马铃薯栽培品种W8 |
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| 申请号 | CN201480080008.1 | 申请日 | 2014-06-17 | 公开(公告)号 | CN106455511A | 公开(公告)日 | 2017-02-22 |
| 申请人 | 杰·尔·辛普洛公司; | 发明人 | C·里克尔; H·严; J·拉斯马森; H·段; N·沙姆普雷; A·巴尔穆特; J·叶; | ||||
| 摘要 | 本 发明 披露称为W8的 马 铃薯栽培品种。本发明涉及马铃薯栽培品种W8的 块 茎、马铃薯栽培品种W8的 种子 、马铃薯栽培品种W8的 植物 和植物部分、由马铃薯栽培品种W8产生的食物产品以及通过使马铃薯栽培品种W8与自身或与另一种马铃薯种类杂交来产生马铃薯植物的方法。本发明还涉及用于产生转基因马铃薯植物的方法以及通过这些方法产生的转基因马铃薯植物和部分。本发明还涉及来源于马铃薯栽培品种W8的马铃薯植物和植物部分、用于产生来源于马铃薯栽培品种W8的其它马铃薯植物或植物部分的方法以及使用这些方法产生的马铃薯植物和其部分。本发明还涉及通过使马铃薯栽培品种W8与另一种马铃薯栽培品种杂交而产生的杂交马铃薯块茎、种子、植物以及植物部分。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种马铃薯栽培品种W8的马铃薯块茎或块茎的一部分，其中所述块茎的代表性样品以ATCC寄存编号PTA-121079寄存。 |
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| 说明书全文 | 马铃薯栽培品种W8背景技术[0001] 本发明涉及称为W8的新型马铃薯栽培品种以及由所述马铃薯种类产生的块茎、植物、植物部分、组织培养物和种子。本发明还涉及由马铃薯栽培品种W8产生的食物产品，如薯条、薯片、脱水马铃薯材料、马铃薯片以及马铃薯粒。本申请案中列举的所有公开案皆以引用的方式并入本文中。 [0002] 马铃薯是全世界第四重要的食物作物并且是目前为止最重要的蔬菜。目前几乎美国的每个州都商业种植马铃薯。在美国，每年马铃薯产量超过1800万吨并且全世界超过30000万吨。马铃薯的普及性主要来源于其变通性和营养价值。马铃薯可在新鲜时、冷冻或脱水后使用，或可加工成面粉、淀粉或酒精。其含有复杂的碳水化合物并且富含钙、烟酸和维生素C。 [0003] 食品工业中的马铃薯质量受两个关键因素的不利影响：(1)马铃薯含有大量天冬酰胺，一种在油炸或烘烤时会快速氧化形成丙烯酰胺(一种致癌产物)的非必需游离氨基酸；和(2)马铃薯极易发生酶促褐变和褪色(当多酚氧化酶从受伤的马铃薯的被破坏的质体渗漏时发生的不良事件)。在细胞质中，酶氧化苯酚，其接着快速聚合以产生黑色素。块茎含有大量磷酸化淀粉，其中一些在储存期间降解以产生葡萄糖和果糖。这些还原糖当在超过120℃的温度下加热时与氨基酸反应以形成包括丙烯酰胺的梅纳产物(Maillard products)。淀粉磷酸化中涉及的两种酶是水二激酶R1和磷酸化酶-L(R1和PhL)。褐变也作为淀粉部分降解成葡萄糖和果糖的结果而以非酶促方式触发。 [0004] 许多马铃薯栽培品种易患晚疫病，其是一种由真菌类卵菌纲病原体致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的破坏性疾病。马铃薯的晚疫病通过叶子和茎干上可快速扩散并且变得坏死的黑色/褐色病灶鉴别。当致病疫霉(P.infestans)在宿主作物上快速生长和繁殖时发生严重晚疫病传染性。 [0005] 迄今为止，不存在可产生具有低丙烯酰胺含量、增加的黑斑碰伤耐受性、降低的还原糖以及增加的对晚疫病的抗性的块茎的马铃薯植物种类。因此，需要研发具有降低的毒性化合物含量和增加的对疾病的抗性，而不使用未知的或外来核酸的马铃薯种类。本发明满足这种需要。 发明内容[0007] 结合系统、工具和方法描述以下实施例和其各方面，其意图是例示性，不限制范围。在各种实施例中，减少或消除一或多种上述问题，而其它实施例引导其它改良。 [0008] 为此目的，本发明提供经核酸序列转型的新型马铃薯种类W8，其对于马铃薯植物基因体来说是原生的并且不含外来DNA、农杆菌(Agrobacterium)DNA、病毒标记或载体主链序列。实际上，插入到马铃薯种类W8的基因体中的DNA对马铃薯来说是原生或对野生型马铃薯(一种马铃薯性相容植物)来说是原生的非编码聚核苷酸，其使涉及黑点损伤的表达、天冬酰胺聚集和衰老甜化的基因沉默。 [0009] 因此，在一个实施例中，本发明提供植物载体，称为pSIM1278，其包含第一沉默盒，所述第一沉默盒含有DNA区段的两个复本，其按反义定向包含天冬酰胺合成酶-1基因(fAsn1)的片段和多酚氧化酶-5基因的3'-非翻译序列；和第二沉默盒，其含有DNA区段的两个复本，其按反义定向包含马铃薯磷酸化酶-L(pPhL)基因的片段和马铃薯R1基因的片段。