢进的猫科动物中上调。所述基因是表A所示基因。这些基因表达的增加促进猫科动物机体中产生高的T4。 [0159] 促进甲状腺激素过量产生的上调基因的描述： [0160] IYD (增加4.55倍) 该基因编码催化一碘酪氨酸和二碘酪氨酸(是甲状腺激素产生的卤化副产物)的氧化NADPH依赖性脱碘的酶。该蛋白质的N端起膜锚着点的作用。该基因的突变由于激素生成异常4型(称为脱碘酶缺乏，或碘酪氨酸脱卤素酶缺乏，或甲状腺激素生成4型)所致，引起先天性甲状腺功能减退。 [0161] TG (增加2.02倍) 甲状腺球蛋白(Tg)是一种主要由甲状腺产生的糖蛋白同二聚体。它起甲状腺素和三碘甲腺原氨酸的合成底物以及无活性形式的甲状腺激素和碘的储存的作用。甲状腺球蛋白自内质网分泌至其碘化部位，随后在滤泡腔中进行甲状腺素生物合成。该基因的突变引起甲状腺激素生成异常(表现为甲状腺肿)，并与中度至重度先天性甲状腺功能减退有关。 [0162] SLC5A5，NIS (增加4.6倍) 该基因编码钠葡萄糖协同转运蛋白家族的成员。编码的蛋白质负责组织(例如甲状腺和分泌乳汁乳房组织)中碘的摄取。被甲状腺摄入的碘被掺入到代谢调节剂三碘甲腺原氨酸(T3)和四碘甲腺原氨酸(T4)中。该基因的突变与甲状腺激素生成异常1有关。 [0163] TPO (增加4.06倍) 该基因编码一种膜结合糖蛋白。编码的蛋白质起酶的作用，并且在甲状腺功能中起重要作用。该蛋白质在甲状腺球蛋白的酪氨酸残基的碘化和碘化酪氨酸对之间形成苯氧基酯中起作用以产生甲状腺激素、甲状腺素和三碘甲腺原氨酸。该基因的突变与甲状腺激素生成的几种病症有关，包括先天性甲状腺功能减退、先天性甲状腺肿和甲状腺激素有机化缺陷IIA。 [0164] TSHR (增加2.2倍) 由该基因编码的蛋白质是一种膜蛋白，并且是甲状腺细胞代 |
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