[0001] 本发明属于临床诊断学领域。具体来说，本发明涉及通过测定标志肽的水平在中风患者中进行结果预后和风险评估。

[0002] 发明背景

[0003] 中风被定义为由脑血管疾病引起的急性局灶性神经功能缺损。中风的两种主要类型是缺血性和出血性中风，分别占约85％和15％(Hickey 2003.《神经和神经外科护理临床实践》第五版(The clinical practice of neurological and neurosurgical nursing)th(5 ed.)，Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins)。当发生缺血性中风时，脑的血液供应中断，脑细胞被剥夺葡萄糖和氧。约45％的缺血性中风由小或大的动脉血栓引起，20％源于栓子，其余的原因未知(Hickey 2003.《神经和神经外科护理临床实践》第五版(The th
clinical practice of neurological and neurosurgical nursing)(5 ed.)，Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins)。

[0004] 短暂性缺血性发作(TIA)(也称为“小中风”)是一种综合征，其特征为个别神经症状突然发作，并在24小时内完全消解。0.5-8％的老年人群可能报告TIA(Bots等，1997.Stroke 28(4):768-73)。表现出TIA的患者处于随后不利事件的高风险中。已报道，90-天中风风险超过10％，最高风险出现在前两天内(Jonston等，2003.Neurology
60:1429-34)。

[0005] 中风是最重要的血管疾病之一。中风仍然是全世界死亡的第二大主因，在欧洲是成年人残疾和病废的主要原因之一(Murray和Lopez, 1997.Lancet 349:1269-76；Murray和Lopez 1997.Lancet 349:1498-504)。在美国，每年有超过700 000人患有中风，其中550,000人是第一次中风(Thom等，2006.“心脏病和中风统计数据——2006年更新：来自美国心脏协会统计委员会和中风统计学分委会的报告”(Heart disease and stroke statistics-2006update:A report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.Circulation 113:85-151)。因此，它是一个重要的公共卫生问题，并且对于保健提供者和整个社区来说是一个负担，因为在保健的计划和提供中不得不投入大量的工作。

[0006] 在我们的社会中，中风的发病率随着年龄增加而显著增加(Modan和Wagener,1992.Stroke 23:1230-36)。大多数缺血性中风发生在71到80岁之间，而大多数出血性中风出现在60到70岁之间(Colombo等，1989.Rivista de Neurologia 59:1-7)。

[0007] 神经放射成像法例如计算机断层成像术(CT)或磁共振断层成像术(MRT)被用于诊断中风。对于患有由脑溢血引起的急性中风的患者，推荐进行CT扫描。然而，这种方法在患有急性缺血性发作的患者中效率较低(灵敏度低于33％)。此外，多普勒超声显像法和数字减影血管造影术(DSA)可用于确定急性循环障碍的原因。

[0008] 缺血性中风的治疗一般集中于支持生命机能和康复性措施。疗法的目的在于通过打破血凝块或机械移除它来除去阻塞、使血凝块的增大降到最低并阻止新血凝块的形成。血栓溶解(血凝块的分解)可以通过在中风后前3个小时内施用纤溶酶原激活剂(tPA或PLAT)来诱导。因为一些疾病状态例如低血糖、偏头痛、脑溢血和某些脑肿瘤具有与急性缺血性中风类似的症状，因此对于快速鉴别诊断存在着需求。

[0009] 疗法还需要根据患者的个体情况、例如个体的预后和/或个体再次中风的风险，进行调整。

[0010] 中风患者在确定时间间隔后的结果预后可以是功能的，或与个体存活相关。对于功能结果的预后来说，使用计分系统例如“改良的评分量表(modified Ranking Scale)”(mRS；Bonita和Beaglehole,1988.“评级量表的改良：在中风后运动功能的恢复”(Modification of Ranking Scale:Recovery of motor function after stroke)，Stroke 19:1497-1500)或“国立卫生研究院中风量表”(National Institutes of Health Stroke Scale)(NIHSS；Adams等，1999.“基线NIH中风量表分值强烈预测中风后结果：
急性中风治疗的Org 10172试验(TOAST)报告”(Baseline NIH Stroke Scale score strongly predicts outcome after stroke:A report of the Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment(TOAST))，Neurology 53:126-31)来确定预定时间后患者的发病率，NIHSS目前是金标准。功能结果也可以根据对护理的需要或根据日常生活的活动(ADL)来表述，例如根据巴氏(Barthel)指数和评级量表(Collin等，1988.“巴氏ADL指数：可靠性研究”(The Barthel ADL Index:a reliability study)，International Disability Study 10:61-3；Bonita和Beaglehole,1988.“评级量表的改良：在中风后运动功能的恢复”(Modification of Ranking Scale:Recovery of motor function after stroke)，Stroke 19:1497-1500)。已经报道，一些生物标志物能够指示将来的心血管事件、例如再一次中风。已报道的潜在中风生物标志物是S-100B(血清蛋白100β；Stranjalis等，2007 Acta Neurochir(Wien)149:231-7；Foerch等，2005.Arch Neurol 62:1130-4)、NSE(神经元特异性烯醇化酶；Anand和Staed 2005.Cerebrovasc Dis 20:213-9)、GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白；Nylen等，2007.Stroke 38:1489-94)、CRP(C反应蛋白；Di Napoli等，2001.Stroke 32:133-8；Di Napoli等，2001.Stroke 32:917-24)、IL-6(白介素-6；Orion等，
2008.Eur J Neurol 15:323-8；Shenhar-Tsarfaty等，2007.Thromb Res 122:167-73)以及血浆纤维蛋白原(Turaj等，2006.J Neurol Sci 246:13-9)。

[0011] 已经显示，N-端proBNP(NT-proBNP)是缺血性中风后(Jensen 等，2006.Cerebrovasc Dis 22:439-44；Sharma 等，2006.J Stroke Cerebrovasc Dis 15:121-7；等，2005.Stroke 36:1016-20；Yip等，2006.Circ J 70:447-52)和出血性中风后(Sharma等，2006.J Stroke Cerebrovasc Dis 15:121-7)个体存活预后的一个独立变量。

[0012] 在患有缺血性中风的患者的样品中已经测定了成熟ANP(Estrada等，1994.Am J Hypertens 7:1085-9)和ADM(Hosomi等，2004.J Hypertens 22:1945-51)的水平。然而，没能显示出ANP浓度与神经状态(Mathew改良量表)或结果的关联性。

[0013] 在中风患者的血液中已经发现升高的ET-1浓度，但是没有调查这些数据的预 后 价 值 (Ziv 等，1992Stroke 23:1014-6；Alioglu 等，2002.Angiology 53:77-82；Giannopoulos等，2008.Neurol.Res.30(7):727-30)。已经发现，在缺血性中风后患者中的ET-1水平升高(Estrada等，1994.Am J Hypertens 7:1085-9)，但是没有确定与存活率的关联性。

[0014] 对患有急性中风的患者的血清降钙素原(PCT)水平的研究(Miyakis等，2004.Clin Chim Acta 350:437-9)，没有显示出在入院当天与第7天时的水平有显著差异。在该研究中没有发现PCT水平与死亡或神经结果的关联性。

[0015] 人生长激素(hGH)是由垂体中的促生长激素细胞产生的多肽。它以脉冲方式分泌(在每24小时的周期中10到20次脉冲)，并且其分泌受到三种下丘脑肽的调控，刺激hGH分泌的生长激素释放激素(GHRH)和生长激素释放肽(ghrelin)，以及通过反向调控抑制hGH分泌的生长素抑制因子(Kato等，2002.“人生长激素分泌的调控及其障碍”(Regulation of human growth hormone secretion and its disorders)，Internal Med 41:7-13)。

[0016] HGH是异质的，由几种分子同工型和片段组成(Baumann G.1991. “生长激素的异质性：基因、同工激素、变体和结合蛋白”(Growth hormone heterogeneity:genes,isohormones,variants and binding proteins)，Endocr Rev 12:424-449)。在人类垂体中已经鉴定到4种主要的hGH同工型，其氨基酸数量不同，并包括191个氨基酸(频率为87.5％)、176个氨基酸(8.1％)、153个氨基酸(3.3％)和145个氨基酸(11％)(Zhan X.等，
2005.“人类垂体中生长激素同工型的蛋白质组学分析”(Porteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary)，Proteomics 5:1228-41)。191个氨基酸形式的分子量为22kDa，与缺少32到46位氨基酸残基的176个氨基酸形式(20kDa同工型)从垂体腺前叶共同分泌(De Palo E.等，2006.“生长激素同工型和区段/片段：分子结构和实验室测量”(Growth hormone isoforms and segments/fragments:molecular structure and laboratory measurements)，Clin Chim Acta 365:67-76)。

[0017] 女性的hGH分泌比男性略高，其最高水平在青春期时观察到。分泌随着年龄每10年减少约14％。此外，分泌随着正常生理和病理生理状况而变。hGH分泌的主要生理调节机制是神经内源节律、睡眠、压力、运动以及营养和代谢信号：在慢波睡眠期间(典型为入睡后1至2小时)hGH水平较高，并被运动、压力、发烧、禁食和使用某些氨基酸(亮氨酸和精氨酸)所增加。HGH分泌也被胰岛素诱导的低血糖、L-多巴、可乐定(α2-肾上腺素能受体激动剂)、γ-羟基丁酸和β-肾上腺素能受体阻断剂所刺激，而口服给予葡萄糖和血清游离脂肪酸水平的增加抑制hGH的分泌。hGH分泌也在肥胖症中并随着衰老而减少。(综述在：Kato等，2002.“人类生长激素分泌的调控及其障碍”(Regulation of human growth hormone secretion and its disorders)，Internal Med 41:7-13)。

[0018] C-反应蛋白(CRP)是一种血浆蛋白，其最初由Tillett和Francis在1930年作为患有急性炎症的患者血清中与肺炎球菌的C多糖反应的物质而发现。已经显示，CRP基础水平升高的患者具有糖尿病、高血 压和心血管疾病的增加的风险(Pradhan等，2001.JAMA286:327-334；Dehghan.2007,Diabetes 56:872)。

[0019] 肌钙蛋白是三种调节蛋白的复合物，其在骨骼肌和心肌而不是平滑肌中是肌肉收缩所必需的。肌钙蛋白具有三个亚基：TnC、TnI和TnT。每种亚基起到不同作用：肌钙蛋白C(TnC)与钙离子结合，在TnI中产生构象变化。肌钙蛋白T与原肌球蛋白结合，使它们连锁以形成肌钙蛋白-原肌球蛋白复合物。肌钙蛋白I与细肌丝中的肌动蛋白结合，将肌钙蛋白-原肌球蛋白复合物保持在位。肌钙蛋白的某些亚型(心脏肌钙蛋白I和T)是心脏肌肉(心肌)损伤的非常灵敏和特异的指示物。它们在血液样品中的水平可用于在患有胸痛的患者中辨别不稳定心绞痛和心肌梗塞(心脏病发作)(Antman等，1996.N Engl J Med；335:1342-9)。

[0020] 发明概述

[0021] 本发明的主题是提供对已患过中风或短暂性缺血性发作的患者进行结果预后或风险评估的改进方法，所述方法包括测定所述患者的样品中至少一种标志肽的水平。

[0022] 本发明涉及对已患过中风或短暂性缺血性发作的患者进行结果预后或风险评估的方法，所述方法包括下列步骤：

[0023] a.提供来自所述患者的样品，

[0024] b.测定所述样品中至少一种标志肽的水平，所述标志肽选自ANP、AVP、ADM、ET-1、降钙素、肌钙蛋白、CRP和hGH或其片段或其前体或所述前体的片段，