pSIM1278载体包含9,512bp主链区域，其支持植物转型作用之前植物DNA的维持并且在植物细胞的转型作用时不转移到植物细胞中，和10,148bp DNA插入区域，其包含在转型作用时稳定整合到植物细胞的基因体中的原生DNA。 [0010] 在另一实施例中，本发明提供第二植物载体，称为pSIM1678，其包含Rpi-vnt1表达盒和植物液泡转化酶基因VInv的沉默盒。Rpi-vnt1基因盒由VNT1蛋白质编码区组成，所述编码区由其原生启动子和终止序列调节以赋予对晚疫病的广泛抗性，而沉默盒由来自由相对植物启动子pGbss和pAgp侧接的马铃薯VInv基因的序列的反向重复组成。pSIM1678载体包含9,512bp主链区域，其支持植物转型作用之前植物DNA的维持并且在植物细胞的转型作用时不转移到植物细胞中，和9,090bp DNA插入区域，其包含在转型作用时稳定整合到植物细胞的基因体中的原生DNA。 [0011] 在不同的实施例中，本发明提供经一或多种本发明的植物载体转型的植物细胞。在另一实施例中，本发明提供马铃薯植物种类，其包含一或多个经本发明的载体转型的细胞。在本发明的一个方面中，马铃薯植物种类表达载体pSIM1278的两个沉默盒中的至少一个并且表达载体pSIM1678的沉默盒，并且沉默盒的表达引起植物的块茎中天冬酰胺合成酶-1基因、多酚氧化酶-5基因和液泡转化酶基因的下调。在本发明的优选方面中，表达至少一个沉默盒的马铃薯植物种类的块茎显示两种或更多种在相同种类的未经转型的植物的块茎中不存在的理想特性。在本发明的最优选方面中，所述两种或更多种理想是选自由以下组成的群组：低天冬酰胺聚集、黑点损伤减少、热诱导丙烯酰胺形成减少以及在储存期间还原糖的聚集减少。 [0012] 在本发明的不同方面中，马铃薯植物种类表达植物DNA载体pSIM1278的两个沉默盒，且表达载体pSIM1678的沉默盒，并且沉默盒的表达引起马铃薯植物种类的块茎中天冬酰胺合成酶-1基因、多酚氧化酶-5基因、磷酸化酶-L基因、二激酶R1基因和液泡转化酶基因的下调。在本发明的优选方面中，表达植物DNA载体pSIM1278的两个沉默盒和表达载体pSIM1678的沉默盒的马铃薯植物种类的块茎显示两种或更多种在相同种类的未经转型的植物的块茎中不存在的理想特性。在一个优选实施例中，所述两种或更多种理想特性是选自由以下组成的群组：低天冬酰胺聚集、黑点损伤减少、在储存期间还原糖的聚集减少和热诱导的丙烯酰胺形成减少。在本发明的一个方面中，表达植物DNA载体pSIM1278的两个沉默盒和植物DNA载体pSIM1678的沉默盒的马铃薯植物种类是褐色布尔班克(Russet Burbank)W8种类。 [0013] 在本发明的另一方面中，本发明的马铃薯植物种类W8表达植物DNA载体pSIM1678的晚疫病抗性基因(Rpi-vnt1)。在本发明的另一方面中，本发明的马铃薯植物种类W8具有增加的对晚疫病感染的抗性。 [0014] 因此，根据本发明，提供马铃薯(Solanum tuberosum L.)属和物种的一种新型马铃薯栽培品种，称为W8。因此，本发明涉及马铃薯栽培品种W8、马铃薯栽培品种W8的块茎、马铃薯栽培品种W8的植物、马铃薯栽培品种W8的种子、由马铃薯栽培品种W8产生的食物产品以及用于产生通过使马铃薯栽培品种W8自花授粉或通过使马铃薯栽培品种W8与另一种马铃薯栽培品种杂交而产生的马铃薯植物的方法，和通过马铃薯栽培品种W8的突变诱发或转型作用进行的变异体产生。 [0015] 因此，任何使用栽培品种W8的这类方法皆是本发明的实施例：自花授粉、回交、杂交产生、群交等。所有使用马铃薯栽培品种W8作为至少一种亲本产生的植物属于本发明的范围内。有利的是，马铃薯栽培品种可用于与其它不同的马铃薯植物杂交以产生具有优良特征的第一代(F1)马铃薯杂交块茎、种子和植物。 [0016] 在另一实施例中，本发明提供马铃薯栽培品种W8的单或多基因转化植物。在一个实施例中，转移的基因可以是显性或隐性等位基因。在一些实施例中，转移的基因将赋予如除草剂抗性、昆虫抗性、对细菌、真菌或病毒疾病的抗性、雄性繁殖力、雄性无菌性、营养质量增强、均匀性以及淀粉和其它碳水化合物的浓度增加、损伤趋势降低和淀粉转化成糖的速率降低等特性。基因可以是天然存在的马铃薯基因或通过遗传工程改造技术、回交或突变引入的转基因。 [0017] 在另一实施例中，本发明提供用于马铃薯栽培品种W8的组织培养物的可再生细胞。在一个实施例中，组织培养物将能够使具有前述马铃薯植物的所有生理学和形态特征的植物再生，以及使具有与前述马铃薯植物实质上相同的基因型的植物再生。在一些实施例中，这类组织培养物中的可再生细胞将是胚芽、原生质体、分生组织细胞、愈合组织、花粉、叶子、花药、雌蕊、子叶、下胚轴、根、根端、花、种子、叶柄、块茎、芽眼或茎干。再者，本发明提供由本发明的组织培养物再生的马铃薯植物。 [0020] 图1描绘pSIM1278转型载体。左侧的载体主链区域的长度是9,512bp，其在位置10,149bp处开始并且在位置19,660bp处结束。主链DNA主要由细菌DNA组成，其提供植物转型作用之前DNA插入物的支持性维持。