[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿发生的烟曲霉主要抗原蛋白Asp f 4的线性B细胞表位（B cell epitope, BCE,或称抗原表位或决定簇）及其最小基序肽，以及这些表位基序肽的应用。

[0002] 烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种广泛存在于自然界中的条件致病菌，易感人群吸入其孢子，定植于肺部，从而产生三种曲霉病：导致咯血的曲霉肿、导致肺纤维化的变应性支气管炎和具有较高死亡率的侵袭性曲霉病（Warris A,et al. The biology of pulmonary aspergillus infections. J Infect, 69 Suppl 1:S36-41,2014）。

[0003] 血清免疫学指标对于曲霉病的诊断非常重要（Chabi ML,et al. Pulmonary aspergillosis. Diagn Interv Imaging, 96(5):435-42,2015）。GM（Galactomannan，半乳甘露聚糖）和BG（（1,3）-β-D-glucans，（1,3）-β-D -葡聚糖）是烟曲霉细胞壁的多糖成分，随着孢子的萌发和菌丝体的生长而进入宿主的血循环，因此可分别用GM和BG单抗检测血清中相应的循环抗原，为目前临床上诊断烟曲霉感染的常用方法，但在特异性和灵敏度方面存在一定的局限性（廖万清.侵袭性真菌感染的实验室诊断. 检验医学，25(7)：503-506，2010）。已有的研究表明利用烟曲霉免疫原性强的体外重组蛋白，可以检测感染者血清中相应的循环抗体，但单个重组蛋白同样在特异性和灵敏度方面存在一定的局限性（Sarfati J,et al. Recombinant antigens as diagnostic markers for aspergillosis. Diagn Microbil infect Dis, 55(4):279-91,2006）。一个蛋白抗原的长表位肽可能与其它抗原蛋白的抗体起交叉反应，因此鉴定蛋白抗原表位的最小基序可以提高检测的特异性；将多个蛋白抗原表位的最小基序组成嵌合肽可以提高检测的灵敏度。

[0004] Asp f 4作为变应原之一，为功能未知蛋白，其命名由世界卫生组织和国际免疫学会联合会变应原命名分委员会（ World Health Organization and International Union of Immunological Societies (WHO/IUIS) Allergen Nomenclature Sub-committee）批准同意（http://www.allergen.org/search.php?TaxSource=Fungi Ascomycota）。人体感染烟曲霉后，免疫系统产生相应的抗Asp f 4的IgG、IgE和IgA抗体（Kurup VP, et al. Specific antibodies to recombinant allergens of Aspergillus fumigatus in cystic fibrosis patients with ABPA.Clin Mol Allergy,4:11,2006）。鉴定Asp f 4的抗原表位最小基序，将其和烟曲霉其它抗原表位肽的最小表位基序构建检测血清嵌合肽，有助于提高诊断烟曲霉感染的特异性和灵敏度。因此，我们用大肠杆菌表达Asp f 415-322，经镍柱纯化后免疫新西兰白兔，得到Asp f 4抗血清。用改良的生物合成肽策略表达相互重叠9个氨基酸残基、覆盖Asp f 415-322全长的18肽融合蛋白，继而用Asp f 4抗血清进行免疫印迹，鉴定阳性18肽；对阳性18肽进一步构建相互重叠8个氨基酸残基的9肽融合蛋白，鉴定最小表位基序（Xu, et al. Minimal motif mapping of a known epitope on human zona pellucida protein-4 using peptide biosynthesis strategy. J Reprod Immunol, 81: 9-16, 2009）。

[0005] 本发明的目的在于提供烟曲霉Asp f 4蛋白的抗原表位最小基序肽，并提供含有所述最小基序肽的扩展短肽，同时提供含所述基序肽的短肽的应用。

[0006] 本发明提供的烟曲霉Asp f 4蛋白的线性抗原表位最小基序肽，其氨基酸序列为226-232 
SEQ ID No.1所示，记为Asp f 4 ，一字简写的氨基酸序列为：kdqfggy。

