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治疗和预防纤维化的方法
申请号 CN200680021090.6 申请日 2006-04-13 公开(公告)号 CN101287759A 公开(公告)日 2008-10-15
申请人 惠氏公司; 美国政府卫生与公众服务部; 哈佛大学校长及研究员协会; 发明人 D·A·杨; T·A·温; M·科林斯; M·格鲁斯比;
摘要 本 发明 提供了通过测量IL－21和/或IL－21受体(IL－21R) 水 平(例如IL－21和/或IL－21R蛋白和/或mRNA的表达水平、IL－21和/或IL－21R的活性水平、IL－21与IL－21R的相互作用水平)的改变而筛选用于 治疗 、改善或 预防 纤维 化和/或纤维化相关状况的组合物的方法。本发明进一步提供了用于治疗纤维化和/或纤维化相关状况的IL－21或IL－21R的拮抗剂。进一步提供了通过测量IL－21和/或IL－21R的水平(即IL－21和/或IL－21R的活性水平、IL－21和/或IL－21R的表达水平(如IL－21和/或IL－21R基因产物的水平)和/或IL－21与IL－21R的相互作用水平)而诊断、预测和监测纤维化和/或纤维化相关状况的进展(例如治疗过程)的方法。
权利要求

1.治疗、改善或预防受试者中的纤维化或纤维化相关病症的方法， 包括给受试者施用治疗有效量的减少受试者中IL-21和/或IL-21R的水平 的试剂。
2.权利要求1的方法，其中该试剂是IL-21/IL-21R拮抗剂，选自： 抗IL-21R抗体、抗IL-21抗体、抗IL-21R抗体的抗原结合片段、抗IL- 21抗体的抗原结合片段和IL-21R的可溶性片段。
3.权利要求2的方法，其中该试剂是IL-21R的可溶性片段，并且 所述IL-21R的可溶性片段包含与选自下组的氨基酸序列具有至少90％ 同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸1-538、SEQ ID NO：2的氨 基酸20-538、SEQ ID NO：2的氨基酸1-235、SEQ ID NO：2的氨基酸20- 235、SEQ ID NO：2的氨基酸1-236、SEQ ID NO：2的氨基酸20-236、SEQ ID NO：5的氨基酸1-529、SEQ ID NO：5的氨基酸20-529、SEQ ID NO：5 的氨基酸1-236和SEQ ID NO：5氨基酸20-236。
4.权利要求3的方法，其中所述IL-21R的可溶性片段结合于IL-21 多肽。
5.权利要求1的方法，其中该试剂是IL-21R的可溶性片段，并且 所述IL-21R的可溶性片段包含与以下所示氨基酸序列基本相同的氨基 酸序列：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、 SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27。
6.权利要求5的方法，其中IL-21R的可溶性片段的氨基酸序列包 含与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列基本相同的氨基 酸序列。
7.权利要求1的方法，其中该试剂是IL-21R的可溶性片段，并且 所述IL-21R的可溶性片段由与以下所示核酸序列基本相同的核苷酸序 列编码：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、 SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26。
8.权利要求7的方法，其中所述IL-21R的可溶性片段由与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：16所示核酸序列基本相同的核苷酸序列编码。
9.权利要求2的方法，其中该试剂是IL-21R的可溶性片段，并且 所述IL-21R的可溶性片段包含IL-21R的胞外域和免疫球蛋白Fc片段。
10.权利要求9的方法，其中IL-21R的胞外域的氨基酸序列包含与 SEQ ID NO：2的氨基酸1-235或SEQ ID NO：2的氨基酸20-235具有至少 90％同一性的氨基酸序列。
11.权利要求9的方法，其中免疫球蛋白Fc片段具有改变的功能。
12.权利要求11的方法，其中免疫球蛋白Fc片段具有SEQ ID NO：17 的氨基酸244-467的氨基酸序列。
13.权利要求1的方法，其中纤维化或纤维化相关病症影响肝、表 皮、内皮、肌肉、腱、软骨、心脏、胰腺、肺、子宫、神经系统、睾丸、 卵巢、肾上腺、动脉、静脉、结肠、小肠、胆管或胃。
14.权利要求13的方法，其中纤维化或纤维化相关病症影响肝、 表皮、内皮或肺。
15.权利要求14的方法，其中纤维化或纤维化相关病症是肺间质 纤维化。
16.权利要求13的方法，其中纤维化或纤维化相关病症是血吸虫 感染的结果。
17.权利要求1的方法，其中纤维化或纤维化相关病症是伤口愈合 的结果。
18.权利要求17的方法，其中伤口愈合由手术切口导致。
19.权利要求1的方法，进一步包括给受试者施用至少一种另外的 治疗剂。
20.权利要求19的方法，其中所述至少一种另外的治疗剂选自： 细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、 酶抑制剂、细胞毒性剂和细胞抑制剂。
21.权利要求19的方法，其中所述至少一种另外的治疗剂选自： TNF拮抗剂、抗TNF剂、IL-12拮抗剂、IL-15拮抗剂、IL-17拮抗剂、 IL-18拮抗剂、IL-22拮抗剂、T细胞消除剂、B细胞消除剂、环孢菌素、 FK-506、CCI-779、依那西普、英夫单抗、利妥希玛、阿达木单抗、泼 尼松龙、硫唑嘌呤、金、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、米诺环素、阿那白滞 素、阿巴他塞、甲氨蝶呤、来氟米特、雷帕霉素、雷帕霉素类似物、Cox-2 抑制剂、cPLA2抑制剂、NSAIDs、p38抑制剂、B7.1、B7.2、ICOSL、 ICOS和/或CD28的拮抗剂和CTLA4激动剂。
22.权利要求1的方法，其中所述受试者是人。
23.鉴定用于治疗、改善或预防受试者中的纤维化或纤维化相关病 症的化合物的方法，包括：(a)测量感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/ 或IL-21R水平；(b)使感兴趣的细胞或样品与化合物接触；和(c)测量与 化合物接触后感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平，其中与 未接触的感兴趣的细胞或样品相比，接触的感兴趣的细胞或样品中的 IL-21和/或IL-21R水平较低，则鉴定出化合物是可用于治疗、改善或预 防受试者中的纤维化或纤维化相关状况的化合物。
24.鉴定用于治疗、改善或预防受试者中的纤维化或纤维化相关病 症的化合物的方法，包括：(a)测量感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/ 或IL-21R水平；(b)使感兴趣的细胞或样品与化合物接触；(c)测量与化 合物接触后感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平；和(d)比 较接触的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平与IL-21和/ 或IL-21R的参照水平，其中与IL-21和/或IL-21R的参照水平相比，接 触的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平较低，则鉴定出化 合物是可用于治疗、改善或预防受试者中的纤维化或纤维化相关状况的 化合物。
25.监测受试者中的纤维化或纤维化相关状况的进展的方法，包 括：(a)在第一时间点测量来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21 和/或IL-21R水平；和(b)在第二时间点测量来自受试者的感兴趣的细胞 或样品中的IL-21和/或IL-21R水平；其中与第一时间点时来自受试者的 感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平相比，第二时间点时来 自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平较低，提供 纤维化或纤维化相关状况的严重程度降低的指示。
26.预测受试者中的纤维化或纤维化相关状况的方法，包括：(a) 在第一时间点测量来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或 IL-21R水平；和(b)在第二时间点测量来自受试者的感兴趣的细胞或样品 中的IL-21和/或IL-21R水平；其中与第一时间点时来自受试者的感兴趣 的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平相比，第二时间点时来自受试 者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平较低，表明受试者 将发生纤维化或纤维化相关状况的可能性降低，或受试者中的纤维化或 纤维化相关状况将恶化的可能性降低。
27.预测受试者中的纤维化或纤维化相关状况的方法，包括：(a) 测量来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平；(b) 比较来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平与 IL-21和/或IL-21R的参照水平，其中与IL-21和/或IL-21R的参照水平 相比，来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平较 低，表明受试者将发生纤维化或纤维化相关状况的可能性降低，或受试 者中的纤维化或纤维化相关状况将恶化的可能性降低。
28.诊断受试者中的纤维化或纤维化相关状况的方法，包括：(a) 测量来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平；(b) 比较来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平与 IL-21和/或IL-21R的参照水平，其中与IL-21和/或IL-21R的参照水平 相比，来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平较 高，表明受试者存在纤维化或纤维化相关状况。
说明书全文

发明领域

[0002]本发明涉及治疗和预防纤维化和纤维化相关状况的方法。相关背景技术
[0003]对任何器官的损伤典型地导致涉及血小板诱导的凝血的生 理反应，随后是炎症细胞和激活的成纤维细胞的流入。由这些细胞类型 产生的细胞因子驱动新的细胞外基质和血管的形成，它们统一形成肉芽 组织。纤维组织是损伤后愈合的正常有益过程的一部分；但是，纤维化 是一种特征在于损伤或炎症后胶原基质异常积累的状况，所述胶原基质 异常积累改变各种组织的结构和功能。肾、肝、肺、心脏、骨、骨髓和 皮肤的进行性纤维化是死亡的主要原因或导致死亡的因素。
[0004]很多与纤维组织增殖相关的疾病是慢性的，通常使人衰弱， 包括，例如皮肤病，如硬皮病。其中的一些，包括肺纤维化，可以是致 死的，这部分是由于现有的治疗具有显著副作用，并且通常在减缓或阻 止纤维化进展中无效。因此，继续需要新的抗纤维化药剂。
[0005]IL-21受体(IL-21R)是I类细胞因子受体家族的新发现的成员 (Parrish-Novak et al.(2000)Nature 408：57-63；Ozaki et al.(2000)Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：11439-44)。IL-21受体显示与IL-4受体α(IL-4R α)链具有显著序列和结构同源性，并且邻近人和小鼠基因组中的IL-4R α，而其配体IL-21与细胞因子IL-2、IL-4和IL-15具有显著同源性 (Sivakumar et al.(2004)Immunology 112：177-82；Habib et al.(2003)J. Allergy Clin.Immunol.112：1033-45)。因此，IL-21和IL-21R是γ链(γc) 依赖性细胞因子网络的新描述的成员，因为它们与需要γc来进行功能 性信号传导的细胞因子和受体具有同源性(Vosshenrich and Di Santo (2001)Curr.Biol.11：R175-77)。由于γc网络的所有成员都表现出在宿主 免疫中的重要和独特作用，越来越多地对发现IL-2R在抗原诱发的体内 免疫反应中的新功能感兴趣。
[0006]最初检验IL-21功能的研究显示，NK细胞扩增受到拮抗， 而抗原特异性T细胞免疫由IL-21促进，包括抗肿瘤免疫(Ma et al.(2003) J.Immunol.171：608-15；Kishida et al.(2003)Mol.Ther.8：552-58；Di Carlo et al.(2004)J.Immunol.172：1540-47)，这一发现提示IL-21作为先天和获 得性免疫反应之间的桥梁(Collins et al.(2003)Immunol.Res.28：131- 40)。IL-21也调节体内B细胞和CD8+T细胞功能(Ozaki et al.(2002) Science 298：1630-34；Suto et al.(2002)Blood 100：4565-73；Mehta et al. (2003)J.Immunol.170：4111-18；Pene et al.(2004)J.Immunol.172：5154- 57；Jin et al.(2004)J.Immunol.173：657-65；Zeng et al.(2005)J.Exp.Med. 201：139-48)。其它研究表明，IL-21是一种能够抑制幼稚TH细胞分化为 分泌FN-γ的TH1细胞的TH2细胞因子(Wurster et al.(2002)J.Exp.Med. 196：969-77)。实际上，用IL-21进行的外源处理有效抑制了IFN-γ产生， 而不影响其它TH1/TH2相关细胞因子，表明IL-21对IFN-γ的阻抑是高 度特异性的。因此，通过其阻抑TH1细胞发育的能力，假定IL-21可能 促进TH2反应(Wurster et al.，supra)。然而，以前还没有在任何TH2依赖 性病症中研究IL-21R信号传导途径在TH2反应产生中的参与。
[0007]在血吸虫病中，TH2细胞因子在疾病的致病机理中起必不可 少的作用(Wynn(2004)Nat.Rev.Immunol.4：583-594；Pearce and MacDonald(2002)Nat.Rev.Immunol.2：499-511)。实际上，IL-4/IL-13-， IL-4R α-和Stat6-缺陷小鼠都显示曼氏血吸虫(S.Mansoni)感染后肉芽 肿形成和肝纤维化显著受阻(Chiaramonte et al.(1999)J.Clin.Invest. 104：777-85；Kaplan et al.(1998)J.Immunol.160：1850-56；Jankovic et al. (1999)J.Immunol.163：337-42；Fallon et al.(2000)J.Immunol.164：2585- 91)。考虑到最近将IL-21分类为TH2细胞因子(Wurster et al.(2002)， supra；Mehta et al.(2005).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102：2016-21)、IL- 4和IL-21受体的显著相似性(Sivakumar et al.，supra；Habib et al.， supra)，以及相关IL-4Rα/Stat6-信号传导途径在该疾病和其它TH2细胞 因子驱动的炎性病症中的作用(Wynn(2003)Annu.Rev.Immunol.21：425- 56)，从这些研究引出了一个重要的问题，即IL-21R信号传导是否在TH2 免疫的起始和/或维持中起显著作用。发明概述
[0008]本发明提供了治疗、改善或预防纤维化或纤维化相关病症的 方法，以及筛选用于这些方法的化合物和组合物的方法。本发明还提供 了诊断、预测和监测纤维化和/或纤维化相关状况进展(如治疗过程)的 方法。这些方法与测量和/或调节IL-21和/或IL-21R的水平(即IL-21 和/或IL-21R的活性水平、IL-21和/或IL-21R的表达水平(如IL-21和/ 或IL-21R基因产物的水平)和/或IL-21与IL-21R的相互作用水平)相关。 本发明进一步提供了用于治疗纤维化和/或纤维化相关状况的IL-21或 IL-21R的拮抗剂。
[0009]在一种实施方案中，本发明提供了治疗、改善或预防受试者 (如人)中的纤维化或纤维化相关病症的方法，包括给受试者施用治疗 有效量的减少受试者中IL-21和/或IL-21R的水平的试剂。在进一步的实 施方案中，该试剂是IL-21/IL-21R拮抗剂，选自：抗IL-21R抗体、抗IL-21 抗体、抗IL-21R抗体的抗原结合片段、抗IL-21抗体的抗原结合片段和 IL-21R的可溶性片段。在另一个进一步的实施方案中，该试剂是IL-21R 的可溶性片段，并且所述IL-21R的可溶性片段包含与选自下组的氨基酸 序列具有至少90％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸1-538、 SEQ ID NO：2的氨基酸20-538、SEQ ID NO：2的氨基酸1-235、SEQ ID NO：2的氨基酸20-235、SEQ ID NO：2的氨基酸1-236、SEQ ID NO：2的 氨基酸20-236、SEQ ID NO：5的氨基酸1-529、SEQ ID NO：5的氨基酸 20-529、SEQ ID NO：5的氨基酸1-236、SEQ ID NO：5氨基酸20-236。 在另一实施方案中，IL-21R的可溶性片段结合于IL-21多肽。
[0010]在另一实施方案中，该试剂是IL-21R的可溶性片段，并且 所述IL-21R的可溶性片段包含与以下所示氨基酸序列基本相同的氨基 酸序列：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、 SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27。在另一实施方案中，IL-21R的可溶性片段的氨基酸序列包含与 SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序 列。在另一实施方案中，该试剂是IL-21R的可溶性片段，并且所述IL- 21R的可溶性片段由与以下所示核酸序列基本相同的核苷酸序列编码： SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26。 在另一实施方案中，所述IL-21R的可溶性片段由与SEQ ID NO：12或 SEQ ID NO：16所示核酸序列基本相同的核苷酸序列编码。
[0011]在另一实施方案中，该试剂是IL-21R的可溶性片段，并且 所述IL-21R的可溶性片段包含IL-21R的胞外域和免疫球蛋白Fc片段。 在进一步的实施方案中，IL-21R的胞外域的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：2的氨基酸1-235或SEQ ID NO：2的氨基酸20-235具有至少90％同 一性的氨基酸序列。在另一实施方案中，免疫球蛋白Fc片段具有改变 的功能。在另一实施方案中，免疫球蛋白Fc片段具有SEQ ID NO：17的 氨基酸244-467的氨基酸序列。
[0012]在另一实施方案中，纤维化或纤维化相关病症影响肝、表 皮、内皮、肌肉、腱、软骨、心脏、胰腺、肺、子宫、神经系统、睾丸、 卵巢、肾上腺、动脉、静脉、结肠、小肠、胆管或胃。在进一步的实施 方案中，纤维化或纤维化相关病症是肺间质纤维化。在另一实施方案 中，纤维化或纤维化相关病症是血吸虫感染的结果。在另一实施方案 中，纤维化或纤维化相关病症是伤口愈合的结果。在进一步的实施方案 中，伤口愈合由手术切口导致。
[0013]在另一实施方案中，本发明还包括给受试者施用治疗有效量 的至少一种另外的治疗剂。在另一实施方案中，所述至少一种另外的治 疗剂选自：细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、 代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒性剂和细胞抑制剂。在另一实施方案中， 所述至少一种另外的治疗剂选自：TNF拮抗剂、抗TNF剂、IL-12拮 抗剂、IL-15拮抗剂、IL-17拮抗剂、IL-18拮抗剂、IL-22拮抗剂、T 细胞消除剂、B细胞消除剂、环孢菌素、FK-506、CCI-779、依那西普、 英夫单抗、利妥希玛、阿达木单抗(adalimumab)、泼尼松龙、硫唑嘌呤、 金、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、米诺环素、阿那白滞素(anakinra)、阿巴他 塞(abatacept)、甲氨蝶呤、来氟米特、雷帕霉素、雷帕霉素类似物、Cox-2 抑制剂、cPLA2抑制剂、NSAIDs、p38抑制剂、B7.1、B7.2、ICOSL、 ICOS和/或CD28的拮抗剂和CTLA4激动剂。
[0014]在另一实施方案中，本发明提供了鉴定用于治疗、改善或预 防受试者中的纤维化或纤维化相关病症的化合物的方法，包括：(a)测量 感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平；(b)使感兴趣的细胞 或样品与化合物接触；和(c)测量与化合物接触后感兴趣的细胞或样品中 的IL-21和/或IL-21R水平，其中与未接触的感兴趣的细胞或样品相比， 接触的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平较低，则鉴定出 化合物是可用于治疗、改善或预防受试者中的纤维化或纤维化相关病症 的化合物。
[0015]在另一实施方案中，本发明提供了鉴定用于治疗、改善或预 防受试者中的纤维化或纤维化相关病症的化合物的方法，包括：(a)测量 感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平；(b)使感兴趣的细胞 或样品与化合物接触；(c)测量与化合物接触后感兴趣的细胞或样品中的 IL-21和/或IL-21R水平；和(d)比较接触的感兴趣的细胞或样品中的IL- 21和/或IL-21R水平与IL-21和/或IL-21R的参照水平，其中与IL-21和 /或IL-21R的参照水平相比，接触的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/ 或IL-21R水平较低，则鉴定出化合物是可用于治疗、改善或预防受试者 中的纤维化或纤维化相关病症的化合物。
[0016]在另一实施方案中，本发明提供了监测受试者中的纤维化或 纤维化相关状况的进展的方法，包括：(a)在第一时间点测量来自受试者 的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平；和(b)在第二时间 点测量来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平； 其中与第一时间点时来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或 IL-21R水平相比，第二时间点时来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的 IL-21和/或IL-21R水平较低，提供纤维化或纤维化相关状况的严重程度 降低的指示。
[0017]在另一实施方案中，本发明提供了预测受试者中的纤维化或 纤维化相关状况的方法，包括：(a)在第一时间点测量来自受试者的感兴 趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平；和(b)在第二时间点测量 来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R水平；其中与 第一时间点时来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21和/或IL-21R 水平相比，第二时间点时来自受试者的感兴趣的细胞或样品中的IL-21 和/或IL-21R水平较低，表明受试者将发生纤维化或纤维化相关状况的 可能性降低，或受试者中的纤维化或纤维化相关状况将恶化的可能性降 低。
[0018]在另一实施方案中，本发明提供了预测受试者中的纤维化或 纤维化相关状况的方法，包括：(a)测量来自受试者的感兴趣的细胞或样 品中的IL-21和/或IL-21R水平；(b)比较来自受试者的感兴趣的细胞或 样品中的IL-21和/或IL-21R水平与IL-21和/或IL-21R的参照水平，其 中与IL-21和/或IL-21R的参照水平相比，来自受试者的感兴趣的细胞或 样品中的IL-21和/或IL-21R水平较低，表明受试者将发生纤维化或纤维 化相关状况的可能性降低，或受试者中的纤维化或纤维化相关状况将恶 化的可能性降低。
[0019]在另一实施方案中，本发明提供了诊断受试者中的纤维化或 纤维化相关状况的方法，包括：(a)测量来自受试者的感兴趣的细胞或样 品中的IL-21和/或IL-21R水平；(b)比较来自受试者的感兴趣的细胞或 样品中的IL-21和/或IL-21R水平与IL-21和/或IL-21R的参照水平，其 中与IL-21和/或IL-21R的参照水平相比，来自受试者的感兴趣的细胞或 样品中的IL-21和/或IL-21R水平较高，表明受试者存在纤维化或纤维化 相关状况。附图简述
[0020]图1表示鼠IL-21R/MU-1的全长cDNA序列。该核苷酸序列 对应于SEQ ID NO：4的核苷酸1-2628。
[0021]图2A-2B表示鼠和人IL-21R/MU-1的氨基酸序列。图2A表 示鼠IL-21R/MU-1的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO：5的氨基酸1- 529)。在氨基酸1-19具有前导序列(经SPScan预测，得分为10.1)(粗体 字)。SEQ ID NO：5的氨基酸237-253为预测的跨膜域(下划线)。预测的 信号传导基序包括氨基酸265-274的“Box 1”基序和氨基酸311-324的 “Box 2”基序。(粗体和下划线)；六个酪氨酸位于SEQ ID NO：5的氨基 酸位置281、319、361、368、397和510。WSXWS基序(SEQ ID NO：3) 位于氨基酸残基214-218(大号字，粗体)。潜在的Stat锚定位点(docking site)包括SEQ ID NO：5的氨基酸393-398和氨基酸510-513。图2B表示 人IL-21R/MU-1的氨基酸序列(对应于SEQ ID NO：2)。标明了预测的信 号序列(SEQ ID NO：2的约氨基酸1-19)；WSXWS基序(SEQ ID NO：2的 约氨基酸213-217)；和跨膜域(SEQ ID NO：2的约氨基酸236-252(或 236-253或236-254)(下划线))。也标明了潜在的JAK结合位点、Box 1 和2信号传导基序和Stat锚定位点。这些位点的大致位置都加了箭头。
[0022]图3表示人与鼠IL-21R/MU-1cDNA序列(分别对应于SEQ ID NO：4的核酸1-2665和SEQ ID NO：9的核酸1-2628)的GAP比较。 HuMU-1＝人IL-21R/MU-1，murMU-1＝鼠IL-21R/MU-1。空位参数：空 位权重＝50，平均匹配＝10.000，长度权重＝3，平均错配＝0.000，同一 性百分比＝66.116。
[0023]图4表示人IL-21R/MU-1蛋白(对应于SEQ ID NO：2的氨基 酸)与鼠IL-21R/MU-1蛋白(对应于SEQ ID NO：5的氨基酸)的GAP比 较。通过BLOSUM62氨基酸取代矩阵(Henikoff and Henikoff(1992)Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-19)产生比对。空位参数＝空位权重：8， 平均匹配＝2.9 12，长度权重＝2，平均错配＝-2.003；同一性百分比＝ 65.267。
[0024]图5表示人IL-21R/MU-1氨基酸(对应于SEQ ID NO：2)、鼠 IL-21R/MU-1氨基酸(对应于SEQ ID NO：5)与人IL2 β链氨基酸 (检索号M26062)的多序列比对。前导序列和跨膜域带有下 划线。保守的细胞因子受体模块基序用粗体字表示。潜在的信号传导区 用下划线+粗体字表示。
[0025]图6表示通过IL-21R/MU-1的信号传导。在用EPO刺激的 表达克隆E7 EPO IL-21R/MU-1嵌合体的细胞中，IL-21R/MU-1使Stat 5 磷酸化。用IL-3处理对照或嵌合BAF-3细胞，引起Stat 3、而不是Stat 1 或5的磷酸化。
[0026]图7A-7B表示在氨基末端与蜜蜂前导序列和His6标记和 Flag标记融合的成熟的人IL-21R的核苷酸序列和氨基酸序列比对。描述 于图7A-7B的融合蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。融合蛋白的成熟的人IL-21R片段和蜜蜂前导 序列/His标记片段的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：2的氨基酸20- 235和SEQ ID NO：11的氨基酸1-44。
[0027]图8A-8C表示在C-末端通过接头与人免疫球蛋白G1(IgG1) Fc序列融合的人IL-21R胞外域的核苷酸序列和氨基酸序列比对。描述 于图8A-8C的融合蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。人IL-21R胞外域、接头和人免疫球蛋白G1 (IgG1)Fc序列的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-235、 SEQ ID NO：13的氨基酸236-243和SEQ ID NO：13的氨基酸244-467。
[0028]图9A-9C表示在C-末端通过接头与人免疫球蛋白G1(IgG1) Fc序列和His6序列标记融合的人IL-21R胞外域的核苷酸序列和氨基酸 序列比对。描述于图9A-9C的融合蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分 别示于SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15。人IL-21R胞外域、接头、人 免疫球蛋白G1(IgG1)Fc序列和His6序列标记的氨基酸序列分别对应于 SEQ ID NO：2的氨基酸1-235、SEQ ID NO：15的氨基酸236-243、SEQ ID NO：15的氨基酸244-467和SEQ ID NO：15的氨基酸468-492。
[0029]图10A-10C表示在C-末端通过接头与人免疫球蛋白G1 (IgG1)Fc突变序列融合的人IL-21R胞外域的核苷酸序列和氨基酸序列 比对。人Fc序列在野生型序列的残基254和257突变，以减少Fc受体 结合。描述于图10A-10C的融合蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别 示于SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17。人IL-21R胞外域、接头和人免 疫球蛋白G1(IgG1)Fc突变序列的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：2 的氨基酸1-235、SEQ ID NO：17的氨基酸236-243和SEQ ID NO：17的 氨基酸244-467。
[0030]图11A-11B表示在C-末端与视紫红质序列标记融合的人 IL-21R胞外域的核苷酸序列和氨基酸序列比对。融合蛋白的核苷酸序列 和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。人IL-21R胞 外域的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-235。
[0031]图12A-12C表示在C-末端与EK切割位点和突变IgG1Fc区 融合的人IL-21R胞外域的核苷酸序列和氨基酸序列比对。描述于图12A -12C的融合蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：20 和SEQ ID NO：21。人IL-21R胞外域和EK切割位点/突变IgG1Fc区的 氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-235和SEQ ID NO：21 的氨基酸236-470。
[0032]图13A-13B表示在C-末端与小鼠免疫球蛋白G2a(IgG2a)融 合的鼠IL-21R胞外域的核苷酸序列和氨基酸序列比对。核苷酸序列和氨 基酸序列分别示于SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。
[0033]图13A-13B表示在C-末端与Flag和His6序列标记融合的鼠 IL-21R胞外域的核苷酸序列和氨基酸序列比对。核苷酸序列和氨基酸序 列分别示于SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25。
[0034]图15A-15B表示在N-末端与Flag和His6序列标记融合的(蜜 蜂前导序列)鼠IL-21R胞外域的核苷酸序列和氨基酸序列比对。核苷酸 序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27。
[0035]图16显示高度极化的1型和2型免疫反应期间的IL-21和 IL-21R表达谱。将每组5只的IL-10/IL-4KO(TH1，Δ)和IL-10/IL-12KO (TH2，●)小鼠用曼氏血吸虫卵腹膜内致敏，14天后攻击。单独制备肺 RNA标本，以进行IL-13和IFN-γ(图16A)以及IL-21R和IL-21(图16B) 的实时RT-PCR分析。基因表达的平均值±SEM表示为与标准化为HPRT 后未攻击的WT对照相比增加的倍数。星号表示在给定时间点各组之间 的显著差异，*p＜0.05。
[0036]图17显示血吸虫卵攻击的IL-21R-/-小鼠肺中2型细胞因子 的产生减少。用活的曼氏血吸虫卵静脉内攻击未接触过抗原的WT(空 心柱)和IL-21R-/-(实心柱)小鼠组，在攻击后4、7和14天处死。(A)从 肺组织制备RNA，通过实时RT-PCR单个进行分析(N＝每组5只/时间 点)。结果显示为框须图，其中5个数字的概括柱表示中值、四分位数 以及分布中的最小和最大百分位数；柱(从底部到顶部)分别表示测试 的样品的第10、25、50、75和90个百分位。星号表示在给定时间点与 野生型值的显著差异*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。(B)分别合并脾 (Spl)和肺相关淋巴结(LN)(2个独立的组，每组3-4只小鼠)，在Con A (CON，1μg/ml)或可溶的卵抗原(SEA，20μg/ml)存在下温育72小时后 测定单细胞悬浮液中的IL-5、IL-10、IL-13和IFN-γ。细胞因子在未刺 激的培养物的检测水平之下。(C)在显微镜下定量肉芽肿大小(体积， mm3×10-3)和肉芽肿中嗜酸性细胞的百分比。(D)肉芽肿肺组组织中 TH2调节的炎症基因的实时PCR分析。所有的数据都代表至少两次独立 的实验。
[0037]图18显示2型反应在巴西诺卡氏菌感染的IL-21R-/-小鼠中 受损。在第7天从各个巴西诺卡氏菌感染的和未处理的C57BL/6或IL- 21R-/-小鼠(5/处理组)取出肺(A)和肺相关淋巴结(LALN)(B)。 按照图17的图标中的描述分离RNA和制备cDNA。通过实时定量PCR 单独分析IL-13、IL-4、AMCase、Ym1和FIZZ1的mRNA。改变倍数是 基于感染的小鼠与未接触过抗原的动物的比较。
[0038]图19显示2型细胞因子驱动的炎症在IL-21R-/-小鼠中减少。 用曼氏血吸虫卵腹膜内致敏WT(空心柱)和IL-21R-/-小鼠(实心柱)， 两周后用活曼氏血吸虫卵静脉内攻击，然后在攻击后4和7天处死。(A) 按照上文图17中图标的描述，从肺组织制备RNA，通过实时RT-PCR 单独分析(N＝每组5只/时间点)。(B)在抗原(SEA)或促分裂原(CON)刺激 后，测定脾(Spl)和肺相关淋巴结(LN)的IL-5、IL-10、IL-13和IFN-γ。 (C)在WT(每组的小鼠数目：N＝10，第4天；N＝15，第7天)和IL-21R-/- 小鼠(N＝11，第4天；N＝16，第7天)中对肉芽肿大小(mm3×10-3)和肉芽 肿中的嗜酸性细胞的百分比进行显微镜定量。(D)肉芽肿肺组组织中TH2 炎症基因的实时PCR分析(N＝每组5只/时间点)。星号表示在给定时间 点与野生型值的显著差异*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。显示的数据 是3次独立实验的合并结果。
[0039]图20显示在缺乏IL-21R的条件下，经皮曼氏血吸虫感染后 慢性肝病减轻。用25-30个曼氏血吸虫尾蚴感染WT(空心柱)和IL-21R- /-小鼠(实心柱)。在感染后9周(急性)或12周(慢性)处死所有动物。 (A)按照上文图17中图标的描述，从肝组织分离RNA，通过实时RT-PCR 单独分析(N＝每组8-10只/时间点)。(B)在2-4只小鼠的各组中合并脾 (Spl)和肠系膜淋巴结(LN)，测定单细胞悬浮液的IL-5、IL-10和IFN-γ。 显示的数据是三个独立合并的组的平均值。(C)在WT小鼠(每组的小 鼠数目：N＝30，第9周；N＝17，第12周)和IL-21R-/-小鼠(每组的小鼠数 目：N＝27，第9周；N＝19，第12周)中对肉芽肿大小(mm3×10-3)和肉芽肿 中的嗜酸性细胞的百分比进行显微镜定量。(D)肉芽肿肺肝组织中TH2 炎症基因的实时PCR分析(N＝每组8-10只/时间点)。显示的数据是在 第9周进行的3次独立实验和在第12周进行的2次实验的合并结果。 星号表示在给定时间点与野生型值的显著差异*p＜0.05，**p＜0.01，*** p＜0.001。
[0040]图21显示IL-21R缺陷没有改变肉芽肿的细胞组成。(A)在9 周感染的WT(N＝10)和IL-21R-/-(N＝9)小鼠的肝中评估肉芽肿的细胞 组成。示出了小淋巴细胞(Sm Lym)、大淋巴细胞(Lg Lym)、巨噬细胞 (Mac)、成纤维细胞(Fibro)、嗜酸性细胞(Eos)和肥大细胞(Mc)的平均 值±SEM。(B)从未接触过抗原的WT和IL-21R-/-小鼠(上图)的灌注的 肺分离淋巴细胞，此后7天，用5000个曼氏血吸虫卵静脉内攻击(下 图)。直方图中的数字表示总肺淋巴细胞中CD4-和CD4+T细胞的百分 比。
[0041]图22显示IL-21R缺陷显著减慢TH2细胞因子依赖性纤维化 的进展。用曼氏血吸虫尾蚴感染WT(空心柱)和IL-21R-/-小鼠(实心 柱)。在感染后9(急性)、12(慢性)(图片A-D)或29周(晚期 慢性)(图片E)处死动物。(A)以平均值±SE示出了每组的平均蠕虫 对、总蠕虫和卵/蠕虫对。在所有实验中都没有感染强度差异(n＝小鼠 数目)。(B)在处死时从小鼠取血，通过ELISA确定SEA同种型特异性 Ab滴度。(C)以μg/ml表示的总血清IgE值。(D-F)通过在肝中检测的每 10,000个卵(图片D)或全肝(图片E和F)的以微摩尔表示的羟脯氨 酸的量，评估纤维化。在图片F中，用IgG2a对照抗体(cIg-空心柱)或 sIL-21R-Fc(实心柱)处理感染的WT C57BL/6小鼠6周。星号表示在给 定时间点与野生型值的显著差异*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0042]图23显示IL-21信号传递通过调节IL-13受体表达，促进替 代的巨噬细胞激活。用IL-4(20ng/ml)、IL-13(20ng/ml)和IL-21(20ng/ml) 的各种组合处理骨髓来源的巨噬细胞过夜。IL-4、IL-13和IL-21处理过 的骨髓来源的巨噬细胞是在施用IL-4和IL-13前用IL-21预处理6小时。 20小时后裂解细胞，通过实时RT-PCR单个分析RNA。(A)通过测量 Arg-1和FIZZ1基因表达评估IL-21促进替代的巨噬细胞激活的能力。(B) 通过测量L-精氨酸向尿素的转化(mg/dL±SEM，三次重复测量)，对精 氨酸酶活性进行定量。(C)通过实时PCR评估IL-4Rα和IL-13Rα1 mRNA的表达。IL-13Rα2mRNA在所有条件下几乎是不可检测的(未 示出)。图片A、B和C中所示的数据是3次独立实验的代表。(D)用 5000个活的曼氏血吸虫卵静脉内攻击未接触过抗原的C57BL/6B小 鼠，并且在第1天到第6天，每隔1天用PBS或rIL-21(2μg/剂)处理。 在第7天处死动物(每组5只)，通过实时PCR测定肺IL-13Rα2mRNA 水平，表示为相对于未处理对照的增加倍数(空心柱)。也在处死时对 小鼠取血，通过ELISA测定各个血清样品中的IL-13Rα2量。星号表示 显著差异，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
[0043]图24显示替代性激活的巨噬细胞不产生显著量的活性TGF- β1。右侧图片显示巨噬细胞激活后的活性TGF-β1，而左侧图片显示巨 噬细胞激活后的总TGF-β1水平。用IL-4(20ng/ml)、IL-13(20ng/ml) 和IL-21(20ng/ml)的各种组合处理骨髓来源的巨噬细胞过夜。IL-4、IL-13 和IL-21处理过的骨髓来源的巨噬细胞是在施用IL-4和IL-13前用IL-21 预处理6小时。激活后20小时，通过ELISA测定上清液中的总TGF- β1和活性TGF-β1。除了用单独的IL-21处理的细胞(例如，比较左侧 图片的“IL-21”与“未处理的”)，在所有组中都检测到了高水平的总TGF- β1(例如，比较左侧图片的“IL-4”与“未处理的”)。尽管总TGF-β1 高表达，但所有组中活性TGF-β1很少(右侧图片)。所示数据是产生 相似结果的3次独立实验的代表。发明详述
[0044]为了检验IL-21/IL-21R信号传递途径在纤维化的致病中的作 用，用各种肺和肝炎症的模型比较了缺乏功能性IL-21R(IL-21R-/-)的小 鼠和野生型小鼠的免疫反应。在一个模型中，将活的血吸虫卵静脉注射 到未接触过抗原的动物或抗原致敏的动物，从而研究肺中的原发和继发 肉芽肿炎症。在另一模型中，用曼氏血吸虫尾蚴经皮感染小鼠，在肝中 观察到卵诱导的炎症和纤维化的发生。在另一模型中，用巴西诺卡氏菌 感染小鼠。采用这些模型，研究了急性和慢性疾病情况下IL-21R对2 型细胞因子驱动的病理的影响。结果证明IL-21R在体内产生极化的2 型反应中，特别是在2型细胞因子介导的炎症和纤维化中的重要作用。
[0045]本发明因此提供了治疗、改善或预防受试者(如人，例如人 患者)中的纤维化或纤维化相关病症的方法，该方法使用相对于未处理 的对照(如患有纤维化或纤维化相关状况的对照受试者、未患纤维化或 纤维化相关状况的对照受试者)或相对于合适的参照水平减少IL-21和/ 或IL-21R的水平(如IL-21和/或IL-21R的表达水平(如IL-21和/或IL-21R 基因产物(即蛋白和/或mRNA)的水平)、IL-21和/或IL-21R的活性 水平、IL-21与IL-21R的相互作用水平等)的试剂。相关于鉴定减少IL-21 和/或IL-21R水平的试剂，测量“IL-21和/或IL-21R的水平”包括但不 限于：(1)测量IL-21和/或IL-21R的表达水平(如测量IL-21和/或IL-21R 基因产物(如蛋白和/或其相应mRNA)的水平)；(2)测量IL-21和/或 IL-21R的活性水平；和(3)测量IL-21与IL-21R的相互作用水平(如在例 如来自受试者(如人患者、对照受试者)的感兴趣的细胞或样品中)。 如本文进一步详细描述的，用于治疗、改善和/或预防纤维化或纤维化相 关状况或病症的示例的试剂包括抗IL-21R抗体、抗IL-21R抗体的抗原 结合片段、抗IL-21抗体、抗IL-21抗体的抗原结合片段和IL-21R多肽 的可溶性片段。本发明进一步提供监测纤维化或纤维化相关病症的治疗 过程、对其进行诊断和预测，以及筛选可用于治疗纤维化或纤维化相关 病症的化合物的方法。
[0046]本文用到的“IL-21”或“IL-21R”表示任何分别与天然存在的 IL-21或IL-21受体蛋白基本相同的多肽。编码人白介素-21(IL-21)及其 受体(IL-21R)的核苷酸和氨基酸序列描述于例如WO 00/53761，WO 01/85792，Parrish-Novak et al.(2000)Nature 408：57-63，和Ozaki et al. (2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：11439-44。理想地，IL-21多肽结 合于IL-21R，或IL-21R多肽结合于IL-21，并且，在相互作用后，IL- 21/IL-21R途径的信号传递活性增加到比对照水平高至少5％，10％，20％， 30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％以上，这是通过任何标准 方法测量的。IL-21R也称作“MU-1”、“NILR”和“zalpha11”。
[0047]减少IL-21和/或IL-21R的水平的试剂包括任何使IL-21/IL- 21R途径的信号传递活性、IL-21和/或IL-21R的表达水平，和/或IL-21 和IL-21R的相互作用水平减少至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％， 70％，80％，90％或100％的试剂。任选地，通过测量纤维化的减少水平而 评估IL-21和/或IL-21R水平的减少。减少IL-21与IL-21R的相互作用水 平的试剂包括任何使IL-21和IL-21R的相互作用减少至少5％，10％，20％， 30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％的试剂。这些上述减少IL- 21和/或IL-21R的活性或表达水平和/或减少IL-21与IL-21R的相互作用 水平的试剂(即减少IL-21和/或IL-21R的水平的试剂)在本文中可以称 作IL-21和/或IL-21R的“拮抗剂”。
[0048]“IL-21基因”或“IL-21R基因”在此分别定义为编码IL-21或 IL-21R多肽的核酸。