[0025] c.将所述至少一种标志肽或其片段或其前体或所述前体的片段的水平与所述患者的结果预后或风险评估相关联。

[0026] 本发明还涉及本发明的方法的应用，用于对已患过中风或短暂性缺血性发作的患者进行结果预后或风险评估。

[0027] 发明详述

[0028] 本发明涉及对已患过中风或短暂性缺血性发作的患者进行结果预后或风险评估的方法，所述方法包括下列步骤：

[0029] a.提供来自所述患者的样品，

[0030] b.测定所述样品中至少一种标志肽的水平，所述标志肽选自ANP、AVP、ADM、ET-1、降钙素、肌钙蛋白、CRP和hGH或其片段或其前体或所述前体的片段，

[0031] c.将所述至少一种标志肽或其片段或其前体或所述前体的片段的水平与所述患者的结果预后或风险评估相关联。

[0032] 本发明的优选标志肽是ANP、BNP、AVP、ADM、ET-1、降钙素、肌钙蛋白、CRP(C-反应蛋白)和hGH。特别优选的标志肽是ANP、BNP、AVP、ADM、ET-1、降钙素和hGH。这些肽也可以根据它们的起源和/或在体内合成的位置或根据主要作用位点或根据功能性质分类成亚组：ANP、BNP和肌钙蛋白(cT)是心血管肽，ET-1和ADM是内皮肽，AVP(包括例如和肽素)和hGH是垂体肽，而PCT和CRP是炎性肽。

[0033] 肌钙蛋白和CRP(C-反应蛋白)是蛋白质或蛋白复合物，即多肽。在本发明的情形中，它们与其他所提到的肽一样，也被称为标志肽。

[0034] 因此，在本发明的情形中，术语“标志肽”是指本发明的心血管、炎性和/或垂体肽。

[0035] 在本发明的一个优选实施方案中，所述样品在干预前从所述患者获取。在本发明的另一个优选实施方案中，所述样品在干预后从所述患者获取。

[0036] 本文中的术语“干预前”是指用于治疗中风或TIA的干预开始之前的时间。

[0037] 使用“干预”是指用于改变健康结果的任何医学干预。该定义包括药物施用、外科程序、使用装置、行为治疗、护理方法改变等。优选，样品在接收患者入院时或中风或TIA的诊断被证实之前获取。术语“干预后”是指干预或治疗已经开始后的时间。

[0038] 通过本发明的方法或使用本发明的分析法获得的标志物的水平，可以用本技术领域的专业人员公知的众多方式进行分析。例如，可以将获得的每个测定结果与“正常”值或指示特定疾病或结果的值进行比较。具体的诊断/预后可以取决于每个测定结果与这种值的比较，所述值可以被称为诊断或预后“阈值”。在某些实施方案中，用于一种或多种诊断或预后指示物的分析法，仅仅通过分析法中所述指示物的存在或不存在而与病症或疾病相关联。例如，可以设计分析法，使得只有当高于特定目标阈值浓度时才出现阳性信号，并且低于该浓度时分析法不提供高于背景的信号。

[0039] 诊断和/或预后测试的灵敏度和特异性不仅取决于测试的分析“质量”，而且还取决于构成异常结果的定义。在实践中，典型地通过将“正常”(即表观健康的)和“患病”群体的变量值对其相对频率进行作图，计算出受试者工作特征曲线(ROC曲线)。对于任何特定标志物来说，患有或未患疾病的对象的标志物水平分布可能交叠。在这些条件下，测试不能以100％准确性绝对辨别正常与疾病，并且交叠的区域表示测试不能辨别正常与疾病的地方。选择一个阈值，高于它(或低于它，取决于标志物随着疾病如何变化)时测试被认为是异常的，低于它时测试被认为是正常的。ROC曲线下的面积是观察到的测量值将允许正确鉴定病症的概率的度量。即使在测试结果不一定给出准确数字的情况下，ROC曲线也能使用。只要人们能够对结果评分，人们即能产生ROC曲线。例如，在“患病”样品上进行的测试的结果可以按照程度评分(例如1＝低，2＝正常，3＝高)。这种评分可以与“正常”群体中的结果相关联，并产生ROC曲线。这些方法在本技术领域中是 公知的。参见例如Hanley等，1982.Radiology 143:29-36。优选，选择阈值以提供ROC曲线面积大于约0.5、更优选大于约0.7、更加优选大于约0.8、更加优选大于约0.85，并且最优选大于约0.9。在这种情形中，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。

[0040] ROC曲线的水平轴表示(1-特异性)，其随着假阳性率而增加。曲线的垂直轴表示灵敏度，其随着真阳性率而增加。因此，对于所选的具体截止值来说，可以测定(1-特异性)的值，并可以获得相应的灵敏度。ROC曲线下的面积是测量到的标志物水平将允许正确鉴定疾病或病症的概率的度量。因此，ROC曲线下的面积可用于确定测试的有效性。

[0041] 在某些实施方案中，不依赖于组中的一个或多个标志物的具体阈值来确定从对象获得的标志物水平情况是否指示了特定诊断/预后。相反，本发明可以利用标志物组“情况”作为统一的整体进行评估。这种标志物组中变化的特定“指纹”模式可以有效用作特定的诊断或预后指示物。正如在本文中讨论的，变化的模式可以从单一样品或组中的一个或多个成员的时间变化(或组的响应值)获得。这里的组是指一组标志物。

[0042] 正如在本文后面所描述的，组的响应值优选通过对在各种截止值下特定标志物组的灵敏度(即真阳性)对组的1-(特异性)(即假阳性)进行ROC曲线作图来确定。在这些方法中，来自对象的标志物测量值的情况合在一起，被认为提供了诊断或预后的总体概率(表示成数字分值或风险百分率)。在这样的实施方案中，标志物的某些亚组的增加可能足以在一个患者中指示特定诊断/预后，而标志物的不同亚组的增加可能足以在另一个患者中指示相同或不同的诊断/预后。也可以向组中的一个或多个标志物施加权重因数，例如，当标志物在鉴定特定诊断/预后中效用特别高时，可以将其权重成使得在给定水平下，它单独即足以传递阳性结果的信号。同样，也可以提供权重因数，使得特 定标志物的任何给定水平都不足以传递阳性结果的信号，而只有当另一个标志物也加入分析时才传递结果的信号。

[0043] 在某些实施方案中，选择标志物和/或标志物组，以表现出至少约70％的灵敏度、更优选至少约80％的灵敏度、更加优选至少约85％的灵敏度、更甚优选至少约90％的灵敏度以及最优选至少约95％的灵敏度，与至少约70％的特异性、更优选至少约80％的特异性、更加优选至少约85％的特异性、更甚优选至少约90％的特异性以及最优选至少约95％的特异性的组合。在特别优选实施方案中，灵敏度和特异性两者均为至少约75％、更优选至少约80％、更加优选至少约85％、更甚优选至少约90％以及最优选至少约95％。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。

[0044] 在其他实施方案中，阳性似然比、阴性似然比、机会比或风险比被用作测试的预测风险或诊断疾病的能力的度量。在阳性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阳性结果的可能性相等；值大于1表示在患病组中阳性结果可能性更大；值小于1表示在对照组中阳性结果可能性更大。在阴性似然比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阴性结果的可能性相等；值大于1表示在测试组中阴性结果可能性更大；值小于1表示在对照组中阴性结果可能性更大。在某些优选实施方案中，优选选择标志物和/或标志物组能够表现出至少约1.5以上或约0.67以下、更优选至少约2以上或约0.5以下、更加优选至少约5以上或约0.2以下、更甚优选至少约10以上或约0.1以下，以及最优选至少约20以上或约0.05以下的阳性或阴性似然比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。

[0045] 在机会比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者的对象中阳性结果可能性相等；值大于1表示在患病组中阳性结果可能性更大；值小于1表示在对照组中阳性结果可能性更大。在某些优选 实施方案中，优选选择标志物和/或标志物组能够表现出至少约2以上或约0.5以下、更优选至少约3以上或约0.33以下、更加优选至少约4以上或约0.25以下、更甚优选至少约5以上或约0.2以下以及最优选至少约10以上或约0.1以下的机会比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。

[0046] 在风险比的情况下，值为1表示在“患病”和“对照”组二者中终点(例如死亡)的相对风险相等；值大于1表示在患病组中风险更高；值小于1表示在对照组中风险更高。在某些优选实施方案中，优选选择标志物和/或标志物组能够表现出至少约1.1以上或约
0.91以下、更优选至少约1.25以上或约0.8以下、更加优选至少约1.5以上或约0.67以下、更甚优选至少约2以上或约0.5以下以及最优选至少约2.5以上或约0.4以下的风险比。在这种情况下，术语“约”是指给定测量值的+/-5％。

[0047] 专业技术人员将会理解，将诊断或预后指示物与诊断或与将来临床结果的预后风险相关联，是一种统计学分析。例如，标志物水平大于X可以传递患者与水平低于或等于X的患者相比更可能遭受不良后果的信号，正如通过统计学显著性水平所确定的。此外，标志物浓度从基线水平的改变可以反映患者的预后，并且标志物水平变化的程度可能与不良事件的严重性相关。统计学显著性经常通过比较两个或多个群体并确定置信区间和/或p值来确定。参见例如Dowdy和Wearden，《用于研究的统计学》(Statistics for Research)，John Wiley&Sons,New York,1983。本发明的优选置信区间是90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而优选的p值是0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、
0.001和0.0001。

[0048] 在其他实施方案中，可以进行多次诊断或预后标志物的测定，并可以使用标志物的时间变化确定诊断或预后。例如，可以在初始时间测定对象样品中的标志物浓度，并在第二个时间从第二个对象样品再 次测定。在这样的实施方案中，标志物从初始时间到第二个时间的增加可以指示特定的诊断或特定的预后。同样地，标志物从初始时间到第二个时间的减少可以指示特定的诊断或特定的预后。

[0049] 当在本文中使用时，术语“样品”是指出于对目标对象例如患者进行诊断、预后或评估的目的而获得的体液样品。优选的测试样品包括血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、唾液、痰液和胸膜腔积液。此外，本技术领域的专业人员将会认识到，某些测试样品在分级或纯化程序、例如将全血分离成血清或血浆组分后，将更容易分析。

[0050] 因此，在本发明的优选实施方案中，样品选自血液样品、血清样品、血浆样品、脑脊液样品、唾液样品和尿液样品，或上面提到的任何样品的提取物。优选，样品是血液样品，最优选为血清样品或血浆样品。

[0051] 本文中使用的术语“患者”是指由于疾病而接受医疗护理或应接受医疗护理的活的人类或非人类生物体。这包括正对其病征进行研究的患有未确定疾病的人。因此，本文描述的方法和分析法适用于人类和兽医疾病两者。

[0052] 当在本文中在涉及诊断和预后标记物的用途中使用时，术语“相关联”是指将患者中标记物的存在或量，与其在已知患有给定病症或已知具有给定病症风险的人、或已知没有给定病症的人中的存在或量进行比较。正如上面讨论的，可以将患者样品中的标志物水平与已知与特定诊断相关的水平进行比较。样品的标志物水平被说成已经与诊断相关联；也就是说，专业技术人员可以使用标志物水平确定患者是否具有特定类型的诊断，并做出相应反应。供选地，样品的标志物水平可以与已知与良好结果(例如不存在疾病等)相关的标志物水平进行比较。在优选实施方案中，将一组标志物的水平与总体概率或特定结果相关联。