[0007] 本发明还提供烟曲霉Asp f 4蛋白的线性抗原表位最小基序肽Asp f 4226-232的扩展短肽（9肽），其序列如SEQ. ID No.2-- SEQ. ID No.4所示，其中：SEQ. ID No.2：X1X2kdqfggy，记为Asp f 4224-232。

[0008] 其中X1是L，X2是P，为最小基序Asp f 4226-232扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。

[0009] SEQ. ID No.3：X1kdqfggyX2，记为Asp f 4225-233。其中X1是P，X2是S，为最小基序Asp f 4226-232扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。

[0010] SEQ. ID No.4：kdqfggyX1X2，记为Asp f 4226-234。其中X1是S，X2是C，为最小基序Asp f 4226-232扩展残基，在化学合成或融合表达9肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其它残基替代。

[0011] 本发明的内容进一步具体描述如下：1. 根据烟曲霉Af293菌株的Asp f 4（NCBI accession No：XP_749515）全长322aa的蛋白序列，经Signal P软件预测，信号肽为1-14aa。去除Asp f 4信号肽1-14aa编码序列，依据大肠杆菌密码子偏好性，全合成Asp f 415-322编码基因，从EcoR I和Sal I酶切位点克隆于pET-22(b+)质粒，构建pET-22(b)- Asp f 415-322重组质粒；将C端带有6×His标签的重组质粒pET-22(b)- Asp f 415-322转入大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达得到重组蛋白Asp f 415-322；通过镍柱亲和层析后获得纯化Asp f 415-322；纯化Asp f 415-322免疫新西兰白兔，得到高特异性兔抗Asp f 4抗血清（图1）；
2. 用pXXGST-1融合表达质粒，构建相互重叠9个氨基酸残基、覆盖Asp f 415-322全长的GST-18肽融合蛋白（Xu, et al. Minimal motif mapping of a known epitope on human zona pellucida protein-4 using peptide biosynthesis strategy. J Reprod Immunol, 81: 9-16, 2009）。继而用兔Asp f 4抗血清进行免疫印迹，鉴定得到其中的一个阳性18肽：Asp f 4222-239delpkdqfg gysctwgef（图2）。构建相互重叠8个氨基酸残基、覆盖
222-239 224-232
Asp f 4 的GST-9肽融合蛋白，免疫印迹鉴定得到3个阳性9肽：Asp f 4  
LPkdqfggy、Asp f 4225-233PkdqfggyS和Asp f 4226-234kdqfggySC，其共有序列Asp f 4226-
232kdqfggy为Asp f 4抗原最小表位基序肽（图3）。

[0012] 本发明所述的表位最小基序肽Asp f 4226-232可用于制备作为临床诊断由烟曲霉感染导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿血清识别表位标志物。

[0013] 本发明所述的表位最小基序肽的扩展短肽Asp f 4224-232、Asp f 4225-233和Asp f 4226-234单独或组合用于制备作为临床诊断由烟曲霉感染导致侵袭性曲霉病、变应性支气管炎和曲霉肿血清识别表位标志物。
附图说明

[0014] 图1 兔抗Asp f 4抗血清ELISA结果。1号、2号、3号和4号为Asp f 4免疫兔血清，对照为免疫前兔血清。

[0015] 图2 Asp f 4 18肽融合蛋白电泳和免疫印迹图。上方蓝色条带为电泳图谱，下方黑色条带为免疫印迹图谱。0号泳道为pXXGST-2表达的GST188，1至34号泳道为跨域Asp f 15-322 15-322
4 、相互重叠9个氨基酸残基的18肽与GST188融合蛋白，由于Asp f 4 全长308aa，故
34号泳道为Asp f 4312-322。；其中24号泳道免疫印迹阳性条带为Asp f 4222-239。

