BUBR1作为药物对呋咱并苯并咪唑响应的生物标记的用途

申请号 CN201280005583.6 申请日 2012-01-19 公开(公告)号 CN103314295B 公开(公告)日 2016-03-16
申请人 巴斯利尔药物股份公司; 发明人 H·A·雷恩; F·巴赫曼; M·布勒勒; M·布特罗斯; D·吉尔伯特; 张闲;
摘要 BUBR1作为 生物 标记在受试者中预测 疾病 例如癌症对化合物反应优选抗性的用途,其中所述的化合物是通式(I)的呋咱并苯并咪唑化合物。
权利要求

1.用于检测作为生物标记的BUBR1的试剂在制备用于预测疾病对化合物的响应的试剂盒中的用途,其中所述合物是通式I的化合物
其中
R表示苯基、噻吩基或吡啶基;
其中所述的苯基任选地被一个或两个取代基取代,所述取代基独立地选自烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、基、一烷氨基、二烷氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、氰基、卤素和硝基;且其中两个相邻取代基是亚甲二氧基;
且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代;
1
X表示基团C=Y,其中Y表示a)氧或b)被羟基或低级烷氧基取代的氮;R表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基;
2 3 6
R、R和R 表示氢;
4 5
R和R 彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
4 5
或R和R 一起表示亚甲二氧基;
及其药学可接受的衍生物;
或其中
R表示苯基或吡啶基;
其中所述的苯基任选地被一个或两个取代基取代,所述取代基独立地选自烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基;且其中两个相邻取代基是亚甲二氧基;
且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代;
X表示氧;
1
R表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基;
2 3 6
R、R和R 表示氢;
4 5
R和R 彼此独立地是表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
4 5
或R和R 一起表示亚甲二氧基;
及其药学可接受的衍生物,
且其中前缀低级表示具有至多且包括7个原子的最大值的基团。
2.根据权利要求1的用途,其中前缀低级表示具有至多且包括4个碳原子的最大值的基团。
3.根据权利要求1的用途,其中所述响应是受试者中具有疾病且在取自动物体的样品中离体测定生物标记BUBR1。
4.根据权利要求1的用途,其中所述响应是受试者中具有疾病且在取自人体的样品中离体测定生物标记BUBR1。
5.根据权利要求1的用途,其中在通式I的化合物中,
R表示苯基或吡啶基;
其中苯基任选地被一个或两个取代基取代,所述取代基独立地选自低级烷基、低级烷氧基、氨基、乙酰基氨基、卤素和硝基;
且其中吡啶基任选地被氨基或卤素取代;
X表示基团C=O;
1
R表示氢或氰基-低级烷基;
2 3 4 5 6
R、R、R、R和R 表示氢;
及其药学可接受的衍生物,
且其中前缀低级表示具有至多且包括7个碳原子的最大值的基团。
6.根据权利要求5的用途,其中前缀低级表示具有至多且包括4个碳原子的最大值的基团。
7.根据权利要求1的用途,其中所述化合物表示为下式:
其中R、Y和R1如下所定义:
或其药学可接受的衍生物。
8.根据权利要求1的用途,其中所述化合物为
或其药学可接受的衍生物。
9.根据权利要求1的用途,其中药学可接受的衍生物选自如权利要求1所定义的通式I的化合物的盐、溶剂合物、前体药物、前体药物的盐、多晶型物和异构体。
10.根据权利要求9的用途,其中所述前体药物是由如权利要求1所定义的通式I化合物的R基团内存在的氨基和甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸的羧基形成的酰胺。
11.根据权利要求1的用途,其中所述化合物为
或其药学可接受的盐。
12.根据权利要求11的用途,其中药学可接受的盐是盐酸盐。
13.根据权利要求11的用途,其中药学可接受的盐是二盐酸盐。
14.根据权利要求1的用途,用于预测受试者中疾病对所述化合物的抗性。
15.根据权利要求1的用途,其中所述疾病是肿瘤性疾病或自身免疫疾病。
16.根据权利要求15的用途,其中所述疾病是癌症。
17.根据权利要求1的用途,其中所述疾病选自乳腺癌前列腺癌宫颈癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、神经内分泌癌、癌、肾癌、血液恶性肿瘤、黑素瘤和肉瘤。
18.根据权利要求17的用途,其中所述疾病选自卵巢癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌和宫颈癌
19.根据权利要求17的用途,其中所述疾病选自肺癌或胃癌。
20.根据权利要求3的用途,其中来自受试者的样品中相对于标准值或标准值组的较低平的BUBR1预示抗性。
21.根据权利要求20的用途,其中样品中较低的BUBR1水平
iii)相对于来自具有相同肿瘤组织型的受试者的标准值或标准值组的BUBR1;或iv)最初处理后取得和与最初处理前取自同一受试者的样品比较;或
iii)相对于来自正常细胞、组织或体液的标准值或标准值组的BUBR1;
预示具有抗性。
22.根据权利要求1的用途,其中所述生物标记用于选择患有或倾向于患有疾病的受试者,其用如权利要求1-13任一项所定义的通式I化合物或其药学可接受的衍生物进行治疗
23.根据权利要求22的用途,其中所述的疾病是癌症。
24.根据权利要求3的用途,其中所述样品来源于肿瘤组织、正常组织、细胞系或循环肿瘤细胞。
25.根据权利要求24的用途,其中所述样品来源于肿瘤组织。
26.根据权利要求1的用途,其中所述试剂包含检测试剂和含有BUBR1检测剂的俘获试剂。
27.根据权利要求26的用途,其中所述俘获试剂是抗体
28.根据权利要求1的用途,其中所述试剂包含结合BUBR1的初级抗体和结合初级抗体且其被标记用于检测的二次抗体。
29.根据权利要求1的用途,其中所述的试剂包含结合BUBR1且其被标记用于检测的初级抗体。
30.根据权利要求1的用途,其中所述的试剂包含用于与BUBR1核酸杂交的标记的探针或引物。
31.根据权利要求1的用途,其中所述的试剂包含在核酸水平测定BUBR1水平的微量阵列。
32.用于预测疾病对如权利要求1-8任一项所定义的式I化合物的响应的试剂盒,包含用于测定取自患有癌症的受试者的样品中BUBR1水平所必需的试剂且还包含对比模,所述对比模块包含待与样品中的BUBR1水平比较的BUBR1水平的标准值或标准值组,所述BUBR1水平的标准或标准值组来自具有相同组织型的癌症的受试者的肿瘤组织或循环肿瘤细胞的样品,其中所述的试剂盒包含式I的化合物或其药学可接受的盐且其中所述的式I化合物是下式:
33.根据权利要求32的试剂盒,其中所述试剂包含检测试剂和含有BUBR1检测剂的俘获试剂。
34.根据权利要求33的试剂盒,其中所述俘获试剂是抗体。
35.根据权利要求32的试剂盒,其中所述试剂包含结合BUBR1的初级抗体和结合初级抗体且其被标记用于检测的二次抗体。
36.根据权利要求32的试剂盒,其中所述的试剂包含结合BUBR1且其被标记用于检测的初级抗体。
37.根据权利要求32的试剂盒,其中所述的试剂包含用于与BUBR1核酸杂交的标记的探针或引物。
38.根据权利要求32的试剂盒,其中所述的试剂包含在核酸水平测定BUBR1水平的微量阵列。
39.根据权利要求32的试剂盒,其中所述式I的化合物药学可接受的盐是下式化合物的二盐酸盐

说明书全文

BUBR1作为药物对呋咱并苯并咪唑响应的生物标记的用途

[0001] 本发明涉及BUBR1作为生物标记在预测疾病例如肿瘤性疾病或自身免疫疾病、优选癌症对通式I的化合物例如3-(4-{1-[2-(4-基-苯基)-2-代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基)-丙腈(BAL27862)的响应中的用途。在其他方面中,本发明涉及涉及方法和试剂盒以及所述生物标记的用途的处理方法。
[0002] 微管是细胞骨架成分之一且由α和β微管蛋白的异二聚体组成。靶向微管的活性剂是最有效的具有广谱活性的细胞毒性化疗剂。微管去稳定剂(例如长春花生物类,例如长春新碱、长春碱和长春瑞滨)用于例如治疗几种类型的血液恶性肿瘤,例如淋巴母细胞白血病和淋巴瘤以及实体瘤,例如癌。微管稳定剂(例如紫杉烷类,例如紫杉醇、多西他赛)用于例如治疗实体瘤,包括乳腺癌、肺癌和前列腺癌
[0003] 然而,对这些已知的微管靶向剂可能存在抗性。这种抗性可以是固有的或可以在接触这些活性剂后获得。这种抗性由此影响了患者的存活率和治疗方案的选择。已经鉴定了几种潜在的抗性机制且包括微管靶标中的缺陷,例如β微管蛋白亚型III的平升高和在β微管蛋白亚型I中获得的已知可减少紫杉烷结合的突变。此外,已经启示其他细胞蛋白中的缺陷涉及对一些微管靶向剂的抗性,例如p-糖蛋白超表达(P-gp,也称作多药耐药蛋白1或MDR1)。然后这样的因素可以用作对这些常规的微管靶向剂的抗性的生物标记。
[0004] 相对近期发现的微管去稳定剂类型是由如下给出的通式包括的化合物:
[0005]
[0006] 其中
[0007] R表示苯基、噻吩基或吡啶基;
[0008] 其中苯基任选地被一个或两个取代基取代,所述取代基独立地选自烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基;其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、氰基、卤素和硝基;且其中两个相邻取代基是亚甲二氧基;
[0009] 且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代;
[0010] X表示基团C=Y,其中Y表示被羟基或低级烷氧基取代的氧或氮;
[0011] R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基;
[0012] R2、R3和R6表示氢;
[0013] R4和R5彼此独立地是表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
[0014] 或R4和R5一起表示亚甲二氧基;
[0015] 及其药学可接受的盐;
[0016] 或其中
[0017] R表示苯基或吡啶基;
[0018] 其中苯基任选地被一个或两个取代基取代,所述取代基独立地选自烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基;其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基;且其中两个相邻取代基是亚甲二氧基;
[0019] 且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代;
[0020] X表示氧;
[0021] R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基;
[0022] R2、R3和R6表示氢;
[0023] R4和R5彼此独立地是表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
[0024] 或R4和R5一起表示亚甲二氧基;
[0025] 及其药学可接受的盐;
[0026] 且其中前缀低级表示具有至多且包括7个原子的最大值的基团,尤其是至多且包括4个碳原子的最大值的基团。
[0027] 这些化合物公开在WO2004/103994A1中,将其引入本文交叉参考。已经证实这些化合物可抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡。
[0028] 通式I化合物的合成一般描述在WO2004/103994A1的29-35页上且尤其是在39-55页上,将它们引入本文交叉参考。可以如所公开的那样制备它们或通过与本文所述方法类似的方法制备它们。
[0029] 属于这类的一种化合物称作BAL27862,且如WO2004/103994A1的实施例58中所示,且特别地将该文献引入本文作为参考,该化合物具有如下给出的结构和化学名:
[0030]
[0031] 化学名:
[0032] 3-(4-{1-[2-(4-氨基-苯基)-2-氧代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基)-丙腈。
[0033] 或本文称作化合物A。
[0034] 其他化合物分别以WO2004/103994A1的实施例50和79为典型且也将该文献引入本文交叉参考,这些化合物具有如下给出的结构和化学名:
[0035]
[0036] 化学名:2-[2-(4-氨基-呋咱-3-基)-苯并咪唑-1-基]-1-(4-氨基-苯基)-乙
[0037] 或本文称作化合物B。
[0038] 和
[0039]
[0040] 化学名:3-(4-{1-[2-(6-氨基-吡啶-3-基)-2-氧代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基)-丙腈