包括侧接边界序列的DNA插入物区域(右侧)的长度是10, 148bp(从1bp到10,148bp)。DNA插入物仅由原生DNA组成并且在转型作用时稳定整合到马铃薯基因体中。 [0021] 图2提供pSIM1278转型载体中插入的DNA插入物中沉默盒的示意图。每个沉默盒含有由间隔物间隔的两个基因片段的两个复本。在块茎中具有主要活性的两个汇集启动子(指示为Pro)之间以反向重复形式插入DNA区段的两个复本，其包含四个靶向基因(即Asn-1、Ppo-5、Phl和R1)的片段。含有所得沉默盒的植物在块茎中产生RNA分子的多样和未聚腺苷酸化阵列，其动态并且强烈地使期望的目标基因沉默。RNA分子的尺寸通常小于所使用的两个启动子之间的距离，因为汇集转录引起碰撞转录。 [0022] 图3描绘本发明的pSIM1678转型载体。左侧的载体主链区域的长度是9,512bp，其在位置9,091bp处开始并且在位置18,602bp处结束。主链DNA主要由细菌DNA组成，其提供植物转型作用之前DNA插入物的支持性维持。包括侧接边界序列的DNA插入区(右侧)的长度是9,090bp(从1bp到9,090bp)。DNA插入物仅由原生DNA组成并且在转型作用时稳定整合到马铃薯基因体中。 [0023] 图4提供在pSIM1278转型载体(上部构筑体)中插入的DNA插入物中的沉默盒和在pSIM1678转型载体(下部构筑体)中插入的DNA插入物中的沉默盒的示意图。 [0024] 图5展示关于两个事件(W3和W8)和褐色布尔班克对照物(WT)的从区域生长植物的块茎分离的总RNA(20μg)的北方印迹分析(Northern blot analysis)的结果。印迹与对Asn1、Ppo5、PhL、R1和VInv转录物(上部图)具有特异性的探针杂交。对内部对照物18s rRNA(中间图)和溴化乙锭染色的总RNA(下部图)具有特异性的探针用作内部和负载对照物。每个印记包括每种样品的两个独立生物复本。W3＝未提交的其它事件。 [0025] 图6展示关于两个事件(W3和W8)和褐色布尔班克对照物(WT)的从区域生长植物的叶子分离的总RNA(20μg)的北方印迹分析的结果。印迹与对Asn1、Ppo5、PhL、R1和VInv转录物(上部图)具有特异性的探针杂交。对内部对照物18s rRNA(中间图)和溴化乙锭染色的总RNA(下部图)具有特异性的探针用作内部和负载对照物。每个印记包括每种样品的两个独立生物复本。W3＝未提交的其它事件。 [0026] 图7展示关于两个事件(W3和W8)和褐色布尔班克对照物(WT)的从区域生长植物的茎干分离的总RNA(20μg)的北方印迹分析的结果。印迹与对Asn1、Ppo5、PhL、R1和VInv转录物(上部图)具有特异性的探针杂交。对内部对照物18s rRNA(中间图)和溴化乙锭染色的总RNA(下部图)具有特异性的探针用作内部和负载对照物。每个印记包括每种样品的两个独立生物复本。W3＝未提交的其它事件。 [0027] 图8展示关于两个事件(W3和W8)和褐色布尔班克对照物(WT)的从区域生长植物的根分离的总RNA(20μg)的北方印迹分析的结果。印迹与对Asn1、Ppo5、PhL、R1和VInv转录物(上部图)具有特异性的探针杂交。对内部对照物18s rRNA(中间图)和溴化乙锭染色的总RNA(下部图)具有特异性的探针用作内部和负载对照物。每个印记包括每种样品的两个独立生物复本。W3＝未提交的其它事件。 [0028] 图9展示关于两个事件(W3和W8)和褐色布尔班克对照物(WT)的从区域生长植物的花朵分离的总RNA(20μg)的北方印迹分析的结果。印迹与对Asn1、Ppo5、PhL、R1和VInv转录物(上部图)具有特异性的探针杂交。对内部对照物18s rRNA(中间图)和溴化乙锭染色的总RNA(下部图)具有特异性的探针用作内部和负载对照物。每个印记包括每种样品的两个独立生物复本。W3＝未提交的其它事件。 [0029] 图10展示多酚氧化酶活性的三种不同儿茶酚分析的结果。对于每种分析，褐色布尔班克对照物在顶部并且种类W8在底部。深褐色表明不存在黑斑损伤减少特性。如图10中所见，W8具有黑斑损伤减少特性，而对照物不具有。 具体实施方式[0031] 等位基因。等位基因是与一种特性或特征有关的基因的一或多种替代形式中的任一种。在二倍体细胞或生物体中，既定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座。 [0032] 氨基酸序列。如本文中所使用，包括寡肽、肽、多肽或蛋白质和其片段，所述氨基酸序列是从植物分离、对植物来说是原生或天然存在于植物中，或按合成方式制得，但包含内源性对应物的核酸序列。 [0033] 人工操纵。如本文中所使用，“人工操纵”意谓通过手或通过机械手段或重组手段(如通过遗传工程改造技术)移动、配置、操作或控制植物或植物细胞，以便产生与未经操纵的天然存在的对应物相比具有不同生物、生物化学、形态或生理学表现型及/或基因型的植物或植物细胞。 [0034] 无性繁殖。