[0053] 优选，所述结果或所述风险是指存活和/或功能结果和/或再次中风或再次短暂性缺血性发作。

[0054] 本发明还涉及用于将患者分层到风险组中的方法，所述患者已患过中风或短暂性缺血性发作，并且所述方法包含上面描述的步骤。

[0055] 在本发明的情形中，ANP是指心房利尿钠肽或其片段或其前体或所述前体的片段。ANP前体的优选片段是中段proANP(MR-proANP)。中段proANP(MR-proANP)被定义为proANP或其任何包含proANP的至少53-90位氨基酸残基的片段。在本发明的情形中，MR-proANP53-90是特别优选的标志肽。

[0056] 在本发明的情形中，AVP是指精氨酸血管加压素(＝血管加压素)或其片段或其前体或所述前体的片段。AVP前体的优选片段是C-端proAVP(CT-proAVP或和肽素)。在本发明的情形中，CT-proAVP107-145(或CT-pre-proAVP126-164)是特别优选的标志肽。

[0057] 在本发明的情形中，ADM是指肾上腺髓质素或其片段、或其前体或所述前体的片段。ADM前体的优选片段是中段proADM(MR-proADM)。在本发明的情形中，MR-proADM24-71(或MR-preproADM45-92)是特别优选的标志肽。

[0058] 在本发明的情形中，ET-1是指内皮素1或其片段或其前体或所述前体的片段。ET-1前体的优选片段是C-端-proET1(CT-proET1)。在本发明的情形中，CT-proET-1151-195(或CT-preproET-1168-212)是特别优选的标志肽。

[0059] 在本发明的情形中，降钙素也涉及其片段或其前体或所述前体的片段。降钙素的优选前体是降钙素原(PCT)。在本发明的情形中，PCT 是指包含1-116、2-116或3-116位氨基酸的降钙素原或其片段。降钙素原可以包含翻译后修饰例如糖基化、脂基化(liposidation)或衍生化。

[0060] 在本发明的情形中，hGH是指人生长激素或其片段或其前体或所述前体的片段。在本发明的情形中，hGH是特别优选的垂体肽。

[0061] 标志肽的“片段”是指长度为至少12个氨基酸、优选长度为至少6个氨基酸残基的片段。

[0062] 此外，本发明涉及对被怀疑患有中风或短暂性缺血性发作或显示出至少与中风或短暂性缺血性发作相似的症状的患者进行诊断的方法，所述方法包含：

[0063] a.提供来自所述患者的样品，

[0064] b.测定所述样品中至少一种标志肽的水平，所述标志肽选自ANP、AVP、ADM、ET-1、降钙素和hGH或其片段或其前体或所述前体的片段，

[0065] c.根据所述至少一种标志肽的水平，确定所述患者是否患有中风或短暂性缺血性发作。

[0066] 中风或类似中风的症状可以包含例如偏瘫、面部肌肉无力、麻木和感官或震动感觉减低。在大多数情况下，症状只影响身体的一侧(单侧)。取决于中风的病因，症状还可能包括下列一种或多种症状：嗅觉、味觉、听觉或视觉改变(完全或部分)，眼睑下垂(下垂症)和眼肌无力，反射(例如呕吐、吞咽、瞳孔对光反应)降低，感觉减低和面部肌肉无力，平衡问题和眼球震颤，呼吸和心率变化，胸锁乳突肌无力伴有不能将头转向一侧，舌无力(不能伸出和/或从一侧移动到另一侧)，失语症(不能说话或理解涉及布罗卡(Broca's)区或韦尼克氏(Wernicke's)区的语言)，失用症(随意运动改变)，视野缺损，记忆缺失(涉及颞叶)，偏侧忽视(涉及顶叶)，思维瓦解，混乱，过度秽言(hypersexual gestures)(涉及前叶)，疾病失认症(坚持否认通 常与中风相关的缺陷的存在)，行走困难，运动协调改变，眩晕和或不平衡。

[0067] 优选，所述至少一种标志肽的水平归因于缺血性中风或出血性中风或短暂性缺血性发作。在本发明的情形中，术语“水平”是指从患者获取的样品中标志肽的浓度(优选表示成重量/体积；w/v)。

[0068] 正如上面所概述的，本发明的标志肽还涉及其片段或其前体肽或所述前体的片段。标志肽还包括激素原或前激素原或其片段，特别是激素原及其片段。在本发明的情形中，优选，ANP是proANP、最优选为MR-proANP。优选，AVP是proAVP、更优选为CT-proAVP、最优选为CT-proAVP107-145及其片段。优选，ADM是proADM、更优选为MR-proADM、最优选为MR-proADM24-71及其片段。优选，ET-1是proET-1、更优选为CT-proET-1、最优选为CT-proET-l151-195及其片段。优选，降钙素是PCT1-116及其片段。

[0069] 在本发明的一个优选实施方案中，标志肽选自ANP、AVP、ADM、ET-1和降钙素。

[0070] 在本发明的另一个优选实施方案中，标志肽选自ANP、AVP、ADM、ET-1和hGH。

[0071] 在本发明的另一个优选实施方案中，标志肽选自ANP、AVP、ADM和ET-1。

[0072] 在本发明的另一个优选实施方案中，标志肽选自ANP、AVP和ADM。

[0073] 在本发明的又一个优选实施方案中，标志肽选自ANP和ADM。

[0074] 在本发明的又一个优选实施方案中，标志肽选自ANP、ADM、ET-1、降钙素和hGH。

[0075] 在本发明的又一个优选实施方案中，标志肽选自ANP、ADM和ET-1。

[0076] 在本发明的特别优选实施方案中，标志肽选自MR-proANP、C-端proAVP(和肽素)、MR-proADM、CT-proET-1、PCT和hGH。

[0077] 在另一个特别优选实施方案中，标志肽选自MR-proANP、MR-proADM和CT-proET-1。

[0078] 在本发明的另一个优选实施方案中，标志肽选自MR-proANP、C-端proAVP(和肽素)、MR-proADM和CT-proET-1。

[0079] 在本发明的又一个优选实施方案中，标志肽选自MR-proANP、MR-proADM、PCT和hGH。

[0080] 在本发明的又一个优选实施方案中，标志肽选自MR-proANP、C-端proAVP(和肽素)、MR-proADM、CT-proET-1和hGH。

[0081] 在本发明的又一个优选实施方案中，标志肽选自MR-proANP、MR-proADM、CT-proET-1、PCT和hGH。

[0082] 在本发明方法的优选实施方案中，标志肽是proANP。优选，标志肽的水平通过检测中段proANP来测定。

[0083] 在本发明方法的优选实施方案中，标志肽是proAVP。优选，标志肽的水平通过检测C-端proAVP来测定。

[0084] 在本发明方法的优选实施方案中，标志肽是proADM。优选，标志肽的水平通过检测中段proADM来测定。

[0085] 在本发明方法的优选实施方案中，标志肽是proET-1。优选，标志肽的水平通过检测C-端proET-1来测定。

[0086] 在本发明方法的优选实施方案中，标志肽是PCT。优选，标志肽的水平通过检测PCT来测定。

[0087] 在本发明方法的优选实施方案中，标志肽是hGH。优选，标志肽的水平通过检测hGH来测定。

[0088] 在本发明的优选实施方案中，使用两种或多种心血管标志物的组合。在本文中，优选第二中或其他心血管标志物选自ANP、BNP、AVP、ADM、ET-1、降钙素和hGH。

[0089] 任选地，附加地测定BNP或其片段或其前体或所述前体的片段的水平。

[0090] 在本发明的情形中，BNP是指脑利尿钠肽或其片段或其前体或所述前体的片段。BNP前体的优选片段是N-端proBNP(NT-proBNP)。在本发明的情形中，NT-proBNP是特别优选的标志肽。

[0091] 在本发明的优选实施方案中，测定一种以上心血管标志物的水平，并对每种单独标志物的结果进行不同加权，用于对已患过中风或短暂性缺血性发作的患者进行结果预后或风险评估。特别优选测定一组两种或以上标志肽的水平，最优选测定一组两种标志肽的水平。

[0092] 样品中一种以上标志肽水平的测定，与单一标志物相比，提供了对患者进行结果预后或风险评估的更高可能性。

[0093] 本发明的特定实施方案涉及本发明的用于对已患过中风或短暂性缺血性发作的患者进行结果预后或风险评估的方法，其中测定了至少两种标志肽的水平，并且其中每种标志肽选自不同的肽亚组，所述亚组选自心脏肽、内皮肽、垂体肽和炎性肽，其中心脏肽选自ANP、BNP和肌钙蛋白(cT)，内皮肽选自ET-1和ADM，垂体肽选自AVP和hGH，炎性肽选自PCT和CRP。

[0094] 在另一个优选实施方案中，测定样品中2、3、4、5、6、7、8或9种标志肽的水平。

[0095] 最优选测定一组至少两种标志肽的水平，并且所述至少两种标志肽的组选自下列心血管肽的组合：ANP与AVP，ANP与ADM，ANP与ET-1，ANP与降钙素，ANP与hGH，ADM与ET-1，ADM与降钙素，ADM与hGH，ET-1与降钙素，ET-1与hGH以及降钙素与hGH。然而，在本发明的某些实施方案中，除了该两种心血管肽的组之外，可以测定第三种或更多标志肽的水平。

[0096] 在一个优选实施方案中，测定ANP和ADM的水平。优选，测定MR-proANP和MR-proADM的水平。

[0097] 在另一个优选实施方案中，测定ANP和ET-1的水平。优选，测定MR-proANP和CT-proET-1的水平。

[0098] 在另一个优选实施方案中，测定ANP和降钙素的水平。优选，测定MR-proANP和PCT的水平。

[0099] 在另一个优选实施方案中，测定ANP和hGH的水平。优选，测定MR-proANP和hGH的水平。

[0100] 在另一个优选实施方案中，测定ANP和BNP的水平。优选，测定MR-proANP和NT-proBNP的水平。

[0101] 在另一个优选实施方案中，测定ADM和ET-1的水平。优选，测定MR-proADM和CT-proET-1的水平。

[0102] 在另一个优选实施方案中，测定ADM和降钙素的水平。优选，测定MR-proADM和PCT的水平。

[0103] 在另一个优选实施方案中，测定ADM和hGH的水平。优选，测定MR-proADM和hGH的水平。

[0104] 在另一个优选实施方案中，测定ADM和BNP的水平。优选，测定MR-proADM和NT-proBNP的水平。

[0105] 在另一个优选实施方案中，测定ET-1和降钙素的水平。优选，测定CT-proET-1和PCT的水平。

[0106] 在另一个优选实施方案中，测定ET-1和hGH的水平。优选，测定CT-proET-1和hGH的水平。

[0107] 在另一个优选实施方案中，测定ET-1和BNP的水平。优选，测定CT-proET-1和NT-proBNP的水平。

[0108] 在另一个优选实施方案中，测定PCT和hGH的水平。优选，测定PCT和hGH的水平。

[0109] 在另一个优选实施方案中，测定PCT和BNP的水平。优选，测定PCT和NT-proBNP的水平。

[0110] 在另一个优选实施方案中，测定hGH和BNP的水平。优选，测定hGH和NT-proBNP的水平。

[0111] 在一个特定实施方案中，在入院第一天(0日)和入院后第1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日或10日测定至少一种标志肽的水平。优选，在入院后第0日、第1日、第3日和第5日测定至少一种标志肽的水平。更优选，在入院后第0日和第5日测定至少一种标志肽的水平。在另一个优选实施方案中，在干预前和干预后测定至少一种标志肽的水平。更优选，在干预前和第5日测定至少一种标志肽的水平。无论何时测定一种或多种标志肽的水平，样品都从患者获取。