[0041] 或本文称作化合物C。
[0042] BAL27862已经通过一大组实验型实体瘤异种移植物模型显示了活性。此外,甚至对肿瘤模型也保持活性,选择这些模型是因为它们对常规的微管靶向剂具有抗性(包括长春花生物碱微管去稳定剂和微管稳定剂紫杉醇和埃坡霉素B)。BAL27862活性既不受任何体外测试模型中P-gp泵超表达影响,也不受人体乳腺肿瘤异种移植物中P-gp泵超表达影响。另外,尽管β微管蛋白亚型III的水平升高和微管蛋白亚型I中突变,但是BAL27862仍然保持其活性。
[0043] 因此,BAL27862活性不受赋予常规微管靶向剂抗性的大量因素的影响。
[0044] 此外,已知通式I的化合物与其他微管靶向剂包括其他微管去稳定剂相比对细胞表型具有不同影响。用通式I的化合物处理诱导来源于不同器官例如肺、宫颈和乳腺的肿瘤细胞系中的一致性的微管表型,正如图1中观察到的。用抗-α-微管蛋白抗体染色这些细胞中的微管显示的不是未处理的细胞的有丝分裂纺锤体,而在处理的细胞中仅有点样结构可见。在图2A和2B中分别使用化合物C和B对肺癌细胞系A549也显示了这种相同的效果。然而,与使用常规的微管靶向剂长春碱、秋水仙碱、紫杉醇和诺考达唑观察到的结构极为不同,正如分别如图3B、3C、3D和4中所示。用抗-α-微管蛋白抗体染色微管且在1000x放大倍数下观察细胞(图3,4)。就用BAL27862处理的细胞而言,多个点样结构可见,而完全相反,其他常规药物产生了丝状微管结构或稠密的微管聚集结构。在抗增殖作用方面被视为最佳的化合物剂量下,这些在表型水平上的差异表示在分子水平上作用方式的差异。
[0045] 此外,已知BAL27862在另外的微管靶向剂的存在下引起占优势的微管表型。用单独的长春碱、秋水仙碱、紫杉醇或诺考达唑处理诱导为这些活性剂特征的微管表型(分别为图5A、5D、5G、6C-6F)。然而,尽管持续存在长春碱、秋水仙碱、紫杉醇或诺考达唑,但是用BAL27862联合处理最终4小时导致这些表型破坏(分别为图5B、5E、5H、6G-6J)。相反,首先用BAL27862处理,然后与长春碱、秋水仙碱、紫杉醇或诺考达唑联合处理4小时对与BAL27862处理一致性的表型生成没有影响(分别为图5C、5F、5I、6K-6N)。
[0046] 这些数据均证实BAL27862以不同于常规微管靶向剂的方式影响微管生物学。
[0047] 因此,从有关常规微管靶向剂的信息中不能预测有关特定基因是否或如何涉及通式I化合物的作用。
[0048] 本发明的目的在于鉴定与对通式I化合物或其药学可接受的衍生物的响应相关的因素,例如鉴定与对如下所定义的通式I化合物、特别是BAL27862或其药学可接受的衍生物的抗性相关的因素。
[0049] 令人意外地发现,BUBR1可以用作对用如下所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物处理的响应的生物标记。
[0050] 在本发明的一个优选的实施方案中,样品中相对低的BUBR1水平与如下所述的BAL27862固有和获得抗性相关。
[0051] BUBR1已经被指定为人类基因命名委员会识别号码HGNC ID:1149和Entrez Gene ID701。相当于人BUBR1的序列通过生物技术信息国家中心(NCBI)参比号NP_001202(图18,SEQ ID No.1,NP_001202.4)得到。
[0052] BUBR1也称作hBUBR1和BubR1;不被苯并咪唑类啤酒酵母同源物β抑制的萌发;有丝分裂关卡基因BUB1B;BUB1B;BUB1β;有丝分裂关卡激酶Mad3L;MAD3L;MAD3-样蛋白激酶;和SSK1。名称BUB1B通常与核酸序列相关,而集中于蛋白质的公开信息通常使用术语BUBR1。为简便起见,本文所用的术语BUBR1应包括所有上述举出的同义词且如果适合,应指核酸和蛋白质水平上的这种本体。
[0053] 名称不被苯并咪唑类抑制的萌发由Hoyt等人在使用苯菌灵进行实验后指定为酵母同源物(Hoyt MA.等入,S.Cerevisiae Genes Required forCell Cycle Arrest in Response to Loss of Microtubule Function.Cell,Vol.66,507-517,1991年8月9日)。该公开文献描述了bub酵母同源物中导致的对苯菌灵超敏反应的突变。
[0054] 人类同源物位于染色体15q15上。人BUBR1基因序列公布在US6,593,098B1中且在其中鉴定为人类BUB1A。该专利的实施例VI描述了在HeLa细胞中进行的实验,其中内源性BUB1A(BUBR1)活性受微注射抗-huBUB1A抗体抑制。然后测试注射的细胞在接触微管去稳定剂诺考达唑(nocadozole)时保持有丝分裂停止的能。该专利描述了注射huBUB1a抗体的细胞在诺考达唑的存在下有丝分裂不会停止且持续进行作为因脱离有丝分裂的早熟结果的细胞凋亡。
[0055] 与Hoyt的公开内容类似,这启示细胞中BUBR1功能缺失、然后用诺考达唑处理导致细胞凋亡比例增高。
[0056] 然而,相反,本发明的发明人已经发现,BUBR1表达缺失与作为对通式I化合物响应的低水平细胞死亡相关,即对这些化合物的抗性。再次强调通式I的化合物与其他微管活性剂包括其他微管去稳定剂相比对细胞表型具有不同影响,正如在图3、4、5和6中观察到的。一方面US6,593,098B1和Hoyt的发现与另一方面本发明的发明人的发现之间的偏差证实根据有关常规微管活性剂的信息不能对有关特定基因是否或如何涉及通式I的化合物的活性进行预测。
[0057] 本发明的一个方面涉及BUBR1作为生物标记在预测对化合物的响应中的用途,其中所述化合物是通式I的化合物
[0058]
[0059] 其中
[0060] R表示苯基、噻吩基或吡啶基;
[0061] 其中苯基任选地被一个或两个取代基取代,所述取代基选自烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基;其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、氰基、卤素和硝基;且其中两个相邻取代基是亚甲二氧基;
[0062] 且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代;
[0063] X表示基团C=Y,其中Y表示被羟基或低级烷氧基取代的氧或氮;
[0064] R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基;
[0065] R2、R3和R6表示氢;
[0066] R4和R5彼此独立地是表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
[0067] 或R4和R5一起表示亚甲二氧基;
[0068] 及其药学可接受的衍生物,
[0069] 或其中
[0070] R表示苯基或吡啶基;
[0071] 其中苯基任选地被一个或两个取代基取代,所述取代基选自烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基;其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基;且其中两个相邻取代基是亚甲二氧基;
[0072] 且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代;
[0073] X表示氧;
[0074] R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基;
[0075] R2、R3和R6表示氢;
[0076] R4和R5彼此独立地是表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
[0077] 或R4和R5一起表示亚甲二氧基;
[0078] 及其药学可接受的衍生物;
[0079] 且其中前缀低级表示具有至多且包括7个碳原子的最大值的基团,尤其是至多且包括4个碳原子的最大值的基团。
[0080] 优选地,所述响应可以是受试者中具有疾病。此外,优选地,所述响应可以是进行治疗,即用通式I的化合物或其药学可接受的衍生物进行治疗。
[0081] 测定离体样品中的生物标记BUBR1或测定取自人体或动物体、优选取自人体的样品中的生物标记BUBR1。
[0082] 在一个优选的实施方案中,本发明涉及BUBR1作为生物标记在预测受试者中疾病对如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的抗性中的用途。
[0083] 优选地,药学可接受的衍生物选自如上述所定义的通式I的化合物的盐、溶剂合物、前体药物、前体药物的盐、多晶型物和异构体。前体药物优选是天然存在的氨基酸、小肽类或聚乙二醇化羟基酸的酯和酰胺类。更优选前体药物是由通式I的化合物的R基团内的氨基和甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸的羧基形成的酰胺。
[0084] 特别优选所述化合物是
[0085]
[0086] 或其药学可接受的盐,优选其盐酸盐,最优选其二盐酸盐。
[0087] 本发明的另一个方面涉及预测受试者中疾病对如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的响应的方法,包括下列步骤:
[0088] a)测定预先获自受试者的样品中的BUBR1水平,以得到表示这种水平的值;和[0089] b)比较来自步骤a)的值与标准值或标准值组。
[0090] 此外,优选所预测的响应是抗性。
[0091] 离体测定预先得到的来自受试者的样品中的BUBR1水平。预先得到的是指如下事实:在进行任意涉及测定生物标记水平的方法后得到样品且预先得到的并非理解为与处理相关。
[0092] 在一个优选的实施方案中,来自受试者的样品中低于标准值或标准值组的BUBR1水平预示抗性。
[0093] 另外,优选所述疾病是肿瘤性疾病或自身免疫疾病。更优选所述疾病是癌症。尤其优选癌症选自乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌(即包括结肠癌和直肠癌、)、胰腺癌、肝癌、脑癌、神经内分泌癌、肺癌、肾癌、血液恶性肿瘤、黑素瘤和肉瘤。更尤其优选癌症选自乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌和肺癌。更特别优选癌症选自宫颈癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌和肺癌。在另一个特别优选的实施方案中,其中确定了获得抗性,癌症是肺癌或卵巢癌。在另一个特别优选的实施方案中,其中确定了固有抗性,癌症选自宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌和肺癌,更优选肺癌或胃癌。
[0094] 在另一个方面中,本发明涉及治疗有此需要的受试者肿瘤性疾病或自身免疫疾病、优选癌症的方法,包括对受试者测定来自该受试者的样品中的BUBR1水平,以得到表示这种水平的值,并且如果所述样品中的BUBR1水平不低于标准值或标准值组,则用如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物治疗该受试者。
[0095] 在另一个方面中,本发明涉及用于治疗肿瘤性疾病或自身免疫疾病、优选癌症中的BUBR1,包括测定来自受试者的样品中的BUBR1水平,以得到表示这种水平的值,并且如果所述样品中的BUBR1水平不低于标准值或标准值组,则用如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物治疗该受试者。
[0096] 离体测定预先获自受试者的样品中的BUBR1水平。
[0097] 在另一个方面中,本发明还涉及治疗肿瘤性疾病或自身免疫疾病、优选癌症的方法,通过下列步骤进行:首先增加受试者中的BUBR1水平,该受试者具有BUBR1水平低于标准水平或标准水平组的样品,然后用如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物治疗该受试者。
[0098] 在另一个方面中,本发明涉及用于预测对如上述所定义的通式I化合物或其药学可接受的衍生物的响应的试剂盒,其包含用于测定样品中BUBR1水平所必需的试剂。更优选该试剂盒还包含对比模,该对比模块包含用于比较样品BUBR1中水平的标准值或标准值组。
[0099] 此外,优选所述试剂盒包含如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物。在一个特别优选的实施方案中,该试剂盒包含具有下式的化合物或其药学可接受的盐:
[0100]
[0101] 化学 名:S-2,6-二氨 基-己 酸[4-(2-{2-[4-(2-氰 基-乙 基 氨基)- 呋咱-3-基]-苯并咪唑-1-基}-乙酰基)-苯基]-酰胺。
[0102] 在一个特别优选的实施方案中,药学可接受的盐是二盐酸盐。
[0103] 本发明的另一个方面涉及用于预测对如上述所定义的通式I化合物或其药学可接受的衍生物的响应的装置,包含用于测定样品中BUBR1水平所必需的试剂和对比模块,该对比模块包含用于比较样品中BUBR1水平的标准值或标准值组。
[0104] 在一个优选的实施方案中,所述试剂盒或装置中的试剂包含含有BUBR1检测剂的俘获试剂和检测试剂。尤其优选俘获试剂是抗体。另外优选地,当BUBR1低于标准值或标准值组时,预示所述疾病对用所述化合物治疗具有抗性。在一个优选的实施方案中,在试剂盒的使用指令中包括对比模块。在另一个优选的实施方案中,对比模块是显示装置的形式。
