治疗和诊断疾病的方法 |
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| 申请号 | CN201510195237.4 | 申请日 | 2012-02-21 | 公开(公告)号 | CN105148269A | 公开(公告)日 | 2015-12-16 |
| 申请人 | 菲布他丁有限合伙公司; | 发明人 | J·索斯; F·雷韦特; R·M·佩雷兹; J.M.佩雷兹; F·雷韦特-罗斯; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了诊断和/或 治疗 慢性肾病、免疫复合物介导的GN、 风 湿性关节炎、和 肺 纤维 化的方法，以及 鉴别 用于这种治疗应用的化合物的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.77kD GPBP的抑制剂用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗免疫复合物介导的GN。 |
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| 说明书全文 | 治疗和诊断疾病的方法[0002] 【交叉引用】 [0003] 本申请要求2011年2月21日提交的美国临时专利申请61/444872、2011年3月31日提交的61/469945、和2011年4月8日提交的61/473411的优先权，每个都在此以其全部通过引用而并入。 [0004] 【发明背景】 [0005] 基底膜胶原蛋白IV的α3链的非胶原性(NC1)结构域[α3(IV)NC1]的构象部分依赖于磷酸化。古德帕斯彻(Goodpasture)抗原结合蛋白(GPBP,77kD GPBP或GPBP-1)(WO00/50607；WO 02/061430)是非传统的蛋白激酶，其在α3(IV)NC1结构域的超分子装配过程中催化α3(IV)NC1结构域的构象异构化，导致基底膜中多种α3(IV)NC1构象异构体的产生和稳定化。已将GPBP的升高的水平与非耐受α3(IV)NC1构象异构体的产生相关联，其引起介导古德帕斯彻(“GP”)病的自身免疫反应。在GP患者中，抗IV型胶原蛋白α3链(“古德帕斯彻抗原”或“GP抗原”)的非胶原性C末端结构域(NC1)的自身抗体引起急进性肾小球肾炎(GN)并且经常引起肺出血，这些是GP综合征的两种主要临床表现。 [0006] 【发明简述】 [0007] 在第一个方面，本发明提供了治疗慢性肾病(CKD)的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的77kD GPBP的抑制剂以治疗CKD。 [0008] 在第二个方面，本发明提供了治疗免疫复合物介导的肾小球肾炎(GN)的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的77kD GPBP的抑制剂以治疗免疫复合物介导的GN。在一个实施方案中，所述免疫复合物介导的GN与选自IgA肾病、系统性红斑狼疮(SLE)和古德帕斯彻病的自身免疫病症相关。 [0010] 在本发明的第一至第三方面的每个中，所述受试者优选是人。在每个方面，可以使用任何适合的77kD GPBP抑制剂；在一个实施方案中，所述抑制剂是与77kD GPBP结合的抗体，例如对于GPBP的77kD同种型为选择性的抗体。 [0011] 在另一个实施方案中，所述GPBP抑制剂包含含有根据通式X1-SHCIX2-X3(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的多肽，其中： [0012] X1是序列ATTAGILATL(SEQ ID NO:3)的0-10个氨基酸； [0013] X2是E或Q；；以及 [0014] X3是序列LMVKREDSWQ(SEQ ID NO:4)的0-10个氨基酸。 [0015] 在另一个实施方案中，所述抑制剂包含式(I)的化合物： [0016] [0017] 或其药学上可接受的盐，其中： [0018] R选自N和CR5； [0019] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C2-C6烷基、和(杂芳基)C1-C6烷基； [0020] R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、或(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)； [0021] R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基； [0022] R3是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C1-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基；以及 [0023] R4是羟基、卤素、C1-C6烷 基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、卞氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷 氧 基 )、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-O(CH2)1-5-C(O)OH、-O(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基。 [0026] (b)检测GPBP结合分子与血浆样品中77kD GPBP之间的复合物形成； [0027] (c)将GPBP结合分子与血浆样品中GPBP之间形成的复合物的量与对照进行比较；并且 [0028] (d)基于所述比较将所述受试者诊断为具有RA或PF，或者将所述比较提供给用于诊断RA或PF的实体。 [0029] 在一个实施方案中，所述77kD GPBP结合分子包括与天然77kD GPBP结合的抗体，例如对于GPBP的77kD同种型为选择性的抗体。 [0030] 在另一个实施方案中，所述检测包括使用选自ELISA、免疫荧光、和色谱的技术。 [0031] 在受试者处于患RA的风险中的某些实施方案中，所述受试者可能遭受选自下列的一种或多种症状：一个或多个肿胀关节、一个或多个僵硬关节、一个或多个发热关节、通常持续超过一小时的清晨关节僵硬、滑液过多、滑膜中纤维组织的产生、和关节活动范围受损。 [0032] 在受试者处于患PF的风险中的某些实施方案中，所述受试者可能遭受选自下列的一种或多种症状：慢性干咳、疲劳、虚弱、胸部不适、食欲不振、快速体重减少，以及伴随运动的呼吸困难。 [0033] 在该第四个方面的任何实施方案中，所述方法可以进一步包括测定所述受试者的C反应蛋白(CRP)的血浆水平，将受试者血浆中的CRP量与对照比较，以及用该CRP比较辅助诊断RA或PF。 [0034] 在另一个实施方案中，本发明提供用于诊断CKD或免疫复合物介导的GN的方法，包括： [0035] (a)使处于患CKD或免疫复合物介导的GN的风险中的受试者的血浆样品与结合77kD GPBP的GPBP结合分子在促进所述GPBP结合分子与GPBP选择性结合的条件下接触； [0036] (b)检测 [0037] (i)所述GPBP结合分子与血浆样品中77kD GPBP之间的复合物形成；以及[0038] (ii)测定所述受试者的C反应蛋白(CRP)的血浆水平 [0039] (c)将 [0040] (i)所述GPBP结合分子与血浆样品中77kD GPBP之间形成的复合物的量与对照比较；以及 [0041] (ii)受试者的血浆中CRP的量与对照比较；以及 [0042] (d)基于该比较将所述受试者诊断为具有CKD或免疫复合物介导的GN，或者将该比较提供给用于诊断CKD或免疫复合物介导的GN的实体。 [0043] 在第五个方面，本发明提供用于鉴别治疗CKD、免疫复合物介导的GN、和/或PF的化合物的方法，包括使77kD GPBP-77kD GPBP底物结合复合物与一个或多个待测化合物在结合条件下接触，其中取代所述结合复合物中的77kD GPBP结合的那些待测化合物是用于治疗CKD、免疫复合物介导的GN、和/或PF的候选化合物。 [0044] 在第六个方面，本发明提供用于鉴别治疗CKD、免疫复合物介导的GN、和/或PF的方法，包括使77kD GPBP底物在结合条件下与下述相接触： [0045] (a)一个或多个待测化合物；和 [0046] (b)77kD GPBP； [0047] 其中就与77kD GPBP结合底物的结合而言超过77kD GPBP的那些待测化合物是用于治疗CKD、免疫复合物介导的GN、和/或PF的候选化合物。 [0049] 图1 GPBP-1阻断性mAbs的表征。A:在不存在(对照)或存在所示mAbs的条件下通过ELISA测定重组GPBP-1与α3(IV)NC1之间的结合。将值表示为被设置为100％的对照的结合百分比。GPBP的其它mAbs不显著阻断GPBP-1与α3(IV)NC1的结合(未显示)。B:NZW小鼠接受了10μg/g体重的生物素化的mAb N12或mAb N26的单次腹膜内推注。在注射后所示的时间收集了血液样品，通过ELISA测定了所示mAb的血清滴度。条形代表平均值±S.D.(n＝3)。 [0050] 图2.用GPBP特异性抗体处理的NZW小鼠中循环GPBP-1(cGPBP-1)水平的减少。A:显示了在用所示抗体进行的代表性治疗测定中，cGPBP-1水平的平均值(点、方块或圆圈)。使用双向ANOVA检验，在第4、5和6周时对照和mAb N12-生物素组之间达到了统计学上显著的差异(*P<0.05和**P<0.01)。B:代表了A中收集的每个单个样品中cGPBP-1的血清水平(圆圈)和每个系列的平均值(线)。根据Kruskal Wallis/Dunn检验，在经mAb N12-生物素处理的组和任何其它两组之间发现了统计学上显著的差异(***P<0.001)。 [0051] 图3.GPBP-1阻断性mAbs的施用减弱了NZW小鼠中GN的进展。所显示的是通过组织化学、免疫荧光和EM程序分析的、所示小鼠组的代表性肾小球切片[对照(n＝6),mAb N12(n＝5),mAb N26(n＝5)]。用苏木精/曙红(HE)和马松三色(Masson)染色鉴别肾小球结构、肾小管萎缩和炎性浸润。使用传统显微镜法、利用标准间接免疫荧光来观察IgG和IgM沉积，并用共聚焦显微镜法观察C3c、GPBP-1和α3(IV)的分布。显微照相显示了对照小鼠中扩大的毛细血管GBM的上皮侧中的电子致密物质(红色箭头)，在经GPBP阻断性mAb处理的小鼠中没有发现异常。原始放大倍数为x400。共聚焦比例尺＝35和54μm(顶部和底部)。电镜比例尺＝2μm(顶部)和1μm(底部)。 [0052] 图4.GPBP-1的下调减少原-IL-1β的水平并延迟IL-1β的分泌。A:用LPS和原-IL-1β引发野生型和GPBP-1沉默的(pSi-GPBP-1)RAW 264.7细胞8小时，用特异性抗体通过Western blot检测细胞溶解物中的GPBP-1。B和C:用1μg/ml的LPS引发野生型和GPBP-1-沉默的(pSi-GPBP-1)RAW 264.7细胞过夜，用10μM多柔比星活化NLRP3所示的时间。通过ELISA检测培养基上清液中的IL-1β(B)和cGPBP-1(C)。 [0053] 图5.cGPBP-1和C反应蛋白(CRP)反相关。测定了蛋白尿患者血清中的cGPBP-1和CRP。图中代表了具有所示CRP水平的三组患者的平均(条形)和个体(圆圈)cGPBP-1水平。根据Kruskal Wallis/Dunn检验，在CRP<3μg/mL和CRP>4μg/mL的患者组之间发现了统计学上显著的差异(***P<0.001)。 [0054] 图6.患有RA的患者显示出升高的循环GPBP-1水平，其由循环CRP水平反向调节。在A中，圆圈代表来自113个具有显著抗环瓜氨酸肽(抗CCP)水平(RA)和100个健康捐献者(对照)的个体血清的循环GPBP-1水平。条形表示一个系列中的平均值。右边显示了曼-惠特尼(Mann-Whittney)分析的结果。在B中，每个圆圈代表在来自具有显著抗CCP水平的RA患者的个体血清中发现的循环CRP和GPBP-1的相应值。 [0055] 图7.发生胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)的小鼠中的循环GPBP-1水平。点代表在用牛II型胶原蛋白免疫接种前(免疫前)或在免疫接种后的所示时间，所示小鼠的个体血清中的cGPBP-1水平。 [0056] 图8.多柔比星对肺纤维化(PF)的诱导。在气管内滴注药物后12天，在对照和经多柔比星处理的小鼠中肉眼可见样子(上)和用苏木精/曙红(中)或马松三色(下)染色的肺(x10)的代表性组织外观。 [0057] 图9.多柔比星诱导的PF的发展过程中GPBP-1的表达。在A中显示了气管内滴注多柔比星后所示时间点的cGPBP-1水平。结果表示为单个小鼠的值。条形代表了每次检查的平均值。在B中显示了药物滴注后12天对照和经多柔比星处理的小鼠的肺中GPBP-1mRNA表达的水平。结果被表示为每个样品中平行检测的GPBP-1表达相对于核糖体18S亚基表达的倍数变化的平均值±SD。在C中，药物滴注后12天，用多克隆抗GPBP-1抗体对对照和经多柔比星处理的小鼠的肺切片中GPBP-1表达的免疫组化检测(x10)。 [0058] 图10.吡那地尔治疗对于多柔比星诱导的PF的产生的效果。多柔比星滴注后12天，检查了未治疗的小鼠或用不同剂量的吡那地尔治疗的动物的肺。显示了用苏木精/曙红染色的肺切片(x10)(左)。此外，每个实验组的个体小鼠的组织损伤的扩展被表示为受影响的实质组织的百分比(右)。 [0059] 图11.在多柔比星诱导的PF的发展期间，吡那地尔或杨梅酮治疗对于诱导胶原蛋白I表达的效果。多柔比星滴注后12天，用RT-qPCR测定未治疗的、或经吡那地尔或杨梅酮治疗的小鼠中α1(I)胶原蛋白mRNA的表达。结果被表示为每个样品中平行检测的α1(I)胶原蛋白表达相对于核糖体18S亚基表达的倍数变化的平均值±SD。统计学差异如下表示：ns：非显著的，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005。 [0060] 图12.GPBP mAb对于多柔比星诱导的PF的效果。多柔比星滴注后12天，用RT-qPCR测定未治疗的，经抗-TGFβ、mAb 14或mAb N12治疗的小鼠中α1(I)和α1(IV)胶原蛋白mRNA的表达。结果被表示为每个样品中平行检测的α1(I)胶原蛋白表达相对于核糖体18S亚基表达的倍数变化的平均值±SD。统计学差异如下表示：ns：非显著的，*p<0.05,***p<0.005。 [0061] 【发明详述】 [0062] 所有所引用的参考文献均在此以其全部通过引用而并入。在本申请中，除非另有说明，所使用的技术可以在数篇众所周知的参考文献的任一篇中找到，例如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Gene Expression Technology(Methods in Enzymology,Vol.185,edited by D.Goeddel,1991.Academic Press,San Diego,CA)，“Guide to Protein Purification”in Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis 等 人 1990.Academic ndPress,San Diego,CA)，Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,2 Ed.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY)，Gene Transfer and Expression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.)和 the Ambion 1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。 [0063] 如本文中所使用的，单数形式“a(一个)”“an(一个)”和“the(所述)”包括复数指代物，除非上下文明确另有所指。如本文中所使用的，“和”与“或”可互换使用，除非明确另有说明。 [0064] 本发明的不同方面和实施方案之间的所有共同术语具有相同的意义，除非上下文明确另有所指。 [0065] 如本申请中所使用的，术语“天然蛋白”指细胞自然产生的蛋白，包括任何翻译后修饰(PTMs)，并且包括非变性的蛋白，或变性的蛋白(例如基本上被纯化并经一种或多种变性剂处理以例如在SDS-PAGE凝胶上跑胶的天然产生的蛋白)。 [0066] 如本申请中所使用的，“基本上经纯化的多肽”是指所述多肽从其体内的细胞环境中被分离。更优选的是，分离的多肽也基本上不含凝胶试剂，例如聚丙烯酰胺、琼脂糖、和色谱试剂。 [0067] 除非上下文明确地另有所指，本发明一个方面公开的实施方案同样可用于本发明的其它方面，并与本发明其它方面公开的实施方案相组合。 [0068] 在不同的实施方案中，所述方法可用于治疗非透析依赖性CKD，例如： [0069] 阶段1：轻微减弱的功能；具有正常或相对高GFR(≥90mL/min/1.73m2)的肾损伤； [0070] 阶段2：GFR轻微减少(60–89mL/min/1.73m2)，具有肾损伤； [0071] 阶段3：GFR中度减少(30–59mL/min/1.73m2)；以及 [0072] 阶段4：GFR严重减少(15–29mL/min/1.73m2)。 [0073] 如本文中所使用的，“治疗”CKD是指(a)减慢受试者向终末期肾病(ESRD)的发展；(b)减慢受试者中GFR的减少；(c)限制受试者肾病的发展；和/或(d)减少CKD症状的严重性。 [0074] 如本文中所使用的，“限制CKD的发展”是指相对于没接受治疗的患者而言，减少或防止接受治疗的那些患者中肾功能的降低。因此这种治疗减少了患者对于肾透析或移植的需要。 [0075] 可以各种方式测量肾病的发展，包括下述方式： [0076] (a)蛋白尿(即蛋白向尿中的丧失增加；通常通过白蛋白水平的测定来评估(即“蛋白尿(albuminuria)”))； [0077] (b)受损的肾小球清除(即肾起作用从血液中清除物质；其可以例如通过肌酸酐(即“受损的肌酸酐清除”)、菊粉、或尿素清除来测定)； [0078] (c)血清肌酸酐水平的增加；和/或 [0079] (d)尿转化生长因子β(TGF-β)水平的增加。 [0080] 因此，本发明的方法可被用于在用本发明的方法治疗的患者中，例如，限制蛋白尿、蛋白尿(albuminuria)、血清肌酸酐水平、和尿TGF-β水平的一种或多种的增加，和/或限制肾小球清除和/或肌酸酐清除的损伤。 [0081] 在第二个方面，本发明提供了治疗免疫复合物介导的GN的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的77kD GPBP抑制剂以治疗免疫复合物介导的GN。所述受试者可以是可能从治疗受益的任何受试者，例如哺乳动物。在优选的实施方案中，所述受试者是人受试者。 [0082] 如本文中所使用的，“GN”是以肾小球损伤为特征的肾病，而“免疫复合物介导的GN”是指以免疫复合物的肾小球沉积为特征的GN。 [0083] 在一个实施方案中，免疫复合物介导的GN与选自IgA肾病、系统性红斑狼疮(SLE)和古德帕斯彻病的自身免疫疾病相关。如本文中所使用的，“治疗”免疫复合物介导的GN是指(a)减慢肾小球损伤的发展；(b)减慢肾小球免疫复合物沉积的发展；(c)减少肾小球炎症；(d)减少肾小球免疫复合物沉积；和/或(d)减慢向ESRD的发展。 [0084] 如下面的实施例中所示，77kD GPBP的抑制剂修复基于肾小球基底膜胶原的改变，减少复合物的肾小球免疫沉积，并减轻与免疫复合物介导的GN相关的炎症。 [0085] 在本发明的第一和第二方面的方法的优选实施方案中，所述77kD GPBP抑制剂可以与一种或多种其它治疗剂共同施用，所述其它治疗剂为例如被治疗的疾病的护理标准治疗剂。在一个优选的实施方案中，此类一种或多种化合物选自血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂，或其在药学可接受载体中的药学可接受的盐。用于本发明的血管紧张素转换酶抑制剂的非限制性实例包括贝那普利、贝那普利拉、卡托普利、地拉普利、芬替普利、福辛普利、赖苯普利、莫希普利、喷托普利、培哚普利、匹伏普利、喹那普利、喹普利拉、雷米普利、螺普利、螺普利拉、佐芬普利、西罗普利、依那普利、吲哚普利、赖诺普利、阿拉普利、和西拉普利，或其药学可接受的盐。用于本发明的血管紧张素受体阻断剂的非限制性实例包括氯沙坦、坎地沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、缬沙坦、替米沙坦、依普沙坦、和他索沙坦。 [0086] 在另一个实施方案中，所述抑制剂可以与贝利木单抗组合施用。 [0087] 在第三个方面，本发明提供了用于治疗肺纤维化(PF)的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的77kD GPBP的抑制剂以治疗PF。所述受试者可以是可能从治疗受益的任何受试者，例如哺乳动物。在优选的实施方案中，所述受试者是人受试者。 [0088] PF是肺中过量结缔组织的形成或发展(纤维化)。肺纤维化的症状包括，但不限于呼吸急促、慢性干咳、疲劳和虚弱、胸部不适、和/或食欲不振和体重快速减少。肺纤维化是由进行性运动伴随的呼吸急促(呼吸困难)的历史提示的。有时，听诊时可以在肺底处听到细吸气性湿罗音。高分辨率的CAT扫描将通常显示异常。 [0089] 如下面的实施例中所示，GPBP抑制剂在治疗多柔比星诱导的PF(人PF的动物模型)方面是有效的。 [0090] 待用本发明的方法治疗的PF可以是其它疾病的继发效应(即“间质性肺病”)，包括但不限于自身免疫疾病(不包括：风湿性关节炎-RA-、SLE、硬皮病等)，病毒感染或肺的其它微观损伤(例如暴露于石棉、硅、雪茄烟等)，或者可以是特发的(即“特发性肺纤维化”)。 [0091] 如如本文中所使用的，“治疗”PF是指(a)减慢肺纤维化的发展；和/或(b)减少PF症状。 [0092] 在本发明第三方面的方法的优选实施方案中，所述77kD GPBP抑制剂可以与一种或多种其它治疗剂(例如被治疗的疾病的标准护理治疗剂)共同施用。在一个优选实施方案中，此类一种或多种化合物选自皮质激素、免疫抑制剂(包括但不限于环磷酰胺，咪唑硫嘌呤，和甲氨蝶呤)，抗炎试剂，IFN-γ，霉酚酸酯和吡非尼酮。 [0093] 在这些方面中的每一个中，所述方法可以在任何适合的受试者上实施，例如已被鉴别为过量表达77kD GPBP的那些受试者。例如，作为标准曲线参照的血浆中77kD GPBP的正常值为小于10ng/ml。在各种优选实施方案中，血浆中正常77kD GPBP的范围是在约1ng/ml-10ng/ml之间。因此，在一个实施方案中，根据本发明的方法治疗了被鉴别为其血浆中具有高于10mg/ml 77kD GPBP的受试者。测定循环77kD GPBP的量的方法是本领域已知的(参见WO2010/009856和US 7935492)，实例在下文中描述。 [0094] 在引述治疗剂治疗方法的本发明的这些方面的每一个中，可以使用任何合适的77kD GPBP抑制剂。在一个实施方案中，所述抑制剂选自77kD GPBP反义RNA、77kD GPBP siRNA、和77kD GPBP抗体。在优选的实施方案中，77kD GPBP抑制剂是77kD GPBP抗体或其药学可接受的盐。示例性的抗体在例如WO 2010/009856和US7935492中公开。在优选的实施方案中，所述抗体识别天然77kD GPBP，包括但不限于在WO 2010/009856和US 7935492中公开的那些抗体，WO 2010/009856和US 7935492向本领域的技术人员提供了产生天然 77kD GPBP的抗体的教导。如本文中所使用的，“天然77kD GPBP的抗体”是指与天然77kD GPBP结合的抗体，且不要求它们不与其它GPBP种类结合。在一个实施方案中，所述抗体是 77kD GPBP特异的。在可与任何其它实施方案组合的其它的优选实施方案中，所述抗体是单克隆抗体，例如人源化单克隆抗体。 [0095] 本文所用的术语抗体意在包括与本发明的多肽或其片段选择性反应的抗体片段。可以用传统方法将抗体片段化，并用与上述用于完整抗体的相同的方式就应用而言筛选所述片段。例如可通过用胃蛋白酶处理抗体产生F(ab')2片段。可以处理所得到的F(ab')2片段以减少二硫桥以产生Fab'片段。 [0096] 单克隆抗体片段的实例包括(i)Fab片段，其是基本上由VL,VH,CL和CH I结构域组成的单价片段；(ii)F(ab)2和F(ab')2片段，其为包含在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iv)基本上由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature341:544-546)，其基本由VH结构域组成；以及(vi)一个或多个分离的CDR或功能性抗体结合部位。 [0097] 可以通过从动物获得脾细胞产生单克隆抗体。(参见Kohler和Milstein,Nature256,495-497(1975))。在一个实例中，通过用77kD GPBP或其抗原性片段免疫自交小鼠制备了目的单克隆抗体(mAb)。通过IP或SC途径以足以引发免疫应答的量和时间间隔免疫接种小鼠。小鼠在第0天接受初次免疫接种并休息大约3至大约30周。通过静脉内(IV)途径对经免疫接种的小鼠给予一次或多次加强免疫接种。用本领域已知的标准方法从经免疫的小鼠中移除脾，获得了来自抗体阳性小鼠的淋巴细胞。通过将脾淋巴细胞与合适的融合伴侣在将允许形成稳定杂交瘤的条件下混合而产生了杂交瘤细胞。在浓度为大约30％至大约50％的聚乙二醇中融合抗体产生性细胞和融合伴侣细胞。通过本领域已知的程序在补充了次黄嘌呤、胸腺嘧啶和氨蝶呤的Dulbecco's改良Eagles培养基(DMEM)中生长而选择融合的杂交瘤细胞。从生长阳性孔中收集了上清液，并通过免疫检测例如固相免疫放射检测筛选抗体的产生。用例如MacPherson,Soft Agar Techniques,in Tissue Culture Methods and Applications,Kruse and Paterson,Eds.,Academic Press,1973的软琼脂技术的技术克隆了来自抗体阳性孔的杂交瘤细胞。 [0098] “人源化抗体”指源自于非人抗体(例如小鼠单克隆抗体)的抗体。或者，人源化抗体可以源自于保留或基本保留了亲本非人抗体的抗原结合性质但在向人施用时与亲本抗体相比表现出减小的免疫原性的嵌合抗体。例如，嵌合抗体可以包括人和鼠抗体片段，通常是人恒定区和鼠可变区。由于人源化抗体在人中的免疫原性远小于非人单克隆抗体，它们优选用于治疗性抗体的应用。 [0099] 可使用本领域已知的多种方法制备人源化抗体，包括但不限于(1)将非人单克隆抗体的互补决定区移接到人框架和恒定区上(“人源化”)，以及(2)移植非人单克隆抗体可变区，但是用通过表面残基置换用类人表面“掩蔽(cloaking)”它们(“镶饰(veneering)”)。这些方法在例如Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Morrison 等 人 ,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,81:6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988)；Verhoeyer 等 人 ,Science 239:1534-1536(1988)； Padlan,Molec.Immun.28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immunol.31(3):169-217(1994)； 和Kettleborough,C.A.等人,Protein Eng.4(7):773-83(1991)中公开。 [0100] 为了产生抗体应答，通常以用于肠胃外施用的药学可接受的载体配制本发明的多肽。这种可接受的佐剂包括但不限于弗式完全佐剂、弗式不完全佐剂、明矾沉淀、包含短棒状杆菌和tRNA的油包水乳液。这种组合物的制剂，包括多肽的浓度和载体及其它组分的选择，都在本领域的技术范围之内。 [0101] 在另一个实施方案中，所述77kD GPBP抑制剂是WO2004/070025和US 7326768中公开的肽抑制剂，或其药学可接受的盐。在一个实施方案中，所述肽抑制剂是包含根据通式X1-SHCIX2-X3(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或由其组成的多肽，其中： [0102] X1是序列ATTAGILATL(SEQ ID NO:3)的0-10个氨基酸； [0103] X2是E或Q；并且 [0104] X3是序列LMVKREDSWQ(SEQ ID NO:4)的0-10个氨基酸。 [0105] 在优选的实施方案中，肽抑制剂包含选自SHCIE(SEQ ID NO:5),SHCIQ(SEQ ID NO:6),ILATLSHCIELMVKR(SEQ ID NO:7),和ILATLSHCIQLMVKR(SEQ ID NO:8)的序列或所述序列组成。 [0106] 在另一个实施方案中，所述肽抑制剂包含至少6个(6,7,8,9,或全部)连续氨基酸EKTAGKPILF(SEQ ID NO:9)或由其组成。在优选的实施方案中，分离的多肽包含序列EKTAGKPILF(SEQ ID NO:10)或由其组成。 [0107] 所述多肽可被进一步衍生化以提供增加的半衰期，例如通过加入聚乙二醇(PEG)或通过本领域知道的其它方式。本发明的多肽可以包含L氨基酸、D氨基酸(其在体内对L氨基酸特异性蛋白酶有抗性)，D和L氨基酸的组合，以及各种“设计”氨基酸(例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、和Nα-甲基氨基酸等)以赋予特殊的性质。合成氨基酸包括用鸟氨酸代替赖氨酸，以及用正亮氨酸代替亮氨酸或异亮氨酸。 [0108] 此外，所述多肽可具有肽模拟物键，例如酯键，以制备具有新性质的多肽。例如，可产生这样的多肽：其掺入还原肽键，即R1-CH2-NH-R2，其中R1和R2是氨基酸残基或序列。还原肽键可以作为二肽亚基被引入。这种肽将对蛋白酶活性有抗性，并将具有延长的体内半衰期。 [0109] 术语“多肽”在其最广泛的含义上被使用，以用来指氨基酸亚基、氨基酸类似物、或肽模拟物序列。所述亚基由肽键连接，虽然所述多肽可以含有不必需通过肽键与所述多肽相连的其它部分。例如，如上文所讨论的，所述多肽可以进一步含有包含芳环的非氨基酸分子。 [0110] 这里所描述的多肽可以被化学合成或重组表达。可以使用本领域中的标准方法实现重组表达，如上文所公开的。这种表达载体可以包含细菌或病毒表达载体，并且这种宿主细胞可以是原核的或真核的。 [0111] 优选地，用于本发明的方法的多肽是化学合成的。用熟知的固相、液相或肽缩合技术、或其任意组合制备的合成多肽可以包括天然和非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是标准Boc(Nα-氨基保护的Nα-t-叔丁氧羰基)氨基酸树脂并使用标准的去保护、中和、偶联和洗脱方案，或者标准的碱不稳定的Nα-氨基保护的9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc Nα-氨基保护的氨基酸可以从Sigma,Cambridge Research Biochemical或本领域技术人员熟悉的其它化学公司获得。此外，可以用本领域技术人员熟悉的其它Nα-保护基团合成所述多肽。 [0112] 固相肽合成可以通过本领域人员熟悉的技术实现，并例如通过使用自动合成仪实现。 [0113] 所述肽/抗体抑制剂可以在药物组合物中与药学可接受的载体共同施用。除肽抑制剂外，所述药物组合物可以包含(a)冻干保护剂；(b)表面活性剂；(c)填充剂；(d)张力调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂和/或(g)缓冲剂。在一些实施方案中，药物组合物中的缓冲剂是Tris缓冲剂、组氨酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂或醋酸盐缓冲剂。所述药物组合物还可以包括冻干保护剂，例如蔗糖、山梨醇或海藻糖。在某些实施方案中，所述药物组合物包括防腐剂例如苯扎氯铵、苯乙铵、氯己定、苯酚、间甲苯酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲苯酚、对甲苯酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸，和它们的各种混合物。在其它的实施方案中，所述药物组合物包括填充剂，如甘氨酸。而在其它实施方案中，所述药物组合物包括表面活性剂，例如聚山梨醇酯-20,聚山梨醇酯-40,聚山梨醇酯-60,聚山梨醇酯-65,聚山梨醇酯-80聚山梨醇酯-85,泊洛沙姆-188,山梨醇单月桂酸酯、山梨醇单硬脂酸酯、山梨醇单油酸酯、山梨醇三月桂酸酯、山梨醇三硬脂酸酯、山梨醇三油酸酯，或它们的组合。所述药物组合物还可以包含张力调节剂，例如使所述制剂与人血液基本上等张或等渗的化合物。示例性张力调节剂包括蔗糖、山梨醇、甘氨酸、甲硫氨酸、甘露醇、右旋糖酐、肌醇、氯化钠、精氨酸和盐酸精氨酸。在其它的实施方案中，所述药物组合物还包括稳定剂，例如当与目的蛋白质组合时，实质上预防或减少冻干或液体形式的目的蛋白质的化学和/或物理不稳定性的分子。示例性的稳定剂包括蔗糖、山梨醇、甘氨酸、肌醇、氯化钠、甲硫氨酸、精氨酸和盐酸精氨酸。 [0114] 所述肽抑制剂/抗体可以是药物组合物中仅有的活性试剂，或者所述组合物可还包含一种或多种适用于所欲用途的其它活性试剂。 [0115] 在另一个实施方案中，所述77kD GPBP抑制剂选自DAB-Am32、吡那地尔和杨梅酮，和其药学可接受的盐，其中的每一个都在后面的实施例中被表明在本发明的方法中是有效的。 [0116] 在其它实施方案中，所述77kD GPBP抑制剂是WO 2011/054530和US 20110105545中所公开的那种。因此，所述化合物可以是式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐： [0117] [0118] 或其药学上可接受的盐，其中： [0119] R选自N和CR5； [0120] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C2-C6烷基、和(杂芳基)C1-C6烷基； [0121] R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、或(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)； [0122] R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基； [0123] R3是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C1-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基；以及 [0124] R4是羟基、卤素、C1-C6烷 基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、卞氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷 氧 基 )、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-O(CH2)1-5-C(O)OH、-O(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基。 [0125] 在另一个实施方案中，式(I)的抑制剂化合物可以是式(II)的化合物： [0126] [0127] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是式(I)或(II)的化合物，其中： [0128] R选自N和CR5； [0129] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、和-(CH2)1-5-C(O)NH2； [0130] R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、或(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)； [0131] R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、或-(CH2)1-5-C(O)NH2； [0132] R3是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C1-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及 [0133] R4是羟基、卤素、C1-C6烷 基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、卞氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷 氧 基 )、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-O(CH2)1-5-C(O)OH、或-O(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)。 [0134] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是式(I)或(II)的化合物，其中： [0135] R选自N和CR5； [0136] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、和氨基(C1-C6烷基)； [0137] R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤代(C1-C6烷氧基)； [0138] R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、或(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)； [0139] R3是C1-C6烷基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及 [0140] R4是羟基、卤素、C1-C6烷 基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、卞氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷 氧 基 )、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-O(CH2)1-5-C(O)OH、或-O(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)。 [0141] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是式(II)的化合物，其中R是N。