[0049]“纤维化”定义为任何由纤维组织的过量产生或异常产生导 致的病理状况。纤维化可以存在于任何器官，包括，例如肾、肺、肝、 皮肤、中枢神经系统、骨、骨髓、心血管系统和内分泌器官或胃肠系统。 “纤维化状况”表示任何与纤维化相关的状况。因此，纤维化相关状况 可能由于纤维化导致，或与纤维化同时发生，或导致纤维化。
[0050]减少IL-21和/或IL-21R的活性水平可以表示相对于未处理 对照或参照样品的IL-21和/或IL-21R水平或生物活性(如参照水平)， IL-21的水平或生物活性的减少。所述水平或活性可以减少至少10％， 20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。IL-21和/或IL-21R 的活性的减少也可以与2型(“Th2”)细胞因子表达和/或功能的减少相 关，这可以包括例如IL-4，IL-13，AMCase，Ym1和Fizz1/RELMα水平和 活性的调节。
[0051]减少IL-21与IL-21R的相互作用水平可以表示相对于未处理 对照或参照样品中的IL-21与IL-21R的相互作用水平，所述相互作用的 减少。所述相互作用水平可以减少至少10％，20％，30％，40％，50％，60％， 70％，80％，90％或100％。可以通过一些公知的分子生物学技术，如ELISA 和蛋白印迹，评估相互作用水平。
[0052]减少IL-21和/或IL-21R基因产物水平表示相对于未处理对 照或参照样品中的IL-21和/或IL-21R的基因或蛋白表达水平，mRNA 和/或蛋白表达水平的减少。所述表达可以减少至少10％，20％，30％，40％， 50％，60％，70％，80％，90％或100％。可以通过许多公知的分子生物学技 术，如RNA印迹或蛋白印迹，评估表达水平。
[0053]“治疗或改善纤维化”表示相对于未处理对照，减少纤维化 水平，这是通过标准方法测量的。也可以通过任何与纤维化或纤维化相 关状况相关的症状减少，测量纤维化的减少。本文公开的实例提供了确 定纤维化水平是否相对于对照减少的示例性方法。
[0054]“治疗或改善纤维化相关状况(或病症)”表示在其发生之 前或之后减少所述状况。与等同的未处理对照相比，所述减少或预防程 度是通过任何标准技术测量的至少5％，10％，20％，40％，50％，60％，80％， 90％，95％或100％。正在进行纤维化相关状况治疗的受试者是被医学从 业者诊断为具有所述状况的受试者。诊断可以通过任何合适的手段。正 在预防纤维化相关状况发生的受试者可以接受或未接受所述诊断。本领 域技术人员可以理解，这些受试者(如患者)可能经历过诊断纤维化相 关状况的标准测试，或可能鉴定(没有检验)为由于存在一个或多个危 险因素，而具有高危险性。本文公开的实例提供了确定纤维化相关病症 的水平是否相对于对照减少的示例性方法。
[0055]“预防”表示在可能发生纤维化或纤维化相关状况的受试者 中，延迟纤维化或纤维化相关状况的发病，或阻止纤维化或纤维化相关 状况的发病。
[0056]“有效量”表示治疗、改善、减少或预防哺乳动物中的纤维 化或纤维化相关状况所需的单独或组合的化合物的量。活性化合物的有 效量根据受试者施用途径、年龄、体重和一般健康状况而改变。最终， 主治医生或兽医将决定合适的量和剂量方案。
[0057]当描述蛋白或多肽时，“基本相同的”表示与参照氨基酸序 列，如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5和例如SEQ ID NOs：11，13，15，17，19， 21，23，25和27所示的融合蛋白表现出至少75％，但优选85％，更优选 90％，最优选95％，或甚至99％同一性的蛋白或多肽。对于蛋白或多肽， 比较序列的长度通常是至少20个氨基酸，优选至少30个氨基酸，更优 选至少40个氨基酸，最优选50个氨基酸，或全长蛋白或多肽。编码所 述“基本相同的”蛋白或多肽的核酸构成“基本相同的”核酸的实例。 已经认识到，由于遗传密码的冗余，一些核酸可能编码给定的蛋白或多 肽；如果这些核酸编码与参照多肽“基本相同的”多肽，则所述核酸在 本发明的范围内。
[0058]本发明的核酸可以包含DNA或RNA，且可以是完全或部分 合成的。本文所述的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA分子(或其 互补物)，且包括具有指定序列的RNA分子，其中U取代为T，除非 上下文另有要求。
[0059]本发明的分离的多核苷酸可以用作杂交探针和引物，用于鉴 别和分离具有与本文公开的多核苷酸的编码序列相同或类似的序列的 核酸。用于鉴别和分离核酸的杂交方法包括聚合酶链反应(PCR)、DNA 印迹杂交、原位杂交和RNA印迹杂交，且是本领域技术人员众所周知 的。
[0060]杂交反应可以在不同严格性条件下进行。杂交反应的严格性 包括任意两种核酸分子彼此杂交的难度。优选地，在降低的严格条件， 更优选严格条件，最优选高度严格的条件下，每个杂交多核苷酸与它的 对应多核苷酸杂交。严格条件的实例显示在下面的表1中：高度严格的 条件是至少像例如条件A-F一样严格的那些；严格的条件至少像例如条 件G-L一样严格；降低的严格条件至少象例如条件M-R一样严格。表1.严格条件
  严格条件   多核苷酸   杂交体   杂交体长度   (bp)1   杂交温度和缓冲   液2   洗涤温度和   缓冲液2   A   DNA:DNA   ＞50   65℃；1xSSC-或-   42℃；1xSSC，   50％甲酰胺   65℃；   0.3xSSC   B   DNA:DNA   ＜50   TB*；1xSSC   TB*；1xSSC   C   DNA:RNA   ＞50   67℃；1xSSC-或-   45℃；1xSSC，   50％甲酰胺   67℃；   0.3xSSC   D   DNA:RNA   ＜50   TD*；1xSSC   TD*；1xSSC   E   RNA:RNA   ＞50   70℃；1xSSC-或-   50℃；1xSSC，   50％甲酰胺   70℃；   0.3xSSC   F   RNA:RNA   ＜50   TF*；1xSSC   TF*；1xSSC   G   DNA:DNA   ＞50   65℃；4xSSC-或-   42℃；4xSSC，   50％甲酰胺   65℃；1xSSC   H   DNA:DNA   ＜50   TH*；4xSSC   TH*；4xSSC   I   DNA:RNA   ＞50   67℃；4xSSC-或-   45℃；4xSSC，   50％甲酰胺   67℃；1xSSC   J   DNA:RNA   ＜50   TJ*；4xSSC   TJ*；4xSSC   K   RNA:RNA   ＞50   70℃；4xSSC-或-   50℃；4xSSC，   50％甲酰胺   67℃；1xSSC   L   RNA:RNA   ＜50   TL*；2xSSC   TL*；2xSSC   M   DNA:DNA   ＞50   50℃；4xSSC-或-   40℃；6xSSC，   50％甲酰胺   50℃；2xSSC   N   DNA:DNA   ＜50   TN*；6xSSC   TN*；6xSSC
  严格条件   多核苷酸   杂交体   杂交体长度   (bp)1   杂交温度和缓冲   液2   洗涤温度和   缓冲液2   O   DNA:RNA   ＞50   55℃；4xSSC-或-   42℃；6xSSC，   50％甲酰胺   55℃；2xSSC   P   DNA:RNA   ＜50   TP*；6xSSC   TP*；6xSSC   Q   RNA:RNA   ＞50   60℃；4xSSC-或-   45℃；6xSSC，   50％甲酰胺   60℃；2xSSC   R   RNA:RNA   ＜50   TR*；4xSSC   TR*；4xSSC
1：杂交体长度是杂交多核苷酸的杂交区域的预期长度。当多核苷 酸与未知序列的靶多核苷酸杂交时，假定杂交体长度是杂交多核苷酸的 长度。当已知序列的多核苷酸杂交时，可以通过比对多核苷酸序列和鉴 别最佳序列互补性的一个或多个区域，确定杂交体长度。
2：SSPE(1xSSPE是0.15M NaCl，10mM NaH2PO4，和1.25mM EDTA，pH 7.4)可以替代杂交和洗涤缓冲液中的SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交结束后，洗涤15分钟。
TB*-TR*：预期长度小于50碱基对的杂交体的杂交温度应当比杂交 体的解链温度(Tm)低5-10℃，其中Tm根据下述方程确定。对于长度 小于18碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。 对于长度为18-49碱基对的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10Na+)+0.41 (％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中的碱基数，Na+是杂交缓冲液 中钠离子的浓度(1xSSC的Na+＝0.165M)。
多核苷酸杂交的严格条件的其它实例参见Sambrook，J.，E.F. Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，chapters 9 和11，和Current Protocols in Molecular Biology，1995，F.M.Ausubel 等，编，John Wiley&Sons，Inc.，sections 2.10和6.3-6.4，在本文中引 作参考。
[0061]本发明的分离的多核苷酸可以用作杂交探针和引物，用于鉴 别和分离具有公开的多核苷酸的等位基因变体的编码序列的DNA。等位 基因变体是公开的多核苷酸的天然存在的替代形式，它们编码与公开的 多核苷酸编码的多肽相同或具有显著相似性的多肽。优选地，等位基因 变体与公开的多核苷酸具有至少90％序列同一性(更优选地，至少95％ 同一性；最优选地，至少99％同一性)。或者，当核酸区段在选择性杂 交条件(例如，高度严格的杂交条件)下与公开的多核苷酸杂交时，存 在显著相似性。
[0062]本发明的分离的多核苷酸还可以用作杂交探针和引物，用于 鉴别和分离具有与公开的多核苷酸同源的多肽的编码序列的DNA。这些 同源物是从与公开的多肽和多核苷酸不同的物种或相同的物种内分离 的多核苷酸和多肽，但是与公开的多核苷酸和多肽具有显著的序列相似 性。优选地，多核苷酸同源物与公开的多核苷酸具有至少50％序列同一 性(更优选地，至少75％同一性；最优选地，至少90％同一性)，而多 肽同源物与公开的多肽具有至少30％序列同一性(更优选地，至少45％ 同一性；最优选地，至少60％同一性)。优选地，公开的多核苷酸和多 肽的同源物是从哺乳动物物种分离的那些。
[0063]通过本领域技术人员公知的方法计算2个序列之间的“同源 性”或“序列同一性”。例如，如下描述了计算序列同一性的一种通用 方法。为了最佳比较目的，比对序列(例如，为了最佳比对，可以在第 1个和第2个氨基酸或核酸序列中的一个或两个中导入空位，为了比较 目的，可以忽略非同源序列)。在一个优选的实施方案中，用于比较目 的而进行比对的参照序列的长度是参照序列长度的至少30％，优选至少 40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％， 80％，90％，100％。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基 酸残基或核苷酸。当第1个序列中的位置被与第2个序列中的对应位置 相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。2个序 列之间的同一性百分比，随序列共有的相同位置数而变化，并考虑空位 数和每个空位的长度，所述空位在2个序列的最佳比对中需要导入。
[0064]使用数学算法，可以实现2个序列之间的序列对比和序列同 一性百分比的确定。在一个优选的实施方案中，使用Needleman和 Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-53)算法，确定2个氨基酸序列 之间的同一性百分比，该算法已经整合进GCG软件包的GAP程序(下 载地址www.gcg.com)，其中使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空 位权重为16，14，12，10，8，6，或4，长度权重为1，2，3，4，5， 或6。在另一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(下 载地址www.gcg.com)，确定2个核苷酸序列之间的同一性百分比，其 中使用NWSgapdna.CMP矩阵，空位权重为40，50，60，70，或80，长 度权重为1，2，3，4，5，或6。一个优选的参数集合是Blossum 62评 分矩阵，其空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5。 还可以使用Meyers和Miller((1989)CABIOS 4：11-17)的算法，确定 2个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比，该算法已经整合进 ALIGN程序(2.0版)，其中使用PAM120加权余数表，空位长度罚分 为12，并且空位罚分为4。
[0065]“基本纯的”定义为从天然伴随的成分，如遗传材料、缔合 的蛋白、膜和细胞碎屑中分离的核酸、多肽或其它分子。典型地，如果 多肽至少60％，70％，80％，90％，95％或甚至99％(重量百分比)与其天 然缔合的蛋白和天然存在的有机分子脱离，则它是基本纯的。例如，可 以通过从天然来源提取、通过在正常情况下不表达该蛋白的细胞中表达 重组核酸，或通过化学合成而获得基本纯的多肽。
[0066]术语“分离的DNA”定义为这样一种DNA，其相对或基本 不含给定DNA所来源的生物的天然基因组中的DNA侧翼的其它DNA 序列。因此，术语“分离的DNA”包括，例如cDNA、克隆的基因组 DNA和合成DNA。
[0067]“IL-21融合”多肽或蛋白，或“IL-21R融合”多肽或蛋白定义 为IL-21或IL-21R氨基酸序列的全部或部分，例如，SEQ ID NO：2的氨 基酸1-235的IL-21R胞外片段，其与第二种异源氨基酸序列连接。在一 种实施方案中，第二种异源氨基酸序列是标记序列。常见的标记序列包 括myc标记、his标记、flag标记等。在本发明的另一实施方案中，第 二种异源氨基酸序列是免疫球蛋白序列，如Fc片段。在本文更详细描 述的所述融合蛋白和多肽由称作“IL-21融合基因”或“IL-21R融合基因” 的核酸序列编码。
[0068]在筛选方法中，“化合物”是指一种化学物质，可以是天然 存在或人工来源的。所述化合物可以包括例如肽、多肽、合成有机分子、 天然存在的有机分子、核酸分子、肽核酸分子及其成分和衍生物。例如， 本发明的有用化合物减少IL-21与IL-21R的结合。
[0069]用于治疗、改善或预防纤维化或纤维化相关状况的IL-21和 IL-21R的拮抗剂也可以由小分子组成。术语“小分子”指不是大分子的 化合物(参见，例如，Karp(2000)Bioinformatics Ontology 16：269-85； Verkman(2004)AJP-Cell Physiol.286：465-74)。因而，小分子经常视 作例如小于1000道尔顿的那些化合物(例如，Voet and Voet， Biochemistry，第2版，编者N.Rose，Wiley and Sons，New York，14 (1995))。例如，Davis等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：5981-86 使用短语小分子来指代叶酸盐、甲氨蝶呤和神经肽，而Halpin和Harbury (2004)PLos Biology 2：1022-30使用该短语来指代小分子基因产物，例 如，DNA、RNA和肽。天然和合成小分子的实例包括但不限于，胆固 醇、神经递质、siRNA和在许多可商业上得到的小分子数据库中列出的 各种化学物质，例如，FCD(精细化学物质数据库)、SMID(小分子相 互作用数据库)、ChEBI(生物利益的化学实体)、和CSD(Cambridge 结构数据库)(参见，例如，Alfarano et al.(2005)Nuc.Acids Res.Datebase Issue 33：D416-24)。
[0070]术语“药物组合物”表示任何包含至少一种治疗或生物活性 试剂并且适于施用于受试者的组合物。这些制剂中的任何一种都可以通 过本领域公知和可接受的方法制备。参见，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21st Ed.，(ed.A.R.Gennaro)，Lippincott Williams&Wilkins，Baltimore，MD(2005)。
[0071]本发明提供了相对于用于治疗和预防纤维化相关状况的标 准疗法的显著益处。如本文所描述，减少IL-21和/或IL-21R的活性或表 达水平或减少IL-21和IL-21R的相互作用水平(即减少IL-21和/或IL- 21R活性水平)的治疗剂的施用导致纤维化和纤维化相关状况的改善、 减轻或预防。此外，本发明提供的化合物筛选方法，使人们能够鉴定改 变损伤过程，而不是仅仅减轻症状的新治疗剂。纤维化病症
[0072]肉芽组织的产生是一个精细协调的过程，其中蛋白酶抑制剂 和胞外基质蛋白的表达上调，并且蛋白酶的表达减少，导致胞外基质的 积累。但是，纤维物质的异常积累，最终导致器官衰竭(如Border et al. (1994)New Engl.J.Med.331：1286-92)。纤维化状况的发生，无论是诱 发还是自发的，都是至少部分由于成纤维细胞活性的刺激导致的。炎症 细胞和激活的成纤维细胞向受损器官的流入取决于这些细胞类型与主 要含有胶原的间质基质相互作用的能力。可以受纤维化影响的示例组织 包括肾、肺、肝、皮肤、中枢神经系统、骨、骨髓、心血管系统的组织、 内分泌器官和胃肠系统的组织。
[0073]本发明的方法和组合物可以用于影响任何组织的任何纤维 化或纤维化相关状况，包括例如内部器官的纤维化、皮肤或真皮纤维化 状况和眼的纤维化状况。内部器官(如肝、肺、肾、心血管、胃肠道) 的纤维化发生在诸如以下的病症：肺纤维化、特发性纤维化、自身免疫 性纤维化、骨髓纤维化、肝硬化、静脉阻塞疾病、系膜增生性肾小球肾 炎、新月体性肾小球肾炎、糖尿病肾病、肾间质纤维化、接受环孢菌素 的受试者中的肾纤维化、同种异体移植物排斥、HIV相关肾病。其它纤 维化相关病症包括系统性硬化、嗜酸性细胞增多症-肌痛综合征和纤维 化相关CNS病症，如眼内纤维化。皮肤纤维化病症包括例如硬皮病、 局限性硬皮病、斑痕疙瘩、肥厚性斑痕、家族性皮肤胶原瘤 (collagenoma)和胶原型结缔组织痣。眼的纤维化状况包括诸如以下状 况：糖尿病视网膜病、手术后斑痕形成(例如青光眼过滤手术后和交叉 眼(斜视)手术后)和增生性玻璃体视网膜病。其它可以用本发明的方 法治疗的纤维化状况可以由于例如以下疾病导致：类风湿关节炎、与长 期关节疼痛和关节损害相关的疾病、进行性系统性硬化、多肌炎、皮肌 炎、嗜酸性细胞性筋膜炎、局限性硬皮病、雷诺综合征和鼻息肉。如本 文的描述，可以施用IL-21/IL-21R途径拮抗剂，以治疗或预防纤维化和 纤维化相关病症，或改善与这些病症相关的一种或多种症状。IL-21或IL-21R拮抗剂(IL-21/IL-21R拮抗剂)
[0074]本发明的IL-21拮抗剂或IL-21R拮抗剂分别与IL-21或IL- 21R(如哺乳动物IL-21或IL-21R，如人、牛、大鼠、小鼠、马或狗) 相互作用，并且减少IL-21和/或IL-21R的水平，例如减少与IL-21和/ 或IL-21R相关的一种或多种生物活性。当所述相互作用涉及直接结合 时，拮抗剂以高亲和力结合于IL-21或IL-21R(例如以至少约107M-1， 优选约108M-1，更优选约109M--1010M-1或更强的亲和常数)。
[0075]IL-21和/或IL-21R的水平理想地减少10％，20％，30％，40％， 50％，60％，70％，80％，90％或甚至100％。拮抗剂可以例如通过中和IL-21 减少IL-21R的活性。拮抗剂可以是包含与非IL-21R片段如免疫球蛋白 Fc区融合的IL-21R片段的融合蛋白，例如，SEQ ID NOs：11，13，15，17，19， 21，23，25和27所示的融合蛋白。其它示例的拮抗剂是抗IL-21R或抗 IL-21抗体或其抗原结合片段、IL-21R的可溶形式、肽、抑制性多核苷 酸(如siRNAs、SNPs和适体)以及小分子。
[0076]在一种实施方案中，IL-21/IL-21R拮抗剂是抗IL-21R或抗 IL-21抗体或其抗原结合片段。在进一步的实施方案中，该抗体是中和 抗体。如果需要，抗体可以是与IL-21或IL-21R或其抗原结合片段(如 Fab、F(ab′)2、Fv或单链Fv片段)结合的单克隆或单特异性抗体。抗体 可以是IL-21或IL-21R多肽的人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或体外产 生的抗体。
[0077]或者，IL-21拮抗剂或IL-21R拮抗剂可以是全长的(如突变 序列)或IL-21多肽或IL-21R多肽(如人)的片段。示例的拮抗剂包括例 如IL-21多肽(如人)的抑制性IL-21受体结合域或鼠或人IL-21R的胞 外域。IL-21拮抗剂可以具有与天然存在的IL-21R(如SEQ ID NO：2(人) 或SEQ ID NO：5(鼠))或其片段基本相同的氨基酸序列(参见表2)。或 者，拮抗剂可以具有由与天然存在的哺乳动物IL-21R或其片段(如SEQ ID NO：1(人)或SEQ ID NO：4(鼠))基本相同的核苷酸序列或由在严格 条件下，如高度严格条件下(参见表1)与前述核苷酸序列之一杂交的 核苷酸序列编码的氨基酸序列。表2：序列概括
  名称   说明   SEQ ID NO：1   人IL-21R cDNA的核酸序列   SEQ ID NO：2   人IL-21R的氨基酸序列   SEQ ID NO：3   保守WSXWS基序的氨基酸序列   SEQ ID NO：4   小鼠IL-21R cDNA的核酸序列   SEQ ID NO：5   小鼠IL-21R的氨基酸序列   SEQ ID NO：6   Fc片段的氨基酸序列   SEQ ID NO：7   人IL-21的核酸(cDNA)序列   SEQ ID NO：8   人IL-21的氨基酸序列   SEQ ID NO：9   肽信号序列   SEQ ID NO：10   与蜜蜂前导序列和氨基末端His6和Flag标记融合的   人IL-21R单体的核酸(cDNA)序列
  名称   说明   SEQ ID NO：11   与蜜蜂前导序列和氨基末端His6和Flag标记融合的   人IL-21R单体的氨基酸序列(20-235)   SEQ ID NO：12   与IgG片段融合的人IL-21R胞外域(1-235)的核酸   (cDNA)序列   SEQ ID NO：13   与IgG片段融合的人IL-21R胞外域(1-235)的氨基酸   序列   SEQ ID NO：14   与IgG片段和His6标记融合的人IL-21R胞外域(1-   235)的核酸(cDNA)序列   SEQ ID NO：15   与IgG片段和His6标记融合的人IL-21R胞外域(1-   235)的氨基酸序列   SEQ ID NO：16   与在残基254和257突变的IgG片段融合的人IL-   21R胞外域(1-235)的核酸(cDNA)序列   SEQ ID NO：17   与在残基254和257突变的IgG片段融合的人IL-   21R胞外域(1-235)的氨基酸序列   SEQ ID NO：18   与视紫红质标记融合的人IL-21R单体的核酸   (cDNA)序列   SEQ ID NO：19   与视紫红质标记融合的人IL-21R单体(20-235)   的氨基酸序列   SEQ ID NO：20   与EK切割位点和具有突变Fc区的IgG1片段融合的   人IL-21R胞外域(1-235)的核酸(cDNA)序列   SEQ ID NO：21   与EK切割位点和具有突变Fc区的IgG1片段融合的   人IL-21R胞外域(1-235)的氨基酸序列   SEQ ID NO：22   与小鼠基因组IgG2a片段融合的小鼠IL-21R胞外域   的核酸序列   SEQ ID NO：23   与小鼠基因组IgG2a片段融合的小鼠IL-21R胞外域   的氨基酸序列   SEQ ID NO：24   与Flag和His6标记融合的小鼠IL-21R胞外域的核酸   (基因组)序列   SEQ ID NO：25   与Flag和His6标记融合的小鼠IL-21R胞外域的氨基   酸序列
  名称   说明   SEQ ID NO：26   与蜜蜂前导序列和氨基末端Flag和His6标记融合的   小鼠IL-21R胞外域的核酸序列   SEQ ID NO：27   与蜜蜂前导序列和氨基末端Flag和His6标记融合的   小鼠IL-21R胞外域的氨基酸序列   SEQ ID NO：28   小鼠IL-21的有义引物   SEQ ID NO：29   小鼠IL-21的反义引物   SEQ ID NO：30   小鼠IL-21R的有义引物   SEQ ID NO：31   小鼠IL-21R的反义引物   SEQ ID NO：32   小鼠IFN-γ的有义引物   SEQ ID NO：33   IFN-γ小鼠IFN-γ的反义引物
[0078]任选地，IL-21R多肽可以是不能锚定细胞膜的可溶性多肽。 所述可溶性多肽包括例如缺乏跨膜域的足够部分或经过修饰使得跨膜 域无功能的IL-21R多肽。例如，IL-21R多肽可以是IL-21R的可溶性片 段(如含有鼠或人IL-21R的胞外域的IL-21R的片段，包括SEQ ID NO：2 (人)的大约氨基酸1-235、1-236、20-235或20-236，或SEQ ID NO：5(鼠) 的大约氨基酸1-236或20-236)。示例的IL-21拮抗剂可以具有与以下 氨基酸序列基本相同的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸20-538(成 熟的人IL-21R)、SEQ ID NO：2的氨基酸1-235(人IL-21R的胞外域)、 SEQ ID NO：2的氨基酸1-236、SEQ ID NO：2的氨基酸20-235、SEQ ID NO：2的氨基酸20-236、SEQ ID NO：5的氨基酸1-236或SEQ ID NO：5的 氨基酸20-236。
[0079]本发明的IL-21拮抗剂也可以由在例如表1所示的高度严格 条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、 SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列杂交的核酸 编码。编码IL-21R蛋白或融合蛋白，但由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NOs：1、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26所示核苷酸序列 不同的分离的多核苷酸也包括在本发明的范围内。由于点突变或诱导的 修饰导致的SEQ ID NOs：1、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26 所示核苷酸序列的变异也包括在本发明的范围内。
[0080]如果需要，可溶性IL-21R多肽可以包括第二部分，如多肽 (如免疫球蛋白链、GST、Lex-A或MBP多肽序列)，或与所述第二部 分融合。例如，融合蛋白可以包括能与IL-21结合的IL-21R多肽片段， 如IL-21R的可溶性片段(如含有鼠或人IL-21R的胞外域的IL-21R的片 段，包括SEQ ID NO：2(人)的氨基酸1-235、1-236、20-235或20-236， 或SEQ ID NO：5(鼠)的氨基酸1-236或20-236)，其与第二部分(如免 疫球蛋白链、Fc片段、各种免疫球蛋白同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区)融合。
[0081]理想地，本发明的IL-21拮抗剂减少至少一种与天然存在的 IL-21R相关的生物活性，包括，例如与IL-21多肽相互作用或结合的能 力、与信号传导分子如γc或JAK1缔合的能力、刺激磷酸化和/或激活 stat蛋白(如Stat 5和/或Stat3)的能力，和调节(例如刺激或减少)增殖、 分化、效应细胞功能、细胞裂解活性、细胞因子分泌和/或免疫细胞存活 的能力，所述免疫细胞如T细胞(CD8+和CD4+T细胞，包括Th1和 Th2细胞)、NK细胞、B细胞、巨噬细胞和巨核细胞。
[0082]根据本发明，IL-21多肽是与IL-2、IL-4和IL-15显示序列同 源性的细胞因子(Parrish-Novak et al.(2000)Nature 408：57-63)。虽然在白 介素细胞因子之间只有低序列同源性，但细胞因子具有共同的二级基 序，即“四螺旋束”结构，其是该家族的代表。IL-21主要在激活的CD4+ T细胞中表达，并且据报道对NK、B和T细胞有作用(Parrish-Novak et al. (2000)supra；Kasaian et al.(2002)Immunity 16：559-69)。IL-12与IL-21R (也称作“MU-1”、“NILR”和“zalpha11”)结合。与IL-21结合后，IL- 21R的激活立即导致Stat5和/或Stat3信号传递(Ozaki et al.(2000) supra)。
[0083]IL-21多肽的氨基酸序列是公知的。例如，人IL-21的核苷酸 序列和氨基酸序列可以从GenBank Acc.No.NM 021803获得。公开的 人IL-21核苷酸序列如下所示：1   gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc
61  tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca
121 caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat
181 tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga
241 agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa
301 gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag
361 gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg
421 tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca
481 aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc
541 taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg
601 tattccaagt ggaggag(SEQ ID NO：7)
[0084]公开的人IL-21多肽的氨基酸序列如下所示：MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVND LVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPST NAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS (SEQ ID NO：8)
[0085]因此，IL-21多肽是指能够与IL-21R相互作用或结合，并且 具有以下特征之一的蛋白：(i)与天然存在的哺乳动物IL-21或其片段(如 SEQ ID NO：8(人))基本相同的氨基酸序列；(ii)由与天然存在的哺乳动 物IL-21核苷酸序列或其片段(如SEQ ID NO：7(人)或其片段)基本相 同的核苷酸序列编码的氨基酸序列；(iii)由与天然存在的哺乳动物IL-21 核苷酸序列或其片段(如SEQ ID NO：7(人)或其片段)简并的核苷酸序 列编码的氨基酸序列；或(iv)在严格条件下与上述核苷酸序列之一杂交 的核苷酸序列。
[0086]在本发明的所有上述方面，IL-21或IL-21R多肽可以提供为 在天然存在的IL-21或IL-21R序列(野生型)中具有突变的变异多肽， 该突变分别导致与IL-21R或IL-21的亲和力更高(相对于未突变的序 列)。所述突变可以用于例如增加对蛋白水解的抗性(相对于未突变的 序列)。公开序列中的一些氨基酸序列可以改变，而不显著改变IL-21 或IL-21R结构或功能。一般地，可以取代形成IL-21或IL-21R蛋白三 级结构的残基，前提是使用行使相似功能的残基。在其它情况下，如果 非关键区域中存在改变，残基的类型可以是完全不相关的。因此，本发 明进一步包括基本上显示IL-21型生物活性的IL-21和IL-21R变体。所 述变体包括缺失、插入、倒置、重复和类型取代(例如，用一个亲水残 基取代另一个，但不用强亲水残基取代强疏水残基)。小的改变或“中 性”氨基酸取代通常对蛋白功能影响很少。(Taylor(1986)J.Theor.Biol. 119：205-18)。保守性取代可以包括但不限于脂族氨基酸之间的替代、酰 胺残基之间的取代、碱性残基的交换和芳香族残基之间的替代。关于哪 种氨基酸改变容易是表型沉默(即不容易显著影响功能)的进一步的指 导可以参见Bowie et al.(1990)Science 247：1306-10 and Zvelebil et al. (1987)J.Mol.Biol.195：957-61。
[0087]任选地，IL-21或IL-21R拮抗剂是含有本文描述的IL-21或 IL-21R多肽或其片段的融合蛋白，所述IL-21或IL-21R多肽或其片段与 第二部分，如免疫球蛋白链，如Fc片段、表位(标记)序列，如GST 或myc，和额外的公知序列如Lex-A，或MBP多肽序列融合。如果需要， 融合蛋白可以包含能够结合IL-21的IL-21R多肽片段，如IL-21R的可 溶性片段(如含有SEQ ID NO：2(人)的大约氨基酸1-235、1-236、20-235 或20-236或SEQ ID NO：5(鼠)的大约氨基酸1-236或20-236的鼠或人 IL-21R的胞外域的IL-21R片段，或与SEQ ID NOs：1或4编码的多肽相 同或基本相同的片段)，所述片段与第二部分(如免疫球蛋白链、Fc片 段、各种同种型，包括IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD和IgE 的重链恒定区)融合。或者，人Fc序列在天然存在的序列中的一个或 多个氨基酸进行了突变(如在SEQ ID NO：16的残基254和257突变)， 以减少Fc受体结合。在其它实施方案中，融合蛋白可以包含鼠IL-21R 的胞外域(SEQ ID NO：5(鼠)的大约氨基酸1-236或20-236)，其与鼠免 疫球蛋白Fc链(包括但不限于鼠IgG，如鼠IgG2a或鼠IgG2a的突变形 式)融合。
[0088]可以用于本发明方法中的拮抗性融合蛋白的实例示于图7- 15。融合蛋白可以包括与SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15， SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27基本相同的氨基酸序列，或由与SEQ ID NOs：10， 12，14，16，18，20，22，24或26基本相同的核苷酸序列编码的氨基酸序 列。一种示例的融合蛋白包含人IL-21R胞外域(如SEQ ID NO：2的氨 基酸1-235)，其在C末端通过接头(对应于SEQ ID NO：17的氨基酸 236-243)与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc突变序列(对应于SEQ ID NO：17 的氨基酸244-467)融合。人Fc序列在野生型序列的残基254和257突 变，以减少Fc受体结合。核苷酸和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：16 和SEQ ID NO：17。
[0089]第二多肽优选是可溶性的。任选地，第二多肽增加连接的多 肽的半衰期(如血清半衰期)。如果需要，第二多肽包括促进融合多肽 与第二IL-21R或IL-21多肽缔合的序列。第二多肽可以包括免疫球蛋白 多肽的至少一个区域。免疫球蛋白融合多肽是本领域已知的，并且描述 于例如美国专利Nos.5,225,538；5,428,130；5,514,582；5,714,147；和 5,455,165。
[0090]任选地，第二多肽是全长免疫球蛋白多肽或其片段(如重 链、轻链、Fab、Fab2、Fv或Fc)。
[0091]在一个实例中，第二多肽具有比野生型免疫球蛋白重链Fc 区更少的效应物功能。Fc效应物功能包括例如Fc受体结合，补体结合 和T细胞消除活性(参见例如美国专利No.6,136,310)。T细胞消除活性、 Fc效应物功能和抗体稳定性的测定方法是本领域已知的。在一个实施方 案中，第二多肽对Fc受体仅有低亲和力或没有亲和力。在一个替代实 施方案中，第二多肽对补体蛋白C1q仅有低亲和力或没有亲和力。
[0092]优选的第二多肽序列包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。该 序列包含Fc区。具有下划线的氨基酸不同于野生型免疫球蛋白序列相 应位置上的氨基酸：HTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPP
SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：6)
[0093]融合蛋白还可包含连接第一部分与第二部分的接头序列。例 如，融合蛋白可包含肽接头，例如长度约4-20个氨基酸的肽接头，更优 选长度5-10个氨基酸的肽接头，最优选长度约8个氨基酸的肽接头。肽 接头中的氨基酸可以包括例如Gly、Ser、Asn、Thr和Ala。因此，肽接 头可以由Gly-Ser元件组成。在其它实施方案中，融合蛋白包含肽接头， 其具有式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y，其中y为1、2、3、4、5、6、7或8。
[0094]在其它实施方案中，融合蛋白的N末端或C末端还可添加 另外的氨基酸序列，以促进表达、检测和/或分离或纯化。例如，IL- 21/IL-21R融合蛋白可以与一种或多种额外部分连接，所述额外部分例 如GST(即谷胱甘肽S-转移酶)、His、FLAG或myc标记。例如，融 合蛋白还可以包括GST肽，其中融合蛋白序列与GST序列的C末端融 合。这样的融合蛋白促进IL-21R/MU-1融合蛋白的纯化或鉴定。在其它 实施方案中，融合蛋白的N末端或C末端可添加另外的氨基酸序列，以 促进表达、立体柔性、检测和/或分离或纯化。
[0095]融合蛋白也可以在其N末端包含异源信号序列。例如，天 然IL-21R信号序列可以被去除，并且被另一种蛋白的信号序列取代。在 某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，可以使用异源信号序列来增 加IL-21R的表达和/或分泌。可以包含在融合蛋白中的一种信号肽是 MPLLLLLLLLPSPLHP(SEQ ID NO：9)。如果需要，可以在包含IL- 21R/MU-1部分的第一多肽部分和第二多肽部分之间额外插入一个或多 个氨基酸。
[0096]本文所述的IL-21/IL-21R拮抗剂可以衍生或与另一功能性分 子(例如另一种肽或蛋白(例如Fab′片段))连接。例如，融合蛋白或抗体或 抗原结合部分可以功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔 合或其它方式)一种或多种其它分子实体，例如抗体(例如双特异性抗体 或多特异性抗体)、毒素、放射性同位素、细胞毒性剂或细胞抑制剂等。
[0097]可以通过标准的重组DNA技术生产本发明的嵌合蛋白或融 合蛋白。例如，按照常规技术例如使用平端或粘端进行连接，将编码不 同多肽序列的DNA片段符合读框地连接在一起，经限制酶消化，提供 合适末端，按照需要补平粘端，用碱性磷酸酶处理以避免不想要的连 接，以及进行酶促连接。在另一个实施方案中，可以通过包括自动化 DNA合成仪的常规技术合成融合基因。或者，使用锚定引物可以进行基 因片段的PCR扩增，这可产生两个连续基因片段之间的互补突出端，其 随后可以退火并重新扩增以产生嵌合基因序列(参见例如Ausubel et al.， supra)。此外，许多表达载体是市售的，它们编码融合部分(例如免疫球 蛋白重链的Fc区)。IL-21R/MU-1或IL-21编码核酸可克隆到表达载体 中，使融合部分与免疫球蛋白蛋白符合读框地连接在一起。在某些实施 方案中，IL-21R/MU-1或IL-21融合多肽以寡聚体例如二聚体或三聚体 形式存在。可以使用本领域已知方法，构建IL-21R/MU-1或IL-21单体 和/或编码IL-21R/MU-1或IL-21的核酸。核酸的生产
[0098]本发明分离的多核苷酸可以与表达控制序列(例如Kaufman 等(1991)Nucleic Acids Res.19，4485-4490中公开的pMT2或pED表达载 体)操作性连接，以便产生重组IL-21R或IL-21多肽(包括其片段和融 合蛋白)。许多合适的表达控制序列是本领域已知的。表达重组蛋白的 通用方法也是已知的，例如参见R.Kaufman(1990)Methods in Enzymology 185，537-566。本文所定义的“操作性连接”是指本发明分 离的多核苷酸和表达控制序列经酶促连接或化学连接形成共价键，其方 式使得IL-21R或IL-21多肽由宿主细胞表达，所述细胞已经用所连接的 多核苷酸/表达控制序列转化(转染)。
[0099]本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸 分子的核酸。一类载体是“质粒”，它是环状双链DNA环，其中可连 接其它DNA区段。另一类载体是病毒载体，其中其它DNA区段可连接 到病毒基因组中。某些载体在它们所导入的宿主细胞(例如具有细菌复制 起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)中能自主复制。其它载体(例如 非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后，可整合到宿主细胞基因组 中，因而可随宿主基因组复制而复制。此外，某些载体能指导与其操作 性连接的基因的表达。这类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称 “表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体通常呈质粒 形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最 常用的载体形式。然而，本发明包括其它形式的表达载体，例如病毒载 体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们行使相同 的功能。
[0100]本发明的重组表达构建体可以携带额外的序列，如调节序列 (即调节载体复制(如复制起点)、编码感兴趣的多肽(或肽)的核酸 序列的转录或编码的多肽的表达的序列)、标记序列，如组氨酸，和选 择标记基因。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其它表达控制元 件(例如聚腺苷酸化信号、转录剪接位点)，其控制转录、复制或翻译。 这类调节序列描述于例如GoeddelGene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。本领域技术 人员将会理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，取决于多种因 素，包括宿主细胞的选择和需要的蛋白表达水平。对于哺乳动物宿主细 胞的表达来说，优选的调节序列包括指导蛋白高水平表达的病毒元件， 例如来自以下的启动子和/或增强子：FF-1a启动子和BGH poly A、巨细 胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如 SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和 多瘤病毒。病毒调节元件及其序列描述于例如美国专利Nos.5,168,062； 4,510,245；和4,968,615。
[0101]本发明的重组表达载体可携带额外序列，例如在宿主细胞中 调节载体复制的序列(例如复制起点和终止子序列)和选择标记基因。选 择标记基因有利于选择导入载体的宿主细胞(参见例如Axel等的美国专 利Nos.4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，选择标记基因通常给 用选择标记转染或转化的宿主细胞赋予对化合物的抗性，所述化合物例 如G418(遗传霉素)、潮霉素或甲氨蝶呤。优选的选择性标记基因包 含二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞，用甲氨蝶呤选择/ 扩增)和neo基因(用于G418选择)，以及给细菌赋予四环素和/或氨苄青 霉素抗性的基因。
[0102]可以选择或构建合适的载体，其中含有合适的调节序列，包 括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化信号、增强子信号、标记基因 和其它合适的序列。公开的方法中也可是使用蛋白的诱导表达，这是通 过使用具有诱导型启动子序列的载体实现的，所述载体例如四环素诱导 型载体，如pTet-OnTM和pTet-OffTM(Clontech，Palo Alto，CA)。关于表达 载体的其它细节，参见例如上文引用的Sambrook等人的文献。很多已 知的用于操作合适，例如制备合适构建体、诱变、测序、将DNA导入 细胞、基因表达和蛋白分析的技术和方案也描述于上文引用的Sambrook 等人的文献。
[0103]许多类型的细胞可作为合适的宿主细胞，用于表达IL- 21R/MU-1或IL-21或其融合蛋白。能表达功能性IL-21R/MU-1或IL-21 蛋白或其融合蛋白的任何细胞类型都可使用。合适的哺乳动物宿主细胞 包括例如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人肾293细胞、人表 皮A431细胞、人Colo205细胞、3T3细胞、CV-1细胞、其它转化的灵 长类细胞系、正常二倍体细胞、来自原代体外组织培养物的细胞株、原 代外植体、HeLa细胞、小鼠L细胞、BHK、HL-60、U937、HaK、 C3H10T1/2、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、M1x或C2C12细胞。
