一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 |
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| 申请号 | CN201610223375.3 | 申请日 | 2016-04-12 | 公开(公告)号 | CN105891508A | 公开(公告)日 | 2016-08-24 |
| 申请人 | 上海奥普生物医药有限公司; | 发明人 | 朱传增; 石晓强; 朱奇朗; 安永君; 张蕾; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开一种快速定量检测H?FABP的时间分辨 荧光 免疫层析 试剂 及其制备方法，属于临床医学诊断领域。该试剂由 试纸 条和荧光液两部分组成。其中，试纸条包括 底板 、Fusion5、 硝酸 纤维 素膜和吸 水 垫；所述Fusion5、硝酸 纤维素 膜和吸水垫水平方向顺序连接固定于底板上。所述硝酸纤维素膜上包被有H?FABP单克隆 抗体 1的检测线和兔IgG抗体构成的质控线。荧光液包含H?FABP单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球。本发明利用时间分辨荧光微球提高荧光强度，降低背景 信号 ，同时定量检测 全血 、血清或 血浆 中的H?FABP含量,样本仅需要10～20微升。该试纸条具有方便快捷、操作简单、检测时间短、特异性强、灵敏度高、检测结果更加准确，适用于临床POCT的快速诊断。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，其特征在于：该试剂由试纸条和荧光液两部分组成；所述的试纸条包括底板(1)、Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)； |
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| 说明书全文 | 一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法 技术领域[0001] 本发明属于临床医学诊断领域，具体涉及一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法。 背景技术[0002] 脂肪酸结合蛋白(FABPs)在活性脂肪酸代谢的组织中大量存在，如心脏和肝脏，它们的主要功能促进细胞内的长链脂肪酸运输。现已确定九个不同类型的FABP，其中，H-FABP(心脏型脂肪酸结合蛋白)是最广泛的，因为它大量存在于心肌细胞。其低分子量和细胞质的位置相结合，使H-FABP成为急性冠脉综合症(尤其是胸痛发作6小时内)的一个高敏的早期标志物，缺血性发作30分钟后即可检测。这可能是因为在心肌缺血和心肌坏死以后，它迅速从细胞质进入血液循环。H-FABP在6-8小时左右达到浓度峰值，然后在24-30小时左右恢复至正常水平。如此迅速恢复至正常水平得益于高肾清除率，这意味着H-FABP不仅能够用作AMI早期标志物，还是理想的心肌梗死复发诊断标志物。尽管H-FABP的释放特点与肌红蛋白相似，但其心肌特异性是肌红蛋白的15-20倍；因此H-FABP是更有效的心肌损伤标志物。此外，H-FABP的正常血清/血浆值比肌红蛋白低，从而降低假阳性比率。 [0003] 相较于单独使用肌钙蛋白的情况，使用H-FABP和肌钙蛋白的组合已证实，在症状出现后的早期(<4小时或<6小时)，可显著改善MI/ACS的诊断敏感性。关于预后，一些大型临床试验中肌钙蛋白阳性和肌钙蛋白阴性的患者分层长期ACS的风险已经说明了H-FABP的价值。即使在使用高度敏感的肌钙蛋白的情况下，诊断和预后，也常增添H-FABP。除了ACS，H-FABP还用于其他范围，例如肺栓塞(PE)，冠状动脉搭桥手术(CABG)和脑血管疾病。 [0004] 时间分辨荧光(TRF)分析技术是以具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合剂作为示踪物，建立的一种新型的非放射性微量分析技术。