通过从叶子插条、茎干插条、根插条、块茎眼、匍匐茎、单个植物细胞原生质体、愈合组织等产生整个植物来产生后代，其不涉及配子的融合。 [0035] 主链。双运载体的核酸序列，其不包括意图转移的DNA插入序列。 [0036] 回交。回交是其中饲养员反复地使杂交后代重新与一个亲本杂交的过程，例如第一代杂交物F1与F1杂交物的一个亲本基因型。 [0037] 环腐病(Bacterial Ring Rot)。环腐病是由细菌番茄细菌性溃疡病菌属(Clavibacter michiganense ssp)引起的疾病。环腐病的名称来源于块茎内脉管环的特征分解。这种环通常呈现奶黄色到浅褐色，干酪质腐烂。在马铃薯的外表面上，严重患病块茎可展示稍微凹陷、脱水和开裂区域。受感染的块茎的脉管组织中的环腐病症状与上述相比可能不太明显，仅呈现破损，偶尔呈现黑线或连续、淡黄色变色。 [0038] 黑斑损伤。在受损块茎组织中发现的黑斑是在细胞损伤后产生的称为黑色素的色素的结果并且使组织具有褐色、灰色或黑色外观。黑色素在酚受质和适合的酶由于细胞损伤而彼此接触时形成。所述损伤无需破坏细胞。然而，受质和酶的混合必须发生，通常在组织受到冲击时。黑斑主要存在于刚好位于脉管环下方的环髓组织中，但可足够大以包括一部分皮层组织。 [0039] 边界类序列。“边界类”序列是从所选择的经修饰的植物物种分离，或从与待修饰的植物物种性相容的植物分离，并且发挥与农杆菌的边界序列类似的功能。也就是说，本发明的边界类序列促进和有助于其所连接的聚核苷酸的整合。本发明的DNA插入物优选含有边界类序列。DNA插入物的边界类序列的长度在5-100bp、10-80bp、15-75bp、15-60bp、15-50bp、15-40bp、15-30bp、16-30bp、20-30bp、21-30bp、22-30bp、23-30bp、24-30bp、25-30bp或26-30bp之间。DNA插入物左和右边界序列是从待修饰的植物的基因体分离和/或对待修饰的植物的基因体来说是原生。在核苷酸序列中，DNA插入物边界类序列不与任何已知的农杆菌衍生T-DNA边界序列相同。因此，DNA插入物边界类序列可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个与来自农杆菌物种(如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))的T-DNA边界序列不同的核苷酸。也就是说，本发明的DNA插入物边界或边界类序列与来自农杆菌物种(如根癌农杆菌或发根农杆菌)的T-DNA边界序列具有至少95％、至少90％、至少80％、至少 75％、至少70％、至少60％或至少50％序列一致性，但不具有100％序列一致性。如本文中所使用，描述性用语“DNA插入物边界”和“DNA插入物边界类”是可交换的。边界类序列可从植物基因体分离并且经修饰或突变以改变功效，其功效能够将核苷酸序列整合到另一核苷酸序列中。可将其它聚核苷酸序列添加到或并入本发明的边界类序列内。因此，DNA插入物左边界或DNA插入物右边界可经修饰以具有5'-和3'-多克隆位点，或其它限制位点。DNA插入物边界序列可经修饰以增加来自伴随载体的主链DNA不整合到植物基因体中的可能性。 [0040] 基本上由……组成。“基本上由某些元素组成”的组合物限于包含这些元素，以及不实质上影响本发明组合物的基本和新颖特征的元素。因此，只要组合物不影响本发明的基本和新颖特征，也就是说，不含不是来自所选择的植物物种或与所选择的植物物种性相容的植物的外来DNA，那么所述组合物可视为由措辞“基本上由……组成”表征的本发明组合物的组分。 [0041] 子叶。子叶是一种种子叶子。子叶含有种子的食物储存组织。 [0042] 简并引物。“简并引物”是含有足够的核苷酸变化的寡核苷酸，其在与具有类似但非严格同源性的序列杂交时可容纳碱基错配。 [0043] 双子叶植物(Dicotyledon/dicot)。一种开花植物，其胚芽具有两个种子叶子或子叶。双子叶植物的实例包括(但不限于)烟草、番茄、马铃薯、甘薯、木薯、豆科植物(包括苜蓿和大豆)、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、菊花和仙人掌。 [0044] DNA插入物。根据本发明，待插入到植物的基因体中的DNA插入物包含对于所述植物来说是原生的聚核苷酸序列或具有所述植物的原生基因元素。在一个实例中，举例来说，来自本发明的马铃薯种类W8的pSIM1278的DNA插入物是10,148bp非编码聚核苷酸，其对于马铃薯或野生型马铃薯(一种马铃薯性相容植物)来说是原生，在转型作用时稳定整合到植物细胞的基因体中并且使涉及黑斑损伤的表达、天冬酰胺聚集和衰老甜化的基因沉默。DNA插入物优选包含两个表达盒并且插入到称为pSIM1278转型载体的转型载体中。第一个盒子包含天冬酰胺合成酶-1基因(Asn1)和多酚氧化酶-5基因(Ppo5)的片段，在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp启动子与颗粒结合合成酶基因(Gbss)的Gbss启动子之间以反向重复形式配置。