[0104]也可通过在一种或多种昆虫表达载体中，将本发明分离的多 核苷酸与合适的控制序列操作性连接，使用昆虫表达系统，产生IL-21R 或IL-21多肽或其融合蛋白。用于杆状病毒/Sf9细胞表达系统的材料与 方法是以试剂盒形式市售的(例如试剂盒，Invitrogen， Carlsbad，CA)。本文描述的多肽的可溶性形式也可用如上所述的合适 的分离的多核苷酸，在昆虫细胞中产生。
[0105]或者，IL-21R或IL-21多肽或其融合蛋白可以在酵母等低等 真核生物或细菌等原核生物中产生。合适的酵母菌株包括啤酒糖酵母、 粟酒裂殖酵母、克鲁维氏酵母属菌株、假丝酵母属或能表达异源蛋白的 任何酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒 沙门氏菌或能表达异源蛋白的任何细菌菌株。在细菌中表达，可能导致 形成含有重组蛋白的包涵体。因此，需要对重组蛋白进行重折叠，以便 产生有活性或活性更高的材料。从细菌包涵体中正确获取折叠的异源蛋 白的一些方法是本领域已知的。这些方法通常包括从包涵体中溶出所述 蛋白，然后用离液剂使蛋白完全变性。当蛋白质的一级氨基酸序列中存 在半胱氨酸残基时，通常需要在允许正确形成二硫键的环境(氧化还原系 统)中完成重折叠。重折叠的通用方法公开于Kohno(1990)Meth.Enzym.， 185：187-195；E.P.0433225和美国专利No.5,399,677。
[0106]本发明的蛋白(或其片段或融合蛋白)也可表达为转基因动 物的产物，例如表达为转基因母牛、山羊、猪或绵羊的乳汁成分，所述 转基因动物的特征是体细胞或生殖细胞中含有例如编码IL-21R或IL-21 或其融合蛋白的多核苷酸序列。因此，可通过在表达所需蛋白必需的培 养条件下培养转化的宿主细胞，制备所述蛋白。所得的表达蛋白然后可 以从培养基或细胞提取物中纯化出来。蛋白的可溶形式可从条件培养基 中纯化出来。可通过从表达细胞中制备全部膜级分并用非离子型去污 剂，例如X-100(EMD Biosciences，San Diego，CA)提取膜，纯 化本发明的IL-21R蛋白的膜结合形式。
[0107]可采用本领域技术人员已知的方法，纯化本文描述的多肽。 例如，本发明的蛋白可用市售的蛋白浓缩滤器，例如或 超滤单元(Millipore，Billerica，MA)进行浓缩。浓缩步骤之 后，浓缩液可加到纯化基质例如凝胶过滤介质上。或者，可使用阴离子 交换树脂，例如，具有二乙氨基乙基(DEAE)或聚亚乙基亚胺 (polyetheyleneimine，PEI)侧基的基质或衬底。这些基质可以是丙烯酰 胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或通常用于蛋白质纯化的其它种类。或者， 可以采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括含磺基丙基或羧基 甲基的各种不溶性基质。优选磺基丙基(例如S-柱， Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。从培养上清液中纯化IL-21/MU-1蛋白或 融合蛋白，也可以包括一个或多个过柱步骤，柱中含有例如伴刀豆球蛋 白A-琼脂糖、AF-HEPARIN650、肝素-或Cibacron blue 3GA(Tosoh Biosciences，San Francisco，CA)等亲和树脂； 或通过疏水作用层析，其中采用苯基醚、丁基醚或丙基醚等树脂；或通 过免疫亲和层析。最后，可以使用一个或多个反相高效液相层析(RP- HPLC)步骤，其中用疏水RP-HPLC介质，例如具有甲基或其它脂族侧基 的硅胶，进一步纯化IL-21R/MU-1或IL-21蛋白。包含抗本发明蛋白的 抗体的亲和柱也可用于按照已知方法进行纯化。上述纯化步骤的部分步 骤或全部步骤，以不同组合或与其它已知方法组合，也可用于提供基本 上纯化的分离的重组蛋白。优选地，分离的蛋白是纯化的，使它基本上 不含其它哺乳动物蛋白。抗体的生产
[0108]本发明的IL-21或IL-21R多肽也可用于免疫动物，以获得多 克隆抗体和单克隆抗体，这样的抗体与IL-21或IL-21R特异性反应，并 且调节IL-21和/或IL-21R的表达或活性，或调节IL-21与IL-21R的相互 作用水平。可以例如使用完整I1-21R或其片段作为免疫原，得到这样的 抗体。肽免疫原还可在羧基端含有半胱氨酸残基，并且与半抗原缀合， 所述半抗原例如匙孔血蓝蛋白(KLH)。可通过用硫酸化酪氨酸残基替代 酪氨酸残基而制备其它肽免疫原。这些肽的合成方法是本领域众所周知 的，例如参见Merrifield(1963)J.Amer.Chem.Soc.85：2149-54 and Krstenansky and Mao(1987)FEBS Lett.211：10-16。
[0109]用携带人免疫球蛋白基因(而不是小鼠系统)的转基因小 鼠，可产生针对IL-21或IL-21R的人单克隆抗体(mAbs)。这些来自经感 兴趣的抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞，用于生产杂交瘤，该杂交瘤分 泌对人蛋白的表位具有特异性亲和力的人mAbs(参见例如WO 91/00906， WO 91/10741，WO 92/03918，WO 92/03917，Lonberg et al.(1994)Nature 368：856-59，Green et al.(1994)Nat.Genet.7：13-21，Morrison et al.(1994) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-55，和Tuaillon et al.(1993)Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：3720-24)。
[0110]也可通过重组DNA技术领域技术人员已知的其它方法生产 单克隆抗体。已经开发了一个示例的方法，称为“组合抗体展示”方法， 用于鉴定并分离具有特定抗原特异性的抗体片段，该方法可用于生产单 克隆抗体(组合抗体展示的描述参见例如Sastry et al.(1989)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.86：5728-32；Huse et al.(1989)Science 246：1275-81；和 Orlandi et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：3833-37)。用免疫原 免疫动物后，克隆所得B细胞集合的抗体所有组成成分。使用寡聚引物 混合物和PCR，可以获取多种免疫球蛋白分子群体的可变区的DNA序 列。例如，对应于5′前导(信号肽)序列和/或构架1(FR1)序列的混合寡核 苷酸引物，以及针对保守的3′恒定区引物的引物，可用于从各种鼠抗体 PCR扩增重链可变区和轻链可变区(Larrick et al.(1991)，BioTechniques 11：152-156)。类似的策略也可用于从人抗体扩增人重链可变区和轻链可 变区(Larrick et al.(1991)Methods：Companion to Methods in Enzymology 2：106-10)。
[0111]嵌合抗体，包括嵌合免疫球蛋白链，可通过本领域已知的重 组DNA技术制备。例如，用限制酶消化编码鼠(或其它物种)单克隆抗体 分子的Fc恒定区的基因，以去除鼠Fc编码区，并且用人Fc恒定区编码 基因的等同部分来取代(参见PCT/US86/02269；EP 184,187；EP 171,496； EP 173,494；WO 86/01533；美国专利No.4,816,567；EP 125,023；Better et al.(1988)Science 240：1041-43；Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.84：3439-43；Liu et al.(1987)J.Immunol.139：3521-26；Sun et al. (1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：214-18；Nishimura et al.(1987) Canc.Res.47：999-1005；Wood et al.(1985)Nature 314：446-49；和Shaw et al.(1988)J.Natl.Cancer Inst.80：1553-59)。
[0112]如果需要，可以通过本领域已知方法，使抗体或免疫球蛋白 链人源化。可通过用人Fv可变区的等同序列取代不直接参与抗原结合 的Fv可变区的序列，而产生人源化抗体，包括人源化免疫球蛋白链。 产生人源化抗体的通用方法由以下文献提供：Morrison，S.L.(1985) Science 229：1202-07，Oi等(1986)BioTechniques 4：214，和美国专利Nos. 5,585,089、5,693,761和5,693,762，所述文献的内容通过引用全部结合 到本文中。这些方法包括编码至少一个重链或轻链的全部或部分免疫球 蛋白Fv可变区的核酸序列的分离、操纵和表达。对于本领域技术人员 来说，所述核酸的来源是众所周知的，例如可得自产生针对预先确定的 靶的抗体的杂交瘤。然后，编码人源化抗体或其片段的重组DNA可以 克隆到合适的表达载体中。
[0113]可通过CDR移植或CDR取代，制备人源化或CDR移植的 抗体分子或免疫球蛋白，其中一个、两个或所有免疫球蛋白链的CDR 都可以被取代。参见例如美国专利No.5,225,539；Jones et al.(1986) Nature 321：552-25；Verhoeyan et al.(1988)Science 239：1534-36；和Beidler et al.(1988)J.Immunol.141：4053-60，所有这些文献的内容通过引用全部 结合到本文中。美国专利No.5,225,539描述了CDR移植方法，所述方 法可用于制备本发明的人源化抗体(也参见GB 2188638A)。特定人抗体 的所有CDRs都可以被至少一部分非人类CDR取代，或者仅有部分 CDRs可以被非人CDRs取代。仅有必要取代人源化抗体与预先确定的 抗原结合所需的CDRs的数量。
[0114]通过例如缺失、添加或取代抗体其它部分(例如恒定区)而修 饰的单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体，也包括在本发明范围内。例 如，抗体可以通过以下方法修饰：(i)缺失恒定区；(ii)用另一个恒定区取 代原有恒定区，所述另一个恒定区例如能增加抗体半衰期、稳定性或亲 和力的恒定区，或者所述恒定区来自另一物种或抗体类别；或(iii)修饰 恒定区内的一个或多个氨基酸，以改变例如糖基化位点的数目、效应细 胞功能、Fc受体(FcR)结合、补体固定等。
[0115]改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。可以通过在抗体恒 定部分用不同的残基取代至少一个氨基酸残基，产生具有功能改变(例如 对细胞上的FcR或补体C1成分等效应配体的亲和力发生改变)的抗体 (参见例如E.P.388,151A1、U.S.5,624,821和U.S.5,648,260，所述文献 的内容全都通过引用结合到本文中)。也可以将类似的改变类型用于鼠免 疫球蛋白或其它物种的免疫球蛋白。例如，可通过用侧链上具有合适官 能团的残基取代指定残基，或者通过引入带电荷的官能团，例如谷氨酸 或天冬氨酸，或许芳族非极性残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或 丙氨酸，来改变抗体(例如IgG，例如人IgG)的Fc区对FcR(例如Fc γR1) 或对C1q结合的亲和力(参见例如U.S.5,624,821)。
[0116]此外，可以用经过修饰的转基因非人动物反应于抗原攻击而 生产IL-21和/或IL-21R的人抗体，以生产全人抗体，而不是动物的内源 抗体。参见例如PCR公开WO 94/02602。已经使非人宿主中编码重和轻 免疫球蛋白链的内源基因丧失能力，并将有活性的编码人重和轻链免疫 球蛋白的基因座插入宿主基因组。使用例如含有必要人DNA区段的酵 母人工染色体，掺入人基因。然后，通过使含有比修饰的完全互补序列 少的修饰的中间转基因动物杂交，得到提供所有需要的修饰的动物后 代。这样的非人动物的一个实施方案是小鼠，并称作XENOMOUSETM， 如在PCT公开WO 96/33735和WO 96/34096中披露的。该动物生产分 泌全人免疫球蛋白的B细胞。可以在用感兴趣的免疫原免疫后从动物直 接得到抗体，例如，多克隆抗体的制备物，或者从源自动物的永生化B 细胞(例如生产单克隆抗体的杂交瘤)得到抗体。另外，可以回收编码 含有人可变区的免疫球蛋白的基因，并表达，以直接得到抗体，或可以 进一步修饰，以得到抗体类似物，例如单链Fv分子。
[0117]也可以用其它蛋白结合分子调节IL-21和/或IL-21R的活 性。这样的蛋白结合分子包括小模块免疫药物(SMIPTM)药物(Trubion Pharmaceuticals，Seattle，WA)。SMIP是一种单链多肽，由相关结构 (例如抗原，反受体等)的结合结构域、具有1个或没有半胱氨酸残基 的铰链区多肽、和免疫球蛋白CH2和CH3结构域组成(也参见 www.trubion.com)。SMIP和它们的用法和用途，公开在例如，美国公 开专利申请Nos.2003/0118592，2003/0133939，2004/0058445， 2005/0136049，2005/0175614，2005/0180970，2005/0186216， 2005/0202012，2005/0202023，2005/0202028，2005/0202534和 2005/0238646及其相关专利家族成员中，它们都在本文中整体引作参 考。
[0118]如本文所公开的，与IL-21R或IL-21或其融合蛋白结合的中 和性或非中和性抗体(优选单克隆抗体)可以用于治疗免疫状况，如纤 维化和纤维化相关状况。
[0119]因此，本发明进一步提供了包含与IL-21R或IL-21或其融合 蛋白特异性反应的抗体的组合物。筛选测定
[0120]本发明的IL-21R或IL-21多肽或融合蛋白也可以用于筛选能 够与IL-21或IL-21R结合的试剂，并且调节IL-21和/或IL-21R的水平， 例如，IL-21和/或IL-21R的活性水平、IL-21和/或IL-21R的表达水平(例 如IL-21和/或IL-21R基因产物的水平)和/或IL-21R和IL-21之间的相互 作用水平。采用游离或固定于支持物的本发明的蛋白或其结合配偶体的 结合测定是本领域公知的。可以用纯化的基于细胞或基于蛋白的(无细 胞)筛选测定，鉴定本发明的IL-21R或IL-21多肽或融合蛋白的结合配 偶体和/或配体(天然或合成的，例如，测试化合物)。例如，IL-21R 可以以纯化形式固定在载体上，并且可以测量潜在配体与IL-21R的结 合。诊断、预测和监测与IL-21相关的纤维化和纤维化相关病症的进展 的方法
[0121]本发明提供了诊断、预测和监测与IL-21和/或IL-21R相关 的病症，即纤维化或纤维化相关状况或病症的进展(如监测治疗过程) 的方法，该方法是通过例如检测和/或测量IL-21和/或IL-21R的水平， 其中术语“IL-21和/或IL-21R的水平”及其等同形式包括但不限于， (1)IL-21和/或IL-21R基因产物的表达水平(如感兴趣的细胞或样品中的 IL-21和/或IL-21R蛋白和/或mRNA的水平)；(2)IL-21蛋白和/或IL-21R 蛋白的活性水平(如感兴趣的细胞或样品中的Th2细胞因子表达和/或功 能)；和(3)IL-21与IL-21R的相互作用水平(如感兴趣的细胞或样品中)。 例如，本发明提供了通过检测IL-21和/或IL-21R基因产物和/或活性的 上调或下调，和/或通过测量IL-21与IL-21R的相互作用水平等而进行诊 断、预测和监测的方法(包括但不限于将所述方法用于人受试者)。也 可以在感兴趣的参照细胞或样品中测量IL-21和/或IL-21R水平，以产生 或获得IL-21和/或IL-21R的参照水平，或所述参照水平可以通过其它方 法获得，或可以通常是本领域技术人员已知的。这些方法可以通过例如 采用预先包装的诊断试剂盒进行，该试剂盒包含至少下组的至少一种成 分：本文描述的IL-21或IL-21R多核苷酸(或其片段)；IL-21或IL-21R 多肽(或其片段和/或融合蛋白)；IL-21或IL-21R多肽的抗体(或其衍 生物或其抗原结合片段)；或IL-21或IL-21R多核苷酸和/或多肽的调节 剂，所述试剂盒可以方便地例如用于临床环境中。
[0122]“诊断的”或“诊断”表示鉴定病理状况的存在与否。诊断 方法包括但不限于通过以下步骤检测IL-21和/或IL-21R水平的上调：确 定来自受试者(人或哺乳动物)的生物样品中的IL-21和/或IL-21R的基 因产物(如RNA、cDNA或多肽，包括其片段)的测试量、测量IL-21 和/或IL-21R的活性，和/或测量IL-21与IL-21R的相互作用水平，并且 比较测试量与例如正常量或范围(如来自已知未患与IL-21相关的病症 的个体或来自已知未患纤维化或纤维化相关状况的个体的量或范围)。 尽管特定诊断方法可能不提供与IL-21相关的病症的确定诊断，但如果 该方法提供有助于诊断的阳性指示，则它是足够的。
[0123]本发明也提供了通过以下步骤预测所述病症的方法：例如检 测IL-21和/或IL-21R水平的上调，例如检测IL-21和/或IL-21R基因产 物和/或活性的上调，和/或测量IL-21与IL-21R的相互作用水平等。“预 测的”或“预测”表示预测病理状况的可能的发展和/或严重性。预测方 法包括确定来自受试者的生物样品中的IL-21和/或IL-21R的基因产物的 测试量，并且比较IL-21和/或IL-21R水平的测试量与预测量或范围(即 来自具有不同严重性的例如与IL-21相关的病症，即纤维化和/或纤维化 相关状况的个体的量或范围)。测试样品中的各种与IL-21和/或IL-21R 的水平相关的量与IL-21和/或IL-21R相关病症如纤维化或纤维化相关状 况的某些预测一致。在特定预测水平上的IL-21和/或IL-21R水平的量的 检测提供了对受试者的预测。
[0124]本发明也提供了通过以下步骤监测所述与IL-21相关的病症 的进展或过程的方法：例如检测IL-21和/或IL-21R水平的上调，例如检 测IL-21和/或IL-21R基因产物、活性和/或IL-21与IL-21R的相互作用 的上调。监测方法包括确定在第一和第二时间点取自受试者的生物样品 中的IL-21基因产物的测试量，并且比较所述量。第一和第二时间点之 间IL-21和/或IL-21R基因产物量的改变表明IL-21相关病症的过程改 变，其中量的减少表明所述病症的消除，量的增加表明所述疾病的进 展。所述监测测定也可以用于评估进行纤维化或纤维化相关病症治疗的 患者中特定治疗干预的效力。测量IL-21和/或IL-21R的水平
[0125]可以在多种生物样品中测量本文描述的本发明方法(如筛选 和/或鉴定用于治疗、改善或预防纤维化或纤维化相关状况的化合物的方 法、诊断、预测和/或监测纤维化或纤维化相关状况的进展的方法，和治 疗、改善或预防纤维化或纤维化相关状况的方法)中的IL-21和/或IL- 21R的水平(如IL-21和/或IL-21基因产物、活性和/或相互作用的水平)， 所述生物样品包括体液(例如，全血、血浆和尿)，细胞(例如，全细 胞、细胞级分和细胞提取物)及其它组织。生物样品还包括组织切片， 例如活检物和为组织学目的制备的冷冻切片。优选的生物样品包括血 液、血浆、淋巴、组织活检物、尿、CSF(脑脊液)、滑液和BAL(支 气管肺泡灌洗液)。应当明白，生物样品的分析不一定需要从受试者取 出细胞或组织。例如，可以将适当标记的、结合IL-21和/或IL-21R基因 产物(例如，抗体、核酸)的试剂施用给受试者，并使用标准的成像技 术(例如，CAT、NMR(MRI)和PET)观察(当结合到靶上时)。
[0126]在本发明的治疗、改善或预防纤维化或纤维化相关病症的方 法，鉴定用于治疗、改善或预防受试者中的纤维化或纤维化相关病症的 化合物的方法，和诊断、预测和监测测定和方法中，检测和测量IL-21 和/或IL-21R的水平，以得到测试量。然后比较测试量与例如正常量或 范围。例如，高于(如较高水平)正常量或范围的量是与IL-21相关的 病症的诊断中的阳性指征。
[0127]对于任何特定样品类型和群体，可以确定IL-21和/或IL-21R 的正常量或基线水平。通常，通过测量来自正常(即健康)受试者的生 物样品类型中IL-21和/或IL-21R各自的水平，确定IL-21和/或IL-21R 的基线(正常)水平。或者，通过测量从与采集患病的(或可能患病的) 测试细胞或组织相同的受试者采集的健康细胞或组织中的量，可以确定 IL-21和/或IL-21R的正常水平。可以以单位细胞、单位总蛋白或单位体 积为基础，确定或表示IL-21和/或IL-21R基因产物的量(正常量或测 试量)。为了确定样品的细胞量，可以测量在采集生物样品的细胞类型 中组成型表达的基因产物或以已知水平表达的其它基因产物的水平。
[0128]应当明白，本发明的测定方法不一定需要测量IL-21和/或 IL-21R水平的绝对值，因为相对值对于这些方法的许多用途是足够的。 还应当明白，除了IL-21和/或IL-21R水平的量或丰度以外，通过比较正 常水平和表达模式，可以鉴别变体或异常IL-21和/或IL-21R水平或它们 的表达模式(例如，突变的转录物，截短的多肽)。
[0129]两种样品中的特定基因或蛋白的水平是增加(即更高)还是 减少(即更低)，例如，分别显著超过或显著低于给定水平，取决于基 因本身，尤其是它在不同个体或不同样品中表达、活性和/或与配体相互 作用的变异性。确定IL-21和/或IL-21R水平在样品之间是显著类似还是 不同，属于本领域常识。当确定两种样品之间IL-21和/或IL-21R水平是 增加还是减少时，可以考虑例如个体、物种、器官、组织、或细胞之间 的遗传变异等因素(在必要的时间和场合)。作为个体、物种、器官、 组织、或细胞之间IL-21和/或IL-21R水平的天然异质性的结果，“显著 高于”或“显著低于”等短语不能定义为精确百分比或值，然而可以由 本领域技术人员在实施本发明后判定。本文描述了检测和测量IL-21和/ 或IL-21R基因产物、活性和相互作用的特定方法。测量IL-21和/或IL-21R基因产物的测定
[0130]本发明的方法涉及检测和定量生物样品中的IL-21和/或IL- 21R的水平，例如IL-21和/或IL-21R的基因产物的水平，IL-21和/或 IL-21R的活性水平，和/或IL-21与IL-21R的相互作用水平。IL-21和 IL-21R基因产物包括mRNA和多肽，这两者都可以采用本领域技术人 员公知的方法测量。
[0131]例如，使用基于杂交的测定，例如RNA印迹杂交、原位杂 交、点和狭线印迹，和寡核苷酸阵列，可以直接检测mRNA。基于杂交 的测定是指使探针核酸与靶核酸杂交的测定。在有些形式中，将靶、探 针或两者固定。固定的核酸可以是DNA，RNA，或另一种寡核苷酸或 多核苷酸，且可以包含天然或非天然存在的核苷酸、核苷酸类似物或主 链。选择用于本发明的核酸探针序列的方法(例如基于IL-21的核酸序 列)是本领域众所周知的。
[0132]或者，可以在检测和定量之前扩增mRNA。这样的基于扩增 的测定是本领域众所周知的，包括聚合酶链反应(PCR)、逆转录-PCR (RT-PCR)、PCR-酶联免疫吸附测定(PCR-ELISA)、和连接酶链反 应(LCR)。本领域技术人员基于IL-21和/或IL-21R的核酸序列，无需 过度试验，可以容易地设计和制备出用于制备和检测扩增的IL-21基因 产物(例如，mRNA或cDNA)的引物和探针。可以直接分析扩增的IL-21 和/或IL-21R基因产物，例如，通过凝胶电泳；通过与探针核酸的杂交； 通过测序；通过检测荧光信号、磷光信号或放射性信号；或通过许多众 所周知的方法中的任一种。另外，本领域技术人员已知用于增加扩增靶 核酸序列产生的信号的方法。本领域技术人员可以认识到，无论使用哪 种扩增方法，如果需要定量基因产物，可以使用本领域已知的许多定量 方法(例如，定量PCR)。
[0133]使用各种众所周知的免疫测定，采用可以按照上文的描述制 备的各自的抗IL-21和/或IL-21R抗体，可以检测IL-21和/或IL-21R多 肽(或其片段)。免疫测定指利用特异性地结合例如IL-21多肽(或其 片段)的抗体(例如，多克隆的，单克隆的，嵌合的，人源化的，scFv 和/或其片段)的测定。适用于实践本发明的这种众所周知的免疫测定包 括ELISA，放射免疫测定(RIA)，免疫沉淀，免疫荧光，荧光激活的 细胞分选(FACS)，和蛋白印迹。本领域技术人员也可以理解，可以 使用标记的IL-21R多肽，检测IL-21多肽。本领域技术人员可以理解， 上述方法可以用于与IL-21相关的病症，特别是纤维化或纤维化相关状 况。测量IL-21和/或IL-21R活性的测定
[0134]可以使用任一种常规因子依赖性细胞增殖测定，对包括但不 限于以下的细胞系，测定IL-21/IL-21R的活性(例如反应于作为细胞因 子产生和细胞增殖/分化调节剂的IL-21/IL-21R拮抗剂)：32D，DA2， DA1G，T10，B9，B9/11，BaF3，MC9/G，M+(preB M+)，2E8，RB5，DA1，123， T1165，HT2，CTLL2，TF-1，Mo7e和CMK。
[0135]T细胞或胸腺细胞增殖的测定描述于例如Current Protocols in Immunology，Coligan et al.(eds.)Greene Pub.Assoc.&Wiley- Interscience，NY，NY(1991)(第3章，“In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function”和第7章，“Immunologic studies in Humans”)； Takai et al.(1986)J.Immunol.137：3494-500；Bertagnolli et al.(1990)J. Immunol.145：1706-12；Bertagnolli et al.(1991)Cell.Immunol.133：327-41； Bertagnolli et al.(1992)J.Immunol.149：3778-83；Bowman et al.(1994)J. Immunol.152：1756-61。细胞因子生产和/或脾细胞、淋巴结细胞或胸腺 细胞增殖的测定描述于例如“Polyclonal T cell stimulation”Kruisbeek and Shevach in Current Protocols in Immunology，Vol.1 Coligan et al.(eds.)pp. 3.12.1-14，John Wiley and Sons，Toronto(1994)；和“Measurement of mouse and human Interferon gamma”Schreiber，R.D.in Current Protocols in Immunology，Vol.1 Coligan et al.(eds.)pp.6.8.1-8，John Wiley and Sons， Toronto(1994)。
[0136]造血细胞和淋巴细胞生成细胞增殖和分化的测定描述于例 如“Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4” Bottomly et al.in Current Protocols in Immunology，Vol.1 Coligan et al. (eds.)pp.6.3.1-12，John Wiley and Sons，Toronto(1991)；deVries et al. (1991)J.Exp.Med.173：1205-11；Moreau et al.(1988)Nature 336：690-92； Greenberger et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2931-38； “Measurement of mouse and human interleukin 6”Nordan，R.in Current Protocols in Immunology，Vol.1 Coligan et al.(eds.)pp.6.6.1-5，John Wiley and Sons，Toronto(1991)；Smith et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A..83：1857-61；“Measurement of human Interleukin 11”Bennett et al. in Current Protocols in Immunology，Vol.1 Coligan et al.(eds.)p.6.15.1， John Wiley and Sons，Toronto(1991)；“Measurement of mouse and human Interleukin 9”Ciarletta et al.in Current Protocols in Immunology，Vol.1. Coligan et al.(eds.)p.6.13.1，John Wiley and Sohs，Toronto(1991)。
[0137]用于针对抗原的T细胞克隆反应的测定(鉴定影响APC-T细 胞相互作用的蛋白等，并通过测定增殖和细胞因子产生而指导T细胞效 应)包括例如以下文献中描述的那些：Current Protocols in Immunology， Coligan et al.(eds.)Greene Pub.Assoc.and Wiley-Interscience，NY，NY (1991)(第3章，“In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function”；第6章， “Cytokines and their cellular receptors”；第7章，“Immunologic studies in Humans”)；Weinberger et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：6091- 95；Weinberger et al.(1981)Eur.J.Immunol.11：405-11；Takai et al.(1986) J.Immunol.137：3494-500；Takai et al.(1988)J.Immunol.140：508-12。测量IL-21与IL-21R的相互作用的测定
[0138]检测和/或测量IL-21与IL-21R的相互作用水平的方法是本 领域公知的。例如，可以利用例如但不限于诸如ELISA、蛋白印迹、免 疫沉淀、Biacore分析等的技术检测和/或测量细胞因子与其受体之间的 相互作用。药物组合物
[0139]一方面，本发明描述了用于治疗、改善或预防IL-21相关病 症，即纤维化或纤维化相关状况的方法。该方法可以包括使细胞群与减 少受试者中的IL 21和/或IL 21R活性的试剂接触(例如通过给患有纤维 化或纤维化相关病症或处于发生所述病症的危险中的受试者施用)，所 述试剂例如IL-21/IL-21R拮抗剂(如抗IL-21R抗体、抗IL-21抗体、抗 IL-21R抗体的抗原结合片段、抗IL-21抗体的抗原结合片段、IL-21R的 可溶性片段(如与选自下组的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸 序列：SEQ ID NO：2的氨基酸1-538、SEQ ID NO：2的氨基酸20-538、SEQ ID NO：2的氨基酸1-235、SEQ ID NO：2的氨基酸20-235、SEQ ID NO：2 的氨基酸1-236、SEQ ID NO：2的氨基酸20-236、SEQ ID NO：5的氨基酸 1-529、SEQ ID NO：5的氨基酸20-529、SEQ ID NO：5的氨基酸1-236和 SEQ ID NO：5氨基酸20-236))，所述试剂的量足以抑制细胞或群体中 的IL-21活性。
[0140]用于治疗纤维化或纤维化相关状况的IL-21/IL-21R-拮抗剂 当与药学可接受的载体组合后，可用作药物组合物。除了IL-21/IL-21R- 拮抗剂和载体之外，所述组合物还可含有各种稀释剂、填充剂、盐类、 缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域众所周知的其它材料。术语“药学可 接受的”是指无毒材料，其不干扰活性成分的生物学活性的有效性。载 体的特性取决于给药途径，并且通常是本领域公知的。
[0141]本发明的药物组合物可以呈脂质体形式，其中IL-21/IL-21R 拮抗剂除了与其它药学可接受的载体组合外，还与两亲性试剂(例如以聚 集形式存在成为胶束、不溶性单层的脂质、液晶或在水溶液中存在的片 层)组合。用于脂质体制剂的合适脂质包括但不限于甘油单酯、甘油二 酯、硫脑苷酯、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆酸等。这类脂质体制剂的 制备在本领域技术人员水平范围内，并在以下文献中公开：例如美国专 利Nos.4,235,871、4,501,728、4,837,028和4,737,323，所有这些文献都 通过引用结合到本文中。
[0142]本文所用的术语“治疗有效量”是指足以给患者带来有用的 益处的药物组合物或方法的各活性成分的总量，所述益处例如改善或减 轻状况的症状、预防所述状况、治愈所述状况或提高其治愈率。当用于 单一活性成分单独给予时，该术语是指单独的该成分。当用于组合时， 该术语是指产生疗效的活性成分的组合量，无论是联合、序贯还是同时 给予。
[0143]在本发明的治疗方法或用途的实践中，将治疗有效量的IL- 21/IL-21R拮抗剂给予受试者，例如哺乳动物(例如人)。IL-21/IL-21R拮 抗剂可以按照本发明的方法单用或与以下详述的其它疗法联合施用。当 与一种或多种试剂联合施用时，IL-21和/或IL-21R拮抗剂可以与第二试 剂同时或序贯施用。如果是序贯施用，主治医师将会决定施用IL- 21/IL-21R-拮抗剂以及其它试剂的合适顺序。
[0144]可以按各种常规途径，施用用于本发明的药物组合物中或用 于实施本发明的方法的IL-21/IL-21R拮抗剂，所述途径例如口服摄入、 吸入或皮肤、皮下或静脉内注射。有时优选静脉内施用于受试者。当治 疗有效量的IL-21/IL-21R激动剂或拮抗剂是经口服施用时，结合剂将呈 片剂、胶囊剂、粉剂、溶液剂或酏剂的形式。当以片剂施用时，本发明 的药物组合物还可含有固体载体，例如明胶或佐剂。片剂、胶囊剂和粉 剂含有约5-95％的结合剂，优选含有约25-90％的结合剂。当以液体形式 给药时，可加入液体载体，例如水、石油、动物油或植物油，例如花生 油(但必须考虑人群中花生过敏的频率)、矿物油、大豆油或芝麻油， 或合成油。药物组合物的液体形式还可含有生理盐水、葡萄糖或其它糖 溶液，或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给药时， 药物组合物含有约0.5-90重量％的结合剂，优选约1-50重量％的结合 剂。
[0145]当治疗有效量的IL-21/IL-21R拮抗剂是经静脉内、皮肤或皮 下注射施用时，所述结合剂将呈无热源、胃肠外可接受的水溶液形式。 具有适当的pH、等渗性、稳定性等的所述胃肠外可接受的蛋白溶液剂 的制备在本领域技术范围内。除了结合剂外，供静脉内、皮肤或皮下注 射用的优选药物组合物还应含有等渗溶媒，例如氯化钠注射液、林格注 射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格注射液或本领 域已知的其它溶媒。本发明的药物组合物也可含有稳定剂、防腐剂、缓 冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其它添加剂。
[0146]本发明药物组合物中IL-21/IL-21R拮抗剂的用量将取决于所 治疗状况的性质和严重程度，以及该受试者以前曾接受过的治疗的性 质。最终，主治医师将会决定用于治疗各个受试者的结合剂的用量。开 始，主治医师将施用低剂量的结合剂，并观察受试者的反应。可施用更 大剂量的结合剂，直到所述受试者达到最佳治疗效果，而且在该点通常 不再继续增加剂量。用于本发明方法的实践的不同药物组合物应含有约 0.1μg至约100mg IL-21/IL-21R-拮抗剂/千克体重。
[0147]用本发明药物组合物进行静脉内治疗的持续时间将会不 同，取决于所治疗疾病的严重程度和每个患者的情况和潜在的特异反 应。每次应用IL-21/IL-21R拮抗剂的持续时间范围将在12-24小时连续 静脉内施用。还考虑使用本发明药物组合物的皮下(s.c.)治疗。这些治 疗可以每天、每周或更优选每2周或每月施用。还考虑，当IL-21/IL-21R 拮抗剂是小分子(例如，口服递送)时，治疗可以每天1次、每天2次、 每天3次等施用。最后，主治医师会决定使用本发明的药物组合物，静 脉内或皮下治疗、或使用小分子治疗的适当持续时间，和施用治疗的时 机。
[0148]预期本发明的多核苷酸和蛋白表现出本文所鉴定的一种或 多种用途或生物活性(包括与本文引用的测定相关的那些用途或生物活 性)。通过施用或使用所述蛋白或抗体，或者通过施用或使用编码所述蛋 白或抗体的多核苷酸(例如在基因疗法或适于导入DNA的载体中)，可提 供本发明蛋白、抗体或多核苷酸的用途或活性。联合疗法
[0149]在一个实施方案中，包含至少一种IL-21/IL-21R拮抗剂，如 IL-21R/IL-21抗体的药物组合物和至少一种治疗剂，在联合疗法中施 用。所述疗法用于治疗病理状况或病症，例如免疫和/或炎性病症。术语 “联合”在本文中是指基本上同时(一起或序贯)给予拮抗剂组合物和治 疗剂。如果是序贯给药，在施用第二种化合物的开始时，两种化合物中 的第一种在治疗部位具有可检测的有效浓度。
[0150]例如，联合疗法可以包括至少一种IL-21/IL-21R拮抗剂，其 与至少一种其它治疗剂共同配制和/或共同施用。所述其它治疗剂可以包 括在下文中更详细描述的至少一种细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、 免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒性剂或细胞抑制 剂。所述联合疗法可有利地用于施用较低剂量治疗剂，从而避免可能的 毒性或各单一疗法相关的并发症。此外，本文所公开的治疗剂的作用途 径与IL-21/IL-21R途径不同，因而预期可增强IL-21/IL-21R拮抗剂的作 用和/或与IL-21/IL-21R拮抗剂产生协同作用。
[0151]与IL-21R/IL-21拮抗剂联用的治疗剂可以是那些干扰自身免 疫和随后炎症反应不同阶段的试剂。在一个实施方案中，本文所述的至 少一种IL-21R/IL-21拮抗剂可与至少一种细胞因子和/或生长因子拮抗 剂共同配制和/或共同施用。所述细胞因子和/或生长因子拮抗剂可以包 括可溶性受体、肽抑制剂、小分子、配体融合物、抗体(与细胞因子或 生长因子或其受体或其它细胞表面分子结合)和“抗炎细胞因子”及其 激动剂。
[0152]可与本文所述IL-21/IL-21R拮抗剂联用的试剂的非限制性实 例包括但不限于至少一种白介素(例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-18和IL-22)的拮抗剂；细胞因子(如TNFα、 LT、EMAP-II和GM-CSF)的拮抗剂或生长因子(如FGF和PDGF)的 拮抗剂。所述试剂也包括但不限于白介素、细胞因子和生长因子的至少 一种受体的拮抗剂。IL-21/IL-21R拮抗剂也可与例如针对诸如以下细胞 表面分子的抗体等的抑制剂联用：CD2、CD3、CD4、CD8、CD20(例 如CD20抑制剂立妥希玛)、CD25、CD28、CD30、CD40、 CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或它们的配体，包括 CD154(gp39或CD40L)或LFA-1/ICAM-1和VLA-4/VCAM-1(Yusuf- Makagiansar et al.(2002)Med.Res.Rev.22(2)：146-67)。可与本文所述的 IL-21/IL-21R拮抗剂联用的其它化合物可以包括IL-1、IL-6、IL-12、 TNFα、IL-15、IL-17、IL-18和IL-22的拮抗剂。
[0153]用于与IL-21R/IL-21拮抗剂进行联合疗法的试剂的实例包括 IL-12拮抗剂(例如结合IL-12的抗体(参见例如WO 00/56772)；IL-12 受体抑制剂(如IL-12受体的抗体)；和可溶性IL-12受体及其片段)。 IL-15拮抗剂的实例包括抗IL-15或其受体的抗体、IL-15受体的可溶性 片段和IL-15结合蛋白。IL-18拮抗剂的实例包括IL-18的抗体、IL-18 受体的可溶性片段和IL-18结合蛋白(IL-18BP，Mallat et al.(2001)Circ. Res.89：E41-45)。IL-1拮抗剂的实例包括白介素-1转化酶(ICE)抑制剂(如 Vx740)、IL-1拮抗剂(如IL-1RA(anakinra(KINERETTM)，Amgen))、 sIL-1RII(Immunex)和抗IL-1受体抗体。
[0154]TNF拮抗剂的实例包括针对TNF(例如人TNFα)的抗体，例 如D2E7(人抗TNFα抗体，美国专利No.6,258,562；HUMIRATM，Abbott Labs)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗体； Celltech/Pharmacia)、cA2(嵌合抗TNFα抗体，REMICADETM，Centocor)； 抗TNF抗体片段(例如CPD870)。其它实例包括可溶性TNF受体(例如  人p55或p75)片段和衍生物，例如p55kdTNFR-IgG(55kD TNF受体- IgG融合蛋白，LENERCEPTTM)和75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG 融合蛋白，ENBRELTM(etanercept-Immunex))。参见例如van der Poll et al. (1997)Blood.89：3727-34；Mori et al.(1996)J.Immunol.157：3178-82。其 它实例包括酶拮抗剂(例如TNFα转化酶抑制剂(TACE)，例如α-磺酰基 异羟肟酸衍生物(WO 01/55112)或N-羟基甲酰胺抑制剂(GW 3333、-005 或-022，GlaxoSmithKline)和TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白，参 见例如Lantz et al.(1991)J Clin Invest.88：2026-31；Kapadia et al.(1995) Amer.J.Physiol.Heart Circ.Phys.268：H517-25)。TNF拮抗剂可以是可溶 性TNF受体(例如人p55或p75)片段和衍生物，例如75kdTNFR-IgG 和TNFα转化酶(TACE)抑制剂。
[0155]其它实施方案中，本文所述的IL-21R/IL-21拮抗剂可与至少 一种以下药物联用：IL-13拮抗剂，例如可溶性IL-13受体和/或抗IL-13 抗体；IL-2拮抗剂，例如IL-2融合蛋白(如Seragen制备的DAB 486-IL-2 和/或DAB 389-IL-2，参见例如Sewell et al.(1993)Arthritis Rheum. 36：1223-33)和抗IL-2R抗体(例如抗Tac(人源化抗体；Protein Design Labs，参见Junghans et al.(1990)Cancer Res.50：1495-502)。另一种联合 疗法包括IL-21R/IL-21拮抗剂与非消除性抗CD4抑制剂如IDEC- CE9.1/SB 210396(抗CD4抗体，GlaxoSmithKline)的联用。其它的联合 包括IL-21R/IL-21拮抗剂与CD80(B7.1)和CD86(B7.2)共刺激途径拮抗 剂(如抗体、可溶性受体或拮抗性配体)；p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL) 和PSGL-1抑制剂(如PSGL和/或PSGL-1的抗体和小分子抑制剂)、T 细胞和B细胞消除剂(如抗CD4或抗CD22抗体)和抗炎细胞因子及其 激动剂(如抗体)。抗炎细胞因子可以包括IL-4(如Schering-Plough Biopharma)；IL-10(如SCH 52000；重组IL-10，Schering-Plough Biopharma)；IL-11；IL-13和TGFβ或其激动剂(例如，激动剂抗体)。
[0156]在其它实施方案中，至少一种IL-21R/IL-21拮抗剂可以与至 少一种抗炎药物、免疫抑制剂、代谢抑制剂和酶抑制剂共同配制和/或共 同施用。可以与本文所述IL-21R/IL-21拮抗剂联合施用的药物或抑制剂 的非限制性实例包括但不限于，下述的至少一种：非甾体类抗炎药 (NSAIDs)(包括但不限于阿司匹林、双水杨酯、二氟尼柳、布洛芬、 酮基布洛芬、萘丁美酮、吡罗昔康、萘普生、双氯芬酸、茚甲新、舒林 酸、托美汀、依托度酸、酮洛来克、奥沙普嗪、替尼达普、美洛昔康、 吡罗昔康、醋氯芬酸、托美汀、噻洛芬酸、尼美舒利等)；柳氮磺胺吡 啶；皮质类固醇(例如泼尼松龙)；细胞因子抑制性抗炎药(CSAIDs)； 核苷酸生物合成抑制剂(例如，嘌呤生物合成抑制剂(如叶酸拮抗剂， 例如，甲氨蝶呤))；和嘧啶生物合成抑制剂，例如，二氢乳清酸脱氢 酶(DHODH)抑制剂，例如，来氟米特(参见例如Kraan et al.(2004)Ann. Rheum.Dis.63：1056-61)。与IL-21/IL-21R拮抗剂联合施用的治疗剂可以 包括NSAIDs、CSAIDs、DHODH抑制剂(例如，来氟米特)和叶酸拮 抗剂(例如，甲氨蝶呤)中的一种或多种。
[0157]可以与IL-21/IL-21R拮抗剂联合使用的其它试剂的实例包括 下述的至少一种：皮质类固醇(口服的、吸入的和局部注射剂)；免疫 抑制剂(例如，环孢菌素和他克莫司(FK-506))；mTOR抑制剂(例 如，西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素类似物和/或衍生物，例如雷帕霉 素酯衍生物，例如，CCI-779(参见例如Elit(2002)Curr.Opin.Investig. Drugs 3：1249-53；Huang et al.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：295- 304)))；干扰促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的信号传递的试剂(例 如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制剂)；TPL-2、Mk-2和NFκb 抑制剂；COX2抑制剂(例如，塞来考昔，罗非考昔等及其变体)；磷 酸二酯酶抑制剂(例如环戊苯丙酮)；磷脂酶抑制剂(例如，胞质溶胶 磷脂酶2(cPLA2)的抑制剂，例如，三氟甲酮类似物(美国专利 6,350,892))；血管内皮细胞生长因子(VEGF)抑制剂；VEGF受体抑制 剂；血管发生抑制剂；RAGE和可溶性RAGE；雌激素受体β(ERB) 激动剂、ERB-NFκb拮抗剂；干扰素-β(例如IFN β-1a和IFN β-1b)； 考帕松；和皮质类固醇。