[0105] 现在通过实施例并且参照附图描述本发明的实施方案。然而,不应将本发明理解为限于这些实施方案。
[0106] 附图简述
[0107] 图1:显示用50nM BAL27862处理来自不同组织型的人肿瘤细胞系。用50nM BAL27862或媒介物对照品处理24小时后染色有丝分裂或G2/M停止的细胞的微管。
[0108] 图1A和1B:A549NSCLC细胞;
[0109] 图1C和1D:HeLa宫颈癌细胞;
[0110] 图1E和1F:SKBR3乳腺癌细胞;
[0111] 媒介物对照品处理:图1A、1C和1E;
[0112] BAL27862处理:图1B、1D和1F。
[0113] 图2:显示用化合物B和C处理A549NSCLC细胞。分别用80nM或20nM化合物B和C处理24小时后染色有丝分裂或G2/M停止的A549NSCLC细胞的微管。白色比例尺表示10微米。
[0114] 图2A:用20nM化合物C处理。
[0115] 图2B:用80nM化合物B处理。
[0116] 图3:显示用BAL27862处理细胞与常规微管靶向剂处理细胞的对比。用50nM的A:BAL27862;B:长春碱;C:秋水仙碱;D:紫杉醇处理24小时后染色有丝分裂或G2/M停止的A549NSCLC细胞微管。通过使用ImageJ软件加工处理每隔1μm取得的影像组。
[0117] 图4:显示用BAL27862处理A549NSCLC细胞与诺考达唑处理细胞的对比。用不同浓度的诺考达唑(B、C和D)和BAL27862(E、F和G)处理24小时后染色有丝分裂或G2/M停止的细胞微管。A:对照品;B:诺考达唑50nM;C:诺考达唑100nM;D:诺考达唑200nM;E:BAL2786220nM;F:BAL2786230nM;和G:BAL2786250nM。白色比例尺表示10微米。显示了所观察到的微管表型的有代表性的影像。
[0118] 图5:显示用BAL27862处理与常规微管靶向剂处理的对比。处理如下所示的次数后染色有丝分裂或G2/M停止的A549NSCLC细胞微管。使用50nM BAL27862、50nM长春碱、50nM秋水仙碱和25nM紫杉醇。白色比例尺表示10微米。
[0119] 图5A:24小时长春碱处理;
[0120] 图5B:24小时长春碱处理与包括BAL27862的最终4小时;
[0121] 图5C:24小时BAL27862处理与包括长春碱的最终4小时;
[0122] 图5D:24小时秋水仙碱处理;
[0123] 图5E:24小时秋水仙碱处理与包括BAL27862的最终4小时;
[0124] 图5F:24小时BAL27862处理与包括秋水仙碱的最终4小时;
[0125] 图5G:24小时紫杉醇处理;
[0126] 图5H:24小时紫杉醇处理与包括BAL27862的最终4小时;
[0127] 图5I:24小时BAL27862处理与包括紫杉醇的最终4小时。
[0128] 图6:显示用BAL27862处理与诺考达唑处理的组合。处理如下所示的次数后染色有丝分裂或G2/M停止的A549NSCLC细胞微管。使用25nM BAL27862和如下所示浓度的诺考达唑。白色比例尺表示10微米。
[0129] 图6A:24小时对照品处理;
[0130] 图6B:24小时25nM BAL27862处理;
[0131] 图6C:24小时50nM诺考达唑处理;
[0132] 图6D:24小时100nM诺考达唑处理;
[0133] 图6E:24小时150nM诺考达唑处理;
[0134] 图6F:24小时200nM诺考达唑处理;
[0135] 图6G:24小时50nM诺考达唑处理与包括25nM BAL27862的最终4小时;
[0136] 图6H:24小时100nM诺考达唑处理与包括25nM BAL27862的最终4小时;
[0137] 图6I:24小时150nM诺考达唑处理与包括25nM BAL27862的最终4小时;
[0138] 图6J:24小时200nM诺考达唑处理与包括25nM BAL27862的最终4小时;
[0139] 图6K:24小时25nM BAL27862处理与包括50nM诺考达唑的最终4小时;
[0140] 图6L:24小时25nM BAL27862处理与包括100nM诺考达唑的最终4小时;
[0141] 图6M:24小时25nM BAL27862处理与包括150nM诺考达唑的最终4小时;
[0142] 图6N:24小时25nM BAL27862处理与包括200nM诺考达唑的最终4小时。
[0143] 图7:显示用BUBR1 siRNA库转染后BUBR1表达的免疫印迹分析。对照组:用单独的培养基处理的未转染的细胞;阳离子脂质体:用单独的转染试剂处理的细胞;NTC:用非靶向对照siRNA处理的细胞;BUBR1:用BUBR1-特异性siRNA库处理的细胞。α-微管蛋白水平作为负荷对照起作用。如所示的细胞信号传导(CS)或BD转染实验室(BD)BUBR1抗体。图7A:HeLa宫颈癌细胞,图7B:H460肺癌细胞。
[0144] 图8:BUBR1 siRNA库对HeLa细胞中BAL27862的响应的作用。接种HeLa细胞、用siRNA处理。48小时温育后,分析前用单独的DMSO或50nM BAL27862处理细胞24小时。上部组:展示未处理表型的细胞/孔(以%计)的部分的直方图。下部组:细胞数量/孔的直方图。误差条:标准偏差。阴性对照:非靶向对照siRNA。BubR1:BUBR1-特异性siRNA库处理的细胞。
[0145] 图9:显示BUBR1 siRNA库对HeLa细胞的BAL27862的响应的作用。用单独的培养基处理指数生长的HeLa细胞(对照组)或用阳离子脂质体、非靶向对照(NTC)siRNA或BUBR1-特异性siRNA库处理。24小时后,加入所示浓度的BAL27862,其中DMSO媒介物用作对照品。48小时处理后,使用YO-PRO增殖测定法评价对HeLa细胞增殖(图9A)和存活率(图9B)的作用。a.u=数据表示为任意单位。
[0146] 图10:显示BUBR1 siRNA库对H460细胞的BAL27862的响应的作用。用非靶向对照(NTC)siRNA或BUBR1-特异性siRNA库转染指数生长的H460细胞。24小时后,加入所示浓度的BAL27862,其中DMSO媒介物用作对照品。48小时处理后,使用YO-PRO增殖测定法评价对HeLa细胞增殖(图10A)和存活率(图10B)的作用。a.u=数据表示为任意单位。
[0147] 图11:显示显示BUBR1 siRNA库对MCF-7细胞的BAL27862的响应的作用。用非靶向对照(NTC)siRNA或BUBR1-特异性siRNA库处理指数生长的MCF-7细胞。24小时后,加入所示浓度的BAL27862,其中DMSO媒介物用作对照品。48小时处理后,使用YO-PRO增殖测定法评价对MCF-7细胞增殖(图11A)和存活率(图11B)的作用。a.u=数据表示为任意单位。
[0148] 图12:显示BUBR1 siRNA库对HeLa、Panc1和HCT116细胞的BAL27862的响应的作用。用非靶向对照(NTC)siRNA或BUBR1-特异性siRNA库处理指数生长的H460细胞。24小时后,加入50nM(HeLa、HCT116)或30nM(Panc1)BAL27862,其中DMSO媒介物用作对照品。48小时处理后,使用结晶紫测定法评价对HeLa(图12A)、Panc1(图12B)和HCT116(图
12C)细胞增殖的作用。a.u=数据表示为任意单位。
[0149] 图13:显示各BUBR1 siRNA对HeLa细胞的BAL27862的响应的作用。用非靶向对照(NTC)siRNA或各BUBR1-特异性siRNAs(siRNA#1、2、3和4,如下实验方法部分中所定义)处理指数生长的H460细胞。24小时后,加入50nM的BAL27862,其中DMSO媒介物用作对照品。48小时处理后,使用结晶紫测定法评价对HeLa细胞增殖(图13A)的作用并且通过免疫印迹评价对BUBR1蛋白质表达的作用(图13B)。a.u=数据表示为任意单位。
[0150] 图14:显示BUBR1蛋白质水平在具有对BAL27862获得抗性的肿瘤品系中下降。选择通过在BAL27862的存在下体外培养对BAL27862具有抗性的肿瘤细胞系。基于IC50测定,BAL27862抗性因子与亲本品系对比为:A549(3.0倍);SKOV3(7.6倍-抗性1品系);H460(5.3倍)(参见表1)。由亲本和抗性品系制备完整细胞蛋白质提取物并且通过对BUBR1表达的免疫印迹进行分析。肌动蛋白水平用作负荷对照。
[0151] 图15:显示在抗性发生过程中将降低的BUBR1蛋白质水平维持在SKOV3肿瘤品系中。选择通过在BAL27862的存在下体外培养增加的时间期限对BAL27862具有抗性的SKOV3肿瘤细胞系。基于IC50测定,BAL27862抗性因子与亲本品系对比为:SKOV3抗性1(7.6倍);SKOV3抗性2(11.6倍)(参见表1)。由亲本和抗性品系制备完整细胞蛋白质提取物并且通过使用转导实验室(BD)BUBR1抗体的免疫印迹对BUBR1表达进行分析。α-微管蛋白水平用作负荷对照。
[0152] 图16:显示肿瘤细胞BUBR1水平在通过离体集落过度生长分析定义为BAL27862抗性的来源于患者的异种移植的肿瘤中下降。制备来源于患者的肿瘤异种移植物(维持在裸鼠中),固定,染色用于使用免疫组织化学的BUBR1蛋白质表达。BAL27862、紫杉醇和长春碱抗性和敏感性如表2中所定义。
[0153] 图17:显示就BUBR1而言,肿瘤细胞中的蛋白质水平反映为其RNA表达水平。图17A:由HeLa和H460细胞系制备样品并且对它们进行定量RT-PCR,以测定RNA水平。将HeLa结果设定在100%且图显示H460样品中相对于HeLa值的RNA表达水平。图17B:由同代的HeLa和H460细胞系制备完整细胞蛋白质提取物,然后通过使用BD转导实验室(BD)BUBR1抗体的免疫印迹分析BUBR1蛋白质表达。α-微管蛋白水平用作负荷对照。
[0154] 图18:显示BUBR1的优选蛋白质序列(SEQ.ID No.1)。
[0155] 图19:显示BUBR1的优选核酸序列(SEQ.ID No.2)。
[0156] 发明详述
[0157] 通式I的化合物
[0158] 本发明的化合物表示为通式I:
[0159]
[0160] 其中
[0161] R表示苯基、噻吩基或吡啶基;
[0162] 其中苯基任选地被一个或两个取代基取代,所述取代基独立地选自烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、氰基、卤素和硝基;且其中两个相邻取代基是亚甲二氧基;
[0163] 且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代;
[0164] X表示基团C=Y,其中Y表示被羟基或低级烷氧基取代的氧或氮;
[0165] R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基;
[0166] R2、R3和R6表示氢;
[0167] R4和R5彼此独立地是表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
[0168] 或R4和R5一起表示亚甲二氧基;
[0169] 及其药学可接受的衍生物,
[0170] 或其中
[0171] R表示苯基或吡啶基;
[0172] 其中苯基任选地被一个或两个取代基取代,所述取代基独立地选自烷基、卤代-低级烷基、羟基-低级烷基、低级烷氧基-低级烷基、酰氧基-低级烷基、苯基、羟基、低级烷氧基、羟基-低级烷氧基、低级烷氧基-低级烷氧基、苯基-低级烷氧基、低级烷基羰基氧基、氨基、一烷氨基、二烷氨基、低级烷氧基羰基氨基、低级烷基羰基氨基、取代的氨基其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基、低级烷基羰基、羧基、低级烷氧基羰基、甲酰基、氰基、卤素和硝基;且其中两个相邻取代基是亚甲二氧基;
[0173] 且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代;
[0174] X表示氧;
[0175] R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基;
[0176] R2、R3和R6表示氢;
[0177] R4和R5彼此独立地是表示氢、低级烷基或低级烷氧基;
[0178] 或R4和R5一起表示亚甲二氧基;
[0179] 及其药学可接受的衍生物;
[0180] 且其中前缀低级表示具有至多且包括7个碳原子的最大值的基团,尤其是至多且包括4个碳原子的最大值的基团。
[0181] 杂环基优选表示饱和、部分饱和或不饱和的单环或双环,其包含4-10个包含1、2或3个选自氮、氧和硫的杂原子的原子,除非另有指定,否则,所述原子是碳或氮连接的,其中环氮原子可以任选地被选自低级烷基、氨基-低级烷基、芳基、芳基-低级烷基和酰基的基团取代且环碳原子可以被低级烷基、氨基-低级烷基、芳基、芳基-低级烷基、杂芳基、低级烷氧基、羟基或氧代取代。杂环基的实例是吡咯烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、二氧戊环基和四氢吡喃基。
[0182] 酰基表示,例如烷基羰基、环己基羰基、芳基羰基、芳基-低级烷基羰基或杂芳基羰基。低级酰基优选是低级烷基羰基,特别是丙酰基或乙酰基。
