一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条及其制备方法 |
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| 申请号 | CN201610703037.X | 申请日 | 2016-08-22 | 公开(公告)号 | CN107247147A | 公开(公告)日 | 2017-10-13 |
| 申请人 | 王秀梅; | 发明人 | 王秀梅; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种EB病毒的lgG 抗体 检测 试纸 条及其制备方法，所述的EB病毒的lgG抗体检测试纸条包括塑料 底板 、样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的 硝酸 纤维 素膜、吸 水 垫，其中金标结合垫上包被有EB病毒特异性重组 抗原 与胶体金的偶联标记物，硝酸 纤维素 膜上包被有EB病毒单克隆抗体的检测线和包被有兔抗鼠IgM的质控线。本发明的试纸条采用胶体金标记技术，检测成本低，检测时间短，特异性好，试纸条 稳定性 好，灵敏度高，而且结果易于判定，显色明显，具有一定的应用前景。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条，其特征在于，该试纸条包括：塑料底板、样品垫、吸水垫、包被有胶体金标记的EB病毒特异性重组抗原的金标垫聚酯膜、包被有EB病毒单克隆抗体的检测线和包被有二抗IgM的质控线的硝酸纤维素膜。 |
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| 说明书全文 | 一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条及其制备方法技术领域[0001] 本发明设计医学检验测试领域，具体涉及一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条及其制备方法。 背景技术[0002] EB病毒又称人类疱疹病毒，是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒，认为该病毒是多种恶性肿瘤(如鼻咽癌)的病因之一，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到有EB病毒基因组存在。本病分布广泛，多呈散发性，亦可引起流行。病毒携带者和病人是本病的传染源。经口密切接触为主要传播途径，飞沫传播虽有可能，但并不重要。发病以15～30岁的年龄组为多，6岁以下多呈不显性感染。全年均有发病，似以晚秋初冬为多。一次得病后可获较持久的免疫力。 [0003] EB病毒进入机体有3种不同途径：一是EB病毒感染人类B淋巴细胞并增生，渗入感染细胞；二是EB病毒长期潜伏在淋巴细胞内，以环状DNA形式游离在胞浆中，并整合到染色体内；三是EB病毒能被灭活后重新产生感染性，按原有方式再感染细胞或者病毒传入到另一个个体。EB病毒最初复制部位是口咽部，在B淋巴细胞和口腔上皮细胞内生长繁殖，然后感染B淋巴细胞，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染。并可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫功能低下时，潜伏的EB病毒活化复发感染。 发明内容[0004] 本发明解决的技术问题是提供一种快速高效的检测EB病毒的lgG抗体检测试纸条及其制备方法。 [0005] 本发明的技术方案为：一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条，包括：塑料底板、样品垫、吸水垫、包被有胶体金标记的EB病毒特异性重组抗原的金标垫聚酯膜、包被有EB病毒单克隆抗体的检测线和包被有二抗IgM的质控线的硝酸纤维素膜。 [0006] 进一步的，所述样品垫的处理方法是将其浸于50ml的硼酸缓冲液中，均匀浸湿，然后在45℃烘干备用，所述硼酸缓冲液是含量为1～1.2％BSA，0.5～0.7％Tween20，2～2.4％PVP和5～5.6％海藻糖混合而成的，pH值为8.0～8.5。 [0007] 进一步的，所述的二抗IgM为兔抗鼠IgM多克隆抗体。 [0008] 进一步的，所述的小鼠IgM的浓度为3mg/ml，所述的EB病毒单克隆抗体的浓度为4mg/ml，所述的二抗IgM浓度为2mg/ml。 [0009] 所述EB病毒的lgG抗体检测试纸条的制备方法，包括以下步骤： [0010] (1)胶体溶液的制备：取消过毒的三角烧瓶1个，容量为500ml，加入超纯水清洗干净后，加入超纯水248mL，而后加入质量浓度为1％的氯金酸HAuCl4·3H2O溶液2mL，配制成250mL0.01％氯金酸水溶液，加热煮沸并持续搅拌，在搅拌的同时加入质量浓度为1％柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O溶液3～5mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，继续加热并搅拌5～10min后停止加热，冷却至室温后加入纯水至250ml，得到紫红色胶体金溶液，在2～8℃保存备用； [0011] (2)金标EB病毒特异性重组抗原的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液140mL，用0.25mol/LNa2CO3调节胶体金溶液的PH至8.5～9.0，用电磁搅拌器以250r/min搅拌，搅拌的同时逐滴加入5mL含0.1mg的EB病毒特异性重组抗原溶液，加入后持续搅拌10min；然后逐滴加入1mL质量浓度为10％的亚硫酸铋琼脂作为稳定剂，继续搅拌10min，然后在2～6℃、2500～2700r/min离心处理30～40min，弃去沉淀；然后将红色上清溶液继续在上述离心条件下离心10～20min，弃上清液，收集沉淀，然后加入缓释剂重悬定容至5ml，即得到金标EB病毒特异性重组抗原； [0012] (3)金标垫聚酯膜的制备：将步骤(2)所制备的金标EB病毒特异性重组抗原稀释至浓度为2mg/ml，然后用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体聚酯膜上，在37℃的恒温烘箱中烘干； [0013] (4)包被有EB病毒单克隆抗体的检测线和包被有二抗IgM的质控线的硝酸纤维素膜的制备：EB病毒单克隆抗体稀释成4mg/mL，然后用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，得到检测线；然后将二抗IgM稀释成2mg/mL，用三维平面点膜喷金仪仪器HM3055，将稀释好的二抗IgM均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线； [0014] (5)制备试纸条：将样品垫、金标垫聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水垫自上而下依次粘贴在塑料底板上，组装成试纸条，然后再切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中，即得本发明产品EB病毒的lgG抗体检测试纸条。 [0015] 本发明试纸条的工作原理：采用胶体金免疫层析技术，当待检样品中含有EB病毒lgG抗体时，EB病毒lgG抗体先和聚酯膜上胶体金标记的EB病毒特异性重组抗原结合，由于层析作用复合物沿硝酸纤维素膜向前移动，当遇到检测线上的EB病毒单克隆抗体时，形成抗体-金标重组抗原-抗体复合物，在检测线上富集，形成红色沉淀线。 [0016] 本发明的有益效果体现在：由于EB病毒能引起鼻咽癌等恶性肿瘤，主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞，故本发明提供一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条，及时检测，及时预防，而且本发明试纸条操作简单、检测成本低、检测时间短、特异性好、灵敏度高，检测时间可控制在10分钟以内，而且试纸条稳定性较好，试纸条分别在4～6℃和20～25℃下密封保存3～6个月，灵敏度未发生改变；37～40℃密封保存的试纸条15～30d内灵敏度保持不变。 具体实施方式[0017] 实施例1：一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条，包括：塑料底板、样品垫、吸水垫、包被有胶体金标记的EB病毒特异性重组抗原的金标垫聚酯膜、包被有EB病毒单克隆抗体的检测线和包被有二抗IgM的质控线的硝酸纤维素膜。 [0018] 其中，所述样品垫的处理方法是将其浸于50ml的硼酸缓冲液中，均匀浸湿，然后在45℃烘干备用，所述硼酸缓冲液是含量为1％BSA，0.5％Tween20，2％PVP和5％海藻糖混合而成的，pH值为8.0。 [0019] 其中，所述的二抗IgM为兔抗鼠IgM多克隆抗体。 [0020] 其中，所述的小鼠IgM的浓度为3mg/ml，所述的EB病毒单克隆抗体的浓度为4mg/ml，所述的二抗IgM浓度为2mg/ml。 [0021] 一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条的构成:塑料底板购自北京傲锐东源(OriGene Technologies)生物科技有限公司，吸水垫购自北京傲锐东源(OriGene Technologies)生物科技有限公司，硝酸纤维素膜购自赛默飞世尔科技有限公司，EB病毒特异性重组抗原、兔抗鼠IgM多克隆抗体以及EB病毒单克隆抗体均购自莆田科信生物技术有限公司，包被有胶体金标记的EB病毒特异性重组抗原的金标垫聚酯膜购自临沂国泰聚酯膜公司。 [0022] 一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条的制备方法，包括以下步骤： [0023] (1)胶体溶液的制备：取消过毒的三角烧瓶1个，容量为500ml，加入超纯水清洗干净后，加入超纯水248mL，而后加入质量浓度为1％的氯金酸HAuCl4·3H2O溶液2mL，配制成250mL0.01％氯金酸水溶液，加热煮沸并持续搅拌，在搅拌的同时加入质量浓度为1％柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O溶液3mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，继续加热并搅拌5min后停止加热，冷却至室温后加入纯水至250ml，得到紫红色胶体金溶液，在2℃保存备用； [0024] (2)金标EB病毒特异性重组抗原的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液140mL，用0.25mol/LNa2CO3调节胶体金溶液的PH至8.5，用电磁搅拌器以250r/min搅拌，搅拌的同时逐滴加入5mL含0.1mg的EB病毒特异性重组抗原溶液，加入后持续搅拌10min；然后逐滴加入 