[0158]可与IL-21R/IL-21拮抗剂联合使用的其它有用治疗剂包括： 布地缩松；表皮生长因子；氨基水杨酸酯；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲 硝唑；脂加氧酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉秦；巴柳氮；抗氧化剂；血 栓烷抑制剂；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；葡 糖苷酸或葡萄糖缀合的泼尼松的前药；地塞米松或布地缩松；ICAM-反 义硫代磷酸酯寡脱氧核糖核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)； 可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；缓释美沙拉秦；血小板 激活因子(PAF)的拮抗剂；环丙沙星；利诺卡因；环孢菌素A；羟氯喹 (PLAQUENILTM)；米诺环素(MINOCINTM)和anakinra(KINERETTM)。
[0159]选择用于与本发明的IL-21/IL-21R拮抗剂联合施用的特定治 疗剂将很大程度取决于一些因素，如特定受试者、需要的靶和治疗的选 定长度。所述确定在本领域技术人员的技术和知识范围内。
[0160]可以与IL-21R/IL-21拮抗剂联合的治疗剂的其它实例包括以 下一种或多种：6-巯基嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤；柳氮磺胺吡啶；美沙拉 秦；奥沙拉秦；氯喹；羟氯喹；青霉胺；金硫丁盐 (aurothiornalate)(肌内和口服)；硫唑嘌呤；秋水仙碱；β-2肾上腺素受 体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)；黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)；色 甘酸盐；奈多罗米；酮替芬；异丙阿托铵和氧托铵；麦考酚酸吗乙酯； 腺苷激动剂；抗血栓剂；补体抑制剂；和肾上腺素能药剂。
[0161]在一种实施方案中，IL-21R/IL-21拮抗剂可以与针对参与调 节免疫反应的其它靶的一种或多种抗体联合使用。可以与本发明的IL- 21R/IL-21拮抗剂联合的、用于治疗或预防免疫反应的试剂的非限制性 实例包括以下这些：针对其它细胞表面分子的抗体，所述细胞表面分子 包括但不限于CD25(白介素-2受体-a)，CD11a(LFA-1)，CD54(ICAM-1)， CD4，CD45，CD28，CTLA4，ICOSL，ICOS，CD80(B7.1)和/或CD86 (B7.2)。在另一实施方案中，IL-21R/IL-21拮抗剂与一种或多种通用免疫 抑制剂，如环孢菌素A或FK506联合使用。在另一实施方案中，IL- 21/IL-21R拮抗剂与CTLA4激动剂如(例如CTLA4 Ig-abatacept )联合使用。
[0162]在本申请中引用的所有参考文献、专利、和公开的专利申请 的完整内容，都在本文引作参考。实施例
[0163]下面的实施例提供了本发明的解释性实施方案，但是不以任 意方式限制本发明。本领域普通技术人员可以认识到，在本发明的范围 内包括许多其它的实施方案。实施例1：材料和方法
实施例1.1：小鼠、寄生虫感染和抗原制备
[0164]从Taconic Farms(Germantown，NY)获得雌性或雄性 C57BL/6，C57BL/6/Ai-IL-10KO/IL-4KO小鼠(Hoffmann et al.(1999)J. Immunol.163：927-938)。C57BL/6背景上的IL-21R-/-小鼠杂交对，是获自 饲养在哈佛公共卫生学院(Boston，MA)的杂交群落(Kasaian et al.(2002) Immunity 16：559-69)。所有的小鼠都在国家卫生部的美国实验动物管理 批准设施鉴定协会的特定无抗原条件下饲养。NIAID动物管理和使用委 员会批准了所有实验程序。曼氏血吸虫卵是按照以前的描述(Wynn et al. (1995)Nature 376：594-96)从受感染的小鼠(Biomedical Research Institute， Rockville，MD)的肝提取。为了诱导同步的原发肺肉芽肿，静脉内(i.v.) 给予小鼠5,000个卵。为了诱导继发肉芽肿，用5000个活卵腹膜内(i.p.) 给小鼠致敏，然后用5,000个活卵静脉内攻击(Wynn et al.(1994)J.Exp. Med.179：551-61)。在感染实验中，用获自感染的Biomphalaria glabrata 蜗牛(Biomedical Research Institute，Rockville，MD)的曼氏血吸虫波多黎 各株(NMRI)的25-30个尾蚴通过尾部经皮感染小鼠。从曼氏血吸虫卵 纯化可溶性卵抗原(SEA)和可溶性蠕虫抗原制剂(SWAP)，并且匀 浆(Cheever et al.(1994)J.Immunol.153：753-59)。所有动物在处死时都进 行灌注，使得能够按照其它部分的描述(id.)确定蠕虫和组织卵负荷。按 照以前的描述(Katona et al.(1983)J.Immunol.130：350-56)制备巴西日圆 线虫(Nippostrongylus brasiliensis)幼虫(L3)。通过皮下注射500个L3 接种小鼠。接种后第7天，收集肺组织和纵隔淋巴结进行细胞因子分析。实施例1.2：组织病理学和纤维化
[0165]在Wright吉姆萨染色的组织切片上确定肺和肝肉芽肿的大 小(Histopath of America，Clinton，MD)。所有分析中包括了每只小鼠大约 30个肉芽肿。熟练的病理学家评价了相同切片中的嗜酸性粒细胞、肥大 细胞和其它类型的细胞的百分比。按照以前的描述确定通过羟脯氨酸水 平测量的肝和肠中的血吸虫卵数目和肝的胶原含量(Cheever et al.， supra)。具体地，110℃下在5ml 6N HCl中水解肝的200mg的部分18 小时后，通过Bergman和Loxley的技术(Bergman and Loxley(1963) Analytical Biochem.35：1961-65)将肝胶原测量为羟脯氨酸。肝的羟脯氨 酸的增加与所有实验中的卵数目正相关，肝胶原报道为每10,000个卵中 以微摩尔表示的高于正常肝胶原的增加；(感染的肝胶原-正常肝胶 原)/肝中卵的数目X 10-4或每对蠕虫的微摩尔数。在慢性时间点的晚 期，纤维化报道为每个肝的总肝胶原。同一个体对所有组织特征进行评 分，并且不知道实验设计。实施例1.3：FACS分析
[0166]收获整个肺，并且置于RPMI中。挤压通过70微米的尼龙 网(BD Falcon，San Diego，CA)而使组织破碎。洗涤单细胞悬浮液，通过 用ACK裂解溶液温育3分钟，裂解红细胞。4℃下用PE-Cy5标记的抗 CD4和Fc阻断抗体(两种抗体都来自BD Pharmingen，San Diego，CA) 一起在FACS缓冲液中将肺淋巴细胞标记15分钟。洗涤后，用FLOWJOTM 软件(Treestar，Inc.，Ashland，OR)在FACS Calibur上分析细胞。实施例1.4：用sIL-21R-Fc进行的IL-21阻断实验
[0167]用30-35个曼氏血吸虫尾蚴通过尾部经皮感染C57BL/6 (10/组)小鼠。从感染后第6周开始，用mIL-21R-Fc(Wyeth Research)或 抗-柔嫩艾美耳球虫(E.Tenella)鼠IgG2a对照抗体(Wyeth Research)处 理小鼠。每只小鼠接受200μg剂量，腹膜内注射3次/周，总共5周。 在感染后12周处死小鼠，通过羟脯氨酸测定，测量肝纤维化。实施例1.5：淋巴细胞培养和用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞 因子
[0168]无菌取出脾和肠系膜淋巴结(感染模型)或肺相关的淋巴结 (肺模型)，按照以前的描述制备单细胞悬浮液(Hesse et al.(2000)Am.J. Pathol.157：945-55)。培养物在湿化的5％CO2气氛下，37℃下温育。用 SEA(20μg/ml)、SWAP(50μg/ml)、伴刀豆球蛋白A(Con A；1μg/ml) 或单独的培养基刺激细胞。在72小时收获上清液，测定细胞因子的产 生。用成对抗体(BD Pharmingen，San Diego，CA)按照以前的描述(id.)， 通过夹心ELISA测量IFN-γ、IL-5和IL-10。用重组鼠细胞因子(BD Pharmingen，San Diego，CA)构建的标准曲线计算细胞因子水平。用鼠 IL-13ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)，根据制造商的方 案测量IL-13水平。用小鼠TGF-β1 DUOSETELISA显示系统(R&D Systems，Minneapolis，MN)，根据制造商的方案对TGF-β1水平进行定 量。为了避免来源于牛的TGF-β1污染，用PBS将细胞洗涤3次，在含 有0.5％小鼠血清的培养基中培养。实施例1.6：RNA分离和纯化以及实时聚合酶链反应
[0169]从肺和肝组织样品提取总RNA，分别置于1ml TRIZOLTM试 剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。用组织polytron(Omni International Inc.， Marietta，GA)将样品匀浆，根据制造商的推荐提取总RNA，用来自Qiagen 的RNEASYTM微试剂盒(Qiagen Sciences，Germantown，MD)进一步纯 化。用SUPERSCRIPT IITM(Invitrogen，Carlsbad，CA)和寡核苷酸(dT)的混 合物以及随机引物对各个样品RNA(1μg)进行逆转录。在ABI PRISMTM 7900序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行实时聚合 酶链反应(RT-PCR)。采用SYBRTM Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)，并且通过Applied Biosystems针对ABI PRISMTM 7700/7900序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA) 描述的比较性阈循环方法，确定一些基因的mRNA的相对量。在该方法 中，将每个样品的mRNA水平标准化为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移 酶mRNA水平，然后表示为与未感染的对照水平的相对增加或减少。用 PRIMER EXPRESSTM软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)设计引 物。以前发表过IL-13、IL-4、IL-10、HPRT(Hesse et al.(2001)J.Immunol. 167：6533-44)、IL-13R α2(Chiaramonte et al.(2003)J.Exp.Med. 197：687-701)、Ym1、FIZZ1和酸性几丁质酶(AMCase)(Sandler et al.， supra)的引物，包括：
[0170]IL-215’GCCAG ATCGC CTCCT GATTA 3’(sense)(SEQ ID NO：28)；
5’CATGC TCACA GTGCC CCTTT 3’(antisense)(SEQ ID NO：29)；
[0171]IL-21R5’CTCCC CCCTT GAACG TGACT 3’(sense)(SEQ ID NO：30)；
5’TTGCC CCTCA GCACG TAGTT 3’(antisense)(SEQ ID NO：31)；
[0172]IFN-γ5’AGAGC CAGAT TATCT CTTTC TACCT CAG 3’(sense)(SEQ ID NO：32)；
5’CCTTT TTCGC CTTGC TGTTG 3’(antisense)(SEQ ID NO：33)。
实施例1.7：血清抗体同种型分析和骨髓来源的巨噬细胞
[0173]用BD OPTEIATM小鼠IgE ELISA Set(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)，根据制造商的方案测量总IgE。通过间接 ELISA评估SEA特异性IgG1和IgG2b同种型特异性抗体(Ab)滴度。用 PBS稀释的10μg/ml SEA(100μl/孔)包被IMMULONTM 4板(Thermo Labsystems Inc.，Beverly MA)，用系列2倍稀释液分析血清样品。以1∶1000 的稀释度使用生物素-大鼠抗小鼠IgG1(Zymed，San Francisco，CA)。此 后使用过氧化物酶标记的链霉亲和素(KPL，Gaithersburg，MD)底物酶。以 1∶1000的稀释度使用第二步辣根过氧化物酶缀合的大鼠抗小鼠IgG2b (Zymed，San Francisco，CA)Ab。加入100μl单成分ABTS过氧化物酶 底物(KPL，Gaithersburg，MD)后，用VMAXTM动态微量滴定板读数器 (Molecular Devices)在405nm读出孔中的吸光度。
[0174]从雌性C57BL/6小鼠回收骨髓，在含有补充的DMEM培养 基(L929-调节的培养基)的培养皿(100×15mm)中培养6天。6天后， 收获细胞，以0.5×106个细胞/孔的浓度将细胞种植在含有补充的 DMEM培养基(10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，100U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)的24孔板中。用IL-4、IL-13和IL-21(R&D，Minneapolis， MN)刺激细胞20小时。在一些测定中，用IL-21预处理细胞。裂解细胞， 采用RNEASYTM试剂盒(Qiagen Sciences，Germantown，MD)，用RNA Cleanup程序纯化RNA。实施例1.8：精氨酸酶活性测定
[0175]以6×105个细胞/孔将骨髓来源的巨噬细胞铺板在96孔组 织培养板中，用IL-4、IL-13和IL-21的组合刺激。IL-21是在IL-4或IL-13 刺激前6小时加入的。刺激后，用PBS洗涤细胞，用含有蛋白酶抑制剂 (Roche，Nutley，NJ)的0.1％Triton X-100裂解。将裂解物转移到96孔PCR 板中，55℃下用10mM MnCl2和50mM Tris HCl(pH 7.5)温育10分钟， 以激活酶。酶激活后，取出25μl裂解物，加入到新PCR板中的25μl 1M 精氨酸(pH 9.7)中，37℃下温育20小时。将每种样品各5μl双份加入 96孔ELISA板中，还一起加入在相同测定条件下稀释的从100mg/dL 开始的5μl每种标准物。根据制造商的方案使用来自QUANTICHROMTM 尿素测定试剂盒(BioAssay Systems，Hayward，CA)的尿素测定试剂。实施例1.9：统计学
[0176]肝纤维化(针对卵数目调整)随着感染强度(蠕虫对)的增 加而减轻。因此，通过分析协方差比较这些变量，其中采用了作为协变 量的活卵总数的对数和每个卵的羟脯氨酸含量的对数。通过单向 ANOVA或斯氏t检验(Cheever et al.，supra)比较不随感染强度改变的变 量。用ANOVA评估细胞因子mRNA表达和肉芽肿大小的改变。当 p＜0.05*，p＜0.01**或p＜0.001***时，认为差异是显著的。实施例2：调节1型和2型极化反应期间的IL-21和IL-21R
[0177]为了研究体内IL-21受体的调节和功能，检验了一些不同的 TH2依赖性炎症的实验系统，包括肺和肝炎症的模型，以及线虫感染的 实验模型(Pearce et al.，supra；Wynn et al.(1994)，supra)。在每种情况下， 将野生型(WT)动物的免疫反应与IL-21R缺陷型小鼠(Hoffman et al.， supra；Kasaian et al.(2002)，supra)进行比较。
[0178]与IL-21(Wurster et al.(2002)，supra；Mehta et al.(2004) Immunol.Rev.202：84-95)相比，对IL-21受体的调节和功能知之甚少。为 了确定IL-21及其受体在体内的病理性TH2反应中是否受到调节，采用 了曼氏血吸虫肉芽肿形成的模型。在该模型中，已知TH2细胞因子在病 变形成中起显著作用(Pearce and MacDonald，supra)。最初的研究设计用 于确定IL-21和IL-21R mRNA表达是否与体内极化的TH2细胞因子反应 相关。通过采用暴露于曼氏血吸虫卵后产生高度加剧的TH1(IL-4-/-/IL- 10-/-)或TH2(IL-12-/-/IL-10-/-)细胞因子反应的小鼠实现了该目的。在IL- 4-/-/IL-10-/-“TH1”小鼠中，到攻击后4天，IFN-γmRNA表达在肺中比 基线增加了75倍，到第14天，保持比背景高大约50倍(图16A)。 在任何时间点都不能在这些小鼠中检测到IL-13mRNA，证实建立了高 度极化的TH1炎症反应。相反，IL-12-/-/IL-10-/-“TH2”小鼠显示在攻击后 所有时间点IL-13mRNA增加200-250倍，IFN-γ改变很少到没有改 变。与展示高度极化的表达模式的TH1/TH2细胞因子相反，IL-21与极 化的表型不相关(图16B)。在这两组中，在血吸虫卵攻击后，IL-21mRNA 水平比基线至少增加50倍，但在TH1-极化的小鼠中观察到的增加平均 比TH2极化的动物高3-4倍(图16B；下图)。IL-21R也不与TH1或 TH2免疫反应特异性相关。但是，与在倾向于TH1的动物中更显著的 IL-21相反，在TH2-极化的小鼠中观察到对I1-21R的最大反应(图16B； 上图)。实施例3：在对血吸虫卵的肺反应期间IL-21R缺陷型小鼠肺中的2 型细胞因子产生减少
[0179]考虑到用血吸虫卵攻击的小鼠中IL-21R表达显著升高(图 16)，随后的实验系列检验了IL-21R信号传递是否影响TH2反应的产 生。在这些实验中，用活的血吸虫卵静脉内注射未接触过抗原的WT和 IL-21R-/-小鼠，在随后的14天内监测肺、脾和引流淋巴结中TH2细胞因 子和TH2调节的基因的产生。在WT小鼠中，暴露于卵后IL-21R mRNA 表达迅速增加，到14天仍然保持升高(图17A)。IL-21显示相似的谱， 在第7天达到峰值表达，然后略微减少。值得注意的是，在IL-21R-/-小 鼠中，IL-21表达在第7和14天持续和高度显著增加，表明IL-21R对其 自身配体的表达具有正影响。与以前的观察结果(Wynn et al.(1993)J. Immunol.151：1430-40；Vella and Pearce(1992)J.Immunol.148：2283-88) 一致，TH2相关细胞因子IL-4和IL-13的表达在WT小鼠的肉芽肿组织 中逐渐增加，到第14天可以检测到5-15倍的增加。相反，IL-21R-/-组 织中IL-4和IL-13mRNA表达显著和明显减少。尽管在攻击后4-14天 在WT小鼠中检测到很少的IFN-γ和IL-10mRNA改变，IFN-γ和IL-10 的产生在IL-21R-/-动物中也略微减少。因此，在IL-21R-/-小鼠中观察到 的TH2反应的减少与TH1细胞因子产生的增加不相关。TH2细胞因子的 减少对肉芽肿组织也是特异性的，因为在用可溶性卵抗原(SEA)或促 分裂原体外刺激后，在淋巴结和脾细胞培养物中观察到了显著的TH2细 胞因子产生(图17B)。实际上，SEA持续刺激从IL-21R-/-小鼠制备的 淋巴结培养物中更强的IL-5、IL-10和IL-13反应。然而，与肺中TH2反 应的减少一致，在IL-21R-/-动物中观察到了更快的肉芽肿形成的消退(图 17C)。此外，一些与Stat6激活或“替代激活的巨噬细胞”()相 关的基因(Nair et al.(2005)Infect.Immun.73：385-94；Zhu et al.(2004) Science 304：1678-82；Chiaramonte et al.(2003)，supra；Gordon，S.(2003) Nat.Rev.Immunol.3：23-35)显著减少，为IL-21R-/-小鼠中TH2效应物反应 的总体减少提供了进一步的证据(图17D)。实施例4：巴西诺卡氏菌感染后IL-21R-/-小鼠中的TH2反应减少
[0180]为了确定TH2效应物反应的减少是否对于曼氏血吸虫肺肉 芽肿形成是特异性的，用肠线虫巴西诺卡氏菌感染WT和IL-21R-/-小 鼠。通过将第三阶段的幼虫(L3)接种到皮肤下，建立感染。随着寄生 虫成熟，它们从接种部位迁移，通过循环系统进入肺。一旦进入肺，寄 生虫引发剧烈和高度极化的TH2反应(Urban et al.(1993)J.Immunol. 151：7086-94)，通过分析一些TH2相关基因在肺(图18A)和肺相关淋 巴结(图18B)中的表达而证实该反应。巴西诺卡氏菌感染后，WT小 鼠的肺和淋巴结展示出IL-4、IL-13、AMCase、FIZZ1/RELM1α和Ym1 mRNA表达的显著增加(图18A和18B)。但是，与肺肉芽肿模型一致， 观察到了IL-21R-/-小鼠肺内IL-4、IL-13和AMCase的水平显著减少，以 及Ym1和FIZZ1mRNA水平轻微减少(图18A)。引流淋巴结显示出 相似的减少，但Ym1和FIZZ1的减少在淋巴结中更显著(图18B)。两 种组织之间仅有的其它主要区别是AMCase mRNA反应，其似乎局限于 肺。综合起来，这些数据证实了IL-21R在体内的TH2反应发生中的重 要作用。但是，显著的是，尽管发生了显著减弱的TH2反应，巴西诺卡 氏菌感染的IL-21R-/-小鼠在成虫排驱方面没有显示显著延迟(未示出)。实施例5：2型细胞因子驱动的炎症在IL-21R-/-小鼠的肺中减少
[0181]设计随后的实验系列，用于确定IL-21R是否调节继发TH2 反应的发生。为了进行这些实验，用曼氏血吸虫卵使WT和IL-21R-/-小 鼠致敏，2周后静脉内攻击。如预期的，致敏的小鼠发生了强肉芽肿反 应，其比初次攻击的动物(图17C)强4-5倍(图19C)。如在初次攻 击的模型中观察到的，暴露于卵后肺内IL-21和IL-21R mRNA显著增 加，但I1-21反应在第二次攻击过程中到达峰值要早得多。与IL-21相比， IL-21R仅轻度增加，但在两个时间点都保持显著升高，而IL-21mRNA 水平在第4天达到峰值后开始减少(图19A)。因此，证明配体在组织 中更紧密的调节。IL-21R-/-小鼠中的IL-21表达也显著减少，证明受体及 其配体之间存在强反馈机制。在TH2相关细胞因子中，IL-13是最强的 反应，显示在WT小鼠中比基线增加50-100倍。但是，它在IL-21R-/- 小鼠中减少到比背景高10-20倍，证明IL-21R是最大程度发生继发性 TH2反应所需要的。再次，IL-21R-/-小鼠中TH2细胞因子表达的减少不 伴随IFN-γ的显著增加。实际上，IFN-γmRNA表达在IL-21R-/-小鼠的 肺内减少。然而，敲除在淋巴结和肺中显示轻度但持续的IFN-γ产生增 加，表明总体上TH2细胞因子的更强抑制(图19B)。与初次卵攻击模 型一致，TH2和TH1细胞因子产生的减少在肉芽肿组织中更显著(图 19A)，但SEA诱导的TH2反应在脾中也部分减少(图19B)。继发性 肉芽肿炎症的显著减少与肺中较弱的TH2反应的发生一致(图19C)。 此外，FIZZ1、Ym1和AMCase表达显著减少(图19D)，进一步证实 了IL-21R-/-小鼠中继发性TH2效应物反应的显著受损。实施例6：IgG抗体、肉芽肿形成和2型细胞因子在感染的IL-21R 缺陷小鼠中显著减少
[0182]随后，为了确定IL-21信号传递是否是维持慢性TH2占优势 的反应所必须的，使动物经皮暴露于曼氏血吸虫尾蚴，分析它们在感染 后的急性和慢性时间点的病理反应和免疫反应。如在肺肉芽肿研究中观 察到的，受感染的WT小鼠的肝中IL-21R和IL-21mRNA表达显著上 调。相反，IL-21mRNA甚至在慢性感染后在IL-21R-/-小鼠中也是几乎检 测不到的(图20A)。在感染后的急性阶段，IL-21R-/-小鼠也表现出TH2 细胞因子mRNA表达的显著减少(图20A)。但是，所述改变仍然局限 于肉芽肿组织，因为这两组的淋巴结和脾细胞反应在寄生虫抗原体外刺 激后是相似的(图20B)。在体外测定中注意到的唯一一致的差异是脾 细胞培养物中IL-5和I1-10产生减少2-3倍。IL-21R-/-小鼠在感染后的 急性期也发生了显著更小的肉芽肿(图20C)，这与肝中IL-4和IL-13 mRNA反应的减少一致(图20A)。但是，这不伴随肉芽肿中嗜酸性细 胞百分比的任何明显改变(图20C)。病变的更详细显微镜分析证明肉 芽肿的总体组成没有可检测的改变(图21A)。也进行了实验，确定IL-21R 缺陷是否特异性影响CD4+T细胞募集到肉芽肿组织。为了解决该问题， 使用肺肉芽肿模型，以使炎症细胞的募集同步。但是，与肝肉芽肿的显 微镜评估(图21A)一致，肺中CD4+T细胞的百分比在暴露于卵之前 和之后在WT和IL-21R-/-小鼠中是相似的(图21B)。因此，CD4+T细 胞募集或扩增的改变不太可能解释在组织中观察到的Th1/Th2细胞因子 反应减少。相反，它们似乎由于总体炎症反应的更普遍减少而导致。重 要的是，到感染后12周，这两组都有效下调了它们的肉芽肿反应(Pearce and MacDonald，supra)。因此，在慢性时间点，肉芽肿大小没有显著差 异(图20C)。在慢性感染的敲除小鼠中观察到了TH2细胞因子反应的 最小损害(图20A)。在急性期观察到的FIZZ1和Ym1的显著减少在 慢性感染的IL-21R-/-动物中也减少(图20D)。但是，在第12周，AMCase 的表达仍保持显著低水平，表明慢性感染的IL-21R-/-小鼠中至少一个亚 组的TH2驱动的反应持续减少。
[0183]也检验了IL-21R-/-小鼠血清抗体水平的改变(图22)。与它 们受抑制的细胞因子反应一致(图20A)，IL-21R-/-小鼠表现出寄生虫 特异性IgG1(TH2-相关抗体)和IgG2b(TH1-相关抗体)滴度的显著减少，这 种减少在慢性时间点保持(图22B)。但是，令人感兴趣的是，这不伴 随IgE的任何显著改变(图22C)，表明选择性受损仅仅是血清抗体同 种型的一个亚型。已经表明外源性IL-21抑制IgE产生(Suto et al.(2002) Blood 100：4565-73)，这可以解释IgE在慢性感染的IL-21R-/-小鼠中IgE 的轻微升高。重要的是，IL-21R-/-小鼠中2型反应的总体减少不是归因 于寄生虫负荷的差异，因为在所有时间点，在这两个组的组织中发现了 相似数目的卵和成对的成虫(图22A)。实施例7：IL-21R缺陷减慢肝纤维化的进展
[0184]由于认为TH2细胞因子在组织纤维生成中起主要作用(Wynn (2004)，supra)，随后检查了曼氏血吸虫感染的IL-21R-/-小鼠中肝纤维化 的发生和进展。在感染后的多个时间点测定肝羟脯氨酸水平，作为组织 胶原含量的直接测量值。如所预期的，在受感染的WT小鼠中观察到了 显著的肝纤维化(图22D)。相反，IL-21R-/-展示出在急性和慢性时间 点的显著更少的纤维化。显著的是，到感染后第29周，IL-21R-/-小鼠显 示出与WT小鼠相比，总的肝胶原含量减少了50％以上(图22E)，由 此证实了IL-21R在TH2-依赖性纤维化进展中的重要和必不可少的作 用。
[0185]进行了实验，以检验IL-21抑制剂是否可以减慢受感染的 WT小鼠中的纤维化的进展。为了进行这些实验，从感染后第6周(大 约此时首先在肝中检测到卵)开始，用sIL-21R-Fc或对照蛋白处理各组 C57BL/6小鼠总共5周。尽管两组具有相似的蠕虫和组织卵负荷(数据 未示出)，接受IL-21阻断剂的小鼠显示在实验结束时肝纤维化减少 50％以上(图22F)。IL-4和IL-13mRNA表达在肝中也减少，肉芽肿 大小减少大约15％(数据未示出)。因此，这些数据支持用IL-21R-/- 小鼠进行的实验。实施例8：IL-21信号传递促进替代激活的巨噬细胞发育
[0186]由于Arg-1、FIZZ1和TGF-β1与纤维化的发生相关，并且 一些TH2/Stat6调节的基因的表达在IL-21R-/-小鼠的病变组织中减少(图 17-20)(也参见Gordon，supra；Nair et al.，supra)，进行了实验，以确 定Arg-1、FIZZ 1和TGF-β1在用IL-21刺激后是否在巨噬细胞中受到直 接调节。Arg-1和FIZZ 1也是替代激活的巨噬细胞()的公知标志物 (Gordon，supra)。为了进行这些研究，制备骨髓来源的巨噬细胞培养物 ()，然后用IL-4、IL-13和IL-21的各种组合刺激。如预期的，IL- 4和IL-13都增加Arg-1和FIZZ1mRNA表达，当组合使用两种刺激时， 观察到叠加作用(图23A)。但是，显著的是，尽管单独使用IL-21对 任何一种基因都没有作用，但用IL-21预处理的培养物在随后用IL-4和 IL-13刺激时展示出高度显著的Arg-1和FIZZ1mRNA表达增加(图 23A)。相同组合也显著增加了细胞中的精氨酸酶功能(图23B)。相 反，IL-21对培养物上清液中的总TGF-β1或活性TGF-β1水平没有影 响(图24)。出乎意料地，单独的IL-21处理显著增加了IL-4R α和IL-13R α1的表达(图23C)。相反，当单独使用时，IL-4和IL-13没有影响(图 23C)，并且当这些刺激组合使用时，没有额外的效果(未示出)。
[0187]由于IL-13R α2也可以影响IL-13依赖性信号传递 (Chiaramonte et al.(2003)，supra；Mentink-Kane et al.Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.101：586-90；Wood et al.(2003)J.Exp.Med.197：703-09)，进行了实 验，检验IL-21是否调节IL-13R α2的产生。不出意料，由于IL-13Rα2 主要由非造血细胞，如成纤维细胞和平滑肌细胞产生(Chiaramonte et al. (2003)，supra；Jakubzick et al.(2003)Am.J.Pathol.162：1475-86；Zheng et al.(2003)J.Allergy Clin.Immunol.111：720-28；Morimoto et al.(2006)J. Immunol.176：342-48)，没有证据表明培养物中的诱饵受体调节 (数据未示出)。但是，当检验到体内诱饵受体的调节时，IL-21下调 用卵静脉内攻击的小鼠的肺中的IL-13Rα2mRNA表达，并且显著减少 它们的血清中的可溶性IL-13Rα2水平(图23D)。当一起观察时，这 些数据表明I1-21通过上调巨噬细胞中的2型IL-4受体(信号传递受 体)，并且通过同时减少血清中的可溶性IL-13Rα2(诱饵受体)水平， 导致替代激活的巨噬细胞的发育。这两种机理都可能导致IL-4/IL-13刺 激的巨噬细胞中Arg-1和FIZZ 1的激活增加。因此，它们提供蠕虫感染 的IL-21R-/-小鼠中的TH2反应受损和TH2-依赖性纤维化的额外机理性解 释。实施例9：讨论
[0188]最近将IL-21表征为能够抑制未接触过抗原的TH细胞分化 未产生IFN-γ的TH1细胞的TH2细胞因子(Wurster et al.(2002)，supra)。 由于血吸虫中的免疫反应从早期IFN-γ进化为持续和显著的TH2反应 (Pearce and MacDonald，supra)，检验了IL-21R信号传递对蠕虫诱导的 TH2反应的发生的影响。用曼氏血吸虫感染WT小鼠，增加了肝中的IL-21 和IL-21R表达，证实I1-21信号传递与蠕虫诱导的2型免疫的联系。但 是，在肺中，血吸虫卵在TH1和TH2极化的反应中都诱导显著IL-21表 达。实际上，当小鼠极化为TH1反应时，IL-21表达增加最多。这些数 据表明IL-21相对于其它TH2-相关细胞因子表现出较受限的表达模式。 IL-21的受体也不能展示TH1/TH2-特异性模式。但是，与TH1极化的小 鼠相比，在TH2极化的小鼠肺中几乎诱导了多4倍的IL-21受体，这提 供了一种最初提示，表明IL-21R信号传递可能参与TH2-介导的炎症的 调节。
[0189]为了确定2型效应物反应在缺乏IL-21R的条件下是否受 损，检验了在TH2极化条件下优先诱导的一些基因的表达。这些基因包 括AMCase、Ym1和FIZZ1，认为所有这些都在TH2介导的炎症的调节 中起重要和非冗余的作用(Zhu et al.，supra；Chiaramonte et al.(2003)， supra；Nair et al.，supra；Mentink-Kane et al.，supra；Guo et al.(2000)J. Biol.Chem.275：8032-37)。尽管在原发、继发或慢性免疫反应过程中观 察到了一些变异，在每种情况下，IL-21R-/-小鼠展示这些TH2-相关基因 的高度显著减少。Ym1和AMCase是与低等生物的几丁质酶具有同源性 的蛋白家族成员(Nair et al.，supra)。尽管它们在宿主免疫反应中的确切 功能还不确定，但认为它们在嗜酸性细胞趋化、组织重塑和纤维化中起 重要作用。实际上，最近的研究表明，AMCase中和作用可以改善过敏 原驱动的炎症和气道高反应性，由此证实哺乳动物几丁质酶参与TH2免 疫(Zhu et al，supra)。FIZZ1也与组织纤维生成相关(Mentink-Kane et al.， supra；Liu et al.(2004)J.Immunol.173：3425-31)。因此，IL-21R的主要功 能可能是调节伤口愈合和纤维化的机理。因此，除了参与蠕虫诱导的免 疫反应，IL-21R可以参与多种TH2-介导的炎性病症的调节。
[0190]在血吸虫病中，IL-21R缺陷对疾病的进展具有显著作用。尽 管感染强度在WT和IL-21R-/-小鼠中相同，但在IL-21R不存在的条件 下，卵诱导的炎症反应显著减少。也存在肺中继发肉芽肿形成的显著减 少和原发肉芽肿的更快消退。综合起来，这些数据说明IL-21R在肉芽肿 性炎症中的必不可少的作用。以前的研究表明IL-4和I1-13对病变形成 是关键的(Pearce and MacDonald；supra)，因此认为IL-21R直接或间接影 响这些细胞因子的活性。这些研究提示IL-21不是单独作用，因为在 IL-4/IL-10双敲除小鼠中观察到了极高水平的IL-21，而肉芽肿形成在这 些TH2缺陷动物中几乎完全消除(Hoffmann et al.(2000)J.Immunol. 164：6406-16；Sandler et al.(2003)J.Immunol.171：3655-67)。因此，IL-21 似乎与IL-4和IL-13一起作用，诱导最大反应。本文公开的数据表明 IL-21R-/-小鼠中肉芽肿的细胞组成没有可检测的改变，并且CD4+T细胞 募集没有特异性受损。综合起来，这些发现提示IL-21R通过调节TH2 效应物反应的总体强度，调节寄生虫诱导的病理学的发展。
[0191]认为IL-21不直接调节IL-4诱导的TH2细胞分化(Suto et al.， supra；Wurster et al.(2002)，supra)。相反，最近的文章推测IL-21可能通 过下调产生IFN-γ的TH1细胞的扩增，放大TH2驱动的反应(Wurster et al. (2002)，supra)。因此，理论上认为缺乏IL-21受体的条件下血吸虫感染 的小鼠中IFN-γ反应可能增加。尽管体外观察到了肺相关淋巴结的小量 增加，IFN-γ产生在肉芽肿组织中持续减少。因此，这些研究没有表明 内源性IL-21R在抑制蠕虫感染过程中的IFN-γ产生中起显著作用。但 是，IL-21R-/-小鼠同时在组织中产生较弱的TH1和TH2细胞因子反应。 感染后在所有时间点IgG2b(TH1-相关的)和IgG1(TH2-相关的)抗体滴度 都显著减少，支持了该结论。Th2细胞因子在巴西诺卡氏菌感染后在肺 和淋巴结中都在mRNA水平上减少。实际上，所有直接的离体数据都证 明受影响组织中TH2细胞因子表达和功能的显著减少。然而，在抗原重 新刺激后分离的淋巴细胞没有TH2细胞因子产生的持续减少，提示IL- 21R-/-小鼠能够产生显著TH2反应，至少在体外产生。因此，本文公开的 数据提示IL-21R选择性增强组织中的TH2应答。除了促进TH2应答， IL-21R也增加IL-21产生。因此，IL-21R似乎以自分泌形式起作用，以 驱动体内TH2细胞因子表达和2型效应物功能。
[0192]为了进一步阐释涉及的机理，进行了实验，确定IL-21是否 直接调节巨噬细胞功能，因为体内数据表明与“替代激活的”表型相关 的一些基因显著减少(Gordon，supra；Mantovani et al.(2005)Immunity 23：344-46)。表现替代激活的表型的巨噬细胞和成纤维细胞是血吸虫肉 芽肿的主要细胞组成成分，功能研究提示它们关键参与疾病进展(Hesse et al.(2001)，supra)。实际上，Brombacher等人的一项重要研究显示完全 缺乏替代激活的巨噬细胞的小鼠在曼氏血吸虫感染后发生致死性卵诱 导的病理(Herbert et al.(2004)Immunity 20：623-35)。此外，由于巨噬细胞 来源的TGF-β1参与IL-13介导的纤维化的机理(Lee et al.(2001)J.Exp. Med.194：809-21；Fichtner-Feigl et al.(2006)Nat.Med.12：99-106)，进行了 实验，确定IL-21是否调节巨噬细胞中的TGF-β1产生。为了研究这些 问题，在用IL-21、IL-4和IL-13的多种组合刺激后，测量骨髓来源的巨 噬细胞中的Arg-1和FIZZ1mRNA、精氨酸酶活性和TGF-β1蛋白反应。 Arg-1和FIZZ1是IL-4R α/Stat6-依赖性基因(Liu et al.，supra；Hesse et al. (2001)，supra；Munder et al.(1998)J.Immunol.160：5347-54)；因此，它们 起替代的巨噬细胞激活的功能性标志物的作用。重要的是，这些发现提 示当巨噬细胞暴露于IL-21时，它们变得对IL-4和IL-13的Arg-1和FIZZ1 诱导活性更敏感。通过尿素的产生评估的精氨酸酶活性也显著增加，证 明IL-21是高度功能性替代激活的巨噬细胞发育的重要刺激物。相反， IL-21对巨噬细胞的TGF-β1产生没有作用。因此，似乎并不涉及促纤 维化的细胞因子TGF-β1，这与以前调查TGF-β1在血吸虫病中的作用 的研究一致(Kaviratne et al.(2004)J.Immunol.173：4020-29)。相反，IL- 21显著增加中的IL-4Rα和IL-13R α1表达，并且减少可溶性 IL-13诱饵受体的体内产生，这可能解释它们对IL-4和IL-13的提高的敏 感性。因此，这些数据符合IL-21R-/-小鼠，并且提示IL-21R信号传递的 一个重要功能是增强的发育，这与纤维化的机理相关(Hesse et al. (2001)，supra；Hesse et al.(2000)，supra)。此外，由于已经表明放 大CD4+TH2细胞分化(Bonecchi et al.(1998)Blood 92：2668-71)，这些数 据也可以解释IL-21R-/-小鼠中蠕虫诱导的TH2活性的总体减少。
[0193]在人类血吸虫病中，纤维化肝病理的发生是慢性发病率和致 死率的主要原因(Pearce and MacDonald，supra；Wynn et al.(2004) Immunol.Rev.201：156-67)。由于已知TH2细胞因子应答在胶原沉积中起 重要作用(Wynn et al.(2004)，supra)，最终的实验系列检验了IL-21R对 肝纤维化进展的影响。显著的是，纤维化的发生在IL-21R-/-小鼠中显著 减少，敲除动物到感染后第29周时显示肝纤维化减少50％以上。重要 的是，当用sIL-21R-Fc处理受感染的WT小鼠时也产生了相似的发现。 因此，IL-21受体也揭示为抗纤维化治疗的潜在的新靶。综上所述，这 些研究说明IL-21R在TH2细胞因子介导的疾病进展中的关键作用。因 此，IL-21R应该归为调节2型免疫和巨噬细胞极化的重要受体之一。实施例10：预示性治疗
[0194]以下是非限制性的一组预示性治疗实施例。
[0195]给诊断患有肝硬化的受试者施用IL-21R融合蛋白，以减少 肝中纤维化组织的积累。IL-21R融合蛋白包括在C末端通过接头(对应 于SEQ ID NO：17的氨基酸236-243)与人免疫球蛋白G1(IgG1)Fc-突变 序列(对应于SEQ ID NO：17的氨基酸244-467)融合的SEQ ID NO：2的 氨基酸1-235。
[0196]给诊断感染血吸虫的受试者施用可溶性IL-21R片段，以减 少纤维化组织的积累。该片段含有SEQ ID NO：2的氨基酸20-538。
[0197]手术后，给受试者施用IL-21R抗体，以减少伤口愈合过程 中由于手术切口导致的纤维化积累。
[0198]给诊断患有肝硬化的受试者施用IL-21抗体，以减少肝中纤 维化组织的积累。相关申请
[0001]本申请要求2005年4月14日提交的美国临时专利申请No. 60/671,374的优先权，该申请在此全文引入作为参考。

发明背景

序列表
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<222>(236)..(1849)
<400>1
gtcgactgga ggcccagctg cccgtcatca gagtgacagg tcttatgaca gcctgattgg    60
tgactcgggc tgggtgtgga ttctcacccc aggcctctgc ctgctttctc agaccctcat    120
ctgtcacccc cacgctgaac ccagctgcca cccccagaag cccatcagac tgcccccagc    180
acacggaatg gatttctgag aaagaagccg aaacagaagg cccgtgggag tcagc atg     238
                                                             Met
                                                             1
ccg cgt ggc tgg gcc gcc ccc ttg ctc ctg ctg ctg ctc cag gga ggc      286
Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly Gly
            5                   10                  15
tgg ggc tgc ccc gac ctc gtc tgc tac acc gat tac ctc cag acg gtc      334
Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Val
        20                  25                  30
atc tgc atc ctg gaa atg tgg aac ctc cac ccc agc acg ctc acc ctt      382
Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu
    35                  40                  45
acc tgg caa gac cag tat gaa gag ctg aag gac gag gcc acc tcc tgc      430
Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys
50                  55                  60                  65
agc ctc cac agg tcg gcc cac aat gcc acg cat gcc acc tac acc tgc      478
Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys
                70                  75                  80
cac atg gat gta ttc cac ttc atg gcc gac gac att ttc agt gtc aac      526
His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val Asn
            85                  90                  95
atc aca gac cag tct ggc aac tac tcc cag gag tgt ggc agc ttt ctc    574
Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Leu
        100                 105                 110
ctg gct gag agc atc aag ccg gct ccc cct ttc aac gtg act gtg acc    622
Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val Thr
    115                 120                 125
ttc tca gga cag tat aat atc tcc tgg cgc tca gat tac gaa gac cct    670
Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Pro
130                 135                 140                 145
gcc ttc tac atg ctg aag ggc aag ctt cag tat gag ctg cag tac agg    718
Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg
                150                 155                 160