这些启动子在块茎中具有主要活性。第二个盒子的功能是使淀粉相关基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的启动子沉默。这个盒子包含淀粉相关基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的启动子的片段，其可操作地连接到与第一个盒子相同的Agp和Gbss启动子。第二DNA插入物来自称为pSIM1678的转型载体，其包含用于植物液泡转化酶基因VInv的Rpi-vnt1表达盒和沉默盒。Rpi-vnt1基因盒由VNT1蛋白质编码区组成，所述编码区由其原生启动子和终止序列调节以赋予对晚疫病的广泛抗性，而沉默盒由来自由相对植物启动子pGbss和pAgp侧接的马铃薯VInv基因的序列的反向重复组成。这些表达盒不含外来DNA，并且仅由来自所选择的植物物种或与所选择的植物物种性相容的植物的DNA组成。 [0045] 胚芽。胚芽是成熟种子内所含的不成熟植物。 [0046] 外来。关于核酸的“外来”意指所述核酸来源于非植物生物，或来源于物种与待转型的植物不同的植物，或不来源于不可与待转型的植物杂交的植物，不属于目标植物的物种。根据本发明，外来DNA或RNA表示真菌、细菌、病毒、哺乳动物、鱼或鸟类的遗传组成中天然存在，但不在待转型的植物中天然存在的核酸。因此，外来核酸是编码例如并非由经转型的植物天然产生的多肽的核酸。外来核酸并非必须编码蛋白质产物。根据本发明，所需基因内植物是不含任何整合到其基因体中的外来核酸的植物。 [0047] 基因。如本文中所使用，“基因”指编码区并且不包括对所述区域是5'-或3'-的核苷酸序列。功能性基因是可操作地连接到启动子或终止子的编码区。可使用转型作用或多种育种方法将基因引入物质的基因体(无论来自不同物种或来自相同物种)。 [0048] 基因转化(转化)。基因转化(转化)植物指通过称为回交的植物育种技术研发植物，其中除通过回交技术、遗传工程改造或突变转移到种类中的一或多个基因以外，恢复种类的实质上所有所需形态和生理学特征。也可以转移一或多个基因座。 [0049] 基因重排。指可活体内以及活体外自发进行的基因元素的重新关联，其引入基因材料的新组织。举例来说，不同染色体基因座处的聚核苷酸剪接在一起可在植物发育和有性再结合期间活体内自发进行。因此，通过非天然基因修饰技术进行的活体外基因元素的再结合与也可以通过活体内有性再结合进行的再结合事件类似。 [0051] 下胚轴。下胚轴是子叶与根之间的胚芽或幼苗的部分。因此，其可视为芽与根之间的过渡区。 [0052] 框内。核苷酸三联体(密码子)翻译成植物细胞中所需重组蛋白的初生氨基酸序列。具体来说，本发明涵盖在阅读框架中连接到第二核酸的第一核酸，其中第一核苷酸序列是基因并且第二核苷酸是启动子或类似调节元件。 [0053] 整合。指来自所选择的植物物种，或来自与所选择的植物相同的物种的植物，或来自与所选择的植物物种性相容的植物的核酸序列插入刀所选择的植物物种的细胞的基因体中。“整合”指仅原生基因元素并入植物细胞基因体。为了整合原生基因元件，如通过同源重组，本发明可“使用”非天然DNA作为这类过程中的步骤。因此，本发明区分“使用”特定DNA分子与将特定DNA分子“整合”到植物细胞基因体。 [0054] 引入。如本文中所使用，指通过包括感染、转染、转型或转导等方法将核酸序列插入细胞中。 [0055] 经分离。“经分离”指任何以物理方式从其正常、原生环境分离的核酸或化合物。经分离的材料可保持在含有例如溶剂、缓冲液、离子或其它组分的适合的溶液中，并且可呈纯化或未纯化形式。 [0056] 晚疫病。由卵菌纲致病疫霉引起的马铃薯疾病并且也称为‘马铃薯晚疫病’，其可感染和毁坏马铃薯植物的叶子、茎干、果实和块茎。 [0057] 前导子。在基因之前(或5'-)的经转录但未经翻译的序列。 [0058] 基因座。基因座提供一或多种特性，如雄性无菌性、除草剂耐受性、昆虫抗性、疾病抗性、糯性淀粉、改良的脂肪酸代谢、改良的植酸代谢、改良的碳水化合物代谢和改良的蛋白质代谢。特性可例如由通过回交、天然或诱导的突变引入到种类的基因体中的天然存在的基因或通过基因转型技术引入的转基因提供。基因座可包含一或多个在单个染色体位置整合的等位基因。 [0059] 商品产量。商品产量是所收集的直径在2与4英寸之间的所有块茎的重量。按cwt(二十分之一吨)测量商品产量，其中cwt＝100磅。 [0060] 单子叶植物(Monocotyledon/monocot)。一种开花植物，其胚芽具有一个子叶或种子叶子。单子叶植物的实例包括(但不限于)草坪草、玉米、大米、燕麦、小麦、大麦、高粱、兰花、鸢尾、百合、洋葱和棕榈。 [0061] 原生。“原生”基因元件指天然存在于、来源于或属于待转型的植物的基因体的核酸。因此，从待转型的植物或植物物种的基因组分离或从与待转型的植物物种性相容或可杂交的植物或物种分离的核酸、基因、聚核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子是所述植物物种“原生”的，即原产的。