1mL质量浓度为10％的亚硫酸铋琼脂作为稳定剂，继续搅拌10min，然后在2～6℃、2500r/min离心处理30min，弃去沉淀；然后将红色上清溶液继续在上述离心条件下离心10min，弃上清液，收集沉淀，然后加入缓释剂重悬定容至5ml，即得到金标EB病毒特异性重组抗原； [0025] (3)金标垫聚酯膜的制备：将步骤(2)所制备的金标EB病毒特异性重组抗原稀释至浓度为2mg/ml，然后用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体聚酯膜上，在37℃的恒温烘箱中烘干； [0026] (4)包被有EB病毒单克隆抗体的检测线和包被有二抗IgM的质控线的硝酸纤维素膜的制备：EB病毒单克隆抗体稀释成4mg/mL，然后用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，得到检测线；然后将二抗IgM稀释成2mg/mL，用三维平面点膜喷金仪仪器HM3055，将稀释好的二抗IgM均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线； [0027] (5)制备试纸条：将样品垫、金标垫聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水垫自上而下依次粘贴在塑料底板上，组装成试纸条，然后再切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中，即得本发明产品EB病毒的lgG抗体检测试纸条。 [0028] 实施例2：一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条，包括：塑料底板、样品垫、吸水垫、包被有胶体金标记的EB病毒特异性重组抗原的金标垫聚酯膜、包被有EB病毒单克隆抗体的检测线和包被有二抗IgM的质控线的硝酸纤维素膜。 [0029] 其中，所述样品垫的处理方法是将其浸于50ml的硼酸缓冲液中，均匀浸湿，然后在45℃烘干备用，所述硼酸缓冲液是含量为1.1％BSA，0.6％Tween20，2.2％PVP和5.3％海藻糖混合而成的，pH值为8.25。 [0030] 其中，所述的二抗IgM为兔抗鼠IgM多克隆抗体。 [0031] 其中，所述的小鼠IgM的浓度为3mg/ml，所述的EB病毒单克隆抗体的浓度为4mg/ml，所述的二抗IgM浓度为2mg/ml。 [0032] 一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条的构成:塑料底板购自北京傲锐东源(OriGene Technologies)生物科技有限公司，吸水垫购自北京傲锐东源(OriGene Technologies)生物科技有限公司，硝酸纤维素膜购自赛默飞世尔科技有限公司，EB病毒特异性重组抗原、兔抗鼠IgM多克隆抗体以及EB病毒单克隆抗体均购自莆田科信生物技术有限公司，包被有胶体金标记的EB病毒特异性重组抗原的金标垫聚酯膜购自临沂国泰聚酯膜公司。 [0033] 一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条的制备方法，包括以下步骤： [0034] (1)胶体溶液的制备：取消过毒的三角烧瓶1个，容量为500ml，加入超纯水清洗干净后，加入超纯水248mL，而后加入质量浓度为1％的氯金酸HAuCl4·3H2O溶液2mL，配制成250mL0.01％氯金酸水溶液，加热煮沸并持续搅拌，在搅拌的同时加入质量浓度为1％柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O溶液4mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，继续加热并搅拌7.5min后停止加热，冷却至室温后加入纯水至250ml，得到紫红色胶体金溶液，在5℃保存备用； [0035] (2)金标EB病毒特异性重组抗原的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液140mL，用0.25mol/LNa2CO3调节胶体金溶液的PH至8.75，用电磁搅拌器以250r/min搅拌，搅拌的同时逐滴加入5mL含0.1mg的EB病毒特异性重组抗原溶液，加入后持续搅拌10min；然后逐滴加入 1mL质量浓度为10％的亚硫酸铋琼脂作为稳定剂，继续搅拌10min，然后在4℃、2600r/min离心处理35min，弃去沉淀；然后将红色上清溶液继续在上述离心条件下离心15min，弃上清液，收集沉淀，然后加入缓释剂重悬定容至5ml，即得到金标EB病毒特异性重组抗原； [0036] (3)金标垫聚酯膜的制备：将步骤(2)所制备的金标EB病毒特异性重组抗原稀释至浓度为2mg/ml，然后用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体聚酯膜上，在37℃的恒温烘箱中烘干； [0037] (4)包被有EB病毒单克隆抗体的检测线和包被有二抗IgM的质控线的硝酸纤维素膜的制备：EB病毒单克隆抗体稀释成4mg/mL，然后用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，得到检测线；然后将二抗IgM稀释成2mg/mL，用三维平面点膜喷金仪仪器HM3055，将稀释好的二抗IgM均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线； [0038] (5)制备试纸条：将样品垫、金标垫聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水垫自上而下依次粘贴在塑料底板上，组装成试纸条，然后再切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中，即得本发明产品EB病毒的lgG抗体检测试纸条。 [0039] 实施例3：一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条，包括：塑料底板、样品垫、吸水垫、包被有胶体金标记的EB病毒特异性重组抗原的金标垫聚酯膜、包被有EB病毒单克隆抗体的检测线和包被有二抗IgM的质控线的硝酸纤维素膜。 [0040] 其中，所述样品垫的处理方法是将其浸于50ml的硼酸缓冲液中，均匀浸湿，然后在45℃烘干备用，所述硼酸缓冲液是含量为1.2％BSA，0.7％Tween20，2.4％PVP和5.6％海藻糖混合而成的，pH值为8.5。 [0041] 其中，所述的二抗IgM为兔抗鼠IgM多克隆抗体。 [0042] 其中，所述的小鼠IgM的浓度为3mg/ml，所述的EB病毒单克隆抗体的浓度为4mg/ml，所述的二抗IgM浓度为2mg/ml。 [0043] 一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条的构成:塑料底板购自北京傲锐东源(OriGene Technologies)生物科技有限公司，吸水垫购自北京傲锐东源(OriGene Technologies)生物科技有限公司，硝酸纤维素膜购自赛默飞世尔科技有限公司，EB病毒特异性重组抗原、兔抗鼠IgM多克隆抗体以及EB病毒单克隆抗体均购自莆田科信生物技术有限公司，包被有胶体金标记的EB病毒特异性重组抗原的金标垫聚酯膜购自临沂国泰聚酯膜公司。 [0044] 一种EB病毒的lgG抗体检测试纸条的制备方法，包括以下步骤： [0045] (1)胶体溶液的制备：取消过毒的三角烧瓶1个，容量为500ml，加入超纯水清洗干净后，加入超纯水248mL，而后加入质量浓度为1％的氯金酸HAuCl4·3H2O溶液2mL，配制成250mL0.01％氯金酸水溶液，加热煮沸并持续搅拌，在搅拌的同时加入质量浓度为1％柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O溶液5mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，继续加热并搅拌10min后停止加热，冷却至室温后加入纯水至250ml，得到紫红色胶体金溶液，在8℃保存备用； [0046] (2)金标EB病毒特异性重组抗原的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液140mL，用0.25mol/LNa2CO3调节胶体金溶液的PH至9.0，用电磁搅拌器以250r/min搅拌，搅拌的同时逐滴加入5mL含0.1mg的EB病毒特异性重组抗原溶液，加入后持续搅拌10min；然后逐滴加入 1mL质量浓度为10％的亚硫酸铋琼脂作为稳定剂，继续搅拌10min，然后在6℃、2700r/min离心处理40min，弃去沉淀；然后将红色上清溶液继续在上述离心条件下离心20min，弃上清液，收集沉淀，然后加入缓释剂重悬定容至5ml，即得到金标EB病毒特异性重组抗原； [0047] (3)金标垫聚酯膜的制备：将步骤(2)所制备的金标EB病毒特异性重组抗原稀释至浓度为2mg/ml，然后用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体聚酯膜上，在37℃的恒温烘箱中烘干； [0048] (4)包被有EB病毒单克隆抗体的检测线和包被有二抗IgM的质控线的硝酸纤维素膜的制备：EB病毒单克隆抗体稀释成4mg/mL，然后用划膜仪以5μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，得到检测线；然后将二抗IgM稀释成2mg/mL，用三维平面点膜喷金仪仪器HM3055，将稀释好的二抗IgM均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线； [0049] (5)制备试纸条：将样品垫、金标垫聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水垫自上而下依次粘贴在塑料底板上，组装成试纸条，然后再切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中，即得本发明产品EB病毒的lgG抗体检测试纸条。 [0050] 临床统计试验： [0051] 临床患者EB病毒的lgG抗体检测：收集50例疑似鼻咽癌病人血清样本、20例确诊鼻咽癌病人血清，与传统的用于EB病毒检测的免疫酶染色法相比较，本发明的试纸条有1例疑似患者未能检出，其灵敏度为98％，特异性为100％，确诊病人都呈阳性，其中疑似病例免疫酶染色法与本试纸条检测结果如下表所示： [0052] 疑似病例 阳性病例 阴性病例 灵敏度 特异度 免疫酶染色法 50 34 12 92％ 100％ 试纸条 50 38 11 98％ 100％ [0053] 试验结果表明：本发明的检测试纸条具有较高的灵敏度和特异性，非常适合临床应用。 [0054] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。 |
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