[0001] 本发明描述的方法和组合物能够实现斑块相关疾病的快速、灵敏和/或有效的体外诊断、能够作为生物技术工具、以及用于药物发现和开发。

[0002] 背景动脉粥样硬化是由动脉中动脉粥样硬化斑块的聚集和发展引起的一种复杂的、进行性
和慢性的炎症性心血管疾病(Lippy P et al 2011)。根据美国心脏协会，约有4千万美国人
被认为患有无显著临床症状的动脉粥样硬化，仅6百万人是有症状的。许多分析方法和工
具被用来诊断有症状和无症状的动脉粥样硬化对象(Naghavi et al, 2003).。

[0003] 表1. 通常用于诊断动脉粥样硬化的分析工具/方法# 诊断方法/工具 具体目标
1 心导管插入术 定位特定动脉的狭窄、阻塞和其他异常
2 计算机断层扫描 诊断和分析动脉粥样硬化斑块中是否存在钙化结节
3 X射线衍射 识别和分析胆固醇和磷酸钙的晶体含量
4 光学显微术和/或拉曼光谱法胆固醇和磷酸钙的晶体含量的半定量分析
5 多普勒超声 使用特殊的传感器来引导声波进入血管以评价血流
6 MUGA/放射性核素血管造影 核扫描以查看心脏壁如何运动以及每次心跳输出的血量
7 同型半胱氨酸 血液中的一种氨基酸标记物，在高水平时会损害动脉管壁的内衬(lining)
8 脂蛋白(a) 通常在具有早发型动脉粥样硬化家族史的人群中升高的独特脂质或脂肪
9 小LDL颗粒 LDL小颗粒(或“不好的”胆固醇)占优势时会在动脉中形成斑块，导致比较大的LDL颗粒更容易形成动脉粥样硬化
10 C-反应蛋白 作为炎症的标记物的痕量蛋白，与较高风险的心脏病发作和中风相关。
11 心电图 测定心跳的电活动的一种测试
大多数这些诊断程序和技术是昂贵的和侵入性的，通常涉及服用化学和/或放射性化
合物以定位或观察动脉粥样硬化斑块(Greenland et al, 2007)。此外，这些程序得到的结
果不足以向可疑患者最终提出治疗性干预的建议。而且，有关动脉粥样硬化斑块形成的机
制的有限了解也使得药物发现和开发具有挑战性。因此，需要一种简单的、确定性的、有成
本效益的方案，用于斑块相关疾病(例如动脉粥样硬化)的诊断、药物发现和开发。

[0004] 淀粉样变性是一群多于二十种的斑块相关疾病，特点是蛋白质聚集，包括艾尔兹海默症(AD)、帕金森症(PD)、朊蛋白介导的疾病、亨廷顿病(HD)、多发性硬化(MS)、II型糖
尿病等。AD是一种常见的与进行性痴呆相关的神经退行性疾病，多数由淀粉样β(Abeta)
肽引起(Yankner, 1996)。Abeta前体蛋白的异常加工是AD发病机理中的早期致病事件
(Selkoe DJ, 2003)。淀粉样前体蛋白通过β-和γ-分泌酶的作用而释放的Abeta肽经
历从单体到寡聚物的结构转变，并最终形成淀粉样纤维/斑块(Dobson CM, 2003)。这种长
期的斑块累积的病理学后果是神经元损失、脑血管炎症、脑血管空间减小和认知减退(Bell
RD et al, 2009)。

[0005] AD通过检查脑组织来确定性地诊断，通常在尸体剖检时进行(Khachaturian et al1985; McKhann et al, 1984)。患AD的对象的脑组织的尸检切片显示存在神经斑块的蛋白
质类细胞外核心形式的淀粉样变性，这是AD的特征。

[0006] 开发用于诊断AD的方法的研究包括(1)基因测试，(2)免疫分析方法，和(3)成像技术。这些方法的局限在于几倍。大量AD家族的基因分析证实，AD是遗传学上异质的
(George-Hyslop et al.1990)。而且，基因测试展示出的是AD的风险因子而非疾病标记物。
诊断脑脊液(CSF)中是否存在淀粉样相关蛋白来诊断AD的免疫分析方法已证明不能检测
出所有患者的AD，特别是在疾病的早期。成像方法面临着获得穿过血脑屏障的成像试剂的
挑战，例如抗体或放射性标记的肽。识别无症状AD个体是一项具有挑战性的任务，目前有
许多涉及神经生理学和神经病理学技术的测试被用于诊断这些对象(Thies W et al 2012)。
AD的临床诊断并非总是精确的，因为标准比较主观，而且该疾病需与其他痴呆疾病相区别。

[0007] 根据美国国家衰老研究所和艾尔兹海默症协会的新推荐，新的生物标记物的识别对于AD诊断和药物开发都势在必行(McKhann GM et al, 2011; Sperling RA et al, 2011)。
无症状对象的诊断将帮助启动早期治疗性干预以降低与斑块相关疾病(包括动脉粥样硬
化和淀粉样变性)的进展相关的威胁生命的风险。

[0008] 因此，对于新的、有成本效益的AD诊断方法和有效的药物发现和开发技术的需求仍未得到满足。

[0009] 通过引用合并所有该说明书中提及的公开文献、专利和专利申请都通过引用合并至本文中，如同每
个单个的公开文献、专利或专利申请被具体和逐个地通过引用合并至本文中一样。

[0010] 发明概述在一些实施方式中，本发明提供了一种检测对象中的斑块颗粒形成的方法，该方法包
括：在体外制备至少一个斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒，其中斑块聚集体或自行形成
的斑块颗粒与可检测标记物相连；将来自所述对象的生物学样品与至少一个所述斑块聚集
体或自行形成的斑块颗粒接触；随后使用装置检测所述可检测标记物。在一些实施方式中，
该标记物是荧光标记物或发光标记物或染料。在一些实施方式中，所述装置是流式细胞仪
或其他荧光检测器或亮光检测器或色度仪。

[0011] 在一些实施方式中，所述生物学样品是生物流体。在其他实施方式中，生物流体选自：血液、血浆、血清、脑脊液、尿液和唾液。在一些实施方式中，生物学样品的接触导致向所
述至少一个斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒加入成分，使得形成至少一个斑块颗粒。在
一些实施方式中，所述接触导致向所述至少一个斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒加入成
分，使得形成至少一个斑块颗粒并且所形成的斑块颗粒类似于与动脉粥样硬化、艾尔兹海
默症、孤独症、帕金森症、多发性硬化、骨关节炎、疯牛病海绵状组织、II型糖尿病、痴呆、全
身性淀粉样变性、透析相关淀粉样变性、溶菌酶淀粉样变性、胰岛素相关性淀粉样变性、和/
或肌萎缩性脊髓侧索硬化症相关的斑块。

[0012] 在一些实施方式中，所形成的至少一个斑块颗粒被与多个自行形成的斑块颗粒进行比较。在其他实施方式中，如果该至少一个斑块颗粒实质上类似于多个自行形成的斑块
颗粒中的一个自行形成的斑块颗粒，那么所述对象被识别为患有或有风险患有斑块相关疾
病。在一些实施方式中，所述斑块相关疾病是动脉粥样硬化或淀粉样变性。在一些实施方
式中，所述对象患有、或有风险患有、或被怀疑患有动脉粥样硬化或包括艾尔兹海默症在内
淀粉样变性。在一些实施方式中，使用了所述至少一个斑块聚集体或多个斑块聚集体。在
一些实施方式中，所述方法进一步包括基于斑块颗粒形成、斑块颗粒亚型、斑块颗粒图像、
斑块颗粒计数、或斑块颗粒模式(profile)来诊断或分类(stratifying)对象。

[0013] 在一些实施方式中，至少一个斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒包括一个或多个以下物质：蛋白质、蛋白质衍生物、胆固醇、胆固醇衍生物、脂质、脂质衍生物、Abeta-42、
Abeta衍生物、突触核蛋白、朊蛋白、淀粉不溶素、Tau蛋白、磷脂质、胆固醇晶体、血清淀粉
样蛋白A、β-微球蛋白、溶菌酶、胰岛素、或超氧化物歧化酶、以及磷酸钙(CP)。

[0014] 在一些实施方式中，所述方法进一步包括，利用被标记了用于产生荧光共振能量转移(FRET)的不同荧光团的多个斑块聚集体或一对斑块聚集体，或被标记了用于产生荧
光共振能量转移(FRET)的不同荧光团的多个自行形成的斑块颗粒或一对自行形成的斑块
颗粒，来筛选所述生物学样品。

[0015] 在一些实施方式中，所述方法进一步包括通过在不同时间点重复制备与可检测标记物相连的斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒、将生物学样品与所述斑块聚集体或自行形
成的斑块颗粒接触、以及使用装置检测所述可检测标记物的步骤从而监测所述对象。在一
些实施方式中，本发明提供了一种检测对象中的斑块颗粒形成的方法：制备至少一个斑块
聚集体或自行形成的斑块颗粒；将来自所述对象的生物学样品与所述至少一个斑块聚集体
或自行形成的斑块颗粒接触；随后将该产物与可检测标记物或连有抗体的可检测标记物接
触；以及随后使用装置检测所述可检测标记物。

[0016] 在一些实施方式中，本发明提供一种筛选测试试剂的方法：在体外制备至少一个斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒，其中所述斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒与可检测
标记物相连；将连有可检测标记物的所述至少一个斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒与至
少一种测试试剂接触；随后使用装置检测所述可检测标记物。在一些实施方式中，至少一种
测试试剂包含小分子或蛋白质或测试试剂的抗体库。在一些实施方式中，至少一种测试试
剂的效果在于加速斑块颗粒的形成。在其他实施方式中，至少一种测试试剂的效果在于减
少、减慢或破坏斑块颗粒形成。在其他实施方式中，该方法进一步包括识别阻止或破坏或减
少斑块颗粒形成的测试试剂。在其他实施方式中，所述方法进一步包括测试所述测试试剂
在破坏斑块颗粒或减少斑块颗粒形成的方面的功效，或进一步包括测试所述测试试剂的安
全性。在一些实施方式中，所述测试试剂是纳米颗粒或以纳米颗粒配制。在这些实施方式
中，所述方法进一步包括监测测试试剂在对象中的功效。

