抗IgA1抗体 |
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| 申请号 | CN201080059844.3 | 申请日 | 2010-12-28 | 公开(公告)号 | CN102712923A | 公开(公告)日 | 2012-10-03 |
| 申请人 | 协和发酵麒麟株式会社; | 发明人 | 金子悦士; 佐佐木由香; 森胜弘; 神田丰; 佐藤光男; | ||||
| 摘要 | 本 发明 的目的在于提供一种对IgA肾病的诊断有效的单克隆 抗体 ，其特异性识别并结合由免疫球蛋白A1的重链基因编码的多肽的 铰链 区，所述铰链区包含未结合半乳糖的丝 氨 酸苏氨酸连接型糖链。根据本发明，能够提供一种单克隆抗体或该抗体 片段 ，其特异性识别并结合由免疫球蛋白A1的重链基因编码的多肽的铰链区，所述铰链区包含未结合半乳糖的丝氨酸苏氨酸连接型糖链；并且能够提供使用该抗体或抗体片段的 诊断剂 以及含有该抗体或抗体片段作为有效成分的 治疗 剂。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种单克隆抗体或该抗体片段，其特异性识别并结合由免疫球蛋白A1的重链基因编码的多肽(以下称为IgA1重链)的铰链区，所述铰链区包含未结合半乳糖的丝氨酸/苏氨酸连接型糖链(以下称为O连接型糖链)。 |
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| 说明书全文 | 抗IgA1抗体技术领域[0001] 本发明涉及一种单克隆抗体或该抗体片段，其特异性识别并结合由免疫球蛋白A1的重链基因编码的多肽的铰链区，所述铰链区包含未结合半乳糖的丝氨酸苏氨酸连接型糖链；并且涉及产生该抗体的杂交瘤、编码该抗体的DNA、含有该DNA的载体、对该载体进行转化而得到的转化体、使用该杂交瘤或转化体的抗体或该抗体片段的制造方法、使用该抗体或抗体片段的诊断剂以及含有该抗体或抗体片段作为有效成分的治疗剂。 背景技术[0002] 近年来，报道了如下实例：伴随着各种疾病的发病和病情的发展，附加在与该疾病和病情相关的细胞所表达的蛋白质上的糖链结构发生变化。该实例中，具有代表性的是在超过80%的人类癌症种类中观察到表达的、作为O连接型(丝氨酸苏氨酸型)糖链抗原之一的Tn抗原(汤姆森(Thomsen)抗原、CD175抗原)和在该Tn抗原上附加有涎酸的涎酸化Tn抗原(CD175s抗原)的表达(非专利文献2)。已知这些糖链抗原在正常细胞中几乎观察不到表达，并且正在进行将其作为癌特异性疫苗疗法的靶分子应用于医疗的研究(非专利文献1)。这些癌特异性糖链抗原的表达通过生物体内存在的构成复杂的糖链生物合成途径和糖链代谢途径的酶活性来进行调控。作为其中一例，已知如下例子：在癌细胞中，编码参与糖链生物合成途径的蛋白质的基因的表达方式发生变化，结果，糖链生物合成途径在中途被阻断；等。Tn抗原作为正常细胞中的O连接型糖链的生物合成途径的中间产物而已知，其具有：在蛋白质氨基酸序列中的特定的丝氨酸(Ser)残基或苏氨酸(Thr)残基的侧链中存在的羟基上具有α连接的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的结构(GalNAcα-Ser/Thr)。利用核心1β3半乳糖转移酶(core1β3Gal-T,T-合成酶)的活性在该Tn抗原的非还原末端侧附加一分子半乳糖，由此进行TF抗原(汤姆森-弗里登雷克(Thomsen-Friedenreich)抗原、CD176抗原)等正常型O连接型糖链的生物合成。认为在多种癌细胞系中，细胞内的核心1β3半乳糖转移酶的活性降低，结果，糖链的生物合成途径被阻断，从而表达Tn抗原或涎酸化Tn抗原。癌细胞内核心1β3半乳糖转移酶的活性降低的机制较复杂，直到目前也没有完全弄清楚。但是，作为其机制之一，推测为如下机制：编码核心1β3半乳糖转移酶的活性表达所需的特定的伴侣蛋白(Cosmc)的基因发生了突变，结果，细胞内的核心1β3半乳糖转移酶活性大幅度降低(非专利文献6)。由于在多个癌症种类中共同地观察到Tn抗原的表达，因此认为细胞内的糖链生物合成途径和糖链代谢途径中的异常是使附加在该细胞内表达的大量不同糖蛋白质上的糖链结构产生共同变化的主要原因。 [0003] 已知糖链结构的变化与病情的发展密切相关的代表性的疾病为癌症。此外，除了癌症以外，作为已知糖链结构的变化与病情的发展密切相关的疾病，已知有IgA肾病。IgA肾病是以作为免疫球蛋白之一的免疫球蛋白A(IgA)颗粒状沉积在肾小球的系膜区的病理所见为特征的慢性肾小球肾炎，于1968年由Berger首次报道(非专利文献2)。该疾病是在日本国内的慢性肾小球肾炎患者中约占半数的代表性的肾炎。据称约四成被诊断为IgA肾病的患者在随后20年以内发展成晚期肾衰竭，因而不得不进行人工透析或肾移植。由此可见，虽然IgA肾病普遍被认为是预后不良的疾病，但在临床上尚未建立有效性得到证明的治疗方法。在IgA肾病的患者体内，已知两种IgA同种型(IgA1和IgA2)中主要是IgA1沉积于肾脏。此外，作为该沉积的原因之一，有如下报道：人IgA1分子中特异性存在的、附加于铰链区的O连接型糖链的结构从正常型变成Tn抗原或涎酸化Tn抗原(非专利文献3、非专利文献4)。已证明，当附加于IgA1铰链区的O连接型糖链缺失半乳糖而变成Tn抗原或涎酸化Tn抗原时，IgA1分子的自身凝集能力亢进，与特异性识别该糖链缺陷型IgA1的自身抗体结合而形成免疫复合物，并且，形成凝集体或免疫复合物后的IgA1分子避开通常的循环血液中的清除机制而沉积在肾系膜区(非专利文献5)。进而报道了：在从IgA肾病患者分离出的产生IgA的细胞中，因Cosmc的表达量降低而导致核心1β3半乳糖转移酶活性降低(非专利文献6)。即，在IgA肾病患者体内的产生IgA的细胞中，糖链生物合成途径在中途被阻断，结果，不能产生具有正常型糖链的IgA1，取而代之，产生糖链缺陷型IgA1。作为IgA肾病的发病机制之一，提出了如下机制：包含该糖链缺陷型IgA1的复合物沉积在肾小球上，结果引发肾组织的炎症。 [0004] 一般而言，IgA由血液中或组织内的B细胞或由B细胞分化成的浆细胞产生。已知浆细胞是B细胞分化的最终阶段，分布于次级淋巴组织、全身的粘膜组织、骨髓等中并产生大量的抗体，而产生IgA的浆细胞主要分布于粘膜组织。另一方面还已知，在次级淋巴组织的生发中心，由获得高亲和性IgA抗体产生能力的B细胞克隆分化出记忆B细胞或浆细胞，并分布于全身的靶器官而长期持续地产生抗体。但尚未明确产生与IgA肾病的发病相关的糖链缺陷型IgA的细胞在B细胞分化过程的哪个阶段中产生以及产生糖链缺陷IgA的B细胞或浆细胞分布于体内的何种组织。 [0005] 已知约半数的IgA肾病患者的血中IgA值升高(非专利文献7)。而且已知，作为在IgA肾病患者中共同观察到的现象，在末梢血或尿液等体液以及肾小球中检测到一般在健康人中观察不到的糖链缺陷型IgA1(非专利文献8)。如上所述，该糖链缺陷型IgA1即半乳糖缺失型IgA1是促进IgA肾病的病情发展的因素，但近年来查明，在除IgA肾病以外的几种人类疾病例如作为过敏性疾病的过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、作为自身免疫疾病的系统性红斑狼疮或作为癌症的IgA1型骨髓瘤的一部分疾病中，该糖链缺陷型IgA1的出现和在肾脏的蓄积也导致肾功能的降低(非专利文献8)。基于上述背景，糖链缺陷型IgA1作为以IgA肾病为代表的特定的人类疾病的生物标志物例如诊断生物标志物、预测生物标志物或药效动力学生物标志物正逐渐被人们所认识。 [0006] 人IgA1的铰链区很难以IgA1重链多肽的氨基酸序列号的形式来严格地定义。一般是指构成IgA1分子的重链多肽中位于CH1结构域与CH2结构域之间的区域。在构成普通的分泌型人IgA1分子的重链多肽(序列号2)中，多指从N末端起第223位的脯氨酸开始至第240位的丝氨酸或第241位的半胱氨酸为止的区域。该区域也称为IgA1铰链区核心肽。在迄今为止的研究中，已鉴定出该区域中附加有O连接型糖链的氨基酸残基，已知有第225位的苏氨酸、第228位的苏氨酸、第230位的丝氨酸、第232位的丝氨酸、第236位的苏氨酸共五处。另外，已知N连接型糖链不与铰链区结合，而与构成IgA1分子的重链多肽中第263位的天冬酰胺和第459位的天冬酰胺结合。 [0007] 作为现行的IgA肾病确诊法的肾活检(活组织检查)是给患者带来精神上的痛苦、肾周围出血的风险以及住院数天所产生的经济负担的方法。到目前为止，已研究了几种以直接检测糖链缺陷型IgA1并进行分析为目的的实验方法。使用识别并结合Tn型糖链或涎酸化Tn型糖链的凝集素例如长柔毛野豌豆(Vicia villosa)来源的凝集素、大果瓦泰豆(Vatairea macrocarpa)来源的凝集素、大豆来源的凝集素、散大蜗牛(Helix aspersa)来源的凝集素或树锦鸡儿(Caragana arborescens)来源的凝集素等的ELISA法或蛋白免疫印迹法等免疫学方法是简易的方法之一(非专利文献9)，但由于这些凝集素具有仅识别糖链结构并与其并结合的性质，因此，存在与人来源试样等样品中含有的、IgA1以外的具有O连接型糖链的糖蛋白(粘蛋白类、补体C1抑制物等)也非选择性地进行结合的问题。另外，使用抗Tn单克隆抗体例如MLS128、22-1-1、HBTn1或Bric111等的ELISA或免疫蛋白印迹等免疫学方法也是简易的方法之一，但与上述凝集素法同样地存在特异性低的问题(非专利文献10)。另一方面，将利用聚糖酶或肽酶等各种酶对从人来源试样等样品中纯化提取出的IgA1进行处理而得到的糖链和糖肽的混合物通过基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)等进行分析的方法具有特异性和检测灵敏度较高的优点(非专利文献11)。但是，该方法需要蛋白质的纯化、酶处理、装置分析的工序，因而难以称其为简易，而且存在定量性差的问题。由此可见，尚未获知能够特异性地、简易且定量性地检测或测定人来源试样等样品中含有的糖链缺陷IgA1的方法。另外，虽然认为上述产生糖链缺陷型IgA1的细胞在其细胞内或细胞表面表达或蓄积糖链缺陷型IgA1，但尚未获知能够特异性地且简易地检测这种细胞的方法。 [0008] 比企等人的方法(专利文献1)中，首先，在固定有识别作为正常型O连接型糖链的TF抗原(汤姆森-弗里登雷克(Thomsen-Friedenreich)抗原、CD176抗原)的植物凝集素木菠萝凝集素的ELISA板上捕获正常型IgA1，制作ELISA板。接着，从患者来源的试样中纯化出IgA1，将其用生物素等标记后添加到该ELISA板上，利用与预先捕获在板上的正常型IgA1的自身凝集反应而使糖链缺陷型IgA1结合到板上。该方法的问题在于定量性差。这是因为，尚未明确IgA1铰链区的糖链缺陷的程度与自身凝集性的强度之间的相关性，而且不能排除由标记引起的患者来源的IgA1的变性给凝集性带来的影响。另外，由于需要从试样中纯化出IgA1，因此，不得不说是在简易性方面也存在问题的方法。 [0009] 成田等人的方法(专利文献2)无需对患者来源的IgA1进行纯化分离，因此是比上述方法更简易的方法。该方法为如下方法：制作固定有链球菌来源的IgA结合肽SAP的ELISA板，向该板上添加患者来源的试样，从而将IgA捕获到板上；然后，添加识别N-乙酰半乳糖胺的植物凝集素(长柔毛野豌豆B4凝集素；VVL)的标记物，由此检测糖链缺陷型IgA1。但是，VVL除了与丝氨酸/苏氨酸上α连接的N-乙酰半乳糖胺结合以外，还与N连接型糖链中含有的半乳糖的非还原末端上β连接的N-乙酰半乳糖胺结合，因此，该成田等人的方法不是特异性检测IgA1铰链区的O连接型糖链的结构变化的方法。比企等人的另一方法(专利文献3)为如下方法：使患者来源的血清在填充有木菠萝凝集素琼脂糖的层析柱上通过而分离出IgA1，然后将该IgA1固定在ELISA板上，接着，向该ELISA板上添加针对具有IgA1铰链区的氨基酸序列的合成肽(PVPSTPPTPSPSTPPTPSPS)的兔来源多克隆抗体，最后，使用标记的抗兔IgG抗体进行检测。该方法是对患者来源的血清中含有的、完全缺失铰链区的O型糖链的IgA1进行检测的方法，而不是对铰链区具有Tn型糖链的糖链缺陷型IgA1进行特异性检测的方法。另外，由于IgA1的纯化中使用作为TF抗原特异性凝集素的木菠萝凝集素，因此，使患者血清中含有的糖链缺陷型IgA1的回收不完全。 [0010] 虽然不是直接检测糖链缺陷型IgA1的方法，但也进行了尝试利用ELISA法分析患者来源的试样来诊断IgA肾病的研究。日本专利第4197393号中记载的方法为如下方法：制作固定有将具有IgA1铰链区的氨基酸序列的合成肽(PVPSTPPTPSPSTPPTPSPSC)与牛血清白蛋白连接而制成的蛋白质的ELISA板，并向该ELISA板上添加患者来源的试样。该方法中，通过将与IgA1铰链区特异性结合的自身抗体(IgG型)捕获到板上并最后添加抗人IgG抗体的标记物，能够检测该自身抗体。但是，该方法中，仅能检测不与铰链区具有Tn型糖链的IgA1结合而与完全缺失铰链区的O型糖链的IgA1结合的IgG型自身抗体。 [0011] 作为特异性识别IgA1的单克隆抗体，报道了：通过对小鼠进行人IgA1重链蛋白质免疫而得到的B3506B4抗体或者通过对小鼠进行人母乳来源的IgA1免疫而得到的3C10抗体等(非专利文献12)。 [0012] B3506B4抗体或3C10抗体对正常糖链型IgA1也具有亲和性。到目前为止，尚未获知特异性识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的IgA1分子的抗体。 [0013] 普遍已知在对人施用非人抗体例如小鼠抗体等时，其作为异物而被识别，由此在人体内诱导出抗小鼠抗体的人抗体(人抗小鼠抗体，Human Anti Mouse Antibody；HAMA)。已知HAMA与所施用的小鼠抗体反应而引起副作用(非专利文献13~16)，或者，加快小鼠抗体在体内的消失(非专利文献17~19)，降低小鼠抗体的治疗效果(非专利文献20、21)。 [0014] 为了解决上述问题，正在尝试利用基因重组技术由非人抗体制作人嵌合抗体和人源化抗体。 [0015] 人源化抗体与小鼠抗体等非人抗体相比，在对人进行施用的方面具有多个优点。例如，据报道，在使用猴进行的实验中，与小鼠抗体相比，其免疫原性降低，血中半衰期延长(非专利文献22、非专利文献23)。即，人源化抗体与非人抗体相比，对人产生的副作用少，并可以期待其治疗效果长期持续。 [0016] 另外，由于人源化抗体利用基因重组技术来制作，因此，能够制作成多种形式的分子。例如，使用γ1亚类作为人抗体的重链(以下记为H链)恒定区(以下记为C区)(将H链C区记为CH)时，能够制作抗体依赖性细胞毒活性(以下记为ADCC活性)等效应功能高的人源化抗体(非专利文献24)，并且，可以期待其血中半衰期比小鼠抗体延长(非专利文献25)。特别是在将细胞表面上表达Tn抗原型IgA1的产生Tn抗原型IgA1的细胞从人体内除去的治疗中，为了通过抗体使效应细胞蓄积在靶细胞的附近而对靶细胞进行特异性杀伤，抗体的Fc段(抗体重链的铰链区以后的区域)介导的补体依赖性细胞毒活性(以下记为CDC活性)或ADCC活性等细胞毒活性是很重要的。在人的治疗中，为了发挥细胞毒活性，优选使用人嵌合抗体、人源化抗体或人源化抗体(非专利文献26、27)。 [0017] 而且，随着近来蛋白质工程、基因工程的进步，人源化抗体也可以制作成Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(以下记为scFv)(非专利文献28)、二聚体化V区片段(以下记为双价抗体(Diabody))(非专利文献29)、二硫键稳定的V区片段(以下记为dsFv)(非专利文献30)、包含CDR的肽(非专利文献31)等小分子量的抗体片段，这些抗体片段与完整的抗体分子相比，向靶组织的移行性更优良(非专利文献32)。 [0018] 现有技术文献 [0019] 专利文献 [0020] 专利文献1：日本特开平9-311132号公报 [0021] 专利文献2：日本特开2007-24661号公报 [0022] 专利文献3：日本特开平10-111290号公报 [0023] 非专利文献 [0024] 非专利文献1：Crit Rev Oncog.,6,57(1995) [0025] 非专利文献2：J Urol Nephrol.,74,694(1968) [0026] 非专利文献3：Clin Exp Immunol.,100,470(1995) [0027] 非专利文献4：J Am Soc Neph.,7,955(1996) [0028] 非专利文献5：Nephrol Dial Transplant.,17,50(2002) [0029] 非专利文献6：J Intern Med.,258,467(2005) [0030] 非专利文献7：日本腎臓学会誌,44(7),514-523(2002) [0031] 非专利文献8：Seminars in Nephrolog,28(1),78(2008) [0032] 非专利文献9：JBC 282,28256,2007;Kidney Int.,1997,52:509 [0033] 非专利文献10：Chem Bio Chem,6,22292005 [0034] 非专利文献11：Carbohydrate Research,339(13),2329-2355(2004) [0035] 非专利文献12：Clinical&Experimental Immunology,79(1),35-40(1990)[0036] 非专利文献13：Hum.Pathol.,38,564(2007) [0037] 非专利文献14：Hum.Pathol.,36,886(2005) [0038] 非专利文献15：FEBS Lett.,579,6179(2005) [0039] 非专利文献16：Cancer Res.,65,7378(2005) [0040] 非专利文献17：Hum.Pathol.,36,886(2005) [0041] 非专利文献18：Oncogene,13,2328(2006) [0042] 非专利文献19：Virchows Arch.,448,52(2006) [0043] 非专利文献20：J.Immunol.,135,1530(1985) [0044] 非专利文献21：Cancer Res.,46,6489(1986) [0045] 非专利文献22：Cancer Res.,56,1118(1996) [0046] 非专利文献23：Immunol.,85,668(1995) [0047] 非专利文献24：CancerRes.,56,1118(1996) [0048] 非专利文献25：Immunol.,85,668(1995) [0049] 非专利文献26：J.Immunol.,144,1382(1990) [0050] 非专利文献27：Nature,322,323(1988) [0051] 非专利文献28：Science,242,423(1988) [0052] 非专利文献29：Nature Biotechnol.,15,629(1997) [0053] 非专利文献30：Molecular Immunol.,32,249(1995) [0054] 非专利文献31：J.Biol.Chem.,271,2966(1996) [0055] 非专利文献32：Cancer Res.,52,3402(1992) 发明内容[0056] 发明所要解决的问题 [0057] 本发明的目的在于提供特异性识别并结合包含未结合半乳糖的O连接型糖链的IgA1的单克隆抗体或该单克隆抗体的使用方法。 [0058] 需要特异性识别并结合包含未结合半乳糖的O连接型糖链的IgA1的单克隆抗体或该单克隆抗体的使用方法。 [0059] 用于解决问题的手段 [0060] 本发明涉及下述(1)~(32)项。 [0061] (1)一种单克隆抗体或该抗体片段，其特异性识别并结合由免疫球蛋白A1的重链基因编码的多肽(以下称为IgA1重链)的铰链区，所述铰链区包含未结合半乳糖的丝氨酸/苏氨酸连接型糖链(以下称为O连接型糖链)。 [0062] (2)一种单克隆抗体或该抗体片段，其不识别结合有O连接型糖链的由IgA1重链基因编码的多肽的铰链区中包含结合有半乳糖的O连接型糖链的IgA1重链的铰链区，而识别并结合包含未结合半乳糖的O连接型糖链的IgA1重链的铰链区。 [0063] (3)如(1)或(2)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，未结合半乳糖的O连接型糖链为选自α-N-乙酰半乳糖胺-丝氨酸/苏氨酸(以下称为Tn抗原)或涎酸化Tn抗原中的至少一种O连接型糖链。 [0064] (4)如(3)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，未结合半乳糖的O连接型糖链为Tn抗原。 [0065] (5)如(1)~(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为特异性识别并结合包含序列号1表示的氨基酸序列的IgA1重链的铰链区的抗体。 [0066] (6)如(1)~(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为特异性识别并结合包含序列号1表示的氨基酸序列的IgA1重链的铰链区多肽的抗体，并且，所述铰链区多肽是在选自从该多肽的氨基末端起第3位的苏氨酸、第6位的苏氨酸、第8位的丝氨酸、第10位的丝氨酸、第14位的苏氨酸中的至少一个氨基酸残基上结合有不具有半乳糖的N-乙酰半乳糖胺的糖肽。 [0067] (7)如(1)~(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体是对包含未结合半乳糖的O连接型糖链的补体C1抑制物不显示交叉反应性的单克隆抗体。 [0068] (8)如(1)~(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体是在向包含未结合半乳糖的O连接型糖链的IgA1重链的铰链区上结合时与选自单克隆抗体KM4137、KM4140、KM4144中的至少一种单克隆抗体发生竞争反应的单克隆抗体。 [0069] (9)如(1)~(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体是与选自单克隆抗体中的至少一种单克隆抗体所结合的、存在于包含未结合半乳糖的O连接型糖链的IgA1重链的铰链区的表位进行结合的单克隆抗体。 [0070] (10)如(1)~(9)中任一项所述的单克隆抗体或抗体片段，其中，单克隆抗体是由选自杂交瘤KM4137(FERM BP-11214)、KM4140(FERM BP-11215)、KM4144(FERM BP-11216)中的至少一种杂交瘤生产的单克隆抗体。 [0071] (11)如(1)~(9)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为基因重组抗体。 [0072] (12)如(11)所述的基因重组抗体或该抗体片段，其中，基因重组抗体为选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中的抗体。 [0073] (13)如(1)~(12)中任一项所述的抗体片段，其中，抗体片段为选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(双价抗体)、二硫键稳定的V区(dsFv)和包含CDR的肽中的抗体片段。 [0074] (14)一种杂交瘤，其生产(1)~(9)中任一项所述的单克隆抗体。 [0075] (15)一种DNA，其编码(1)~(13)中任一项所述的抗体或该抗体片段。 [0076] (16)一种重组载体，其含有(15)所述的DNA。 [0077] (17)一种转化株，其通过将(16)所述的重组载体导入宿主细胞中而得到。 [0078] (18)一种抗体或该抗体片段的制造方法，用于制造(1)~(13)中任一项所述的抗体或该抗体片段，其特征在于，将(14)所述的杂交瘤或(17)所述的转化株在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积(1)~(13)中任一项所述的抗体或该抗体片段，并从该培养物中收集抗体或该抗体片段。 [0079] (19)一种IgA1的免疫学检测或测定方法，所述IgA1具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区，所述方法中，使用(1)~(13)中任一项所述的抗体或该抗体片段。 [0080] (20)一种IgA1的检测试剂，所述IgA1具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区，所述检测试剂中，使用(1)~(13)中任一项所述的抗体或该抗体片段。 [0081] (21)一种IgA1相关疾病的诊断剂，所述IgA1具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区，所述诊断剂中，使用(1)~(13)中任一项所述的抗体或该抗体片段。 [0082] (22)如(21)所述的诊断剂，其中，与具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区的IgA1相关的疾病为自身免疫疾病。 [0083] (23)如(21)所述的诊断剂，其中，与具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区的IgA1相关的疾病为IgA肾病。 [0084] (24)一种IgA1相关疾病的治疗剂，所述IgA1具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区，所述治疗剂中，含有(1)~(13)中任一项所述的抗体或抗体片段作为有效成分。 [0085] (25)如(24)所述的治疗剂，其中，与具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区的IgA1相关的疾病为自身免疫疾病。 [0086] (26)如(24)所述的治疗剂，其中，与具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区的IgA1相关的疾病为IgA肾病。 [0087] (27)一种IgA1相关疾病的诊断方法，所述IgA1具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区，所述诊断方法包括：使用(1)~(13)中任一项所述的抗体或该抗体片段，对具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区的IgA1进行检测或测定。 [0088] (28)如(27)所述的诊断方法，其中，与具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区的IgA1相关的疾病为自身免疫疾病。 [0089] (29)如(27)所述的诊断方法，其中，与具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区的IgA1相关的疾病为IgA肾病。 [0090] (30)(1)~(13)中任一项所述的抗体或该抗体片段在制造IgA1相关疾病的治疗剂中的应用，所述IgA1具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区。 [0091] (31)如(30)所述的抗体或该抗体片段的应用，其中，与具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区的IgA1相关的疾病为自身免疫疾病。 [0092] (32)如(30)所述的抗体或该抗体片段的应用，其中，与具有包含未结合半乳糖的O连接型糖链的铰链区的IgA1相关的疾病为IgA肾病。 [0093] 发明效果 [0094] 根据本发明，能够提供一种单克隆抗体，其特异性识别并结合由免疫球蛋白A1的重链基因编码的多肽的铰链区，所述铰链区包含未结合半乳糖的O连接型糖链。另外，根据本发明，能够提供与包含未结合半乳糖的O连接型糖链的、由免疫球蛋白A1的重链基因编码的多肽的铰链区相关的各种疾病的治疗剂或诊断剂。附图说明 [0095] 图1是表示质粒pCR2B8PVH的构建流程的图。 [0096] 图2是表示质粒pCRIgA的构建流程的图。 [0097] 图3是表示质粒pCRmIgA的构建流程的图。 [0098] 图4是表示质粒pCR2B8PmIgA的构建流程的图。 [0099] 图5是表示质粒pKAN932B8PVHmIgA的构建流程的图。 [0100] 图6是表示mIgA1-Fc的SDS聚丙烯酰胺电泳的图。 [0101] 图7是通过ELISA法对mIgA1-Fc的O连接型糖链结构进行分析而得到的图。纵轴表示样品波长415nm、参比波长490nm下的平均荧光强度(OD415-OD490)，凡例中的值表示竞争物质浓度(μg/ml)。 [0102] 图8是通过ELISA法对建立的单克隆抗体的结合特异性进行分析而得到的图。纵轴为ELISA的吸光度，表示对栏外示出的各固定化抗原的结合性。 [0103] 图9是通过竞争ELISA法对建立的单克隆抗体的结合特异性进行分析而得到的图。上段中，Tn抗原型人IgA1为竞争物质，下段中，人血浆来源的IgA1为竞争物质。纵轴表示吸光度，横轴表示竞争物质的浓度(μg/ml)。 [0104] 图10是通过流式细胞术对建立的单克隆抗体的结合特异性进行分析而得到的图，上段为确认与表达mIgA1的DG44细胞株结合的图，下段为确认与表达mIgA1的Lec8细胞株结合的图。纵轴表示细胞数，横轴表示荧光强度。 [0105] 图11表示通过使用建立的单克隆抗体而构建的夹心ELISA法对糖链缺陷型IgA1进行定量而得到的结果。纵轴表示吸光度，横轴表示抗原的浓度(μg/ml)。 [0106] 图12表示通过流式细胞术(FCM)测定KM4137(▲)、KM4140(◆)和KM4144(●)对生物素标记的抗附加有Tn抗原的mIgA铰链肽单克隆抗体KM4137(a)、KM4140(b)或KM4144(c)与Tn抗原型人IgA1的结合的竞争抑制活性而得到的结果。纵轴表示样品波长415nm、参比波长490nm下的平均荧光强度(OD415-OD490)，横轴表示竞争物质浓度(μg/ml)。 具体实施方式[0107] 本发明涉及一种单克隆抗体，其特异性识别并结合由免疫球蛋白A1的重链基因编码的多肽的铰链区，所述铰链区包含未结合半乳糖的O连接型糖链。作为免疫球蛋白A1的重链基因，只要是编码免疫球蛋白A1的重链的基因则均可，作为一例，可以列举包含编码分泌型免疫球蛋白A1重链恒定区的氨基酸序列(序列号2)的碱基序列(序列号3)的基因。另外，在严格条件下与包含序列号3表示的碱基序列的DNA杂交并且编码具有IgA1重链功能的多肽的基因等也包括在本发明的IgA1重链基因中。 [0108] 在严格条件下杂交的DNA是指以具有序列号3表示的碱基序列的DNA为探针，通过集落杂交法、噬菌斑杂交法、DNA印迹杂交法、DNA微阵列法等而得到的能够杂交的DNA，具体而言，可以列举通过如下方法进行鉴定的DNA：使用固定有来源于杂交的集落或噬菌斑的DNA、或者具有该序列的PCR产物或寡聚DNA的过滤器或载玻片，在0.7~1.0摩尔/升的氯化钠存在下在65℃下进行杂交，然后，使用0.1~2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成包括150毫摩尔/升的氯化钠、15毫摩尔/升的柠檬酸钠)，在65℃的条件下清洗过滤器或载玻片，由此进行鉴定。杂交可以依据[Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第二版(冷泉港实验室出版社，1989)、Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法)(约翰威立父子出版公司，1987-1997)、DNA Cloning 1:CoreTechniques,A Practical Approach(DNA克隆1：核心技术与实用方法)，第二版(牛津大学，1995)]等中记载的方法来进行。作为能够杂交的DNA，可以列举与序列号3表示的碱基序列具有至少60%以上的同源性的DNA，优选与序列号3表示的碱基序列具有80%以上的同源性的DNA，更优选与序列号3表示的碱基序列具有95%以上的同源性的DNA。 [0109] 编码真核生物的蛋白质的基因的碱基序列常常可以观察到基因的多态性。本发明中使用的IgA1重链基因也包括碱基序列因基因的多态性而稍有突变的基因。 [0110] 作为IgA1重链，可以列举：具有序列号2表示的氨基酸序列的多肽；包含在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列且具有IgA1重链的功能的多肽；以及包含与序列号2表示的氨基酸序列具有60%以上、优选80%以上、更优选90%以上、最优选95%以上的同源性的氨基酸序列且具有IgA1重链的功能的多肽等。 [0111] 具有在序列号2表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽可以通过如下方法得到：使用[Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第二版(冷泉港实验室出版社，1989)、Current Protocols in Molecular Biology(约翰威立父子出版公司，1987-1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等中记载的定点诱变法，在例如编码具有序列号2表示的氨基酸序列的多肽的DNA中导入定点突变。缺失、取代或添加的氨基酸数没有特别限定，优选为一个至数十个、例如1~20个的氨基酸，更优选为一个至数个、例如1~5个的氨基酸。 [0112] 在没有特别说明的情况下，本发明中记载的同源性的数值可以是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序而计算出的数值，对于碱基序列而言，可以列举：使用BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中默认的参数而计算出的数值等，对于氨基酸序列而言，可以列举：使用BLAST2[Nucleic AcidsRes.,25,3389(1997);Genome Res.,7,649(1997);http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/ information3.html]中默认的参数而计算出的数值等。 [0113] 作为默认的参数，G(起始空位罚分，Cost to open gap)在碱基序列的情况下为5，在氨基酸序列的情况下为11；-E(空位延伸罚分，Cost to extend gap)在碱基序列的情况下为2，在氨基酸序列的情况下为1；-q(核苷酸错配罚分，Penalty for nucleotide mismatch)为-3；-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)为1；-e(期望值，expect value)为10；-W(字长大小，word size)在碱基序列的情况下为11个残基，在氨基酸序列的情况下为3个残基；-y(非空位延伸下降的阈值，Dropoff(X)for blast extensions in bits)在blastn中为20，在blastn以外的程序中为7；-X(空位比对的下降阈值，X dropoff value for gapped alignment in bits)为15；-Z(最终空位比对的下降值，final X dropoff value for gapped alignment in bits)在blastn中为50，在blastn以外的程序中为25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。 [0114] 包含序列号2表示的氨基酸序列的部分序列的多肽可以通过本领域技术人员公知的方法来制作，例如，可以通过使编码序列号2表示的氨基酸序列的DNA的一部分缺失并对导入有包含上述DNA的表达载体的转化体进行培养来制作。另外，基于这样制作的多肽或DNA，通过与上述同样的方法，可以得到具有在序列号2表示的氨基酸序列的部分序列中缺失、取代或添加一个以上的氨基酸而成的氨基酸序列的多肽。 [0115] 本发明中，包含未结合半乳糖的O连接型糖链的、由IgA1重链基因编码的多肽，只要是包含未结合半乳糖的O连接型糖链的IgA1重链则均可，具体而言，可以列举：包含未结合半乳糖的O连接型糖链的、由序列号3表示的碱基序列编码的IgA1重链多肽。 [0116] 作为IgA1的铰链区，具体而言，可以列举：与文献[Biochemical and Biophysical Research Communication]中公开的IgA1重链多肽的第223~240位相当的区域等。本发明中，包含未结合半乳糖的O连接型糖链的、由IgA1重链基因编码的多肽的铰链区，只要是包含未结合半乳糖的O连接型糖链的IgA1重链多肽的铰链区则均可，具体而言，可以列举：在包含未结合半乳糖的O连接型糖链的由序列号3表示的碱基序列编码的IgA1重链多肽中共同含有的、由序列号1表示的氨基酸序列。 [0117] O连接型糖链是指在蛋白质的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的氨基酸残基中借助各氨基酸侧链所含的-OH基而结合有糖链的结构。在O连接型糖链中，将多肽上的Ser或Thr氨基酸侧链的-OH基上结合有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的O连接型糖链称为粘蛋白型糖链。作为O连接型糖链的具体例，可以列举：T抗原(TF抗原)、涎酸化T抗原、Tn抗原或涎酸化Tn抗原等(表1)。 [0118] [表1] [0119]糖链抗原名称 糖链结构 Tn抗原 GalNAc1α→Ser/Thr 涎酸化Tn抗原 NeuNAcα2→6GalNAc1α→Ser/Thr T抗原 Galβ1→3GalNAc1α→Ser/Thr 涎酸化T抗原 NeuNAcα2→3Galβ1→3GalNAc1α→Ser/Thr [0120] (NeuNAc：N-乙酰神经氨酸) [0121] 本发明中，未结合半乳糖的O连接型糖链是指在借助蛋白质的Ser或Thr的氨基酸残基的-OH基结合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上未结合半乳糖(Gal)的O连接型糖链，具体而言，可以列举上述的Tn抗原和涎酸化Tn抗原。未结合半乳糖的O连接型糖链是正常O连接型糖链的合成途径中的中间体，通常在正常细胞的糖蛋白质中几乎不存在，而在癌症和肾病等某些特定的疾病中观察到表达。 [0122] 以下，本发明中，有时将未结合半乳糖的O连接型糖链记为异常糖链，将结合有异常糖链的蛋白质记为糖链缺陷型蛋白质，将结合有异常糖链的IgA1记为糖链缺陷型IgA1。 [0123] 作为O连接型糖链所结合的多肽中的氨基酸残基，可以列举：IgA1重链多肽的铰链区的氨基酸序列中的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的氨基酸残基。 [0124] 另外，对于O连接型糖链所结合的多肽中的氨基酸残基，可以通过使用NetOGlyc3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)等序列检索软件来确认结合O连接型糖链的共有序列。或者，可以通过对具有O连接型糖链的糖蛋白进行质谱(MS)分析来确定具体的糖链结合位点。 [0125] 本发明中，作为IgA1重链多肽上的O连接型糖链所结合的铰链区多肽中的氨基酸残基，在IgA1重链多肽的铰链区氨基酸序列中任意一个Ser或Thr残基上均可以结合O连接型糖链，优选列举包含选自人IgA1重链多肽的氨基酸序列中第225位的苏氨酸、第228位的苏氨酸、第230位的丝氨酸、第232位的丝氨酸、第236位的苏氨酸中的至少一个氨基酸残基的糖链结合位点。 [0126] 作为每一分子IgA1重链多肽的重链铰链区上结合的O连接型糖链数，只要在至少一个Ser残基或Thr残基上结合有O连接型糖链即可，O连接型糖链数没有限定。 [0127] 作为获取表达本发明的包含未结合半乳糖的O连接型糖链的IgA1(以下记为糖链缺陷型IgA1)的细胞的方法，可以通过如下方法制作表达糖链缺陷型IgA1的细胞：在O连接型糖链合成过程中，向在多肽上的Ser/Thr上结合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与尿苷5’-二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的细胞株中导入编码IgA1重链的DNA和编码IgA1轻链的DNA，由此制作表达糖链缺陷型IgA1的细胞。另外，也可以通过使涎酶和半乳糖苷酶等糖链切割酶对表达包含正常O型糖链的IgA1的细胞起作用来制作表达具有未结合半乳糖的O连接型糖链的IgA1的细胞。 [0128] 作为向多肽上的Ser或Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶的具体例，可以列举β1,3-半乳糖基转移酶[The Journal of Biological Chemistry,277,178-186(2002)]等。另外，作为与向多肽上的Ser或Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶的活性相关的蛋白质，可以列举与该酶的蛋白质折叠相关的伴侣Cosmc[Procedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,99,16613-16618(2002)]等。 [0129] IgA肾病患者来源的IgA1表达细胞，由于编码向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质等的DNA上发生了添加、缺失或取代等而使酶的活性降低或缺失，因此，可以作为表达糖链缺陷型IgA1的细胞来利用。 [0130] 作为与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质，可以列举UDP-半乳糖转运蛋白等。作为UDP-半乳糖转运蛋白的活性降低或缺失的细胞系，可以列举Lec8细胞 [Glycobiology.,1,307-14(1991)]等。 [0131] 本发明中，作为表达糖链缺陷型IgA1的细胞，可以列举：在人体中内源性存在的细胞、由人体中内源性存在的细胞建立的细胞系或通过基因重组技术得到的细胞等。优选列举：使在如上所述的O连接型糖链合成过程中向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的细胞系、具有相同的性质并且在人体中内源性存在的细胞等。 [0132] 作为在人体中内源性存在的细胞，优选在O连接型糖链合成过程中向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的细胞系，具体而言，可以列举在IgA肾病患者体内或癌症患者体内表达IgA1重链多肽的细胞，例如，可以列举通过活组织检查等得到的免疫相关细胞或肿瘤细胞中表达IgA1重链多肽的细胞。 [0133] 作为通过基因重组技术得到的细胞，可以列举如下细胞：制作使O连接型糖链合成过程中向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的宿主细胞，将包含编码目标多肽的cDNA的表达载体导入宿主细胞中，由此表达糖链缺陷型IgA1。 [0134] 作为宿主细胞，具体而言，可以列举：UDP-半乳糖转运蛋白的活性降低的Lec8细胞，或者，因β1,3-半乳糖基转移酶或与该酶活性相关的Comsc伴侣蛋白的异常而使酶的活性降低或缺失的IgA肾病患者来源的IgA1表达细胞等。 [0135] 此外，作为制作糖链缺陷型IgA1蛋白的方法，可以列举：使用上述的IgA1表达细胞来表达糖链缺陷型IgA1蛋白并进行纯化的方法等。 [0136] 作为获取糖链缺陷型IgA1蛋白的方法，可以通过以IgA1蛋白与其他物质的融合蛋白的形式进行表达和纯化来获取。作为与IgA1蛋白融合的物质，可以列举：抗体恒定区、抗体Fc段、GST标签、组氨酸标签(也称为His标签)或Myc标签等多肽等。该融合蛋白可以通过使用蛋白A、镍柱、特异性抗体柱等亲和层析柱来分离纯化。 [0137] 本发明的单克隆抗体或该抗体片段对如上得到的糖链缺陷型IgA1细胞或糖链缺陷型IgA1具有结合活性。 [0138] 本发明的抗体或该抗体片段与糖链缺陷型IgA1蛋白的结合例如可以通过以下方法确认：使用公知的免疫学检测方法、优选荧光细胞染色法等来确认表达特定抗原的细胞与抗特定抗原的抗体的结合性的方法。另外，也可以将公知的免疫学检测方法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice(单克隆抗体的原则与实践)，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual(抗体实验指南)，冷泉港实验室(1988)；単クロ-ン抗体実験マニユアル(单克隆抗体实验指南)、講談社サイエンテイフイツク(1987)]等组合来进行确认。 [0139] 作为本发明的单克隆抗体，可以列举：由杂交瘤生产的抗体、以及由利用包含抗体基因的表达载体进行转化而得到的转化体生产的基因重组抗体。 [0140] 杂交瘤例如可以通过如下方法制备：制备表达上述糖链缺陷型IgA1的细胞等作为抗原，利用经该抗原免疫后的动物诱导出具有抗原特异性的抗体生产细胞，进而，使该抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合。通过对该杂交瘤进行培养或者对动物施用该杂交瘤细胞而使该动物产生癌性腹水并对该培养液或腹水进行分离、纯化，可以获得抗糖链缺陷型IgA1抗体。 [0141] 作为进行抗原免疫的动物，只要能够制作杂交瘤则均可以使用，优选使用小鼠、大鼠、仓鼠、兔等。另外，由如下制作的杂交瘤生产的抗体等也包括在本发明的抗体中：从上述动物中获取具有抗体产生能力的细胞，在体外对该细胞实施免疫，然后与骨髓瘤细胞融合而制作杂交瘤。 [0142] 单克隆抗体是指单一克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体，该抗体仅识别一个表位(也称为抗原决定簇)，并且构成单克隆抗体的氨基酸序列(一级结构)一致。 [0143] 表位可以列举：单克隆抗体所识别并结合的单一氨基酸序列、由氨基酸序列构成的立体结构、结合有糖链的氨基酸序列以及由结合有糖链的氨基酸序列构成的立体结构等。作为本发明的单克隆抗体的表位，可以列举糖链缺陷型IgA1蛋白的立体结构。 [0144] 作为本发明的单克隆抗体，只要是识别并结合糖链缺陷型IgA1的重链铰链区的单克隆抗体，则可以是任意一种抗体，具体而言，可以列举：单克隆抗体KM4137、KM4138、KM4139、KM4140和KM4144等。 [0145] 更具体而言，可以列举：由杂交瘤KM4137生产的单克隆抗体KM4137、与单克隆抗体KM4137竞争地与糖链缺陷型IgA1的重链铰链区结合的单克隆抗体以及与单克隆抗体KM4137所结合的存在于糖链缺陷型IgA1重链铰链区的表位进行结合的单克隆抗体。 [0146] 作为本发明的单克隆抗体，还可以列举：由杂交瘤KM4138生产的单克隆抗体KM4138、与单克隆抗体KM4138竞争地与糖链缺陷型IgA1的重链铰链区结合的单克隆抗体以及与单克隆抗体KM4138所结合的存在于糖链缺陷型IgA1重链铰链区的表位进行结合的单克隆抗体。 [0147] 作为本发明的单克隆抗体，还可以列举：由杂交瘤KM4139生产的单克隆抗体KM4139、与单克隆抗体KM4139竞争地与糖链缺陷型IgA1的重链铰链区结合的单克隆抗体以及与单克隆抗体KM4139所结合的存在于糖链缺陷型IgA1重链铰链区的表位进行结合的单克隆抗体。 [0148] 另外，作为本发明的单克隆抗体，还可以列举：由杂交瘤KM4140生产的单克隆抗体KM4140、与单克隆抗体KM4140竞争地与糖链缺陷型IgA1的重链铰链区结合的单克隆抗体以及与单克隆抗体KM4140所结合的存在于糖链缺陷型IgA1重链铰链区的表位进行结合的单克隆抗体。 [0149] 此外，作为本发明的单克隆抗体，还可以列举：由杂交瘤KM4144生产的单克隆抗体KM4144、与单克隆抗体KM4144竞争地与糖链缺陷型IgA1的重链铰链区结合的单克隆抗体以及与单克隆抗体KM4144所结合的存在于糖链缺陷型IgA1重链铰链区的表位进行结合的单克隆抗体等。 [0150] 作为与本发明的单克隆抗体发生竞争反应的单克隆抗体，具体而言，可以列举：如上所述对各种单克隆抗体和存在于糖链缺陷型IgA1的重链铰链区的表位具有竞争反应的单克隆抗体。 [0151] 与单克隆抗体发生竞争反应是指，以与本发明的单克隆抗体相同或部分相同的表位作为抗原并与该表位结合的抗体。 [0152] 另外，作为与本发明的单克隆抗体所结合的表位进行结合的单克隆抗体，具体可以列举：如上所述与各种单克隆抗体所识别的存在于糖链缺陷型IgA1重链铰链区的表位结合的单克隆抗体。 [0153] 杂交瘤KM4137、KM4140、KM4144于2009年12月18日依照布达佩斯条约保藏于日本独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(305-856，日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏编号分别为FERM BP-11214、FERM BP-11215、FERM BP-11216。 [0154] 作为基因重组抗体，包括人嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或该抗体片段等通过基因重组技术制造的抗体。基因重组抗体中，具有抗原结合活性、抗原性低且血中半衰期延长的基因重组抗体优选作为治疗剂。 [0155] 人嵌合抗体是指包含非人抗体的重链可变区(以下记为VH)和轻链可变区(以下记为VL)与人抗体的重链恒定区(以下记为CH)和轻链恒定区(以下记为CL)的抗体。 [0156] 本发明的人嵌合抗体可以如下进行制造。即，由本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1并与该重链铰链区结合的单克隆抗体或者产生特异性识别糖链缺陷型IgA1并与该重链铰链区结合的单克隆抗体的杂交瘤获取编码VH和VL的cDNA，将它们插入到具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人嵌合抗体表达载体，将其导入动物细胞中而对抗体进行表达，从而制作人嵌合抗体。 [0157] 作为人嵌合抗体的CH，只要属于人免疫球蛋白(以下记为hIg)则均可以使用，优选hIgG类的CH，而且可以使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4等亚类中的任意一种。另外，作为人嵌合抗体的CL，可以是属于hIg的任意一种CL，可以使用κ类或λ类的CL。 [0158] 人源化抗体是指将非人抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到人抗体的VH和VL的适当位置而得到的抗体，也称为人CDR移植抗体、重构抗体(reshaped antibody)。 [0159] 本发明的人源化抗体可以如下制造：构建编码抗体可变区的cDNA，所述抗体可变区是将由产生本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1蛋白并与该重链铰链区结合的单克隆抗体的杂交瘤产生的非人抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植到任意的人抗体的VH和VL的框架(以下记为FR)中而形成的抗体可变区(以下记为V区)，将上述cDNA插入到具有编码人抗体的CH和CL的基因的动物细胞用表达载体中，构建人源化抗体表达载体，并将其导入动物细胞中，由此进行表达，从而制造人源化抗体。 [0160] 人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列只要是人抗体来源的VH和VL的FR的氨基酸序列，则均可以使用。可以使用例如：蛋白数据库(Protein Data Bank)等数据库中登记的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列或者Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)等中记载的人抗体的VH和VL的FR的各亚类的共有氨基酸序列等。 [0161] 作为人源化抗体的CH，只要属于hIg则均可以使用，优选hIgG类的CH，而且可以使用属于hIgG类的hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4等亚类中的任意一种。另外，作为人源化抗体的CL，只要属于hIg则可以为任意一种，可以使用κ类或λ类的CL。 [0162] 人抗体原本是指人体中内源性存在的抗体，也包括从利用最近的基因工程、细胞工程、发育工程的技术进步制作的人抗体噬菌体文库和产生人抗体的转基因动物而得到的抗体等。 [0163] 人体中内源性存在的抗体例如可以如下获得：分离出人末梢血淋巴细胞，使其感染EB病毒等而永生化，并进行克隆，由此可以培养产生该抗体的淋巴细胞，并可以从培养上清中纯化出该抗体。 [0164] 人抗体噬菌体文库是通过将由人B细胞制备的抗体基因插入到噬菌体基因中而使Fab、scFv等抗体片段在噬菌体表面进行表达而得到的文库。可以以抗体片段对固定有抗原的底物的结合活性为指标，从该文库中回收在表面表达具有期望的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体。该抗体片段还可以进一步通过基因工程方法转化为包含两条完整的H链和L链的人抗体分子。 [0165] 产生人抗体的转基因动物是指细胞内重组有人抗体基因的动物。具体而言，例如，向小鼠ES细胞中导入人抗体基因，将该ES细胞移植入小鼠的早期胚胎中，然后使其发育，由此可以制作产生人抗体的转基因小鼠。由产生人抗体的转基因动物制作人抗体的方法中，通过通常的在人以外的动物中实施的杂交瘤制作方法获取产生人抗体的杂交瘤，并进行培养，由此，可以在培养上清中产生并蓄积人抗体。 [0166] 在构成上述抗体或抗体片段的氨基酸序列中缺失、添加、取代或插入一个以上的氨基酸并且具有与上述抗体或其抗体片段相同的活性的抗体或其抗体片段也包括在本发明的抗体或其抗体片段中。 [0167] 缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸数为一个以上，其数量没有特别限定，可以是利用分子克隆第二版、最新分子生物学实验方法、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)、 Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci USA,82,488(1985)等中记载的定点诱变法等公知的技术能够缺失、取代或添加的程度的数量。例如为一个至数十个，优选为1~20个，更优选为1~10个，进一步优选为1~5个。 [0168] 在上述抗体的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加一个以上的氨基酸残基表示如下含义。即，意味着在同一序列中的任意且一个或多个氨基酸序列中，存在一个或多个氨基酸残基的缺失、取代、插入和/或添加。另外，既存在同时发生缺失、取代、插入和/或添加的情况，也存在被取代、插入或添加的氨基酸残基为天然型和非天然型中的任意一种的情况。作为天然型氨基酸残基，可以列举：L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和L-半胱氨酸等。 [0169] 以下示出可相互取代的氨基酸残基的优选例。同一组中所含的氨基酸残基可以相互取代。 [0170] A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸 [0171] B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸[0172] C组：天冬酰胺、谷氨酰胺 [0173] D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸 [0174] E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸 [0175] F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸 [0176] G组：苯丙氨酸、酪氨酸 [0177] 作为本抗体的效应活性，可以列举：ADCC活性、CDC活性、抗体依赖性吞噬活性(antibody dependent cellular phagocytosis，ADCP)、调理作用等，可以通过各种方法进行调控。 [0178] 作为调控效应活性的方法，可以列举：对结合于抗体的Fc段的糖链进行调控的方法、对抗体的Fc段的氨基酸残基进行氨基酸改变的方法等。 [0179] 作为对结合于抗体的Fc段的糖链进行调控的方法，可以列举：通过将IgG抗体的第297位的 糖链除去而降低ADCC、CDC活性 的方法[Molecular Immunology,32,1311,(1995)，WO2008/030564]；使半乳糖与抗体的Fc段的结合减少而降低CDC活性的方法等。 [0180] 另外，作为对结合于抗体的Fc段的糖链进行调控的方法，可以列举如下方法：生产在IgG抗体的Fc段的第297位的天冬酰胺上结合的N连接型糖链中包含在糖链所结合的基部的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)上未结合岩藻糖的糖链的抗体的方法(US7,214,775、US6,946,292)；生产包含结合有平分型(bisecting)GlcNAc的糖链的抗体的方法[Nature Biotechnology,17,176,(1999)]；生产具有结合有与非还原末端结合的半乳糖(Gal)的糖链的抗体的方法[Hum.Antibod.Hybridomas,5,143-151,(1994)]；等。 [0181] 作为对抗体的Fc段的氨基酸残基进行氨基酸改变的方法，可以列举如下方法：通过进行抗体的Fc段的氨基酸改变来调控效应活性的方法 (J.B.C.,277,26733-26740,2002、US6,737,056、US7,297,775、US2007/0020260、WO2005/070963)；以及通过进行抗体的Fc段的各亚类之间的结构域交换来调控效应活性的方法(WO2007/011041)等。 [0182] 作为本发明的抗体片段，可以列举：Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、双价抗体、dsFv等。 [0183] 作为本发明的抗体片段，可以列举：Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、双价抗体、dsFv和包含CDR的肽等。 [0184] Fab是将IgG用蛋白分解酶木瓜蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第224位的氨基酸残基处切断)、N末端侧约一半的H链与整个L链通过二硫键结合而成的分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。 [0185] 本发明的Fab可以通过将本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1蛋白且与该重链铰链区结合的单克隆抗体用蛋白分解酶木瓜蛋白酶进行处理而得到。或者，可以通过将编码该抗体的Fab的DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中并将该载体导入原核生物或真核生物中使其进行表达来制造。 [0186] F(ab’)2是将IgG的铰链区的两个二硫键的下部用胃蛋白酶分解而得到的、两个Fab区在铰链部分结合而构成的、分子量约为10万的具有抗原结合活性的片段。 [0187] 本发明的F(ab’)2可以通过将本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1蛋白且与该重链铰链区结合的单克隆抗体用蛋白分解酶胃蛋白酶进行处理而得到。或者，可以通过使下述Fab’以硫醚键结合或以二硫键结合来制作。 [0188] Fab’是将上述F(ab’)2的铰链区的二硫键切断而得到的分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。 [0189] 本发明的Fab’可以通过将本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1蛋白且与该重链铰链区结合的F(ab’)2用还原剂二硫苏糖醇进行处理而得到。或者，可以通过将编码该抗体的Fab’片段的DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中并将该载体导入原核生物或真核生物中使其进行表达来制造。 [0190] scFv是使用适当的肽接头(以下记为P)将一条VH与一条VL连接而形成的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，并且是具有抗原结合活性的抗体片段。 [0191] 本发明的scFv可以通过如下方法制造：获取编码本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1蛋白且与该重链铰链区结合的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。 [0192] 双价抗体为scFv二聚体化而得到的抗体片段，并且是具有二价抗原结合活性的抗体片段。二价抗原结合活性可以相同，也可以使其中一者具有不同的抗原结合活性。 [0193] 本发明的双价抗体可以通过如下方法制造：获取本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1蛋白且与该重链铰链区结合的单克隆抗体，以P的氨基酸序列长度为8个残基以下的方式构建编码scFv的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。 [0194] dsFv是指使VH和VL中各一个氨基酸残基取代为半胱氨酸残基的多肽借助该半胱氨酸残基之间的二硫键结合而得到的抗体片段。取代为半胱氨酸残基的氨基酸残基可以根据Reiter等人公开的方法[Protein Engineering,7,697(1994)]基于抗体的立体结构预测来进行选择。 [0195] 本发明的dsFv可以通过如下方法制造：获取编码本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1蛋白且与该重链铰链区结合的单克隆抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。 [0196] 包含CDR的肽可以包含VH或VL的CDR中的至少一个区域以上而构成。包含多个CDR的肽可以直接进行结合或者借助肽接头而进行结合。 [0197] 本发明的包含CDR的肽可以通过如下方法制造：构建编码本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1蛋白且与该重链铰链区结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物中，由此进行表达。 [0199] 本发明中包括：利用化学或基因工程方法在本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1蛋白且与该重链铰链区结合的单克隆抗体或抗体片段上结合药剂、蛋白质、放射性同位素等而得到的与抗体的结合物。 [0200] 本发明的结合物通过利用化学方法[抗体工学入門(抗体工程入门)，金光修著，地人书馆(1994)]在本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1蛋白且与该重链铰链区结合的单克隆抗体或其抗体片段的H链或L链的N末端侧或C末端侧、抗体或其抗体片段中的适当的取代基或侧链以及抗体或其抗体片段中的糖链等上结合药剂、蛋白质、放射性同位素等来制造。 [0201] 另外，也可以通过基因工程方法来制造，即，使编码本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1蛋白且与该重链铰链区结合的单克隆抗体或其抗体片段的DNA与编码要结合的蛋白质的DNA连接后插入表达载体中，并将该表达载体导入原核生物或真核生物的宿主细胞中。 [0202] 作为药剂，可以列举：化疗剂、抗体药品、免疫刺激剂、高分子药剂等。 [0203] 作为蛋白质，可以列举：细胞因子、增殖因子、毒蛋白等。 [0204] 此外，与抗体或该抗体片段结合的药剂可以为前药的形式。本发明中的前药是指利用存在于肿瘤环境中的酶等进行化学修饰而转变为具有杀伤癌细胞的作用的物质的药剂。 [0205] 作为化疗剂，包括烷化剂、亚硝基脲剂、代谢拮抗剂、抗癌性抗生素、植物来源的生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素疗法制剂、激素拮抗剂、芳香化酶抑制剂、P糖蛋白抑制剂、铂络合物衍生物、M期抑制剂、激酶抑制剂等任何的化疗剂。作为化疗剂，可以列举：阿米福汀(氨磷汀)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链脲霉素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、阿霉素脂质体(多喜)、表柔比星、吉西他滨(健择)、柔红霉素、柔红霉素脂质体(DaunoXome)、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、培洛霉素、雌莫司汀、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(多西他奇)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、克拉屈滨、喜树碱、CPT-11、10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)、5-氟脱氧尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司那、依立替康、拓扑替康(ノギテカン)、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、羟基脲、普卡霉素、密妥坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、链脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、长春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他滨、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奥沙利铂、吉非替尼(易瑞沙)、伊马替尼(STI571)、厄洛替尼、Flt3抑制剂、血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂(易瑞沙、特罗凯等)、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安吖啶、全反式维甲酸、沙利度胺、阿那曲唑、法曲唑、来曲唑、依西美坦、硫代苹果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立宾、环孢素、雷帕霉素、氢化可的松、蓓萨罗丁(塔革雷汀)、他莫昔芬、地寒米松、孕激素类、雌激素类、阿那曲唑(瑞宁德)、利普安、阿司匹林、吲哚美辛、塞来昔布、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代苹果酸金、马来酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯马斯汀、维甲酸、蓓萨罗丁、砷、硼替佐米、别嘌呤醇、吉妥单抗、替伊莫单抗、131托西莫单抗、塔革雷汀、奥唑米星、克拉霉素、瘤可维、异环磷酰胺、酮康唑、氨鲁米特、苏拉明、甲氨蝶呤、类美登醇(Maytansinoid)及其衍生物等。 [0207] 作为抗体药品，可以列举：对通过抗体的结合诱导凋亡的抗原、与肿瘤的病态形成相关的抗原或调节免疫功能的抗原、与病变部位的血管新生相关的抗原具有抗性的抗体。 [0208] 作为通过抗体的结合诱导凋亡的抗原，可以列举：分化抗原(Cluster of differentiation，以下记为CD)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、人类白细胞抗原(HLA)II类、EGFR等。 [0209] 作为与肿瘤的病态形成相关的抗原或调节免疫功能的抗原，可以列举：CD4、CD40、CD40配体、B7家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4)、B7家族分子的配体(CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、BTLA)、OX-40、OX-40配体、CD137、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族分子(DR4、DR5、TNFR1、TNFR2)、TNF相关的凋亡诱导配体受体(TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受体家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、核因子κB受体活化因子配体(RANK)、RANK配体、CD25、叶酸受体4、细胞因子[白细胞介素-1α(以下将白细胞介素记为IL)、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、转化生长因子(TGF)β、TNFα等]、上述细胞因子的受体、趋化因子(SLC、ELC、I-309、TARC、MDC、CTACK等)、上述趋化因子的受体。 [0210] 作为抑制病变部位的血管新生的抗体的抗原，可以列举：血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、EGF、血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细胞生成素(EPO)、TGFβ、IL-8、Ephilin、SDF-1等以及它们的受体。 [0211] 作为免疫刺激剂，可以是作为免疫佐剂已知的天然物，作为具体例，使免疫亢进的药剂可以列举：β-1,3-葡聚糖(香菇多糖、西佐糖)、α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)、菌体粉末(溶链菌、BCG)、菌体提取物(云芝多糖)。 [0212] 作为高分子药剂，可以列举：聚乙二醇(以下记为PEG)、白蛋白、右旋糖酐、聚环氧乙烷、苯乙烯马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羟丙基甲基丙烯酰胺等。通过使这些高分子药剂与抗体或抗体片段结合，可以期待发挥如下效果：(1)提高对化学性、物理性或生物性的各种因素的稳定性；(2)显著延长血中半衰期；(3)抑制免疫原性消失并抑制抗体产生；等[バイオコンジユゲ-ト医薬品，广川书店(1993)]。例如，作为使PEG与抗体结合的方法，可以列举与PEG化修饰试剂进行反应的方法等[バイオコンジユゲ-ト医薬品，广川书店(1993)]。作为PEG化修饰试剂，可以列举：赖氨酸的ε-氨基的修饰剂(日本特开昭61-178926)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修饰剂(日本特开昭56-23587)、精氨酸的胍基的修饰剂(日本特开平2-117920)等。 [0213] 作为细胞因子或增殖因子，只要是使NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞等细胞亢进的细胞因子或增殖因子则均可，可以列举例如：干扰素(以下记为IFN)-α、INF-β、INF-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。 [0214] 作为毒蛋白，可以列举：蓖麻毒素、白喉毒素、ONTAK等，还包括为调节毒性而向蛋白质中引入突变而得到的蛋白毒素。 [0215] 作为放射性同位素，可以列举：131I、125I、90Y、64Cu、199Tc、77Lu、211At、Re186、Re188、In111等。放射性同位素可以通过氯胺T法等直接与抗体进行结合。另外，也可以在抗体结合用于螯合放射性同位素的物质。作为螯合剂，可以列举甲基苯基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。 [0216] 本发明中，可以将本发明中使用的抗体与一种以上的其他药剂组合来施用，或者也可以与放射线照射组合。作为其他药剂，可以列举：上述的化疗剂、抗体药品、免疫刺激剂、细胞因子或增殖因子等。 [0218] 作为组合施用的方法，可以与本发明中使用的抗体同时施用，或者也可以在施用本发明中使用的抗体前后施用。 [0219] 本发明的检测方法、定量方法、检测试剂、定量试剂或诊断剂中，可以列举将特定的标记物标记到本发明的抗体上来使用的方法。作为标记物，可以列举通常的免疫学检测或测定方法中使用的标记物，可以列举：碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶等酶；吖啶酯、洛酚碱等发光物质；异硫氰酸荧光素(FITC)、三甲基罗丹明(RITC)等荧光物质；等。 [0220] 以下，对本发明的抗体的制造方法进行具体说明。 [0221] 1.单克隆抗体的制造方法 [0222] (1)抗原的制备 [0223] 通过下述中记载的方法，将包含编码全长或部分长度IgA1重链的cDNA的表达载体导入在O连接型糖链合成过程中向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与UDP-半乳糖的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的酵母、昆虫细胞、动物细胞等中，由此，能够得到作为抗原的糖链缺陷型IgA1蛋白或表达糖链缺陷型IgA1的细胞。另外，也可以使用通过从在细胞膜上或培养液中大量表达糖链缺陷型IgA1的各种人来源的培养细胞、人组织等中纯化出糖链缺陷型IgA1来制备抗原的方法，或者，制备具有糖链缺陷型IgA1的部分序列的合成肽并作为抗原使用。此外，可以通过在试管内向使用不具有糖链附加能力的大肠杆菌等原核生物进行表达、纯化而得到的IgA1蛋白上附加糖链来得到糖链缺陷型IgA1。 [0224] 另外，同样地操作，向具有正常的O连接型糖链合成过程的酵母、昆虫细胞、动物细胞等宿主细胞中导入包含编码全长或部分长度IgA1重链的cDNA的表达载体，由此可以获得表达具有正常O连接型糖链的IgA1重链的细胞，并可以从该细胞中纯化出具有正常O连接型糖链的IgA1重链蛋白。 [0225] 如上得到的糖链缺陷型IgA1蛋白、具有正常O连接型糖链的IgA1蛋白或它们的表达细胞可以用于目标抗体的筛选、确认所获得的抗体对抗原的反应性。 [0226] 作为本发明中使用的多肽，可以通过使用Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版，冷泉港实验室出版社(1989)或Current Protocols INMolecular Biology，约翰威立父子出版公司(1987-1997)等中记载的方法等，例如利用以下的方法，使编码该多肽的DNA在宿主细胞中进行表达来制造。 [0227] 首先，将编码全长多肽的cDNA插入适当的表达载体的启动子的下游，由此制作重组载体。此时若有需要，也可以基于全长cDNA来制备包含编码多肽的部分的适当长度的DNA片段，并使用该DNA片段来代替上述全长cDNA。接着，将该重组载体导入适合于该表达载体的宿主细胞中，由此可以得到生产多肽的转化体。 [0228] 作为宿主细胞，只要是大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等具有附加O连接型糖链的能力并且能够表达目的基因的宿主细胞，则均可以使用。 [0229] 作为表达载体，使用能够在所使用的宿主细胞中进行自主复制或者能够整合到染色体中并且在能够转录编码多肽的DNA的位置含有适当的启动子的表达载体。 [0230] 在使用大肠杆菌等原核生物作为宿主细胞的情况下，含有编码本发明中使用的多肽的DNA而构成的重组载体优选为在原核生物中能够进行自主复制并且包含启动子、核糖体结合序列、本发明中使用的DNA和转录终止序列的载体。该重组载体可以进一步含有调控启动子的基因。 [0231] 作为表达载体，可以列举例如：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均为罗氏诊断公司制造)、pKK233-2(Pharmacia公司制造)、pSE280(Invitrogen公司制造)、pGEMEX-1(Promega公 司 制 造 )、pQE-8(QIAGEN 公 司 制 造 )、pKYP10( 日 本 特 开 昭 58-110600)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBlue scriptII SK(-)(Stratagene 公 司 制 造 )、pTrs30[ 由 大 肠 杆 菌 JM109/pTrS30(FERMBP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERMBP-400)制备，日本特开昭60-221091]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备，日本特开昭60-221091]、pTerm2(US4686191,US4939094,US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司制造)、pET系统(Novagen公司制造)、pME18SFL3等。 [0232] 作为启动子，只要是能够在所使用的宿主细胞中发挥功能的启动子则均可使用。可以列举例如：trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用两个Ptrp串联而成的串联启动子、tac启动子、lac T7启动子、let I启动子等经过人为设计改变而得到的启动子等。 [0233] 另外，作为上述重组载体，优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子的间隔调节至适当距离(例如6~18个碱基)而得到的质粒。编码本发明中使用的多肽的DNA的碱基序列中，可以对碱基进行取代，以形成最适于在宿主内表达的密码子，由此，能够提高目标多肽的生产率。此外，上述重组载体中的基因的表达不一定需要转录终止序列，但优选在紧邻结构基因的下游配置转录终止序列。 [0234] 作为宿主细胞，可以列举属于埃希氏菌属等的微生物，可以列举例如：大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌DH5α等。 [0235] 作为重组载体的导入方法，只要是向上述宿主细胞中导入DNA的方法则均可以使用，可以列举例如：使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、Gene,17,107(1982)或Molecular&General Genetics,168,111(1979)中记载的方法等。 [0236] 在使用动物细胞作为宿主的情况下，作为表达载体，可以列举例如：pcDNAI、pcDM8( 由 フ ナ コ シ 公 司 销 售)、pAGE107[ 日 本 特 开 平 3-22979； Cytotechnology,3,133,(1990)]、pAS3-3( 日 本 特 开 平 2-227075)、 pCDM8[Nature,329,840,(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen 公 司 制 造 )、 pcDNA3.1(Invitrogen 公 司 制 造 )、pREP4(Invitrogen 公 司 制 造 )、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93[WO97/10354]等。 [0237] 作为启动子，只要是能够在动物细胞中发挥功能的启动子则均可以使用，可以列举例如：巨细胞病毒(CMV)的IE(即刻早期)基因的启动子、SV40的早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子、莫洛尼小鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)的启动子和增强子等。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一同使用。 [0238] 作为宿主细胞，只要是在糖链合成途径中向多肽上的Ser/Thr上结合的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与尿苷5’-二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的细胞系，则均可以使用。具体而言，可以列举：作为UDP-半乳糖转运蛋白缺失的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)的Lec8突变体[ACSSymp.Ser.128,214(1980)]。 [0239] 此外，可以使用在与糖链合成途径相关的酶、转运蛋白的活性未缺失的细胞中使UDP-半乳糖转运蛋白(别名：UDP-半乳糖转位蛋白，UGALT)或者核心1合酶即糖蛋白-N-乙酰半乳糖胺3-β-半乳糖基转移酶(C1GALT1，别名：核心1-β-3-gal-t，t合酶)或C1GALT1-特异伴侣蛋白1(c1galt1c1，别名：核心1β-3-半乳糖基转移酶-特异分子伴侣(COSMC)，C1GALT2)等酶、转运蛋白的功能降低或缺失的细胞系。 [0240] 作为与糖链合成途径相关的酶、转运蛋白的活性未缺失的细胞，可以列举例如：那马瓦(Namalwa)细胞、作为猴细胞的COS细胞、作为中国仓鼠来源的细胞的CHO细胞、HBT5637(日本特开昭63-299)等。 [0241] 作为降低基因功能的方法，可以列举：反义法、核酶法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96,1886(1999)]、同源重组法[Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual(小鼠胚胎操作实验指南)，第二版，冷泉港实验室出版社(1994)、Gene Targeting,A Practical Approach(基因寻靶：实践探讨)，牛津大学出版社旗下的IRL出版社(1993)]、RNA-DNA寡核苷酸(RDO)法、RNA干扰(RNAi)法[Nature,391,806,(1998)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,15502,(1998)、Nature,395,854,(1998)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA),96,5049,(1999)、Cell,95,1017,(1998)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,1451,(1999)roc.Natl.Acad.Sci.USA,95,13959,(1998)、Nature Cell Biol.,2,70,(2000)]、使用逆转录病毒的方法、使用转座子的方法[Nature Genetics,25,35,(2000)]等。 [0242] 作为载体的导入方法，只要是向动物细胞中导入DNA的方法则均可以使用，可以列举例如：电穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙法(日本特开平2-227075)、脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。 [0243] 作为基因的表达方法，除了直接表达以外，还可以根据Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版，冷泉港实验室出版社(1989)中记载的方法等进行分泌生产、融合蛋白表达等。在真核生物来源的细胞中进行表达的情况下，可以得到附加有糖或糖链的多肽。 [0244] 将如上得到的转化体在培养基中进行培养，在培养物中生成并蓄积该多肽，并从该培养物中进行收集，由此可以制造多肽。将该转化体在培养基中进行培养的方法可以根据宿主的培养中使用的通常的方法来进行。 [0245] 对利用使用诱导性启动子作为启动子的重组载体进行转化后的微生物进行培养时，可以根据需要向培养基中添加诱导物。例如，对利用使用lac启动子的重组载体进行转化后的微生物进行培养时，可以向培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，对利用使用trp启动子的重组载体进行转化后的微生物进行培养时，可以向培养基中添加吲哚丙烯酸等。 [0246] 作为用于培养以动物细胞为宿主而得到的转化体的培养基，可以使用 普 遍 使 用 的 RPMI 1640 培 养 基 [The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)]、伊戈尔(Eagle)的MEM培养基[Science,122,501(1952)]、杜尔贝科改良MEM培养基[Virology,8,396(1959)]、199培养基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]或者向这些培养基中添加FCS等而得到的培养基等。培养通常在pH6~8、 30~40℃、5%CO2存在下等条件下进行1~7天。另外，在培养中，可以根据需要向培养基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。 [0247] 如上所述，将包含重组有编码本发明中使用的多肽的DNA的重组载体的来源于微生物、动物细胞等的转化体根据通常的培养方法进行培养，生成并蓄积该多肽，并从该培养物进行收集，由此可以制造本发明中使用的多肽。 [0248] 作为基因的表达方法，除了直接表达以外，还可以根据MolecularCloning,Alaboratory Manual,第二版，冷泉港实验室出版社(1989)中记载的方法等进行分泌生产、融合蛋白表达等。 [0249] 作为多肽的生产方法，有如下方法：在宿主细胞内生产的方法、分泌到宿主细胞外的方法以及在宿主细胞外膜上生产的方法，通过改变使用的宿主细胞或者所生产的多肽的结构，可以选择适当的方法。 [0250] 在宿主细胞内或宿主细胞外膜上生产多肽的情况下，通过使用鲍尔森等人 的 方 法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、罗 等 人 的 方 法 [Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)]或者日本特开平05-336963、WO94/23021等中记载的方法，可以使该基因产物分泌到宿主细胞外。 [0251] 另外，还可以根据日本特开平2-227075中记载的方法，利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统来提高生产量。 [0252] 多肽可以以例如如下所述的方式进行分离和纯化。 [0253] 多肽在细胞内以溶解状态进行表达的情况下，培养结束后通过离心分离来回收细胞，悬浊于水性缓冲液中后，利用超声波破碎机、法式压滤壶、MANTON-GULIN匀浆器、卧式砂磨机等将细胞破碎，从而得到无细胞提取液。将该无细胞提取液进行离心分离，从所得到的上清中利用通常的酶的分离纯化法得到纯化制备品，即，单独或组合使用溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化学公司制造)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制造)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、聚焦层析法、等电点电泳等电泳法等方法。 [0254] 另外，多肽在细胞内形成包涵体而进行表达的情况下，同样地将细胞回收后进行破碎，并进行离心分离，由此，以沉淀级分的形式回收该多肽的包涵体。利用蛋白变性剂使回收的该多肽的包涵体可溶化。通过对该可溶化液进行稀释或透析，使该多肽恢复至正常的立体结构，然后，通过与上述同样的分离纯化方法得到多肽的纯化制备品。 [0255] 另外，本发明中使用的多肽也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。另外，还可以利用Advanced ChemTech公司、パ-キン·エルマ-公司、Pharmacia公司、Protein Technology Instrument公司、Synthecell-Vega公司、PerSeptive公司、岛津制作所等的肽合成仪进行化学合成。 [0256] (2)动物的免疫和抗体产生细胞的制备 [0257] 对3~20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠进行如上制备的抗原的免疫，收集该动物的脾脏、淋巴结、末梢血中的抗体产生细胞。另外，在免疫原性低因而在上述动物中未观察到充分的抗体效价升高的情况下，还有使用CD27敲除动物作为被免疫动物的方法。 [0258] 免疫通过将抗原连同适当的佐剂[例如，完全弗氏佐剂(Complete Freund’s Adjuvant)或氢氧化铝凝胶和百日咳菌疫苗等]一同施用到动物的皮下、静脉内或腹腔内来进行。在抗原为部分肽的情况下，与BSA(牛血清白蛋白)或KLH(钥孔 血蓝蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等载体蛋白制成结合物，将其作为免疫原使用。 [0259] 关于抗原的施用，在第一次施用之后，每隔1~2周施用5~10次。每次施用后第3~7天从眼底静脉丛采血，利用酶免疫测定法[Antibodies-A Laboratory Manual，冷泉港实验室,1988]等考察其血清与抗原的反应。将其血清对免疫所用的抗原显示出充分的抗体效价的小鼠、大鼠或仓鼠供作脾脏细胞的供给源。 [0260] 在供于脾脏细胞与骨髓瘤细胞的融合时，在抗原物质的末次施用后第3~7天从免疫后的小鼠、大鼠或仓鼠中摘除脾脏，收集脾脏细胞。将脾脏在MEM培养基(日水制药公司制造)中细细切碎，用镊子搅散，并离心分离(1200rpm、5分钟)，然后，弃去上清，用Tris-氯化铵缓冲液(pH7.65)处理1~2分钟以除去红细胞，并用MEM培养基洗涤3次，从而提供融合用脾脏细胞。 [0261] (3)骨髓瘤细胞的制备 [0262] 作为骨髓瘤细胞，使用由小鼠得到的确立细胞系。可以使用例如：8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(BALB/c来源)骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topicsin Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1) [European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/O-Ag 14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、P3-X63-Ag8(X63) [Nature,256,495(1975)]等。这些细胞系在8-氮杂鸟嘌呤培养基[向在RPMI-1640培养-5 基中添加有谷氨酰胺(1.5mM)、2-巯基乙醇(5×10 M)、庆大霉素(10μg/mL)和胎牛血清(FCS)的培养基(以下称为正常培养基)中进一步添加8-氮杂鸟嘌呤(15μg/mL)而得到的培养基]中传代培养，在细胞融合的3~4天之前传代到正常培养基中，以确保融合当天达 7 到2×10 个以上的细胞数。 [0263] (4)细胞融合 [0264] 将上述抗体产生细胞和骨髓瘤细胞用MEM培养基或PBS(磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g、食盐7.65g、蒸馏水1升、pH7.2)充分洗涤，以使细胞数达到抗体产生细胞:骨髓瘤细胞=5~10:1的方式进行混合，离心分离(1200rpm、5分钟)后，弃去上清，将沉淀 8 的细胞群充分搅散后，在搅拌的同时在37℃下以0.2~1mL/10 个抗体产生细胞的量加入2g聚乙二醇-1000(PEG-1000)、2mL MEM和0.7mL二甲亚砜的混合溶液，并每隔1~2分钟加入 1~2mL的MEM培养基，重复数次后，加入MEM培养基至总量达到50mL。离心分离(900rpm、 5分钟)后，弃去上清，轻轻地将细胞搅散后，通过用刻度吸管吸入并吹出，轻轻地将细胞悬-4 浮于100mL HAT培养基[在正常培养基中添加有次黄嘌呤(10 摩尔/升)、胸腺嘧啶核-5 -7 苷(1.5×10 摩尔/升)和氨基蝶呤(4×10 摩尔/升)的培养基]中。将该悬浮液以 100μL/孔分注到96孔培养板中，在5%CO2的培养箱中在37℃下培养7~14天。 [0265] 培养后，取一部分培养上清，通过后述的结合分析等选出与包含本发明中使用的多肽的抗原发生反应而不与不含多肽的抗原发生反应的细胞。 [0266] 然后，利用有限稀释法重复进行两次克隆[第一次使用HT培养基(从HAT培养基中除去氨基蝶呤而得到的培养基)，第二次使用正常培养基]，选出稳定地观察到强抗体效价的细胞作为产生单克隆抗体的杂交瘤株。 [0267] (5)单克隆抗体的制备 [0268] 对姥鲛烷处理[腹腔内施用0.5mL的2,6,10,14-四甲基十五碳烷(姥鲛烷)，饲6 7 养2周]后的8~10周龄的小鼠或裸鼠以2×10~5×10 细胞/只的量腹腔内注射(4)中得 到的产生抗CD27单克隆抗体的杂交瘤细胞。在10~21天内杂交瘤产生癌性腹水。从该小鼠中收集腹水，离心分离(3000rpm、5分钟)除去固体成分后，用40~50%的硫酸铵进行盐析，然后，利用辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱进行纯化，收集IgG或IgM级分，作为纯化的单克隆抗体。 [0269] 抗体亚类的确定使用亚类分型试剂盒通过酶免疫测定法来进行。蛋白量的定量通过劳里法和280nm下的吸光度来计算。 [0270] (6)结合分析 [0271] 作为抗原，使用：通过本项(1)中记载的方法将包含编码本发明中使用的CD27多肽的cDNA的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等中而得到的基因导入细胞或重组蛋白、或者由人组织得到的纯化多肽或部分肽。在抗原为部分肽的情况下，与BSA(牛血清白蛋白)或KLH(钥孔 血蓝蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等载体蛋白制成结合物，并使用该结合物。 [0272] 将上述抗原分注到96孔板中并使其固相化，然后，分注被免疫动物血清、产生单克隆抗体的杂交瘤的培养上清或纯化抗体作为第一抗体，并使其发生反应。用PBS或PBS-0.05%吐温充分洗涤后，分注由生物素、酶、化学发光物质或放射线化合物等标记的抗免疫球蛋白抗体作为第二抗体，并使其发生反应。用PBS-吐温充分洗涤后，进行与第二抗体的标记物质对应的反应。 [0273] 与识别包含未结合半乳糖的O连接型糖链的CD27且与该重链铰链区结合的单克隆抗体产生竞争的抗体，可以通过向上述结合分析系统中添加受试抗体并使其反应来获得。即，筛选出在加入受试抗体时单克隆抗体的结合受到抑制的抗体，由此可以获得在向糖链缺陷型IgA1的重链铰链区上结合时与获得的单克隆抗体产生竞争的单克隆抗体。 [0274] 另外，与识别糖链缺陷型IgA1且与该重链铰链区结合的单克隆抗体所识别的表位结合的抗体，可以通过如下方法获得：对在上述结合分析系统中获得的抗体的表位进行鉴定，制作所鉴定出的表位的部分糖链结合肽或者模拟表位的立体结构的糖链结合肽等，并进行免疫。 [0275] 2.基因重组抗体的制作 [0276] 作为基因重组抗体的制作例，以下示出人嵌合抗体和人源化抗体的制作方法。 [0277] (1)基因重组抗体表达用载体的构建 [0278] 基因重组抗体表达用载体是指重组有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体，可以通过将编码人抗体的CH和CL的DNA分别克隆到动物细胞用表达载体中来进行构建。 [0279] 人抗体的C区可以使用任意的人抗体的CH和CL。可以列举例如：人抗体的γ1亚类的CH和κ类的CL等。作为编码人抗体的CH和CL的DNA，可以使用包含外显子和内含子的染色体DNA，也可以使用cDNA，优选使用cDNA。作为动物细胞用表达载体，只要是能够重组并表达编码人抗体的C区的基因的载体则均可以使用。可以列举例 如：pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]、pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)〕等。作为动物细胞用表达载体中使用的启动子和增强子，可以列举：SV40的早期启动子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]、免疫球蛋白H链的启动子[Cell,41,479(1985)]和增强子[Cell,33,717(1983)]等。 [0280] 基因重组抗体表达用载体可以使用抗体H链和L链存在于不同载体上的类型或者存在于同一载体上的类型(串联型)中的任意一种，从基因重组抗体表达载体的构建的容易度、向动物细胞中导入的容易度、抗体H链与L链在动物细胞内的表达量的平衡均衡等观点出发，优选串联型基因重组抗体表达用载体[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]。作为串 联型基 因重组 抗体 表达用 载体，可 以列举 pKANTEX93[WO97/10354]、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]等。 [0281] (2)编码人以外的动物来源的抗体的V区的cDNA的获得和氨基酸序列的分析[0282] 编码非人抗体的VH和VL的cDNA可以如下获得。 [0283] 从产生非人抗体的杂交瘤细胞中提取mRNA，并合成cDNA。将合成的cDNA克隆到噬菌体或质粒等载体中，制作cDNA文库。使用编码小鼠抗体的C区部分或V区部分的DNA作为探针，从该文库中分别分离出具有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。分别确定重组噬菌体或重组质粒上的目标小鼠抗体的VH或VL的全长碱基序列，由碱基序列分别推测出VH或VL的全长氨基酸序列。 [0284] 作为人以外的动物，只要能够制作小鼠、大鼠、仓鼠、兔等的杂交瘤细胞则均可以使用。 [0285] 作为由杂交瘤细胞制备总RNA的方法，可以列举异硫氰酸胍三氟乙酸铯法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]等，另外，作为试剂盒，可以列举RNAeasy试剂盒(QIAGEN公司制造)等。作为由总RNA制备mRNA的方法，可以列举固定有寡聚(dT)的纤维素柱法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版(冷泉港实验室出版社,1989)]等，另外，作为试剂盒，可以列举OligoTM-dT30 [0286] 作为cDNA的合成和cDNA文库的制作方法，可以列举：常规方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版(冷泉港实验室出版社,1989);Current Protocols in Molecular Biology,副刊1-34]或者使用市售试剂盒例如用于cDNA合成和质粒克隆的TMSuperScript 质粒系统(Invitrogen公司制造)或ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene公司制造)的方法等。 [0287] 在制作cDNA文库时，用于重组以由杂交瘤细胞提取出的mRNA为模板而合成的cDNA的载体只要是能够重组该cDNA的载体则均可以使用。可以使用例如：ZAPExpress[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene 公 司 制 造 )、λgt10、λgt11[DNA Cloning:A Practical Approach,I,49(1985)]、λBlueMid(Clontech公司制造)、λExCell、pT7T318U(Pharmacia公司制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]和pUC18[Gene,33,103(1985)]等。 [0288] 作为用于导入由噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，只要是能够导入、表达和保持该cDNA文库的大肠杆菌则均可以使用。可以使用例如： XL1-Blue MRF’[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]和JM105[Gene,38,275(1985)]等。 [0289] 作为从cDNA文库中筛选编码非人抗体的VH或VL的cDNA克隆的方法，可以通过使用同位素或荧光标记的探针的克隆杂交法或噬菌斑杂交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版(冷泉港实验室出版社,1989)]来进行筛选。另外，也可以制备引物，将由mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，通过聚合酶链反应[以下记为PCR法；Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第二版、冷泉港实验室出版社(1989);Current Protocolsin Molecular Biology,副刊1-34]来制备编码VH或VL的cDNA。 [0290] 将通过上述方法筛选出的cDNA利用适当的限制性酶等进行切割后，克隆到pBluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，进行通常使用的碱基序列分析方法例如桑格(Sanger,F.)等人的双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等的反应，并使用碱基序列自动分析装置例如A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia公司制造)等进行分析，由此，可以确定该cDNA的碱基序列。 [0291] 由确定出的碱基序列分别推测VH和VL的全长氨基酸序列，与已知的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]进行比较，由此，可以分别确认所获得的cDNA是否编码包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列。关于包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列，通过与已知的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]进行比较，可以推测出分泌信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进而可以获知它们所属的亚类。另外，VH和VL的各CDR的氨基酸序列也通过与已知的抗体的VH和VL的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]进行比较来找出。 [0292] 进而，使用VH和VL的完整氨基酸序列，利用任意的数据库例如对于SWISS-PROT或PIR-蛋白等利用BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等进行序列同源性检索，从而可以确认使用的氨基酸序列是否是新的氨基酸序列。 [0293] (3)人嵌合抗体表达载体的构建 [0294] 将编码非人抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到本项2的(1)中记载的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，从而可以构建人嵌合抗体表达载体。例如，为了使编码非人抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧与人抗体的CH或CL的5’末端侧连接，制作以如下方式设计的VH和VL的cDNA：连接部分的碱基序列编码适当的氨基酸并且为适当的限制性酶识别序列。将所制作的VH和VL的cDNA分别克隆到本项2的(1)中记载的人源化抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达，从而可以构建人嵌合抗体表达载体。另外，也可以使用在两端具有适当的限制性酶的识别序列的合成DNA，通过PCR法对编码非人抗体VH或VL的cDNA分别进行扩增，并将它们分别克隆到本项2的(1)中记载的基因重组抗体表达用载体中。 [0295] (4)编码人源化抗体的V区的cDNA的构建 [0296] 编码人源化抗体的VH或VL的cDNA可以如下构建。首先，分别选择用于移植非人抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH或VL的框架区(以下记为FR)的氨基酸序列。作为选择的FR的氨基酸序列，只要是人抗体来源的氨基酸序列则均可以使用。可以列举例如：蛋白数据库(Protein Data Bank)等数据库中登记的人抗体的FR的氨基酸序列、人抗体的FR的各亚类的共有氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]等。为了抑制抗体的结合活性的降低，选择与原来的抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列具有尽量高的同源性(至少60%以上)的FR的氨基酸序列。接着，向选择好的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列中分别移植原抗体的CDR的氨基酸序列，从而分别设计出人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列。考虑在抗体基因的碱基序列中出现的密码子的使用频率[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]，将设计好的氨基酸序列转变为DNA序列，从而分别设计出编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。基于设计好的DNA序列，合成多条包含约100个碱基的长度的合成DNA，使用这些合成DNA进行PCR法。这种情况下，从PCR中的反应效率和能够合成的DNA的长度考虑，优选对于H链、L链均设计6条合成DNA。 [0297] 另外，通过在位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制性酶的识别序列，可以容易地将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA克隆到本项2的(1)中构建的人源化抗体表达用载体中。PCR反应后，将扩增产物分别克隆到pBluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，通过本项2的(2)中记载的方法来确定碱基序列，从而获得具有编码期望的人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。 [0298] (5)人源化抗体的V区的氨基酸序列的改变 [0299] 已知：仅将非人抗体的VH和VL的CDR移植到人抗体的VH和VL的FR中时，人源化抗体的抗原结合活性与原来的非人抗体相比降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。认为其原因在于，原来的非人抗体的VH和VL中，不仅CDR与抗原结合活性相关，而且FR内的氨基酸残基也直接或间接地与抗原结合活性相关，因此，通过人源化使非人抗体的FR的氨基酸残基取代为人抗体的FR的氨基酸残基时，抗原结合活性降低。为了解决该问题，在人源化抗体中，鉴定出人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中直接与抗原的结合相关的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基以及维持抗体的立体结构并间接与抗原的结合相关的氨基酸残基，将这些氨基酸残基取代为原来的非人抗体的氨基酸残基，由此使降低的抗原结合活性升高[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。人源化抗体的制作中，为了解决如何能够有效地鉴定出这些与抗原结合活性相关的FR的氨基酸残基的问题，利用X射线晶体分析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或计算机模拟分析[Protein Engineering,7,1501(1994)]等进行抗体的立体结构的构建和分析。上述抗体的立体结构的信息给人源化抗体的制作带来很多有益的信息，而另一方面，尚未建立能够适用于所有抗体的人源化抗体的制作方法，就现状而言，需要进行针对各个抗体制作多种改变体并研究它们与抗原结合活性的相关性等各种尝试。 [0300] 人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基可以通过使用改变用合成DNA进行本项2的(4)中记载的PCR法来进行改变。对于PCR后的扩增产物，通过本项2的(2)中记载的方法来确定碱基序列，从而确认已实施了目标改变。 [0301] (6)人源化抗体表达载体的构建 [0302] 将构建好的编码基因重组抗体的VH或VL的cDNA分别克隆到本项2的(1)中记载的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，从而可以构建人源化抗体表达载体。 [0303] 例如，通过向本项2的(4)和(5)中构建人源化抗体的VH或VL时使用的合成DNA中、位于两端的合成DNA的5’末端导入适当的限制性酶的识别序列，可以将构建好的VH或VL的cDNA分别克隆到本项2的(1)中记载的人源化抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达。 [0304] (7)基因重组抗体的瞬时表达 [0305] 为了有效地评价制作的多种人源化抗体的抗原结合活性，可以使用本项2的(3)和(6)中记载的基因重组抗体表达载体或者对上述载体进行改变后的表达载体，进行基因重组抗体的瞬时表达。作为用于导入表达载体的宿主细胞，只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞则可以使用任何细胞，从表达量高的观点出发，一般使用COS-7细胞(ATCC CRL1651)[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]。作为将表达载体导入COS-7细胞的方法，可以列举：DEAE-右旋糖酐法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]、脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。 [0306] 导入表达载体后，培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性可以通过酶联免疫吸附法[以下记为ELISA法；Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港实验室(1988)、単クロ-ン抗体実験マニユアル、講談社サイエンテイフイツク(1987)]等来测定。 [0307] (8)基因重组抗体的稳定表达 [0308] 通过将本项2的(3)和(6)中记载的基因重组抗体表达载体导入适当的宿主细胞中，可以得到稳定表达基因重组抗体的转化株。 [0309] 作为将表达载体导入宿主细胞的方法，可以列举电穿孔法[日本特开平2-257891、Cytotechnology,3,133(1990)]等。 [0310] 作为用于导入基因重组抗体表达载体的宿主细胞，只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞则可以使用任何细胞。可以列举例如：小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、两种中国仓鼠卵巢细胞CHO/dhfr-细胞(ATCC CRL9096)和CHO/DG44细胞[Somatic Cell and Molecular Genetics,12,555(1986)]、获得了凝集素抗性的Lec13细胞[Somatic Cell and Molecular genetics,12,55(1986)]、α1,6-岩藻糖转移酶基因缺失的CHO细胞(WO05/35586、WO02/31140)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662)等。 [0311] 除了上述宿主细胞以外，还可以使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶等蛋白质、与在N-糖苷键复合型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺的6位上使岩藻糖的1位进行α连接的糖链修饰相关的酶等蛋白质或与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的宿主细胞，优选使用WO05/35586、WO02/31140等中记载的α1,6-岩藻糖转移酶基因缺失的CHO细胞等。 [0312] 导入表达载体后，根据日本特开平2-257891中公开的方法，在含有G418硫酸盐(以下记为G418，SIGMA公司制造)等药剂的动物细胞培养用培养基中进行培养，由此可以筛选稳定表达基因重组抗体的转化株。作为动物细胞培养用培养基，可以使用：RPMI1640培养基(Invitrogen公司制造)、GIT培养基(日本制药公司制造)、EX-CELL301培养基(JRH公司制造)、IMDM培养基(Invitrogen公司制造)、杂交瘤-SFM培养基(Invitrogen公司制造)或者在这些培养基中添加有胎牛血清(以下记为FCS)等各种添加物的培养基等。通过将所得到的转化株在培养基中进行培养，可以在培养上清中表达并蓄积基因重组抗体。培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性可以通过ELISA法等来测定。另外，可以根据日本特开平2-257891中公开的方法，利用DHFR扩增系统等，使转化株的基因重组抗体的表达量升高。 [0313] 基因重组抗体可以使用蛋白A层析柱从转化株的培养上清中进行纯化[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,第三版，美国学术出版社(1996)； Antibodies-ALaboratory Manual,冷泉港实验室(1988)]。另外，除此以外，可以使用蛋白纯化中通常使用的纯化方法。例如，可以将凝胶过滤、离子交换层析和超滤等组合来进行纯化。纯化后的基因重组抗体的H链、L链或整个抗体分子的分子量可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳[以下记为SDS-PAGE；Nature,227,680(1970)]或蛋白免疫印迹法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港实验室(1988)]等来测定。 [0314] 3.本发明的抗体或抗体片段的活性评价 [0315] 纯化后的本发明的抗体或抗体片段的反应特异性可以如下进行评价。 [0316] 将表达正常型糖链的细胞和在O连接型糖链合成过程中向多肽上的Ser/Thr上结合的GalNAc上附加Gal的酶、与该酶的活性相关的蛋白质或与尿苷5’-二磷酸半乳糖(UDP-半乳糖)的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的细胞系作为宿主，可以分别制作表达编码IgA1重链的碱基序列(3)的IgA1表达细胞。这样，可以制作出表达具有正常O连接型糖链的IgA1的细胞、表达糖链缺陷型IgA1的细胞，并通过ELISA法和荧光抗体法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]等测定表达各IgA1的细胞系与纯化抗体的反应性。 [0317] 另外，通过将膜型IgA1的细胞外结构域以融合蛋白等可溶物的形式分别在上述宿主细胞中进行表达并在适当的条件下进行纯化，可以分别制作保持了立体结构的可溶型IgA1蛋白。作为融合蛋白，可以列举：使IgA1蛋白与抗体恒定区(也称为Fc)、GST标签、组氨酸标签(也称为His标签)或Myc标签等其他多肽融合而得到的蛋白。该融合蛋白可以通过使用蛋白A、镍柱、特异性抗体柱等亲和层析柱来进行分离纯化。也可以通过利用TM表面等离子体共振(SPR)的BIAcore 、ELISA法或免疫沉淀法等来测定这些纯化的可溶型CD27蛋白与纯化抗体的反应性[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual,冷泉港实验室(1988)]。 [0318] 4.使用特异性识别本发明的糖链缺陷型IgA1且与该重链铰链区结合的单克隆抗体或其抗体片段的疾病诊断方法 [0319] 通过使用本发明的抗体或该抗体片段对糖链缺陷型IgA1或表达、蓄积该多肽的细胞进行检测或定量，可以诊断糖链缺陷型IgA1相关疾病。 [0320] 作为与糖链缺陷型IgA1蛋白或表达糖链缺陷型IgA1的细胞相关的疾病，只要是在生物体内发现包含糖链缺陷型IgA1多肽的蛋白或者表达糖链缺陷型IgA1多肽的细胞的疾病则均包括在内。优选为与健康人相比时与糖链缺陷型IgA1蛋白或表达糖链缺陷型IgA1的细胞相关的疾病的患者的该多肽的表达量增加的疾病。具体而言，可以列举自身免疫疾病或癌症。作为自身免疫疾病，可以列举：以IgA肾病为主的慢性肾小球肾炎、系统性红斑狼疮、过敏性紫癜等。另外，作为癌症，可以列举来源于浆细胞的癌症，具体而言，可以列举：浆细胞瘤、IgA型骨髓瘤套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、小淋巴细胞性白血病、伯基特(バ-キツト)淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、浆细胞瘤等。 [0321] 本发明中，作为糖链缺陷型IgA1多肽的检测或测定对象的生物试样，只要是组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液、培养液等可能包含该多肽的试样则没有特别限定。 [0322] 与糖链缺陷型IgA1相关的疾病中，例如，IgA肾病的诊断可以如下进行。 [0323] 对于从多名健康人的体内收集的生物试样，使用本发明的抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，利用下述的免疫学方法，进行糖链缺陷型IgA1多肽的检测或测定，从而确认健康人的生物试样中的该多肽的表达量。对受试者的生物试样也同样考察该多肽的表达量，将其表达量与健康人的表达量进行比较。在受试者的该多肽的表达量与健康人相比增加的情况下，可以判断为IgA肾病或者将来患IgA肾病的可能性高。 [0324] 与糖链缺陷型IgA1相关的疾病中，例如癌症的诊断可以如下进行。 [0325] 对于从多名健康人的生物体内收集的生物试样，使用本发明的抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，利用下述的免疫学方法，进行糖链缺陷型IgA1多肽的检测或测定，从而确认健康人的生物试样中的该多肽的表达量。对受试者的生物试样也同样考察该多肽的表达量，将其表达量与健康人的表达量进行比较。在受试者的该多肽的表达量与健康人相比增加的情况下，可以判断癌症为阳性。 [0326] 含有本发明的抗体或该抗体片段或者它们的衍生物的诊断剂中，根据目标的诊断方法，可以含有用于进行抗原抗体反应的试剂、该反应的检测用试剂。作为用于进行抗原抗体反应的试剂，可以列举缓冲剂、盐等。作为检测用试剂，可以列举：抗体或该抗体片段、或者它们的衍生物、或者识别它们的衍生物的标记的二次抗体、标记物的底物等通常的免疫学检测或测定方法中使用的试剂。 [0327] 作为本发明中检测或测定糖链缺陷型IgA1的量的方法，可以列举任意的公知方法。例如，可以列举免疫学检测或测定方法等。 [0328] 免疫学检测或测定方法是指使用实施过标记的抗原或抗体来检测或测定抗体量或抗原量的方法。