[0016] 图3 Asp f 4226-232最小表位肽基序免疫印迹图。24-2表示Asp f 4223-231，24-3表示Asp f 4224-232，24-4表示Asp f 4225-233，24-5表示Asp f 4226-234，24-6表示Asp f 4227-235，箭226-232
头表示免疫印迹反应阳性条带。最小表位肽基序为Asp f 4 kdqfggy。

[0017] 本发明可进一步通过下列实例描述。这些例子并不意味限制本发明所涉及的范围，该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件以及[美]J. 萨姆布鲁克和D.W. 拉塞尔编著黄培堂等翻译的第三版“分子克隆：实验室手册”（科学出版社，2002）和[美]E. 哈洛和D. 莱恩编著沈关心等翻译的“抗体技术实验指南” （科学出版社，2002）中所述的步骤，或按照生产销售商建议的条件进行。

[0018] 材料和方法：1. pET-22(b+) 质粒和E.coli BL21（DE3）菌株购自德国Novagen公司，热诱导表达质粒pXXGST-1和对照质粒pXXGST-2由本专利发明人构建(专利号：200710173305.2)；
2. 限制性内切酶EcoR I、BamH I、Sal I购自美国New England Biolabs公司， DL2000 DNA分子量标准购于北京康为世纪生物科技有限公司，T4 DNA连接酶和预染蛋白分子量标准购自美国Thermo-Fermentas公司，小鼠6 × His单克隆抗体和弗氏完全佐剂以及弗氏不完全佐剂购于美国Sigma公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；
3. Gel Extraction凝胶回收试剂盒和Plasmid Mini质粒小量抽提试剂盒购于美国Omega公司；
4. 新西兰白兔购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司；
5. Asp f 415-322编码基因由上海旭冠生物科技发展有限公司合成。两端分别为BamH I和Sal I粘性末端，中间为覆盖Asp f 415-322全长且相互重叠9个氨基酸残基的18肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段以及覆盖免疫印迹反应18肽且相互重叠8个氨基酸残基的9肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段由上海杰李生物技术有限公司合成。DNA重组子测序由上海睿迪生物科技有限公司完成。

[0019] Asp f 4226-232最小表位肽基序鉴定的具体步骤如下：15-322
1.烟曲霉Asp f 4 的表达与纯化
1.1 表达载体pET-22(b)- Asp f 415-322的构建
根据烟曲霉Af293菌株的Asp f 4（NCBI accession No：XP_749515）的蛋白序列，经Signal P软件预测，信号肽为1-14aa。去除Asp f 4信号肽1-14aa编码序列，依据大肠杆菌密码子偏好性，全合成Asp f 415-322编码基因，从EcoR I和Sal I酶切位点克隆于pET-22(b+)质粒，构建pET-22(b)- Asp f 415-322重组质粒，Asp f 415-322全长为308个氨基酸。

[0020] 1.2 重组Asp f 415-322表达将C端带有6×His标签的重组质粒pET-22(b)- Asp f 415-322取1µL（约100ng/µL）转化到10µL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，冰上冷却5min，加入
900µL LB液体培养基37℃复苏40min～60min，最后10000r/min离心1min弃去约800 µL培养基，其余混匀后涂氨苄青霉素抗性的LB平板。待菌液被培养基吸收后37℃倒置培养16～
24h。

[0021] 挑取单克隆菌落于含50µg/mL氨苄青霉素的3mL LB液体培养基中，37℃培养过夜。翌日，按照1:50的比例将过夜菌转接至新的3mL LB液体培养基中，氨苄青霉素的工作浓度不变，37℃培养约2.5～3h（OD600为0.6~0.8）后，取出1mL菌液样本作为诱导前对照，其余菌液加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，表达条件为37℃培养4h。取500 µL诱导后菌液样本，10000r/min离心5min，收集菌体，用150µL 1×PBS缓冲液溶菌，并加入50 µL 4×SDS-PAGE Loading Buffer混匀，沸水煮样7～10min保存待用。