[0017] 在一些实施方式中，本发明提供一种筛选测试试剂的方法，包括：在体外制备至少一个斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒，其中所述至少一个斑块聚集体或自行形成的斑块
颗粒与可检测标记物相连；将哺乳动物细胞与连有可检测标记物的所述至少一个斑块聚集
体或自行形成的斑块颗粒一起培养，其中所述哺乳动物细胞显示出形态学变化、病理学症
状、表达细胞粘附分子、细胞因子和或细胞凋亡、炎症；将所述哺乳动物细胞与至少一种测
试试剂接触；随后识别阻止或减轻细胞中的病理学症状的形成或形态学变化的测试试剂。

[0018] 在一些实施方式中，本发明提供一种在对象中识别生物标记物的方法，所述方法包括：在体外制备至少一个斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒，其中所述斑块聚集体或自
行形成的斑块颗粒与可检测标记物相连；将来自所述对象的生物学样品与所述至少一个斑
块聚集体或自行形成的斑块颗粒接触；随后利用蛋白质组学或质谱分析或类似技术识别出
所述生物学样品中有助于加速斑块颗粒形成的蛋白质或抗体或代谢物或物质。

[0019] 在一些实施方式中，本发明提供的上述方法被用于筛选血液或血液制品的斑块颗粒形成。在其他实施方式中，该血液或血液制品在筛选或测试后被施加给受体对象，其中阴
性结果是指在所述血液或血液制品与斑块聚集体接触后发现很少或没有发现新斑块。

[0020] 附图简述通过以下阐述示例性实施方式的详细描述和附图可更好地理解本发明的特征和优点，
这些实施方式中利用了本发明的原理。

[0021] 图1显示了利用流式细胞仪检测的斑块阵列方法示意图(实施例1)。

[0022] 图2A显示了体内斑块发展过程中涉及到的三个主要步骤。首先，斑块的成分以分子形式出现。其次，这些成分聚集在一起形成斑块聚集体。再次，斑块聚集体转变为不溶性
斑块颗粒。图2B显示了胆固醇衍生物的化学结构。图2C显示了磷脂质衍生物的化学结构。

[0023] 图3显示通过流式细胞仪可检测到荧光标记的胆固醇斑块聚集体和自行形成的斑块颗粒。

[0024] 在图4A中，具有流式细胞检测的斑块阵列方法显示患有动脉粥样硬化的患者的血清加速由胆固醇斑块聚集体向斑块颗粒的合成(实施例3)。图4B显示了用正常血清样
品和动脉粥样硬化对象血清样品处理的荧光标记的斑块聚集体形成胆固醇斑块颗粒的时
间进程研究。这是一个胆固醇斑块颗粒数量(y轴)相对于时间(x轴)的曲线：与来自正
常对象的血清一起温育的荧光标记的胆固醇斑块聚集体(菱形)；与来自患有动脉粥样硬
化的对象的血清一起温育的荧光标记的胆固醇斑块聚集体(三角形、叉形和方块)。(实施
例3)。

[0025] 在图5中，利用流式细胞检测的斑块阵列方法显示患有动脉粥样硬化的对象的血清加速由少量自行形成的斑块颗粒到斑块颗粒的合成。图A显示了自行形成的胆固醇颗粒
的结果，图B-H显示了与来自七个患有动脉粥样硬化的对象的血清温育1小时的自行形成
的斑块颗粒的结果(实施例4)。

[0026] 在图6中，具有流式细胞检测的斑块阵列方法显示患有动脉粥样硬化的对象的血清加速由磷脂质斑块聚集体向斑块颗粒的合成。图A显示温育1小时的荧光标记的磷脂质
斑块聚集体。图B显示与来自正常对象的血清温育1小时的荧光标记的磷脂质斑块聚集体。
图C-F显示了与来自四个患有动脉粥样硬化的不同对象的血清温育1小时的荧光标记的磷
脂质斑块聚集体的结果。(实施例5)。

[0027] 在图7中，具有流式细胞检测的斑块阵列方法显示，与未处理的血清相比，与患有动脉粥样硬化的对象的IgG缺失的血清一起温育胆固醇斑块聚集体导致较少的斑块颗粒
的形成。荧光标记的胆固醇斑块聚集体的流式细胞分析，聚集体温育1小时：(左侧)与患
有动脉粥样硬化的对象的未处理血清一起温育；(中间)与IgG缺失的血清一起温育，即使
用蛋白质A/G预处理了的患有动脉粥样硬化的对象的血清；(右侧)IgG-缺失的血清一起
温育，即使用蛋白质A预处理了的患有动脉粥样硬化的对象的血清(实施例6)。

[0028] 在图8中，具有流式细胞检测的斑块阵列方法被用来检测动脉粥样硬化小鼠模型的体内变化。携带ApoE-基因突变的小鼠和相同年龄组的正常C57BL/6小鼠，从8周到20
周被喂以引起动脉粥样化的饮食。图中显示了荧光标记的胆固醇斑块聚集体在与血清样品
温育1小时后的流式细胞检测结果，这些血清样品是在：(从做到右)8周、12周、16周、20
周时从ApoE-突变小鼠(上方一行)和C57BL/6-小鼠(下方一行)中收集的(实施例7)。

[0029] 在图9中，具有流式细胞检测的斑块阵列方法显示了由用患有AD的对象的血清处理的荧光标记的Abeta-42斑块聚集体合成的斑块颗粒。图A显示温育1小时的荧光标记的
Abeta-42斑块聚集体。图B显示与来自正常对象的血清温育1小时的荧光标记的Abeta-42
斑块聚集体。图C-H显示了与来自六位患有AD的不同对象的血清温育1小时的荧光标记
的Abeta-42斑块聚集体(实施例8)。

[0030] 在图10A中，具有流式细胞检测的斑块阵列方法显示患有AD的对象的血清加速由未标记的Abeta-42和Abeta-28斑块聚集体向斑块颗粒的形成(实施例9)。在图
10B中，具有流式细胞检测的斑块阵列方法显示患有AD的对象的血清加速由荧光标记的
Abeta-42(左侧)、Abeta-28(中间)和胆固醇(右侧)斑块聚集体向斑块颗粒的形成(实
施例9)。

[0031] 在图11中，具有流式细胞检测的斑块阵列方法显示，与未处理的血清相比，用患有AD的对象的IgG缺失的血清与Abeta-42斑块聚集体温育时，显示出减少的斑块颗粒形
成。未标记的Abeta-42斑块聚集体的流式细胞分析，聚集体温育1小时：(左侧)与患有
AD的对象的血清温育；(中间)与IgG缺失的血清一起温育，即使用蛋白质A/G预处理了的
患有AD的对象的血清；(右侧)IgG-缺失的血清一起温育，即使用蛋白质A预处理了的患
有AD的对象的血清。利用Thioflavin S染料检测斑块颗粒(实施例10)。

[0032] 在图12中，具有流式细胞分析的斑块阵列方法被用来检测艾尔兹海默症小鼠模型的体内变化。图中显示了荧光标记的胆固醇斑块聚集体在与血清样品温育1小时后的流
式细胞检测结果，这些血清样品是在：(从做到右)8周、12周、16周、20周时从APPSWE/PS-1
突变小鼠(上方一行)和相同年龄组的C57BL/6-小鼠(下方一行)中收集的，两种小鼠从
8周到20周被喂以正常饮食(实施例11)。

[0033] 图13A显示了来自患有AD的对象的血清对由荧光标记的Abeta-42斑块聚集体向斑块颗粒的合成的影响的终点FRET试验结果(相对荧光单位(RF1))的柱状图(实施例
12)。图13B显示了来自患有动脉粥样硬化的对象的血清对由胆固醇斑块聚集体向斑块颗
粒的合成的影响的终点FRET试验结果(相对荧光单位(RF1))的柱状图(实施例13)。

[0034] 图14A显示了来自成像流式细胞仪的结果，其显示在存在来自患有AD的对象的血清的情况下，由Abeta-42斑块聚集体合成的Abeta-42斑块颗粒的图像和尺寸分布。结果
显示存在三种主要种类的Abeta-42斑块颗粒(实施例14)。图14B显示了来自成像流式细
胞仪的结果，其显示了在存在来自患有动脉粥样硬化的对象的血清的情况下，由胆固醇斑
块聚集体合成的胆固醇斑块颗粒的图像和尺寸分布。结果显示，存在三种主要种类的胆固
醇斑块颗粒(实施例15)。

[0035] 图15A显示在不同条件下由荧光标记的胆固醇斑块聚集体合成的三种亚型的胆固醇斑块颗粒(实施例16)。图15B显示了在不同条件下由荧光标记的磷脂质斑块聚集体
合成的两种亚型的磷脂质斑块颗粒(实施例16)。

[0036] 图16显示以荧光标记的Abeta-42斑块聚集体筛选的噬菌体库的点状图(实施例17)。

[0037] 图17显示了用荧光标记的胆固醇和磷脂质斑块聚集体处理的人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)的流式细胞分析。左图显示了用荧光斑块聚集体处理的细胞的前向和侧向散
射。中间图显示了在流式细胞仪的FL1(520 nm)和FL2(560 nm)通道中检测到的细胞荧光。
右侧直方图显示了结合了斑块聚集体的细胞的荧光强度。

[0038] 图18显示了基于用荧光标记的斑块聚集体处理的人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)的流式细胞分析的细胞凋亡实验。A是HCAEC的点状图。B是与混合的荧光标记的胆固醇
磷脂质斑块聚集体Chl-LS温育的HCAEC的点状图。C是与混合的荧光标记的磷酸钙胆固醇
磷脂质斑块混合聚集体CP-Chl-LS温育的HCAEC的点状图。D显示了结合至CP-Chl-LS混
合斑块处理的HCAEC的膜联蛋白V的柱状图。E显示了碘化丙啶与CP-Chl-LS混合斑块处
理的HCAEC结合的柱状图(实施例19)。