换句话说，原生遗传成分表示植物培育者可获得的用于通过传统植物育种改良植物的全部遗传材料。根据本发明，原生核酸的任何变异体也视为“原生”。在这方面中，“原生”核酸还可以从植物或其性相容物种分离并且经修饰或突变，使得所得变异体在核苷酸序列方面与从植物分离的未经修饰的原生核酸具有大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、 81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、 66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％相似性。原生核酸变异体的核苷酸序列还可以具有小于约60％、小于约55％或小于约50％相似性。从植物分离的“原生”核酸还可以编码从核酸转录和翻译的天然存在的蛋白质产物的变异体。因此，原生核酸可编码在氨基酸序列方面与分离核酸的植物中表达的未经修饰的原生蛋白质具有大于或等于99％、98％、97％、 96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、 81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、 66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％相似性的蛋白质。 [0062] 原生基因元件。“原生基因元件”可并入和整合到根据本发明的所选择的植物物种基因体中。从属于所选择的植物物种的植物或从与所选择的植物物种性相容的植物分离原生基因元件。举例来说，并入所培育的马铃薯(potato/Solanum tuberosum)中的原生DNA可来源于马铃薯的任何基因型或与马铃薯性相容的野生型马铃薯物种(例如马铃薯野生种(Solanum demissum))的基因型。 [0063] 天然存在的核酸。在所选择的植物物种的基因体内发现天然存在的核酸并且可以是DNA分子或RNA分子。植物物种的基因体中通常存在的限制位点的序列可工程改造成外源性DNA分子，如载体或寡核苷酸，即使限制位点未以物理方式从基因体分离。因此，本发明允许合成产生核苷酸序列，如限制酶识别序列，只要所述序列天然存在于所选择的植物物种的基因体或与待转型的所选择的植物物种性相容的植物中即可。 [0064] 可操作地连接。以使得在组合中在植物细胞中发挥适当功能的方式组合两个或更多个分子。举例来说，当启动子控制结构基因的转录时，启动子可操作地连接于结构基因。 [0065] 植物。如本文中所使用，术语“植物”包括(但不限于)被子植物和裸子植物，如马铃薯、番茄、烟草、苜蓿、莴苣、胡萝卜、草莓、甜菜、木薯、甘薯、大豆、玉米、草皮草、小麦、大米、大麦、高粱、燕麦、橡树、桉树、胡桃和棕榈。因此，植物可以是单子叶植物或双子叶植物。如本文中所使用，词语“植物”还涵盖植物细胞、种子、植物后代、繁殖体(无论以有性或无性方式产生)，和这些物质中的任一个的后代，如插条或种子。植物细胞包括悬浮培养物、愈合组织、胚芽、分生组织区、愈合组织、叶、根、嫩枝、配子体、孢子体、花粉、种子和花粉粒。植物可处于成熟期的多个阶段，并且可以在液体或固体培养物中，或在罐、温室或旷野中的土壤或适合培养基中生长。植物中所引入的前导子、尾部序列或基因序列的表达可以是暂时性或永久性的。“所选择的植物物种”可以是(但不限于)这些“植物”中的任一个的物种。 [0066] 植物部分。如本文中所使用，术语“植物部分”(或马铃薯植物，或其一部分)包括(但不限于)原生质体、树叶、、茎干、根、根端、花药、雌蕊、种子、胚芽、花粉、胚珠、子叶、下胚轴、花、块茎、芽眼、组织、叶柄、细胞、分生组织细胞等。 [0067] 植物物种。属于多种官方命名植物物种的植物群，其至少显示一些性相容。 [0068] 植物转型和细胞培养物。大体上指用于对植物细胞进行遗传修饰并且转移到适合的植物培养基中以用于维持、进一步生长和/或进一步发育的过程。 [0069] 精确育种。指通过将核酸(如原生基因和调节元件，其是从所选择的植物物种分离，或来自与所选择的植物相同的物种中的另一种植物，或来自与所选择的植物物种性相容的物种)稳定引入个别植物细胞中，并且随后使这些经遗传修饰的植物细胞再生成完全植物来改良植物。因为不存在未知的或外来核酸永久性并入植物基因体中，本发明的技术利用也可以通过常规植物育种获得的相同基因材料。 [0070] 后代。如本文中所使用，包括由两种马铃薯植物的杂交产生的F1马铃薯植物，其中至少一种植物包括马铃薯栽培品种W8并且后代更包括(但不限于)与轮回亲本的后续F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9和W8代杂交物。 [0071] 定量特性基因座(QTL)。定量特性基因座(QTL)指在一定程度上控制可以数值方式表示的通常连续分布的特性的基因基因座。 [0072] 重组型。