aac cgg gga gac ccc tgg gct gtg agt ccg agg aga aag ctg atc tca    766
Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile Ser
            165                 170                 175
gtg gac tca aga agt gtc tcc ctc ctc ccc ctg gag ttc cgc aaa gac    814
Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp
        180                 185                 190
tcg agc tat gag ctg cag gtg cgg gca ggg ccc atg cct ggc tcc tcc    862
Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser Ser
    195                 200                 205
tac cag ggg acc tgg agt gaa tgg agt gac ccg gtc atc ttt cag acc    910
Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr
210                 215                 220                 225
cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac cct cac ctg ctg ctt ctc    958
Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu Leu
                230                 235                 240
ctc ctg ctt gtc ata gtc ttc att cct gcc ttc tgg agc ctg aag acc    1006
Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys Thr
            245                 250                 255
cat cca ttg tgg agg cta tgg aag aag ata tgg gcc gtc ccc agc cct    1054
His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser Pro
        260                 265                 270
gag cgg ttc ttc atg ccc ctg tac aag ggc tgc agc gga gac ttc aag    1102
Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe Lys
    275                 280                 285
aaa tgg gtg ggt gca ccc ttc act ggc tcc agc ctg gag ctg gga ccc    1150
Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly Pro
290                 295                 300                 305
tgg agc cca gag gtg ccc tcc acc ctg gag gtg tac agc tgc cac cca    1198
Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His Pro
                310                 315                 320
cca cgg agc ccg gcc aag agg ctg cag ctc acg gag cta caa gaa cca    1246
Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu Pro
            325                 330                 335
gca gag ctg gtg gag tct gac ggt gtg ccc aag ccc agc ttc tgg ccg    1294
Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp Pro
        340                 345                 350
aca gcc cag aac tcg ggg ggc tca gct tac agt gag gag agg gat cgg    1342
Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg
    355                 360                 365
cca tac ggc ctg gtg tcc att gac aca gtg act gtg cta gat gca gag    1390
Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala Glu
370                 375                 380                 385
ggg cca tgc acc tgg cec tgc agc tgt gag gat gac ggc tac cca gcc    1438
Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala
                390                 395                 400
ctg gac ctg gat gct ggc ctg gag ccc agc cca ggc cta gag gac cca    1486
Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp Pro
            405                 410                 415
ctc ttg gat gca ggg acc aca gtc ctg tcc tgt ggc tgt gtc tca gct    1534
Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Ala
        420                 425                 430
ggc agc cct ggg cta gga ggg ccc ctg gga agc ctc ctg gac aga cta    1582
Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu
    435                 440                 445
aag cca ccc ctt gca gat ggg gag gac tgg gct ggg gga ctg ccc tgg    1630
Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro Trp
450                 455                 460                 465
ggt ggc cgg tca cct gga ggg gtc tca gag agt gag gcg ggc tca ccc    1678
Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro
                470                 475                 480
ctg gcc ggc ctg gat atg gac acg ttt gac agt ggc ttt gtg ggc tct    1726
Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly Ser
            485                 490                 495
gac tgc agc agc cct gtg gag tgt gac ttc acc agc ccc ggg gac gaa    1774
Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp Glu
        500                 505                 510
gga ccc ccc cgg agc tac ctc cgc cag tgg gtg gtc att cct ccg cca    1822
Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro Pro
    515                 520                 525
ctt tcg agc cct gga ccc cag gcc agc taatgaggct gactggatgt          1869
Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser
530                 535
ccagagctgg ccaggccact gggccctgag ccagagacaa ggtcacctgg gctgtgatgt  1929
gaagacacct gcagcctttg gtctcctgga tgggcctttg agcctgatgt ttacagtgtc  1989
tgtgtgtgtg tgtgcatatg tgtgtgtgtg catatgcatg tgtgtgtgtg tgtgtgtctt    2049
aggtgcgcag tggcatgtcc acgtgtgtgt gtgattgcac gtgcctgtgg gcctgggata    2109
atgcccatgg tactccatgc attcacctgc cctgtgcatg tctggactca cggagctcac    2169
ccatgtgcac aagtgtgcac agtaaacgtg tttgtggtca acagatgaca acagccgtcc    2229
tccctcctag ggtcttgtgt tgcaagttgg tccacagcat ctccggggct ttgtgggatc    2289
agggcattgc ctgtgactga ggcggagccc agccctccag cgtctgcctc caggagctgc    2349
aagaagtcca tattgttcct tatcacctgc caacaggaag cgaaagggga tggagtgagc    2409
ccatggtgac ctcgggaatg gcaatttttt gggcggcccc tggacgaagg tctgaatccc    2469
gactctgata ccttctggct gtgctacctg agccaagtcg cctcccctct ctgggctaga    2529
gtttccttat ccagacagtg gggaaggcat gacacacctg ggggaaattg gcgatgtcac    2589
ccgtgtacgg tacgcagccc agagcagacc ctcaataaac gtcagcttcc ttcaaaaaaa    2649
aaaaaaaaaa tctaga                                                    2665
<210>2
<211>538
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr
            20                  25                  30
Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr
        35                  40                  45
Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser
    50                  55                  60
Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val
                85                  90                  95
Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp
    130                 135                 140
Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys
            180                 185                 190
Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser
        195                 200                 205
Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe Ile Pro Ala Phe Trp Ser Leu Lys
                245                 250                 255
Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Val Pro Ser
            260                 265                 270
Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser Gly Asp Phe
        275                 280                 285
Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu Glu Leu Gly
    290                 295                 300
Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr Ser Cys His
305                 310                 315                 320
Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu Leu Gln Glu
                325                 330                 335
Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro Ser Phe Trp
            340                 345                 350
Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp
        355                 360                 365
Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Leu Asp Ala
    370                 375                 380
Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro
385                 390                 395                 400
Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly Leu Glu Asp
                405                 410                 415
Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser
            420                 425                 430
Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Asp Arg
        435                 440                 445
Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly Gly Leu Pro
    450                 455                 460
Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser
465                 470                 475                 480
Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Val Gly
                485                 490                 495
Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser Pro Gly Asp
            500                 505                 510
Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val Ile Pro Pro
        515                 520                 525
Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser
    530                 535
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>趋化因子受体保守基序
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400>3
Trp Ser Xaa Trp Ser
1               5
<210>4
<211>2628
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(407)..(1993)
<400>4
gtcgacgcgg cggtaccagc tgtctgccca cttctcctgt ggtgtgcctc acggtcactt  60
gcttgtctga ccgcaagtct gcccatccct ggggcagcca actggcctca gcccgtgccc  120
caggcgtgcc ctgtctctgt ctggctgccc cagccctact gtcttcctct gtgtaggctc  180
tgcccagatg cccggctggt cctcagcctc aggactatct cagcagtgac tcccctgatt  240
ctggacttgc acctgactga actcctgccc acctcaaacc ttcacctccc accaccacca  300
ctccgagtcc cgctgtgact cccacgccca ggagaccacc caagtgcccc agcctaaaga  360
atggctttct gagaaagacc ctgaaggagt aggtctggga cacagc atg ccc cgg     415
                                                   Met Pro Arg
                                                   1
ggc cca gtg gct gcc tta ctc ctg ctg att ctc cat gga gct tgg agc    463
Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu lle Leu His Gly Ala Trp Ser
     5                      10              15
tgc ctg gac ctc act tgc tac act gac tac ctc tgg acc atc acc tgt    511
Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr Ile Thr Cys
20                  25                  30                  35
gtc ctg gag aca cgg agc ccc aac ccc agc ata ctc agt ctc acc tgg    559
Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser Leu Thr Trp
                40                  45                  50
caa gat gaa tat gag gaa ctt cag gac caa gag acc ttc tgc agc cta    607
Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe Cys Ser Leu
            55                  60                  65
cac agg tct ggc cac aac acc aca cat ata tgg tac acg tgc cat atg    655
His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr Cys His Met
        70                  75                  80
cgc ttg tct caa ttc ctg tcc gat gaa gtt ttc att gtc aat gtg acg    703
Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val Asn Val Thr
    85                  90                  95
gac cag tct ggc aac aac tcc caa gag tgt ggc agc ttt gtc ctg gct    751
Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Val Leu Ala
100                 105                 110                 115
gag agc atc aaa cca gct ccc ccc ttg aac gtg act gtg gcc ttc tca    799
Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val Ala Phe Ser
                120                 125                 130
gga cgc tat gat atc tcc tgg gac tca gct tat gac gaa ccc tcc aac    847
Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn
            135                 140                 145
tac gtg ctg agg ggc aag cta caa tat gag ctg cag tat cgg aac ctc    895
Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Leu
        150                 155                 160
aga gac ccc tat gct gtg agg ccg gtg acc aag ctg atc tca gtg gac    943
Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile Ser Val Asp
    165                 170                 175
tca aga aac gtc tct ctt ctc cct gaa gag ttc cac aaa gat tct agc    991
Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys Asp Ser Ser
180                 185                 190                 195
tac cag ctg cag gtg cgg gca gcg cct cag cca ggc act tca ttc agg    1039
Tyr Gln Leu Gln Val Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr Ser Phe Arg
                200                 205                 210
ggg acc tgg agt gag tgg agt gac ccc gtc atc ttt cag acc cag gct    1087
Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ala
            215                 220                 225
ggg gag ccc gag gca ggc tgg gac cct cac atg ctg ctg ctc ctg gct    1135
Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu Leu Leu Ala
        230                 235                 240
gtc ttg atc att gtc ctg gtt ttc atg ggt ctg aag atc cac ctg cct    1183
Val Leu Ile Ile Val Leu Val Phe Met Gly Leu Lys Ile His Leu Pro
    245                 250                 255
tgg agg cta tgg aaa aag ata tgg gca cca gtg ccc acc cct gag agt    1231
Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Pro Val Pro Thr Pro Glu Ser
260                 265                 270                 275
ttc ttc cag ccc ctg tac agg gag cac agc ggg aac ttc aag aaa tgg    1279
Phe Phe Gln Pro Leu Tyr Arg Glu His Ser Gly Asn Phe Lys Lys Trp
                280                 285                 290
gtt aat acc cct ttc acg gcc tcc agc ata gag ttg gtg cca cag agt    1327
Val Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val Pro Gln Ser
            295                 300                 305
tcc aca aca aca tca gcc tta cat ctg tca ttg tat cca gcc aag gag    1375
Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro Ala Lys Glu
        310                 315                 320
aag aag ttc ccg ggg ctg ccg ggt ctg gaa gag caa ctg gag tgt gat    1423
Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu Glu Cys Asp
    325                 330                 335
gga atg tct gag cct ggt cac tgg tgc ata atc ccc ttg gca gct ggc    1471
Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu Ala Ala Gly
340                 345                 350                 355
caa gcg gtc tca gcc tac agt gag gag aga gac cgg cca tat ggt ctg    1519
Gln Ala Val Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro Tyr Gly Leu
                360                 365                 370
gtg tcc att gac aca gtg act gtg gga gat gca gag ggc ctg tgt gtc    1567
Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly Leu Cys Val
            375                 380                 385
tgg ccc tgt agc tgt gag gat gat ggc tat cca gcc atg aac ctg gat    1615
Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met Asn Leu Asp
        390                 395                 400
gct ggc cga gag tct ggc cct aat tca gag gat ctg ctc ttg gtc aca    1663
Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu Leu Val Thr
    405                 410                 415
gac cct gct ttt ctg tct tgc ggc tgt gtc tca ggt agt ggt ctc agg    1711
Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser Gly Leu Arg
420                 425                 430                 435
ctt gga ggc tcc cca ggc agc cta ctg gac agg ttg agg ctg tca ttt    1759
Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg Leu Ser Phe
                440                 445                 450
gca aag gaa ggg gac tgg aca gca gac cca acc tgg aga act ggg tcc    1807
Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg Thr Gly Ser
            455                 460                 465
cca gga ggg ggc tct gag agt gaa gca ggt tcc ccc cct ggt ctg gac    1855
Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro Gly Leu Asp
        470                 475                 480
atg gac aca ttt gac agt ggc ttt gca ggt tca gac tgt ggc agc ccc    1903
Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys Gly Ser Pro
    485                 490                 495
gtg gag act gat gaa gga ccc cct cga agc tat ctc cgc cag tgg gtg    1951
Val Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val
500                 505                 510                 515
gtc agg acc cct cca cct gtg gac agt gga gcc cag agc agc    1993
Val Arg Thr Pro Pro Pro Val Asp Ser Gly Ala Gln Ser Ser
                520                 525 
tagcatataa taaccagcta tagtgagaag aggcctctga gcctggcatt tacagtgtga    2053
acatgtaggg gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt    2113
gtgtgtgtgt cttgggttgt gtgttagcac atccatgttg ggatttggtc tgttgctatg    2173
tattgtaatg ctaaattctc tacccaaagt tctaggccta cgagtgaatt ctcatgttta    2233
caaacttgct gtgtaaacct tgttccttaa tttaatacca ttggttaaat aaaattggct    2293
gcaaccaatt actggaggga ttagaggtag ggggcttttg agttacctgt ttggagatgg    2353
agaaggagag aggagagacc aagaggagaa ggaggaagga gaggagagga gaggagagga    2413
gaggagagga gaggagagga gaggagagga gaggagaggc tgccgtgagg ggagagggac    2473
catgagcctg tggccaggag aaacagcaag tatctggggt acactggtga ggaggtggcc    2533
aggccagcag ttagaagagt agattagggg tgacctccag tatttgtcaa agccaattaa    2593
aataacaaaa aaaaaaaaaa agcggccgct  ctaga                              2628
<210>5
<211>529
<212>PRT
<213>小鼠
<400>5
Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu His Gly
1               5                   10                  15
Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr
            20                  25                  30
Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe
    50                  55                  60
Cys Ser Leu His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Cys His Met Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val
                85                  90                  95
Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu
    130                 135                 140
Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Val Asp Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys
            180                 185                 190
Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln Val Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr
        195                 200                 205
Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Pro His Met Leu Leu
225                 230                 235                 240
Leu Leu Ala Val Leu Ile Ile Val Leu Val Phe Met Gly Leu Lys Ile
                245                 250                 255
His Leu Pro Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala Pro Val Pro Thr
            260                 265                 270
Pro Glu Ser Phe Phe Gln Pro Leu Tyr Arg Glu His Ser Gly Asn Phe
        275                 280                 285
Lys Lys Trp Val Asn Thr Pro Phe Thr Ala Ser Ser Ile Glu Leu Val
    290                 295                 300
Pro Gln Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Leu His Leu Ser Leu Tyr Pro
305                 310                 315                 320
Ala Lys Glu Lys Lys Phe Pro Gly Leu Pro Gly Leu Glu Glu Gln Leu
                325                 330                 335
Glu Cys Asp Gly Met Ser Glu Pro Gly His Trp Cys Ile Ile Pro Leu
            340                 345                 350
Ala Ala Gly Gln Ala Val Ser Ala Tyr Ser Glu Glu Arg Asp Arg Pro
        355                 360                 365
Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val Gly Asp Ala Glu Gly
    370                 375                 380
Leu Cys Val Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp Gly Tyr Pro Ala Met
385                 390                 395                 400
Asn Leu Asp Ala Gly Arg Glu Ser Gly Pro Asn Ser Glu Asp Leu Leu
                405                 410                 415
Leu Val Thr Asp Pro Ala Phe Leu Ser Cys Gly Cys Val Ser Gly Ser
            420                 425                 430
Gly Leu Arg Leu Gly Gly Ser Pro Gly Ser Leu Leu Asp Arg Leu Arg
        435                 440                 445
Leu Ser Phe Ala Lys Glu Gly Asp Trp Thr Ala Asp Pro Thr Trp Arg
    450                 455                 460
Thr Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Glu Ser Glu Ala Gly Ser Pro Pro
465                 470                 475                 480
Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly Phe Ala Gly Ser Asp Cys
                485                 490                 495
Gly Ser Pro Val Glu Thr Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg
            500                 505                 510
Gln Trp Val Val Arg Thr Pro Pro Pro Val Asp Ser Gly Ala Gln Ser
        515                 520                 525
Ser
<210>6
<211>224
<212>PRT
<213>未知
<220>
<223>免疫球蛋白Fc片段
<400>6
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser
1               5                   10                  15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
            20                  25                  30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
        35                  40                  45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
    50                  55                  60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65                  70                  75                  80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