[0112] 在本发明的特定实施方案中，在第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10日从所述患者获取样品，测量所述样品中至少一种标志肽的水平，并将其用于对所述患者进行结果预后或风险评估，或用于确定所述患者是否患有中风或短暂性缺血性发作。

[0113] 在本发明的情形中特别优选，没有测定样品中选自NOGO受体、RNA结合蛋白调节亚基、遍在蛋白融合物降解蛋白1同系物、β-嵌合素、核苷二磷酸激酶A和硝基酪氨酸的标志物或一种或多种与其相关的标志物的存在或量。在这种情形中，术语“相关标志物”是指特定标志物的可以作为标志物本身的替代被检测的一种或多种片段。这些相关标志物可以是例如标志物的“前体”、“原”或“原的前体”形式，或被移除以形成成熟标志物的“前体”、“原”或“前体原”片段。

[0114] 根据优选实施方案，测定使用多变量分析进行，所述多变量分析还考虑到了选自NIHSS、巴氏指数和mRS的另外一种或多种协变量。

[0115] 本文中的术语“结果”是指例如患者在规定时间例如5天、4周、 3个月、1年后的存活、或再次中风或功能结果。最优选，预测中风或TIA后3个月的结果。

[0116] 在本发明的情形中，术语“功能结果”涉及患者在规定时间例如5天、4周、3个月或1年后疾病的严重性程度，即健康状况，优选是在中风或中风样症状方面。最优选，预测中风或TIA后3个月的功能结果。

[0117] 在本发明的情形中，优选功能结果被确定为结果的严重性评分或程度。功能结果也可以根据对护理的需要或根据日常生活活动(ADL)、例如根据巴氏指数、NIHSS和改良的评分量表来表述。

[0118] 此外，本发明还涉及用于对已患过中风或短暂性缺血性发作的患者进行结果预后或风险评估的试剂盒，所述试剂盒包含针对选自ANP、AVP、ADM、ET-1、降钙素、肌钙蛋白、CRP和hGH的标志肽或其片段或其前体或所述前体的片段的一种或多种捕获探针(优选为抗体或其功能性片段)。试剂盒可以任选包含针对BNP的捕获探针(优选为抗体或其功能性片段)。试剂盒可以另外包含检测所需的试剂例如缓冲液。此外，试剂盒还可以包含一种或多种标准样品，即一种或多种标志肽的具有确定浓度的一种或多种样品。

[0119] 优选，试剂盒包含针对标志肽或其片段或其前体或所述前体的片段的至少两种捕获探针的组合，所述组合选自MR-proANP与MR-proADM、MR-proANP与CT-proET-1、MR-proADM 与 CT-proET-1、MR-proANP 与 hGH、hGH 与 MR-proADM、hGH 与 CT-proET-1、MR-proANP与PCT、MR-proADM与PCT、CT-proAVP与PCT、CT-proET-1与PCT和hGH与PCT。

[0120] 本发明还涉及本发明的方法或本发明的试剂盒的应用，用于已患过中风或短暂性缺血性发作的患者中进行结果预后或风险评估。

[0121] 本发明还涉及本发明方法的应用，用于在已患过中风或短暂性缺血性发作的患者中监测治疗。

[0122] 本发明还涉及本发明方法的应用，用于在所述对象中鉴别诊断缺血性中风、出血性中风和/或短暂性缺血性发作，优选在中风或TIA的第一次症状后24小时内。特别优选，所述方法和试剂盒用于鉴别缺血性中风与出血性中风，或用于鉴别缺血性和/或出血性中风与短暂性缺血性发作。在这种情形中，优选的单一标志物是ANP特别是MR-proANP、AVP特别是和肽素、ADM特别是MR-proADM、ET-1特别是CT-proET-1、PCT和hGH。在这种情形下，也可以使用本发明的两种或多种标志肽的组合。特别优选的组合包含MR-proANP与MR-proADM、MR-proANP与CT-proET-1、MR-proADM与CT-proET-1、MR-proANP与hGH、hGH与MR-proADM、hGH与CT-proET-1、MR-proANP与PCT、MR-proADM与PCT、CT-proAVP与PCT、CT-proET-1与PCT、hGH与PCT。

[0123] 本文中标志肽的水平的测定(或测量或检测)使用下面解释的检测方法和/或诊断分析法来进行。

[0124] 当在本文中提到时，“分析法”或“诊断分析法”可以是在诊断学领域中应用的任何类型的分析法。这样的分析法可以基于待检测分析物与具有一定亲和性的一种或多种捕获探针的结合。对于捕获分子与靶分子或目标分子之间的相互作用来说，亲和常数优选大于8 -1
10M 。

[0125] 在本发明的情形中，“捕获分子”是可用于结合来自样品的靶分子或目标分子、即分析物(即在本发明的情况下是心血管肽)的分子。因此，捕获分子必须在空间上和表面特征例如表面电荷、疏水性、亲水性、存在或不存在路易斯供体和/或受体方面适当塑造，以特异性结合靶分子或目标分子。因此，结合可以由例如捕获分子与靶分子或目 标分子之间的离子、范德华、π-π、δ-π、疏水或氢键相互作用或两种以上上面提到的相互作用的组合来介导。在本发明的情形中，捕获分子可以例如选自核酸分子、糖类分子、RNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选，捕获分子是抗体，包括其与靶或目标分子具有足够亲和性的片段，并包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体或其源自于变体链的长度为至少12个氨基酸的片段的化学和/或生物化学修饰的衍生物。

[0126] 优选的检测方法包括各种格式的免疫分析法，例如放射免疫分析(RIA)、化学发光-和荧光-免疫分析、酶联免疫分析(ELISA)、基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列分析，以及快速检测格式例如免疫层析试纸试验。

[0127] 分析法可以是均相或非均相分析、竞争和非竞争性夹心分析。在特别优选的实施方案中，分析法是夹心分析形式，其是非竞争性免疫分析，其中待检测和/或定量的分子与第一抗体并与第二抗体结合。第一抗体可以结合到固相例如珠子上、孔或其他容器的表面上、芯片或试纸上，并且第二抗体是例如用染料、放射性同位素或者反应性或催化活性部分标记的抗体。然后通过适合的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。“夹心分析”所涉及的通用组合物和程序是已确立的，并为专业技术人员所公知。(《免疫分析手册》(The Immunoassay Handbook)，David Wild主编，Elsevier LTD,Oxford；第三版(2005年5月)，ISBN-13:978-0080445267；Hultschig C等，Curr Opin Chem Biol.2006Feb；10(1):4-10.PMID:16376134)，在此引为参考。

[0128] 在特别优选的实施方案中，分析法包含两种捕获分子，优选为都作为分散体存在于液体反应混合物中的抗体，其中第一种标记组分附着在第一种捕获分子上，其中所述第一种标记组分是基于荧光-或化学发光-淬灭或扩增的标记系统的一部分，并且所述标记系统的第二种标记组分附着于第二种捕获分子上，使得当两种捕获分子与分析物结合 后产生可测量信号，允许检测在包含样品的溶液中形成的夹心复合物。

[0129] 更加优选，所述标记系统包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花青类型的染料的组合。

[0130] 在本发明的情形中，基于荧光的分析法包含使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基荧光素)、VIC、NED、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7、占吨、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、TET、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、罗丹明110、BODIPY染料例如BODIPY TMR、俄勒冈绿、香豆素类例如伞形酮、苯并亚胺类例如Hoechst 33258；菲啶类例如德克萨斯红、雅吉瓦黄、Alexa Fluor、PET、溴化乙锭、吖啶类染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料等。

[0131] 在本发明的情形中，基于化学发光的分析法包含使用基于对化学发光材料描述的物理原理的染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化学技术百科全书》(Encyclopedia of chemical technology)第四版，J.I.Kroschwitz执行主编，M.Howe-Grant编辑，John Wiley&Sons,1993,vol.15,p.518-562中，在此引为参考，包括在551-562页中的引用文献。优选的化学发光染料是吖啶酯。

[0132] 将患者样品中的一种或多种标志肽(或其片段或其前体或所述前体的片段)的水平、即浓度，与患者的结果预后或风险评估相关联。例如，标志肽的浓度高于某个阈值表明患者的不良结果或升高的风险。这样的阈值对于MR-proANP来说优选在约100至300pmol/l的范围内，更优选为250pmol/l、最优选为188pmol/l；对于和肽素来说，在约10至40pmol/l的范围内，更优选为15pmol/l、最优选为20.3pmol/l；对 于MR-proADM来说，在约0.4至1.0nmol/l的范围内，更优选为0.5nmol/l、最优选为0.67nmol/l；对于CT-pro-ET-1来说，在约50至120pmol/l的范围内，更优选为75pmol/l、最优选为98.3pmol/l；对于PCT来说，在约0.01至0.06ng/ml的范围内，更优选为0.015ng/ml、最优选为0.026ng/ml；对于hGH来说，在约0.25至1.0ng/ml范围内，更优选为0.5ng/ml、最优选为0.34ng/ml；对于NT-proBNP来说，在约250至500pg/ml的范围内，更优选为450pg/ml、最优选为370pg/ml。

[0133] 在本文中，优选使用灵敏的PCT分析法(例如PCT灵敏分析法，B.R.A.H.M.S AG,Hennigsdorf，德国)。在本文中，优选PCT分析法具有0.05ng/ml以下的功能性灵敏度。

[0134] 这意味着在本发明方法的一个实施方案中，以高灵敏度(即灵敏度为0.05ng/ml，优选为0.02ng/ml)测量患者样品中的PCT水平。在这种情形中，优选将PCT水平与患者的存活预后相关联。

[0135] 在本发明的另一个实施方案中，通过将患者个体的标志肽水平与健康群体的某个百分位数(例如97.5百分位数)相关联，来确定患者的风险和/或结果。

[0136] 用于中风(出血性和/或缺血性)与TIA的鉴别诊断的优选阈值，对于MR-proANP来说在约90至约140pmol/l的范围内，对于和肽素来说在约9.5至约11.5pmol/l的范围内，对于MR-proADM来说在约0.5至约0.8nmol/l的范围内，对于CT-pro-ET-1来说在约65至约90pmol/l的范围内，对于PCT来说在约0.0230至约0.0260ng/ml的范围内，对于hGH来说在约0.10至约0.3ng/ml的范围内，其中低于阈值的值表明TIA，高于阈值的值表明中风。用于鉴别诊断的实例性阈值提供在实施例11的表25中。

[0137] 存活分析(Cox回归和风险比)和Kaplan-Meier估计可用于评估 或预测例如肽水平高于或低于截止值的患者的结果或风险(例如发病率)。在例如中风或TIA后3、4或12个月的发病率可以通过风险比进行评估，所述风险比描述了肽水平高于某个截止值的患者的风险的增加。在中风或TIA后的观察期内出现的再次中风或再次TIA的风险的增加，可以分别通过例如机会比和交叉表来确定。

[0138] 从入院之日与入院后某个时间、例如入院后第5日时的一种或多种标志肽的相应水平的比较，可以使用Kaplan-Meier估计和风险比为例如肽水平高于或低于截止值的患者预测结果/风险，例如3、4、12个月后的存活概率。