这些化合物可以用式(III)来表示： [0142] [0143] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是式(II)的化合物，其中R是CR5。这些化合物可以用式(IV)来表示： [0144] [0145] 在一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R1是氢、羟基、或C1-C6烷氧基。 [0146] 在一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R1是氢。 [0147] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、或磺酰基(C1-C6烷基)。 [0148] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、或甲酰基(C0-C6烷基)。 [0149] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R2可以是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、或羟基(C1-C6烷基)。例如，在某些实施方案中，R2可以是C1-C6烷基如甲基、乙基、或异丙基。在其它实施方案中，R2可以是卤代(C1-C6烷基)如氟甲基、二氟甲基、或三氟甲基。在某些实施方案中，R2可以是羟基(C1-C6烷基)。例如羟基(C1-C6烷基)可以是羟甲基、1-羟乙基、或2-羟乙基。 [0150] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R2是C1-C6烷基。在某些优选的实施方案中，R2是甲基。 [0151] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R3是C1-C6烷基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-CH＝CH-C(O)OH、或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)。 [0152] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R3是-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、或-(CH2)1-5-C(O)NH2。 [0153] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R3是-(CH2)1-2-C(O)OH、或-(CH2)1-2-C(O)(C1-C6烷氧基)。例如，在某些实施方案中，R3可以是-(CH2)2-C(O)OH、-(CH2)2-C(O)(OCH3)、-(CH2)2-C(O)(OCH2CH3)、或-(CH2)2-C(O)(OC(CH3)3)。在其它的实施方案中，R3可以是-(CH2)2-C(O)OH、或-(CH2)2-C(O)(OCH2CH3)。 [0154] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R3是-(CH2)1-2-C(O)OH。优选R3是-(CH2)2-C(O)OH。 [0155] 在一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R4是羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、或卞氧基。 [0156] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中R4是羟基或C1-C6烷氧基(例如甲氧基)。优选R4是C1-C6烷氧基。在更优选的实施方案中，R4是甲氧基。 [0157] 在一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)、(II)或(IV)的化合物，其中R5是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤代(C1-C6烷氧基)。 [0158] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)、(II)或(IV)的化合物，其中R5是C1-C6烷基，例如甲基。 [0159] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(I)、(II)或(IV)的化合物，其中R5是卤代(C1-C6烷基)，例如三氟甲基。 [0160] 在某些优选的实施方案中，所述抑制剂是式(I)、(II)或(IV)中任一种的化合物，其中： [0161] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、和氨基(C1-C6烷基)； [0162] R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤代(C1-C6烷氧基)； [0163] R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、或(C1-C6烷基)硫代(C1-C6烷基)； [0164] R3是 -(CH 2)1-2-C(O)OH、-(CH2)1-2-C(O)(C1-C6烷 氧 基 )、-(CH 2)1-2-C(O)NH2、-(CH2)1-2-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-2-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及 [0165] R4是羟基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、或卞氧基。 [0166] 在某些优选的实施方案中，所述抑制剂是式(III)的任意化合物，其中： [0167] R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤代(C1-C6烷氧基)； [0168] R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、或(C1-C6烷基)硫代(C1-C6烷基)； [0169] R3是 -(CH 2)1-2-C(O)OH、-(CH2)1-2-C(O)(C1-C6烷 氧 基 )、-(CH 2)1-2-C(O)NH2、-(CH2)1-2-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-2-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及 [0170] R4是羟基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、或卞氧基。 [0171] 在某些优选的实施方案中，所述抑制剂是式(I)、(II)或(IV)中任一种的化合物，其中R1是氢；R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、或甲酰基(C1-C6烷基)；R3是-(CH2)1-2-C(O)OH、-(CH2)1-2-C(O)(C1-C6烷氧基)、或-(CH2)1-2-C(O)NH2；R4是羟基或C1-C6烷氧基；以及R5是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤代(C1-C6烷氧基)。 [0172] 在特定的优选实施方案中，所述抑制剂是式(III)的任意化合物，其中R1是氢；R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、或甲酰基(C1-C6烷基)；R3是-(CH2)1-2-C(O)OH、-(CH2)1-2-C(O)(C1-C6烷氧基)、或-(CH2)1-2-C(O)NH2；R4是羟基或C1-C6烷氧基；以及R5是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤代(C1-C6烷氧基)。 [0173] 在某些优选的实施方案中，所述抑制剂是式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中： [0174] R，如果存在的话，选自N和CR5； [0175] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、和氨基(C1-C6烷基)； [0176] R1是氢； [0177] R2是C1-C6烷基； [0178] R3是-(CH2)1-2-C(O)OH；以及 [0179] R4是C1-C6烷氧基。 [0180] 在某些优选的实施方案中，所述抑制剂是式(I)-(IV)中任一种的化合物，其中： [0181] R，如果存在的话，选自N和CR5； [0182] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、和氨基(C1-C6烷基)； [0183] R1是氢； [0184] R2是甲基； [0185] R3是-(CH2)2-C(O)OH；以及 [0186] R4是甲氧基。 [0187] 在一个优选的实施方案中，所述抑制剂是式(V)的化合物，其是式(VI)： [0188] [0189] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是式(V)或(VI)的化合物，其中： [0190] R选自N和CR5； [0191] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、和-(CH2)1-5-C(O)NH2； [0192] R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、或(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)； [0193] R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-CH＝CH-C(O)OH、或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及[0194] R6是羟基、卤素、C1-C6烷 基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、卞氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷 氧 基 )、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、或-OS(O)2CF3。 [0195] 在另一个优选的实施方案中，本公开提供了式(V)或(VI)的化合物，其中： [0196] R选自N和CR5； [0197] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、和氨基(C1-C6烷基)； [0198] R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤代(C1-C6烷氧基)； [0199] R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C1-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-CH＝CH-C(O)OH、或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及 [0200] R6是羟基、卤素、C1-C6烷 基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、卞氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷 氧 基 )、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、或-OS(O)2CF3。 [0201] 在一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(V)-(VI)任一种的化合物，其中R1是氢。 [0202] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(V)-(VI)任一种的化合物，其中R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)，-CH＝CH-C(O)OH、或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)。 [0203] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(V)-(VI)任一种的化合物，其中R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、甲酰基(C0-C6烷基)、-CH＝CH-C(O)OH、或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了如上所述的参照式(V)-(VI)任一种的化合物，其中R2可以是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)。例如，在某些实施方案中，R2可以是C1-C6烷基如甲基、乙基、或异丙基。在其它实施方案中，R2可以是卤代(C1-C6烷基)如氟甲基、二氟甲基、或三氟甲基。在某些实施方案中，R2可以是羟基(C1-C6烷基)。例如羟基(C1-C6烷基)可以是羟甲基、1-羟乙基、或2-羟乙基。 [0204] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(V)-(VI)任一种的化合物，其中R2是C1-C6烷基。在某些优选的实施方案中，R2是甲基。 [0205] 在一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(V)-(VI)任一种的化合物，其中R6是羟基、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、卞氧基、或-OS(O)2CF3。 [0206] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(V)-(VI)任一种的化合物，其中R6是羟基或C1-C6烷氧基(例如甲氧基)。在一个优选的实施方案中，本公开提供了如上所述的参照式(V)-(VI)任一种的化合物，其中R5是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤代(C1-C6烷氧基)。 [0207] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(V)-(VI)任一种的化合物，其中R5是C1-C6烷基，例如甲基。 [0208] 在另一个优选的实施方案中，所述抑制剂是如上所述的参照式(V)-(VI)任一种的化合物，其中R5是卤代(C1-C6烷基)，例如三氟甲基。在某些优选的实施方案中，本公开提供了式(V)-(VI)任一种的化合物，其中： [0209] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、和氨基(C1-C6烷基)； [0210] R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤代(C1-C6烷氧基)； [0211] R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)硫代(C1-C6烷基)、或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；以及 [0212] R6是羟基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、或-OS(O)2CF3。 [0213] 在某些优选的实施方案中，所述抑制剂是式(V)-(VI)任一种的化合物，其中R1是氢；R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、羟基(C1-C6烷基)、甲酰基(C0-C6烷基)、或-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)；R6是羟基、C1-C6烷氧基、或-OS(O)2CF3；且R5是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、或卤代(C1-C6烷氧基)。GBPB抑制剂化合物包括药学可接受的盐、酯、酰胺、和其前药，以及可能时包括本发明化合物的两性离子形式，包括但不限于本发明化合物的羧酸盐、氨基酸加成盐、酯、酰胺和前药，其在合理的医学判断范围内并适用于与患者组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应等等，其与合理的利益/风险率相称，并有效用于其预期应用。术语“盐”指相对无毒性的、本发明化合物的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在化合物的最终分离和纯化过程中被原位制备，或者通过使自由碱形式的纯化的化合物与合适的有机或无机酸分别反应并分离所形成的盐而制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、醋酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月硅酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐、和月桂基磺酸盐，等等。这些可以包括基于碱金属和碱土金属的阳离子，例如钠、锂、钾、钙、镁等等，以及无毒性的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、乙基胺等等。(参见，例如Berge S.M.等人,“Pharmaceutical Salts,”J.Pharm.Sci.,1977；66:1-19，其通过引用而并入本文)。 [0214] 所述抑制剂的药学可接受的非毒性酯的实例包括C1-C6烷基酯，其中烷基基团是直链或支链的，经取代或未取代的，C5-C7环烷基酯，以及芳基烷基酯例如苄基和三苯基甲基。优选C1-C4烷基酯，例如甲基、乙基、2,2,2-三氯乙基，和叔丁基。本发明的化合物的酯可以根据常规方法制备。 [0215] 所述抑制剂的药学可接受的非毒性酰胺的实例包括衍生自氨、伯C1-C6烷基胺和仲C1-C6二烷基胺的酰胺，其中烷基基团是支链或支链的。在仲胺的情况下，胺也可以是包含一个氮原子的5-或6-元杂环的形式。优选衍生自氨、C1-C3烷基伯胺和C1-C2二烷基仲胺的酰胺。本发明化合物的酰胺可以根据常规方法制备。 [0216] 术语“前药”指在体内迅速转化以产生上述通式的亲本化合物的化合物，例如通过在血液中水解。在T.Higuchi and V.Stella,“Pro-drugs as Novel Delivery Systems,”Vol.14of the A.C.S.Symposium Series，以及Bioreversible Carriers in Drug Design,ed.Edward B.Roche,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中提供了关于前药的充分讨论，二者均通过引用而并入本文。 [0217] 除非另有说明，本文中使用的术语“烯基”指包含2-10个碳的直链或支链烃，并且其包含至少一个碳碳双键。烯基的代表性实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、3-丁烯基、4-戊烯基、5-己烯基、2-庚烯基、2-甲基-1-庚烯基、3-癸烯基、和3,7-二甲基八-2,6-二烯基。 [0218] 本文中使用的术语“烷氧基”是指如本文所定义的烷基，其通过氧原子被附加至亲本分子。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基。 [0219] 本文中使用的术语“烷基”是指包含1-10个碳原子的直链或支链烃，除非另有说明。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、和正癸基。当“烷基”基团是两个其它部分之间的连接基团时，其也可以是直链或支链；实例包括但不限于-CH2-，-CH2CH2-，-CH2CH2CHC(CH3)-，-CH2CH(CH2CH3)CH2-。 [0220] 术语“亚烷基”指二价烷基。“亚烷基链”是聚亚甲基基团，即-(CH2)n-，其中n是正整数，优选1-6、1-4、1-3、1-2，或2-3。经取代的亚烃基链是聚亚甲基，其中一个或多个亚甲基氢原子被取代基替代。合适的取代基包括下文针对经取代的脂肪基团所描述的那些。亚烷基链还可以在一个或多个位置被脂肪基团或经取代的脂肪基团取代。 [0221] 本文中使用的术语“炔基”指包含2-10个碳原子的直链或支链烃基，且包含至少一个碳碳三键。炔基的代表性实例包括但不限于乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，3-丁炔基，2-戊炔基，和1-丁炔基。 [0222] 本文中使用的术语“芳基”指苯基(即单环芳基)，或包含至少一个苯环的双环系统，或在芳香双环系统中仅包含碳原子的芳香双环。双环芳基可以是与单环环烷基、单环环烯基或单环杂环基融合的甘菊环基(azulenyl)，萘基，或苯基。双环芳基通过双环系统的苯基部分中所包含的任何碳原子、或萘基或甘菊环基环中的任何碳原子与亲本分子部分相连。双环芳基的融合单环环烷基或单环杂环基部分任选地被一个或两个氧和/或噻基团取代。双环芳基的代表性实例包括但不限于甘菊环基，萘基，二氢茚-1-基,二氢茚-2-基,二氢茚-3-基,二氢茚-4-基,2,3-二氢吲哚-4-基,2,3-二氢吲哚-5-基,2,3-二氢吲哚-6-基,2,3-二氢吲哚-7-基,茚-1-基,茚-2-基,茚-3-基,茚-4-基,二氢萘-2-基,二氢萘-3-基,二氢萘-4-基,二氢萘-1-基,5,6,7,8-四氢萘-1-基,5,6,7,8-四氢萘-2-基,2,3-二氢苯并呋喃-4-基,2,3-二氢苯并呋喃-5-基,2,3-二氢苯并 呋喃-6-基,2,3-二氢苯并呋喃-7-基,苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基,苯 并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基,2H-二氢苯并哌喃-2-酮-5-基,2H-二氢苯并哌 喃-2-酮-6-基,2H-二氢苯并哌喃-2-酮-7-基,2H-二氢苯并哌喃-2-酮-8-基,异二氢吲哚-1,3-二酮-4-基,异二氢吲哚-1,3-二酮-5-基,茚-1-酮-4-基,茚-1-酮-5-基,茚-1-酮-6-基,茚-1-酮-7-基,2,3-二氢苯并[b][1,4]二恶烷-5-基,2,3-二 氢苯并[b][1,4]二恶烷-6-基,2H-苯并[b][1,4]嗪3(4H)-酮-5-基,2H-苯并[b] [1,4]嗪3(4H)-酮-6-基,2H-苯并[b][1,4]嗪3(4H)-酮-7-基,2H-苯并[b][1,4] 嗪3(4H)-酮-8-基,苯并[d]嗪-2(3H)-酮-5-基,苯并[d]嗪-2(3H)-酮-6-基,苯 并[d]嗪-2(3H)-酮-7-基,苯并[d]嗪-2(3H)-酮-8-基,喹唑啉-4(3H)-酮-5-基, 喹唑啉-4(3H)-酮-6-基,喹唑啉-4(3H)-酮-7-基,喹唑啉-4(3H)-酮-8-基,喹 唑啉-2(1H)-酮-5-基,喹唑啉-2(1H)-酮-6-基,喹唑啉-2(1H)-酮-7-基,喹唑 啉-2(1H)-酮-8-基,苯并[d]噻唑-2(3H)-酮-4-基,苯并[d]噻唑-2(3H)-酮-5-基,苯并[d]噻唑-2(3H)-酮-6-基,和苯并[d]噻唑-2(3H)-酮-7-基。在某些实施方案中，所述双环芳基是与5或6元单环环烷基、5或6元单环环烯基、或5或6元单环杂环基融合的(i)萘基或(ii)苯环，其中所述融合的环烷基，环烯基，和杂环基任选地被一个或两个独立地是氧或噻的基团取代。 [0223] 本文中使用的术语“卤代”或“卤素”指-Cl,-Br,-I或–F。 [0224] 术语“卤代烷基”、“卤代烯基”和“卤代烷氧基”指烷基、烯基或烷氧基基团，其视情况被一个或多个卤素原子取代。 [0225] 本文中使用的术语“杂芳基”指包含至少一个杂芳环的单环杂芳基或双环系统。所述单环杂芳基可以是5或6元环。5元环由两个双键和一个、两个、三个或四个氮原子以及任选的一个氧或硫原子组成。6元环由三个双键和一个、两个、三个或四个氮原子组成。5或6元杂芳基通过杂芳基内包含的任何碳原子或任何氮原子与亲本分子部分相连。单环杂芳基的代表性实例包括但不限于呋喃基、咪唑基、异恶唑基、异噻唑基、氧杂二唑、恶唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、吡咯基、四唑基、噻二唑、噻唑基、噻吩基、三唑基、和三嗪基。双环杂芳基由与苯基、单环环烷基、单环环烯基、单环杂环基、或单环杂芳基融合的单环杂芳基组成。双环杂芳基基团的融合环烷基或杂环基部分任选地被独立地是氧或噻的一个或两个基团取代。当双环杂芳基包含融合的环烷基、环烯基、或杂环基环时，所述双环杂芳基基团通过双环系统的单环杂芳基部分内包含的任何碳或氮原子与亲本分子部分相连。当双环杂芳基是与苯并环融合的单环杂芳基时，所述双环杂芳基基团通过双环系统中的任何碳原子或氮原子与亲本分子部分相连。双环杂芳基的代表性实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并氧杂二唑、苯并氧杂噻二唑，苯并噻唑基、喋啶基，5,6-二羟基喹啉-2-基、5,6-二羟基异喹啉-1-基、呋喃嘧啶基、吲唑基、吲哚基、异喹啉基、萘啶基、喹啉基、嘌呤基、5,6,7,8-四羟基喹啉-2-基、5,6,7,8-四羟基喹啉-3-基、5,6,7,8-四羟基喹啉-4-基、5,6,7,8-四羟基喹啉-1-基、噻吩嘧啶、4,5,6,7-四氢苯并[c][1,2,5]氧杂二唑，和6,7-二氢苯并[c][1,2,5]氧杂二唑-4(5H)-酮基。在某些实施方案中，融合的双环杂芳基是与苯环、5或6元单环环烷基、5或6元单环杂芳环、5或6元单环环烯基、5或6元单环杂环基、或5或6元单环杂芳基融合的5或6元单环杂芳基环，其中融合的环烷基、环烯基和杂环基任选地被独立地是氧或噻的一个或多个基团取代。 [0226] GPBP抑制剂通常与适用于所示施用途径的一种或多种佐剂相组合。所述抑制剂可以与乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠和钙盐、阿拉伯树胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、和/或聚乙烯醇混合，并被制成片剂或胶囊用于常规施用。或者，所述抑制剂可被溶解于生理盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄芪胶，和/或各种缓冲剂中。其它佐剂和施用模式是药物领域众所周知的。载体或稀释剂可以包括延时材料，例如单独地或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或者本领域熟知的其它材料。 [0227] 所述抑制剂可以作为仅有的活性药物制剂被施用，或者它们可以与一种或多种可用于实施本发明方法的其它化合物组合使用。当组合施用时，治疗剂可以被配制成被同时或不同时给药的分开的组合物，或者所述治疗剂可以作为单一组合物给药。 [0228] 可以固体形式(包括微粒、粉末或栓剂)或液体形式(例如溶液、悬液或乳液)制成所述抑制剂。可以各种溶液形式应用所述抑制剂，并且可使其经受常规的制药操作例如灭菌和/或可以包含常规的佐剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、缓冲剂等。 [0229] 可以以包含常规非毒性药学可接受载体、佐剂和媒介物的剂量单位制剂口服、局部、肠胃外、通过吸入或喷雾或直肠地施用所述抑制剂。本文中使用的术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如静脉内)、肌肉内、或鞘内注射或输注技术等等。包含抑制剂的药物组合物可以是适于口服使用的形式，例如作为片剂、锭剂(troches)、锭剂(lozenges)、水性或油性悬液、可分散的粉末或微粒、乳剂、硬或软的胶囊、或糖浆或酏剂。 [0230] 意在用于口服使用的组合物可以通过本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法制备，并且此类组合物可以包含选自甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂的一种或多种试剂以提供可口的制备物。片剂包含与适用于片剂制造的非毒性的药学可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；造粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯树胶，以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包覆的或者它们可以用已知技术包覆。在一些情形中，可通过已知技术制备这种包衣以延缓崩解和胃肠道吸收，从而提供长期的持续作用。例如，可采用延时物质例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。 [0231] 口服应用的制剂也可以被呈递为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者被呈递为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。 [0232] 水性悬液包含与适用于制造水性悬液的赋形剂混合的活性材料。这种赋形剂是悬浮试剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯树胶；分散或湿润剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如硬脂酸聚氧乙烯酯，或者环氧乙烷和长链脂肪醇的缩合产物，例如十七乙烯氧基鲸蜡醇，或者环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或者环氧乙烷与与衍生自脂肪酸与己糖醇酐的部分酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯。所述水性悬液还可以包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂，例如蔗糖或糖精。 [0233] 可通过将所述抑制剂悬浮于植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或于矿物油例如液体石蜡中来配制油性悬液。油性悬液可以包含增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。 [0234] 适用于通过加入水而制备水性悬液的可分散粉末和微粒提供了所述抑制剂与分散或湿润剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂相混合。合适的分散或湿润剂或悬浮剂由上面已经提及的那些给予示例。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。 [0235] 所述抑制剂还可以以水包油乳液的形式被施用。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的胶例如阿拉伯树胶或黄芪胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或部分酯，例如山梨醇单油酸酯，和所述部分酯与环氧乙烯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。乳液还可以包含甜味剂和调味剂。 [0236] 糖浆和酏剂可以用甜味剂，例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖配制。这种制剂还可以包含缓和剂、防腐剂、以及调味剂和着色剂。抑制剂组合物可以是无菌可注射的水或油性悬液的形式。可使用上文提及的那些合适的分散或湿润剂以及悬浮剂来根据已知技术配制这种悬液。所述无菌可注射制剂还可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。在可接受的可被采用的媒介物和溶剂中有水、Ringer's溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油通常被用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的固定油包括合成的单或双甘酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于制备可注射剂。 [0237] 包含抑制剂的组合物还可以以栓剂的形式被施用，例如用于药物的直肠施用。可以通过将药物与在常温下是固体但在直肠温度下是液体并因此将会在直肠中融化以释放药物的合适的无刺激的赋形剂相混合而制备这些组合物。这种材料包括可可脂和聚乙二醇。 [0238] 本发明的包含抑制剂的组合物可以在无菌介质中被肠胃外施用。根据所使用的媒介物和浓度，所述药物可以被悬浮或溶解于所述媒介物中。有利地，可将佐剂例如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶于所述媒介物中。 [0239] 在大约0.01mg至大约50mg/公斤体重/天、更优选大约0.1mg至大约50mg/公斤体重/天的数量级上的抑制剂的剂量水平可用于治疗上述指出的病况。可以与载体物质组合以产生单一剂量形式的抑制剂的量将根据所治疗的宿主和特定的施用模式而不同。剂量单位形式将通常包含大约1mg至大约500mg抑制剂。 [0240] “药学可接受的”指下述那些化合物、物质、组合物、和/或剂量形式：其在可靠医学判断的范围内，适于与人类和动物组织接触，而没有过量的毒性、刺激、过敏反应、或者与合理的收益/风险率相称的其它问题或并发症，或者否则是被美国食品与药物管理局的批准为可接受用于人或家养动物的。 [0241] 在第四个方面，本发明提供了诊断风湿性关节炎(RA)或肺纤维化(PF)的方法，其包括： [0242] (a)使处于患RA或PF风险中的受试者的血浆样品与结合77kD GPBP的GPBP结合分子在促进所述GPBP结合分子与GPBP选择性结合的条件下接触； [0243] (b)检测GPBP结合分子与血浆样品中77kD GPBP之间的复合物形成； [0244] (c)将GPBP结合分子与血浆样品中77kD GPBP之间形成的复合物的量与对照相比较；并且 [0245] (d)基于该比较将所述受试者诊断为具有RA或PF，或者将该比较提供给用于诊断RA或PF的实体。 [0246] 处于患RA风险中的受试者是具有RA的任何症状或风险因素的那些受试者。症状包括但不限关节的炎症，其中受影响的关节肿胀、发热、疼痛和/或僵硬，特别是清晨睡醒或长期不活动之后；通常持续超过一小时的增加的清晨关节僵硬；肌腱束缚；肌腱受损；关节表面破坏；关节活动范围受损；涉及关节的变形(包括手/手指、脚/脚趾、颈椎、膝盖、和肩膀)；和关节功能丧失。 [0247] PF是肺中过量结缔组织的形成或发展(纤维化)。肺纤维化的症状包括但不限于呼吸急促例如进行性呼吸急促(伴随运动的呼吸困难)，慢性干咳，疲劳和虚弱，胸部不适，和/或食欲不振及体重快速减少。有时，听诊时可在肺底听到细呼吸性湿罗音。高分辨率的CAT扫描将通常显示异常。 [0248] 如下面的的实施例所示，77kD GPBP是RA和PF的前炎性标记物，循环77kD的量在RA和PF的前炎性阶段增加，然后随着炎性RA特征性肿胀关节中疼痛的发生，和炎性PF特征性的伴随运动的呼吸困难的发生而减少。因此，所述方法可被用于鉴别具有处于前炎症阶段的RA或PF的受试者，允许对患有RA或PF的受试者进行更早的治疗。 [0249] 因此，在优选的实施方案中，所述方法可被用于在具有前炎性RA症状(例如一个或多个肿胀关节、一个或多个僵硬关节、一个或多个发热关节、通常持续超过一小时的增加的清晨关节僵硬、滑液过量、滑膜中纤维组织的发展、和/或关节活动范围受损)的受试者中诊断RA。在另一个实施方案中，受试者在所有的一个或多个肿胀关节中都没有体验到疼痛。在另一个实施方案中，受试者未遭受关节软骨损伤或者一个或多个关节的关节僵硬。 [0250] 在另一个优选的实施方案中，所述方法可被用于在具有前炎性PF症状(例如慢性干咳、疲劳和虚弱、胸部不适、食欲不振和/或体重快速减少、和/或伴随运动的呼吸困难)的受试者中诊断PF。在其它的实施方案中，所述受试者不遭受休息时呼吸困难。 [0251] 虽然特定的诊断方法可能不提供对病况的确定性诊断，如果该方法提供辅助诊断的正面指示就足够了。 [0252] 如在该方面中所使用的，血浆样品中的77kD GPBP的量可以仅是完整的77kD GPBP，或者可以包含一定量77kD GPBP和77kD GPBP片段。 [0253] 所述受试者可以是可能从诊断受益的任何受试者，例如哺乳动物。在优选的实施方案中，所述受试者是人受试者。 [0254] 关节炎(RA)是慢性的、系统性的炎性病症，其可影响许多组织和器官，但主要攻击(滑液)关节。这个过程产生继发于滑膜细胞膨胀的关节周围囊的炎性应答，过量的滑液，和滑膜中纤维组织的发展。该疾病过程的病理学通常导致关节软骨的破坏和关节僵硬。RA还可以产生肺部、心包、胸膜、巩膜中的弥漫性炎症，和皮下组织中最常见的结节状病变。 [0255] 大约1％的世界人口受到RA困扰，与男性相比，对于女性为三倍更常见。其最常在40至50岁间发作，但是任何年龄的人都可能受到影响。它可以是致残性且痛苦的病况，如果没有充分治疗的话，其可导致机能和运动能力的实质性丧失。虽然美国风湿病学会(ACR)和欧洲抗风湿病联盟(EULAR)公布了诊断指南，但其临床诊断是基于症状、身体检查、X射线和实验室检测做出的。 [0256] 与一种或多种其它生物学分子、结构、细胞、组织等不同，“GPBP结合分子”是与77kD GPBP选择性结合的肽或核酸分子。此类GPBP结合分子的示例性实施方案包括但不限于抗体、适体或底物。本文中使用的“GPBP底物”是与77kD GPBP结合的GPBP生物活性靶标，或保留了GPBP结合活性的其片段。此类GPBP底物包括但不限于I-20(SEQ ID NO:18)，GPBP相互作用蛋白(GIP)(SEQ ID NOS:19-23)，髓磷脂碱性蛋白(MBP)及其衍生物(SEQ ID NOS:24-27)，朊病毒蛋白(PrP)(SEQ ID NO:28)，IV型胶原蛋白α3链NC1结构域(α3(IV)NC1)(SEQ ID NO:29)，和阿尔茨海默病β肽(Aβ1-42)(SEQ ID NO:30)。表明这些底物的GPBP结合的示例性参考文献可在美国专利号6,579,969；7,147,855；和7,326,768中找到，在此以其全部通过引用而并入。 [0257] “血浆样品”是指血浆，血液的液体组分，并且例如是通过将全血离心以除去血细胞来制备的。本文中使用的血浆样品还包括血清样品，其中除去了凝血因子。 [0258] 血浆样品可以得自任何合适的受试者，优选得自处于患RA或PF风险中的哺乳动物，包括但不限于人、狗、猫、马、或家畜(牛、羊等)。在最优选的实施方案中，所述血浆样品得自人受试者。如本文所公开的，发明人在RA和PF的动物模型中观察到了增加的循环77kD GPBP水平。 [0259] 所述抗体可以是任何选择性GPBP抗体，无论其是多克隆、单克隆或者上文所述的人源化单克隆，虽然优选单克隆抗体。 [0260] 适于促进GPBP结合分子，例如抗体、适体或底物与血浆样品中的77kD GPBP结合的条件可以由所属领域的技术人员根据本文的教导和下面提供的实施例确定。例如，抗体-抗原结合通常取决于疏水相互作用(所谓的疏水键)；因此，高盐浓度(例如摩尔范围内)可被用于减少非特异性结合和增加特异性抗原-抗体结合。任选地，可以包括其它步骤以促进选择性和特异性，这包括但不限于一个或多个洗涤步骤以除去未结合的77kD GPBP和/或GPBP结合分子，或者未结合或微弱结合的血清蛋白；非特异性结合的抑制剂以减少高浓度血清蛋白的结合，已知包含77kD GPBP的对照样品和/或已知不结合77kD GPBP的阴性对照，和/或已知不具有77kD GPBP的血浆样品(不包括：去除GPBP的)。 [0261] 所述方法可以通过标准技术检测血浆样品中77kD GPBP的存在，所述技术包括但不限于ELISA、免疫荧光和色谱(例如侧向流动检测，其中抗体被固定在表面上，标记血浆蛋白并允许其在适于允许该抗体与血浆中GPBP结合的条件下流过该表面)。在一个实施方案中，使用与流式细胞计数相关联的功能性珠(Becton Dickinson technology)；该技术是用于测量生物流体或细胞/组织提取物中蛋白水平的新兴方法。特别地，用一种或多种77kD GPBP抗体包覆由荧光基质制造的珠，将其与血浆样品混合并进一步用以藻红蛋白标记的检测抗体进行孵育。最后，通过流式细胞技术程序分析所述珠，所述程序根据基质荧光发射选择珠子并通过藻红蛋白发射测定分析物的水平。有多达三十种可以被细胞计数器同时检测并区分的不同类型的珠子。由于包覆GPBP抗体的特定的珠子类型可以与包覆有其它分析物的结合肽(即自身抗体)的不同珠子类型混合并同时测定，因此这种方法将高灵敏性和性能与多功能性结合在一起。对各种分析物的测定可以提高GPBP测定的潜在可能性。在一个实施方案中，该技术可仅检测77kD GPBP同种型的存在与否。或者，该技术可以是定量的，并提供关于样品中77kD GPBP相对含量的信息。为了定量的目的，优选ELISA。 [0262] 免疫复合物形成的检测可以通过标准检测技术实现。例如可以通过使用经标记的抗体或二抗实现免疫复合物的检测。这种方法，包括标记的选择，是所属领域的普通技术人员已知的。或者，抗体可以与可检测物质相偶联。术语“偶联”用于表示可检测物质与抗体物理连接。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。合适的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发125 131 35 3 光物质的实例包括鲁米诺。合适的放射性物质的实例包括 I、 I、S或 H。 [0263] 所述方法包括将待测血浆样品中的77kD GPBP水平与对照相比较，所述对照为例如来自于已知具有“正常”77kD GPBP水平的血浆样品的对照或之前测定过的从其获得血浆的受试者的血浆中77kD GPBP的正常值。在各种实施方案中，对照利用重组77kD GPBP或参照值提供标准曲线。在血浆样品77kD GPBP量与对照的比较中，血浆样品中77kD GPBP相对于对照的增加表示存在RA或PF。 [0264] 在另一个实施方案中，血浆中用作标准曲线参照的77kD GPBP的正常值是约1ng/ml-10ng/ml之间，而前炎性RA受试者超过正常值至少10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍甚至更高(即300倍)。因此，在各种实施方案中，如果受试者的77kD GPBP血浆水平是100ng/ml或更高、200ng/ml或更高、300ng/ml或更高、400ng/ml或更高、500ng/ml或更高、600ng/ml或更高、700ng/ml或更高、800ng/ml或更高、900ng/ml或更高、1000ng/ml或更高、2000ng/ml或更高、或3000ng/ml或更高，则处于患RA危险的该受试者被诊断为患有RA。 [0265] 前炎性PF模型超过正常77kD GPBP值至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或更多。因此，在各种实施方案中，如果受试者的77kD GPBP血浆水平是20ng/ml或更高、30ng/ml或更高、40ng/ml或更高、50ng/ml或更高、60ng/ml或更高、70ng/ml或更高、或80ng/ml或更高，则处于患PF危险的该受试者被诊断为患有PF。 [0266] 在其它的实施方案中，将77kD GPBP的检测与其它分析物的分析相结合时，所述方法允许进行对RA或PF的鉴别诊断或预后。在非限制性实施方案中，可以在处于患RA风险中的受试者中检测的其它分析物包括类风湿因子(RF)、抗CCP、抗突变的瓜氨酸化波形蛋白(抗MCV)。可以在处于PF风险中的受试者中检测的其它分析物包括转化生长因子β(TGF-β)。 [0267] 在该第四个方面的所有实施方案和实施方案的组合中的优选实施方案中，所述方法进一步包括测定受试者血浆中的C反应蛋白(CRP)水平。CRP是炎症标志物。如下文的实施例中所公开的，在CKD和RA中，血清中77kD GPBP和CRP的水平反相关：77kD GPBP血浆水平在CKD和RA的前炎性阶段升高，然后在炎性过程中降低。相反，CRP血浆水平在RA和CKD的炎性期升高，而在RA和CKD的前炎性期保持在基线水平。因此，在一个实施方案中，所述方法进一步包括测定血浆CRP的水平，将血浆CRP的量与对照相比；以及使用CRP比较辅助将受试者诊断为患有RA或PF。 [0268] 在另一个实施方案中，本发明提供了诊断CKD或免疫复合物介导的GN的方法，包括： [0269] (a)使处于患CKD或免疫复合物介导的GN风险中的受试者的血浆样品与结合77kD GPBP的GPBP结合分子在促进所述GPBP结合分子与GPBP选择性结合的条件下接触； [0270] (b)检测 [0271] (i)GPBP结合分子和血浆样品中77kD GPBP之间的复合物形成；以及 [0272] (ii)测定受试者的C反应蛋白(CRP)的血浆水平 [0273] (c)将 [0274] (i)GPBP结合分子和血浆样品中77kD GPBP之间形成的复合物的量与对照比较；以及 [0275] (ii)受试者血浆中CRP的量与对照比较；以及 [0276] (d)基于所述比较将受试者诊断为具有CKD或免疫复合物介导的GN，或者将所述比较提供给用于诊断CKD或免疫复合物介导的GN的实体。 [0277] 任何这些实施方案的方法，或其组合，可以进一步包含在两个或更多个时间点(即2、3、4、5或更多个时间点)测定来自于受试者的血浆中的77kD GPBP和CRP水平，将每个测定值与对照比较，并根据两次或更多次测定的比较将所述受试者诊断为患有RA、PF、CKD或免疫复合物介导的GN。在所有的实施方案中，可以从与测定77kD GPBP水平相同的血浆样品或不同的血浆样品中测定CRP水平。健康人血浆中的CRP正常浓度通常低于3μg/mL。由于发炎，CRP的水平为至少4μg/ml，例如对于轻微炎症为10μg/ml，对于活跃性炎症为40μg-200μg/ml(或更高)。 [0278] 在第五个方面，本发明提供了鉴别治疗CKD、免疫复合物介导的GN、和/或PF的化合物的方法，所述方法包括使77kD GPBP-77kD GPBP底物结合复合物与一个或多个待测化合物在结合条件下接触，其中替代结合复合物中的77kD GPBP的那些待测化合物是用于治疗CKD、免疫复合物介导的GN、和/或PF的候选化合物。 [0279] 在第六个方面，本发明提供了用于鉴别治疗CKD、免疫复合物介导的GN、和/或PF的方法，所述方法包括使77kD GPBP底物在结合条件下与下述相接触： [0280] (a)一个或多个待测化合物；以及 [0281] (b)77kD GPBP； [0282] 其中就与77kD GPBP底物的结合而言超过77kD GPBP的那些待测化合物是用于治疗CKD、免疫复合物介导的GN、和/或PF的候选化合物。 [0283] 在这些第五和第六实施方案中，合适的77kD GPBP如上文所述，这包括但不限于I-20(SEQ ID NO:18)，GPBP相互作用蛋白(GIP)(SEQ ID NOS:19-23)，髓磷脂碱性蛋白(MBP)及其衍生物(SEQ ID NOS:24-27)，朊病毒蛋白(PrP)(SEQ ID NO:28)，IV型胶原蛋白α3链NC1结构域(α3(IV)NC1)(SEQ ID NO:29)，和阿尔茨海默病β肽(Aβ1-42)(SEQ ID NO:30)。在一个优选的实施方案中，所述77kD GPBP底物包含α3(IV)NC1。显示出这些底物的GPBP结合的示例性参考文献可见于美国专利号6,579,969；7,147,855；和7,326,768中，在此以其全部通过引用而并入。 [0284] 如下文中的实施例所示，替代含有77kD GPBP底物的结合复合物中的77kD GPBP或者与77kD GPBP竞争结合77kD GPBP底物的化合物(例如抗体)是治疗CKD、免疫复合物介导的GN和或PF的候选化合物。评估待测化合物与α3(IV)NC1或其它77kD GPBP底物结合的适合的条件可以由所属领域的技术人员根据本文的教导确定。在一个实施方案中，可以使用例如下面的实施例中使用的那些条件。在一个非限制性实施方案中，可以用适当缓冲液中的适当量的α3(IV)NC1包被微孔板以评估结合相互作用。然后可以将所述板封闭以使非特异性结合最小化。在一个实施方案中，然后将所述板与一定量的77kD GPBP(例如天然77kD GPBP)在合适的条件下孵育以促进与α3(IV)NC1的结合(形成结合复合物)，继以任何适当的洗涤步骤(以除去未结合的77kd GPBP)，然后与一个或多个待测化合物结合以评估是否有任何待测化合物可替代微孔中77kD GPBP-α3(IV)NC1结合复合物中的77kD GPBP。在备选的实施方案中，77kD GPBP和一个或多个检测化合物同时在结合条件下接触，以鉴别就与α3(IV)NC1的结合而言能超过77kD GPBP的待测化合物。在这些实施方案中，所述77kD GPBP可被可检测地标记，和/或所述一个或多个待测化合物可以被可检测地标记以便于鉴别和分析结合事件。在非限制性的示例性的实施方案中，用PBS中的1μg/mL聚-His-α3(IV)NC1包被板。将板在4℃包被16h并用PBS中的3％BSA在室温下封闭 1h。封闭后，将板与1μg/mL FLAG-77kD GPBP在不存在或存在1μg/mL待测化合物的条件下在室温下伴随轻微摇晃孵育1-2小时。用1μg/mL抗-FLAG M2-过氧化物酶检测结合的FLAG-77kD GPBP。 [0285] 其它示例性的合适的条件如上文所述。例如，当待测化合物是抗体时，抗体-抗原结合通常取决于疏水相互作用(所谓的疏水键)；因此，高盐浓度(例如在摩尔范围内)可被用于减少非特异性结合及增加特异性抗原-抗体结合。任选地，可以包括其它步骤以促进选择性和特异性，这包括但不限于一个或多个洗涤步骤以除去未结合的77kD GPBP和/或检测化合物；已知包含与GPBP竞争结合77kD GPBP底物(如α3(IV)NC1)的竞争物的对照样品和/或已知不与77kD GPBP竞争结合77kD GPBP底物(如α3(IV)NC1)的阴性对照。 [0286] 所述方法可以使用标准技术，包括但不限于ELISA、免疫荧光和色谱。为了定量的目的，优选ELISA。结合事件的检测可以通过标准检测技术实现。例如可以通过使用经标记的抗体或二抗来实现对结合复合物的检测。这种方法(包括标记的选择)是所属领域的普通技术人员已知的。或者，抗体可以与可检测物质相偶联。术语“偶联”用于表示可检测物质与抗体物理连接。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。合适的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红 125 131 35 3 蛋白。发光物质的实例包括鲁米诺。合适的放射性物质的实例包括 I、 I、S或 H。 [0287] 当待测化合物包含多肽序列时，这种多肽可以被化学合成或重组表达。重组表达可以用本领域的标准方法实现，如上文所描述的。此类表达载体可以包含细菌或病毒表达载体，并且此类宿主细胞可以是原核的或真核的。用熟知的固相、液相或肽缩合技术或其任意组合制备的合成多肽可以包括天然和非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是标准Boc(Nα-氨基保护的Nα-t-叔丁氧羰基)氨基酸树脂，使用标准的去保护、中和、偶联和洗脱方案，或者标准的碱不稳定的Nα-氨基保护的9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸。可以从Sigma,Cambridge Research Biochemical或本领域技术人员熟悉的其它化学公司获得Fmoc和Boc Nα-氨基保护的氨基酸。此外，所述多肽可以用本领域技术人员熟悉的其它Nα-保护基团合成。固相肽合成可以通过本领域人员熟悉的技术实现，并例如通过使用自动化合成仪提供。 [0288] 当待测化合物包含抗体时，此类抗体可以是多克隆或单克隆。抗体可以是人源化的、全人的、或者鼠形式的抗体。这种抗体可以用众所周知的方法制造，例如Harlow and Lane,Antibodies；A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)所描述的。 [0289] 当待测化合物包含核苷酸序列时，此种核苷酸序列也可以被化学合成或重组表达。重组表达技术是本领域人员熟知的(参见，例如，Sambrook,等人,1989,见上)。核酸可以是DNA或RNA，可以是单链或双链的。类似地，此类核酸可以用本领域标准技术通过人工或自动化反应化学地或酶促地合成。如果是化学地或是通过体外酶促合成而合成，所述核酸可以在引入细胞前被纯化。例如可以通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱或其组合而从混合物中纯化所述核酸。或者，可以不纯化或进行最少的纯化而使用所述核酸以避免由于样品加工带来的损失。 [0290] 当待测化合物包含除多肽、抗体或核酸以外的化合物时，此类化合物可以用本领域中用于进行有机化学合成的各种方法中的任一种制造。【实施例】 [0291] 【实施例1.古德帕斯彻抗原-结合蛋白-1是免疫复合物介导的GN的治疗靶标】[0292] COL4A3BP(GPBP基因)表达至少三种多肽，这包括经典的GPBP-1，也称为77-kD GPBP或GPBP(1)；GPBP-2，mRNA外显子可变剪接同种型，也称为CERT或GPBPΔ26(2)；以及GPBP-3，由mRNA可变翻译起始产生的变体，也称为91-kD GPBP(3)。GPBP-1主要被分泌并与IV型胶原蛋白相互作用(3)；GPBP-2主要位于细胞质中(3)，在内质网和高尔基体之间转运神经酰胺(4)并诱导蛋白分泌(5)；GPBP-3与细胞膜相结合并促进GPBP-1输出(3)。 [0293] IV型胶原蛋白由六个不同的α链(α1-α6)组成，所述α链形成三种类型的三螺旋分子[α1.α1.α2(IV)，α3.α4.α5(IV)和α5.α5.α6(IV)](6)。肾小球的主要结构支持包括外周包膜-组织化的α3.α4.α5(IV)网络(GBM)和中心网孔-组织化α1.α1.α2(IV)网络(肾小球系膜基质)。在毛细血管壁上，α3.α4.α5(IV)网络(上皮的)与膜组织化α1.α1.α2(IV)网络(内皮的)融合以产生毛细血管GBM的骨架，其为肾小球过滤屏障的主要组分。 [0294] GPBP-1是非常规Ser/Thr激酶，其靶向IV型胶原蛋白(1)并调节其肾小球组织(7)。因此增加的GPBP-1表达引起肾小球过滤屏障上α3.α4.α5(IV)和α1.α1.α2(IV)网络的解离，并诱导α1.α1.α2(IV)网络的扩张，从而介导毛细血管塌陷(肾小球硬化症)。在狼疮倾向性NZW小鼠中，自身抗体的产生与肾小球过表达GPBP-1有关，并导致在被破坏的毛细血管GBM上形成免疫复合物沉积(7)。 [0295] GPBP-1被分泌至细胞外区室(3)，我们表明了GPBP-1是人血浆的组成部分(cGPBP-1)，并且cGPBP-1水平的增加与免疫复合物介导的GN有关(WO 2010/009856和US7935492)。在这里我们表明cGPBP-1是免疫复合物介导的GN的治疗靶标。 [0296] 【结果】 [0297] 【cGPBP-1的鉴别及其临床相关性的评估】 [0298] 为了分离cGPBP-1，使人血浆吸附到包含固定的mAb N26(GPBP特异性单克隆抗体(mAb)，)的亲和柱上，如WO 2010/009856和US7935492中所述。洗脱了所结合的物质，显示其含有与GPBP特异性抗体有反应的约77kDa的主要多肽和更低Mr的次要多肽，这证实了GPBP-1和衍生的产物是人血浆的正常组分。cGPBP-1的Mr在74kDa与80kDa之间变化，其取决于所使用的分子量标准(未显示)。 [0299] 为了测定cGPBP-1，我们开发了直接夹心ELISA，其中使用mAb N26作为捕获抗体以及mAb N27-HRP作为检测抗体，二者均与不同的非重叠的表位结合，如WO 2010/009856和US 7935492中所述。用重组GPBP-1制作的标准曲线显示出在0.4和400ng/mL之间的线性关系。使用这一标准，我们估计了人cGPBP-1的正常水平为低于10ng/mL，未检测到其随年龄和性别有明显变化。 [0300] 为了探究cGPBP-1检测的临床相关性，我们测定了其在蛋白尿(>0.5g/天)患者中的水平，发现了这些患者显示出更高的cGPBP-1水平。但是，当比较特定的临床实体和对照时，cGPBP-1水平的差异更有意义，因为只有患有IgA肾病或狼疮性肾炎的患者表现出升高的cGPBP-1水平，而其它患有普通肾病(多囊性肾病，PKD)或不由肾小球胶原蛋白上的免疫复合物的沉积介导的GN的患者没有统计学上显著的cGPBP-1水平的增加，如WO 2010/009856和US 7935492中所述。当检测抗体是mAb e11-2(识别GPBP-1而不识别GPBP-2的mAb)时获得了类似的结论。 [0301] 为了评估cGPBP-1水平的升高是否具有有害的生物学效果，用升高水平的重组cGPBP-1(200ng/mL)培养了A549人细胞，并分析了mRNA表达谱。没有观察到个体基因的表达上有统计学上显著的变化；但是，KEGG途径的功能分析揭示出升高的重组cGPBP-1激活了map05322途径(网站：genome.jp/dbget-bin/www_bget？pathway:map05322)，其与SLE的发作相关(表1)。 [0302] 【表1】 [0303] [0304] 【衰老的NZW小鼠中自身抗体和cGPBP-1的协调增加】 [0305] 我们先前已报道了衰老的NZW小鼠发生与GPBP-1增加的肾小球表达相关的自身免疫应答(SLE)(7)。虽然GPBP-1增加的肾小球表达可归因于增加的局部mRNA表达，肾小球中GPBP-1的积聚还可以是由于(至少部分地)肾小球结构中cGPBP-1的截留。因此，我们探究了cGPBP-1的水平是否反映SLE在NZW小鼠中的自然发展。有趣的是，衰老的NZW小鼠中cGPBP-1血浆水平增加了，并且其与自身抗体的血浆水平直接相关，这揭示了升高的cGPBP-1水平与病理学标志物之间的关系，而且还表明cGPBP-1水平的正常化或抑制作为阻止GN发展的治疗策略。 [0306] 【NZW小鼠中IgG免疫复合物的显著沉积】 [0307] 我们已经报道了NZW小鼠发生狼疮倾向性自身免疫应答，其由IgG和IgA自身抗体组成，并且在肾小球有IgA免疫复合物的显著沉积(7)。然而，在本研究中，NZW小鼠发生基于IgG的狼疮倾向性自身免疫应答，并且没有检测到循环IgA自身抗体(数据未显示)。为了进一步研究NZW小鼠中自身免疫应答和GN之间的关系，通过组化和免疫组化技术分析了衰老的小鼠(≥8个月)的肾。如之前所描述的(7)，我们发现了被破坏的GBM胶原蛋白网络以及大量的GPBP-1积聚在GBM的上皮组分与扩大的肾小球膜或内皮GBM组分之间(图3A)。组织学分析也表明存在多个病理学发现(图3B)：肾小球系膜增生(a)，透明血栓(b)，内皮下沉积物(c)，基质扩张(d)，线圈状沉积(wire-loop deposits)(e)，肾小球分叶(f)，毛细血管内增生(g)，肾小球炎性浸润(h)，坏死、核破裂和核固缩(i)，偶发的新月体(j)，肾小管间质炎性浸润(k)和肾小管萎缩(l)。我们还注意到存在大量IgG和C3c的粒状沉积物(主要分布在肾小球的外周)以及IgM沉积物(优先占据肾小球膜)。通过共聚焦显微镜分析和电镜进一步证实了IgG和C3c沉积物沿着GBM的上皮组分的定位(见下文)。最后，如先前所报道的(7)，在这些小鼠中没有可检测到的GN的临床表现。 [0308] 【GPBP-1阻断抗体的表征】 [0309] 评估了生物素化的mAb N12或N26抑制GPBP-1与IV型胶原蛋白[α3(IV)NC1]结合的能力，发现了这些mAbs可潜在地在体内阻断cGPBP-1(图1A)。 [0310] 为了研究mAb在血浆中的动力学，通过单次腹腔内推注(250μg)对NZW小鼠进行了注射并监控了它们的循环水平(图1B)。注射后3天两种mAbs都达到了峰值(10μg/mL)。mAb N12-生物素的水平在第8天下降一半，到第14天几乎检测不到，而mAb N26-生物素的水平在第14天还保持升高(6μg/mL)，这表明mAb N26-生物素的血清清除比mAb N12-生物素低。 [0311] 有趣的是，我们观察到抗体施用在小鼠中随时间增加了cGPBP-1的水平(未显示)，表明抗体靶向cGPBP-1并且引发了反弹效果。已描述了血浆水平的反弹效果与其它生物学处理有关(8)。 [0312] 【用抗GPBP mAb治疗NZW小鼠GN】 [0313] 为了评估mAb治疗GN的效力，给衰老的NZW小鼠(8-10月龄)注射PBS(载体)或约1μg/g体重的鼠IgG(对照)，mAb N12-生物素或mAb N26-生物素，此剂量被发现不引发反弹效果(图2)。第一次注射后，不管如何治疗，cGPBP-1水平下降，表明在研究开始的时候，对小鼠的操作激发的某些应激反应影响了cGPBP-1水平。然而，在第一周之后，cGPBP-1水平增加了，并且在第三周中几乎回复到了最初的水平，除了用mAb N12-生物素治疗的小鼠随着治疗的进行还保持为减少的，在第四周和第六周之间达到了统计学显著性(图2A)。此外，在整个研究进程中，用mAb N12-生物素治疗的小鼠中的cGPBP-1水平的降低比用mAb N26-治疗的小鼠更有效(图2B)。 [0314] 在治疗末期，处死了所有小鼠并对肾脏病理进行了评估(图3)。对照小鼠的肾表现出NZW免疫复合物介导的GN的特征性异常；然而，用GPBP-特异性抗体治疗的小鼠没有呈现相关的肾小球或肾小管损伤(HE和Mason)。相应地，生物学治疗减少了GPBP-1的肾小球沉积物，不影响GPBP在肾小管的细胞内表达，并且减少了免疫复合物(IgG，IgM和C3c)的沉积。通常在对照小鼠的毛细血管GBM的上皮侧发现的高电子密度沉积物的实质上缺乏也进一步支持了后者。与所有这些观察一致，在用GPBP特异性抗体治疗的小鼠中，肾小管间质炎性浸润急剧减少(HE)。 [0315] 【讨论】 [0316] 人们对包括IgA肾病和狼疮性肾炎肾炎(SLE的最严重表现形式)在内的免疫复合物介导的GN了解甚少。目前治疗这些病症的治疗选择是有限的而且不完全有效。贝利木单抗(抗B-淋巴细胞刺激物(BLYS)的mAb)代表在过去50年中已获得食品和药物管理局批准用于治疗SLE的第一个药物(9)。无论病因如何，CKD的特征是不可阻挡地向ESRD发展，其通过大量的肾小管间质纤维化显现，是所有类型的肾病最后的共同病理阶段。因此需要有新的生物标志物和治疗靶标用于早期检测和减弱CKD的发展。 [0317] 我们先前已经报道了衰老的NZW小鼠发生IgA和IgG狼疮倾向性自身抗体应答，伴随肾小球上显著的IgA沉积(7)。这里我们显示了NZW小鼠发生狼疮倾向性IgG自身免疫应答，伴随显著的肾小球IgG沉积。这些发现表明NZW小鼠的遗传背景使其易于患有SLE和免疫复合物介导的GN，但是沉积的免疫复合物的组成大体上取决于自身免疫应答的性质。由于NZW小鼠在遗传上是同种性的，预期自身免疫应答和因此沉积的免疫复合物的组成方面的差异是取决于环境因素。与此相一致的是，我们先前的研究是用宿养在标准动物设施中的NZW小鼠进行的，而对于本研究，NZW小鼠是被保持在无病原体的环境中。为了研究这种可能性，将得自商业供应商的年幼的NZW小鼠保持在无病原体或非无病原体条件下并进一步证实了NZW小鼠在无病原体环境中显著沉积IgG，而在非无病原体环境中显著沉积IgA(未发表的观察结果)。但是，在我们的两组研究中，GPBP-1依赖性GBM胶原蛋白改变是相似的，除了其炎性表现之外，这可归因于IgG免疫复合物沉积的更为促进炎症的状况。总之，证据表明NZW小鼠的遗传背景使其易于产生狼疮倾向性自身抗体和增加GPBP-1的肾小球表达；然而，环境因素将最终决定病理学严重性，这决定在破坏的GBM上产生和沉积的自身抗体的类型。相应地，NZW小鼠发生“炎性”类狼疮性肾炎(本实施例)或“非炎性”类IgA肾病(7)，这取决于它们分别被保持在无病原体还是较少限制性的环境中。 [0318] 当施用时，预期阻断抗体特异性抑制包含与组织结合的GPBP-1和cGPBP-1的胞外GPBP-1的活性。因此，本文的治疗测定是独特的检测，用于确定胞外GPBP-1在NZW小鼠发生的临床无症状的类狼疮性肾炎中的致病作用。我们的结果表明抗体治疗实质上修复了基于GBM胶原蛋白的改变，减少了免疫复合物在肾小球的沉积，并且因此减轻了炎症。表现出不同的降低cGPBP-1水平的能力、但在阻断GPBP-1与GBM胶原蛋白结合上具有相似活性的两种独立的mAb以类似的方式减弱了GN的发展。后者表明相比于cGPBP-1水平的清除，治疗效果更依赖于阻断。此外，抗GPBP治疗明显比降低cGPBP-1水平(图2)更有效地减少了肾小球GPBP-1沉积(图3)，这表明肾小球GPBP-1负责GBM胶原蛋白的去组织化。 [0319] 预期阻断抗体通过减少cGPBP-1与GBM胶原蛋白结合的能力并通过增加与组织结合的GPBP-1的释放来降低肾小球GPBP-1。虽然仍要确定cGPBP-1水平如何影响与组织结合的GPBP-1水平，两种GPBP-1源可能都有效并且，在更一般的情境下，引起主要(主要是局部产生)或次级(主要是远端产生)的免疫复合物介导的GN。 [0320] 与对于GN发展的有益效果相反，用mAb治疗在减少或减轻自身免疫应答方面无效(未公开的观察结果)。虽然循环GPBP-1的升高可与自身抗体相关，但是不相关的致病事件、它们在小鼠个体中的正相关(未公开的观察结果)却表明在常见的独特的致病级联中，cGPBP-1水平的诱导发生在自身抗体产生的下游。与此一致地，增加的GPBP-1表达在缺少自身抗体产生的情况下诱导免疫复合物GN(7)。 [0321] 总之，数据表明与组织结合的自身抗体诱导GPBP-1表达和分泌。GPBP-1或者在周围的胞外区室中保持与组织结合，或者进入血浆。在肾小球中，与组织结合的GPBP-1是由局部产生和cGPBP-1截留引起的。无论如何，与组织结合的GPBP-1的积聚是由增加的局部产生(主要GN)或增加的远端产生和随后的截留(次级GN)引起的，GBM胶原蛋白经历去组织化并促进额外的免疫复合物沉积形成。由升高的cGPBP-1介导的免疫复合物沉积和狼疮倾向性细胞刺激正向调节保持SLE和GN发展的发病机制。抗GPBP阻断性抗体减轻GBM胶原蛋白去组织化和免疫复合物沉积物形成，破坏致病性反馈。我们的数据鉴别了cGPBP-1，其为免疫复合物介导的GN的致病因子和治疗靶标。 [0322] 【实施例1的参考文献】 [0323] 1.Raya A,Revert F,Navarro S and Saus J.Characterization of a novel type of serine/threonine kinase that specifically phosphorylates the human Goodpasture antigen.J Biol Chem 1999；274:12642-12649。 [0324] 2.Raya A,Revert-Ros F,Martinez-Martinez P,Navarro S,Rosello E,Vieites B,Granero F,Forteza J and Saus J.Goodpasture antigen-binding protein,the kinase that phosphorylates the Goodpasture antigen,is an alternatively spliced variant implicated in autoimmune pathogenesis.J Biol Chem 2000；275:40392-40399。 [0325] 3.Revert F,Ventura I,Martínez-Martínez P,Granero-Moltó F,Revert-Ros F,Macías J and Saus J.Goodpasture antigen-binding protein is a soluble 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[0332] 【实施例2.cGPBP-1是前和促炎性生物标志物】 [0333] 【GPBP-1是促炎性因子】 [0334] 抗GPBP-1抗体治疗导致炎性浸润减少的发现(图3)提示我们研究GPBP-1是否作为促炎性因子起作用。 [0335] 对表达或不表达人重组GPBP-1的A549细胞的转录组的比较分析表明响应于人重组GPBP-1表达，NLRP3的表达特异性增加了，而其它相关NLRP家族成员的表达保持不变(表2)。 [0336] 【表2】 [0337]GEN 统计值 倍数 p,调整的 NLRP2 -0.518610385 -0.069824178 0.783545114 NLRP3 8.547879904 1.771963852 0.003351881 NLRP4 1.574117626 0.388428279 0.322787609 NLRP5 1.216975198 0.691560834 0.445902128 NLRP6 -1.526104933 -0.819338257 0.336900082 NLRP7 -0.207647712 -0.016592656 0.932245268 NLRP8 -0.244957718 -0.187884448 0.915529983 NLRP9 0.473037136 0.039491996 0.805796945 [0338] 类似地，Neuro 2a细胞中GPBP-1的过表达诱导IL-1β和NLRP5(炎性体组分)的mRNA表达升高。所有这些表明GPBP-1诱导前-IL-1β表达和炎性体活化。 [0339] 为了研究这种关系，我们使用了巨噬细胞RAW264.7和LPS以及多柔比星(1)来评估前-IL-1β表达和IL-1β释放。许多不同的试剂例如石棉、硅酸盐、尿酸晶体或多柔比星都是炎性体激活剂(2)，但是它们不能诱导前-IL-1β(37KDa)在巨噬细胞中的表达，这种表达依赖于Toll样受体(TLR)激动剂(即LPS)。用LPS刺激巨噬细胞后，前-IL-1β在细胞质中积聚，并且炎性体激活剂导致前-IL-1β分裂并向胞外介质释放成熟的IL-1β(17KDa)(3)。 [0340] 在我们的测定中，用1μg/ml的LPS过夜刺激RAW264.7巨噬细胞，并用10μM多柔比星激活NLRP3炎性体。在指定的时间通过ELISA测量培养基中被分泌的IL-1β和cGPBP-1，并通过蛋白质印迹分析了细胞溶解物中前-IL-1β和GPBP-1的细胞质表达(图4)。GPBP-1在RAW264.7细胞中的沉默引起前-IL-1β合成和IL-1β释放的减少(图4A和 4B)。这些细胞中cGPBP-1释放的时间模式与IL-1β的类似(图4B和4C)，因此经GPBP-1沉默的RAW264.7细胞表现出cGPBP-1释放的显著减少，这表明GPBP-1是细胞分泌的主要GPBP同种型。 [0341] 我们的数据还表明GPBP-1诱导前-IL-1β表达和炎性体激活，这导致cGPBP-1和IL-1β向胞外区室的协调分泌。 [0342] 【cGPBP-1是蛋白尿患者的前炎性生物标志物】 [0343] 为了进一步确定cGPBP-1在早期前炎性步骤中的作用，我们测定了蛋白尿患者血清中系统性炎症C反应蛋白(CRP)的生物标志物水平。我们发现在CRP和cGPBP-1血清水平之间存在反向关系(图5)，表明在这些患者中cGPBP-1水平的增加早于CRP水平，因此cGPBP-1应被设想为蛋白尿患者中的前炎性生物标志物。 [0344] 【cGPBP-1是RA的前炎性生物标志物】 [0345] 为了确定上述发现的范围，我们测定了经历介导RA的自身免疫应答的患者中的cGPBP-1水平并发现了这些患者相对于对照个体显示出增加的cGPBP-1水平(图6A)。有趣的是，当我们测量这些患者中的cGPBP-1和CRP水平时，我们得到了与分析蛋白尿患者时相似的结论，因而显示了cGPBP-1和CRP水平是被相反调节的(图6B)。 [0346] 近几十年来在我们对RA的发病机理中所涉及的免疫机制的了解上取得的巨大进展主要是由实验动物模型的发展带来的。在这之中，研究最多和最频繁使用的是用牛II型胶原蛋白(CIA)免疫接种后的自身免疫性关节炎模型。CIA的发展是由MHC控制的(4)，并且其临床进展由性激素控制，它在男性或以睾酮雄性化的女性中更为严重(5)。最近的发现支持了重组人Bcl-2在T细胞中的表达抑制CIA的发展。这可能是因为抗凋亡分子允许抑制自身免疫应答的调节性T细胞群体扩大(6)。我们使用了这个实验模型来研究对CIA发展中cGPBP-1水平的调节。在以II型胶原蛋白免疫接种的非转基因(tg)雌性小鼠(发生轻度CIA)和不能发生CIA的Bcl-2-Tg雌性小鼠中，cGPBP-1的水平在整个自身免疫过程中保持不变(p>0.05)。相反，发生严重CIA的小鼠[用抗CD25单克隆抗体处理后耗竭了调节性T细胞的、经II型胶原蛋白免疫接种的雄性小鼠或非Tg的雌性以及Bcl-2-Tg雌性小鼠(5,6)]在临床CIA发作之前表现出非常高的cGPBP-1水平(CIA诱导后4周；在所有情形中p<0.02)，但是一旦CIA临床显示高严重性，这些水平便显著减少，甚至低于在健康的非免疫接种对照中观察到的水平(CIA诱导后8周；在所有情形中p<0.05；图7)。总之，我们的数据表明循环GPBP-1是RA发病早期的生物标志物。 [0347] 【讨论】 [0348] IL-1β是原型的多功能细胞因子，其主要由血单核细胞产生，但也由巨噬细胞、树突细胞和几乎所有类型的各种细胞产生(7)。在数种炎性病症的发病机理和GN的人和动物模型中都涉及到IL-1β(7,8,9,10)。 [0349] 在激活炎性体的相同的促炎性刺激下协调IL-1β与cGPBP-1的释放。在促炎性条件(例如LPS刺激)下，前-IL-1β和GPBP-1在细胞中积聚。然后，在多柔比星介导的炎性体激活后，IL-1β和cGPBP-1均被分泌到胞外介质中。 [0350] 在经培养的巨噬细胞样鼠细胞系RAW 264.7中，GPBP-1的下调减少了前-IL-1β的产生并延迟了IL-1β的释放，这揭示了在促炎性级联中，GPBP-1的表达和激活比前-IL-1β的表达和激活更早。我们发现健康对照的血清中cGPBP-1的浓度低于10ng/ml，并且其在IgA肾病和狼疮性肾炎患者的血清中显著增加(见上文)。这与我们先前的关于GPBP-1在经历亚临床免疫复合物介导的GN的衰老的NZW肾的肾小球中积聚的发现一致(11)。在促炎性刺激后，巨噬细胞RAW264.7分泌大量的cGPBP-1(>20ng/ml)以及IL-1β，这提出了下述可能性：cGPBP-1可作为自分泌，旁分泌(肾小球中的cGPBP-1)或者甚至内分泌促炎性因子(血清中的cGPBP-1)起作用。此外，GPBP-2先前被提出为治疗炎症的靶标(12)，这是由于预期对它的抑制限制在响应于IL-1β的PGE2合成中神经酰胺的可获得性，表明GPBP-1和GPBP-2都是促炎性级联的一部分。此外，我们将cGPBP-1的水平与CRP(系统性炎症的标志物)的水平进行了相比较。在蛋白尿或RA患者的血清中这些蛋白的血清水平显示出反向相关，这表明cGPBP-1作为前-和促-炎性因子的双重作用。 [0351] 【参考文献】 [0352] 1.Sauter KA,Wood LJ,Wong J,Iordanov M and Magun BE.Doxorubicin and daunorubicin induce processing and release of interleukin-1βthrough activation of the NLRP3inflammasome.Cancer Biol Ther 2011；11:1008-1016。 [0353] 2.Schroder K,Zhou R and Tschopp J.The NLRP3Inflammasome:A Sensor for Metabolic Danger？Science 2010；327:296-300。 [0354] 3.Perregaux D and Gabel CA.Interleukin-1βMaturation and Release in Response to ATP and Nigericin.J Biol Chem 1994；269:15195-15203。 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当肺组织受到损害并有疤痕的时候发生肺纤维化(PF)。PF可能因不知名的原因发生(特发性PF)或者与多种状况相关或受其诱导，所述状况包括慢性炎症过程，感染，环境因素，暴露于电离辐射和某些药物下(1)。在这方面，估计有大约5-10％的接受癌症化疗的患者可能发生某种程度的PF。因此，已显示了博来霉素和多柔比星在不同的动物物种包括人中诱导PF(2-5)。PF患者的预后差，并且大部分患此病的患者在5年内死亡。不幸的是，没有药物已被显示改善PF患者的结果(1)，肺移植是目前可用的唯一治疗选择。 [0366] GPBP-1调节细胞内和细胞外结构蛋白的超分子组织构成(6,7)。由于GPBP-1的表达受到炎性刺激例如TNFα的调节(8,9)，并且炎症在纤维化过程的起始和/或发展中起到重要的作用，我们在此假设的是GPBP-1可能是以不同类型胶原蛋白(即I型胶原蛋白)异常积聚为特征的疾病例如PF的发病中所涉及的关键分子。在我们当前的研究中，我们表征了两种来自Pretswick Chemical Library的化合物具有在体外调节GPBP-1活性的能力。用小鼠中多柔比星诱导的PF的实验模型在体内评估了这些化合物，吡那地尔和杨梅酮的治疗能力。最后，为了证实GPBP-1是多柔比星诱导的PF的靶标，我们使用了GPBP-1的两种不同的单克隆抗体，mAb 14和mAb N12以治疗小鼠中多柔比星诱导的PF。 [0367] 【结果】 [0368] 【多柔比星的气管内滴注促成PF】 [0369] 向C57BL/6雄性小鼠中气管内(i.t.)滴注75μg多柔比星引起在药物施用12天后肺结构中发生一般化改变，其肉眼可见的特征是出现出血的肺部严重炎症(图8)。组织学分析显示严重的炎性细胞浸润，这包括存在血管周肉芽肿和间质基质沉积，其导致肺泡闭塞(图8,HE)。