如本文中所使用，广泛描述可用于基因克隆、DNA测序和产生蛋白质产物的多种技术。如本文中所使用，所述术语还描述在基因转移到植物宿主系统的细胞中之后产生的蛋白质。 [0073] 再生。再生指植物从组织培养物发育。 [0074] 调节序列。指标准并且为所属领域的技术人员已知的序列，其可包括于表达载体中以增加和/或最大化相关基因的转录或植物系统中所得RNA的转译。这些序列包括(但不限于)启动子、肽输出信号序列、内含子、聚腺苷酸化和转录终止位点。修饰核酸构筑体以增加植物中的表达含量的方法也是所属领域中一般已知的(参见例如罗格(Rogers)等人,260生物化学杂志(J.Biol.Chem.)3731-38,1985；科尔内霍(Cornejo)等人,23植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)567:81,1993)。在工程改造植物系统以影响蛋白质的转录率时，多种所属领域中已知的因素可具有影响，包括调节序列(如正性或负性作用序列)、强化子和沉默子以及染色质结构。本发明假设这些因素中的至少一个可用于工程改造植物以表达相关蛋白质。本发明的调节序列是原生基因元件，即从待修饰的所选择的植物物种分离。 [0075] 可选标记。“可选标记”通常是编码可提供对抗生素、除草剂或毒性化合物的某种抗性的蛋白质的基因，并且用于鉴别转型事件。可选标记的实例包括编码链霉素(streptomycin)抗性的链霉素磷酸转移酶(spt)基因、将甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6磷酸的磷酸甘露糖异构酶(pmi)基因；编码卡那霉素(kanamycin)和遗传霉素(geneticin)抗性的新霉素(neomycin)磷酸转移酶(nptII)基因、编码对潮霉素(hygromycin)的抗性的潮霉素磷酸转移酶(hpt或aphiv)基因、编码对磺酰脲型除草剂的抗性的乙酰乳酸合成酶(als)基因、编码对发挥作用以抑制谷氨酰胺合成酶的作用的除草剂(例如草丁膦 (phosphinothricin)或巴斯特(basta))的抗性的基因(例如bar基因)，或所属领域中已知的其它类似基因。 [0076] 有义抑制。通过转基因植物中所有或一部分内源性基因的一或多个其它复本的表达使所述内源性基因的表达降低。 [0077] 比重。如本文中所使用，“比重”是密度的表示并且是马铃薯质量的测量值。块茎的比重与干物质或总固体的淀粉含量和百分比之间存在高相关性。更高的比重有助于所处理的产物的更高的回收率和更好的质量。 [0078] T-DNA类。“T-DNA类”序列是从所选择的植物物种分离或来自与所选择的植物物种性相容的植物的核酸，并且其与农杆菌物种T-DNA共有至少75％、80％、85％、90％或95％但非100％序列一致性。T-DNA类序列可含有一或多个边界或边界类序列，其各自能够将核苷酸序列整合到另一个聚核苷酸中。 [0079] 总产量。总产量指所有收集的块茎的总重量。 [0080] 尾部序列。在基因之后(或3'-)经转录但未经翻译的序列。 [0081] 经转录的DNA。包含基因和与所述基因相关联的非翻译前导子和尾部序列的DNA，其通过前述启动子的作用转录成单个mRNA。 [0082] 植物细胞的转型。用于将DNA稳定整合到植物细胞的基因体中的过程。“稳定”指细胞基因体中和由细胞基因体进行的聚核苷酸的永久性或非暂时性保留和/或表达。因此，稳定整合的聚核苷酸是经转型的细胞基因体内的固定物并且可通过细胞或所得经转型的植物的连续后代来复制和繁殖。转型可以在天然或人工条件下使用所属领域中众所周知的多种方法进行。转型可凭借任何用于将核酸序列插入原核或真核宿主细胞中的已知方法，包括农杆菌介导的转型方案、病毒感染、触须、电穿孔、热休克、脂质体转染、聚乙二醇处理、微注射和粒子轰击。 [0083] 转基因。将插入到宿主基因体中的基因，其包含蛋白质编码区。在本发明的情形下，从宿主基因体分离包含转基因的元件。 [0084] 转基因植物。经遗传修饰的植物，其含有至少一个转基因。 [0085] 变异体。如本文中所使用，“变异体”应理解成意指偏离具体基因或蛋白质的标准或既定核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。术语“同种型”、“同型”和“类似物”也指核苷酸或氨基酸序列的“变异体”形式。通过添加、移除或取代一或多个氨基酸或改变核苷酸序列而改变的氨基酸序列可以视为“变异体”序列。变异体可具有“保守性”变化，其中经取代的氨基酸具有类似结构或化学特性，例如用异白氨酸置换白氨酸。变异体可具有“非保守性”变化，例如用色氨酸置换甘氨酸。类似微小变化还可以包括氨基酸缺失或插入或其两者。测定哪个氨基酸残基可经取代、插入或缺失的指导可使用所属领域中众所周知的计算机程序(例如载体NTI程序组(Vector NTI Suite)(马里兰州因弗马斯公司(InforMax,MD))软件)发现。 [0086] 藤本植物成熟。藤本植物成熟指植物持续使用碳水化合物和光合作用的能力。