[0022] 配制2块相同的12%的SDS-PAGE胶，按照同样的顺序（蛋白分子量marker→诱导前全菌蛋白→诱导后全菌蛋白）和同样的上样量（5 µL）在同一电泳系统内进行SDS-PAGE凝胶电泳。电泳完成后，其中一块胶用于考马斯亮蓝R250染色分析诱导表达条带，另一块用小鼠6 × His单克隆抗体为一抗、HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Western-blot验证。实验结果表明成功表达了重组蛋白Asp f 415-322。

[0023] 1.3重组蛋白Asp f 415-322的纯化选取表达量高的单克隆菌株作为保种菌。取保种菌10µL接入50mL含50ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜。次日，按照1:50的比例将菌液转入500mL含50µg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，用1mM IPTG诱导4h，5000r/min 4℃离心5min，弃去培养基收集菌体。菌体称重（事先称好500mL塑料瓶的重量）后，加入菌体重量10陪的1×start buffer（1g菌体加10mL 1×start buffer ；start buffer: 50mM Na2HPO4/NaH2PO4，pH8.0，
300mM NaCl，10mM咪唑，1mM β-巯基乙醇），重悬菌体。用高压细胞破碎机在合适的压力下破菌，重复破菌3次后，4℃、15000rpm离心30分钟，收集上清。5mL His Trap HP预装柱事先用5倍柱体积的纯水冲净，并以5倍柱体积以上的Start Buffer平衡。上样完毕后，以Start Buffer冲洗柱子，去除未吸附的蛋白。以含40 mM 咪唑浓度的Start Buffer冲洗柱子，尽量去除杂蛋白，随后设置15mL 长度，12%-100% Elution Buffer （50mM Na2HPO4/NaH2PO4，
300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0）洗脱，收集目的蛋白。与此同时将pET-22(b+)空质粒作为
15-322
阴性对照与实验重组质粒pET-22(b)- Asp f 4 做平行实验，并收集两个空质粒的诱导前菌体及IPTG诱导4h后菌体，用于SDS-PAGE电泳。

[0024] 分别收集全菌液、上清和纯化产物20uL，加入工作浓度为1×SDS Loading Buffer Loading混匀，煮沸5min，冷却后取10µL上样，用于变性SDS-PAGE电泳检测。将蛋白条带和预计分子量测吻合，纯度达到80%以上的样品合并，并进行超滤、浓缩处理，用Bradford法估测纯化后蛋白浓度。用像素计算软件估测详细的纯化蛋白的纯度。

[0025] 2. 兔抗重组蛋白Asp f 4抗血清的制备取1mg Asp f 415-322纯化蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下注射新西兰白兔，进行初次免疫；3周后取0.5mg Asp f 415-322纯化蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化后皮下注射新西兰白兔，进行第一次加强免疫；2周后取0.5mg Asp f 415-322纯化蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化后皮下注射新西兰白兔，进行第二次加强免疫；第二次加强免疫一周后，在实验兔子的耳缘静脉取血约3～5mL，离心得到抗血清，ELISA法检测抗体效价后备用。