[0139] 一般来说，一种以上标志肽水平的测定值，可以通过对高于相应截止值的肽水平值的数量进行计数，用于评估患者的结果和风险。超过截止值的肽水平越多，患者的风险越高。Kaplan-Meier估计可用于预测死亡率，机会比可用于描述风险增加，用于再次中风或再次TIA的预测。

[0140] 正如在上文中提到的，根据本发明，标志肽的测定水平可以按照功能结果进行表述，例如按照巴氏指数、NIHSS或改良的评分量表进行表述。例如，利用箱线图(肽水平对结果)、受试者工作特征曲线(ROC)分析和机会比，可以使用肽水平预测将来的功能结果。

[0141] 本发明的方法和试剂盒也可用于根据所述至少一种心血管肽的水平，确定所述患者是否患有中风或短暂性缺血性发作。在这种情况下，优选在干预前获取样品。

[0142] 序列

[0143] 肾上腺髓质素的前体肽(前肾上腺髓质素原)的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:1中。肾上腺髓质素原是指前肾上腺髓质素原序列的22至185位氨基酸残基。肾上腺髓质素原(pro-ADM)的氨基酸序列提 供在SEQ ID NO.2中。pro-ADM N-端20肽(PAMP)是指pre-proADM的22-41位氨基酸残基。PAMP的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:3中。MR-pro-肾上腺髓质素(MR-pro-ADM)是指pre-pro-ADM的45-92位氨基酸残基。MR-pro-ADM的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:4中。成熟的肾上腺髓质素(ADM)的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:5中。

[0144] ANP的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:8中。153个氨基酸的pre-pro-ANP的序列显示在SEQ ID NO:6中。在切掉N-端信号肽(25个氨基酸)和两个C-端氨基酸(127/128)后，释放出proANP(SEQ ID NO:7)。ANP包含来自前体激素原pro-ANP的C-端的99-126位残基。该激素原被切割成成熟的28个氨基酸的肽ANP，也称为ANP(1-28)或α-ANP，以及氨基端片段ANP(1-98)(NT-proANP，SEQ ID NO:9)。中段proANP(MR-proANP)被定义为NT-proANP或其包含proANP的至少53-90位氨基酸残基(SEQ ID NO:10)的任何片段。C-端两个精氨酸残基(SEQ ID NO:6的pre-pro-ANP中152和153位)在pre-pro-ANP的编码基因的另一个等位基因中不存在，因此pre-pro-ANP可以只包含1到151位残基。对于pre-pro-ANP的相应片段来说当然也是如此，特别是pro-ANP与和肽素可以包含或可以不包含这两个C-端精氨酸。

[0145] 164个氨基酸的血管加压素前体肽(前血管加压素原)的序列提供在SEQ ID NO:11中。血管加压素原是指前血管加压素原序列的29至164位氨基酸残基。血管加压素原的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:12中。血管加压素原被切割成成熟的血管加压素、后叶激素运载蛋白II和C-端血管加压素原(CT-proAVP或和肽素)。血管加压素是指前血管加压素原的20至28位氨基酸残基。血管加压素的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:13中。和肽素是指前血管加压素原的126至164位氨基酸残基。和肽素的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:14中。后叶激素运载蛋白II包含前血管加压素原的32至124位氨基酸残基，其序列显示在SEQ ID NO:15中。

[0146] 212个氨基酸的内皮素-1前体肽(前内皮素原-1)的序列提供在SEQ ID NO:16中。Pro-ET-1是指pre-pro-ET-1序列的18至212位氨基酸残基。pro-ET-1的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:17中。Pro-ET-1被切割成成熟ET-1、big-ET-1和C-端proET-1(CT-proET-1)。ET-1是指pre-pro-ET-1的53至73位氨基酸残基。ET-1的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:18中。CT-proET-1是指pre-pro-ET-1的168至212位氨基酸残基。CT-proET-1的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:19中。Big-ET-1包含pre-pro-ET-1的53至90位氨基酸残基，其序列显示在SEQ ID NO:20中。

[0147] 141个氨基酸的降钙素前体肽(前降钙素原)序列提供在SEQ ID NO:21中。降钙素原(PCT)是指前降钙素原序列的26至141位氨基酸残基。PCT的氨基酸序列显示在SEQ ID NO:22中。降钙素原被切割成N-端PCT、降钙素和钙抑肽(katacalcin)。N-端PCT包含26至82位氨基酸，其序列显示在SEQ ID NO:23中。降钙素是指8至116位氨基酸，其序列提供在SEQ ID NO:24中。包含121-141位氨基酸残基的钙抑肽的序列提供在SEQ ID NO:25中。

[0148] 134个氨基酸的脑利尿钠肽的前体肽(pre-pro-BNP)的序列提供在SEQ ID NO:26中。Pro-BNP是指pre-pro-BNP的27至134位氨基酸残基。pro-BNP的序列显示在SEQ ID NO:27中。Pro-BNP被切割成N-端pro-BNP(NT-pro-BNP)和成熟BNP。NT-pro-BNP包含27至102位氨基酸残基，其序列显示在SEQ ID NO:28中。SEQ ID NO:29显示了BNP的序列，其包含pre-pro-BNP肽的103至134位氨基酸残基。

[0149] SEQ ID NO:1(pre-pro-ADM的氨基酸序列)：

[0150]

[0151] SEQ ID NO:2(pro-ADM的氨基酸序列)：

[0152]

[0153] SEQ ID NO:3(pro-ADM N20的氨基酸序列)：

[0154] 1 ARLDVASEFR KKWNKWALSR

[0155] SEQ ID NO:4(MR-pro-ADM的氨基酸序列)：

[0156] 1 ELRMSSSYPT GLADVKAGPA QTLIRPQDMK GASRSPEDSS

[0157] SEQ ID NO:5(ADM的氨基酸序列)：

[0158]

[0159] SEQ ID NO:6(pre-pro-ANP的氨基酸序列)：

[0160]

[0161] SEQ ID NO:7(pro-ANP的氨基酸序列)：

[0162]

[0163] SEQ ID NO:8(ANP的氨基酸序列)：

[0164] 1 SLRRSSCFGG RMDRIGAQSG LGCNSFRY

[0165] SEQ ID NO:9(NT-proANP的氨基酸序列)：

[0166]

[0167] SEQ ID NO:10(proANP的53-90位氨基酸的氨基酸序列)：

[0168] 1 PEVPPWTGEV SPAORDGGAL GRGPWDSSDR SALLKSKL

[0169] SEQ ID NO:11(pre-pro-AVP的氨基酸序列)：

[0170]

[0171] SEQ ID NO:12(pro-AVP的氨基酸序列)：

[0172]

[0173] SEQ ID NO:13(AVP的氨基酸序列)：

[0174] 1 CYFQNCPRG

[0175] SEQ ID NO:14(CT-pre-proAVP或和肽素的氨基酸序列)：

[0176] 1 ASDRSNATQL DGPAGALLLR LVQLAGAPEP FEPAQPDAY

[0177] SEQ ID NO:15(后叶激素运载蛋白II的氨基酸序列)：

[0178]

[0179] SEQ ID NO:16(pre-pro-ET-1的氨基酸序列)：

[0180]

[0181] SEQ ID NO:17(pro-ET-1的氨基酸序列)：

[0182]

[0183] SEQ ID NO:18(ET-1的氨基酸序列)：

[0184] 1 CSCSSLMDKE CVYFCHLDII W

[0185] SEQ ID NO:19(CT-pro-ET-1的氨基酸序列)：

[0186] 1 RSSEEHLRQT RSETMRNSVK SSFHDPKLKG KPSRERYVTH NRAHW

[0187] SEQ ID NO:20(Big-ET-1的氨基酸序列)：

[0188] 1 CSCSSLMDKE CVYFCHLDII WVNTPEHVVP YGLGSPRS

[0189] SEQ ID NO:21(前降钙素原的氨基酸序列)：

[0190]

[0191] SEQ ID NO:22(PCT的氨基酸序列)：

[0192]

[0193] SEQ ID NO:23(N-端PCT的氨基酸序列)：

[0194]

[0195] SEQ ID NO:24(降钙素的氨基酸序列)：

[0196] 1 CGNLSTCMLG TYTQDFNKFH TFPQTAIGVG AP

[0197] SEQ ID NO:25(钙抑肽的氨基酸序列)：

[0198] 1 DMSSDLERDH RPHVSMPQNA N

[0199] SEQ ID NO:26(pre-pro-BNP的氨基酸序列)：

[0200]

[0201] SEQ ID NO:27(pro-BNP的氨基酸序列)：

[0202]

[0203] SEQ ID NO:28(NT-pro-BNP的氨基酸序列)：

[0204]

[0205] SEQ ID NO:29(BNP的氨基酸序列)：

[0206] 1 SPKMVQGSGC FGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH附图说明

[0207] 图1：干预前测量到的MR-proANP水平高(短划线)和低(实线)的患者的Kaplan-Meier图(在四个月内存活的患者的比例)。

[0208] 图2：具有干预前测量到的MR-proADM水平高(短划线)和低(实线)的患者的Kaplan-Meier图。

[0209] 图3：具有的干预前测量到的CT-proET-1水平高(短划线)和低(实线)的患者的Kaplan-Meier图。

[0210] 图4：干预前测量到的CT-proAVP水平高(短划线)和低(实线)的患者的Kaplan-Meier图。

[0211] 图5：干预前测量到的PCT水平高(短划线)和低(实线)的患者的Kaplan-Meier图。

[0212] 图6：干预前测量到的hGH水平高(短划线)和低(实线)的患者的Kaplan-Meier图。

[0213] 图7：干预前测量到的MR-proANP和CT-proAVP(两种标志的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0214] 图8：干预前测量到的MR-proANP和MR-proADM(两种标志物的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0215] 图9：干预前测量到的MR-proANP和CT-proET-1(两种标志物的 成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0216] 图10：干预前测量到的MR-proANP和PCT(两种标志物的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0217] 图11：干预前测量到的CT-proAVP和MR-proADM(两种标志物的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0218] 图12：干预前测量到的CT-proAVP和CT-proET-1(两种标志物的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0219] 图13：干预前测量到的CT-proAVP和PCT(两种标志物的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0220] 图14：干预前测量到的MR-proADM和CT-proET-1(两种标志物的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0221] 图15：干预前测量到的MR-proADM和PCT(两种标志物的成对 组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0222] 图16：干预前测量到的CT-proET-1和PCT(两种标志物的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于预定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0223] 图17：干预前测量到的hGH和MR-proANP(两种标志物的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0224] 图18：干预前测量到的hGH和MR-proADM(两种标志物的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0225] 图19：干预前测量到的hGH和CT-proET-1(两种标志物的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0226] 图20：干预前测量到的hGH和PCT(两种标志物的成对组合)水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：两种标志物低(低于规定阈值)；短划/点线：两种标志物高(高于规定阈值)；短划线：第一种标志物低，第二种标志物高；点线：第一种标志物高，第二种标志物低。

[0227] 图21：MR-proANP、MR-proADM、CT-proAVP、CT-proET-1和/ 或PCT水平高的患者的Kaplan-Meier图。从上到下的曲线：0、1、2、3和4个或更多标志物高于规定阈值。

[0228] 图22：干预前测量到的MR-proANP、MR-proADM、CT-proAVP、CT-proET-1和/或PCT水平高的患者的Kaplan-Meier图。MR-proANP和CT-proAVP被计数两次。从上到下的曲线：0、1、2、3、4、5和6个或更多标志物高于规定阈值。