                85                  90                  95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr
            100                 105                 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
        115                 120                 125
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
    130                 135                 140
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
145                 150                 155                 160
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
                165                 170                 175
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
            180                 185                 190
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
        195                 200                 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
    210                 215                 220
<210>7
<211>617
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(47)..(532)
<400>7
gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtactt atg aga tcc     55
                                                   Met Arg Ser
                                                   1
agt cct ggc aac atg gag agg att gtc atc tgt ctg atg gtc atc ttc    103
Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met Val Ile Phe
    5                   10                  15
ttg ggg aca ctg gtc cac aaa tca agc tcc caa ggt caa gat cgc cac    151
Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His
20                  25                  30                  35
atg att aga atg cgt caa ctt ata gat att gtt gat cag ctg aaa aat    199
Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn
                40                  45                  50
tat gtg aat gac ttg gtc cct gaa ttt ctg cca gct cca gaa gat gta    247
Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val
            55                  60                  65
gag aca aac tgt gag tgg tca gct ttt tcc tgc ttt cag aag gcc caa    295
Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln
        70                  75                  80
cta aag tca gca aat aca gga aac aat gaa agg ata atc aat gta tca    343
Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser
    85                  90                  95
att aaa aag ctg aag agg aaa cca cct tcc aca aat gca ggg aga aga    391
Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg
100                 105                 110                 115
cag aaa cac aga cta aca tgc cct tca tgt gat tct tat gag aaa aaa    439
Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys
                120                 125                 130
cca ccc aaa gaa ttc cta gaa aga ttc aaa tca ctt ctc caa aag atg    487
Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met
            135                 140                 145
att cat cag cat ctg tcc tct aga aca cac gga agt gaa gat tcc        532
Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
        150                 155                 160
tgaggatcta acttgcagtt ggacactatg ttacatactc taatatagta gtgaaagtca  592
tttctttgta ttccaagtgg aggag                                        617
<210>8
<211>162
<212>PRT
<213>人
<400>8
Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met
1               5                   10                  15
Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln
            20                  25                  30
Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln
        35                  40                  45
Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro
    50                  55                  60
Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln
65                  70                  75                  80
Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile
                85                  90                  95
Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala
            100                 105                 110
Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr
        115                 120                 125
Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu
    130                 135                 140
Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu
145                 150                 155                 160
Asp Ser
<210>9
<211>16
<212>PRT
<213>Apis mellifera
<400>9
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Ser Pro Leu His Pro
1               5                   10                  15
<210>10
<211>786
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(780)
<400>10
atg aaa ttc tta gtc aac gtt gcc ctt gtt ttt atg gtc gtg tac att    48
Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile
1               5                   10                  15
tct tac atc tat gcc ggc agc gga cac cac cat cat cac cac ggt agc    96
Ser Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gly His His His His His His Gly Ser
            20                  25                  30
ggc gac tat aaa gac gat gac gat aag ggt tcc gga tgc ccc gac ctc    144
Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly Cys Pro Asp Leu
        35                  40                  45
gtc tgc tac acc gat tac ctc cag acg gtc atc tgc atc ctg gaa atg    192
Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met
    50                  55                  60
tgg aac ctc cac ccc agc acg ctc acc ctt acc tgg caa gac cag tat    240
Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr
65                  70                  75                  80
gaa gag ctg aag gac gag gcc acc tcc tgc agc ctc cac agg tcg gcc    288
Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala
                85                  90                  95
cac aat gcc acg cat gcc acc tac acc tgc cac atg gat gta ttc cac    336
His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys His Met Asp Val Phe His
            100                 105                 110
ttc atg gcc gac gac att ttc agt gtc aac atc aca gac cag tct ggc    384
Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly
        115                 120                 125
aac tac tcc cag gag tgt ggc agc ttt ctc ctg gct gag agc atc aag    432
Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys
    130                 135                 140
ccg gct ccc cct ttc aac gtg act gtg acc ttc tca gga cag tat aat    480
Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn
145                 150                 155                 160
atc tcc tgg cgc tca gat tac gaa gac cct gcc ttc tac atg ctg aag    528
Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys
                165                 170                 175
ggc aag ctt cag tat gag ctg cag tac agg aac cgg gga gac ccc tgg    576
Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp
            180                 185                 190
gct gtg agt ccg agg aga aag ctg atc tca gtg gac tca aga agt gtc    624
Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser Arg Ser Val
        195                 200                 205
tcc ctc ctc ccc ctg gag ttc cgc aaa gac tcg agc tat gag ctg cag    672
Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln
    210                 215                 220
gtg cgg gca ggg ccc atg cct ggc tcc tcc tac cag ggg acc tgg agt    720
Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser
225                 230                 235                 240
gaa tgg agt gac ccg gtc atc ttt cag acc cag tca gag gag tta aag    768
Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys
                245                 250                 255
gaa ggc tgg aac taatga                                             786
Glu Gly Trp Asn
            260
<210>11
<211>260
<212>PRT
<213>人
<400>11
Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile
1               5                   10                  15
Ser Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gly His His His His His His Gly Ser
            20                  25                  30
Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly Cys Pro Asp Leu
        35                  40                  45
Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met
    50                  55                  60
Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr
65                  70                  75                  80
Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala
                85                  90                  95
His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr Cys His Met Asp Val Phe His
            100                 105                 110
Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly
        115                 120                 125
Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys
    130                 135                 140
Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn
145                 150                 155                 160
Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys
                165                 170                 175
Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp
            180                 185                 190
Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser Arg Ser Val
        195                 200                 205
Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln
    210                 215                 220
Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser
225                 230                 235                 240
Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys
                245                 250                 255
Glu Gly Trp Asn
            260
<210>12
<211>1472
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(15)..(1415)
<400>12
gcggccgcac cacc atg ccg cgt ggc tgg gcc gcc ccc ttg ctc ctg ctg    50
                Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu
                1               5                   10
ctg ctc cag gga ggc tgg ggc tgc ccc gac ctc gtc tgc tac acc gat    98
Leu Leu Gln Gly Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp
        15                  20                  25
tac ctc cag acg gtc atc tgc atc ctg gaa atg tgg aac ctc cac ccc    146
Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro
    30                  35                  40
agc acg ctc acc ctt acc tgg caa gac cag tat gaa gag ctg aag gac    194
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp
45                  50                  55                  60
gag gcc acc tcc tgc agc ctc cac agg tcg gcc cac aat gcc acg cat    242
Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His
                65                  70                  75
gcc acc tac acc tgc cac atg gat gta ttc cac ttc atg gcc gac gac    290
Ala Thr Tyr Thr Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp
            80                  85                  90
att ttc agt gtc aac atc aca gac cag tct ggc aac tac tcc cag gag    338
Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu
        95                  100                 105
tgt ggc agc ttt ctc ctg gct gag agc atc aag ccg gct ccc cct ttc    386
Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe
    110                 115                 120
aac gtg act gtg acc ttc tca gga cag tat aat atc tcc tgg cgc tca    434
Asn Val Thr Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser
125                 130                 135                 140
gat tac gaa gac cct gcc ttc tac atg ctg aag ggc aag ctt cag tat    482
Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr
                145                 150                 155
gag ctg cag tac agg aac cgg gga gac ccc tgg gct gtg agt ccg agg    530
Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg
            160                 165                 170
aga aag ctg atc tca gtg gac tca aga agt gtc tcc ctc ctc ccc ctg    578
Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu
        175                 180                 185
gag ttc cgc aaa gac tcg agc tat gag ctg cag gtg cgg gca ggg ccc    626
Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro
    190                 195                 200
atg cct ggc tcc tcc tac cag ggg acc tgg agt gaa tgg agt gac ccg    674
Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro
205                 210                 215                 220
gtc atc ttt cag acc cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac ggc    722
Val Ile Phe Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Gly
                225                 230                 235
tcc ggc tct aga gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct    770
Ser Gly Ser Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            240                 245                 250
gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag    818
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        255                 260                 265
gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg    866
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    270                 275                 280
gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac    914
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
285                 290                 295                 300
ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac    962
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
                305                 310                 315
aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac    1010
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            320                 325                 330
tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc    1058
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
        335                 340                 345
cca gtc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga    1106
Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    350                 355                 360
gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag    1154
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
365                 370                 375                 380
aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac    1202
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                385                 390                 395
atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag    1250
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            400                 405                 410
acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc    1298
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        415                 420                 425
aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca    1346
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
    430                 435                 440
tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc    1394
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
445                 450                 455                 460
ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa tgagtgaatt cacacgcaga agagcctctc       1445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                 465
cctgtccccg ggtaaatgag tgaattc    1472
<210>13
<211>467
<212>PRT
<213>人
<400>13
Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr
            20                  25                  30
Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr
        35                  40                  45
Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser
    50                  55                  60
Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val
                85                  90                  95
Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp
    130                 135                 140
Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys
            180                 185                 190
Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser
        195                 200                 205
Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Gly Ser Gly Ser Arg
225                 230                 235                 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
                245                 250                 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
            260                 265                 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
        275                 280                 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
    290                 295                 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile
            340                 345                 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
        355                 360                 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
    370                 375                 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385                 390                 395                 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
                405                 410                 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
            420                 425                 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
        435                 440                 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Pro Gly Lys
465
<210>14
<211>1499
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(15)..(1493)
<400>14
gcggccgcac cacc atg ccg cgt ggc tgg gcc gcc ccc ttg ctc ctg ctg    50
                Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu
                1               5                   10
ctg ctc cag gga ggc tgg ggc tgc ccc gac ctc gtc tgc tac acc gat    98
Leu Leu Gln Gly Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp
        15                  20                  25
tac ctc cag acg gtc atc tgc atc ctg gaa atg tgg aac ctc cac ccc    146
Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro
    30                  35                  40
agc acg ctc acc ctt acc tgg caa gac cag tat gaa gag ctg aag gac    194
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp
45                  50                  55                  60
gag gcc acc tcc tgc agc ctc cac agg tcg gcc cac aat gcc acg cat    242
Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His
                65                  70                  75
gcc acc tac acc tgc cac atg gat gta ttc cac ttc atg gcc gac gac    290
Ala Thr Tyr Thr Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp
            80                  85                  90
att ttc agt gtc aac atc aca gac cag tct ggc aac tac tcc cag gag    338
Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu
        95                  100                 105
tgt ggc agc ttt ctc ctg gct gag agc atc aag ccg gct ccc cct ttc    386
Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe
    110                 115                 120
aac gtg act gtg acc ttc tca gga cag tat aat atc tcc tgg cgc tca    434
Asn Val Thr Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser
125                 130                 135                 140
gat tac gaa gac cct gcc ttc tac atg ctg aag ggc aag ctt cag tat    482
Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr
                145                 150                 155
gag ctg cag tac agg aac cgg gga gac ccc tgg gct gtg agt ccg agg    530
Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg
            160                 165                 170
aga aag ctg atc tca gtg gac tca aga agt gtc tcc ctc ctc ccc ctg    578
Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu
        175                 180                 185
gag ttc cgc aaa gac tcg agc tat gag ctg cag gtg cgg gca ggg ccc    626
Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro
    190                 195                 200
atg cct ggc tcc tcc tac cag ggg acc tgg agt gaa tgg agt gac ccg    674
Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro
205                 210                 215                 220
gtc atc ttt cag acc cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac ggc    722
Val Ile Phe Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Gly
                225                 230                 235
tcc ggc tct aga gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct    770
Ser Gly Ser Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            240                 245                 250
gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag    818
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        255                 260                 265
gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg    866
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    270                 275                 280
gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac    914
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
285                 290                 295                 300
ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac    962
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
                305                 310                 315
aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac    1010
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            320                 325                 330
tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc    1058
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
        335                 340                 345
cca gtc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga    1106
Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    350                 355                 360
gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag    1154
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
365                 370                 375                 380
aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat  ccc agc gac    1202
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                385                 390                 395
atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag    1250
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            400                 405                 410
acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc    1298
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        415                 420                 425
aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca    1346
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
    430                 435                 440
tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc    1394
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
445                 450                 455                 460
ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa tca gga atg gca tca atg aca gga ggt    1442
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly
                465                 470                 475
caa caa atg ggt tct gga tct cat cat cat cat cat cat tct gga ggt    1490
Gln Gln Met Gly Ser Gly Ser His His His His His His Ser Gly Gly
            480                 485                 490
tga gaattc                                                         1499
<210>15
<211>492
<212>PRT
<213>人
<400>15
Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr
            20                  25                  30
Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr
        35                  40                  45
Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser
    50                  55                  60
Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val
                85                  90                  95
Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp
    130                 135                 140
Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys
            180                 185                 190
Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser
        195                 200                 205
Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Gly Ser Gly Ser Arg
225                 230                 235                 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
                245                 250                 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
            260                 265                 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
        275                 280                 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
    290                 295                 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile
            340                 345                 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
        355                 360                 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
    370                 375                 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385                 390                 395                 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
                405                 410                 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
            420                 425                 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
        435                 440                 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Pro Gly Lys Ser Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly
465                 470                 475                 480
Ser Gly Ser His His His His His His Ser Gly Gly
                485                 490
<210>16
<211>1426
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(15)..(1415)
<400>16
gcggccgcac cacc atg ccg cgt ggc tgg gcc gcc ccc ttg ctc ctg ctg    50
                Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu
                1               5                   10
ctg ctc cag gga ggc tgg ggc tgc ccc gac ctc gtc tgc tac acc gat    98
Leu Leu Gln Gly Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp
        15                  20                  25
tac ctc cag acg gtc atc tgc atc ctg gaa atg tgg aac ctc cac ccc    146
Tyr Leu Gln Thr Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro
    30                  35                  40
agc acg ctc acc ctt acc tgg caa gac cag tat gaa gag ctg aag gac    194
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp
45                  50                  55                  60
gag gcc acc tcc tgc agc ctc cac agg tcg gcc cac aat gcc acg cat    242
Glu Ala Thr Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His
                65                  70                  75
gcc acc tac acc tgc cac atg gat gta ttc cac ttc atg gcc gac gac    290
Ala Thr Tyr Thr Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp
            80                  85                  90
att ttc agt gtc aac atc aca gac cag tct ggc aac tac tcc cag gag    338
Ile Phe Ser Val Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu
        95                  100                 105
tgt ggc agc ttt ctc ctg gct gag agc atc aag ccg gct ccc cct ttc    386
Cys Gly Ser Phe Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe
    110                 115                 120
aac gtg act gtg acc ttc tca gga cag tat aat atc tcc tgg cgc tca    434
Asn Val Thr Val Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser
125                 130                 135                 140
gat tac gaa gac cct gcc ttc tac atg ctg aag ggc aag ctt cag tat    482
Asp Tyr Glu Asp Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr
                145                 150                 155
gag ctg cag tac agg aac cgg gga gac ccc tgg gct gtg agt ccg agg    530
Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg
            160                 165                 170
aga aag ctg atc tca gtg gac tca aga agt gtc tcc ctc ctc ccc ctg    578
Arg Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu
        175                 180                 185
gag ttc cgc aaa gac tcg agc tat gag ctg cag gtg cgg gca ggg ccc    626
Glu Phe Arg Lys Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro
    190                 195                 200
atg cct ggc tcc tcc tac cag ggg acc tgg agt gaa tgg agt gac ccg    674
Met Pro Gly Ser Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro
205                 210                 215                 220
gtc atc ttt cag acc cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac ggc    722
Val Ile Phe Gln Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Gly
                225                 230                 235
tcc ggc tct aga gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct    770
Ser Gly Ser Arg Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            240                 245                 250
gaa gcc ctg ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag    818
Glu Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
        255                 260                 265
gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg    866
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
    270                 275                 280
gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac    914
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
285                 290                 295                 300
ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac    962
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
                305                 310                 315
aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac    1010
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
            320                 325                 330
tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc    1058
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
        335                 340                 345
cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga    1106
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
    350                 355                 360
gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag    1154
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
365                 370                 375                 380
aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac    1202
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
                385                 390                 395
atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag    1250
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
            400                 405                 410
acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc    1298
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
        415                 420                 425
aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca    1346
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
    430                 435                 440
tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc    1394
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
445                 450                 455                 460
ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa tgagtgaatt c                           1426
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                465
<210>17
<211>467
<212>PRT
<213>人
<400>17
Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr
            20                  25                  30
Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr
        35                  40                  45
Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser
    50                  55                  60
Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val
                85                  90                  95
Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp
    130                 135                 140
Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys
            180                 185                 190
Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser
        195                 200                 205
Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Gly Ser Gly Ser Arg
225                 230                 235                 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly
                245                 250                 255
Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
            260                 265                 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
        275                 280                 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
    290                 295                 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
            340                 345                 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
        355                 360                 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
    370                 375                 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385                 390                 395                 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
                405                 410                 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
            420                 425                 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
        435                 440                 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Pro Gly Lys
465
<210>18
<211>741
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(735)
<400>18
atg ccg cgt ggc tgg gcc gcc ccc ttg ctc ctg ctg ctg ctc cag gga    48
Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
ggc tgg ggc tgc ccc gac ctc gtc tgc tac acc gat tac ctc cag acg    96
Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr
            20                  25                  30
gtc atc tgc atc ctg gaa atg tgg aac ctc cac ccc agc acg ctc acc    144
Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr
        35                  40                  45
ctt acc tgg caa gac cag tat gaa gag ctg aag gac gag gcc acc tcc    192
Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser
    50                  55                  60
tgc agc ctc cac agg tcg gcc cac aat gcc acg cat gcc acc tac acc    240
Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr
65                  70                  75                  80
tgc cac atg gat gta ttc cac ttc atg gcc gac gac att ttc agt gtc    288
Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val
                85                  90                  95
aac atc aca gac cag tct ggc aac tac tcc cag gag tgt ggc agc ttt    336
Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
ctc ctg gct gag agc atc aag ccg gct ccc cct ttc aac gtg act gtg    384
Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
acc ttc tca gga cag tat aat atc tcc tgg cgc tca gat tac gaa gac    432
Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp
    130                 135                 140
cct gcc ttc tac atg ctg aag ggc aag ctt cag tat gag ctg cag tac    480
Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
agg aac cgg gga gac ccc tgg gct gtg agt ccg agg aga aag ctg atc    528
Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile
                165                 170                 175
tca gtg gac tca aga agt gtc tcc ctc ctc ccc ctg gag ttc cgc aaa    576
Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys
            180                 185                 190
gac tcg agc tat gag ctg cag gtg cgg gca ggg ccc atg cct ggc tcc    624
Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser
        195                 200                 205
tcc tac cag ggg acc tgg agt gaa tgg agt gac ccg gtc atc ttt cag    672
Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
acc cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac aaa acc gaa acc tcc    720
Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Lys Thr Glu Thr Ser
225                 230                 235                 240
cag gtt gct ccg gca taatga                                         741
Gln Val Ala Pro Ala
                245
<210>19
<211>245
<212>PRT
<213>人
<400>19
Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr
            20                  25                  30
Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr
        35                  40                  45
Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser
    50                  55                  60
Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val
                85                  90                  95
Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp
    130                 135                 140
Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys
            180                 185                 190
Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser
        195                 200                 205
Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Lys Thr Glu Thr Ser
225                 230                 235                 240
Gln Val Ala Pro Ala
                245
<210>20
<211>1413
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1410)
<400>20
atg ccg cgt ggc tgg gcc gcc ccc ttg ctc ctg ctg ctg ctc cag gga    48
Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
ggc tgg ggc tgc ccc gac ctc gtc tgc tac acc gat tac ctc cag acg    96
Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr
            20                  25                  30
gtc atc tgc atc ctg gaa atg tgg aac ctc cac ccc agc acg ctc acc    144
Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr
        35                  40                  45
ctt acc tgg caa gac cag tat gaa gag ctg aag gac gag gcc acc tcc    192
Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser
    50                  55                  60
tgc agc ctc cac agg tcg gcc cac aat gcc acg cat gcc acc tac acc    240
Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr
65                  70                  75                  80
tgc cac atg gat gta ttc cac ttc atg gcc gac gac att ttc agt gtc    288
Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val
                85                  90                  95
aac atc aca gac cag tct ggc aac tac tcc cag gag tgt ggc agc ttt    336
Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
ctc ctg gct gag agc atc aag ccg gct ccc cct ttc aac gtg act gtg    384
Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
acc ttc tca gga cag tat aat atc tcc tgg cgc tca gat tac gaa gac    432
Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp
    130                 135                 140
cct gcc ttc tac atg ctg aag ggc aag ctt cag tat gag ctg cag tac    480
Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
agg aac cgg gga gac ccc tgg gct gtg agt ccg agg aga aag ctg atc    528
Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile
                165                 170                 175
tca gtg gac tca aga agt gtc tcc ctc ctc ccc ctg gag ttc cgc aaa    576
Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys
            180                 185                 190
gac tcg agc tat gag ctg cag gtg cgg gca ggg ccc atg cct ggc tcc    624
Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser
        195                 200                 205
tcc tac cag ggg acc tgg agt gaa tgg agt gac ccg gtc atc ttt cag    672
Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
acc cag tca gag gag tta aag gaa ggc tgg aac gat gac gat gac aag    720
Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Asp Asp Asp Asp Lys
225                 230                 235                 240
ggc tcc ggc gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa    768
Gly Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
                245                 250                 255
gcc ctg ggg gca ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac    816
Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
            260                 265                 270
acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac    864
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        275                 280                 285
gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc    912
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    290                 295                 300
gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac    960
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305                 310                 315                 320
agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg    1008
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                325                 330                 335
ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca    1056
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
            340                 345                 350
gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa    1104
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        355                 360                 365
cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac    1152
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
    370                 375                 380
cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc    1200
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc    1248