[0183] 优选地,本发明通式I的化合物如这样所定义,其中R1选自氢、乙酰基、CH2CH2CN和CH2CH2CH2OH。
[0184] 在一个优选的实施方案中,本发明通式I的化合物选自:
[0185] 4-(1-苯酰基-1H-苯并咪唑-2-基)-呋咱-3-基胺;
[0186] 4-[1-(4-溴苯酰基)-1H-苯并咪唑-2-基卜呋咱-3-基胺肟;
[0187] N-{4-[1-(4-氯苯酰基)-1H-苯并咪唑-2-基卜呋咱-3-基}-乙酰胺;
[0188] 4-[1-(4-氯苯酰基)-1H-苯并咪唑-2-基卜呋咱-3-基-N-(2-氰基乙基)-胺;
[0189] 4-[1-(4-氯苯酰基)-1H-苯并咪唑-2-基卜呋咱-3-基-N-(3-羟基丙基)-胺;
[0190] 4-[1-(3-氨基-4-氯苯酰基)-1H-苯并咪唑-2-基卜呋咱-3-基胺;
[0191] 4-[1-(3-甲氧基-4-甲氧基甲氧基-苯酰基)-1H-苯并咪唑-2-基卜呋咱-3-基胺;
[0192] 及其药学可接受的衍生物。
[0193] 在另一个优选的实施方案中,本发明通式I的化合物是:
[0194]
[0195] 其中1
[0196] R、Y和R如下所定义:
[0197]
[0198]
[0199]
[0200]
[0201]
[0202] 或其药学可接受的衍生物。
[0203] 在另一个优选的实施方案中,本发明通式I的化合物选自:
[0204] 4-(1-苯氧基甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-呋咱-3-基胺;
[0205] 4-[1-(4-氟苯氧基甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺;
[0206] 4-[1-(3,4-二甲基苯氧基甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基-N-(2-氰基乙基)-胺;
[0207] 和下式表示的化合物:
[0208]
[0209] 其中R和R1如下所定义
[0210]
[0211]
[0212] 或其药学可接受的衍生物。
[0213] 在另一个优选的实施方案中,本发明通式I的化合物是:
[0214]4 5
[0215] 其中R、R和R 如下所定义
[0216]
[0217] 或其药学可接受的衍生物。
[0218] 更优选本发明的化合物是通式I的化合物
[0219]
[0220] 其中
[0221] R表示苯基或吡啶基;
[0222] 其中苯基任选地被一个或两个取代基取代,所述取代基选自低级烷基、低级烷氧基、氨基、乙酰基氨基、卤素和硝基;
[0223] 且其中吡啶基任选地被氨基或卤素取代;
[0224] X表示基团C=O;
[0225] R1表示氢或氰基-低级烷基;
[0226] R2、R3、R4、R5和R6表示氢;
[0227] 及其药学可接受的衍生物,
[0228] 且其中前缀低级表示具有至多且包括7个碳原子的最大值的基团,尤其是至多且包括4个碳原子的最大值的基团。
[0229] 尤其优选地,本发明的化合物表示为下式:
[0230]
[0231] 其中R、Y和R1如下所定义:
[0232]
[0233]
[0234] 或其药学可接受的衍生物。
[0235] 更尤其优选地,本发明的化合物表示为下式:
[0236]
[0237] 其中R、Y和R1如下所定义:
[0238]
[0239] 或其药学可接受的衍生物。
[0240] 特别优选地,本发明的化合物是
[0241]
[0242] 或其药学可接受的衍生物。
[0243] 措词通式I化合物的“药学可接受的衍生物”中的术语衍生物是指其盐、溶剂合物和复合物及其盐的溶剂合物的和复合物及其前体药物、多晶型物和异构体(包括光学异构体、几何异构体和互变异构体)且还有其前体药物的盐。在一个更优选的实施方案中,该术语指的是盐和前体药物及其前体药物的盐。
[0244] 盐优选是酸加成的盐。盐优选使用有机酸无机酸由式(I)的化合物与碱性氮原子形成,尤其是药学可接受的盐。适合的无机酸是,例如卤代酸,例如盐酸、硫酸磷酸。适合的有机酸是,例如羟基酸、膦酸、磺酸或氨基磺酸,例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、乙醇酸、乳酸、富酸、琥珀酸己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、苹果酸、酒石酸柠檬酸、氨基酸例如谷氨酸或天冬氨酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、环己烷甲酸、金刚烷甲酸、苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、苯二甲酸、苯乙酸、扁桃酸肉桂酸、甲磺酸或乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙-1,2-二磺酸、苯磺酸、2-磺酸、1,5-萘-二磺酸、2-,3-或4-甲基苯磺酸、甲基硫酸、乙基硫酸、十二烷基硫酸、N-环己基氨基磺酸、N-甲基-、N-乙基-或N-丙基-氨基磺酸或其他有机质子酸例如抗坏血酸
[0245] 本发明的化合物可以以前体药物形式施用,其在人体或动物体内被分解得到通式I的化合物。前体药物的实例包括通式I化合物的体内可水解的酯类和酰胺类。所考虑的具体的前体药物是天然存在的氨基酸的酯和酰胺类和小肽的酯或酰胺类,特别是由至多5、优选2或3个氨基酸组成的小肽类和聚乙二醇化羟基酸的酯类和酰胺类,特别是羟基乙酸和乳酸。前体药物的酯类由氨基酸的酸性官能团或肽的C末端和通式I化合物上适合的羟基形成。前体药物的酰胺类由氨基酸的氨基官能团或肽的N末端和通式I化合物上适合的羧基形成,或由氨基酸的酸性官能团或肽的C末端和通式I化合物上适合的氨基形成。特别优选前体药物的酰胺类由式I的R基团内存在氨基形成。
[0246] 更优选地,前体药物式由如上述所定义的通式I化合物的R基团内存在的氨基和甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸的羧基形成。
[0247] 甚至更优选通式I的化合物是选自下式化合物的前体药物形式:
[0248]
[0249]
[0250] 在一个特别优选的实施方案中,本发明通式I的化合物是具有下式的前体药物形式:
[0251]
[0252] 在一个最特别优选的实施方案中,本发明的化合物是
[0253]
[0254] 或其药学可接受的盐,优选盐酸盐,最优选二盐酸盐。
[0255] 在这种情况中,药学可接受的体内活性代谢物是BAL27862。
[0256] 这些前体药物可以通过本身公知的方法制备,特别是这样一种方法,其中使式(II)的化合物
[0257]
[0258] 其中R1如对式(I)所定义,Z是CH或N;或包含被保护形式的官能团的这种化合物的衍生物,
[0259] 或其盐
[0260] (1)被式(III)的氨基酸酰基化
[0261]
[0262] 其中
[0263] R10选自氢(Gly);甲基(Ala)和被保护的氨基丁基(Lys),R11是适合的氨基保护基;和
[0264] (2)除去得到的化合物的被保护的衍生物上任意的保护基,得到如上所示的前体药物,且如果需要,则
[0265] (3)通过用酸处理将所述前体药物转化成盐,或将式(II)化合物的盐转化成相应的式(II)的游离化合物或转化成另一种盐,和/或将异构体产物化合物的混合物分离成各个异构体。
[0266] 用式(III)的氨基酸酰化式(II)的化合物按照本身已知的方式进行,通常在适合的极性或双极性无质子溶剂的存在下,根据需要使用冷却或加热,例如在约-80℃-约+150℃的温度,更优选-30℃-+120℃,尤其是约0℃-所用溶剂的回流温度。任选地加入适合的碱,特别是芳香碱样吡啶或可力丁或叔胺碱,例如三乙胺或二异丙基乙胺或无机碱式盐,例如碳酸或碳酸钠。
[0267] 酰化可以在用于肽化学中本身已知的酰胺形成的条件下进行,例如使用羧基的活化试剂,例如碳二亚胺类,如N,N’-二乙基-、N,N’-二丙基-、N,N’-二异丙基-、N,N’-二环己基碳二亚胺和N-(3-二甲基氨基异丙基)-N’-乙基碳二亚胺-盐酸盐(EDC);或使用这样的试剂,例如1-羟基苯并三唑(HOBt)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)-磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、O-(7-氮杂-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基-脲六氟磷酸盐(HATU)、2-(2-氧代-1-(2H)-吡啶基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟酸盐(TPTU),任选地在适合的碱、催化剂或辅助-试剂的存在下。羧基还可以被活化为酰卤、优选为酰氯,例如通过与亚硫酰氯或草酰氯反应,或活化为对称或不对称酸酐,例如通过与卤代甲酸酯如氯甲酸乙酯任选地在适合的碱、催化剂或辅助-试剂的存在下反应。
[0268] 如果式(II)或(III)化合物上的一个或多个另外的官能团例如羧基、羟基或氨基被保护或需要被保护(因为它们不应参与反应),则它们是这样的保护基,如通常应用于合成酰胺类,特别是肽化合物、头孢菌素类、青霉素类、核酸衍生物和糖类,它们是本领域技术人员所公知的。氨基的适合的保护基是例如氨基甲酸叔丁酯、氨基甲酸苄酯或氨基甲酸9-芴基甲酯。
[0269] 保护基可以已经存在于前体中且应防止所涉及的官能团受到不需要的二次反应的影响,例如烷基化、酰化、醚化、酯化、氧化、溶剂解和类似的反应。保护基的特征在于它们易于被除去,典型地通过溶剂解、还原、光解或还可以通过酶活性,例如在与生理条件类似的条件下且它们不存在于终产物中,即没有不期望的二次反应。本领域技术人员已知或易于确立适合于上文和下文中举出的反应的保护基。
[0270] 用这种保护基保护这种官能团、保护基自身及其除去反应描述在例如肽合成的标准参考书和有关保护基的专用书籍中,例如J.F.W.McOmie,″Protective Groups in Organic Chemistry ″,Plenum Press,London 和NewYork1973;″ Methoden der organischen Chemie″(Methods of organicchemistry),Houben-Weyl,第4版,Volume15/I,Georg Thieme Verlag,Stuttgart1974;和T.W.Greene,G.M.Wuts″Protective Groups inOrganic Synthesis″,Wiley,New York,2006。
[0271] 疾病implication
[0272] 已经证实本发明通式I的化合物使细胞增殖停止并且诱导细胞凋亡。
[0273] 细胞增殖失调或缺乏适合的细胞死亡已经具有广泛的临床含意。与这种失调相关的疾病包括增殖过度、炎症、组织重塑和修复。在这种类型中熟知的适应征包括癌症、再狭窄、血管内皮内细胞过度增生、血管发生、子宫内膜异位症、淋巴组织增殖性疾病、移植相关病理学情况(移植排斥)、息肉病、组织重塑情况中的神经功能缺失等。
[0274] 癌症与异常细胞增殖和细胞死亡率相关。因为在大部分类型的增殖性肿瘤性疾病中细胞凋亡受到抑制或延迟,所以诱导细胞凋亡是治疗癌症的选择,尤其是在显示对传统化疗、放疗和免疫疗法产生抗性的癌症类型中(Apoptosis and Cancer Chemotherapy,Hickman和Dive,eds.,BlackwellPublishing,1999)。此外,在自身免疫和移植相关疾病和病理学情况中,诱导细胞凋亡的化合物可以用于恢复正常细胞死亡过程且由此可以根除症状且可以治愈疾病。诱导细胞凋亡的化合物的另外的应用可以在于再狭窄即血管平滑肌细胞在动脉壁上蓄积和无法根除细菌-病毒-感染细胞导致的持续感染。此外,可以在上皮细胞、内皮细胞、肌细胞和其他无法接触细胞外基质的细胞中诱导或重建细胞凋亡。
[0275] 通式I的化合物可以用于预防或尤其是治疗人体或动物体,特别是治疗肿瘤性疾病、自身免疫疾病、移植相关病理学情况和/或变性疾病。这种肿瘤性疾病的实例包括、但不限于上皮性肿瘤、鳞状细胞肿瘤、基底细胞肿瘤、移行细胞乳头状瘤和癌、腺瘤和腺癌、附件和皮肤附件肿瘤、粘液表皮样肿瘤、胆囊肿瘤、粘蛋白状和浆液肿瘤、导管肿瘤(ducal-)、小叶肿瘤和延髓瘤、腺泡细胞肿瘤、复合上皮性肿瘤、特殊的性腺肿瘤、副神经节瘤和血管球瘤、痣和黑素瘤、软组织肿瘤和肉瘤、纤维瘤性肿瘤、粘液瘤性肿瘤、脂肪瘤性肿瘤、肌瘤性肿瘤、复杂性混合和间质性肿瘤、纤维上皮肿瘤、滑膜样肿瘤、间皮肿瘤、精细胞肿瘤、滋养层肿瘤、中肾瘤、血管瘤、淋巴管肿瘤、骨和软骨肿瘤、巨细胞瘤、混合型骨肿瘤、牙源性肿瘤、神经胶质瘤、神经上皮瘤性肿瘤、脑膜瘤、神经鞘肿瘤、粒细胞肿瘤和软组织腺泡状肉瘤、何杰金和非何杰金淋巴瘤、其他淋巴网状细胞肿瘤、浆细胞瘤、肥大细胞瘤、免疫增生性病、白血病、混合型骨髓增殖性疾病、淋巴组织增殖性疾病和骨髓增生异常综合征。