[0039] 发明实施方式的详细描述如本文所使用的，出文中另有明确说明外，单数形式“一个”和“该”包括复数指代。
Abeta-42指淀粉样β肽1-42及衍生物；Abeta-28指淀粉样β肽1-28及衍生物；Abeta-17
指淀粉样β肽1-17及衍生物；Chl指胆固醇；LS指磷脂质；CP指磷酸钙。

[0040] 用在斑块阵列方法中的两种反应物是斑块聚集体和自行形成的斑块颗粒。斑块聚集体由有机或无机分子在导致分子聚集的条件下制备而成。斑块聚集体可被直接用在斑块
阵列方法中。例如，它们可被用来筛选生物学样品，以诊断对象是否患有斑块相关疾病。本
文公开的第二种反应物是自行形成的斑块颗粒。自行形成的斑块颗粒是由斑块聚集体形成
的。这是随时间变化而出现的，无需将斑块聚集体与生物学样品接触。类似于斑块聚集体，
自行形成的斑块颗粒可被用来在斑块阵列方法中筛选生物学样品。为进行斑块阵列方法，
生物学样品被添加至反应物—斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒。向该反应物中添加生物
学样品导致形成斑块颗粒，其通过荧光检测器或亮光检测器或色度仪来检测。所形成的斑
块颗粒被称作斑块颗粒或体外斑块颗粒。

[0041] 本文公开的“斑块颗粒”或“体外斑块颗粒”是指在存在添加的生物学样品的情况下形成的相同反应产物，并且这两个术语可互换使用。这两个术语不同于术语“自行形成的
斑块颗粒”，后者是在未添加生物学样品的情况下形成的。“自行形成的颗粒斑块”是指用在
斑块阵列试验中的一种类型的反应物。

[0042] 本文公开的斑块聚集体(包括胆固醇斑块聚集体、磷脂质斑块聚集体、Abeta斑块聚集体、混合斑块聚集体等)是水溶性的。本文公开的自行形成的斑块颗粒和斑块颗粒是
水不溶性的。本文公开的各种Abeta肽的聚集体，例如Abeta聚集体，通常在文献中是指寡
聚物。本文中公开的阵列或板是指多个斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒。

[0043] 在本文的一些实施方式中，斑块阵列方法使用通常存在于动脉粥样硬化和淀粉样变性斑块中的构建材料，包括脂质、蛋白质、胆固醇、钙、淀粉样肽、内皮细胞、细菌和矿物
质。这些成分以可溶性聚集体和成熟斑块/晶体形式存在于体内斑块内部，促成了斑块相
关疾病的起源和进展(图2A)。因此，斑块阵列方法利用一个或多个这些斑块聚集体或自行
形成的斑块颗粒，来检查与生物学样品接触时的体外斑块颗粒形成。

[0044] 本文的一些实施方式涉及动脉粥样硬化。在这些实施方式中，用来筛选生物流体或生物学样品对斑块颗粒形成的作用的斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒可包括
一种或多种以下物质：蛋白质、蛋白质衍生物、胆固醇、胆固醇衍生物(胆固三烯醇(胆
固-5,7,9(11)-三烯-3b-醇)、22-NBD-胆固醇(=22-(N-(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二
唑-4-基)氨基)-23，24-二正-5-胆-3-醇)、a-环氧胆固醇-胆甾烷-5a,6a环氧-3β
二醇；35-羟基胆固醇；7-酮基胆固醇、胆固醇一水合物等(图2B中所示实施例))、脂质、
或脂质衍生物(溶酶磷脂酰胆碱；C6-NBD-磷脂酰胆碱(C6-NBD-PC)、C12-NBD-磷脂酰胆碱
(C12-NBD-PC))、DMPG-1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱；1-棕榈酰基-2-(二吡
咯亚甲基硼二氟化物)十一酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-(9’-氧杂-壬
酰)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱、磷脂酰乙醇胺等，图2C)。

[0045] 本文的一些实施方式涉及淀粉样变性。在这些实施方式中，用于筛选生物流体或生物学样品在斑块颗粒形成上的作用的斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒可包含一种或
多种以下物质：
Abeta肽和衍生物
Abeta 1-42 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA；
Abeta 1-28 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK；
Abeta 1-17 DAEFRHDSGYEVHHQKL；
Abeta 22-35 EDVGSNKGAIIGLM；
淀粉样蛋白 (1-42 S26C)-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGCNKGAIIGLMVGGVVIA；
淀粉样蛋白(1-42)；E22V-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAVDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA；
淀粉样蛋白1-42)；N27A-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSAKGAIIGLMVGGVVIA等)、突触
核蛋白、朊蛋白、淀粉不溶素、Tau蛋白、磷脂质、胆固醇晶体、血清淀粉样蛋白A、β微球蛋
白、溶菌酶、胰岛素或超氧化物歧化酶。在一些实施方式中，该方法包含荧光标记的磷酸钙
(CP)、脂质和胆固醇的混合物。

[0046] 在一些实施方式中，斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒包含至少一种本领域技术人员已知存在于患有有症状的和无症状的淀粉样变性的对象的体内形成的斑块中的成分。
在这些实施方式中，该成分可连接至可检测标记物。在其他实施方式中，斑块聚集体或自行
形成的斑块颗粒包含Abeta-42肽。在其他实施方式中，斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒
包含Abeta-28肽。

[0047] 在一些实施方式中，斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒包含至少一种本领域技术人员已知存在于患有动脉粥样硬化的对象的体内形成的斑块中的成分。在这些实施方式
中，该成分可连接至可检测标记物。在其他实施方式中，斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒
包含胆固醇及其衍生物。在其他实施方式中，斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒包含磷脂
质或其衍生物。在一些实施方式中，斑块聚集体包含单个成分，而在其他实施方式中，它们
是混合的聚集体且包含不止一种成分。在一些实施方式中，自行形成的颗粒包含单个成分，
而在其他实施方式中，它们是混合的自行形成的斑块颗粒且包含不止一种成分。

[0048] 在一些实施方式中，斑块聚集体和自行形成的斑块颗粒在磷酸盐缓冲盐水(PBS)或磷酸盐缓冲液中制备。本领域技术人员会意识到，可使用任何合适的水溶液作为替代。在
一些实施方式中，斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒利用有机溶剂(例如醇)制备。在一
些实施方式中，形成斑块聚集体和自行形成的斑块颗粒的反应在37℃进行。在其他实施方
式中，该反应在适合反应进展的温度和时间进行。在一些实施方式中，利用斑块聚集体和自
行形成的斑块颗粒用于诊断或药物发现或开发或其他用途的反应在37℃进行。在其他实施
方式中，该反应在适合反应进展的温度和时间进行。

[0049] Abeta斑块聚集体的形成取决于缓冲液中肽的浓度、37℃的温育时间以及金属离子(例如铜、铁、铝和锌)的存在。我们发现，在37℃温育Abeta肽6小时即足以制备斑块
聚集体。在37℃温育24至48小时产生自行形成的Abeta斑块颗粒。类似地，胆固醇或磷
脂质斑块聚集体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备(0 hr)并用于斑块阵列试验。在37℃温
育12至48小时导致形成自行形成的胆固醇或磷脂质斑块颗粒。由斑块聚集体在存在和不
存在生物流体的情况下形成斑块颗粒取决于斑块聚集体的浓度以及在37℃的温育时间。所
产生的自行形成的斑块颗粒或在血清中形成的斑块颗粒在水、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓
冲液等中是不溶性的。

[0050] 在一个方面，本发明提供一种由斑块聚集体或由自行形成的斑块颗粒形成斑块颗粒的方法。在本文公开的一些实施方式中，斑块颗粒的形成在存在生物样品(包括生物流
体)的情况下被加速。在其他实施方式中，斑块颗粒的形成通过人工生长培养基、化学培养
基等被加速。

[0051] 任何生物学样品都可根据所公开的方法被测试。这样的样品可为细胞、组织、血液、尿液、精液、或它们的一部分(例如血浆、血清、尿液上清、尿液细胞团块或前列腺细
胞)，它们可从患者或其他来源的生物学材料获得，例如尸检样品或法医材料。在接触斑块
聚集体或自行形成的斑块颗粒之前，样品可被处理以分离或富集样品的期望分子，可利用
多种标准实验室操作来实现此目的，例如离心、免疫捕获、细胞裂解。

[0052] 生物流体是一类生物学样品。本文公开的术语生物流体是流体生物学样品，且与术语生物学流体互换使用。虽然用在本文实施例中的生物流体是来自患者的血清，但在一
些实施方式中，生物流体可包括血浆或唾液。在其他实施方式中，生物流体可包括尿液或脑
脊液。在其他实施方式中，生物流体可包括血液。

[0053] 生物学样品可从动物(包括人)获得并包括流体、固体、组织和气体。生物学样品包括脑脊液、痰液、支气管冲洗物、支气管抽吸物、尿液、 淋巴液、和各种呼吸道、肠道和泌
尿生殖道的外部分泌物、眼泪、唾液、乳液、生物学流体(例如细胞培养上清液)、组织、细胞
等。

[0054] 在一些实施方式中，自行形成的斑块颗粒包括所连接的可检测标记物，其利用荧光检测仪、亮光检测仪、色度仪等被检测。在另一个实施方式中，本发明包括一种阵列方法，
其用于体内形成动脉粥样硬化或淀粉样变性的斑块颗粒，并且是利用荧光染料或蛋白或荧
光标记或亮光标记的抗体来检测斑块颗粒或斑块颗粒亚型的间接方式，所述方法包括首先
将有机或无机分子转变为斑块聚集物(0 hr)或自行形成的斑块颗粒(24 hr)，其中有机或
无机分子选自未标记的胆固醇或其衍生物、或脂质或其衍生物、或Abeta-42或其衍生物，
以及将斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒与生物学样品接触，因而斑块聚集体与蛋白质、
脂质或碳水化合物以及其他存在于生物学样品中的分子相互作用，导致斑块颗粒的体外形
成。所产生的斑块颗粒或斑块颗粒亚型的检测使用结合至斑块颗粒的成分的荧光标记或亮
光标记的抗体。这是检测斑块颗粒和亚型的间接方法，其会帮助识别附接至斑块颗粒的分
子，并利用这些分子作为生物标记物来预测动脉粥样硬化和AD。