自从1983年Pettersson等采用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)法定量测定hCG以来，TRFIA方法学研究和临床应用发展迅速，成为既RIA之后标记免疫分析发展的一个新的里程碑，国内外相继研制出了多钟TRFIA仪和配套的商业化试剂盒。TRFIA技术具有灵敏度高、标准曲线范围宽、操作简便、无放射性污染、多标记等优点，广泛地应用于肿瘤、传染病、内分泌疾病、自身免疫性疾病、遗传性疾病的临床实验室诊断，已成为生物医学研究和临床超微量生化检验常用的分析手段之一。将TRF、聚苯乙烯微球及硝酸纤维素膜结合，可用于快速体外诊断领域。专利(ZL03819391.4)涉及一种采用时间分辨荧光的基于膜的检测，用于检测测试样本中分析物的存在和含量；专利(CN 202149903 U)发明C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测；专利(CN 202166649 U)发明新喋呤时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条；专利(CN 102879559 A)发明一种时间分辨荧光免疫层析即时定量检测试剂盒方法；专利(CN 103760368 A)发明一种AFP和Free-β-HCG时间分辨荧光双标的定量检测试剂盒；专利(CN 204514928 U)发明一种基于时间分辨荧光免疫层析法检测胃蛋白酶原I和II的试纸条以及其应用的试纸条。 [0005] 专利(CN 2783324 Y)发明一种心血管疾病诊断和预测多指标蛋白芯片检测试剂盒，用于CRP、Myo、cTnI、cTnT、NT-proBNP、CKMB、H-FABP、GPBB的联合检测。 [0006] 专利(CN 102226811B)发明一种检测尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白诊断试剂的制备方法，主要采用固相胶体金免疫层析法。 [0007] 专利(CN102520194B)发明一种定量检测人心脏脂肪酸结合蛋白的荧光免疫层析试剂盒，主要采用基于量子点标记的固相免疫层析法。 [0008] 专利(CN102608325A)发明一种脂肪酸结合蛋白测定试剂盒，主要采用胶乳增强免疫比浊法。 [0009] 专利(CN102628864B)发明一种胶乳增强免疫比浊法测定血清或尿液中心脏型脂肪酸结合蛋白的试剂盒。 [0010] 专利(CN102788880A)发明一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及其制备方法，主要采用免疫比浊法。 [0011] 专利(CN103123319B)发明一种心型脂肪酸结合蛋白含量检测试剂盒及其制备方法，主要采用胶乳增强免疫比浊法。 [0012] 专利(CN103543272A)发明一种同时检测心型脂肪酸结合蛋白和肌钙蛋白I的快速定量检测装置及检测方法，主要采用胶体金免疫层析法。 [0013] 专利(CN104215772A)发明一种心脏型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及其制备方法，主要采用胶乳增强免疫比浊法。 [0014] 专利(CN104330576A)发明一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂及其制备方法，主要采用胶体金颗粒进行标记。 [0015] 专利(CN104678098A)发明一种心肌肌钙蛋白I和心型脂肪酸结合蛋白联检试纸制备方法，主要采用胶体金固相免疫层析方法。 [0016] 专利(CN104714015A)发明一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及检测方法，主要采用固相荧光免疫层析法。 [0017] 专利(CN203490224U)发明一种人心脏型脂肪酸结合蛋白免疫层析试纸条，主要采用上转发光固相免疫层析法。 [0018] 专利(CN204228721U)发明一种心型脂肪酸结合蛋白定量检测试纸条，主要采用固相荧光免疫层析法。 [0019] 专利(CN204287199U)发明一种心脏型脂肪酸结合蛋白免疫层析定量检测试纸条，主要采用固相荧光免疫层析法。 [0020] 专利(CN204405681U)发明一种用于心型脂肪酸结合蛋白检测的试纸条，主要采用量子点荧光免疫层析法。 [0021] 目前，H-FABP检测的方法主要有酶联免疫吸附法、胶乳增强免疫比浊法、胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法等。酶联免疫吸附法操作复杂、检测时间长、检测范围窄；胶乳增强免疫比浊需要结合大型仪器，成本高；胶体金免疫层析法定性或定量检测，灵敏度低、线性范围窄，不能满足定量、准确检测的要求；荧光免疫层析法大多数采用荧光素或其他物质作为发光源，虽然有较高的线性范围，但受背景信号的干扰，不能够保证低端灵敏度。 [0022] 尽管时间分辨荧光免疫层析法已经广泛用于多种项目的检测，但是大多数都采用将时间分辨荧光微球固定在结合物释放垫上，由于微球的释放不均一，导致不精密度很大，无法满足灵敏度要求高的项目，尤其是肌钙蛋白I的检测。此外，为了检测全血样本，多数厂家的样品垫采用人工处理过玻璃纤维作为结合物释放垫，同样增加了不精密度。 [0023] 综上所述，在H-FABP定量检测时，迫切需要一种样本量少、精密度高、检测背景信号低、灵敏度高、线性范围宽、样品垫不需处理就能检测全血样本的时间分辨荧光免疫层析试剂。 发明内容[0024] 本发明的目的是提供一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂，该试剂能在较短的检测时间内完成H-FABP的检测，检测时间短，检测灵敏度高。 [0025] 本发明还提供了快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂的制备方法。 [0026] 一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂由试纸条和荧光液两部分组成 [0028] 所述Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)水平方向顺序连接固定于底板上。 [0029] 所述的荧光液(7)包含H-FABP单克隆抗体2标记的时间分辨荧光微球、羊抗兔抗体标记的时间分辨荧光微球 [0030] 所述硝酸纤维素膜(3)上包被有H-FABP单克隆抗体1(5)、的检测线和兔IgG抗体(6)构成的质控线。 [0031] 所述的时间分辨荧光微球选自修饰过的聚苯乙烯微球。 [0033] 所述的时间分辨荧光微球内部填充镧系元素的螯合物。 [0034] 所述的镧系元素为铕、钐、鈊、镝中的一种。 [0035] 所述的时间分辨荧光微球标记步骤如下： [0036] (1)H-FABP单克隆抗体2标记时间分辨荧光微球的制备及稀释： [0037] 将时间分辨荧光微球溶于MES缓冲液中，加入活化剂活化；随后加入氨基乙酸，使得微球表面连接手臂；洗涤、离心后，再次加入活化剂活化；再次洗涤、离心，将时间分辨荧光微球用硼酸缓冲液复溶，随后加入H-FABP单克隆抗体2进行反应，硼酸缓冲液、微球与抗体的质量比为10mg:0.01mg～10mg：2.0mg；反应完后加入封闭剂进行封闭；封闭过后，洗涤、离心，再次用硼酸缓冲液及封闭剂复溶、超声，使微球均匀分散在缓冲液中，2-8℃避光保存。选择合适的缓冲液稀释荧光微球，工作浓度在0.5～50μg/ml，用于H-FABP性能的评估。 [0038] (2)羊抗兔抗体标记的荧光微球的制备及稀释过程同(1)所述。 [0039] 优选的，采用铕粒子螯合物填充的时间分辨荧光微球，粒径为：100～500nm； [0040] 优选的，微球与抗体的包被比例为：10mg:0.01mg～10mg：2.0mg； [0041] 优选的，荧光液的工作浓度为：0.5～50μg/ml； [0042] 一种快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂及制备方法，包括如下步骤： [0043] (1)制备检测线和质控线：硝酸纤维素膜(3)在免疫荧光试纸条中用于固定包被抗体，同时也是免疫反应的发生的场所；检测线(5)是将H-FABP单克隆抗体1使用柠檬酸盐或蔗糖稀释液稀释，划线于所述硝酸纤维素膜(3)上；质控线(6)是将兔IgG抗体使用柠檬酸盐或蔗糖稀释液稀释，划线与所述硝酸纤维素膜(3)上。