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                405                 410                 415
acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag    1296
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            420                 425                 430
ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc    1344
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        435                 440                 445
tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc    1392
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    450                 455                 460
tcc ctg tcc ccg ggt aaa tga                                        1413
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>21
<211>470
<212>PRT
<213>人
<400>21
Met Pro Arg Gly Trp Ala Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln Gly
1               5                   10                  15
Gly Trp Gly Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gln Thr
            20                  25                  30
Val Ile Cys Ile Leu Glu Met Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu Thr
        35                  40                  45
Leu Thr Trp Gln Asp Gln Tyr Glu Glu Leu Lys Asp Glu Ala Thr Ser
    50                  55                  60
Cys Ser Leu His Arg Ser Ala His Asn Ala Thr His Ala Thr Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Cys His Met Asp Val Phe His Phe Met Ala Asp Asp Ile Phe Ser Val
                85                  90                  95
Asn Ile Thr Asp Gln Ser Gly Asn Tyr Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
Leu Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Phe Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
Thr Phe Ser Gly Gln Tyr Asn Ile Ser Trp Arg Ser Asp Tyr Glu Asp
    130                 135                 140
Pro Ala Phe Tyr Met Leu Lys Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Asn Arg Gly Asp Pro Trp Ala Val Ser Pro Arg Arg Lys Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Val Asp Ser Arg Ser Val Ser Leu Leu Pro Leu Glu Phe Arg Lys
            180                 185                 190
Asp Ser Ser Tyr Glu Leu Gln Val Arg Ala Gly Pro Met Pro Gly Ser
        195                 200                 205
Ser Tyr Gln Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
Thr Gln Ser Glu Glu Leu Lys Glu Gly Trp Asn Asp Asp Asp Asp Lys
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
                245                 250                 255
Ala Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
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Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
        275                 280                 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
    290                 295                 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305                 310                 315                 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
                325                 330                 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
            340                 345                 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
        355                 360                 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
    370                 375                 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
                405                 410                 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
            420                 425                 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
        435                 440                 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
    450                 455                 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>22
<211>1754
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(720)
<400>22
atg ccc cgg ggc cca gtg gct gcc tta ctc ctg ctg att ctc cat gga    48
Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu His Gly
1               5                   10                  15
gct tgg agc tgc ctg gac ctc act tgc tac act gac tac ctc tgg acc    96
Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr
            20                  25                  30
atc acc tgt gtc ctg gag aca cgg agc ccc aac ccc agc ata ctc agt    144
Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser
        35                  40                  45
ctc acc tgg caa gat gaa tat gag gaa ctt cag gac caa gag acc ttc    192
Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe
    50                  55                  60
tgc agc cta cac agg tct ggc cac aac acc aca cat ata tgg tac acg    240
Cys Ser Leu His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr
65                  70                  75                  80
tgc cat atg cgc ttg tct caa ttc ctg tcc gat gaa gtt ttc att gtc    288
Cys His Met Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val
                85                  90                  95
aat gtg acg gac cag tct ggc aac aac tcc caa gag tgt ggc agc ttt    336
Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
gtc ctg gct gag agc atc aaa cca gct ccc ccc ttg aac gtg act gtg      384
Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
gcc ttc tca gga cgc tat gat atc tcc tgg gac tca gct tat gac gaa      432
Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu
    130                 135                 140
ccc tcc aac tac gtg ctg agg ggc aag cta caa tat gag ctg cag tat      480
Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
cgg aac ctc aga gac ccc tat gct gtg agg ccg gtg acc aag ctg atc      528
Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile
                165                 170                 175
tca gtg gac tca aga aac gtc tct ctt ctc cct gaa gag ttc cac aaa      576
Ser Val Asp Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys
            180                 185                 190
gat tct agc tac cag ctg cag gtg cgg gca gcg cct cag cca ggc act      624
Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln Val Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr
        195                 200                 205
tca ttc agg ggg acc tgg agt gag tgg agt gac ccc gtc atc ttt cag      672
Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
acc cag gct ggg gag ccc gag gca ggc tgg gac ggc tcc ggc tct aga      720
Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Gly Ser Gly Ser Arg
225                 230                 235                 240
gagccccgcg gaccgacaat caagccctgt cctccatgca aatgcccagg taagtcacta    780
gaccagagct ccactcccgg gagaatggta agtgctataa acatccctgc actagaggat    840
aagccatgta cagatccatt tccatctctc ctcatcagca cctaacctcg agggtggacc    900
atccgtcttc atcttccctc caaagatcaa ggatgtactc atgatctccc tgagccccat    960
agtcacatgt gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca gatgtccaga tcagctggtt    1020
tgtgaacaac gtggaagtac acacagctca gacacaaacc catagagagg attacaacag    1080
tactctccgg gtggtcagtg ccctccccat ccagcaccag gactggatga gtggcaaggc    1140
tttcgcatgc gccgtcaaca acaaagacct cccagcgccc atcgagagaa ccatctcaaa    1200
acccaaaggt gagagctgca gcctgactgc atgggggctg ggatgggcat aaggataaag    1260
gtctgtgtgg acagccttct gcttcagcca tgacctttgt gtatgtttct accctcacag    1320
ggtcagtaag agctccacag gtatatgtct tgcctccacc agaagaagag atgactaaga    1380
aacaggtcac tctgacctgc atggtcacag acttcatgcc tgaagacatt tacgtggagt    1440
ggaccaacaa cgggaaaaca gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc ctggactctg    1500
atggttctta cttcatgtac agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg gtggaaagaa    1560
atagctactc ctgttcagtg gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg actaagagct    1620
tctcccggac tccgggtaaa tgagctcagc acccacaaaa ctctcaggtc caaagagaca    1680
cccacactca tctccatgct tcccttgtat aaataaagca cccagcaatg cctgggacca    1740
tgtaatagga attc                                                      1754
<210>23
<211>240
<212>PRT
<213>小鼠
<400>23
Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu His Gly
1               5                   10                  15
Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr
            20                  25                  30
Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe
    50                  55                  60
Cys Ser Leu His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Cys His Met Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val
                85                  90                  95
Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu
    130                 135                 140
Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Val Asp Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys
            180                 185                 190
Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln Val Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr
        195                 200                 205
Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Gly Ser Gly Ser Arg
225                 230                 235                 240
<210>24
<211>795
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(19)..(783)
<400>24
ctgcaggtcg acaccacc atg ccc cgg ggc cca gtg gct gcc tta ctc ctg    51
                    Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu
                    1               5                   10
ctg att ctc cat gga gct tgg agc tgc ctg gac ctc act tgc tac act    99
Leu Ile Leu His Gly Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr
            15                  20                  25
gac tac ctc tgg acc atc acc tgt gtc ctg gag aca cgg agc ccc aac    147
Asp Tyr Leu Trp Thr Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn
        30                  35                  40
ccc agc ata ctc agt ctc acc tgg caa gat gaa tat gag gaa ctt cag    195
Pro Ser Ile Leu Ser Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln
    45                  50                  55
gac caa gag acc ttc tgc agc cta cac agg tct ggc cac aac acc aca    243
Asp Gln Glu Thr Phe Cys Ser Leu His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr
60                  65                  70                  75
cat ata tgg tac acg tgc cat atg cgc ttg tct caa ttc ctg tcc gat    291
His Ile Trp Tyr Thr Cys His Met Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp
                80                  85                  90
gaa gtt ttc att gtc aat gtg acg gac cag tct ggc aac aac tcc caa    339
Glu Val Phe Ile Val Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln
            95                  100                 105
gag tgt ggc agc ttt gtc ctg gct gag agc atc aaa cca gct ccc ccc    387
Glu Cys Gly Ser Phe Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro
        110                 115                 120
ttg aac gtg act gtg gcc ttc tca gga cgc tat gat atc tcc tgg gac    435
Leu Asn Val Thr Val Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp
    125                 130                 135
tca gct tat gac gaa ccc tcc aac tac gtg ctg agg ggc aag cta caa    483
Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln
140                 145                 150                 155
tat gag ctg cag tat cgg aac ctc aga gac ccc tat gct gtg agg ccg    531
Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro
                160                 165                 170
gtg acc aag ctg atc tca gtg gac tca aga aac gtc tct ctt ctc cct    579
Val Thr Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro
            175                 180                 185
gaa gag ttc cac aaa gat tct agc tac cag ctg cag gtg cgg gca gcg    627
Glu Glu Phe His Lys Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln Val Arg Ala Ala
        190                 195                 200
cct cag cca ggc act tca ttc agg ggg acc tgg agt gag tgg agt gac    675
Pro Gln Pro Gly Thr Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp
    205                 210                 215
ccc gtc atc ttt cag acc cag gct ggg gag ccc gag gca ggc tgg gac    723
Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp
220                 225                 230                 235
ggc agc gga cac cac cat cat cac cac ggt agc ggc gac tat aaa gac    771
Gly Ser Gly His His His His His His Gly Ser Gly Asp Tyr Lys Asp
                240                 245                 250
gat  gac gat aag tagtgagaat tc                                     795
Asp Asp Asp Lys
            255
<210>25
<211>255
<212>PRT
<213>小鼠
<400>25
Met Pro Arg Gly Pro Val Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ile Leu His Gly
1               5                   10                  15
Ala Trp Ser Cys Leu Asp Leu Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr
            20                  25                  30
Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser
        35                  40                  45
Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe
    50                  55                  60
Cys Ser Leu His Arg Ser Gly His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr
65                  70                  75                  80
Cys His Met Arg Leu Ser Gln Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val
                85                  90                  95
Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe
            100                 105                 110
Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val
        115                 120                 125
Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu
    130                 135                 140
Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr
145                 150                 155                 160
Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile
                165                 170                 175
Ser Val Asp Ser Arg Asn Val Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys
            180                 185                 190
Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln Val Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr
        195                 200                 205
Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln
    210                 215                 220
Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu Ala Gly Trp Asp Gly Ser Gly His His
225                 230                 235                 240
His His His His Gly Ser Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
                245                 250                 255
<210>26
<211>792
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(786)
<400>26
atg aaa ttc tta gtc aac gtt gcc ctt gtt ttt atg gtc gtg tac att    48
Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile
1               5                   10                  15
tct tac atc tat gcc ggc agc gga cac cac cat cat cac cac ggt agc    96
Ser Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gly His His His His His His Gly Ser
            20                  25                  30
ggc gac tat aaa gac gat gac gat aag ggt tcc gga tgc ctg gac ctc    144
Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly Cys Leu Asp Leu
        35                  40                  45
act tgc tac act gac tac ctc tgg acc atc acc tgt gtc ctg gag aca    192
Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr
    50                  55                  60
cgg agc ccc aac ccc agc ata ctc agt ctc acc tgg caa gat gaa tat    240
Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr
65                  70                  75                  80
gag gaa ctt cag gac caa gag acc ttc tgc agc cta cac agg tct ggc    288
Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe Cys Ser Leu His Arg Ser Gly
                85                  90                  95
cac aac acc aca cat ata tgg tac acg tgc cat atg cgc ttg tct caa    336
His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr Cys His Met Arg Leu Ser Gln
            100                 105                 110
ttc ctg tcc gat gaa gtt ttc att gtc aat gtg acg gac cag tct ggc    384
Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly
        115                 120                 125
aac aac tcc caa gag tgt ggc agc ttt gtc ctg gct gag agc atc aaa    432
Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys
    130                 135                 140
cca gct ccc ccc ttg aac gtg act gtg gcc ttc tca gga cgc tat gat    480
Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp
145                 150                 155                 160
atc tcc tgg gac tca gct tat gac gaa ccc tcc aac tac gtg ctg agg    528
Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg
                165                 170                 175
ggc aag cta caa tat gag ctg cag tat cgg aac ctc aga gac ccc tat    576
Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr
            180                 185                 190
gct gtg agg ccg gtg acc aag ctg atc tca gtg gac tca aga aac gtc    624
Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser Arg Asn Val
        195                 200                 205
tct ctt ctc cct gaa gag ttc cac aaa gat tct agc tac cag ctg cag    672
Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln
    210                 215                 220
gtg cgg gca gcg cct cag cca ggc act tca ttc agg ggg acc tgg agt    720
Val Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser
225                 230                 235                 240
gag tgg agt gac ccc gtc atc ttt cag acc cag gct ggg gag ccc gag    768
Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu
                245                 250                 255
gca ggc tgg gac tag tga gaattc                                     792
Ala Gly Trp Asp
            260
<210>27
<211>260
<212>PRT
<213>小鼠
<400>27
Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile
1               5                   10                  15
Ser Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gly His His His His His His Gly Ser
            20                  25                  30
Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gly Cys Leu Asp Leu
        35                  40                  45
Thr Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Trp Thr Ile Thr Cys Val Leu Glu Thr
    50                  55                  60
Arg Ser Pro Asn Pro Ser Ile Leu Ser Leu Thr Trp Gln Asp Glu Tyr
65                  70                  75                  80
Glu Glu Leu Gln Asp Gln Glu Thr Phe Cys Ser Leu His Arg Ser Gly
                85                  90                  95
His Asn Thr Thr His Ile Trp Tyr Thr Cys His Met Arg Leu Ser Gln
            100                 105                 110
Phe Leu Ser Asp Glu Val Phe Ile Val Asn Val Thr Asp Gln Ser Gly
        115                 120                 125
Asn Asn Ser Gln Glu Cys Gly Ser Phe Val Leu Ala Glu Ser Ile Lys
    130                 135                 140
Pro Ala Pro Pro Leu Asn Val Thr Val Ala Phe Ser Gly Arg Tyr Asp
145                 150                 155                 160
Ile Ser Trp Asp Ser Ala Tyr Asp Glu Pro Ser Asn Tyr Val Leu Arg
                165                 170                 175
Gly Lys Leu Gln Tyr Glu Leu Gln Tyr Arg Asn Leu Arg Asp Pro Tyr
            180                 185                 190
Ala Val Arg Pro Val Thr Lys Leu Ile Ser Val Asp Ser Arg Asn Val
        195                 200                 205
Ser Leu Leu Pro Glu Glu Phe His Lys Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Gln
    210                 215                 220
Val Arg Ala Ala Pro Gln Pro Gly Thr Ser Phe Arg Gly Thr Trp Ser
225                 230                 235                 240
Glu Trp Ser Asp Pro Val Ile Phe Gln Thr Gln Ala Gly Glu Pro Glu
                245                 250                 255
Ala Gly Trp Asp
            260
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>28
gccagatcgc ctcctgatta    20
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>PCR引物
<400>  29
catgctcaca gtgccccttt                                         20
<210>  30
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物
<400>  30
ctcccccctt gaacgtgact                                         20
<210>  31
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物
<400>  31
ttgcccctca gcacgtagtt                                          20
<210>  32
<211>  28
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物
<400>  32
agagccagat tatctctttc tacctcag                                 28
<210>  33
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
<220>
<223>  PCR引物
<400>  33
cctttttcgc cttgctgttg                                          20
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