[0055] 在一些实施方式中，体外形成的斑块颗粒类似于与以下疾病相关的斑块：动脉粥样硬化、艾尔兹海默症、孤独症、帕金森症、多发性硬化、骨关节炎、疯牛病海绵状组织、II型
糖尿病、痴呆、全身性淀粉样变性、透析相关淀粉样变性、溶菌酶淀粉样变性、胰岛素相关性
淀粉样变性、和/或肌萎缩性脊髓侧索硬化症。

[0056] 在某些实施方式中，本发明包括一种诊断、归类、评价、定量或预测测试对象中的动脉粥样硬化病或淀粉样病(包括艾尔兹海默症)的方法。这种方法可包括：(a)将测试
对象的血液、血浆、血清、尿液、唾液、脑脊液与多个一种或多种亮光或荧光标记的斑块聚集
体或自行形成的斑块颗粒接触；以及利用装置来检测可检测标记物并识别血液、血浆或血
清中加速所述一种或多种斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒的斑块颗粒形成的分子。

[0057] 本发明可包括一种诊断、检测、评价或施用给予对象的治疗有效剂量的药物、生物学化合物、蛋白质、抗体或化学化合物，其中所述药物、生物学化合物或化学化合物已被筛
选为具有结合、穿透、分解、破坏或阻止动脉粥样硬化斑块或淀粉样变性斑块的能力。

[0058] 在另一个实施方式中，本发明包括一种阵列方法，用于识别生物流体中有助于体外斑块颗粒的集合的分子。胆固醇或磷脂质或淀粉样肽斑块聚集体与存在于人血清或血浆
中的蛋白质、脂质或碳水化合物和其他分子相互作用，导致斑块颗粒的体外形成。质谱分析
和蛋白质组学分析可辅助识别附接至斑块颗粒并涉及斑块集合过程的分子。这些分子可被
用作生物学标记物，用于检测体内动脉粥样硬化和淀粉样变性疾病发展和进程的过程。

[0059] 在本文的一些实施方式中，斑块阵列技术使得可以发现新的机制和分子，其催化当用生物学样品(包括生物流体)处理时的加速的斑块颗粒集合。在一些实施方式中，斑
块阵列使得能够评价不同成分的斑块的致病性。

[0060] 本发明还提供一种斑块阵列试剂盒，用于辅助诊断、预测、预后、或检测斑块相关疾病，例如AD和动脉粥样硬化。该方法还可包括针对斑块颗粒板的组成获得或生成AD或
动脉粥样硬化的潜在风险的指定(designation)。在一些实施方式中，该试剂盒包括一种或
多种用于制备本文所述的斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒或斑块颗粒的分子。在其他实
施方式中，该试剂盒包括具有载体(例如盐、缓冲液、促进剂等)的一个或多个斑块聚集体
或自行形成的斑块颗粒或斑块颗粒的组合物。在其他实施方式中，该试剂盒进一步包括用
于斑块阵列试验的试剂以及通过流式细胞仪或亮光检测仪的斑块颗粒检测试剂。

[0061] 本发明还包括可用于斑块相关疾病的诊断、药物发现和药物开发的斑块阵列试剂盒。在一些实施方式中，提供有教导使用根据本文的各种方法和途径的试剂盒的说明书。这
些试剂盒也可包括例如下述信息：科学文献参考、包装插入材料、临床实验结果、和/或这
些内容的概述等，其说明或设立了试剂的作用和/或优点。这样的信息可基于各种研究结
果，例如，生化斑块试验、利用涉及到体内模型的实验动物的研究、和基于人类临床实验的
研究。本文所述的试剂盒可被提供、推广和/或促销给健康提供者，包括医生、护士、药师、
处方官员(formulary officials)等。

[0062] 在另一个实施方式中，本发明涉及使用本文所述的斑块阵列方法来筛选抑制或刺激斑块颗粒体外形成的试剂。这样的试剂被测试作为诊断、预防、治疗和/或治愈淀粉样
斑块疾病的治疗线索的可能性，这些试剂包括但不限于化学化合物、小分子化合物、治疗药
物、生物学分子、寡聚物、配体、蛋白质、抗体或其他成分，这些试剂能够在存在或不存在生
物流体的情况下结合斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒或斑块颗粒、阻止它们的集合、分
解已形成的这些聚集体或自行形成的斑块颗粒或斑块颗粒、或降低它们的致病性质。因为
本发明公开的方法或过程能够分离出体外斑块颗粒形成的步骤，因此靶定斑块的不同发展
阶段的抗斑块试剂也能够被识别。术语“抗斑块试剂”和“抗斑块治疗剂”在本文互换使用
并且指能够有效地进行下述行为的化合物或药物：a)溶解、抑制或破坏本文所述的斑块聚
集体或自行形成的斑块颗粒或斑块颗粒的构造或结构，和/或b)抑制、阻止或减轻斑块可
能对人的其他细胞、组织或器官的有害作用。

[0063] 在某些实施方式中，本发明包括一种筛选药物、化学或生物学化合物的方法，所述药物、化学或生物学化合物包括蛋白质和抗体，且控制当斑块聚集体或自行形成的斑块颗
粒被血清、确定成分培养基或合成培养基、或血浆样品处理时体外斑块颗粒的形成。这是通
过以下步骤实现的：将哺乳动物细胞与本文所述的至少一种斑块聚集体或自行形成的斑块
颗粒一起培养，所述培养导致细胞表现出形态学变化、细胞死亡、炎症、DNA损害、老化或年
龄相关退行性过程；随后利用该系统筛选阻止或减轻斑块颗粒诱导的病理学症状的形成、
细胞死亡或细胞形态学变化的药物、化学或生物学化合物。在某些实施方式中，该斑块颗粒
类似于动脉粥样硬化斑块或淀粉样斑块。

[0064] 在一些实施方式中，本发明包括一种对药物或药物制剂、纳米材料进行性质分析或归类或评价功效、测试安全性的方法。在一些实施方式中，一种或多种本文所述的斑块
聚集体或自行形成的斑块颗粒被用来评价在动脉粥样硬化或淀粉样疾病动物模型中的药
物功效、药物安全性、致病性。该动物可为小鼠、大鼠、猪、马、非人灵长类、豚鼠、仓鼠、鸡、青
蛙、狗、羊、牛或人。
实施例

[0065] 实施例1 –斑块阵列技术综述图1中展示的实施例包括示意性图和斑块阵列方法的发展中涉及的步骤，该方法用于
检测和定量由存在于测试对象的生物流体中的分子催化的体外斑块颗粒形成。该阵列方法
包括三个步骤：(1)制备斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒，(2)将斑块聚集体或自行形成
的斑块颗粒与生物学样品一起温育，和(3)利用流式细胞仪、或荧光板读取器或亮光读取
器或色度仪或其他检测方法检测和计数所产生的斑块颗粒。

[0066] 本文显示的流式细胞术的结果通常以在对数尺度上的一维图或二维显示(点状图)来呈现，对数坐标可在四十至五十范围内延伸。图1A显示，荧光标记的斑块聚集体通
过流式细胞术未被检测到；图1B，稀释的人生物流体通过流式细胞术未显示出可检测的斑
块颗粒；图1C显示，与来自正常对象的生物流体温育1小时的荧光标记的Abeta斑块聚集
体或胆固醇斑块聚集体显示出少量的斑块颗粒；图1D显示，与来自患有淀粉样变性或动脉
粥样硬化的生物流体温育1小时的荧光标记的Abeta斑块聚集体或胆固醇斑块聚集体，与
图1C相比，显示出明显更多量的斑块颗粒。总体而言，这显示出，来自患有斑块相关疾病的
对象的血清加速了由不可检测的斑块聚集体“种子”向可检测的斑块颗粒的合成。

[0067] 实施例2 –用于斑块相关疾病动脉粥样硬化的斑块阵列的开发胆固醇、脂质和钙晶体是存在于动脉粥样硬化斑块中的主要成分。具体而言，易受损害
的动脉粥样硬化斑块(IV型，Va型)含有大量的累积胆固醇、脂质和钙化晶体。为开发出
该斑块阵列方法，首先制备了包含胆固醇、磷脂质、Abeta肽和/或磷酸钙的荧光标记的斑
块聚集体(0 hr)。随后，通过温育24小时由斑块聚集体合成自行形成的斑块颗粒(24 hr)。
自行形成的斑块颗粒可利用流式细胞仪检测。

[0068] 由单个分子制备斑块聚集体之前有报道(Madasamy, 2009, USPTO申请号码：20090104121)。简言之，1 mg的荧光标记的胆固醇或胆固醇衍生物(Ex/Em = 495nm/507nm)
溶解于1 mL的100%醇中。从该储存溶液中取100μL并混合于900μL的PBS中。酯化了
的胆固醇分子从有机介质(醇)转移至PBS缓冲液导致单个分子转变为胆固醇斑块聚集体
(0 hr)。样品在5000 rpm离心5 min以除去沉淀(如有)，含有可溶性聚集体的上清液被用
于斑块阵列试验。

[0069] 随后，1-10μg的荧光标记的胆固醇斑块聚集体在37℃温育24小时以分析在不存在任何添加的生物流体的情况下斑块颗粒的自行形成。利用流式细胞仪分析斑块聚集体(0
hr)和自行形成的斑块颗粒(24 hr)。图3(上方一行)显示了荧光标记的胆固醇自行形成
的斑块颗粒的点状图。上方一行：左图是荧光标记的胆固醇斑块聚集体(0 hr)。中间和右
图分别是由荧光标记的胆固醇斑块聚集体在24 hr温育期间合成的自行形成的斑块颗粒的
二维点状图和一维柱状图。此处检测到的颗粒被命名为自行形成的斑块颗粒，因为它们的
合成发生在未添加来自对象的生物流体的情况下。结果显示，胆固醇斑块聚集体未在流式
细胞仪中检测到，而在37℃温育24 hr的斑块聚集体形成了可检测的自行形成的斑块颗粒。
这些数据表明，斑块聚集体(0 hr)在性质上是可溶的，因而当它们在样品采集过程中通过
流式细胞仪的荧光检测器时未被有效检测到。相反，当它们在37℃时温育24 hr时，它们自
身聚集在一起并在缺少生物流体的情况下转变成被流式细胞仪检测到的自行形成的斑块
颗粒。