[0276] 通式I的化合物或其可药用衍生物可以用于治疗自身免疫疾病。这种自身免疫疾病的实例包括、但不限于系统性、盘形或亚急性皮肤红斑狼疮、类湿性关节炎、抗磷脂综合征、CREST、进行性系统性硬化、混合性结缔组织病(Sharp综合征)、莱特尔综合征、少年关节炎、冷凝集素疾病、特发性混合性冷球蛋白血症、风湿热、强直性脊柱炎、慢性多关节炎、重症肌无力、多发性硬化、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、格-巴综合征、皮肌炎/多肌炎、自身免疫性溶血性贫血、血小板减少性紫癜、嗜中性白血球减少症、I型糖尿病、甲状腺炎(包括桥本和格雷夫斯氏病)、阿狄森病、多腺体综合征、天疱疮(寻常型、落叶型、皮脂型和增殖型)、大疱和瘢痕性类天疱疮、妊娠性类天疱疮、获得性大疱性表皮松解、线性IgA疾病、硬化萎缩苔癣、杜林病、寻常性屑病、点滴状、泛发性脓疱和局限性脓疱性银屑病、白癫风、斑秃、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性肝炎、所有形式的肾小球肾炎、肺出血(古德帕斯丘综合征)、IgA肾病、恶性贫血和自身免疫胃炎、炎性肠疾病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、贝切特病、Celic-Sprue疾病、自身免疫眼色素层炎、自身免疫心肌炎、肉芽肿性睾丸炎、无睾丸炎的精子生成缺乏、特发性和继发性肺纤维化、具有自身免疫发病机制可能性的炎性疾病例如坏疽性脓皮病、红苔藓、结节病(包括勒夫格伦和皮肤/皮下类型)、环状肉芽肿、过敏性I型和IV型免疫反应、支气管哮喘、花粉病、特应性、接触性和空气传播性炎、大血管脉管炎(巨细胞和高安动脉炎)、中等大小血管脉管炎(结节性多发性动脉炎、川崎病)、小血管脉管炎(韦格纳肉芽肿、丘斯综合征、microscopic polangiitis、亨-舌紫癜、原发性冷球蛋白血症脉管炎、cutaneous leukoklastic angiitis)、超敏反应综合征、中毒性表皮坏死松解症(斯-约二氏综合征、多形红斑)、因药物副作用导致的疾病、因I-vu型(Coombs分类)免疫形式的反应导致的所有形式的皮肤、器官特异性和全身效应、移植相关病理学情况例如急性和慢性移植物抗宿主病和宿主抗移植物病,涉及所有器官(皮肤、心脏、肾、骨髓、眼、肝、脾、肌肉、中枢神经系统和外周神经系统、结缔组织、骨、血液和淋巴管、生殖泌尿系统、、软骨、主要和次要淋巴系统包括骨髓、淋巴结、胸腺、胃肠道包括口咽、食管、胃、小肠、结肠和直肠包括上述举出的降至单细胞水平和子结构的器官的部分,例如干细胞)。
[0277] 特别优选本发明的疾病是肿瘤性疾病或自身免疫疾病。在一个特别优选的实施方案中,所述疾病是癌症。
[0278] 受侵害的身体器官和部分的癌症实例包括、但不限于乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌(包括结肠和直肠,即结肠直肠癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌和间皮瘤)、内分泌系统癌、骨癌、肾上腺癌、胸腺癌、肝癌、胃癌、肠癌(包括胃癌)、胰腺癌、骨髓瘤、血液恶性肿瘤(例如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤)、膀胱癌、尿道癌、肾癌、皮肤癌、甲状腺癌、脑癌、头癌、颈癌、前列腺癌和睾丸癌。优选癌症选自乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、神经内分泌癌、肺癌、肾癌、血液恶性肿瘤、黑素瘤和肉瘤。尤其优选癌症选自乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌和肺癌。更尤其优选癌症选自宫颈癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、结肠癌和肺癌。
[0279] 样品
[0280] 可以对来源于受试者的体外生物组织样品测定BUBR1水平。样品可以是分离自身体的任意生物材料,例如正常组织、肿瘤组织、细胞系、血浆、血清、全血、脑脊髓液、淋巴液、循环肿瘤细胞、细胞裂解物、组织裂解物、尿和抽吸物。优选样品来源于正常组织、肿瘤组织、细胞系、循环肿瘤细胞或血液。更优选样品来源于肿瘤组织或循环肿瘤细胞。在一个特别优选的实施方案中,样品来源于肿瘤组织。例如,可以测定新鲜、冷冻或福尔马林固定/石蜡包埋的肿瘤组织样品中的BUBR1水平。
[0281] 样品预先获自受试者,然后使样品经历包括测定生物标记水平的方法步骤。取出样品的方法是本领域众所周知的且可以例如通过活组织检查从受试者中取出,例如通过冲压活组织检查、核心活组织检查或抽吸细针活组织检查、内窥镜活组织检查或表面活组织检查。可以通过静脉穿刺采集血样并且根据标准技术进一步加工。循环肿瘤细胞还可以基于例如大小获自血液(例如ISET-根据上皮肿瘤细胞大小分离)或免疫磁性细胞富集(例如 Veridex,Raritan,NJ)。
[0282] 样品比较
[0283] 本发明的受试者可以是人或动物,优选受试者是人。
[0284] 测定取自人体或动物体、优选取自人体的离体样品中的生物标记BUBR1。样品预先获自人体或动物体、优选预先获自人体,然后使样品经历包括测定生物标记水平的方法步骤。
[0285] 生物标记一般是用作生物响应指示剂、优选用作倾向于给予处理的指示剂的物质,在本发明的应用中,用通式I的化合物或其药学可接受的衍生物进行处理。
[0286] 在一个特别优选的实施方案中,样品中相对于标准值或标准值组较低的BUBR1水平预示抗性。本文所用的相对于标准值或标准值组降低或相对低或低或较低水平是指样品中生物标记的量或浓度可检测地低于样品中标准水平或标准水平组。这包括相对于标准至少下降约1%或低于标准约1%的水平,优选相对于标准至少下降约5%或低于标准约5%的水平。更优选相对于标准下降至少约10%或低于标准约10%的水平。更特别优选相对于标准下降至少约20%或低于标准约20%的水平。例如,这种下降较低水平可以包括、但不限于相对于标准至少下降约1%、约10%、约20%、约30%、约50%、约70%、约80%、约90%或约100%。因此,下降还包括样品中不存在可检测到的BUBR1。
[0287] 优选地,样品中较低BUBR1水平
[0288] i)相对于来自具有相同肿瘤组织型的受试者的标准值或标准值组;或
[0289] ii)最初治疗后取得并且与来自治疗开始前同一受试者的样品比较,然后开始治疗;或
[0290] iii)相对于来自正常细胞、组织或体液的标准值或标准值组;
[0291] 预示抗性。
[0292] 离体测定预先获自受试者的样品中BUBR1水平。此外,优选预测的响应是抗性。
[0293] 更优选样品中较低BUBR1水平
[0294] i)相对于来自具有相同肿瘤组织型的受试者的标准值或标准值组;或
[0295] ii)最初治疗后取得并且与来自治疗开始前同一受试者的样品比较,然后开始治疗;
[0296] 预示抗性。
[0297] 尤其优选样品中相对于来自具有相同肿瘤组织型的受试者的标准值或标准值组较低的BUBR1水平预示抗性。
[0298] 在一个优选的实施方案中,就i)的情况而言,其中比较样品中的测量值与来自具有相同肿瘤组织型作为比较样品的样品的标准值和标准值组,标准值和标准值组根据具有该癌症类型的受试者群体的样品建立。来自这些标准受试者的样品可以例如来源于肿瘤组织或循环肿瘤细胞,只要样品来源在标准样品与比较样品之间存在一致性。
[0299] 在另一个优选的实施方案中,就情况ii)而言,其中比较取自处理开始后的样品中的测量值并且比较取自处理开始前的同一受试者的样品的测量值,优选确认预示获得抗性。比较来自相同生物来源的细胞或组织的样品。预测获得抗性随后可以显示用所述化合物处理应停止。生物标记由此用于监测用所述化合物进一步处理是否能够得到期望的响应(例如异常细胞减少)或是否所述细胞对这种处理不具有响应或具有抗性。
[0300] 在另一个优选的实施方案中,就情况iii)而言,其中比较样品中的测量值与来自正常细胞、组织或体液的标准值或标准值组,标准值和标准值组根据正常(例如非癌性)细胞、组织或体液的样品建立。这种数据可以采集自受试者群体,以显示标准值或标准值组。
[0301] 标准值或标准值组根据预先得到的样品离体建立,所述的样品可以来自细胞系或优选来自至少一种受试者的生物材料且更优选来自受试者平均值(例如n=2-1000或以上)。
[0302] 然后将标准值或标准值组与相同细胞系或相同受试者对用通式I的化合物或其药学可接受的衍生物处理的响应建立相关性。从这种相关性中可以建立对比模块,例如相关比例尺或评分系统,任选地包括截止值或阈值,它们可显示生物标记水平与对通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的响应水平谱相关。这种响应水平谱可以包含对化合物的治疗活性的相对敏感性(例如高敏感性与低敏感性)和对治疗活性的抗性。在一个优选的实施方案中,这种对比模块包含预示对治疗的抗性的截止值或截止值组。
[0303] 例如,如果免疫组织化学方法用于测定样品中BUBR1水平,则标准值可以是评分系统形式。这种系统可以考虑到对其中存在的BUBR1染色的细胞的百分比。该系统还可以考虑到各细胞中染色的相对强度。然后可以将BUBR1水平的标准值或标准值组与数据建立相关性,该数据显示受试者或组织或细胞系对通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的响应,尤其是抗性。这种数据然后可以构成对比模块的组成部分。
[0304] 响应是细胞系或优选受试者或更优选受试者中的疾病对通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的活性、优选治疗活性的反应。这种响应水平谱可以包含对化合物的活性、优选治疗活性的相对敏感性(例如高敏感性与低敏感性)和对所述活性、治疗活性的抗性。可以例如在如下方面检测该响应数据:客观响应率、时间与疾病进展、无进展的存活率和总存活率。
[0305] 可以通过使用癌症治疗领域技术人员众所周知的标准评价癌性疾病的响应,例如、但不限于
[0306] Response Evaluation Criteria in Solid Tumors(RECIST)Guidelines,Source:Eisenhauer EA,Therasse P,Bogaerts J,Schwartz LH,Sargent D,Ford R,Dancey J,Arbuck S,Gwyther S,Mooney M,Rubinstein L,Shankar L,Dodd L,Kaplan R,Lacombe D,Verweij J.New response evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline(1.1版).Eur J Cancer.2009;45:228-47;
[0307] RANO Criteria for High-Grade Gliomas,Source:Wen PY,Macdonald DR,Reardon DA,Cloughesy TF,Sorensen AG,Galanis E,Degroot J,Wick W,Gilbert MR,Lassman AB,Tsien C,Mikkelsen T,Wong ET,ChamberlainMC,Stupp R,LambornKR,Vogelbaum MA,van den Bent MJ,Chang SM.Updated responseassessment criteria for high-grade gliomas:response assessment inneuro-oncology working group.J Clin Oncol.2010;28(11):1963-72;
[0308] CA-125Rustin Criteria for Ovarian Cancer Response,Source:Rustin GJ,Quinn M,Thigpen T,du Bois A,Pujade-Lauraine E,Jakobsen A,Eisenhauer E,Sagae S,Greven K,Vergote I,Cervantes A,Vermorken J.Re:New guidelines toevaluate the response totreatment in solid tumors(ovarian cancer).J Natl Cancer Inst.2004;96(6):487-8;
[0309] 和
[0310] PSA Working Group2Criteria for Prostate Cancer Response,Source:Scher HI,Halabi S,Tannock I,Morris M,Sternberg CN,CarducciMA,Eisen berger MA,Higano C,Bubley GJ,Dreicer R,Petrylak D,Kantoff P,Basch E,Kelly WK,FiggWD,Small EJ,Beer TM,WildingG,Martin A,Hussain M;Prostate Cancer Clinical Trials Working Group.Design and end points of clinical trials for patients with progressiveprostate cancer and castrate levels of testosterone:recommendations of theProstate Cancer Clinical Trials Working Group.J Clin Oncol.2008;26(7):1148-59。