对肺进行马松三色染色后证明了间质基质沉积的成胶状态(图8)。与组织学病变的发展同时，通过RT-qPCR分析在经多柔比星处理的小鼠的肺中观察到α1-胶原蛋白I基因表达的增加(图9)。 [0370] 【在多柔比星诱导的PF的诱导过程中GPBP-1的表达增加】 [0371] 为了探究GPBP-1可能参与多柔比星诱导的PF的发病，我们首先通过ELISA在多柔比星滴注后不同的时间点测定了循环GPBP-1的水平：GPBP-1的血清水平在多柔比星滴注后早期(第5天)急剧增加，随后在第12天当炎症和纤维化在临床上明显时下降到最低值(图9A，在所有情形中p<0.05)，在此情形中表达的水平与对照类似(图9B)。最后，用特异性抗GPBP-1多克隆抗体进行的免疫组化研究(6)显示出GPBP-1在未处理的小鼠的肺中以非常低的水平表达，并且其表达局限于支气管上皮(图9C)。与此相反，在经多柔比星处理的小鼠的肺中观察到GPBP-1表达的增加，其位于支气管上皮和软组织二者中。在这最后的位置，GPBP-1表达采取与细胞外基质沉积有关的斑块模式(patched pattern)(图9C)。 [0372] 【吡那地尔和杨梅酮，GPBP-1的两个体外抑制剂，在体内改善由多柔比星诱导的PF】 [0373] 选择了来自于the Pretwick Chemical Library的两种化合物，吡那地尔和杨梅酮，因为它们具有在体外干扰GPBP-1活性的能力(未显示)。 [0374] 我们在此探究了吡那地尔和杨梅酮在治疗多柔比星诱导的PF中的潜在应用。首先，用多柔比星对小鼠进行气管内滴注，并从实验的开始直到结束(第0-12天)用不同剂量的吡那地尔进行处理。0.08mg/kg吡那地尔的每日剂量强烈降低了多柔比星诱导的肺纤维化的严重程度(图10)，并且与此一致地，在经吡那地尔治疗的小鼠中观察到了肺α1(I)胶原蛋白mRNA表达的显著减少(图11A)。更低剂量的吡那地尔导致类似的α1(I)胶原蛋白mRNA表达的减少(图11A)。突出地，当施用更高剂量的药物时(0.25或1.225mg/kg/天)，吡那地尔的治疗效果丧失了(图11A)。相反，当用杨梅酮处理小鼠时，在所有检测的剂量都获得了多柔比星诱导的纤维化的有效减少(图11B)。 [0375] 【mAb 14和mAb N26，GPBP-1的两种单克隆抗体，在体内改善多柔比星诱导的PF】[0376] 我们探究了mAb 14和mAb N12在治疗多柔比星诱导的PF中的潜在应用。用多柔比星对四组小鼠进行气管内注射，并从气管内滴注后的第一天起用抗转化生长因子β的单克隆抗体(一种已知的抗纤维化治疗)(αTGFβ；1mg/周，分为3次剂量)(10)，或者用mAb-14(1mg/周，分为3次剂量)，或者用mAb N12(25μg/周，单次注射)进行处理，或者不进行处理(Doxo)。为了评估对肺纤维化的治疗效果，通过RT-qPCR测定了肺中胶原蛋白I(2)和胶原蛋白IV的α1链的mRNA表达。多柔比星增加了α1(I)和α1(IV)二者的表达(纤维化)。抗GPBP-1的mAb比αTGF更好地减少了α1(I)和α1(IV)二者的表达，αTGF不显著减少α1(IV)的表达，并且对α1(I)的表达的影响更有限(*P<0.05，***P<0.001)。(图12) [0377] 【结论】 [0378] 多柔比星诱导的PF的气管内滴注。 [0379] 1)在多柔比星诱导的PF的发展过程中观察到血清中cGPBP-1水 [0380] 平和肺中GPBP-1水平的增加。 [0381] 2)四种不同的GPBP-1抑制剂，包括抗GPBP-1的两种mAb，改 [0382] 善了多柔比星诱导的PF。 [0383] 【参考文献】 [0384] 1.Noth I and Martinez FJ.Recent advances in idiopathic pulmonary fibrosis.Chest 2007；132:637-650。 [0385] 2.Sleijfer S.Bleomycin-induced pneumonitis.Chest 2001；120:617-624。 [0386] 3.Injac R and Strukelj B.Recent advances in protection against doxorubicin-induced toxicity.TechnolCancer Res Treat 2008；7:497-516。 [0387] 4.Meadors M,Floyd J and Perry MC.Pulmonary toxicity of chemotherapy Semin Oncol 2006；33:98-105。 [0388] 5. 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Ibérica(Barcelona,西班牙)购买了5-10周大的C57BL/6雄性小鼠。为了进行多柔比星(Sigma)的气管内(i.t.)滴注，通过腹膜内(i.p.)注射氯胺酮(50μg/g体重)，阿托品(0,2μg/g)和安定(4μg/g)麻醉了小鼠。通过在颈部的前缘部切割皮肤并用镊子固定来定位气管。然后用30G针气管内注射75μl多柔比星盐酸盐(1mg/ml)。然后用3/0丝缝合皮肤。用正常饮食任意喂养小鼠，并在多柔比星气管内滴注后在不同的时间点从框后丛取血。根据其在体外抑制GPBP的自身磷酸化活性的能力，从Pretswick Chemical Library选择了吡那地尔和杨梅酮。向气管内滴注了多柔比星的小鼠每天腹膜内注射0.027，0.08，0.25或1.225mg/kg吡那地尔，或者0.11，0.34或0.95mg/kg杨梅酮。在多柔比星施用后12天处死小鼠进行基因表达分析和肺的病理解剖研究。 [0399] 【人血清样品】 [0400] 在先经过 相应的 伦理委员 会批准 的程 序之后，自 Hospital 12de Octubre(Madrid,Spain) 和 Washington University George M.O'Brien Center for Kidney Disease Research(St Louis,USA)获得了人血清样品。除了PKD之外，患者的诊断得到了相应肾活检的组织学分析的支持。 [0401] 【抗体和蛋白质印迹】 [0402] 单克隆抗体N12，N26，和N27是抗毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)人重组GPBP-1而产生的，先前报道过其产生(1,2)。单克隆抗体e11-2是抗GST-e26而产生的，GST-e26是在大肠杆菌(E.coli)中表达的，其包含与谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的由GPBP-1的外显子11(在GPBP-2中不存在)编码的蛋白质序列。当显示时，mAb N12和N26用磺基-NHS-LC-生物素(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)进行了生物素标记并TM被用于体内测定。对于免疫荧光研究，用经Alexa Fluor 546(Invitrogen,Carlsbad,CA)标记的mAb N27或先前表征过的鸡抗GPBP-pep1单克隆抗体(3)使GPBP-1可见。用辣根TM 过氧化物酶(HRP；EZ-LINK Plus Activated Peroxidase,Thermo Fisher Scientific)标记的单克隆抗体N27被用于检测重组GPBP-1和cGPBP-1。 [0403] 按照标准程序，在还原条件下进行了SDS-PAGE和蛋白质印迹。 [0404] 【商业抗体】 [0405] AlexaTM Fluor 647(Invitrogen,Carlsbad,CA)标记的山羊抗IV型胶原蛋白多克隆抗体(Chemicon,Temecula,CA)，和生物素标记的抗α3(IV)mAb3(Wieslab AB,Lund,Sweden)分别被用于检测肾小球α1.α1.α2(IV)和α3.α4.α5(IV)网络。用抗FLAG M2-过氧化物酶(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)检测了重组cGPBP-1和α3(IV)NC1结构域二者。补体成分3c(C3c)，IgA，IgG和IgM沉积物分别用兔多克隆抗C3c-FITC(Abcam)和山羊抗小鼠IgA-，IgG-或IgM-FITC(Sigma-Aldrich)可视化。用高灵敏度NeutrAvidin-HRP(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)，链霉亲和TM 素-AF488(Invitrogen)或Extravidin -TRITC(Sigma-Aldrich)检测了生物素化抗体。 所使用的二抗为抗鸡IgY-FITC的山羊多克隆抗体(Abcam)和驴抗小鼠IgG-HRP(Jackson InmunoResearch Europe Ltd,Suffolk,UK)。 [0406] 【细胞培养】 [0407] 用Dulbecco’s改良Eagle’s F-12培养A549细胞，而用Dulbecco’s改良Eagle’s培养基培养HEK 293和RAW 264.7。所有的培养基都补充了10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素。 [0408] 【质粒构建和细胞转染】 [0409] 采用了pSilencerTM 2.1-U6hygro载体(Ambion)来进行特异用于沉默GPBP-1的小干扰mRNA(siRNA)的稳定表达。所衍生的构建体被命名为pSi-GPBP-1，cDNA靶序列是GCCCTATAGTCGCTCTTCC(SEQ ID NO:11)，如之前所描述的(4)。 [0410] 为了表达和纯化GST-e26(其用于获得mAb e11-2抗体)，将GPBP-1外显子11的cDNA在框内克隆到pGEX-5x-1载体(GE Healthcare)中GST的cDNA的下游。 [0411] 根据制造商的建议，使用ProFectionTM哺乳动物转染系统(Promega)或Lipofectamine 2000(Invitrogen)通过磷酸钙程序进行了RAW 264.7细胞的转染。通过对细胞提取物的蛋白质印迹分析测了定单个克隆中GPBP-1的表达。使用了表达减少水平的GPBP-1的克隆进行功能研究。 [0412] 【细胞处理】 [0413] 将野生型RAW 264.7细胞和GPBP-1沉默的RAW 264.7细胞以2x106细胞/孔铺板于6孔培养板中，并用1μg/ml LPS(Sigma-Aldrich,大肠杆菌血清型026:B6)刺激过夜(16h)。然后在2，4和6h中，将经LPS引发的巨噬细胞暴露于10μM多柔比星(Sigma-Aldrich)。在用多柔比星孵育后，通过蛋白质印迹分析了细胞溶解物中前-IL-1β和细胞质GPBP-1的表达，并通过ELISA定量了培养基上清液中的成熟IL-1β和cGPBP-1。 [0414] 通 过 在 裂 解 缓 冲 液(25mM Tris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl,1 ％ Triton X-100,0.1％SDS,1μM亮抑酶肽,1mM PMSF)中破碎细胞获得了细胞裂解物，并在冰上孵育10min。通过在4℃下以15,000x g离心10分钟使裂解物澄清，并通过蛋白质印迹进行分析。 [0415] 【GPBP-1和GST-e26的重组表达和纯化】 [0416] 从大肠杆菌中纯化了ELISA中所使用的重组聚-His-GPBP-1，该大肠杆菌经被同框克隆到表达质粒pET-15b(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)的多克隆位点的GPBP-1cDNA转化，其添加了六个组氨酸的标签以促进根据标准程序用镍螯合的琼脂糖柱(Clontech Laboratories,Mountain View,CA)进行纯化。 [0417] 使用抗-FLAG M2Affinity Gel(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)从组成型分泌FLAG-GPBP-1的HEK 293细胞克隆的细胞培养基中纯化了重组的cGPBP-1(rcGPBP-1)。 [0418] 用1mM IPTG在包含pGEX-5x-1-e26构建体的大肠杆菌DH5α细胞中诱导了GST-e26表达，并根据制造商的建议用GSH-琼脂糖亲和树脂(Sigma)进行了纯化。 [0419] 通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色评估了聚-His-GPBP-1，rcGPBP-1或GST-e26的纯度，用GPBP-1的mAb(包括mAb N26，mAb N27和mAb e11-2)通过蛋白质印迹评估了其完整性。 [0420] 【病理学研究】 [0421] 在CO2室中处死了所有小鼠。在用抗体进行的体内实验(实施例1)后，将肾固定在10％福尔马林中并包埋在石蜡中。通过电子旋转切片机(Microm,Walldorf,Germany)获得了2μm的切片，并使其经受常规的苏木精/曙红(HE)，马松染色(Masson)。 [0422] 在PF测定中，用4％磷酸盐缓冲的福尔马林支气管内地灌注小鼠的肺，然后在此固定剂中孵育24小时，最后包埋在石蜡中。按照常规方法用HE或马松三色对5μm的组织切片进行染色。对于免疫组化，用抗GPBP-pep1抗体(3)对石蜡包埋的肺进行染色，用抗-鸡-HPR和DAB底物(Dako Diagnósticos,S.A.,Barcelona Spain)进行检测。用苏木精对样品进行复染。 [0423] 【免疫荧光】 [0424] 将肾包埋在OCT(Sakura,Tokyo,Japan)中并冷冻。用低温恒温器(Microm)获得了6μm的切片并染色以进行常规的共聚焦显微镜分析，如前所述(3)。 [0425] 【微阵列分析】 [0426] 加入或不加200ng/mL的rcGPBP-1而培养人A549细胞3小时。然后裂解细胞，TM并用RNeasy Protect微型试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)根据制造商的建议提取总TM RNA。用NanoDrop ND1000(NanoDrop Technologies,Wilminton,DE)通过光谱测定法定量RNA并通过RNA 6000Nano Bioanalyzer(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)测定TM 证实了其质量。简要地，用Low Input Quick Amp Labelling Kit One-Color(Agilent)根据制造商的说明用150ng总RNA产生花青3-CTP-标记的cRNA。按照‘One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis’方案6.0版本(Agilent)，使1600ng经标记的cRNA与包含41000+独特人基因和转录物的全人基因组寡核苷酸微阵列试剂盒(Agilent)杂交。在Agilent微阵列扫描仪上根据制造商的说明扫描阵列，并按照Agilent方案GE1_107_Sep09，网格模板014850_D_F_20100430和QC Metric Set GE1_QCMT_Sep09用Agilent Feature Extraction软件10.7.1提取数据。用Agilent微阵列扫描仪(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)在Centro de Investigación Príncipe Felipe(Valencia,Spain)的基因组核心服务中进行了分析。 [0427] 使用供应商的方法对原始数据文件进行了本底校正，并通过分位数归一化算法对阵列进行强度信号标准化。使用limma moderated t-检验对所有比较的差异基因表达进行了评估。使用了Benjamini Hochberg提出的(5)对多重检验的常规调整以获得经调整的P值。而且，对于本研究中所进行的每一个比较，使用对数回归模型进行了基因集分析，并如之前所述对多重检验进行了校正(5)。使用Bioinformatics Department of Centro TMde Investigación Príncipe Felipe的Babelomics (6)网站套件进行了所有的分析。阵列数据被储存在GEO(登录号GSE32181)。 [0428] 【实时PCR分析】 [0429] 在实验性肺纤维化的测定中，通过实时定量PCR分析了(RT-qPCR)GPBP和I型和IV型胶原蛋白mRNA在肺中的表达。根据制造商的说明，用RT-PCR试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)用1μg经分离的RNA进行了cDNA合成。用特异 性 引 物 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,Life Technologies Corporation) 在 MX-3000P Stratagene 设 备 (Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA)上进行了RT-qPCR。所使用的引物是：对于α1(I)胶原蛋白基因，5’引物5’-TCCTGCTGGTGAGAAAGGAT-3’(SEQ ID NO:12)，3’引物5’-CTGGAGTCCCATAACGACCT-3’(SEQ ID NO:13)；对于GPBP基因，5’引物5’-GCTGTTGAAGCTGCTCTTGACA-3’(SEQ ID NO:14)； 3’引 物5’-CCTGGGAGCTGAATCTGTGAA-3’(SEQ ID NO:15)；对 于 18S基 因5’引 物 5’-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3’(SEQ ID NO:16)，3’引物5’-GCGATGATGGCTAACCTACC-3’(SEQ ID NO:17)。相对于核糖体18S亚基的表达使结果(一式三份)归一化，并且在每个样品中平行测量。将数据表示为相对于对照样品的平均倍数变化。 [0430] 【cGPBP-1的免疫纯化】 [0431] 通过亲和色谱从人血浆中提取了cGPBP-1。特别地，将血浆(200mL)通过离心澄清，过滤(0.45μm)，并用补充了0.05％Tween 20的25mM Tris pH 7.4,150mM NaCl(Tris缓冲液,TBS)(TBST)1:5(v/v)稀释。将上清液加载到包含固定在1mL溴化氰活化的琼脂糖4B(Sigma-Aldrich)中的1mg mAb N26的柱上。用10mL TBST洗涤所结合的物质，用TMImmunoPure Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液(Thermo Fisher Scientific)洗脱，并相对于TBS充分透析。 [0432] 【ELISA程序】 [0433] 为了评估GPBP-1与IV型胶原蛋白α3链的非胶原性1结构域[α3(IV)NC1]之间的相互作用，用PBS中的1μg/mL聚-His-GPBP-1包被板。封闭后，将板在不存在或存在1μg/mL mAb N12或N26的条件下与1μg/mL FLAG-α3(IV)NC1孵育。用1μg/mL抗-FLAG M2-过氧化物酶检测结合的FLAG-α3(IV)NC1。 [0434] 分别用PBS中的2μg/mL的mAb N26或聚-His-GPBP-1包被板，通过夹心ELISA来定量cGPBP-1或生物素化的mAb。将板封闭并用样品(1:10-1:20稀释)孵育，分别用1μg/TMmL的mAb N27-HRP或高灵敏度NeutrAvidin -HRP进行了检测。 [0435] 在所有的情形中，将板在4℃下包被16h，并用PBS中的3％BSA在室温封闭1h。随后在室温伴随轻微摇晃进行1-2小时随后的孵育。在各步骤之间充分清洗板，并用荧光TM HRP底物(Quanta Blue,Thermo Fisher Scientific)显色。用SpectraMax Gemini XPS Fluorescence Microplate Reader(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测量荧光强度，用TM SoftMax Pro Data Acquisition&Analysis软件(Molecular Devices)分析所获得的数据。除非另外指出，用TBST进行了所有的稀释和洗涤。 [0436] 按照制造商的说明，分别使用Alpha Diagnostic Intl.(San Antonio,TX)和Meditec(Kiel,Germany)的商业试剂盒通过间接夹心ELISA测量了抗-ss-DNA IgG和CRP滴度。 [0437] 为了评估由经刺激的RAW 264.7细胞产生的成熟IL-1β，根据制造商的说明，使用用于鼠IL-1β的ELISA Ready-Set-Go试剂盒(eBioscience,San Diego,CA)分析了细胞培养基。 [0438] 【电镜研究】 [0439] 切割肾并通过在0.1M磷酸钠pH 7.4(PB)中的2％多聚甲醛和2.5％戊二醛中，在4℃下浸泡24小时而将其固定，然后用PB洗涤。用振动切片机(Leica VT-1000；Leica Microsystems Heidelberg GmbH,Mannheim，德国)获得了200μm的切片，用PB中的2％四氧化锇固定了1.5小时，用蒸馏水洗涤(3x 5min)，通过用浓度增加的冷冻乙醇溶液顺次洗涤(30％5分钟，50％5分钟，70％10分钟)进行脱水，用70％乙醇中的2％乙酸铀酰于4℃洗涤2.5小时，并通过70％乙醇洗涤2x 5分钟，以96％乙醇洗涤2x 5分钟和10分钟，用100％乙醇洗涤2x 7分钟，以及用100％无水乙醇单次洗涤10分钟而进行进一步脱水。 最后用环氧丙烷将切片洗涤2x 10分钟并包埋于环氧树脂(Durcupan,Sigma-Aldrich)中。 用金刚石刀切割1.5μm的半薄切片和0.08μm的超薄切片，并用分别用1％甲苯胺蓝和柠檬酸铅(Reynolds solution)染色。 [0440] 【统计学分析】 [0441] 使用了Prism 4.0软件(GraphPadTM Software,San Diego,CA)进行所有的计算。用双向ANOVA或Kruskal-Wallis检验分析了数据以评估各系列之间的显著性差异，用Spearman's检验分析了数据以确定cGPBP-1和抗-ssDNA自身抗体之间相关性的统计学显著性。P值<0.05被认为是显著的。 [0442] 【参考文献】 [0443] 1.Raya A,Revert F,Navarro S and Saus J.Characterization of a novel type of serine/threonine kinase that specifically phosphorylates the human Goodpasture antigen.J Biol Chem1999；274:12642-12649。 [0444] 2.Raya A,Revert-Ros F,Martinez-Martinez P,Navarro S,Rosello E,Vieites B,Granero F,Forteza J and Saus 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I,Carbonell J,Pulido L,Madeira SC,Goetz S,Conesa A,Tárraga J,Pascual-Montano A,Nogales-Cadenas R,Santoyo J,García F,MarbàM,Montaner D and Dopazo J.Babelomics:an integrative platform for the analysis of transcriptomics,proteomics and genomic data with advanced functional profiling.Nucleic Acids Res 2010；38(Web Server issue):W210-W213。 [0450] 1.一种治疗肺纤维化(PF)的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的77kD GPBP的抑制剂以治疗PF。 [0451] 2.实施方式1的方法，其中所述PF是非特发性PF。 [0452] 3.一种治疗慢性肾病(CKD)的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的77kD GPBP的抑制剂以治疗CKD。 [0453] 4.一种治疗免疫复合物介导的GN的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的77kD GPBP的抑制剂以治疗免疫复合物介导的GN。 [0454] 5.实施方式4的方法，其中所述免疫复合物介导的GN与选自下组的自身免疫性病症相关：IgA肾病、系统性红斑狼疮(SLE)和古德帕斯彻氏病。 [0455] 6.实施方式1-5中任一项的方法，其中所述受试者是人。 [0456] 7.实施方式1-6中任一项的方法，其中所述77kD GPBP抑制剂是与77kD GPBP相结合的抗体。 [0457] 8.实施方式7的方法，其中所述抗体对于77kD GPBP同种型有选择性。 [0458] 9.实施方式7或8的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。 [0459] 10.实施方式1-9中任一项的方法，其中所述GPBP抑制剂包含含有根据通式X1-SHCIX2-X3(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的多肽，其中： [0460] X1是序列ATTAGILATL(SEQ ID NO:3)的0-10个氨基酸； [0461] X2是E或Q；以及 [0462] X3是序列LMVKREDSWQ(SEQ ID NO:4)的0-10个氨基酸。 [0463] 11.实施方式1-10中任一项的方法，其中所述GPBP抑制剂包含式(I)的化合物： [0464] [0465] 或其药学可接受的盐，其中： [0466] R选自N和CR5； [0467] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C2-C6烷基、和(杂芳基)C1-C6烷基； [0468] R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、或(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)； [0469] R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基； [0470] R3是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C1-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基；以及 [0471] R4是羟基、卤素、C1-C6烷 基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、卞氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷 氧 基 )、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-O(CH2)1-5-C(O)OH、-O(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基。 [0472] 12.一种诊断风湿性关节炎(RA)或肺纤维化(PF)的方法，包括： [0473] (a)使处于患RA或PF的风险中的的受试者的血浆样品与结合77kD GPBP的GPBP结合分子在促进所述GPBP结合分子与所述77-kD GPBP选择性结合的条件下接触； [0474] (b)检测所述GPBP结合分子与血浆样品中77kD GPBP之间的复合物形成； [0475] (c)将所述GPBP结合分子与血浆样品中77kD GPBP之间形成的复合物的量与对照进行比较；以及 [0476] (d)基于所述比较将所述受试者诊断为患有RA或PF，或者将该比较提供给用于诊断RA或PF的实体。 [0477] 13.实施方式12的方法，其中所述77kD GPBP结合分子包含与天然77kD GPBP结合的抗体。 [0478] 14.实施方式13的方法，其中所述抗体对77kD GPBP同种型有选择性。 [0479] 15.实施方式13或14的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。 [0480] 16.实施方式12-15中任一项的方法，其中所述检测包括使用选自下列的技术：ELISA、免疫荧光和色谱。 [0481] 17.实施方式12-16中任一项的方法，其中所述受试者处于患RA的风险中的。 [0482] 18.实施方式17的方法，其中所述受试者遭受选自下述的一个或多个症状：一个或多个肿胀关节，一个或多个僵硬关节，一个或多个发热关节，通常持续超过一小时的清晨关节僵硬，过量滑液，滑膜中纤维组织的产生，和关节活动范围受损。 [0483] 19.实施方式12-16中任一项的方法，其中所述受试者处于患PF的风险中的。 [0484] 20.实施方式19的方法，其中所述受试者遭受选自下述的一个或多个症状：慢性干咳，疲劳，虚弱，胸部不适，食欲不振，体重快速减少，和伴随运动的呼吸困难。 [0485] 21.实施方式12-20中任一项的方法，进一步包括测定受试者的C反应蛋白(CRP)的血浆水平，将受试者血浆中CRP的量与对照比较，以及利用CRP的比较来辅助诊断RA或PF。 [0486] 22.一种诊断CKD或免疫复合物介导的GN的方法，包括： [0487] (a)使处于患CKD或免疫复合物介导的GN风险中的的患者的血浆样品与结合77kD GPBP的GPBP结合分子在促进所述GPBP结合分子与77kD GPBP选择性结合的条件下接触； [0488] (b)检测 [0489] (i)GPBP结合分子与所述血浆样品中77kD GPBP之间的复合物形成；以及[0490] (ii)测定所述受试者的C反应蛋白(CRP)的血浆水平 [0491] (c)比较 [0492] (i)GPBP结合分子与血浆样品中及对照中的77kD GPBP之间形成的复合物的量；以及 [0493] (ii)所述受试者血浆中与对照中CRP的量；以及 [0494] (d)基于所述比较将所述受试者诊断为具有CKD或免疫复合物介导的GN，或者将所述比较提供给用于诊断CKD或免疫复合物介导的GN的实体。 [0495] 23.一种鉴别治疗CKD、免疫复合物介导的GN、和/或PF的化合物的方法，包括使77kD GPBP-77kD GPBP底物结合复合物与一种或多种待测化合物在结合条件下接触，其中取代结合复合物中的77kD GPBP的那些待测化合物是用于治疗CKD，免疫复合物介导的GN，和/或PF的候选化合物。 [0496] 24.一种鉴别治疗CKD、免疫复合物介导的GN、和/或PF的方法，包括使77kD GPBP底物在结合条件下与下述接触： [0497] (a)一种或多种待测化合物；以及 [0498] (b)77kD GPBP； [0499] 其中就与77kD GPBP结合底物的结合而言超过77kD GPBP的那些待测化合物是用于治疗CKD、免疫复合物介导的GN、和/或PF的候选化合物。 [0500] 本说明书进一步包括下列内容： [0501] 1. 77kD GPBP的抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肺纤维化。 [0502] 2.实施方式1的用途，其中所述肺纤维化是非特发性肺纤维化。 [0503] 3. 77kD GPBP的抑制剂用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗慢性肾病。 [0504] 4. 77kD GPBP的抑制剂用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗免疫复合物介导的GN。 [0505] 5.实施方式4的用途，其中所述免疫复合物介导的GN与选自下组的自身免疫性病症相关：IgA肾病、系统性红斑狼疮和古德帕斯彻氏病。 [0506] 6.实施方式1-5中任一项的用途，其中所述药物将被施用于人。 [0507] 7.实施方式1-6中任一项的用途，其中所述77kD GPBP的抑制剂是与77kD GPBP相结合的抗体。 [0508] 8.实施方式7的用途，其中所述抗体对于77kD GPBP同种型有选择性。 [0509] 9.实施方式7或8的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。 [0510] 10.实施方式1-9中任一项的用途，其中所述GPBP抑制剂包含含有根据通式X1-SHCIX2-X3(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的多肽，其中： [0511] X1是序列ATTAGILATL(SEQ ID NO:3)的0-10个氨基酸； [0512] X2是E或Q；以及 [0513] X3是序列LMVKREDSWQ(SEQ ID NO:4)的0-10个氨基酸。 [0514] 11.实施方式1-10中任一项的用途，其中所述GPBP抑制剂包含式(I)的化合物： [0515] [0516] 或其药学可接受的盐，其中： [0517] R选自N和CR5； [0518] R5选自氢、卤素、氰基、硝基、羟基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、氨基、(C1-C6烷基)氨基、二(C1-C6烷基)氨基、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C2-C6烷基、和(杂芳基)C1-C6烷基； [0519] R1是氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、或(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)； [0520] R2是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C0-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基； [0521] R3是C1-C6烷基、卤代(C1-C6烷基)、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、羟基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷氧基)C1-C6烷基、甲酰基(C1-C6烷基)、氨基(C1-C6烷基)、磺酰基(C1-C6烷基)、(C1-C6烷基)磺酰基(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基；以及 [0522] R4是羟基、卤素、C1-C6烷 基、C1-C6烷氧基、卤代(C1-C6烷氧基)、卞氧基、-(CH2)1-5-C(O)OH、-(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷 氧 基 )、-(CH2)1-5-C(O)NH2、-(CH2)1-5-C(O)NH(C1-C6烷基)、-(CH2)1-5-C(O)N(C1-C6烷基)2、-CH＝CH-C(O)OH、-CH＝CH-C(O)(C1-C6烷氧基)、-O(CH2)1-5-C(O)OH、-O(CH2)1-5-C(O)(C1-C6烷氧基)、(芳基)C1-C6烷基、或(杂芳基)C1-C6烷基。 [0523] 12.结合77kD GPBP的GPBP结合分子用于制备诊断剂的用途，所述诊断剂用来诊断处于患风湿性关节炎或肺纤维化的风险中的的受试者中的风湿性关节炎或肺纤维化。 [0524] 13.实施方式12的用途，其中所述77kD GPBP结合分子包含与天然77kD GPBP结合的抗体。 [0525] 14.实施方式13的用途，其中所述抗体对77kD GPBP同种型有选择性。 [0526] 15.实施方式13或14的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。 [0527] 16.实施方式12-15中任一项的用途，其中所述诊断包括检测所述GPBP结合分子与77kD GPBP之间的复合物形成，并且所述检测包括使用选自下列的技术：ELISA、免疫荧光和色谱。 [0528] 17.实施方式12-16中任一项的用途，其中所述受试者处于患风湿性关节炎的风险中的。 [0529] 18.实施方式17的用途，其中所述受试者遭受选自下述的一个或多个症状：一个或多个肿胀关节，一个或多个僵硬关节，一个或多个发热关节，通常持续超过一小时的清晨关节僵硬，过量滑液，滑膜中纤维组织的产生，和关节活动范围受损。 [0530] 19.实施方式12-16中任一项的用途，其中所述受试者处于患肺纤维化的风险中的。 [0531] 20.实施方式19的用途，其中所述受试者遭受选自下述的一个或多个症状：慢性干咳，疲劳，虚弱，胸部不适，食欲不振，体重快速减少，和伴随运动的呼吸困难。 [0532] 21.实施方式12-20中任一项的用途，其中所述诊断由测定受试者的C反应蛋白的血浆水平所辅助。 [0533] 22.结合77kD GPBP的GPBP结合分子用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于诊断处于患风湿性关节炎或肺纤维化的风险中的的受试者中的风湿性关节炎或肺纤维化，其中所述试剂盒还包括用于测定所述受试者的C反应蛋白的血浆水平的试剂。 [0534] 23.结合77kD GPBP的GPBP结合分子用于制备诊断剂的用途，所述诊断剂用于诊断处于患慢性肾病或免疫复合物介导的GN风险中的的受试者中的慢性肾病或免疫复合物介导的GN，其中所述诊断还涉及测定所述受试者的C反应蛋白的血浆水平。 [0535] 24.结合77kD GPBP的GPBP结合分子用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于诊断处于患慢性肾病或免疫复合物介导的GN风险中的的受试者中的慢性肾病或免疫复合物介导的GN，其中所述试剂盒还包含用于测定所述受试者的C反应蛋白的血浆水平的试剂。 [0536] 25.一种鉴别治疗慢性肾病、免疫复合物介导的GN、和/或肺纤维化的化合物的方法，包括使77kD GPBP-77kD GPBP底物结合复合物与一种或多种待测化合物在结合条件下接触，其中取代结合复合物中的77kD GPBP的那些待测化合物是用于治疗慢性肾病，免疫复合物介导的GN，和/或肺纤维化的候选化合物。 [0537] 26.一种鉴别治疗慢性肾病、免疫复合物介导的GN、和/或肺纤维化的方法，包括使77kD GPBP底物在结合条件下与下述接触： [0538] (a)一种或多种待测化合物；以及 [0539] (b)77kD GPBP； [0540] 其中就与77kD GPBP结合底物的结合而言超过77kD GPBP的那些待测化合物是用于治疗慢性肾病、免疫复合物介导的GN、和/或肺纤维化的候选化合物。 |
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