KIT突变形式的抑制剂

本发明涉及特征为KIT突变形式的依赖KIT的疾病的治疗，其中鉴 定了所述突变KIT和施用了所述突变KIT的适当抑制剂。

c-kit基因编码受体蛋白酪氨酸激酶，其在本文中称作KIT，但也称为 肥大/干细胞生长因子受体。KIT的氨基酸序列和c-kit基因的核苷酸序列 是已知的。参见Swiss Prot.：P10721。与它的配体干细胞因子结合后，KIT 形成二聚体，所述二聚体自磷酸化并活化导致细胞生长的信号级联。导致 KIT经活化形式，特别是独立于它的配体的活化的形式的突变是已知的并 且认为在某些增生性疾病中起作用，所述疾病为诸如肥大细胞疾病，如肥 大细胞增生症，特别是全身性肥大细胞增生症、急性骨髓性白血病、胃肠 道间质瘤、sinonasal NK/T-细胞淋巴瘤、精原细胞瘤和无性细胞瘤。

已知作为甲磺酸盐以商品名GLIVEC或GLEEVEC上市的伊马替尼 (Imatinib)抑制野生型KIT和某些KIT突变，例如通常在胃肠道间质瘤 (GIST)中发现的外显子中的KIT突变。然而，它对某些其它的KIT突 变形式，例如通常在全身性肥大细胞增生症中发现的D816V突变也是无活 性的或显著较低的活性。本发明基于如下研究：该研究将特征为KIT突变 形式的疾病的治疗与适当的备选药物治疗基于该备选药物治疗能够抑制突 变KIT而联系起来。

因此，本发明涉及治疗患者中依赖KIT的疾病的方法，所述方法包括

(a)鉴定与依赖KIT的疾病相关的KIT突变形式；和

(b)向所述患者施用有效抑制突变KIT量的抑制剂，所述抑制剂选自 米哚妥林(midostaurin)、vatalanib和化合物A。

依赖KIT的疾病一般为增生性疾病，其特征是由于KIT中的活化突 变导致的过度KIT激酶活性。此种活化突变是本领域已知的并且通过本领 域已知的技术鉴定。

依赖KIT的疾病包括特征为以下已知的KIT突变的疾病：D816F、 D816H、D816N、D816Y、D816V、K642E、Y823D、Del 550-558、Del 557- 561、N822K、V654A、N822H、Del 550-558+V654A、Del 557-561+V654A、 Ins503AY、V560G、558NP、Del 557-558、Del VV559-560、F522C、Del 579、 R634W、K642E、T801I、C809G、D820Y、N822K、N822H、Y823D、 Y823C和T670I。

在本发明的重要实施方案中，依赖KIT的疾病对伊马替尼的治疗有抗 药性。对伊马替尼的治疗有抗药性的依赖KIT的疾病通常为如以上描述的 依赖KIT的疾病，其中以400-1000mg/天的剂量施用的伊马替尼不提供对 突变KIT的足够抑制以实现显著的治疗益处。一般地，对伊马替尼有抗药 性的突变KIT具有突变KIT的体外IC50大于约3微摩尔/升。伊马替尼抗 药性KIT突变包括D816F、D816H、D816N、D816Y、D816V、T670I和 包括V654A的突变形式。

抑制KIT突变形式的化合物的选择基于检测此种化合物或许多化合物 抑制突变KIT的能力。此种检测通过本领域已知的或本领域技术人员技术 范围内的标准抑制测定法实施。

根据本发明的方法利用的KIT抑制剂包括米哚妥林、vatalanib和化合 物A。米哚妥林(US5;093,330)和vatalanib(WO 98/35958)是本领域 已知的。化合物A是式

化合物A

的化合物并且可以根据WO 04/005281制备。

通过常规方法确定米哚妥林、vatanalib和化合物A的适当剂量。

施用适当剂量的米哚妥林例如，每天一次、两次或三次，每天的总剂 量为25-300，优选50-300更优选50-100，最优选100-300mg，例如每天 施用两次或三次，每天的总剂量为150-250mg，优选225mg。

Vatanalib的适当的日剂量为300-4000mg，例如300-2000mg/天或 300-1500mg/天，特别地，300、500、750、1000、1250、1500或2000mg/ 天，特别是1250mg/天。

对于70kg/人，化合物A的日剂量为大约0.05-5g，优选大约0.25-1.5 g。

实施例

将编码aa 544-976的人KIT基因克隆到杆状病毒供体质粒 pFB-GST-01。用限制性内切酶Bam H1和EcoR1切割该编码序列并连接 到具有相容末端的Bac-to-Bac供体载体pFB-GEX-P1。随后通过本领域技 术人员已知的方法将所希望的突变导入到KIT基因中。由于在用于产生突 变编码序列的最初质粒中的移码，因此对于如图1显示的每种突变体用限 制酶BamH1-EcoR1将突变的质粒插入片段切除并插入到Bac-to-Bac供体 载体pFB-GST-01中。自动测序证明每种突变质粒都存在正确的序列。