[0311] 抗性与可观察到的和/或可测定的如下一种或多种情况减少或不存在相关:异常细胞、优选癌细胞数量减少或异常细胞、优选癌细胞不存在;就癌性疾病而言:肿瘤大小减小;进一步的肿瘤生长抑制(即减缓至一定程度且优选停止);肿瘤标记例如PSA和CA-125水平降低、癌细胞浸润入其他器官(包括癌扩散入软组织和骨)抑制(即减缓至一定程度且优选停止);肿瘤转移抑制(即即减缓至一定程度且优选停止);与特定癌症相关的一种或多种症状缓解;和发病率和死亡率下降。
[0312] 在一个优选的实施方案中,抗性是指可观察到的和/或可测定的如下一种或多种标准减少或不存在:肿瘤大小减小;进一步的肿瘤生长抑制;癌细胞浸润入其他器官抑制;和肿瘤转移抑制。
[0313] 在一个更优选的实施方案中,抗性是指一种或多种如下标准:无肿瘤大小减小;无进一步的肿瘤生长抑制;无癌细胞浸润入其他器官抑制;和无肿瘤转移抑制。Annexin[0314] 上述举出的抗性标准的测定根据癌症治疗领域普通技术人员众所周知的临床指导原则进行,例如上述用于测定癌性疾病的响应的举出的那些。
[0315] 还可以通过评价细胞增殖和/或细胞死亡在体外建立响应。例如,可以通过一种或多种如下充分建立的测定法评价对细胞死亡或增殖的作用:A)用Hoechst 33342染料进行核染色,提供有关核形态学和是细胞凋亡标志的DNA片段化的信息。B)反映出质膜外脂质双层的磷脂酰丝氨酸含量的膜联蛋白V结合测定法。这种情况被视为细胞凋亡的早期标志。C)TUNEL测定法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记测定法),即用于评价细胞经历细胞凋亡或坏死的荧光法,通过经标记核酸末端测定DNA片段化来进行。D)用于测定细胞代谢活性的MTS增殖测定法。活细胞具有代谢活性,而具有呼吸链受损的细胞在这种试验中显示活性降低。E)结晶紫染色测定法,其中通过直接染色细胞成分检测对细胞数量的作用。F)通过掺入溴脱氧尿苷(BrdU)监测DNA合成的增殖测定法。可以直接测定对生长/增殖的抑制作用。G)涉及膜不渗透性、荧光、单体酞菁、核酸染色的YO-PRO测定法,允许在不干扰细胞存活率的情况下分析染色(例如细胞凋亡)的细胞。还可以在细胞透化后分析对细胞数量的总体作用。H)用于细胞周期分布的碘化丙啶染色显示在细胞周期的不同期限中的分布改变。可以测定细胞周期停滞点。I)非停泊性生长测定法,例如集落过度生长测定法,其评价软琼脂中单细胞混悬液对生长成集落的能力。
[0316] 在一个涉及体外抗性测定的优选的实施方案中,抗性是指异常细胞增殖速率和/或异常细胞数量减少没有下降。更优选抗性是指癌细胞增殖速率和/或癌细胞数量减少没有下降。异常细胞、优选癌细胞数量减少可以通过各种程序性和非程序性细胞死亡机制发生。细胞凋亡、胱天蛋白酶不依赖性程序性细胞死亡和自体吞噬性细胞死亡是程序性细胞死亡的实例。然而,并不将本发明实施方案中涉及的细胞死亡标准视为限于任意一种细胞死亡机制。
[0317] BUBR1
[0318] 如上所述,本文所用的术语BUBR1包括所有预先举出的同义词且指的是如果适合在核酸和蛋白质水平上的这种本体。核酸水平是指例如mRNA、cDNA或DNA且术语蛋白质包括翻译的多肽或蛋白质序列及其翻译后修饰形式。
[0319] BUBR1(人BUBR1)的蛋白质序列的优选实例如图18SEQ.ID No.1中所举出的。然而,术语BUBR1还包括该序列的同源物、突变体形式、等位基因变体、同种型、剪接变体和等效物。优选还包括该序列的人同源物、突变体形式、等位基因变体、同种型、剪接变体和等效物。更优选包括与所述序列具有至少约75%同一性、尤其优选至少约85%同一性、特别优选至少约95%同一性且更特别优选约99%同一性的序列。
[0320] 在一个特别优选的实施方案中,BUBR1是核酸或蛋白质水平上的本体,其在蛋白质水平上表示为SEQ ID NO.1或与该序列具有至少95%同一性、优选至少99%同一性的序列。在一个特别优选的实施方案中,BUBR1表示为SEQ.ID.No.1。
[0321] BUBR1(人BUBR1)的核酸序列的优选实例可通过NCBI参比序列NM_001211得到并且如图19的SEQ.ID.No.2(NM_001211.5)所示。该术语BUBR1还包括所述序列的修饰物、多种简并变体、所述序列的补体和与所述序列之一杂交的寡核苷酸。这种修饰物包括、但不限于一种或多种核苷酸的突变、插入、缺失和取代。更优选包括与所述序列具有至少约75%同一性的序列,尤其优选至少约85%同一性,特别优选至少约95%同一性,更特别优选约99%同一性。
[0322] 在另一个优选的实施方案中,BUBR1是在核酸或蛋白质水平上的本体,其在核酸水平上表示为SEQ ID NO.2或与这种序列具有至少95%同一性、优选至少99%同一性的序列。在一个特别优选的实施方案中,BUBR1表示为SEQ.ID.No.2。
[0323] BUBR1水平
[0324] 可以通过本领域技术人员众所周知的技术方式测定BUBR1水平。可以在转录和翻译水平上测定。
[0325] 在一个优选的实施方案中,测定样品中的BUBR1核酸、优选BUBR1mRNA水平。适合于在核酸水平上测定BUBR1水平的本领域中公知的基因表达分析方法的实例包括、但不限于:i)使用能够与mRNA杂交的标记探针;ii)使用涉及基于BUBR1基因序列的一种或多种引物的PCR,例如使用应用标记探针例如氟来源的探针的定量PCR方法,例如定量实时PCR;iii)微量阵列;IV)RNA印迹;V)基因表达系列分析(SAGE)、READS(消化的cDNAs的限制性核酸内切酶扩增)、差异展示和测定microRNA。
[0326] 在一个优选的实施方案中,测定蛋白质水平上的BUBR1水平。适合于在蛋白质水平上测定BUBR1水平的本领域中公知的蛋白质表达分析方法的实例包括、但不限于:i)免疫组织化学(IHC)分析;ii)蛋白质印迹;iii)免疫沉淀;iv)酶联免疫吸附测定(ELISA);v)放射性免疫测定;vi)荧光活化细胞分选系统(FACS);vii)质谱法,包括基质辅助的激光解吸/电离(MALDI,例如MALDI-TOF)和表面增强的激光解吸/电离(SELDI,例如SELDI-TOF)。
[0327] 一些上述方法中涉及的抗体可以是单克隆或多克隆抗体、抗体片段和/或不同类型的合成抗体,包括嵌合抗体。可以标记该抗体以能够使其在与一种或多种另外的种类反应后被检测到或能够检测,例如使用标记或能够产生可检测结果的二次抗体。对BUBR1具有特异性的抗体商购自BDTransduction Laboratories和Cell Signaling Technology,Inc.或可以通过本领域技术人员众所周知的常规抗体生成方法制备。
[0328] 蛋白质分析的优选方法是ELISA、质谱技术、免疫组织化学和蛋白质印迹,更优选蛋白质印迹和免疫组织化学。在也称作免疫印迹的蛋白质印迹中,标记的抗体可以用于评价蛋白质水平,其中来自可检测标记的信号强度相当于蛋白质的量,且可以例如通过光密度测定法定量。
[0329] 免疫组织化学还使用标记的抗体检测生物标记的存在和相对量。它可以用于评价存在生物标记的细胞百分比。还可以用于评价各细胞中生物标记的定位或相对量;将后者视为染色强度的函数。
[0330] ELISA表示酶联免疫吸附测定,因为它使用与抗体连接的酶或用于检测特异性蛋白质的抗原。ELISA典型如下进行(不过,存在方法的其他变化形式):用识别生物标记的初级抗体包裹固体底物,例如96孔培养板。然后用对生物标记特异的二次抗体识别结合的生物标记。可以使其直接连接酶或可以使用结合酶的第三种抗免疫-球蛋白抗体。加入底物,所述酶催化反应,得到特定颜色。通过测定这种颜色的光密度,可以确定生物标记的存在和量。
[0331] 生物标记的用途
[0332] 在一个优选的实施方案中,生物标记用于预测受试者中疾病对如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的固有抗性。
[0333] 在另一个优选的实施方案中,生物标记用于预测受试者中疾病对如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的获得抗性。
[0334] 生物标记可以用于选择患有或倾向于患有疾病、优选癌症的受试者,以便用如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物治疗。这种生物标记的水平可以用于鉴定患者对用这种活性剂治疗可能的响应或无响应或持续响应或无持续响应。可以对患者分层次以避免不必要的治疗方案。特别地,生物标记可以用于根据未展示出低于标准水平或标准水平组的BUBR1水平的样品鉴定受试者,此时可以选择这样的受试者用如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物治疗。
[0335] 在给药量和给药方案方面,生物标记还可以用于辅助确定治疗方案。另外,生物标记可以用于选择对受试者施用药物的组合,包括通式I的化合物或其药学可接受的衍生物和另一种化疗(细胞毒性)剂。此外,生物标记可以用于辅助确定受试者中的疗法策略,包括通式I的化合物或其药学可接受的衍生物是否可以与靶向疗法、内分泌疗法、放疗、免疫疗法或手术干预组合或它们的组合施用。
[0336] BUBR1还可以与其他生物标记联用以预测对通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的响应并且确定治疗方案。还可以与化学敏感性测试联用以预测抗性和确定治疗方案。化学敏感性测试包括直接将通式I的化合物施用于取自受试者例如来自具有血液恶性肿瘤或可取得的实体瘤例如乳腺癌和头颈癌或黑素瘤的受试者的细胞,以确定细胞对化合物的响应。
[0337] 治疗方法
[0338] 本发明在一些方面中还涉及治疗方法和BUBR1在治疗方法中的用途,其中首先建立相对于标准水平或标准水平组或预-治疗起始水平的BUBR1水平,然后如果所述样品中的BUBR1水平分别低于标准值或标准值组或相对于预治疗起始水平未降低,则施用如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物。可以以药物组合物的形式施用通式I的化合物或其药学可接受的衍生物,正如本领域技术人员众所周知的。适合的组合物和剂量例如公开在WO2004/103994A1的35-39页中,特别地将它们引入本文作为参考。对温血动物、尤其是人而言,尤其优选用于肠施用的组合物,例如鼻、口含、直肠或尤其是口服施用;和用于胃肠外施用的组合物,例如静脉内、肌内或皮下施用。更具体地,优选用于静脉内施用的组合物。
[0339] 组合物包含活性成分和药学可接受的载体。组合物的实例包括、但不限于如下:5000软胶囊,它们各自包含0.05g式(I)的化合物之一作为活性成分,如下所述制备:将
250g粉状活性成分混悬于2升 (月桂酸丙二醇酯,Gattefossé S.A.,
Saint Priest,France),用湿粉碎研磨,产生约1-3μm的粒径。然后使用装胶囊机将
0.419g部分的混合物导入软胶囊。
[0340] 本发明在一个方面中还涉及治疗肿瘤性疾病或自身免疫疾病、优选癌症的方法,通过下列步骤进行:首先增加受试者中BUBR1的水平,该受试者具有低于标准水平或标准水平组或预-治疗起始水平的BUBR1水平的样品,然后用如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物治疗该受试者。可以通过直接或间接化学或遗传方式增加BUBR1水平。这种方法的实例是用导致BUBR1表达增加的药物治疗和靶向递送病毒、质粒或肽构建体或抗体或siRNA或反义引物以增量调节BUBR1水平。例如,病毒或质粒构建体可以用于增加细胞中BUBR1的表达。然后可以用通式I的化合物或其药学可接受的衍生物治疗受试者。
[0341] 可以单独施用或于一种或多种其他治疗剂组合施用通式I的化合物或其药学可接受的衍生物。可能的联合疗法可以采用固定组合的形式或交错或彼此独立地施用本发明的化合物与一种或多种另外的治疗剂或联合施用固定的组合和一种或多种另外的治疗剂。
[0342] 除此之外或此外,通式I的化合物或其药学可接受的衍生物尤其还可以与化疗(细胞毒性疗法)、靶向疗法、内分泌疗法、放疗、免疫疗法、手术干预或它们的组合联合用于肿瘤疗法。长期疗法可能等同于如上所述的其他治疗策略范围内的辅助疗法。其他可能的治疗是在肿瘤退化乃至化疗预防例如在处于风险中的患者中维持患者状态。
[0343] 试剂盒和装置
[0344] 在一个方面中,本发明涉及试剂盒,在另一个方面中,本发明涉及装置,它们用于预测受试者中疾病对如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的响应,它们包含用于测定样品中BUBR1水平必不可少的试剂。优选地,所述试剂包含含有用于BUBR1的检测剂的俘获试剂和检测试剂。
[0345] 所述试剂盒和装置还可以优选地包含对比模块,该对比模块包含比较样品中BUBR1水平的标准值或标准值组。在一个优选的实施方案中,对比模块包括在试剂盒的使用说明书中。在另一个优选的实施方案中,对比模块是显示装置形式,例如色条或数值码材料,将它们设计成紧邻样品测量读出器以指示抗性水平。可以如上所述测定标准值或标准值组。
[0346] 试剂优选是选择性地结合BUBR1的抗体或抗体片段。它们可以是例如结合BUBR1的一种特异性初级抗体和结合初级抗体且自身被标记用于检测的二次抗体形式。还可以标记初级抗体以便直接检测。所述试剂盒或装置还可以任选地包含洗涤溶液,与洗涤后的其他生物标记相比,其能够选择性地保持生物标记结合俘获试剂。这种试剂盒随后用于ELISA、蛋白质印迹、流式细胞计量术、免疫组织化学或其他免疫化学方法,以检测生物标记水平。