将划好的硝酸纤维素膜置于真空干燥箱(37～45℃)，烘干24～48小时。检测线(5)位于质控线(6)左侧，即液体首先接触的位置； [0044] (2)试纸条的组装：试纸条底板(1)由左到右依次粘附Fusion5(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水纸(4)。将组装好的大板切成小条，即得到所述快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试纸条。 [0045] 优选的，柠檬酸盐或蔗糖稀释液稀中柠檬酸盐或蔗糖占5-20％； [0046] 优选的，检测线和质控线抗体的划膜浓度为0.5～2mg/ml； [0047] 优选的，检测线和质控线抗体的划膜喷量为0.5～2.0μl/cm； [0048] 以上快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂的检测方法，其步骤包括： [0049] (1)标准曲线的绘制：取10～20μl的H-FABP标准品与80～500μl的荧光混合液(H-FABP、羊抗兔荧光液)混合，取混合液70～100μl滴加到试纸条的Fusion5上，反应时间15～20分钟，通过与试纸条配套的时间分辨免疫层析定量分析仪读取系统检测信号，然后以标准品的各浓度为横坐标，各浓度系统检测信号的平均值为纵坐标，拟合制备标准品曲线； [0050] (2)待测样品的检测，分别取10～20μl的待测样品与80～500μl的荧光混合液(H-FABP、羊抗兔荧光液)混合，取混合液70～100μl滴加到试纸条的Fusion5上，反应时间15～20分钟，通过系统检测信号的值即可得到待测样品中的H-FABP的浓度值。 [0051] 所述(1)中，H-FABP标准品的浓度分别为:0、1、2、5、10、20、40、80、120ng/ml； [0052] 本发明的有益效果是： [0053] (1)本发明采用Fusion5为样品垫，摒弃了传统的样品垫及结合物释放垫，无需预处理，可以进行全血、血清、血浆样本的检测，能够极大的提高检测精密度和准确性。 [0054] (2)本发明将荧光液置于硝酸纤维素膜之外，不同于传统方法将荧光微球固定于结合物释放垫上，不存在荧光微球释放不均一的现象，同样能够极大的提高检测精密度和准确性。 [0055] (3)本发明采用铕粒子螯合物填充的时间分辨荧光微球，由于其大的Stokes位移(激发波长为340nm左右，发射波长为615nm左右，差值为275nm左右)，能够明显降低背景信号值，提高检测的灵敏度。 [0057] 图1是本发明快速定量检测H-FABP的时间分辨荧光免疫层析试剂的结构示意图(1为底板、2为Fusion5、3为硝酸纤维素膜、4为吸水垫、5为H-FABP检测线、6为兔IgG质控线)： [0058] 图2是本发明H-FABP的标准品曲线； [0059] 图3是本发明奥普与胶乳增强免疫比浊H-FABP的相关性曲线； 具体实施方式[0060] 下面结合实施例，对本发明作进一步说明： [0061] 本发明中，H-FABP抗体和荧光微球的供应商和货号如下所示 [0062]抗体名称 目录号 厂家 Anti-h FABP3clone 2302 100292 Medix Anti-h FABP3clone 2303 100293 Medix 200nm荧光微球 FC02F Bangs laboratories [0063] 实施例1 [0064] H-FABP时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备： [0065] (1)检测线(T)溶液的制备：用10倍、50mM的柠檬酸盐溶液稀释H-FABP单克隆抗体1至1～2mg/ml； [0066] (2)质控线(C)溶液的制备：用用10倍、50mM的柠檬酸盐溶液稀释兔IgG抗体至1～2mg/ml； [0067] 在带有背胶的底板(1)上采用搭接的方式，首先粘贴硝酸纤维素膜(3)，然后再硝酸纤维素膜(3)的两端分别粘贴Fusion5膜(2)和吸水纸(4)。