[0070] 随后，为制备荧光标记的磷脂质(LS)斑块聚集体，1 mg的荧光标记的磷脂质或其衍生物(Ex/Em = 495nm/507nm)被溶解在1 mL的100%醇中。从该储存溶液中取100μL并
混合于900μL的PBS中。样品在5000 rpm离心5 min以除去沉淀(如有)，含有可溶性聚集
体的上清液被用于斑块阵列试验。酯化了的磷脂质分子从有机介质(醇)转移至PBS缓冲
液导致这些分子转变为磷脂质斑块聚集体。要注意的是，当胆固醇或脂质分子转变成可溶
性或不溶性聚集体时，它们获得了新的构象(Stapronos et al 2003; McCourt et al 1997)，
因而所产生的斑块聚集体在结构上不同于它们的可溶形式。随后，1-10 μg的荧光标记的
磷脂质斑块聚集体在37℃温育24小时以允许在不存在任何添加的生物流体的情况下自行
形成的斑块颗粒的合成。使用流式细胞仪检测斑块聚集体(0 hr)和自行形成的斑块颗粒
(24 hr)。

[0071] 图3中间一行：左图是荧光标记的磷脂质斑块聚集体(0 hr)。中间和右图分别是由荧光标记的磷脂质斑块聚集体在24 hr温育期间合成的自行形成的斑块颗粒的二维点状
图和一维柱状图。图3底部一行显示的实验结果是：利用荧光标记的Abeta-42代替该实施
例中的胆固醇实验中使用的荧光标记的胆固醇以及利用36 hr的温育时间代替24 hr。

[0072] 总言之，这些结果显示，0 hr Chl、LS和Abeta-42斑块聚集体是可溶的，因而通过流式细胞仪未有效检测到。但是，当它们在37℃温育24 hr或更长时间时，它们相互作用并
变成了可被流式细胞仪检测到的不溶性斑块颗粒(图3)。

[0073] 实施例3 –利用荧光标记的胆固醇(Chl)聚集体来筛选血清样品的斑块阵列制备出不同组合的荧光标记的斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒，以模拟动脉粥样硬
化的不同阶段，并用于筛选人血清和血浆样品。对于每个使用荧光标记的斑块聚集体的试
验，来自动脉粥样硬化对象和正常健康对象的血浆或血清样品都首先在5000 rpm离心5
min，上清液被转移至新的离心管。随后，上清液在PBS中被稀释，以获得50%的血清和血浆
样品，并用于处理斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒，以检查是否出现体外斑块颗粒合成。

[0074] 每个试验在200 μL反应物中进行(100 μL 50%血浆或血清)和100 µL (10 µg)的Chl斑块聚集体)，混合物在37℃温育1 hr。温育后，300 µL鞘液(sheath fluid)被加
入至该混合物，该样品被用于流式细胞仪中采样(每分钟1-2000个事件/颗粒)。图4A显
示了利用在不同条件下温育的荧光标记的胆固醇斑块聚集体(0 hr)的流式细胞术分析的
终点试验的结果。图A显示了1 hr温育后的斑块聚集体(对照)。图B显示了与来自正常
对象的血清温育1 hr后的斑块聚集体(对照)。图C – F显示与来自四位不同动脉粥样硬
化对象的血清温育1 hr后的斑块聚集体的结果。

[0075] 与对照相比，与动脉粥样硬化对象的血清样品的温育物产生了明显更大数量的斑块颗粒。我们推断，动脉粥样硬化对象的血清的存在加速了由斑块聚集体向斑块颗粒的合
成。

[0076] 我们进行了时间进程研究，以监测在存在和不存在动脉粥样硬化对象血清的情况下的斑块颗粒的形成。在与血清一起温育荧光标记的胆固醇斑块聚集体(0 hr)后，在不同
时间点收集样品，并用于流式细胞仪中的采样(每分钟1-2000个事件/颗粒)。图4B绘制
出了斑块颗粒数量(y轴)和时间(x-轴)的相对关系：与来自正常对象的血清温育的荧光
标记的胆固醇斑块聚集体(菱形)；与动脉粥样硬化对象的血清温育的荧光标记的胆固醇
斑块聚集体(三角形、叉形和方块)。

[0077] 该点状图显示，与正常对象相比，在与动脉粥样硬化对象的血清的温育物中形成了明显更大量的斑块颗粒。此外，时间进程显示样品中形成的斑块颗粒的数量从0至24 hr
随着时间变化而增加，并且在不同时间点被分析。

[0078] 这些结果表明，具有已知动脉粥样硬化相关心血管疾病病史的患者的血清样品含有“催化”由斑块聚集体向斑块颗粒的体外形成的因子。在对照中，检测到少量的斑块颗粒，
表明正常对象的血清样品可能缺少促成斑块颗粒形成的因子，或含有抑制体外斑块颗粒形
成的因子。要注意的是，人血清或血浆是一种复杂的生物学流体，在一个给定的时间点，其
7
含有约289种蛋白质和10 个不同的循环的免疫球蛋白(Molina H et al, 2005)。斑块颗粒
的加速形成可能是由于斑块聚集体与许多分子结合而导致的，包括存在于动脉粥样硬化对
象的血清中的蛋白质、抗体、脂质、碳水化合物、金属和代谢物。显得可能的是，涉及体外斑
块颗粒的形成或集合的物质可能是特异性的，且与体内动脉粥样硬化斑块发展相关。

[0079] 实施例4 –利用荧光标记的胆固醇斑块颗粒的斑块阵列方法接下来，通过在37℃温育胆固醇斑块聚集体(0 hr)24小时制备的荧光标记的胆固醇自
行形成的斑块颗粒被与血清样品一起温育。作为对照实验，荧光标记的胆固醇斑块颗粒在
PBS中在不存在血清的情况下温育。每个体外斑块颗粒形成试验在200 µL反应物(100 µL
50%血浆或血清，和100 µL(10 µg)的荧光标记的胆固醇自行形成的斑块颗粒)中进行，并
且混合物在37℃温育1 hr。温育后，向混合物中添加300 µL鞘液，在流式细胞仪中分析样
品。

[0080] 图5. PAM1、PAM2等是患有动脉粥样硬化的对象。图A显示了自行形成的斑块颗粒，而图B显示了自行形成的斑块颗粒与动脉粥样硬化对象的血清温育1 hr的结果。点状
图分析显示，不同于斑块聚集体(0 hr)，胆固醇自行形成的斑块颗粒(24 hr)在对照图A中
是可检测的。有趣的是，在动脉粥样硬化对象的血清中温育的胆固醇自行形成的斑块颗粒，
与对照相比，显示出明显更大数量的斑块颗粒。这些结果与之前观察到的结果有很好的一
致性，表明动脉粥样硬化对象的血清样品含有加速斑块颗粒集合的分子。

[0081] 实施例5 –利用荧光标记的磷脂质(LS)斑块聚集体的斑块阵列接下来，为进一步检查Chl-斑块聚集体中观察到的加速的斑块颗粒合成是否是独特
的机制还是对于其他脂质斑块聚集体也一样，制备了荧光标记的LS-斑块聚集体并用于筛
选稀释的人血清和血浆样品。利用从发现有动脉粥样硬化症状的对象和正常健康对象中收
集到的血清样品进行实验。作为对照实验，荧光标记的斑块聚集体在PBS中温育并且不用
血清处理。每个体外斑块颗粒形成试验在200 µL反应物(100 µL 50%血浆或血清，和100
µL(10 µg)的LS-斑块聚集体)中进行，并且混合物在37℃温育1 hr。温育后，向混合物中
添加300 µL鞘液，通过流式细胞术分析样品。

[0082] 如图6所示，患者1、2、3和4是动脉粥样硬化对象。图A显示了温育1 hr的荧光标记的磷脂质斑块聚集体。图B显示与正常对象的血清温育1 hr的荧光标记的磷脂质斑块
聚集体。图C – F显示与来自四位不同的动脉粥样硬化对象的血清温育1 hr的荧光标记
的磷脂质斑块聚集体的结果。

[0083] 点状图分析显示，如之前在胆固醇斑块聚集体中所观察到的，磷脂质斑块聚集体未通过流式细胞术被检测到(图6，图A)。有趣的是，与动脉粥样硬化对象的血清温育的
磷脂质斑块聚集体，相比于与正常对象的血清温育的情况，显示出明显更大量的斑块颗粒
(图C-F)。如之前Chl斑块聚集体中所观察到的，这些结果整体上强有力地表明，动脉粥样
硬化患者的血清样品含有促成由相应斑块聚集体向Chl和LS-斑块颗粒的加速形成的分
子。

[0084] 实施例6 –利用IgG-缺失的血清接触荧光标记的胆固醇斑块聚集体的斑块阵列体内动脉粥样硬化斑块含有免疫球蛋白亚型IgG、IgM和IgA，它们与脂质和胆固醇沉
积物共定位。但是，它们在动脉粥样硬化的表现中的作用尚未完全被理解(Hannson G et
al, 1984)。我们之前已发现了动脉粥样硬化对象的血清样品中结合至自行形成的斑块聚
集体的抗体(Madasamy S, 2009, USPTO申请号码：20090104121)。实施例3至5中描述的
结果证实，动脉粥样硬化对象的血清含有促成增强的体外斑块颗粒形成的因子。

[0085] 为了鉴定出免疫球蛋白在体外斑块颗粒形成中的作用，利用胆固醇斑块聚集体来检查动脉粥样硬化对象的IgG缺失的血清。IgG-缺失的血清通过在用蛋白质A和蛋白A/
G预涂布且用封闭缓冲液预封闭的微滴定板中温育(RT，1 hr)稀释的血清而制备。温育后，
筛选出能够加速斑块聚集体的体外斑块颗粒形成的血清上清液。每个试验在200 µL反应物
(100 µL 的终浓度为25%的稀释血清，和100 µL的聚集体)中进行，并且混合物在37℃温育
1 hr以实现体外斑块颗粒形成。向混合物中添加鞘液(300 µL )，通过流式细胞术分析样品
以检测和计数斑块颗粒。