[0026] 3. Asp f 4226-232最小表位肽基序鉴定3.1 Asp f 4222-239阳性表位肽鉴定
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依据Asp f 4基因序列公开信息，设计跨越Asp f 4 全序列的系列相互重叠9个氨
基酸残基的18肽编码DNA正负链片段（正链5’-端加5’-gatcc,3’-端加taag-3’；负链5’-端加5’-tcgactta，3’-端加g-3’），外送DNA合成。将1或2个OD的互补正负链片段用ddH2O溶解成20 µmol/µL储存液（根据DNA合成报告单数据），各取10 µL储存液和20 ddH2O于1.5 mL Eppendorf管中，94℃水浴加热5 min,自然降至室温后，在15 µL反应体积中吸入2 µL退火片段、1 µL 约200 ng/µL经BamH I和Sal I双酶切的pXXGST-1质粒、1 µL T4 DNA连接酶和其1.5 µL缓冲液，连接过夜；连接液转化感受态BL21（DE3）宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37℃培养过夜；第二天挑取氨苄LB平板上长出的单克隆转接3 mL LB培养液诱导表达，以由pXXGST-2表达的GST188蛋白为对照，各表达的GST188-18肽融合蛋白经15％SDS-PAGE分析确认（与对照蛋白电泳迁移率相差约2 kDa），挑取各重组克隆外送进行DNA测序。将插入片段测序结果正确的克隆接种加入Amp的3 mL LB 培养液中，于30℃振荡培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中，30℃振荡培养2 ～ 3 h 至菌体浓度达到0.6 ～ 
0.8 OD后，调高温度至42℃热诱导4 h，离心收集菌体，加上样裂解液煮沸5 min，进行15％SDS-PAGE。用兔抗Asp f 4抗血清为一抗，羊抗兔IgG /HRP为二抗，进行免疫印迹。Asp f 
4222-239为阳性表位肽之一。

[0027] 3.2 Asp f 4226-232最小表位基序肽鉴定以pXXGST-1为表达载体，构建表达跨越Asp f 4222-239、相互重叠8个氨基酸残基的系列
9肽GST188融合蛋白，用兔抗Asp f 4抗血清为一抗，羊抗兔IgG /HRP为二抗，进行免疫印迹，Asp f 4224-232LPkdqfggy、Asp f 4225-233PkdqfggyS和Asp f 4226-234kdqfggySC为阳性表位肽，其共有序列Asp f 4226-232kdqfggy为Asp f 4抗原最小表位基序肽。

[0028] 应用例应用Asp f 4224-232、Asp f 4225-233和Asp f 4226-234检测血清中Asp f 4抗体
1. 用Asp f 415-322蛋白免疫新西兰白兔后取血清，以免疫前血清为对照，4只实验兔的Asp f 4抗体滴度均达到1.28×105以上（图1），用于后续免疫印迹反应；
2. 以pXXGST-1为载体，表达Asp f 4223-231、Asp f 4224-232、Asp f 4225-233、Asp f 4226-234 227-235
和Asp f 4 融合蛋白；
3. 表达的Asp f 4223-231、Asp f 4224-232、Asp f 4225-233、Asp f 4226-234和Asp f 4227-235融合蛋白进行15% SDS-PAGE电泳；
4. 将电泳凝胶蛋白条带电转移至PVDF膜，印迹膜用封闭液（TBSTM）封闭后，用封闭缓冲液（TBST）洗膜，然后以一定比例稀释的实验兔血清为一抗，4℃振荡孵育过夜；
5. 次日，用TBST洗膜后将印迹膜置于TBSTM中，加入一定比例稀释的HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，室温震荡孵育1.5h。用TBST洗膜3遍后将膜置于TBS缓冲液中，加入ECL化学发光剂，约1min后进行曝光，判断检测结果。包含最小表位基序肽Asp f 4226-232kdqfggy的Asp f 
4224-232、Asp f 4225-233和Asp f 4226-234印迹反应为阳性；而Asp f 4223-231kLPkdqfgg和Asp f 
4227-235dqfggySCT由于分别缺少包含于最小表位基序肽Asp f 4226-232中的第232位残基Y和第226位残基k，印迹反应为阴性（图3）。

[0029] 尽管本发明描述了Asp f 4蛋白抗原表位最小基序Asp f 4226-232kdqfggy，以及可单独和/或组合用含最小基序的9肽或9肽融合蛋白研制用作检测人烟曲霉感染的抗原肽（或化学合成或融合表达），但有一点对于相关领域研究技术人员来说是显而易见的，即在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的表位肽基序和扩展的含最小基序9肽融合蛋白作各种变化改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。