[0229] 图23：干预前测量到的MR-proANP水平高和低并且第5日的改良评分量表为5的患者的Kaplan-Meier图。

[0230] 图24：干预前测量到的MR-proANP水平高和低并且第5日的巴氏指数<85％的患者的Kaplan-Meier图。

[0231] 图25：具有干预前测量到的PCT水平高和低并且第1日的NIHSS指数<10的患者的Kaplan-Meier图。

[0232] 图26：干预前测量到的MR-proANP水平高和低并且第5日的NIHSS指数<10的患者的Kaplan-Meier图。

[0233] 图27：干预前测量到的PCT水平高和低并且第1日的NIHSS指数<10的患者的Kaplan-Meier图。

[0234] 图28：干预前(第0日)和/或第5日测量到的MR-proANP水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：水平在第0和5日低于阈值；短划线：水平第0日低于阈值并且在第5日高于阈值；点线：水平第0日高于阈值并且在第5日低于阈值；短划/点线：水平在第0和5日高于阈值。

[0235] 图29：干预前(第0日)和/或第5日测量到的CT-proAVP水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：水平在第0和5日低于阈值；短划线：水平第0日低于阈值并且在第5日高于阈值；点线：水平第0日高于阈值并且在第5日低于阈值；短划/点线：水平在第0和5日高于阈值。

[0236] 图30：干预前(第0日)和/或第5日测量到的MR-proADM水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：水平在第0和5日低于阈值；短划线：水平第0日低于阈值并且在第5日高于阈值；点线：水平第0日高于阈值并且在第5日低于阈值；短划/点线：水平在第0和5日高 于阈值。

[0237] 图31：干预前(第0日)和/或第5日测量到的CT-proET-1水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：水平在第0和5日低于阈值；短划线：水平第0日低于阈值并且在第5日高于阈值；点线：水平第0日高于阈值并且在第5日低于阈值；短划/点线：水平在第0和5日高于阈值。

[0238] 图32：干预前(第0日)和/或第5日测量到的PCT水平高和低的患者的Kaplan-Meier图。实线：水平在第0和5日低于阈值；短划线：水平第0日低于阈值并且在第5日高于阈值；点线：水平第0日高于阈值并且在第5日低于阈值；短划/点线：水平在第0和5日高于阈值。

[0239] 图33：第5日具有高的NIHSS(>10)和低的NIHSS(<10)的患者的Kaplan-Meier图。

[0240] 图34：第5日测量到的MR-proANP水平高/低的患者的Kaplan-Meier图。

[0241] 图35：第5日具有高/低的MR-proANP水平和高/低的NIHSS的患者的Kaplan-Meier图。实线：标志物水平低，NIHSS低；短划线：标志物水平低，NIHSS高；点线：
标志物水平高，NIHSS低；短划/点线：标志物水平高并且NIHSS高。

[0242] 图36：第5日具有高/低的CT-proAVP水平的患者的Kaplan-Meier图。

[0243] 图37：第5日具有高/低的CT-proAVP水平和高/低的NIHSS的患者的Kaplan-Meier图。实线：标志物水平低，NIHSS低；短划线：标志物水平低，NIHSS高；点线：
标志物水平高，NIHSS低；短划/点线：标志物水平高并且NIHSS高。

[0244] 图38：第5日具有高/低的CT-proET-1水平的患者的Kaplan-Meier图。

[0245] 图39：第5日具有高/低的CT-proET-1水平和高/低的NIHSS的患者的Kaplan-Meier图。实线：标志物水平低，NIHSS低；短划线：标志物水平低，NIHSS高；点线：
标志物水平高，NIHSS低；短划/点线： 标志物水平高并且NIHSS高。

[0246] 图40：第5日巴氏指数<85％(短划线)和>85％(实线)的患者的Kaplan-Meier图。

[0247] 图41：第5日具有高/低的MR-proANP水平并且巴氏指数85％的患者的Kaplan-Meier图。实线：标志物水平低，巴氏指数>85％；短划线：标志物水平低，巴氏指数<85％；点线：标志物水平高，巴氏指数>85％；短划/点线：标志物水平高并且巴氏指数<85％。

[0248] 图42：第5日具有高/低的CT-proAVP水平并且巴氏指数85％的患者的Kaplan-Meier图。实线：标志物水平低，巴氏指数>85％；短划线：标志物水平低，巴氏指数<85％；点线：标志物水平高，巴氏指数>85％；短划/点线：标志物水平高并且巴氏指数<85％。

[0249] 图43：第5日具有高/低的CT-proET-1水平并且巴氏指数85％的患者的Kaplan-Meier图。实线：标志物水平低，巴氏指数>85％；短划线：标志物水平低，巴氏指数<85％；点线：标志物水平高，巴氏指数>85％；短划/点线：标志物水平高并且巴氏指数<85％。

[0250] 图44：第5日改良评分量表分值为0-2(实线)和3-6(短划线)的患者的Kaplan-Meier图。

[0251] 图45：第5日具有高/低的MR-proANP水平并且改良评分量表分值在0-2或3-6之间的患者的Kaplan-Meier图。实线：标志物水平低，评分0-2；短划线：标志物水平低，评分3-6；点线：标志物水平高，评分0-2；短划/点线：标志物水平高并且评分3-6。

[0252] 图46：第5日具有高/低的MR-proADM水平并且改良评分量表分值在0-2或3-6之间的患者的Kaplan-Meier图。实线：标志物水平低，评分0-2；短划线：标志物水平低，评分3-6；点线：标志物水平高，评分0-2；短划/点线：标志物水平高并且评分3-6。

[0253] 图47：第5日具有高/低的CT-proAVP水平并且改良评分量表分值在0-2或3-6之间的患者的Kaplan-Meier图。实线：标志物水平低，评分0-2；短划线：标志物水平低，评分3-6；点线：标志物水平高，评分0-2；短划/点线：标志物水平高并且评分3-6。

[0254] 图48：第5日具有高/低的CT-proET-1水平并且改良评分量表分 值在0-2或3-6之间的患者的Kaplan-Meier图。实线：标志物水平低，评分0-2；短划线：标志物水平低，评分3-6；点线：标志物水平高，评分0-2；短划/点线：标志物水平高并且评分3-6。

[0255] 图49：第5日具有高/低的PCT水平并且改良评分量表分值在0-2或3-6之间的患者的Kaplan-Meier图。实线：标志物水平低，评分0-2；短划线：标志物水平低，评分3-6；点线：标志物水平高，评分0-2；短划/点线：标志物水平高并且评分3-6。

[0256] 图50：三个月后测定的改良评分量表分别与干预前测量到的CT-proAVP(A)和MR-proANP(B)水平之间的关联性的箱线图。在x轴上从左到右评分为0至6。

[0257] 图51：干预前测量到的CT-proAVP与三个月后二分式改良评分量表(好结果＝mRS 0-2；坏结果＝mRS 3-6)的受试者工作特征曲线(ROC)图。曲线下面积(AUC)＝0.723。

[0258] 图52：干预前测量到的MR-proANP与三个月后二分式改良评分量表(好结果＝mRS 0-2；坏结果＝mRS 3-6)的ROC图。AUC＝0.703。

[0259] 图53：干预前测量到的MR-proADM与三个月后二分式改良评分量表(好结果＝mRS 0-2；坏结果＝mRS 3-6)的ROC图。AUC＝0.658。

[0260] 图54：干预前测量到的CT-proET-1与三个月后二分式改良评分量表(好结果＝mRS 0-2；坏结果＝mRS 3-6)的ROC图。AUC＝0.608。

[0261] 图55：干预前测量到的PCT与三个月后二分式改良评分量表(好结果＝mRS 0-2；坏结果＝mRS 3-6)的ROC图。AUC＝0.580。

[0262] 图56干预前测量到的hGH与三个月后二分式改良评分量表(好结果＝mRS 0-2；坏结果＝mRS 3-6)的ROC图。AUC＝0.581。

[0263] 图57：在患有缺血性中风、出血性中风和TIA的患者中MR-proANP水平的分布。中位数值分别为137.0pmol/L、124.0pmol/L和90.6pmol/L。

[0264] 图58：使用MR-proANP作为单一标志物鉴别诊断缺血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.65(P<0.0001)。

[0265] 图59：使用MR-proANP作为单一标志物鉴别诊断出血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.65(P<0.001)。

[0266] 图60：在患有缺血性中风、出血性中风和TIA的患者中CT-proAVP(和肽素)水平的分布。中位数值分别为11.0pmol/L、16.6pmol/L和4.8pmol/L。

[0267] 图61：使用和肽素作为单一标志物鉴别诊断缺血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.71(P<0.0001)。

[0268] 图62：使用和肽素作为单一标志物鉴别诊断出血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.74(P<0.0001)。

[0269] 图63：在患有缺血性中风、出血性中风和TIA的患者中MR-proADM水平的分布。中位数值分别为0.74nmol/L、0.71nmol/L和0.61nmol/L。

[0270] 图64：使用MR-proADM作为单一标志物鉴别诊断缺血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.61(P<0.0001)。

[0271] 图65：使用MR-proADM作为单一标志物鉴别诊断出血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.59(P＝0.033)。

[0272] 图66：在患有缺血性中风、出血性中风和TIA的患者中CT-proET-1水平的分布。中位数值分别为72.0pmol/L、75.7pmol/L和63.3pmol/L。

[0273] 图67：使用CT-proET-1作为单一标志物鉴别诊断缺血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.59(P<0.001)。

[0274] 图68：使用CT-proET-1作为单一标志物鉴别诊断出血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.68(P<0.0001)。

[0275] 图69：在患有缺血性中风、出血性中风和TIA的患者中PCT水平的分布。中位数值分别为0.018ng/ml、0.018ng/ml和0.016ng/ml。

[0276] 图70：使用PCT作为单一标志物鉴别诊断缺血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.58(P<0.001)。

[0277] 图71：使用PCT作为单一标志物鉴别诊断出血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.56(P＝0.17)。

[0278] 图72：在患有缺血性中风、出血性中风和TIA的患者中hGH水平的分布。中位数值分别为0.42ng/ml、0.41ng/ml和0.24ng/ml。

[0279] 图73：使用hGH作为单一标志物鉴别诊断缺血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.60(P<0.001)。

[0280] 图74：使用PCT作为单一标志物鉴别诊断出血性中风与TIA的ROC图。AUC＝0.61(P＝0.013)。

[0281] 图75：SEQ ID NO:1(pre-pro-ADM的氨基酸序列)

[0282] 图76：SEQ ID NO:2(pro-ADM的氨基酸序列)

[0283] 图77：SEQ ID NO:3(pro-ADM N20的氨基酸序列)

[0284] 图78：SEQ ID NO:4(MR-pro-ADM的氨基酸序列)

[0285] 图79：SEQ ID NO:5(ADM的氨基酸序列)

[0286] 图80：SEQ ID NO:6(pre-pro-ANP的氨基酸序列)

[0287] 图81：SEQ ID NO:7(pro-ANP的氨基酸序列)

[0288] 图82：SEQ ID NO:8(ANP的氨基酸序列)

[0289] 图83：SEQ ID NO:9(NT-proANP的氨基酸序列)

[0290] 图84：SEQ ID NO:10(pro ANP的53-90位氨基酸的氨基酸序列)

[0291] 图85：SEQ ID NO:11(pre-pro-AVP的氨基酸序列)