[0347] 在另一个优选的实施方案中,所述试剂还可以是能够测定样品中BUBR1核酸水平的那些。适合的样品是组织或肿瘤组织样品、固定和石蜡包埋的切片或冷冻组织或肿瘤组织样本、循环肿瘤细胞和血液和体液衍生的样品。优选地,所述试剂包含用于与样品中BUBR1核酸杂交的标记的探针或引物。基于PCR扩增技术或标记探针的检测,适合的检测系统能够对样品中的BUBR1核酸定量。该方法可以如下进行:i)在样本自身上原位,优选在来自石蜡包埋或冷冻样品的切片中;ii)在来自肿瘤、组织或血液衍生的样品的提取物中,其中适合的试剂选择性地富集核酸。所述试剂盒或装置能够测定和定量:i)原位与样品的杂交标记探针的量;或ii)通过基于探针自身或连接引物的报道分子的特定物化特性的方法的基于引物扩增产物的量。
[0348] 此外,所述装置可以包含成像装置或测量装置(例如、但不限于荧光测量),它们可以进一步加工处理测定的信号并且将它们转化成对比模块中的比例尺。
[0349] 更优选地,所述试剂盒包含如上述所定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物。然后正如通过试剂盒中包含的试剂所测定的,可以根据来自受试者的样品中的生物标记水平将这种化合物施用于该受试者。因此,本发明的试剂盒可以用于如上述所定义的本发明的治疗方法。在一个特别优选的实施方案中,所述试剂盒包含下式的化合物或其药学可接受的盐:
[0350]
[0351] 在试剂盒的一个特别优选的实施方案中,所述盐是二盐酸盐。在另一个方面中,本发明涉及如上所述的这种试剂盒的用途。
[0352] 在本说明书中,措词“包含,,应理解为指的是包含所述要素或要素组,但不排除任意其他要素或要素组。
[0353] 实验方法
[0354] 培养的细胞的免疫荧光染色
[0355] 以50%的密度将A549人肺小细胞肺癌(NSCLC,ATCC参比号CCL-185)细胞、HeLa宫颈癌细胞(ATCC参比号CCL-2)和SKBR3乳腺癌细胞(ATCC参比号HTB-30)接种在圆形显微镜盖玻片上,在37℃、5%CO2在包含10%FCS(也称作FBS)的RPMI-1640中培养24小时。将测试化合物溶于DMSO。用包含稀释化合物(紫杉醇、长春碱、秋水仙碱和诺考达唑购自Sigma-Aldrich)或媒介物的培养基替代细胞培养基。处理后,洗涤盖玻片,在室温用甲醇/丙酮(1∶1)将细胞固定5分钟,然后在室温在封闭缓冲液(0.5%BSA和0.1%TX-100的PBS溶液)中温育30分钟。然后在室温封闭缓冲液中将样本与抗-α-微管蛋白抗体(Sigma,1∶2000)一起温育1小时。几次洗涤步骤后,将细胞与AlexaFluor-488山羊-抗-小鼠IgG(Molecular Probes,1∶3000)一起在室温温育1小时,然后用封闭缓冲液进行几次洗涤步骤。然后用ProLong Gold抗衰退剂(Molecular Probes)固定样本,用指甲油封闭,用免疫荧光显微镜检验。用冷却的CCD-照相机俘获图像,用ImageJ软件加工处理。
[0356] siRNA转染
[0357] 为了显示BUBR1是抗性生物标记,进行siRNA实验。为了进行用于评价对肿瘤细胞表型和数量的作用的siRNA实验(图8),在37℃和5%CO2在具有10%FCS(Invitrogen)的DMEM中培养HeLa(ATCC参比号CCL-2)宫颈癌细胞。将1000HeLa细胞/孔接种入黑色384孔多滴定板(BDFalcon)上。用20nM非靶向对照siRNA(ON-Target-+非-靶向库D001810,Dharmacon)或4种BUBR1 siRNAs的混合物(ON-Target-+SmartpoolL-004101,Dharmacon,参见如下的序列信息)、使用Dharmafect1(Dharmacon,Thermo)转染试剂逆转染细胞。细胞接种和siRNA转染后48小时,用BAL27862(50nM,0.1%DMSO)处理一种复制配对的siRNA克隆,用对照溶液(0.1%DMSO)处理另一种复制配对24小时。通过基于甲醇的固定(-20℃,5min)终止实验,然后使用α-微管蛋白(FITC标记的,1∶500,F2168,Sigma)和肌动蛋白(TRITC-次毒蕈环肽,1∶3000,P1951,Sigma)抗体和Hoe33342 DNA染色剂(1∶8000,Sigma)进行免疫染色(1小时,室温)。基于免疫染色,使用多参数方法(BD Pathway855荧光显微镜;20x目镜)与适合的软件分析处理细胞的形态。另外还基于核的Hoe33342染色计算每个孔中的细胞数量。这能够计算展示(正常)表型的未处理细胞分数(以%计)。
[0358] 为了进行用于通过免疫印迹评价对BUBR1表达水平的作用和使用YO-PRO测定法(图7、9、10和11)和结晶紫测定法(图12和13)对肿瘤细胞增殖和存活率的作用的siRNA实验,以适合的密度将细胞接种在6孔培养板中:HeLa(宫颈癌细胞;ATCC参比号CCL-2)2.5E+04(就YO-PRO而言)或4.0E+04(就结晶紫而言)细胞/孔、H460(NSCLC细胞;ATCC参比号HTB-177)5.0E+04细胞/孔、MCF-7(乳腺癌细胞;ATCC参比号HTB-22)2.4E+05细胞/孔、Panc1(胰腺癌细胞,ATCC参比号CRL-1469)和HCT116(结肠癌细胞,ATCC参比号CCl-247)8E+04细胞/孔,在37℃和5%CO2在RPMI-1640或包含10%FCS的DMEM(完全培养基)中培养。第二天用4种BUBR1 siRNAs的混合物(ON-Target-+SmartpoolL-004101,Dharmacon,参见如下序列信息)、4种各个BUBR1 siRNAs(ON-Target-+4种改进的升级LU-004101组)或非靶向对照siRNAs(ON-Target-+非靶向库D001810,Dharmacon)转染细胞,对H460使用Hiperfect(Qiagen),对HeLa和MCF-7使用Panc1和HCT116或Lipofectamine2000(Invitrogen),根据制造商的说明进行。siRNA的终浓度为10nM(H460)或20-30nM(HeLa)或20nM(MCF-7,Panc1,HCT116)。将细胞维持在37℃和5%CO224小时,然后进行化合物处理48小时,然后进行YO-PRO分析、结晶紫测定或提取用于免疫印迹测定。ON-Target-+siRNAs是双链siRNAs,将其进行化学修饰以改进对期望靶标的特异性。
[0359] 所用的4种BUBR1 siRNAs的序列为:
[0360] ON-TARGET+BUBR1 siRNA#1 SEQ ID.No.3
[0361] 5′GAUGGUGAAUUGUGGAAUA
[0362] ON-TARGET+BUBR1 siRNA#2 SEQ ID.No.4
[0363] 5′GAAACGGGCAUUUGAAUAU
[0364] ON-TARGET+BUBR1 siRNA#3 SEQ ID.No.5
[0365] 5′GCAAUGAGCCUUUGGAUAU
[0366] ON-TARGET+BUBR1 siRNA#4 SEQ ID.No.6
[0367] 5′CAAUACAGCUUCACUGAUA
[0368] siRNA-处理的细胞的YO-PRO测定
[0369] 将溶于DMSO的BAL27862稀释入完全培养基,然后以所示浓度添加到细胞中(终浓度DMSO0.5%)。将细胞温育48小时,然后进行YO-PRO分析。
[0370] 碘化物是膜不渗透性的荧光单体酞菁核酸染料,其允许在不干扰细胞存活率的情况下分析染色(例如细胞凋亡)的细胞。
[0371] 将12.5μl 碘化物(491/509)(Invitrogen/Molecular Probes,#Y-3603;1mM在DMSO中)加入到1ml5-倍浓缩的YO-PRO缓冲液(100mM柠檬酸Na,pH4.0;
134mM NaCl)中,以产生YO-PRO混合物。为了测定细胞毒性/细胞凋亡,在6孔培养板中的每个孔中加入500μlYO-PRO混合物(稀释度1∶5),在黑暗中室温温育10min。通过使e
用SpectraMax M2培养板读出器(Molecular Devices)、使用485nm激发和538nm发射、以
530nm的截止值评价摄入细胞的YO-PRO染料。为了测定对细胞生长/总细胞数量的总体作用,在每个孔中加入500μl裂解缓冲液(30mM EDTA;30mM EGTA;0.6%NP-40;用0.33倍e
YO-PRO缓冲液),在室温在黑暗中温育30min。用SpectraMax M2培养板读出器(Molecular Devices)、使用485nm激发和538nm发射以530nm的截止值进行荧光读取。将死亡细胞的%计算为占总剩余细胞数量的百分比。
[0372] siRNA-处理的细胞的结晶紫测定
[0373] 将细胞与DMSO或稀释入完全培养基(终浓度DMSO0.5%)的BAL27862一起温育48小时。除去培养基后,固定细胞,通过在每个孔中添加1ml结晶紫染色剂(0.2%结晶紫的50%甲醇溶液)染色。将培养板在室温温育1小时。然后滗析染色剂,用双蒸水将培养板洗涤4次。将培养板风干几小时。通过在每个孔中添加2ml缓冲液(0.1M Tris pH7.5,e
0.2%SDS,20%乙醇)并且振摇培养板溶解染色剂。使用SpectraMax M2培养板读出器(Molecular Devices)测定590nm处的吸光度。为了扣除起始细胞数,固定对照培养板,在加入所述化合物的同一天染色。通过从对照品(DMSO)或化合物处理的细胞的吸光度中扣除起始细胞吸光度计算最终结果。低于零的值表示细胞死亡。
[0374] 集落过度生长测定:
[0375] 制备来源于患者的肿瘤异种移植物(维持在裸鼠中)的单细胞混悬液。为了进行集落过度生长测定,根据Hamburger & Salmon(Primarybioassay of human tumour stem cell,Science,1977,197:461-463)介绍的测定法将细胞在24-孔培养板中的软琼脂上铺板。将包含0.4%琼脂的0.2mL培养基中的2.0E+04-6.0E+04细胞在0.75%琼脂底层上铺板。将测试化合物涂布在0.2mL培养基上。每个24-孔培养板包含未处理的对照样品和样品,一式三份。将培养物在37℃和7.5%CO2温育5-28天。分析前24小时,用可代谢的四唑鎓盐染色活集落(Alley MC等人,Life Sci.1982,31:3071-3078),用自动图像分析系统计数(Omnicon 3600,Biosys GmbH)。
[0376] 相对药物作用表示为处理孔中的集落平均数与对照孔中的集落平均数之比。通过绘制化合物浓度与相对集落计数的关系图确定IC70-值。
[0377] 定量实时PCR
[0378] 使HeLa宫颈癌和H460NSCLC(ATCC参比号HTB-177)细胞生长在10cm-平皿中,直到它们达到80%汇合率为止,然后进行胰蛋白酶消化,沉淀,重新混悬于1ml Trizol试剂(Invitrogen)。根据制造商的说明分离总RNA。使用TaqMan RNA-to-Ct1-步试剂盒(Applied Biosystems,参比号4392938)和使用100ng RNA/反应的基因表达测定法(Applied Biosystems)、应用ABI Prism 7000序列检测系统进行实时PCR。使用如下基因表达测定法:用于定量BUBR1的测定法ID Hs01084828_m1或用于定量18S-RNA的测定法ID HS99999901_s1。全部样品均一式三份分析。使用SDS软件(Applied Biosystems)进行数据分析。将BUBR1表达水平对18S-RNA校准。
[0379] BAL27862-抗性细胞系的传代和结晶紫测定
[0380] 通过长期在完全细胞培养基(包含10%FCS的RPMI-1640;Sigma-Aldrich)中选择、经逐步增加BAL27862浓度生成人非小细胞肺癌(H460ATCC参比号HTB-177;A549ATCC参比号CCL-185)、卵巢癌(SKOV3ATCC参比号HTB-77)品系的BAL27862-抗性亚系。依赖于细胞系,选择过程进行8-12个月,以得到抗性因子(抗性细胞系和适合的野生型细胞系IC50之比)为3-11.6。以最高耐受的BAL27862浓度铺展抗性亚系,然后冷冻,贮存在液氮中。
[0381] 以如下密度将细胞接种在96孔培养板中:A549:2000,H460:1000,SKOV3:2000,24小时温育后,与稀释入完全培养基(终浓度DMSO最大0.5%)的DMSO、BAL27862、秋水仙碱、诺考达唑、紫杉醇或长春碱一起温育72小时。除去培养基后,固定细胞,通过在每个孔中添加50μl结晶紫染色剂(0.2%结晶紫的50%甲醇溶液)染色。将培养板在室温温育1小时。然后滗析染色剂,用双蒸水将培养板洗涤4次。将培养板风干几小时。通过在每个孔中添加100μl缓冲液(0.1M Tris pH7.5,0.2%SDS,20%乙醇)并且振摇培养板溶解染色剂。使用SpectraMax M2e培养板读出器(Molecular Devices)测定590nm处的吸光度。根据浓度响应取曲线、使用GraphPad Prism软件计算抗增殖IC50值。将抗性因子计算为抗性品系变体中的BAL27862 IC50与亲代品系中的IC50之比。
[0382] 蛋白质提取
[0383] 肿瘤细胞提取:用包含1mM苯基甲基磺酰基氟(PMSF)的冷PBS和包含50mM HEPES(pH7.5)、150mM NaCl、25mM β-甘油磷酸盐、25mM NaF、5mM EGTA、1mM EDTA、15mM焦磷酸盐、2mM原酸钠、10mM钼酸钠、亮抑蛋白酶肽(10μg/mL)、抑肽酶(10μg/mL)和1mM苯基甲基磺酰基氟(PMSF)的冰冷缓冲液洗涤细胞。用包含1%NP-40的相同缓冲液提取细胞。匀化后,通过离心使裂解液澄清,冷冻在-80℃下。