作为免疫学检测或测定方法，可以列举：放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法(luminescent immunoassay)、蛋白免疫印迹法和物理化学方法(TIA、LAPIA、PCIA)等。 [0329] 作为放射免疫测定法(RIA)，例如可以列举下述方法：使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进而使实施过放射线标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后，利用闪烁计数仪等进行测定。 [0330] 作为酶免疫测定法(EIA或ELISA)，例如可以列举下述方法：使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进而使实施过标记的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后，利用吸光光度计来测定发光色素；可以使用例如夹心ELISA法等。作为酶免疫测定法中使用的标记物，可以使用如上所述的任意的公知(石川荣次等编，酶免疫测定法，医学书院)的酶标记。可以使用例如：碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光素酶标记、生物素标记等。 [0331] 夹心ELISA法为如下方法：将抗体结合在固相上后，使其捕获要检测或测定的抗原，并使第二抗体与被捕获的抗原反应。该ELISA法中，准备两种识别要检测或测定的抗原的抗体或抗体片段，其抗原识别部位不同，预先使其中一种抗体或抗体片段吸附到板(例如，96孔板)上，将第二抗体或抗体片段用FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶、生物素等预先进行标记。在吸附有上述抗体的板上，使从生物体内分离出的细胞或其破碎液、组织或其破碎液、细胞培养上清、血清、胸水、腹水、眼液等进行反应，然后，使标记后的单克隆抗体或抗体片段反应，并进行与标记物质相对应的检测反应。在利用该方法测定受试样品中的抗原浓度的情况下，可以由将浓度已知的抗原进行梯度稀释而制作的标准曲线计算出受试样品中的抗原浓度。作为夹心ELISA法中使用的抗体，可以使用多克隆抗体、单克隆抗体中的任意一种，也可以使用Fab、Fab’、F(ab’)2等抗体片段。作为夹心ELISA法中使用的两种抗体的组合，可以是识别不同表位的单克隆抗体或抗体片段的组合，也可以是为多克隆抗体与单克隆抗体或抗体片段的组合。 [0332] 作为荧光免疫测定法(FIA)，可以列举文献[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；単クロ-ン抗体実験マニユアル、講談社サイエンテイフイツク(1987)]等中记载的方法。作为荧光免疫测定法中使用的标记物，可以使用如上所述的任意的公知(川生明著，荧光抗体法，ソフトサイエンス公司)的荧光标记。例如，可以使用FITC标记、RITC标记等。 [0333] 作为发光免疫测定法(luminescent immunoassay)，可以使用[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；単クロ-ン抗体実験マニユアル、講談社サイエンテイフイツク(1987)]等中记载的方法来进行。作为发光免疫测定法中使用的标记物，可以列举如上所述的任意的公知[今井一洋编，生物发光和化学发光，广川书店；临床检查42(1998)]的发光体标记。例如，可以使用吖啶 酯标记、洛酚碱标记等。 [0334] 蛋白免疫印迹法为如下方法：将抗原或表达抗原的细胞等用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[Antibodies-A Laboratory Manual(冷泉港实验室，1988)]使级分分离后，将该凝胶印迹到PVDF膜或硝酸纤维素膜上，使识别抗原的抗体或抗体片段与该膜进行反应，进而使实施过FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶标记、生物素标记等的抗小鼠IgG抗体或结合片段进行反应，然后，使该标记可见化，由此来进行确认。以下示出蛋白免疫印迹法的一例。 [0335] 使表达具有序列号2表示的氨基酸序列的多肽的细胞或组织溶解，在还原条件下使每个泳道的蛋白量为0.1~30μg，通过SDS-PAGE法进行电泳。将电泳后的蛋白转印到PVDF膜上，在含有1%BSA的PBS(以下记为BSA-PBS)中在室温下反应30分钟，进行封闭操作。在此，使本发明的单克隆抗体进行反应，用含有0.05%的吐温-20的PBS(以下记为吐温-PBS)进行洗涤，并使过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG在室温下反应2小时。用吐温-PBS洗涤，使用ECLTM蛋白免疫印迹检测试剂(Amersham公司制造)等对结合有单克隆抗体的条带进行检测，由此，可以检测出具有序列号2表示的氨基酸序列的多肽。作为蛋白免疫印迹法的检测中使用的抗体，可以使用能够与未保持天然型的立体结构的多肽结合的抗体。 [0336] 物理化学方法具体而言可以如下进行：使用本发明的抗体或该抗体片段，使作为抗原的结合半乳糖缺失的O型糖链的CD27与本发明的抗体或该抗体片段结合，由此形成凝集体，并对该凝集体进行检测。除此以外，作为物理化学方法，可以列举：毛细管法、一维免疫扩散法、免疫比浊法或乳胶免疫比浊法等[临床检查法提要，金原出版，499(1998)]。 [0337] 例如，乳胶免疫比浊法中，使用敏化抗体或抗原的粒径约0.1μm~约1μm的聚苯乙烯乳胶等载体，利用对应的抗原或抗体引起抗原抗体反应时，反应液中的散射光增加，透射光减少。将该变化以吸光度或积分球浊度的形式进行检测，由此可以测定受试样品中的抗原浓度等。 [0338] 由于本发明的抗体或该抗体片段能够与糖链缺陷型IgA1多肽的重链铰链区结合，因此，可以适合用于检测表达该多肽的细胞。 [0339] 在表达该多肽的细胞的检测中，可以使用公知的免疫学检测方法，优选使用免疫沉淀法、免疫细胞染色法和免疫组织染色法等。另外，也可以应用使用FMAT8100HTS系统(アプライドバイオシステム公司制造)的荧光抗体染色法等。 [0340] 免疫沉淀法为如下方法：使表达该多肽的细胞等与本发明的单克隆抗体或抗体片段反应后，加入对蛋白G-琼脂糖等免疫球蛋白具有特异性结合能力的载体而使抗原抗体复合物沉淀。或者，也可以通过如下方法来进行。 [0341] 使上述本发明的抗体或该抗体片段固相化于ELISA用96孔板上，然后，利用BSA-PBS进行封闭。在抗体为未纯化的状态例如杂交瘤培养上清等未纯化的状态下，使抗小鼠免疫球蛋白或大鼠免疫球蛋白或蛋白A或G等预先固相化于ELISA用96孔板上，用BSA-PBS封闭后，分注杂交瘤培养上清而使其进行结合。弃去BSA-PBS，用PBS充分洗涤后，使表达具有序列号2表示的氨基酸序列的多肽的细胞或组织的溶解液进行反应。用SDS-PAGE用样品缓冲液从充分洗涤后的板上提取出免疫沉淀物，通过上述蛋白免疫印迹法进行检测。 [0342] 免疫细胞染色法和免疫组织染色法是指如下的荧光抗体染色法(流式细胞术)：将表达抗原的细胞或组织等根据需要用表面活性剂或甲醇等进行处理，以增加抗体的通过性，然后使本发明的抗体进行反应，进而，使实施过FITC等荧光标记、过氧化物酶等酶标记、生物素标记等的抗免疫球蛋白抗体或结合片段进行反应，然后，使该标记可见化并利用显微镜进行显微观察，或者使细胞与荧光标记的抗体反应并利用流式细胞仪进行分析。例如，可以使用文献[Monoclonal Antibodies-Principles and practice，第三版，美国学术出版社(1996)；単クロ-ン抗体実験マニユアル、講談社サイエンテイフイツク(1987)]等中记载的方法来进行。特别是，由于本发明的抗体或该抗体片段能够与糖链缺陷型IgA1的重链铰链区结合，因此，可以优选用于对细胞膜上保持天然型立体结构而表达的CD27进行检测的流式细胞术的分析。 [0343] 另外，通过使用利用荧光抗体染色法原理的FMAT8100HTS系统(アプライドバイオシステム公司制造)，可以在不对所形成的抗体-抗原复合物与未参与抗体-抗原复合物形成的游离抗体或抗原进行分离的情况下测定抗原量或抗体量。 [0344] 5.使用特异性识别并结合本发明的糖链缺陷型IgA1多肽的单克隆抗体或该抗体片段的疾病治疗方法 [0345] 本发明的特异性识别糖链缺陷型IgA1多肽且与该重链铰链区结合的单克隆抗体或其抗体片段可以用于治疗与糖链缺陷型IgA1多肽相关的疾病。 [0346] 作为与糖链缺陷型IgA1多肽相关的疾病，只要是在生物体内发现表达该多肽的细胞的疾病则可以为任何疾病，可以列举例如IgA肾病或癌症等。 [0347] 此外，作为疾病，还可以列举患有IgA肾病并表现肾病综合征的疾病或表现肾衰竭的疾病。 [0348] 作为癌症，可以列举造血器官起源的肿瘤(也称为血液癌)或上皮起源的实体癌。 [0349] 作为血液癌，具体而言，可以列举：白血病、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤等。作为具体的非霍奇金淋巴瘤，可以列举：套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、小淋巴细胞性白血病、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、浆细胞瘤等。 [0351] 作为本发明的治疗剂，可以列举以本发明的抗体或该抗体片段作为有效成分的癌治疗剂。具有ADCC活性或CDC活性等效应活性的癌治疗剂或者利用凋亡诱导作用的癌治疗剂等也包括在本发明的治疗剂内。 [0352] 本发明的抗体或该抗体片段能够识别在细胞膜上表达的糖链缺陷型IgA1多肽，因此，能够识别生物体内存在的表达糖链缺陷型IgA1多肽的细胞。因此，属于本发明的抗体或该抗体片段且具有效应活性的抗体或该抗体片段能够在体内和体外杀伤表达糖链缺陷型IgA1多肽的细胞。另外，上述本发明的抗体或该抗体片段能够杀伤生物体内的表达糖链缺陷型IgA1多肽的细胞而使其减少，因此，可以作为治疗剂特别有效地使用。 [0353] 含有本发明的抗体或该抗体片段或者它们的衍生物的治疗剂可以仅含有作为有效成分的该抗体或该抗体片段或者它们的衍生物，通常优选以与药理学上可容许的一种以上的载体一同混合并通过制剂学的技术领域中公知的任意方法制造而成的医药制剂的形式来提供。 [0354] 施用途径优选使用治疗时最有效的途径，可以列举：经口施用或者口腔内、气管内、直肠内、皮下、肌肉内和静脉内等非经口施用，在抗体或肽制剂的情况下，可以优选列举静脉内施用。作为施用形式，可以列举：喷雾剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏、胶带剂等。 [0355] 作为适于经口施用的制剂，可以列举：乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂等。乳剂和糖浆剂这样的液体制备物可以使用如下成分作为添加剂来制造：水、蔗糖、山梨醇、果糖等糖类，聚乙二醇、聚丙二醇等二醇类，芝麻油、橄榄油、大豆油等油类，对羟基苯甲酸酯等防腐剂，草莓香料、薄荷等香料类。胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂等可以使用如下成分作为添加剂来制造：乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等赋形剂，淀粉、海藻酸钠等崩解剂，硬脂酸镁、滑石等润滑剂，聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等粘结剂、脂肪酸酯等表面活性剂、甘油等增塑剂等。 [0356] 作为适于非经口施用的制剂，可以列举注射剂、栓剂、喷雾剂等。注射剂使用包含盐溶液、葡萄糖溶液或者两者的混合物的载体等来制备。栓剂使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体来制备。另外，喷雾剂使用该抗体或抗体片段本身以及不刺激接受者的口腔和气管粘膜并且使该抗体或抗体片段分散为微细粒子而容易吸收的载体等来制备。作为载体，具体可以例示例如乳糖、甘油等。根据该抗体或抗体片段和使用的载体的性质，可以为气溶胶、干粉等制剂。另外，也可以向这些非经口剂中添加在经口剂中作为添加剂而例示的成分。 [0357] 施用量或施用次数根据目标治疗效果、施用方法、治疗时间、年龄、体重等而不同，通常成人每天为10μg/kg~8mg/kg。 [0358] 以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明不受下述实施例的限定。 [0359] 实施例1 [0360] 在细胞膜上高表达糖链缺陷型IgA1的CHO细胞株的制作 [0361] (1)膜型IgA表达质粒pKAN932B8PVHmIgA的构建 [0362] 按照以下顺序制作用于在细胞膜上表达膜型免疫球蛋白A的载体pKAN932B8PVHmIgA。本质粒是记载在专利WO03/085107中的表达使抗CD20抗体2B8P的重链Fab部分与膜型免疫球蛋白的恒定区连接而成的蛋白质的质粒载体。 [0363] 1.pCR2B8PVH的制作 [0364] 以专利WO03/085107中记载的质粒载体pKANTEX932B8P为模板，通过以下所示的PCR反应对包含抗CD20抗体2B8P的重链可变区的基因片段进行扩增。在含有0.2毫摩尔/升dNTPs、1毫摩尔/升氯化镁的反应液中使用1ng的pKANTEX932B8P、1微摩尔/升RitNotNheIfw(序列号4)、1微摩尔/升RitNotNheIrv(序列号5)和2.5单位的KOD聚合酶(东洋纺公司制造)，调节至总计50μL，进行PCR反应。反应条件为：以98℃下15秒、65℃下2秒、74℃下30秒为1次循环，进行25次循环。将该反应液利用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后，使用Zero Blunt PCR克隆试剂盒(インビトロジエン公司制造)，依照附带的使用说明书将约450bp的PCR产物导入pCR-Blunt载体中，从而获得具有序列号 6所示的DNA序列的pCR2B8PVH(图1)。 [0365] 2.pCRIgA的制作 [0366] 接着，以作为人源cDNA克隆FLJ46724登记在基因库(Genebank)中的质粒(由NEDO人类cDNA测序项目分售)为模板，使用以下所示的PCR对包含免疫球蛋白A的恒定区的DNA片段进行扩增。在含有0.2毫摩尔/升dNTPs、1毫摩尔/升氯化镁的反应液中使用1ng包含FLJ46724的质粒、1微摩尔/升Ig-a-NheI(序列号7)、1微摩尔/升Ig-b-BamHI(序列号8)和2.5单位的KOD聚合酶(东洋纺公司制造)，调节至总计50μL，进行PCR反应。反应条件为：以98℃下15秒、68℃下30秒为1次循环，进行25次循环。将该反应液利用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后，使用Zero Blunt PCR克隆试剂盒(インビトロジエン公司制造)，依照附带的使用说明书将约1000bp的PCR产物导入pCR-Blunt载体中，从而获得具有序列号9所示的DNA序列的pCRIgA(图2)。 [0367] 3.pCRmIgA的制作 [0368] 接着，在含有0.2毫摩尔/升dNTPs、1毫摩尔/升氯化镁的反应液中使用0.02微摩尔/升的AMD-A(序列号10)、0.02微摩尔/升的AMD-B(序列号11)、1微摩尔/升的AMDBamHIfw(序列号12)、1微摩尔/升的AMDSpeIrv(序列号13)和2.5单位的KOD聚合酶(东洋纺公司制造)，调节至总计50μL，进行PCR反应。反应条件为：以98℃下15秒、65℃下2秒、74℃下30秒为1次循环，进行25次循环。将该反应液利用2%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后，使用Zero Blunt PCR克隆试剂盒(インビトロジエン公司制造)，依照附带的使用说明书将约450bp的PCR产物导入pCR-Blunt载体中，从而获得具有序列号14所示的DNA序列的pCRmIgA(图3)。 [0369] 4.pCR 2B8P mIgA的制作 [0370] 使将上述1项中制作的pCR2B8PVH用限制性酶NotI和限制性酶NheI消化而得到的约450bp的DNA片段和将上述2项中制作的pCRIgA用限制性酶NheI和限制性酶BamHI消化而得到的约1000bp的DNA片段与将上述3项中制作的pCRmIgA用限制性酶NotI和限制性酶BamHI消化而得到的约3.5Kbp的质粒DNA连接，由此，构建编码抗CD20抗体2B8P的重链可变区与膜型免疫球蛋白的重链恒定区连接而成的DNA的质粒pCR 2B8P mIgA(图4)。将本质粒所编码的膜型IgA1序列(重链)示于序列号15。 [0371] 5.pKAN932B8PVHmIgA的构建 [0372] 使将上述4项中制作的pCR 2B8P mIgA用限制性酶NotI和限制性酶SpeI消化而得到的1580bp的DNA片段和将KANTEX932B8P用限制性酶EcoRI和限制性酶NotI消化而得到的2845bp的DNA片段与同样将pKANTEX932B8P用限制性酶EcoRI和限制性酶SpeI消化而得到的约13.5Kbp的DNA片段连接，由此，制作表达抗CD20抗体2B8P的恒定区为膜型免疫球蛋白A的蛋白的质粒pKAN932B8PVHmIgA(图5)。将使用该表达载体转化的大肠杆菌接种到100mL的LB培养基中，培养过夜后，回收菌体，使用Qiafilter质粒中量纯化试剂盒(Qiafilter Plasmid midi kit)(キアゲン公司制造)，依照附带的规程对质粒进行纯化。纯化后，将30μg的质粒载体用限制性酶AatII进行消化，由此进行线性化。线性化之后，进行苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀，溶解于1/10浓度的TE缓冲液(1mM TrisHCl,0.1mM EDTA)后，测定浓度，并供于基因导入。 [0373] (2)膜型免疫球蛋白A表达质粒pKAN932B8PVHmIgA的导入 [0374] 将pKAN932B8PVHmIgA基因导入作为主要表达Tn型糖链的突变CHO细胞的Lec8细胞和主要表达正常型糖链的CHO/DG44细胞中，由此，建立表达膜型免疫球蛋白A的Lec8细胞和DG44细胞。膜型免疫球蛋白A表达质粒pKAN932B8PVHmIgA向CHO/DG44细胞(以下记为DG44)或Lec8细胞中的导入可以依据电穿孔法[サイトテクノロジ-,3,133(1990)]按照以下顺序进行。首先，将在基本培养基[添加有10%胎牛透析血清(インビトロ-ジエン公司)、50μg/mL庆大霉素(ナカライテスク公司)和1×HT添加剂(インビトロ-ジエン公司制造)的伊思考夫改良的杜尔贝科培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)(インビトロ-ジエン公司)]中传代的DG44细胞悬浮于K-PBS缓冲液[137毫摩尔/升KCl、2.7毫摩尔/升NaCl、8.1毫摩尔/升Na2HPO4、1.5毫摩尔/升KH2PO4、4.0毫摩尔/升 6 6 MgCl2]中，使其达到8×10 个/mL，制备细胞悬浮液。将200μL(1.8×10 个)制备好的细胞悬浮液与10μg上述(1)中制备的线性化质粒pKAN932B8PVHmIgA混合。但是，Lec8细胞的传代在未添加1×HT添加剂的基本培养基(以下记为HT-培养基)中进行。将该细胞DNA混合液转移到Gene Pulser的电击杯(电极之间的距离为2mm)(BIO-RAD公司)中，然后，使用基因导入装置Gene Pulser(BIO-RAD公司)，在脉冲电压为0.35KV、电容为250μF的条件下进行基因导入。将该细胞悬浮液混合到30mL的HT-培养基[添加有10%胎牛透析血清(インビトロ-ジエン公司制造)和50μg/mL庆大霉素(ナカライテスク公司)的伊思考夫改良的杜尔贝科培养基(インビトロ-ジエン公司制造)]中，以100μL/孔接种到3块96孔板上。接种2天后，更换为含有500μg/mL G418的传代用培养基，培养10天。10天后，更换为含有50nM MTX(Sigma aldrich公司制造)的HT-培养基，获得MTX抗性株。将Lec8株来源的膜型免疫球蛋白表达株命名为mIgA/Lec8，另一方面，将DG44细胞来源的膜型免疫球蛋白A表达细胞命名为mIgA/DG44。 [0375] 实施例2 [0376] 糖链缺陷型IgA1-Fc融合蛋白的制备 [0377] 为了获得可溶性mIgA1蛋白，设计了使mIgA1细胞外区部分与人IgG4Fc连接而成的Fc融合蛋白mIgA1-Fc。具体而言，利用PCR法制作使mIgA1细胞外区的一部分与人IgG4Fc连接而成的基因片段，将其插入实施例1中得到的pKAN932B8PVHmIgA中，由此，制备Fc融合mIgA1表达载体pKANTEX-mIgA1-Fc。将该表达载体导入CHO/DG44细胞株和Lec8细胞株中，向培养基中添加500μg/mL的G418，由此筛选基因导入细胞。将筛选出的基因导入细胞在无血清培养基Excell-302(SAFC公司)中培养一周，得到含有mIgA1-Fc的培养上清。使用Mabselect(GE Healthcare公司)柱，依照附带的说明书从约1升的培养上清中进行纯化，获得各自约为5mg的DG44来源mIgA1-Fc和Lec8来源mIgA1-Fc。将所得到的各mIgA1-Fc供于SDS-PAGE分析，考察分子量和纯化度(图6)。另外，为了确认纯化蛋白的修饰糖链，实施以下的酶免疫测定法。向96孔的EIA用板(Greiner公司)中以50μL/孔分注1μg/mL的DG44来源的mIgA1-Fc或Lec8来源的mIgA1-Fc或者人IgG4(SIGMA公司)，在4℃下放置过夜使其进行吸附。洗涤后，以100μL/孔加入1%BSA-PBS，在室温下反应1小时，对残余的活性基团进行封闭。弃去1%BSA-PBS，以50μL/孔分注用PBS稀释的小鼠抗人IgA1单克隆抗体B3506B4(Beckman Coulter公司)或小鼠抗Tn抗原抗体22-1-1(MBL公司)作为一次抗体，使其反应2小时。用0.05%吐温-PBS洗涤后，以50μL/孔加入稀释后的过氧化物酶标记抗小鼠免疫球蛋白(DAKO公司)作为二次抗体，在室温下反应1小时，用0.05%吐温-PBS洗涤后，使用ABTS[2.2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵]底物液[1毫摩尔/升ABTS、0.1摩尔/升柠檬酸缓冲液(pH4.2)、0.1%H2O2]进行显色，使用酶标仪(MULTISKAN SPECTRUM，Thermo公司)测定样品波长415nm、参比波长490nm下的吸光度(OD415-OD490)。结果，确认到抗IgA1抗体与DG44来源的mIgA1-Fc和Lec8来源的mIgA1-Fc结合，而另一方面，确认到抗Tn抗原抗体仅与Lec8来源mIgA1-Fc结合(图7)。由以上确认，Lec8来源的mIgA1-Fc具有Tn抗原型O连接型糖链。 [0378] 实施例3 [0379] 抗Tn抗原附加型IgA1的铰链区的单克隆抗体的制作 [0380] (1)作为免疫原的糖肽的制备 [0381] 使用自动合成计(岛津制作所)，合成如下的肽(Tn附加型IgA1铰链肽，序列号16)：在人IgA1(IgA1)铰链区氨基酸序列(从氨基末端数第223位至第240位的氨基酸)的第230位和第232位的丝氨酸(Ser)以及第225位、第228位和第236位的苏氨酸(Thr)上通过α连接附加有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，进而为了与载体蛋白结合而在氨基末端附加有半胱氨酸(Cys)。为了提高免疫原性，通过以下的方法制作与KLH(和光纯药公司)的结合物，作为免疫原。即，将KLH溶解于PBS中并调节至10mg/mL，滴加1/10体积的25mg/mL的MBS[N-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯](ナカライテスク公司)，搅拌30分钟使其反应。利用预先用PBS平衡化的セフアデツクスG-25柱等凝胶过滤柱除去游离的MBS，将2.5mg所得到的KLH-MBS与溶解在0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中的1mg肽混合，在室温下搅拌3小时使其反应。反应后，将用PBS透析而得到的物质作为免疫原。 [0382] (2)动物的免疫和抗体产生细胞的制备 [0383] 将100μg通过(1)所示的方法制备的Tn抗原附加型IgA1铰链肽-KLH结合物连9 同2mg铝凝胶和1×10 个细胞的百日咳疫苗(千叶县血清研究所制造)一起施用给4周龄的雌性SD大鼠(日本エスエルシ-公司)，从2周后开始每周施用一次100μg的结合物，共计4次。从尾静脉采血，通过以下所示的酶免疫测定法考察对来源于人血浆的Tn抗原附加IgA1的反应性，在末次免疫3天后从显示充分抗体效价的大鼠中摘除脾脏。将脾脏在MEM培养基(日水制药公司)中细细切碎，用镊子搅散，离心分离(1200rpm，5分钟)后，弃去上清，用Tris-氯化铵缓冲液(pH7.65)处理1~2分钟以除去红细胞，用MEM培养基洗涤3次，用于细胞融合。 [0384] (3)酶免疫测定法 [0385] 使用人血浆来源IgA1(BIOPUR公司)作为分析用的阴性对照抗原，使用Tn抗原型人IgA1作为阳性对照抗原。Tn抗原型人IgA1通过如下方法得到：使5U/mL的β-半乳糖苷酶(ProZyme公司，GKX-5013)、1U/mL的神经氨酸酶(ナカライ公司，24229-61)在37℃下与人血浆来源IgA1作用过夜，将正常糖链转换为Tn抗原。另外，为了排除仅识别Tn抗原的抗体，与IgA1同样地对人血浆来源的C1抑制物蛋白(ZLB ベ-リング，商品名ベリナ-ト)进行酶处理，将所得到的Tn抗原型C1抑制物也作为阴性对照抗原使用。向96孔的EIA用板(グライナ-公司)中以50μL/孔分别分注2.5μg/mL的各抗原，在4℃下放置过夜使其进行吸附。洗涤后，以100μL/孔加入1%BSA-PBS，在室温下使其反应1小时，对残余的活性基团进行封闭。弃去1%BSA-PBS，以50μL/孔分注杂交瘤的培养上清或被免疫大鼠抗血清作为一次抗体，使其反应2小时。用0.05%吐温-PBS洗涤后，以50μL/孔加入稀释后的过氧化物酶标记抗大鼠免疫球蛋白(ダコ公司)作为二次抗体，在室温下使其反应1小时，用0.05%吐温-PBS洗涤后，使用ABTS[2.2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵]底物液[1毫摩尔/升ABTS、0.1摩尔/升柠檬酸缓冲液(pH4.2)、0.1%H2O2]进行显色，使用酶标仪(Emax；Molecular Devices公司)测定样品波长415nm、参比波长490nm下的吸光度(OD415-OD490)。 [0386] (4)小鼠骨髓瘤细胞的制备 [0387] 将8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤细胞系P3-U1在正常培养基中进行培养，确保细7 胞融合时达到2×10 以上的细胞，作为亲本株供于细胞融合。 [0388] (5)杂交瘤的制作 [0389] 将(2)中得到的大鼠脾细胞与(4)中得到的骨髓瘤细胞以10:1的比例进行混合，离心分离(1200rpm、5分钟)后，弃去上清，将沉淀的细胞群充分搅散，然后，在搅拌的同时8 在37℃下以每10 个小鼠脾细胞为0.5mL的量加入1g聚乙二醇-1000(PEG-1000)、1mL MEM培养基和0.35mL二甲亚砜的混合溶液，并每隔1~2分钟向该悬浮液中加入1mLMEM培养基，重复数次后，加入MEM培养基至总量达到50mL。离心分离(900rpm、5分钟)后，弃去上清，轻轻地将细胞搅散后，通过用刻度吸管吸入并吹出，轻轻地将细胞悬浮于100mL HAT培养基[在添加有10%胎牛血清的RPMI培养基中加入HAT培养基添加剂(Invitrogen公司)而得到的培养基]中。将该悬浮液以200μL/孔分注到96孔培养用板中，在5%CO2的培养箱中在37℃下培养10~14天。通过(3)中记载的酶免疫测定法对该培养上清进行考察，选出与Tn抗原型人IgA1特异性反应的孔，重复克隆两次，从而建立生产抗Tn抗原附加mIgA铰链肽单克隆抗体的杂交瘤株KM4137、4138、4139、4140、4144。通过使用亚类特异性的二次抗体的酶免疫测定法对抗体类别进行考察，确定KM4137、KM4138、KM4139、KM4144为大鼠IgG2a，KM4140为大鼠IgG2b。它们的抗体类别示于表2中。 [0390] [表2] [0391]KM No. 动物种类 抗体类别 KM4137 大鼠 IgG2a KM4138 大鼠 IgG2a KM4139 大鼠 IgG2a KM4140 大鼠 IgG2b KM4144 大鼠 IgG2a [0392] 需要说明的是，还实施了数次对Balb/c小鼠和BxSB狼疮小鼠免疫(1)项中制备的糖肽-KLH融合蛋白的实验，但无法得到Tn抗原型铰链区特异性的单克隆抗体。另外，还实施了数次对SD大鼠和Balb/c小鼠免疫实施例1中建立的在细胞膜上高表达Tn抗原型IgA1的CHO细胞株(mIgA/Lec8)的实验，但无法得到Tn抗原型铰链区特异性的单克隆抗体。进而，还实施了数次对SD大鼠和Balb/c小鼠免疫实施例2中建立的Tn抗原型IgA1-Fc融合蛋白的实验，但无法得到Tn抗原型铰链区特异性的单克隆抗体。 [0393] (6)单克隆抗体的纯化 [0394] 将(5)中得到的杂交瘤株分别以5~20×106细胞/只的量对姥鲛烷处理后的8周龄雌性裸鼠(Balb/c)进行腹腔内注射。10~21天后，杂交瘤产生癌性腹水。从积存有腹水的小鼠中收集腹水(1~8mL/只)，离心分离(3000rpm、5分钟)除去固体成分，然后，利用辛酸沉淀法(Antibodies-A Laboratory manual，冷泉港实验室，1988)进行纯化，制成纯化的单克隆抗体。 [0395] 实施例4 [0396] 抗Tn抗原附加mIgA铰链肽单克隆抗体的反应性 [0397] (1)结合ELISA [0398] 通过实施例3的(3)中记载的酶免疫测定法，对所得到的单克隆抗体的反应特异性进行研究。KM4137~4140和KM4144均对Tn抗原型人IgA1显示出特异性的反应性，对人IgA1和Tn抗原型C1抑制物不反应(图8)。 [0399] (2)竞争性酶免疫测定法 [0400] 为了对建立的单克隆抗体的结合特异性进行评价，实施以下的竞争性酶免疫测定法。向96孔的EIA用板(Greiner公司)中以50μL/孔分注2.5μg/mL的实施例3的(3)中制备的Tn抗原型人IgA1，在4℃下放置过夜使其吸附。洗涤后，以100μL/孔加入 1%BSA-PBS，在室温下反应1小时，对残余的活性基团进行封闭。弃去1%BSA-PBS，以25μL/孔分注Tn抗原型人IgA1或人血浆来源的IgA1作为竞争物质，进而，作为一次抗体，将实施例3中建立的各杂交瘤的培养上清制备成约1μg/mL的抗体浓度，以25μL/孔分注到板中，使其反应2小时。用0.05%吐温-PBS洗涤后，以50μL/孔加入稀释后的过氧化物酶标记抗大鼠免疫球蛋白(DAKO公司)作为二次抗体，在室温下使其反应1小时，用0.05%吐温-PBS洗涤后，使用ABTS[2.2-连苯基双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵]底物液[1毫摩尔/升ABTS、0.1摩尔/升柠檬酸缓冲液(pH4.2)、0.1%H2O2]进行显色，使用酶标仪(MULTISKAN SPECTRUM，Thermo公司)测定样品波长415nm、参比波长490nm下的吸光度(OD415-OD490)。使用大鼠抗阿维菌素抗体KM1762作为阴性对照抗体，使用大鼠抗人IgA单克隆抗体LO-HA-9(P.A.R.I.S公司)作为阳性对照。结果可知，在使用Tn抗原型人IgA1作为竞争物质的情况下，建立的单克隆抗体显示出依赖于竞争物质浓度的吸收，而且在比使用人血浆来源IgA1作为竞争物质时低约100倍~约1000倍的竞争物质浓度下有吸收(图 9)。由以上表明，建立的单克隆抗体均对Tn抗原型人IgA1具有高结合特异性。 [0401] (3)与Tn抗原型人IgA1或人血浆来源IgA1的结合活性的测定 [0402] 利用表面等离子体共振法进行结合活性测定。以下的操作全部使用Biacore T-100(Biacore公司)来进行。通过胺偶联法将抗小鼠免疫球蛋白抗体(ビアコア公司)固相化于CM5传感芯片(Biacore公司)上，使抗体浓度已知的各杂交瘤的培养上清在芯片上流过，以捕获各抗体。然后，使利用HBS-EP+缓冲液(Biacore公司)从2μg/mL开始以六个梯度进行稀释后的Tn抗原型人IgA1或人血浆来源IgA1以30μL/分钟的速度在芯片上流过，对各浓度下的传感图进行分析，使用动力学分析(1:1结合模式)计算出各抗体对Tn抗原型人IgA1的结合速度常数和解离速度常数。Biacore-T100的内部温度设定为25℃，在每次抗体的结合中使用pH1.5的甘氨酸缓冲液(Biacore公司)对芯片进行再生。结果，所-8有的单克隆抗体均对Tn抗原型人IgA1显示出解离常数约为10 [M]的亲和性，与此相对，未观察到与人血浆来源IgA1进行结合(表3)。由以上表明，建立的单克隆抗体均对Tn抗原型人IgA1具有高结合特异性和高亲和性。 [0403] [表3] [0404]Ka[1/Ms] Kd[1/s] KD[M] KM4137 4.07×104 7.13×10-4 1.75×10-8 KM4138 3.83×103 7.65×10-4 2.00×10-7 KM4139 4.21×104 6.21×10-4 1.47×10-8 KM4140 1.68×104 1.24×10-3 7.40×10-8 KM4144 4.36×104 8.87×10-4 2.03×10-8 [0405] (4)与mIgA1表达转染体的反应性评价 [0406] 将实施例(1)中建立的表达mIgA的DG44细胞株和表达mIgA1的Lec8细胞株的5×105个细胞在建立的各杂交瘤的培养上清50μL中悬浮，在4℃下使其反应1小时。反应后，使用含有0.05%NaN3的PBS离心分离3次而进行洗涤，然后，添加50μL将Alexa488标记山羊抗大鼠IgG(H+L)抗体(Invitrogen公司)或Alexa488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Invitrogen公司)用1%BSA-PBS稀释300倍而得到的溶液，悬浮后在4℃下反应1小时。反应后，使用含有0.05%NaN3的PBS离心分离3次而进行洗涤，然后，悬浮于500μL含有0.05%NaN3的PBS中，使用流式细胞仪FACS Calibur(BD Biosciences公司)进行分析。 使用小鼠抗ND28单克隆抗体KM511(日本特开平08-165300号)或大鼠抗阿维菌素单克隆抗体KM1762(Clin Cancer Res.,2005May1;11(9):3494-502)作为阴性对照抗体，使用小鼠抗Tn抗原单克隆抗体22-1-1(MBL公司)或大鼠抗人IgA单克隆抗体LO-HA-9(P.A.R.I.S公司)作为阳性对照。结果确认，建立的单克隆抗体均不与表达mIgA1的DG44细胞结合而与表达mIgA1的Lec8细胞特异性结合(图10)。由于表达mIgA1的Lec8细胞表达Tn抗原型mIgA1，因此暗示，建立的单克隆抗体能够识别存在于细胞表面上的Tn抗原型mIgA1。 [0407] (5)人血清中的Tn抗原型IgA1的定量 [0408] 为了构建人血清中的糖链缺陷IgA1的检测系统，实施以下的酶免疫测定法。作为受试物质，使用将Tn抗原型人IgA1或人血浆来源的IgA1用人血清(SIGMA公司)稀释后得到的溶液。以50μL/孔分注xμg/mL的实施例3中纯化的KM4137、KM4140、KM4144或大鼠抗人IgA单克隆抗体LO-HA-9(P.A.R.I.S公司)，在4℃下放置过夜使其进行吸附。洗涤后，以100μL/孔加入1%BSA-PBS，在室温下反应1小时，对残余的活性基团进行封闭。弃去1%BSA-PBS，以50μL/孔分注用PBS稀释的受试物质，使其反应1小时。用0.05%吐温-PBS洗涤后，以50μL/孔加入稀释后的过氧化物酶标记小鼠抗人IgA1单克隆抗体B3506B4(Beckman Coulter公司)作为二次抗体，在室温下使其反应1小时，用0.05%吐温-PBS洗涤后，使用ABTS[2.2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵]底物液[1毫摩尔/升ABTS、0.1摩尔/升柠檬酸缓冲液(pH4.2)、0.1%H2O2]进行显色，使用酶标仪(MULTISKAN SPECTRUM，Thermo公司)测定样品波长415nm、参比波长490nm下的吸光度(OD415-OD490)。结果，在吸附有抗人IgA单克隆抗体的板上，Tn抗原型人IgA1或人血浆来源IgA1均被同样地检出，而另一方面，在吸附有建立的KM4137、KM4140、KM4144的板上，仅以依赖于添加浓度的方式检测到Tn抗原型人IgA1(图11)。由以上表明，通过使用KM4137、KM4140、KM4144的酶免疫测定法，能够仅对糖链缺陷型人IgA1进行特异性检测并定量。 [0409] 实施例5 [0410] 为了对建立的抗Tn抗原附加mIgA铰链肽单克隆抗体KM4137、KM4140和KM4144的竞争抑制活性进行评价，实施以下的竞争性酶免疫测定法。向96孔的nunc maxisorp板(NUNC公司)中以50μL/孔分注25μg/mL的实施例3的(3)中制备的Tn抗原型人IgA1，在4℃下放置过夜使其进行吸附。洗涤后，以200μL/孔加入1%BSA-PBS，在室温下反应1小时，对残余的活性基团进行封闭。弃去1%BSA-PBS，以25μL/孔分注实施例3中纯化的抗Tn抗原附加mIgA铰链肽单克隆抗体KM4137、KM4140或KM4144作为竞争物质，进而，作为一次抗体，将实施例3中纯化的抗Tn抗原附加mIgA铰链肽单克隆抗体进行生物素标记，分别制备成2μg/mL、0.16μg/mL和10μg/mL的生物素标记KM4137、生物素标记KM4140和生物素标记KM4144，分别以25μL/孔进行分注，并使其反应1小时。用0.05%吐温-PBS洗涤后，以50μL/孔加入稀释后的过氧化物酶标记链亲和素(Sigma-Aldrich公司)作为二次抗体，在室温下使其反应1小时，用0.05%吐温-PBS洗涤后，使用ABTS[2.2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵]底物液[1毫摩尔/升ABTS、0.1摩尔/升柠檬酸缓冲液(pH4.2)、0.1%H2O2]进行显色，使用酶标仪(MULTISKAN SPECTRUM，Thermo公司)测定样品波长415nm、参比波长490nm下的吸光度(OD415-OD490)。使用大鼠抗阿维菌素抗体KM1762作为阴性对照抗体。结果表明，建立的抗Tn抗原附加mIgA铰链肽单克隆抗体KM4137、KM4140和KM4144对Tn抗原附加mIgA铰链区存在相互竞争(图12)。 [0411] 产业上的可利用性 [0412] 根据本发明，能够提供一种单克隆抗体或该抗体片段，其特异性识别并结合由免疫球蛋白A1的重链基因编码的多肽的铰链区，所述铰链区包含未结合半乳糖的丝氨酸苏氨酸连接型糖链；并且能够提供使用该抗体或抗体片段的诊断剂或者含有该抗体或抗体片段作为有效成分的治疗剂。 [0413] 保藏编号 [0414] IPOD FERM BP-11214 [0415] IPOD FERM BP-11215 [0416] IPOD FERM BP-11216 [0418] 序列号1-人IgA1铰链区氨基酸序列 [0419] 序列号2-人IgA1重链氨基酸序列 [0420] 序列号3-人IgA1铰链区DNA序列 [0421] 序列号4-人工序列的记载：RitNotNheIfw [0422] 序列号5-人工序列的记载：RitNotNheIrv [0423] 序列号6-人工序列的记载：pCR2B8PVH [0424] 序列号7-人工序列的记载：Ig-a-NheI [0425] 序列号8-人工序列的记载：Ig-b-BamHI [0426] 序列号9-人工序列的记载：pCRIgA [0427] 序列号10-人工序列的记载：AMD-A [0428] 序列号11-人工序列的记载：AMD-A [0429] 序列号12-人工序列的记载：AMDBamHIfw [0430] 序列号13-人工序列的记载：AMDSpeIrv [0431] 序列号14-人工序列的记载：pCRmIgA [0432] 列号15-人工序列的记载：膜型IgA1序列 [0433] 序列号16-Tn附加型IgA1铰链肽氨基酸序列 |
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