[0086] 图7显示荧光标记的胆固醇斑块聚集体温育1 hr的流式细胞分析结果：(左)与动脉粥样硬化对象的血清温育；(中)与用蛋白质A/G预处理的动脉粥样硬化对象的IgG缺
失血清温育；(右)与用蛋白质A预处理的动脉粥样硬化对象的IgG缺失血清温育。IgG缺
失血清样品显示，与未用蛋白质A/G处理以实现IgG缺失的各对照血清相比，所形成的斑块
颗粒的数量明显减少。IgG缺失的动脉粥样硬化血清样品的点状图分析显示，斑块颗粒形成
降低了~5-50%，表明了抗体在斑块颗粒形成中的作用(表2)。

[0087] 艾尔兹海默症的血管性痴呆的进展中涉及到异常的胆固醇代谢(Umeda T, et al,2012)。越来越多的证据显示，胆固醇和Abeta肽的受损的代谢之间存在很强的关联性，并
且它们一起在血管性痴呆的进展中起到作用(Pac-Soo C, et al, 2011)。虽然这些血清样品
是从具有已知动脉粥样硬化病史的对象中收集的，但我们决定检查这些对象是否具有任何
淀粉样斑块相关疾病。为此，如之前所进行的，利用Abeta-42聚集体筛选这些血清样品，对
所产生的点状图数据进行分析显示，~20%的动脉粥样硬化对象相比于对照是Abeta-42斑
块颗粒阳性的(表2)。总言之，这些结果强有力地表明，利用不同类型的斑块聚集体或自
行形成的斑块颗粒，斑块阵列方法可成功地用于识别和分类动脉粥样硬化和AD对象。

[0088] 表2. 利用斑块阵列进行的血清样品的斑块颗粒形成的动脉粥样硬化筛选的汇总动脉粥样硬化血清样品 胆固醇斑块颗粒* 脂质斑块颗粒* Abeta-42斑块颗粒* 蛋白质A/G处理的-IgG缺失血清. 胆固醇斑块颗粒*患者1 1340 420 640 760
患者2 960 1600 0 420
患者3 300 100 0 60
患者4 80 100 0 40
患者5 800 560 0 480
患者6 1940 900 100 820
患者7 880 800 0 300
患者8 280 180 0 220
患者9 280 200 0 40
患者10 140 80 0 100
患者11 860 640 440 280
患者12 560 480 0 480
患者13 1860 1560 0 740
患者14 980 680 0 520
正常1 40 40 0 20
正常2 20 0 20 0
正常3 20 0 0 40
正常4 0 20 0 20
表中所示的斑块颗粒的数量为25µL血清样品获得的：斑块颗粒数量×40 = 所形成的
斑块颗粒的总数/mL。血清样品收集自具有支架固定的、CT扫描阳性和/或心肌梗塞病史
的对象。

[0089] 这些是动脉粥样硬化对象或患者。在本文公开的动脉粥样硬化相关实施方式的意义上来说，正常对象没有这种已知病史。

[0090] 实施例7 –将动脉粥样硬化小鼠模型的血清样品用于体外胆固醇斑块颗粒形成的斑块阵列方法
利用动脉粥样硬化小鼠模型，携带ApoE-基因突变的小鼠以及相同年龄组的正常
C57BL/6小鼠从8周至20周被喂以致动脉粥样硬化饮食。在不同时间点收集的血清样品被
用于基于荧光标记的胆固醇斑块聚集体的体外斑块颗粒形成来检测疾病进展。图8显示，
荧光标记的胆固醇颗粒聚集体与血清样品温育1 hr后的流式细胞检测结果，血清样品是从
ApoE-小鼠(上方一行)和C57BL/6-小鼠(下方一行)在：(从左至右)8周、12周、16周
和20周采集的。结果表明，在ApoE突变小鼠在12周的时间内采集的血清样品与胆固醇斑
块聚集体的温育物中，形成的胆固醇斑块颗粒的数量逐渐增加。在对照的以致动脉粥样硬
化饮食喂养的正常C57BL/6小鼠中，观察到相对少的数量的斑块颗粒。总言之，这些结果显
示，斑块阵列方法可成功地用于测定动脉粥样硬化小鼠模型中的体内变化。

[0091] 纵观之，利用荧光标记的Chl-斑块和LS-斑块聚集体或自行形成的斑块颗粒并结合使用血清样品或其他生物流体的斑块阵列方法，提供了一种新的血清学诊断测试，其帮
助测定和表征来自已知和未知对象的血清样品。一般来说，血清学试验可用于评价高风险
个体以及利用其他诊断方法获得的数据来补充风险分析以利于最终做决定。促进斑块颗粒
形成的血清分子的滴定度在较长的动脉粥样硬化斑块发展的窗口期内可能具有独特的升
降模式。最后，使用这种斑块阵列方法显著地帮助快速诊断有症状的个体，并且在疾病发展
的早期阶段采取合适的预防措施。

[0092] 实施例8 –利用荧光标记的Abeta-42斑块聚集体的斑块阵列该实施例的目的是检查来自患有AD的对象的血清是否加速由Abeta-42聚集体向斑块
颗粒的合成。为制备荧光标记的Abeta-42聚集体，1 mg的荧光标记的Abeta-42肽被悬浮
于1 mL的PBS中，该样品在37℃温育6 hr。样品在5000 rpm离心5 min以除去沉淀(如
有)，含有聚集体的上清液被用于斑块阵列试验。类似地，为制备未标记的Abeta-42聚集
体，1 mg的Abeta-42肽被悬浮于1 mL的PBS中，样品在37℃温育6 hr。对于Abeta-28聚
集体制备，1 mg的Abeta-28被悬浮于1 mL的PBS中，样品在37℃温育6 hr。

[0093] 通过温育6 hr制备的Abeta聚集体通过流式细胞仪未能检测到，而通过在37℃温育36-48 hr的自行形成的Abeta颗粒可通过流式细胞仪检测到。这表明聚集体的延长的温
育导致在不存在生物流体的情况下自行形成斑块颗粒(表3，下方一行)。因此，下述试验
利用Abeta聚集体进行。每个试验在200 µL的反应物(100µL终浓度为25%的稀释血清，和
100 µL (10 µg)的聚集体)中进行，混合物在37℃温育1 hr以实现体外斑块颗粒形成。对
于含有未标记的Abeta-42或Abeta-28聚集体的样品，在与稀释血清温育后，加入10µL的
Thioflavin S (Ex/Em = 430nm/550nm)荧光染料(10µg)，样品在37℃温育额外的30 min。温
育之后，向混合物中加入300 µL鞘液，样品用于流式细胞仪中采样(1-2000 个事件/颗粒
/min)。

[0094] 如图9所示，图A显示了温育了6 hr的荧光标记的Abeta-42斑块聚集体(对照)。图B显示了与来自正常对象的血清温育1 hr的荧光标记的Abeta-42斑块聚集体(对照)。
图C显示了与患有AD的不同对象的血清温育1 hr的荧光标记的Abeta-42斑块聚集体的结
果。有趣的是，与患有AD的对象的血清样品温育的Abeta-42斑块聚集体，相比于对照反应
体系，显示出产生明显更大量的斑块颗粒。

[0095] 实施例9 –利用Abeta-42、Abeta-28和胆固醇斑块聚集体来筛选AD血清样品的斑块阵列
接下来，利用三种不同的斑块聚集体筛选患有AD的对象的血清样品，以确定这些患者
中斑块颗粒形成的模式。根据以上实施例8描述的方案，利用Abeta-42、Abeta-28和胆固醇
斑块聚集体来测试患有AD的对象的血清的体外斑块颗粒形成。如图10A所示：上方一行：
未标记的Abeta-42肽斑块聚集体与来自三位AD对象的血清温育1 hr。向该混合物中，加入
Thioflavin S，混合物再温育30 min。所产生的产物的流式细胞分析显示，来自AD对象的血
清加速斑块颗粒的形成；下方一行：显示了使用未标记的Abeta-28斑块聚集体代替未标记
的Abeta 1-42斑块聚集体的相应实验的结果。如图10B所示：荧光标记的Abeta-42(左)、
Abeta-28肽(中)和胆固醇(右)斑块聚集体与来自AD对象的血清温育1 hr。所产生的
产物的流式细胞分析显示，在Abeta-42和Abeta-28斑块聚集体中形成了可检测的斑块颗
粒。点状图分析显示，即使使用了单个患者样品，Abeta-42和Abeta-28所产生的斑块颗粒
的数量明显不同(图10A和10B)。

[0096] 这些结果表明，每个患者血清形成了不同水平的淀粉样斑块和动脉粥样硬化斑块颗粒形成，这又可能决定了多种斑块相关疾病的发展和进程。体外斑块颗粒形成的模式可
被用来区分患有Abeta相关痴呆或血管性痴呆的患者(分别由Abeta肽和胆固醇的异常代
谢引起)。这些结果与我们之前关于动脉粥样硬化斑块颗粒形成所观察到的结果保持很好
的一致性，表明患有AD的对象的血清样品含有催化体外斑块颗粒形成的分子。

[0097] 实施例10：利用AD对象的抗体缺失血清样品的斑块阵列免疫系统在AD和相关神经炎症的发展中的作用已有充分论述(Maetzler W, et al,
2011: Hou H, et al, 2012)。实施例9中描述的结果证实，AD对象的血清样品含有促成增
强的体外斑块颗粒形成的因子。为了发现免疫球蛋白在体外斑块颗粒形成中的作用，使用
Abeta-42聚集体来检查Abeta阳性对象的IgG缺失的血清样品。对于抗体反应试验，通过
在用蛋白质A和蛋白A/G预涂布且用封闭缓冲液预封闭的微滴定板中温育(RT，1 hr)稀释
的血清而制备IgG-缺失的血清。温育后，血清上清液与Abeta-42斑块聚集体温育，并确定
了体外斑块颗粒形成。每个试验在200 µL反应物中进行，并且混合物在37℃温育1 hr。向
混合物中添加鞘液(300 µL)，样品通过流式细胞术分析，以检测和计数斑块颗粒。