[0384] 免疫印迹/蛋白质印迹
[0385] 使用20μg总蛋白/泳道进行免疫印迹。使用BCA蛋白质测定法(Pierce)测定总蛋白质浓度。用7.5%SDS-凝胶分离蛋白质并且使用半干印迹(90min,50mA/凝胶)转至PVDF膜上。用于免疫印迹的初级抗体如下:
[0386] BUBR1Ab.No1:BUBR1CS(购自Cell Signaling Technology,Inc,参比号4116)来源:家兔,多克隆,稀释度1∶1000,缓冲液条件:5%乳的PBS/0.1%Tween溶液[0387] BUBR1Ab.No2:BUBR1BD(购自BD Transduction Laboratories,参比号612502)来源:小鼠,单克隆,稀释度1∶5000,缓冲液条件:3%BSA的PBS/0.1%Tween溶液[0388] α-微管蛋白:(购自Sigma,参比号T5168)来源:小鼠,单克隆稀释度1∶10000,缓冲液条件:5%乳或3%BSA的PBS/0.1%Tween溶液
[0389] 肌动蛋白:(购自Chemicon,参比号MAB1501)来源:小鼠,单克隆稀释度1∶5000,缓冲液条件:5%乳或3%BSA的PBS/0.1%Tween溶液
[0390] 用于免疫印迹的二次抗体是过氧化物酶缀合的山羊抗-家兔或山羊抗-小鼠(购 自Jackson ImmunoResearch Laboratories INC:参 比 号111-035-144JIR 和115-035-146JIR),稀释度1∶5000,缓冲液条件:5%乳的PBS/0.1%Tween溶液。使用Raytest Stella3200高性能成像系统揭示出标记的带。
[0391] 免疫组织化学
[0392] 在室温将来源于患者的肿瘤异种移植物(维持在裸鼠中)固定在包含4%甲的10%中性缓冲的福尔马林中20-28小时。将固定的样本保持在70%乙醇溶液中最长1周,然后使用如下举出的条件根据标准方法进行脱水和石蜡包埋:
[0393]依次处理 时间(小时)
70%EtOH 1
80%EtOH 2
99%EtOH 1
100%异丙醇 0.5
100%异丙醇 1
木糖醇 0.5
木糖醇 1
木糖醇 1
石蜡 1
石蜡 2
石蜡 2
[0394] 切下约2μm的石蜡切片,通过使用运行标准加工步骤的自动化免疫荧光染色仪Benchmark (Roche)加工处理。用5mg/ml浓度的DAB(3,3-二氨基联苯胺)作为显色底物对特异性抗体染色显影。如下初级抗体和加工条件用于染色:
[0395]
[0396] 详细实施例
[0397] 实施例1:通式I化合物诱导的差别有丝分裂表型
[0398] 用化合物A(BAL27862)或用化合物B或化合物C处理在所有测试的肿瘤细胞系中诱导高度可再现的和不同的微管表型(对A549、HeLa和SKBR3细胞中的化合物A如图1中所示,对A549细胞中的化合物B和化合物C如图2中所示)。在分裂细胞中,有丝分裂纺锤体的表观片段化出现,导致形成点状结构(图1)。显示这种表型不同于使用常规微管靶向剂例如微管稳定剂紫杉醇和微管去稳定剂长春碱和秋水仙碱(图3)和诺考达唑(图4)观察到的结果。
[0399] 实施例2:BAL27862以优势方式克服常规微管靶向药物诱导的微管表型[0400] 为了显示其对微管的活性的唯一性,使用A549细胞测试BAL27862与长春碱、秋水仙碱和紫杉醇(图5)和诺考达唑(图6)的组合。单独使用长春碱、秋水仙碱、紫杉醇或诺考达唑处理诱导具有这些活性剂特征的有丝分裂微管表型。然而,尽管持续存在长春碱、秋水仙碱、紫杉醇或诺考达唑,但是与BAL27862组合处理最终4小时导致微管结构破坏;生成与用单独的BAL27862处理一致性的表型。相反,首先用BAL27862处理,然后与长春碱、秋水仙碱、紫杉醇或诺考达唑组合处理4小时对所观察到的使用BAL27862处理一致性的微管表型没有产生影响。
[0401] 这些数据显示通式I的化合物一致性地、但以不同于常规微管靶向剂的方式影响微管生物学。
[0402] 本发明的详细实施例
[0403] 实施例3:siRNA-介导的BUBR1表达的减量调节抑制BAL27862处理诱导的抗增殖效应和肿瘤细胞死亡
[0404] 通过免疫印迹分析(使用BUBR1Ab.No.1和2),显示使用4种BUBR1siRNAs的库的BUBR1表达的减量调节在HeLa宫颈肿瘤和H460NSCLC细胞系中都极为有效(图7)。
[0405] 令人意外地,在BAL27862的存在下,集合的BUBR1siRNA处理对HeLa细胞数量和具有正常表型的HeLa细胞的部分的作用的分析显示BUBR1是最佳效果所需的(图8)。使用YO-PRO测定法对BUBR1表达减少对HeLa细胞增殖和活力的作用的进一步分析显示,尽管BUBR1表达缺失自身导致增殖率的适度下降,但是BAL27862的抗增殖作用显著降低(图9,上组)。此外,与大量BAL27862-处理的对照组相比,未观察到肿瘤细胞死亡增加(图9,下组)。
[0406] 显示这种作用不是细胞系或肿瘤类型特异性的,与处理H460(图10)和MCF7乳腺癌细胞(图11)后的观察结果相同。此外,使用分析细胞增殖的备选方法(结晶紫测定法),在HeLa和胰腺(Panc1)和结肠癌(HCT116)细胞(图12)中再次观察到了相同的效果。
[0407] 为了控制用于图7-12中呈现的实验的BUBR1 siRNA库的特异性,还评价了所述库中包含的各siRNAs。用所有各种siRNAs处理降低了BAL27862对细胞增殖的作用(正如通过结晶紫测定法所评价的)(图13A)。重要的是,降低程度与每种siRNA各自导致的BUBR1蛋白质减量调节效率相关(比较图13A与13B)。
[0408] 实施例4:在为BAL27862抗性选择的肿瘤品系中观察到BUBR1表达的减量调节[0409] 对BAL27862抗性的体外选择导致3种相对抗性的肿瘤细胞系生成,与亲代品系相比具有如下抗性因子(基于使用结晶紫测定法的IC50测定):A549(3.0倍);SKOV3抗性1(7.6倍);SKOV3抗性2(11.6倍);H460(5.3倍)(表1)。
[0410] 表1:
[0411]
[0412] 一般而言,与BAL27862相比,这些BAL27862-抗性细胞显示对其他微管去稳定剂例如秋水仙碱、诺考达唑和长春碱的不同响应水平;实际上,在全部品系中均观察到对微管稳定剂紫杉醇的敏感性增加(表1)。
[0413] 这些品系的提取和免疫印迹分析(使用BUBR1Ab.No.2,小鼠单克隆)显示与亲代品系相比BUBR1蛋白质表达减少(图14)。这一结果维持在SKOV3细胞中自始至终的抗性发展(图15)。这些数据显示BUBR1表达水平降低与对BAL27862的获得抗性的相关性。
[0414] 实施例5:低BUBR1表达水平与来源于获自的肿瘤细胞对BAL27862处理的抗性的相关性
[0415] 基于集落过度生长测定法,使用来源于作为异种移植物维持在小鼠中的患者来源的肿瘤细胞,鉴定来自胃和肺癌的BAL27862-敏感性或相对抗性肿瘤细胞(参见表2)。与对照组相比70%生长抑制下的浓度(IC70)如表2中所示。在该表中,BAL27862-敏感性肿瘤细胞具有低纳摩尔范围的IC70值,而BAL27862-抗性肿瘤细胞定义为IC70值>600纳摩尔。使用相同离体测定法,也得到了全部肿瘤模型的紫杉醇和长春碱数据。均对使用紫杉醇处理具有抗性,而对使用长春碱处理均敏感。
[0416] 表2:
[0417]
[0418] 进行免疫组织化学分析,测定作为异种移植物维持的相同肿瘤中的肿瘤细胞BUBR1蛋白质表达。分析全肿瘤BUBR1水平显示BUBR1水平在不同肿瘤之间可变(图16)。
[0419] 基于集落过度生长测定法和相同IC70标准,紫杉醇或长春碱抗性与低BUBR1表达水平之间不存在相关性。这是显而易见的,因为就胃肿瘤类型而言,两种模型对紫杉醇都具有抗性,而就GXF97而言,BUBR1水平远低于GXF251中的水平。相同的相关性缺乏对长春花生物碱长春碱在胃模型中而言是确切的,因为这些肿瘤都对长春碱敏感。这种相关性缺乏在肺肿瘤模型中重复。因此,经证实BUBR1水平不适合于作为来源于患者的肿瘤模型中对常规微管活性剂紫杉醇和长春碱具有抗性的可靠生物标记。
[0420] 令人意外地,相反,当将如通过集落过度生长测定法所定义的BAL27862抗性数据与BUBR1水平比较时,显示BUBR1表达仅在抗性肿瘤中较低,而不是在来源于相同肿瘤组织型的敏感性肿瘤中(比较图16与表2)。低BUBR1水平由此一致性地指示对BAL2786具有抗性。因此,经证实BUBR1水平是本发明的化合物BAL27862的抗性的生物标记。
[0421] 实施例6:BUBR1 RNA与蛋白质表达水平对比
[0422] 为了证实BUBR1 RNA表达水平反映出的蛋白质表达水平,并由此RNA表达水平可以用于预测对BAL27862的抗性,如下测定RNA和蛋白质水平上的表达水平。全细胞蛋白质提取物由HeLa和H460细胞系制备并且通过免疫印迹分析BUBR1蛋白质表达(图17B)。RNA样品由同一小细胞传代制备并且进行定量RT-PCR(图17A)。免疫印迹数据(图17B)和RT-PCR数据(图17A)的对比显示在这些细胞系中BUBR1的蛋白质与RNA表达水平之间存在良好的相关性。
[0423] 缩写清单
[0424] A549 人非小细胞肺癌细胞系
[0425] BCA 双金鸡宁酸
[0426] Bcl-2 B-细胞淋巴瘤2蛋白
[0427] BRCA1 乳腺癌1型易感蛋白
[0428] BrdU 溴脱氧尿苷
[0429] BSA 血清白蛋白
[0430] CCD 带电荷的偶合装置
[0431] cDNA 互补脱氧核糖核酸
[0432] CA-125 癌抗原125
[0433] CREST 有限硬皮病综合征
[0434] DAB 3,3-二氨基联苯胺
[0435] DMSO 二甲亚砜
[0436] DMEM Dulbecos改进的必需培养基
[0437] DNA 脱氧核糖核酸
[0438] dUTP 2′-脱氧尿苷5′-三磷酸
[0439] EDTA/EGTA 乙二胺四乙酸盐/乙二醇-双(β-氨基乙基)-N,N,N′,N′-四乙酸盐[0440] ELISA 酶联免疫吸附测定
[0441] ErbB-2 人表皮生长因子受体2
[0442] EtOH 乙醇
[0443] FACS 荧光活化细胞扫描/分选
[0444] FCS/FBS 胎牛/胎牛血清
[0445] G2/M 细胞周期中从G2过度到有丝分裂期
[0446] GXF251 来源于患者的胃癌
[0447] GXF97 来源于患者的胃癌
[0448] HCT116 人结肠直肠癌细胞系
[0449] HeLa 人鳞状细胞癌细胞系
[0450] HEPES 4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙磺酸
[0451] Hoe33342 2′-(4′-乙氧基苯基)-5-(4-甲基哌嗪-1-基)-2,5′-双-1H-苯并咪唑三盐酸盐三水合物
[0452] H460 人非小细胞肺癌细胞系
[0453] IgA 免疫球蛋白A
[0454] IgG 免疫球蛋白G
[0455] IHC 免疫组织化学
[0456] ISET 通过上皮肿瘤细胞大小分离
[0457] LXFA629 来源于患者的肺癌细胞
[0458] LXFL529 来源于患者的肺癌细胞
[0459] MALDI 基质辅助的激光解吸/电离质谱法
[0460] MALDI-TOF 基质辅助的激光解吸/电离-飞行时间质谱法
[0461] MCF-7 人乳腺癌细胞系
[0462] mRNA 信使核糖核酸
[0463] MTS 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓
[0464] NaCl 氯化钠
[0465] NaF 氟化钠
[0466] NCBI 国家生物技术信息中心
[0467] NSCLC 非小细胞肺癌
[0468] NP40 Nonidet P40
[0469] NTC 非模板对照
[0470] PBS 磷酸缓冲盐溶液
[0472] P-gp P-糖蛋白
[0473] PMSF 苯基甲基磺酰基氟
[0474] PSA 前列腺特异抗原
[0475] PVDF 聚偏氟乙烯
[0476] RANO 高等级神经胶质瘤响应评价
[0477] RECIST 实体瘤中响应评价标准
[0478] READS 消化的cDNAs的限制性核酸内切酶扩增
[0479] RPMI-1640 用于培养转化和未转化真核细胞和细胞系的细胞培养基
[0480] RT-PCR 实时聚合酶链反应
[0481] SAGE 基因表达系列分析
[0482] SDS 十二烷基硫酸钠
[0483] SELDI 表面增强的激光解吸/电离质谱法
[0484] SELDI-TOF 表面增强的激光解吸/电离-飞行时间质谱法
[0485] SEQ.ID No. 序列识别号
[0486] siRNA 小抑制性核糖核酸
[0487] SKBR3 人乳腺癌细胞系
[0488] SKOV3 人卵巢癌细胞系
[0489] TUNEL 末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记
[0490] TX-100 Triton-X100
[0491] YO-PRO 荧光,单体酞菁,核酸染料
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