在硝酸纤维素膜(3)且靠近Fusion5膜(2)处，划T(H-FABP捕获线(5))、，在靠近吸水纸(4)的一端划C(兔IgG)线，T、C的间距为5mm。 [0068] 在T线处划T线，在C线处划C线。T线抗体的终浓度为1mg/ml，C线兔IgG的终浓度为1mg/ml，C、T线的喷量为1.0μl/cm。 [0069] 将喷好的大卡置于37℃恒温烘箱中烘烤24小时。烘烤完后，在湿度小于40％的房间，用切条机将其切成3.85mm宽度的试纸条，将其装入塑料壳中压实，然后装入一袋干燥剂，封口置于干燥柜中保存，待用。具体如图1所示。 [0070] 实施例2 [0071] H-FABP时间分辨荧光免疫层析试纸条的检测 [0072] (1)制备H-FABP、羊抗兔时间分辨荧光微球 [0073] 将时间分辨荧光微球(粒径为200nm左右)溶于100mM MES缓冲液(PH为6.0)中，加入活化剂(NHS,20mg/ml；EDC,20mg/ml)活化15分钟；洗涤、离心，将时间分辨荧光微球用60mM硼酸缓冲液(PH为8.5)复溶，随后加入H-FABP单克隆抗体2进行反应2小时(微球与抗体的质量比在10mg:0.5mg)；反应完后加入封闭剂(BSA，100mg/ml)进行封闭2小时；封闭过后，洗涤、离心，再次用60mM硼酸缓冲液(PH为8.5)及封闭剂(BSA，100mg/ml)复溶、超声，使微球均匀分散在缓冲液中，2-8℃避光保存。 [0074] 羊抗兔抗体标记的荧光微球的制备过程同H-FABP制备微球的过程相同。 [0075] (2)滴配 [0076] 用PH为8.0、200mM的Tris缓冲液将步骤(1)中的H-FABP、羊抗兔包被的荧光微球进行稀释。其中，H-FABP包被的荧光微球稀释200～300倍，羊抗兔包被的荧光微球稀释2000～3000倍，混合后即为所需要的荧光混合液。 [0077] (3)标准曲线的绘制 [0078] 用小牛血清稀释H-FABP标准品，浓度为：0、1、2、5、10、20、40、80、120ng/ml。分别取10μl混合标准品与80μl荧光混合液混合，再取80μl混合液滴加载实施例1中的H-FABP时间分辨荧光免疫层析试纸条上，反应15分钟后，通过与H-FABP时间分辨荧光免疫层析试纸条配套的免疫层析读数仪，读取系统检测信号，每个混合标准品的浓度检测三次，具体数值如表1所示。表1标准品检测值 [0079] [0080] [0081] 由表1数据可知，H-FABP的灵敏度可达1ng/ml，检测上限可达120ng/ml。本发明H-FABP检测性能均优于胶体金层析法，同胶乳增强免疫比浊试剂性能相近，体现出时间分辨荧光免疫层析法的优势。 [0082] (4)制作ID卡： [0083] 以标准品H-FABP浓度值为横坐标，各浓度的系统检测信号平均值为纵坐标，绘制标准品曲线，具体如图2所示，烧录ID卡，并导入配套仪器中。 [0084] 实施例3 [0085] 精密度检测 [0086] 用实施例2中的测试方法，测试H-FABP的标准品(浓度为10和80ng/ml)，每个标准品重复检测十次，具体检测数值如下表2所示。 [0087] 表2精密度测试结果表 [0088] [0089] [0090] 如表2数据可知，采用本发明的H-FABP检测试纸条，H-FABP的精密度小于10％，完全符合POCT产品精密度小于15％的要求。 [0091] 实施例4 [0092] 临床样本的相关性检测 [0093] 用实施例2中的测试方法，选取40例国外胶乳增强免疫比浊法检测H-FABP的临床样本(样本浓度覆盖标准品的检测范围)，采用上海奥普生物的H-FABP试剂进行检测。具体检测结果如表3所示。 [0094] 表3上海奥普三联检测与胶乳增强免疫比浊法检测数据 [0095] [0096] [0097] 以胶乳增强免疫比浊法检测的H-FABP浓度为横坐标，上海奥普生物检测H-FABP浓度为纵坐标，绘制样本相关性曲线。如图3。其中，H-FABP的相关性方程为y＝0.935x+1.163，相关性系数R大于0.95，完全符合临床试验的要求。 |
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