[0292] 图86：SEQ ID NO:12(pro-AVP的氨基酸序列)

[0293] 图87：SEQ ID NO:13(AVP的氨基酸序列)

[0294] 图88：SEQ ID NO:14(CT-pre-proAVP或和肽素的氨基酸序列)

[0295] 图89：SEQ ID NO:15(后叶激素运载蛋白II的氨基酸序列)

[0296] 图90：SEQ ID NO:16(pre-pro-ET-1的氨基酸序列)

[0297] 图91：SEQ ID NO:17(pro-ET-1的氨基酸序列)

[0298] 图92：SEQ ID NO:18(ET-1的氨基酸序列)

[0299] 图93：SEQ ID NO:19(CT-pro-ET-1的氨基酸序列)

[0300] 图94：SEQ ID NO:20(Big-ET-1的氨基酸序列)

[0301] 图95：SEQ ID NO:21(前降钙素原的氨基酸序列)

[0302] 图96：SEQ ID NO:22(PCT的氨基酸序列)

[0303] 图97：SEQ ID NO:23(N-端PCT的氨基酸序列)

[0304] 图98：SEQ ID NO:24(降钙素的氨基酸序列)

[0305] 图99：SEQ ID NO:25(钙抑肽的氨基酸序列)

[0306] 图100：SEQ ID NO:26(pre-pro-BNP的氨基酸序列)

[0307] 图101：SEQ ID NO:27(pro-BNP的氨基酸序列)

[0308] 图102：SEQ ID NO:28(NT-pro-BNP的氨基酸序列)

[0309] 图103：SEQ ID NO:29(BNP的氨基酸序列)实施例

[0310] 实施例1：临床研究

[0311] 研究设置，入选/排除标准

[0312] 研究在巴塞尔大学医院(University Hospital of Basel)的急诊部和神经与神经外科门诊部进行。研究入选了急诊部接纳的在最近3天内症状发作的符合世界卫生组织(World Health Organization)标准的缺血性或出血性中风或短暂性脑缺血发作(TIA)的所有连续患者。排除了没有知情同意书的患者。

[0313] 基线数据收集

[0314] 访问没有入选本研究的所有合格患者的数据，对于避免选择偏倚是重要的。因此，在所有合格患者中收集了关于入选和排除标准的基线数据和信息，不论他们是否入选在研究中。这允许对同意参加与不同意参加的合格患者的基线数据进行比较。患者中的基线数据收集由研究者进行，并包含：

[0315] a)年龄

[0316] b)性别

[0317] c)BMI

[0318] d)病史项：入院前的真实病史；患有短暂性缺血性发作的患者中的ABCD分值(Rothwell等，2005.“鉴定在短暂性缺血性发作后处于高的早期中风风险中的个体的简单计分方法(ABCD)”(A simple score(ABCD)to identify individuals at high early risk of stroke after transient ischaemic attack).Lancet 366:29-36)；家族史；也通过charlson指数(Goldstein等，2004.“用于缺血性中风结果研究的charlson指数并存疾病调整”(Charlson Index comorbidity adjustment for ischemic stroke outcome studie)s.Stroke 35:1941-5)评估的相关并存疾病(即高血压、以前的中风、以前的TIA、缺血性心脏病、心房纤颤、糖尿病、肾和肝功能障碍、充血性心力衰竭、血脂异常)；具有低钠血症风险的并存 疾病(严重的甲状腺功能减退、糖皮质激素不足、肿瘤、HIV感染)；吸烟史(每年包数)和状态(每天包数)；正在使用的药物；饮酒量(每天杯数和克数)；从症状发作到入院的时间。

[0319] e)居住地点：即独立生活，被定义为住在家里或在养老院中，具有或不具有家庭圈和/或专业护理的支持(家庭圈由配偶和/或其他与患者一起生活的重要成员组成)；不独立生活，被定义为住在疗养院长住部门、其他医院。

[0320] f)临床项：身体检查包括神经状态、NIHSS(用于评估中风的严重性)和格拉斯哥昏迷量表(Glasgow Coma scale)(GCS；Adams等，1999.“基线NIH中风量表分值强烈预测中风后结果：急性中风治疗的Org 10172试验(TOAST)报告”(Baseline NIH Stroke Scale score strongly predicts outcome after stroke:A report of the Trial of Org10172in Acute Stroke Treatment(TOAST))，Neurology 53:126-31)、血压、脉搏率、体重、容量状态(包括皮肤充盈、颈静脉扩张、听诊、如果可获得的话流体摄入和失去的流程表)、体温；在神经外科患者中的脑内压，如果在常规临床管理中进行的话。

[0321] g)在神经病患者中，在入院时和钠失衡的情况下评估低钠血症的 临床症状。在经历颅内手术的患者中，将每日评估临床症状。具体来说，监测头痛、厌食、恶心、呕吐、肌肉痉挛和疼痛、癫痫发作、意识不清、感觉迟钝或昏睡发展的出现。

[0322] h)常规/标准实验室化验：常规采血包括：血细胞比容、血尿素氮、碳酸氢盐、总蛋白、白蛋白、血清尿酸和尿电解质、尿液和血清渗透压、肌酸酐、脂类、TSH、fT4、T3和基础皮质醇。如果可行，所有采血在摄取任何食物或吸烟之前进行。或者，对影响因素进行监测。

[0323] i)成像：脑颅的计算机断层成像或MRI(T1、T2、扩散加权的成像序列，使用或不使用造影)，如果指明使用磁共振血管造影术或常规脑血管造影术的话。记录了施加造影剂的时间点。

[0324] 也在缺血性病灶的血管区域的基础上将中风患者分类如下：完全前循环综合征(TACS)，部分前循环综合征(PACS)，腔隙性循环综合征(LACS)，后循环综合征(POCS)。

[0325] j)其他调查：对中风患者进行神经声像图、心回波描记术、标准的12导心电图和24小时心电图检查，然后按照急性治疗中的Org 10172试验(TOAST)中风亚型分类标准，通过中风的病因进行分类，所述分类标准用于区分大动脉粥样硬化、心源性脑栓塞、小动脉阻塞、其他病因和未确定病因。

[0326] 知情同意书陈述

[0327] 研究得到巴塞尔伦理委员会(Ethikkommission beider Basel)的批准。重要的是指出，这是一项探索性和观察性的研究；与研究相关的唯一干预是要求在常规进行的采血过程中获得7.5ml血浆。因此，要求患者提供他们同意将其数据用于科学目的的书面知情同意书。在由于急性CNS病变(这是入选的先决条件)的后遗症而不能“知情同意”的患者中，患者的最近亲属将签署同意书以陈述患者的假定意愿。在不容易找到最近亲属的情况下，没有参与本研究的主治医生必须证明从他的观点来看不反对入选到本研究中。只有在这些知情同意书程序后，患者才被入选在本研究中。

[0328] 在整个试验过程中参与者的管理：

[0329] 步骤1.急诊部或神经科病房中的所有合格患者入选本研究。

[0330] 步骤2.收集所有基线数据。

[0331] 步骤3.在住院期间，通过图表审查评估临床项目包括体重、血压、脉搏率、容积状态和体温，直到出院。

[0332] -流体治疗和药物

[0333] -可能的低钠血症症状，即头痛、恶心、呕吐、肌肉痉挛和疼痛、厌食、意识受损、癫痫发作。

[0334] -在常规采血时间点处取样进行常规实验室化验(化学图、血糖、血清渗透压、尿液渗透压、尿钠、血细胞比容)。

[0335] 步骤4.在所有患者中，在入院第5日，使用NIHSS、巴氏指数和评分量表进行临床检查(Collin等，1988.“巴氏ADL指数：可靠性研究”(The Barthel ADL Index:a reliability study)，International Disability Study 10:61-3；Bonita和Beaglehole,1988.“排序量表的改良：在中风后运动功能的恢复”(Modification of Ranking Scale:Recovery of motor function after stroke)，Stroke 19:1497-1500)。

[0336] 评估了未来居住地(即非独立或独立生活)。

[0337] 步骤6.在患有缺血性中风的患者中，在3个月后获得了关于发病和死亡(通过巴氏指数和评分量表进行评估)的电话随访。不利结果被定义为巴氏指数<85或改良的评分量表为3到6。

[0338] 标志肽浓度的管理

[0339] MR-proANP水平使用检测下限为6pmol/L的化学发光夹心免疫分析测量。在325位健康个体中，MR-proANP的浓度范围是9.6-313pmol/L，中位数为45pmol/L。浓度在男性和女性之间差异不显著，但是与对象的年龄显著相关。

[0340] MR-proADM水平使用检测下限为0.08nmol/L的化学发光夹心免疫分析测量。在264位健康个体(117位男性和147位女性)中，MR-proADM值符合高斯分布(Gaussian distribution)，平均值(SD)为0.33(0.07)nmol/L，范围为0.10-0.64nmol/L。在性别之间没有显著差异，但是MR-proADM浓度与年龄显著相关。

[0341] CT-proET-1水平使用检测下限为0.4pmol/L的化学发光夹心免疫分析测量。在326位健康个体(150位男性和176位女性)中，CT-proET-1值符合高斯分布，平均值(SD)为44.3(10.6)pmol/L，范围为10.5-77.4pmol/L。男性和女性中的CT-proET-1平均浓度没有显著差异，但是与年龄显著相关。

[0342] CT-proAVP(和肽素)水平使用检测下限为1.7pmol/L的化学发光夹心免疫分析测量。在359位健康个体(153位男性和206位女性)中，CT-proAVP中位水平为4.2pmol/L，范围为1.0-13.8pmol/L。在男性和女性之间，CT-proAVP的中位浓度差异显著。在CT-proAVP水平 与年龄之间没有相关性。

[0343] PCT水平使用检测下限为7pg/ml的化学发光夹心免疫分析“灵敏PCT”(B.R.A.H.M.S,Hennigsdorf，德国)测量。在500位健康个体中，中位值为13.5pg/ml(范围为<7至63pg/ml)。在男性与女性之间或不同年龄组之间PCT值的范围和中位数没有显著差异。

[0344] 人生长激素使用新开发的用于特异性检测最丰富的22kDa hGH同工型的化学发光夹心免疫分析测量。在50位献血者的组群中22kDa hGH同工型的中位浓度为0.19ng/ml(范围为0.05-8.82ng/ml)。

[0345] 在352位患有缺血性中风的患者、32位患有脑溢血的患者和102位患有TIA的患者中，测定了标志肽MR-proANP、MR-proADM、CT-proET-1、CT-proAVP(和肽素)、PCT和hGH的血浆水平。血样在入院当天(第0日)和入院后第1、3和5日获取。

[0346] 实施例2至11

[0347] 实施例2至11涉及相同的患者组并基于实施例1的研究。表1和2归纳了研究的患者及其结果。血样(EDTA处理的血浆样品)从501位中风或TIA患者组获取。患者组与实施例1中的相同，但是数量可能略有不同，因为不是所有天中所有患者都可获取，并且不是所有天每个患者都有足够的样品体积用于测定所有标志物。

[0348] 实施例2：使用第0日测量的标志物对存活的预后(在3个月内死亡)

[0349] 调查了中风或TIA患者在中风或TIA后3(4)个月内的结果，并将其与所述患者样品中标志物MR-proANP、MR-proADM、CT-proAVP、CT-proET1和PCT的水平相关联。样品在第0日(入院当天)获取。由该关联性，对给定的截止值(阈值)计算了风险比(HR)。通过将从时间依赖性ROC分析所测定到的灵敏度和特异性的总和最大化，确 定截止值。