[0098] 温育1 hr的未标记的Abeta-42斑块聚集体的流式细胞分析：(左)与AD对象的血清温育；(中)与IgG缺失血清温育，即AD对象的用蛋白质A/G预处理的血清；(右)与
IgG缺失血清温育，即AD对象的用蛋白质A预处理的血清。利用Thioflavin S染料检测斑
块颗粒。观察到，与未用蛋白质A/G处理以实现IgG缺失的各对照相比，IgG缺失血清样品
显示出明显减少的斑块颗粒形成数量(图11)。在所测试的多个IgG缺失AD血清样品中，
观察到不同水平的斑块颗粒形成的减少(~5-50%)，表明抗体在斑块颗粒形成中的作用(表
3)。来自IgG缺失血清研究和体外Abeta-42、Abeta-28和胆固醇颗粒形成的数据，为斑块
阵列方法用于诊断AD和动脉粥样硬化提供了临床验证。

[0099] 表3. 利用斑块阵列进行血清样品的体外斑块颗粒形成的AD筛选汇总表中所示的斑块颗粒的数量为25µL血清样品获得的：斑块颗粒数量×40 = 所形成的
斑块颗粒的总数/mL。血清样品收集自具有轻度认知功能障碍(1-6)和AD(7-14)病史的患
者。这些是AD对象。表3中的正常对象以及在本文公开的其他AD相关实施方式不具有这
些症状。

[0100] 实施例11 –利用AD小鼠模型检测体内Abeta-42斑块形成的斑块阵列携带APPSWE/PS-1突变基因的AD小鼠模型以及相同年龄段的C57BL/6正常小鼠从8
周到20周被喂以正常饮食。使用在不同时间点收集的血清样品来检测斑块进展(利用斑
块阵列方法)。Abeta-42斑块聚集体被用来利用来自AD模型小鼠和正常小鼠的血清样品
来检查体外斑块颗粒形成。结果显示，从第8周到第20周收集的AD小鼠模型血清样品的
Abeta-42斑块颗粒形成的数量逐渐增加。相比于AD小鼠模型，对照小鼠或正常小鼠中观察
到少量的斑块颗粒形成(图12)。如之前动脉粥样硬化小鼠模型中观察到的，其他动物的血
清样品可被用来利用斑块阵列方法检测体内淀粉样斑块发展的状态。

[0101] 实施例12 –用于检测体外Abeta-42斑块颗粒形成的结合FRET的斑块阵列荧光共振能量转移(FRET)是一种广泛用于研究生物分子间相互作用的多用途生化方
法(Selvin PR 2000)。为进一步检查斑块聚集体的自行集合过程以及它们在缺少生物流体
的情况下向自行形成的斑块颗粒的转变，进行了以下实验。上述实施例证实了荧光标记的
斑块聚集体彼此相互作用或自行集合，导致形成自行形成的斑块颗粒(即使速度缓慢)(图
3)。相反，当荧光标记的斑块聚集体与动脉粥样硬化或AD患者的血清样品温育时，观察到
了加速的体外斑块颗粒形成。基于这个观察结果，开发出了结合FRET的斑块阵列，以用于
检测自行形成的斑块颗粒形成。

[0102] 对于FRET试验，我们使用了标记了荧光团的供体Abeta-42聚集体(Ext/Emi=485/520)，以及标记了另一种荧光团的受体Abeta-42斑块聚集体(Ext/Emi= 540/570)。当
供体Abeta-42聚集体的荧光团在485 nm被直接激发时，一部分能量被受体Abeta-42获得，
随后供体荧光团在570 nm波长处发射。明显地，这种能量转移仅在两种染料空间上非常靠
近(通常少于100 Å)时才发生，因而信号的强度取决于供体和受体之间的相互作用程度。

[0103] 如图13A所示，两种不同浓度(1= 2µg斑块聚集体；2= 1µg斑块聚集体)的荧光标记的Abeta-42斑块聚集体在37℃与PBS(左侧条形图)和AD对象的血清(右侧条形图)
温育30 min。在485 nm处激发，分别在520 nm和570 nm处检测到发射。左栏代表供体分
子的荧光的发射检测(570 nm处)，中间栏代表不存在供体时受体分子的荧光发射(570 nm
处)，右栏代表存在供体时受体分子的荧光发射(570 nm处)。

[0104] 在对照FRET实验中，标记由两种不同荧光团的Abeta-42斑块聚集体在于PBS样品中温育时会随时间变化自行集合成斑块颗粒，导致在终点FRET试验中产生某些信号。在
存在AD对象的血清的情况下，由Abeta-42斑块聚集体形成Abeta-42斑块颗粒的速度明显
加快，因而在终点FRET试验中检测到了增强的水平的信号(图13A)。因此，利用基于FRET
的斑块阵列筛选血清样品，将会基于与正常和对照试验相比的增加的FRET信号而帮助识
别AD对象。

[0105] 实施例13 –用于检测体外斑块颗粒形成的结合FRET的斑块阵列如图3所示，在缺少血清的情况下，荧光标记的胆固醇聚集体温育24 hr导致产生自行
形成的斑块颗粒。对于动脉粥样硬化FRET试验(如实施例12所示)，在存在PBS或正常对
象的血清的情况下，两种不同(供体和受体)荧光标记的胆固醇斑块聚集体的温育导致聚
集体之间的相互作用降低，因而产生较少的斑块颗粒和较少的FRET信号。相反，在存在动
脉粥样硬化对象的血清的情况下，两种荧光标记的胆固醇聚集体的温育导致形成增加的斑
块颗粒，因而产生比对照明显更高的FRET信号(图13B)。因此，利用基于FRET的斑块阵列
筛选血清样品，将会基于增加的FRET信号来辅助识别动脉粥样硬化对象。

[0106] 为开发出一种组合FRET试验，以利用一对斑块聚集体来筛选AD和动脉粥样硬化血清样品，供体Abeta-42斑块聚集体被标记有荧光团(Ext/Emi= 485/520)，而受体胆固醇
斑块聚集体被标记有另一种荧光团(Ext/Emi= 540/570)。在这种情况下，当供体Abeta-42
聚集体的荧光团在485 nm处被直接激发时，一部分激发能量被受体胆固醇获得，随后供体
染料在570 nm波长处发射。在对照FRET试验中，标记有不同荧光激发/发射的荧光团的
Abeta-42斑块和胆固醇聚集体，当在PBS或正常血清样品中温育时，彼此相互作用，导致产
生较少的斑块颗粒和较少的FRET信号。当存在AD或动脉粥样硬化血清样品时，Abeta-42斑
块聚集体之间的相互作用被加速，以形成更大数量的斑块颗粒，其又导致产生增强的FRET
信号。因此，利用组合FRET试验来筛选血清样品，将帮助识别无症状的动脉粥样硬化和AD
对象。

[0107] 实施例14 –用于识别亚型和表型分析的体外Abeta-42斑块颗粒的成像接下来，为进一步理解血清样品增强的斑块颗粒集合的机制，分析了体外形成的
Abeta-42斑块颗粒的图像。因此，为捕获单个Abeta-42斑块颗粒的图像，AD对象的血清样
品和Abeta-42斑块聚集体(6 hr)被在37℃温育1 hr。在于稀释的血清温育后，加入10µL
的Thioflavin S (Ex/Em = 430nm/550nm)荧光染料(10µg)，样品在37℃温育额外的30 min。
温育后，利用成像流式细胞仪(Amnis Corporation, Seattle, WA, USA)获得Abeta-42斑
块颗粒的图像。斑块颗粒的图像分析显示，至少有三种不同尺寸的Abeta-42斑块颗粒(图
14A)。此外，图像分析显示，小尺寸(1-3µ)Abeta-42斑块颗粒的数量高于观察到的中等
(5-10µ)和大尺寸(25-50µ)斑块颗粒的数量。

[0108] 实施例15 –用于识别亚型和表型分析的体外动脉粥样硬化斑块颗粒的成像为进一步理解斑块颗粒在血清样品中的集合的机制，分析了体外斑块颗粒的图像。因
此，为捕获单个胆固醇斑块颗粒的图像，动脉粥样硬化对象的血清样品与荧光标记的胆固
醇斑块聚集体在37℃温育1 hr。所产生的样品通过成像流式细胞仪获得，点状图分析显示，
与血清样品温育产生了三种主要类别的胆固醇斑块颗粒(图14B)。图像分析显示，小尺寸
(1-3µ)的胆固醇斑块颗粒的数量高于所观察到的中等(5-10µ)和大尺寸(25-50µ)斑块颗
粒的数量。重要的是，要注意到在体内动脉粥样硬化斑块核心内部，胆固醇颗粒有三种不同
的尺寸，例如小球粒(3-5µ)、细长结构体(10-30µ)和大的不规则沉淀物(100µ) (Sarig S,
et al, 1994)。总言之，这些结果表明，体外斑块颗粒以及它们的亚种群的成分可被用作生
物标记物来确定无症状和有症状动脉粥样硬化和AD对象的疾病进展进程。

[0109] 实施例16 –不同类型/尺寸的胆固醇和磷脂质斑块颗粒的识别接下来，为进一步确认表明胆固醇和磷脂质斑块颗粒的结果(实施例14和15)，进行
了下述实验。如之前在实施例4至8中所提及的，制备了荧光标记的胆固醇和磷脂质斑块
聚集体，并用于与稀释的人动脉粥样硬化血清温育。在前述实施例(实施例4至8)中，利
用流式细胞仪对含有体外形成的胆固醇和磷脂质斑块颗粒的样品进行采样以实现每分钟0
至2000个事件/颗粒的检测。在本试验中，为识别稀有的/所有类别的斑块颗粒，在流式
细胞仪中采样更大的样品量，以每分钟捕获超过10000个事件/斑块颗粒。

[0110] 如图15A所示，上方一行：胆固醇斑块颗粒显示与R4区的设门的(gated)点状图：胆固醇斑块聚集体在缺少血清情况下温育1 hr(左边，第一图)，胆固醇斑块聚集体在缺少
血清情况下温育48 hr(左边，第二个点状图)。在从左边数的第三个点状图中，在R1、R2、
R3和R4区内可发现有不同群体的颗粒。R4区在数据采集图中被识别为感兴趣区域，设门
(gating)使得可以收集与正常对象的血清温育1 hr的这些颗粒和胆固醇斑块聚集体(右
边)。