从用如在材料和方法中描述的pFB-GO1-KIT-突变质粒克隆转化每个 DH10Bac细胞的10个菌落产生杆粒DNA，将此种杆粒DNA转染到Sf9 细胞中。将转染的细胞沉淀，将培养基上清液中存在的所得重组杆状病毒 扩大。使用用于免疫检测的抗KIT和抗GST抗体对经裂解的细胞沉淀物 应用蛋白质印迹以证实病毒克隆表达GST-c-KIT融合蛋白。

图1   Kit突变   Vatalanib   IC50(μM)(avg)   化合物A   IC50(μM)(avg)   D816F   ＞10   ＞10   D816H   ＞10   ＞10   D816N   ＞10   ＜10   D816Y   ＞10   ＞10   D816V   ＞10   ＞10   K642E   ＜1   ＜10   Y823D   ＜1   ＜1   Del 550-558   ＜1   ＜2   Del 557-561   ＜1   ＜2   N822K   ＜2   ＜10   V654A   ＞10   ＞10   N822H   ＜2   ＜10   Del 550-558+V654A   ＜10   ＜10   Del 557-561+V654A   ＞10   ＞10   米哚妥林     HIS制备物   平均   IC50μM     SEM     N°值   HT-KIT-TA23wt   1.7   0.15   2   HT-KIT TA23-D820G   0.084   0.05   2   HT-KIT TA23-T670I   0.89   0.21   2   GST制备物   平均   IC50μM   SEM   N°值   GST-KIT wt   1.8   0.26   10   GST-KIT Del 557-561   0.32   0.042   3   GST-KIT Del 550-558   0.53   0.057   3   GST-KIT Del 550-558+V654A   0.27   0.079   5   GST-KIT Del 557-561+V654A   0.34   0.11   5   GST-KIT V654A   0.46   0.16   5   GST-KIT K642E   0.64   0.036   4   GST-KIT R634W   0.33   0.13   2   GST-KIT T670I+Del 550-558   0.11   0.05   2   GST-KIT D816F   0.41   0.055   5   GST-KIT D816H   0.35   0.078   5   GST-KIT D816N   0.74   0.25   5   GST-KIT D816Y   0.29   0.11   9   GST-KIT D816V   0.25   0.039   3   GST-KIT D816H+R634W   0.08   0.04   2   GST-KIT N822H   0.37   0.12   5   GST-KIT N822K   0.15   0.058   5   GST-KIT Y823D   0.13   0.0075   3

测定条件：1μM ATP，5μg/ml Poly-EY，室温孵育10分钟。

从经转染细胞培养物中收集包含病毒的培养基用于感染以增加它的滴 度。两轮感染后获得的包含病毒的培养基用于大规模的蛋白质表达。对于 大规模的蛋白质表达，用5×107个细胞/板接种100cm2圆形组织培养板， 并用1mL包含病毒的培养基(大约5MOI)感染。3天后，将细胞从培养 板刮下，以500转/分钟离心5分钟。来自10-20个100cm2培养板的细胞 沉淀物在50mL用冰预冷的裂解缓冲液(25mM Tris-HCl，pH7.5，2mM EDTA，1％NP-40，1mM DTT，1mM PMSF)中重新悬浮。将细胞在 冰上搅拌15分钟，然后以5000转/分钟离心20分钟。

将经离心的细胞裂解物加到2mL谷胱甘肽-琼脂糖(sepharose)柱 (Pharmacia)上，用10mL的25mM Tris-HCl，pH7.5，2mM EDTA， 1mM DTT，200mM NaCl清洗3次。然后通过10次应用(每次1mL) 25mM Tris-HCl，pH7.5，10mM还原型谷胱甘肽，100mM NaCl，1mM DTT，10％甘油洗脱GST-标记的蛋白质，-70℃保存。

在存在或不存在抑制剂的20mM Tris-HCl，pH7.6，3mM MnCl2， 3mM MgCl2，1mM DTT，10μM Na3VO4，3μg/mL poly(Glu，Tyr)4∶1， 1％DMSO，1.5μM ATP(γ-[33P]-ATP 0.1μCi)中测定200-500ng多种 Kit突变体的蛋白激酶活性。该测定(30μL)在96孔板中室温进行30分 钟，加入20μL的125mM EDTA终止反应。随后，将30μL的反应混合 物转移到事先用甲醇浸泡5分钟的Immobilon-PVDF膜(Millipore， Bedford，MA，美国)上，用水清洗，然后用0.5％H3PO4浸泡5分钟，按 照到与真空源分离的多头真空装置上。点上所有样品后，连接真空，每个 孔用200μL 0.5％H3PO4清洗。将膜除去并在振动器上用1.0％H3PO4清洗 4次，用甲醇清洗一次。在室温干燥，固定到Packard TopCount 96孔框 架并加入10uL/孔的Microscint(Packard)后，对膜进行计数。通过对4 种浓度(通常0.01、0.1、1和10μM)一式两份的每种化合物抑制百分率 的线性回归分析计算IC50值。蛋白激酶活性的一个单位定义为在室温每 mg蛋白质每分钟将1纳摩尔33P从[γ33P]ATP转移到底物蛋白质。