[0350] 表3a到4归纳了不同标志物及其组合的HR值。图1至27显示了不同标志物/标志物组合以及与评分/巴氏s指数/NIHSS组合的Kaplan-Meier图(在4个月内存活的患者的比例)。

[0351] 表1：患者的概况

[0352]确定的诊断 频率 百分数
出血性中风 32 6.4
倾向性中风 362 72.3
TIA 107 21.4
总和 501 100.0

[0353] 表2：患者的存活

[0354]3个月内死亡 频率 百分数
是 53 10.6
否 447 89.2
未知 1 0.2
总和 501 100.0

[0355] 表3a：不同标志物的风险比(HR)

[0356]标志物 HR 截止值
MR-proANP 10.8 188
CT-proAVP 9.4 20.257
MR-proADM 4.7 0.666
CT-proET-1 4.1 98.3
灵敏PCT 3.4 0.026
hGH 1.4 0.34

[0357] 表3b：不同标志物组合的风险比(HR)

[0358]标志物组合 HR(二者都高对二者都低)
MR-proANP+CT-proAVP 61.4
MR-proANP+MR-proADM 62.7
MR-proANP+CT-proET-1 17.6
MR-proANP+灵敏PCT 25.2
CT-proAVP+MR-proADM 37.9
CT-proAVP+CT-proET-1 13.2
CT-proAVP+灵敏PCT 25.3
MR-proADM+CT-proET-1 8.7
MR-proADM+灵敏PCT 11.4
CT-proET-1+灵敏PCT 6.8
HGH+MR-proANP 12.3
HGH+MR-proADM 5.8
HGH+CT-proET-1 5.0
HGH+灵敏PCT 4.4

[0359] 表3c：所有6种标志物的组合的风险比(HR)

[0360]标志物组合 HR(>3种高对都低)
6种的组合，模型1 >100
6种的组合，模型2 >100

[0361] 表4：不同标志物与不同分值的组合的风险比(HR)

[0362]

[0363] 实施例3：使用在第0日和第5日(第0和5日的组合)测量到的标志物对存活(3个月内死亡)的预后

[0364] 表5：不同标志物的风险比(HR)

[0365]

[0366] 表5归纳了在第0和5日获取的样品中不同标志物的HR值。图28至32显示了不同标志物的Kaplan-Meier图(在4个月内存活的患者的比例)。

[0367] 实施例4：使用第5日测量到的标志物以及与NIHSS的组合对存活(3个月内死亡)的预后

[0368] 表6：不同标志物的风险比(HR)

[0369]

[0370] 表6归纳了在第5日获取的样品中不同标志物以及与所述患者的NIHSS值的组合的HR值。图33至39显示了基于第5日获取的样品，单独的NIHSS以及不同标志物与NIHSS的组合的Kaplan-Meier图(在4个月内存活的患者的比例)。

[0371] 实施例5：使用第5日测量到的标志物以及与巴氏指数的组合对存活(3个月内死亡)的预后

[0372] 表7：不同标志物的风险比(HR)

[0373]

[0374] 表7归纳了在第5日获取的样品中不同标志物以及与所述患者的巴氏指数值的组合的HR值。图40至43显示了基于第5日获取的样品，对巴氏指数以及不同标志物与巴氏指数的组合的Kaplan-Meier图(在4个月内存活的患者的比例)。

[0375] 实施例6：使用第5日测量到的标志物以及与改良评分量表的组合对存活的预后，结果为“3个月内死亡”

[0376] 表8：不同标志物的风险比(HR)

[0377]

[0378] 表8归纳了在第5日获取的样品中不同标志物以及与所述患者的改良评分量表值的组合的HR值。图44至49显示了基于第5日获取的样品，对单独的改良评分量表以及不同标志与改良评分量表的组合的Kaplan-Meier图(在4个月内存活的患者的比例)。

[0379] 实施例7：使用在第0日测量的标志物对“再次中风/再次TIA”(3个月内)的预后

[0380] 表9归纳了在患者组中再次发生的中风(再次中风)和TIA(再次TIA)。表10至14归纳了对不同标志物和标志物组合计算的HR值。

[0381] 表9：3个月内再次中风或再次TIA

[0382]3个月内事件再次发生 频率 百分数
否 419 83.6
是 29 5.8
未知 53 10.6
总和 501 100.0

[0383] 表10：不同标志物的机会比(OR)

[0384]标志物 OR OR(仅仅TIA) 截止值
MR-proANP 3.6 21.7 323.2
CT-proAVP 3.0 >100 38.6
MR-proADM 3.7 4.2 1.18
CT-proET-1 - 7.0 59.2
灵敏PCT 2.9 3.2 0.057
hGH - 1.9 0.34

[0385] 表11：不同标志物组合的机会比

[0386]

[0387] *在组中没有足够患者，“二者都高”允许计算OR；但是，给出的OR是“二者都低”对“第一种标志物高”。

[0388] 表13a至13e：所有患者的机会比计算(再次中风和再次TIA)

[0389] 表13a：MR-proANP的OR计算

[0390]

[0391] 表13b：CT-proAVP的OR计算

[0392]

[0393] 表13c：MR-proADM的OR计算

[0394]

[0395] 表13d：MR-proANP与CT-proAVP的组合的OR计算

[0396]

[0397] 表13d：MR-proANP与MR-proADM的组合的OR计算

[0398]

[0399] 表13e：CT-proAVP与MR-proADM的组合的OR计算

[0400]

[0401] 表14a至14d：TIA患者的机会比的计算(再次中风和再次TIA)

[0402] 表14a：MR-proANP的OR的计算

[0403]

[0404] 表14b：CT-proAVP的OR的计算

[0405]

[0406] 表14c：MR-proADM的OR的计算

[0407]

[0408] 表14d：CT-proET1的OR的计算

[0409]

[0410] 表14e：MR-proANP与CT-proAVP的组合的OR的计算

[0411]

[0412] 表14f：CT-proET1与CT-proAVP的组合的OR的计算

[0413]

[0414] 表14g：MR-proANP与MR-proADM的组合的OR的计算

[0415]

[0416] 实施例8：使用第0日测量到的标志物以及与第5日的组合进行“再次中风/再次TIA”(3个月内)的预后

[0417] 表15至16d归纳了不同标志物/标志物组合的ROC分析(监测)的结果，特别是机会比。

[0418] 表15：不同标志物的OR的计算

[0419]

[0420] 表16a至d：第0和第5日单一标志物的OR的计算：

[0421] 表16a：MR-proANP的OR计算

[0422]

[0423] 表16b：CT-proAVP的OR计算

[0424]

[0425] 表16c：MR-proADM的OR计算

[0426]

[0427] 表16d：PCT的OR计算

[0428]

[0429] 实施例9：使用第0天测量到的标志物进行功能结果(mRS，3个月后)的预后[0430] 表17归纳了患者组根据改良评分量表(0至6)的结果。表18列出了不同标志物与改良评分量表的关联性的Kruskal-Wallis卡方统计数据和p值。表19归纳了两类结果：具有好结果(评分0-2)的患者和具有坏结果(评分3-6)的患者。表20a至20c归纳了第0日的标志物/标志物组合对于患者3个月后好或坏结果的OR。表21a至21h归纳了对不同标志物/标志物组合计算的机会比(OR)。图50用箱线图分别说明了评分与CT-proAVP(A)和MR-proANP(B)水平之间的关联性。图51至56显示了不同标志物的ROC图。

[0431] 表17：3个月后中风/TIA患者的结果(使用改良评分量表度量)的频率分布[0432]3个月后的评分 频率 百分数
0 155 30.9
1 106 21.2
2 53 10.6
3 55 11.0
4 56 11.2
5 20 4.0
6 53 10.6
未知 3 0.6
合计 501 100.0

[0433] 表18：不同标志物的结果

[0434]

[0435] 表19：3个月后的评分

[0436]3个月后的评分 频率 百分数
评分0-2(“好”) 314 62.7
评分3-6(“坏”) 184 34.7
未知 3 0.6
合计 501 100.0

[0437] 表20a：不同标志物的OR

[0438]标志物 OR 截止值
MR-proANP 4.5 188
CT-proAVP 5.1 20.257
MR-proADM 2.8 0.666
CT-proET-1 3.6 98.3
灵敏PCT 2.1 0.026
hGH 1.5 0.34

[0439] 表20b：不同标志物组合的OR

[0440]标志物(组合) OR(二者都高对二者都低)
MR-proANP+CT-proAVP 15.6
MR-proANP+MR-proADM 7.3
MR-proANP+CT-proET-1 7.6
MR-proANP+灵敏PCT 8.2
CT-proAVP+MR-proADM 9.8
CT-proAVP+CT-proET-1 8.5
CT-proAVP+灵敏PCT 7.1
MR-proADM+CT-proET-1 5.4
MR-proADM+灵敏PCT 4.4
CT-proET-1+灵敏PCT 4.6
HGH+CT-proAVP 5.6
HGH+MR-proADM 4.3
HGH+CT-proET-1 4.4
HGH+灵敏PCT 2.7
HGH+MR-proANP 6.2

[0441] 表20c：所有6种标志物的组合的OR

[0442]标志物(组合) OR(全高对全低)
6种的组合 22.0

[0443] 表21a：CT-proAVP的OR的计算

[0444]

[0445] 表21b：MR-proANP的OR的计算

[0446]

[0447] 表21c：MR-proADM的OR的计算

[0448]

[0449] 表21d：CT-proET-1的OR的计算

[0450]

[0451] 表21e：PCT的OR的计算

[0452]

[0453] 表21f：MR-proANP与CT-proAVP的组合的OR的计算

[0454]

[0455] 表21g：MR-proANP与MR-proADM的组合的OR的计算

[0456]

[0457] 表21h：MR-proADM与CT-proAVP的组合的OR的计算

[0458]

[0459] 实施例10：使用第0日测量到的标志物以及与第5日的组合对功能结果(mRS，3个月后)进行预后

[0460] 表22归纳了第0日的单一标志物以及与第5日的组合的OR。表23和24归纳了两种不同标志物与评分值相关联的计算机会比(OR)。

[0461] 表22：不同标志物的机会比

[0462]

[0463] 表23：第0和5日CT-proAVP的OR的计算

[0464]

[0465] 表24：第0和5日PCT的OR的计算

[0466]

[0467] 实施例11：TIA、缺血性中风和出血性中风的鉴别诊断

[0468] 图57至74归纳了使用MR-proANP、和肽素、MR-proADM、CT-proET-1、PCT和hGH作为单一标志物鉴别诊断TIA、缺血性中风和出血性中风的结果。在第0和第1日如上所述测定标志物水平。对于每种标志物和患者组(出血性中风、缺血性中风、TIA)确定了中位数值，并产生了用于鉴别诊断出血性中风与TIA和缺血性中风与TIA的ROC曲线。

[0469] 表25：使用单一标志物鉴别诊断TIA与中风(分别与缺血性和出血性中风)的优化截止值。

[0470]标志物 TIA对缺血性中风的截止值 TIA对出血性中风的截止值
CT-proAVP 9.65pmol/L 11.35pmol/L
CT-proET 67.15pmol/L 66.35pmol/L
hGH 0.13ng/ml 0.13ng/ml
MR-proADM 0.67nmol/L 0.36nmol/L
MR-proANP 130.5pmol/L 96.1pmol/L
PCT 0.0235ng/mL 0.0235ng/mL