[0111] 如图15A所示，下方一行，从左至右：与正常对象的血清温育1 hr的胆固醇斑块聚集体，以及与动脉粥样硬化对象的血清温育1 hr的胆固醇斑块聚集体的三个图。所产生的
样品采集的点状图分析显示，在动脉粥样硬化对象的血清样品中形成有三种主要类别的胆
固醇斑块颗粒(图15A)。在这三种类别中，与正常对象相比，在门R4中发现的斑块颗粒在
动脉粥样硬化对象中显示出高达500倍的变化。斑块颗粒的总数量以及在设门的点状图中
检测到的胆固醇斑块颗粒的亚型，共同作为生物标记物，以辅助预测体内动脉粥样硬化疾
病起源和进展的进程。

[0112] 类似地，为识别磷脂质斑块颗粒的稀有/所有类别，在流式细胞仪中采集更大的样品量，从而每分钟捕获大于10000个事件/斑块颗粒。

[0113] 如图15B所示，上方一行：在缺少血清的情况下温育1 hr的磷脂质斑块聚集体(左边，第一图)、在缺少血清的情况下温育48 hr的磷脂质斑块聚集体(左边，第二个点状图)。
在从左侧数第三个点状图中，在区域R1、R2、R3和R4中可发现不同群组的颗粒。R1区在数
据采集图中被识别为感兴趣区域，并且设门使得可以收集与正常对象的血清温育1 hr的这
些颗粒和胆固醇斑块聚集体(右边)；下方一行，从左至右：与正常对象的血清温育1 hr的
磷脂质斑块聚集体，和与动脉粥样硬化的对象的血清温育1 hr的磷脂质斑块聚集体的三个
图。点状图分析显示，在动脉粥样硬化对象的血清样品中形成有两种主要类别的磷脂质斑
块颗粒。在这两种主要类别中，与正常对象相比，点状图的门R1中发现的斑块颗粒在动脉
粥样硬化对象中显示出高达500倍的变化。斑块颗粒的总数量以及在设门的点状图中所示
的磷脂质斑块颗粒的亚型，共同作为生物标记物，以辅助预测体内动脉粥样硬化疾病的进
程。

[0114] 从多个斑块阵列分析(例如检测加速的斑块颗粒形成、计数斑块颗粒数量、抗体在斑块颗粒形成中的作用、利用成像技术的斑块颗粒的表型分析以及斑块颗粒亚型的识
别)收集的数据共同帮助开发出“斑块指纹分析”(PF)。“斑块指纹分析”的应用包括临床
诊断、开发特定药物的同伴诊断(companion diagnosis)、以及开发用于斑块相关疾病(包
括AD和动脉粥样硬化)的对象的个性化医疗。

[0115] 前述实施例强有力地表明，基于加速的斑块颗粒形成，有症状和无症状的淀粉样疾病(包括艾尔兹海默症和动脉粥样硬化病)的个体都可利用这种非侵入性的斑块阵列方
法被快速诊断。本发明预期，加速的斑块颗粒形成的模式在正常个体和疑似个体之间会不
同，比较他们的模式会帮助非侵入性地诊断患者并且预测AD和动脉粥样硬化斑块发展的
严重程度。最后，利用斑块阵列方法检测无症状个体将帮助在早期识别可疑的无症状个体，
并以适当疗法治疗他们。

[0116] 实施例17 –利用斑块阵列方法筛选噬菌体展示cDNA文库和肽文库以识别先导候选药物
之前的实施例清楚地证明，动脉粥样硬化和艾尔兹海默症对象的血清样品含有促成斑
块颗粒加速形成的分子。因此，生物流体中体外斑块颗粒形成的机制以及促成该过程的因
子都是药物发现的潜在靶标。被发现会破坏、加速、或抑制这些过程的任何药物或类似药物
的分子都会是用于治疗动脉粥样硬化和其他淀粉样斑块相关疾病的新的治疗候选物。

[0117] 药物发现的第一个目的是识别结合至斑块聚集体的分子，因而生物流体中斑块颗粒集合的启动可被改变。为此，利用人内皮细胞的噬菌体展示cDNA文库来进行筛选。为将
斑块颗粒结合至噬菌体文库，将荧光标记的胆固醇噬菌体聚集体(10µg)或Abeta-42斑块
6 6
聚集体(10µg)与cDNA文库(pfu 1x10)或噬菌体展示肽文库(pfu 1x10)混合。在37℃
温育30 min后，通过流式细胞术检测该样品。

[0118] 如图16所示：上方一行：以荧光标记的胆固醇斑块聚集体筛选的人内皮细胞的cDNA噬菌体文件(左图)；以荧光标记的胆固醇斑块聚集体筛选的人内皮细胞的肽噬菌体展
示文库(中间)；和荧光标记的胆固醇斑块聚集体(右图)。下方一行：以Abeta-42斑块聚集
体筛选的人内皮细胞cDNA噬菌体文库(左图)；以Abeta-42斑块聚集体筛选的人内皮细胞
的肽噬菌体展示文库(中间)；和Abeta-42斑块聚集体(右图)。点状图中显示阳性地结合
斑块聚集体的噬菌体克隆通过分类而自动分离，并用于进一步分析以识别结合分子的性质。

[0119] 可使用类似的方法来在筛选化学文库后成功识别小分子，并通过质谱法表征和识别阳性克隆。上述结果清楚地显示，斑块阵列是一种强有力的药物发现平台，可实现加快的
药物发现。而且，该平台能够使人筛选分子文库以识别新的抗动脉粥样硬化和抗淀粉样化
合物，该化合物可有效地破坏促成体外斑块颗粒形成的多种相互作用。因为该独特且新颖
的性质，基于斑块阵列的药物发现平台使得可以快速发现新的治疗形式以预防或治愈动脉
粥样硬化、艾尔兹海默症和其他斑块相关疾病。

[0120] 实施例18 –利用人上皮细胞的斑块聚集体或颗粒的集合为确定斑块成分和细胞之间的相互作用，荧光标记的斑块聚集体或自行形成的斑块颗
粒被与内皮细胞一起温育。为此，培养人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)以覆盖包含20 mL内皮
2
细胞生长培养基(ECGM)的75 cm 培养瓶。除去培养基后，从板上挂下细胞并用冰冷PBS缓
冲液洗涤一次。离心并细胞计数后，将HCAEC(500000)与荧光标记的Chl斑块聚集体(5µg)
和LS斑块聚集体(5µg)一起温育。在室温温育30 min后，通过流式细胞术检测斑块聚集体
处理的细胞。图17A)与HCAEC温育的荧光标记的胆固醇斑块聚集体的点状图，B)与HCAEC
温育的荧光标记的胆固醇斑块聚集体的点状图，C) 与HCAEC温育的荧光标记的胆固醇斑块
聚集体的柱状图，D) 与HCAEC温育的荧光标记的磷脂质斑块聚集体的点状图，E) 与HCAEC
温育的荧光标记的磷脂质斑块聚集体的点状图，F) 与HCAEC温育的荧光标记的磷脂质斑块
聚集体的柱状图。点状图和柱状图分析显示，荧光标记的Chl-斑块聚集体(图17A、B、C)
和LS-斑块聚集体(图17D、E、F)有效地结合至HCAEC。这些结果表明，斑块聚集体直接向
HCAEC的结合可能诱导了细胞的几种病理学变化，例如凋亡、DNA损伤和老化。

[0121] 实施例19 – HCAEC与Chl-LS以及CP-Chl-LS结合以检查凋亡接下来，为调查斑块聚集体与内皮细胞结合的后果，分析了受斑块影响的细胞的凋亡
情况。首先，按之前报道(Madasamy S, 2009, USPTO 申请号码：20090104121)制备了混合的
斑块聚集体，例如磷酸钙(CP)-Chl-LS和Chl-LS，并与HCAEC温育。作为对照实验，含钙的
混合斑块聚集体CP-Chl-LS被与Flu 3荧光染料温育，该染料特异性地结合至斑块聚集体
的钙部分。其次，斑块聚集体处理的细胞生长12 hr。除去培养基后，从平板上挂下细胞，并
用冰冷PBS缓冲液洗涤一次。离心和细胞计数后，利用荧光标记的膜联蛋白V (FITC)和碘
化丙啶(PI)荧光DNA结合染料来分析HCAEC的凋亡情况。在室温下温育20 min后，在流式
细胞仪中分选细胞。

[0122] 点状图分析显示，未用斑块聚集体处理的对照细胞没有显示出明显的凋亡(图18A)，而LS-Chl斑块聚集体处理的HCAEC显示出~15%的凋亡(图18B)，CP-Chl-LS斑块聚
集体处理的细胞显示出明显更高水平的凋亡(~94%)。该结论获得了膜联蛋白V试验的柱状
图的支持，其显示CP-Chl-LS处理的细胞有98%的凋亡(18D)，碘化丙啶试验的柱状图显示，
CP-Chl-LS处理的细胞有94%的凋亡(18E)。明显地，CP-Chl-LS斑块聚集体直接向HCAEC
的结合对细胞造成严重的病理学症状。这表明，动脉粥样硬化斑块聚集体向内皮细胞的体
内结合可能导致它们功能障碍，并且在动脉粥样硬化斑块的发展中导致死亡步骤。

[0123] 这种利用HCAEC或PBMC的斑块聚集体影响的细胞培养系统使得不同斑块亚型集合，以模拟动脉粥样硬化斑块亚型，例如含有高脂质含量的前期动脉粥样硬化(I至III
型)，和含有CP、Chl、脂质和纤维蛋白凝块的动脉粥样硬化型(IV和Va型)。识别阻止或
抑制斑块聚集体或斑块颗粒对HCAEC或PBMC的致病性作用的药物化合物，可以成为治疗动
脉粥样硬化和其他斑块相关疾病的成功的治疗候选物。此外，基于斑块的HCAEC和PBMC细
胞培养模型系统可被用来测试抗动脉粥样硬化药物或抗淀粉样药物的功效和安全性。

[0124] 其他公开文献1.Libby P, Ridker PM, Kansan GK (2011) Progress and challenges in translating
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