藤本植物成熟按照1到5的等级打分，其中1＝死亡的藤本植物并且5＝绿色、仍开花的藤本植物。 [0087] 将理想特性插入马铃薯植物的基因体中存在具体困难，因为马铃薯是四倍体植物、高异型接合并且对近交衰退敏感。因此，在使用常规育种进行处理期间，极难以有效产生可产生较少丙烯酰胺和较少有害梅纳反应产物的转殖基因马铃薯植物，所述梅纳反应产物包括N-亚硝基-N-(3-酮-1,2-丁二醇)-3'-硝基酪胺酸(王(Wang)等人,毒理学文献(Arch Toxicol)70:10-5,1995)、5-羟基甲基-2-糠醛(扬佐夫斯基(Janzowski)等人,食品与化学品毒理学(Food Chem Toxicol)38:801-9,2000)和其它具有突变诱发特性的梅纳反应产物(柴本(Shibamoto),临床与生物学研究进展(Prog Clin Biol Res)304:359-76,1989)。 [0088] 已测试若干种方法并且正在进行研究以通过过程变化、右旋糖较少以及添加剂(如天冬酰胺酶、柠檬酸)和竞争氨基酸来减少丙烯酰胺。整个马铃薯工业中用于实施过程变化的所需资源费用将花费数百万美元。除费用以外，这些过程变化具有显著缺陷，包括与添加剂(如天冬酰胺酶或柠檬酸)有关的潜在不良味道。通常，薯条制造商在炸薯条加工期间添加右旋糖以产生所需金褐色，但右旋糖也通过梅纳反应而增加丙烯酰胺的形成。在过程中仅省略右旋糖科显著减少丙烯酰胺；然而，那么必须以另一种方式产生标志性金褐色(如通过添加颜料，如胭脂树橙)。使用替代性颜料，引起不存在通过这些褐变反应产生的典型味道。使用添加剂以减少反应物(如天冬酰胺)的另一项挑战是在冷冻储存期间发生的水分迁移，其中引起天冬酰胺返回表面和丙烯酰胺增加。最终，在马铃薯受损之后发生的黑化影响炸薯条和薯片加工中的质量和回收率。损坏或损伤的马铃薯必须在加工之前修整或丢弃，引起质量问题或经济缺失。 [0089] 本发明的“原生技术”通过降低多酚氧化酶-5(PPO-5)(其引起黑斑损伤)的表达、天冬酰胺合成酶-1(Asn-1)(其引起天冬酰胺聚集，天冬酰胺是丙烯酰胺形成中的前驱体，其可降低液泡转化酶的表达，所述液泡转化酶将蔗糖转化成葡萄糖和果糖)的表达和/或磷酸化酶-L和激酶-R1(其是与还原糖的聚集相关的酶，所述还原糖通常与氨基酸(如天冬酰胺)反应，并且形成毒性梅纳产物，包括丙烯酰胺)的表达来解决马铃薯工业中改良马铃薯的农艺特征和营养价值的需要。块茎中这些基因的部分或完全沉默可降低产生丙烯酰胺的可能性。使用本发明的原生技术允许通过使仅具有“原生”基因材料(即从马铃薯植物或与马铃薯植物性相容的植物获得的基因材料，其仅含有非编码调节区域)的马铃薯转型，而不将任何外来基因材料整合到植物基因体中来将所需特性并入有商业价值的马铃薯植物种类的基因体中。所需特性包括对撞击引起的黑斑损伤的高耐受性、对晚疫病感染的抗性增加、丙烯酰胺前驱体天冬酰胺的形成减少和还原糖的聚集较少，从而使毒性梅纳产物(包括丙烯酰胺)的聚集减少，改良的质量和食物颜色控制。将这些理想特性并入现有马铃薯种类中无法通过传统育种实现，因为马铃薯是四倍体植物、高异型接合并且对近交衰退敏感。 [0090] 本发明中使用的非编码马铃薯植物DNA插入物序列对于马铃薯植物基因体来说是原生并且不含任何农杆菌DNA。DNA插入物中一个的优选包含两个表达盒并且插入到称为pSIM1278转型载体的转型载体中。第一个盒子包含天冬酰胺合成酶-1基因(Asn1)和多酚氧化酶-5基因(Ppo5)的片段，在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp启动子与颗粒结合合成酶基因(Gbss)的Gbss启动子之间以反向重复形式配置。这些启动子在块茎中具有主要活性。第二个盒子的功能是使淀粉相关基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的启动子沉默。这个盒子包含淀粉相关基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的启动子的片段，其可操作地连接到与第一个盒子相同的Agp和Gbss启动子。这些表达盒不含外来DNA，并且仅由来自所选择的植物物种或与所选择的植物物种性相容的植物的DNA组成。第二DNA插入物来自称为pSIM1678的转型载体，其包含用于植物液泡转化酶基因VInv的Rpi-vnt1表达盒和沉默盒。Rpi-vnt1基因盒由VNT1蛋白质编码区组成，所述编码区由其原生启动子和终止序列调节以赋予对晚疫病的广泛抗性，而沉默盒由来自由相对植物启动子pGbss和pAgp侧接的马铃薯VInv基因的序列的反向重复组成。第一个盒子的功能是赋予对晚疫病的抗性，而第二个盒字的功能是使液泡转化酶基因沉默，减少葡萄糖和果糖。 [0091] 本发明中使用的有商业价值的马铃薯植物变种是褐色布尔班克。Luther Burbank在1870年代早期研发这一种类。植物是精力旺盛的并且在整个季节持续藤本植物生长。茎干较厚，显著成角度并且有细斑。小叶的宽度是长到中等并且颜色是浅绿色到中等绿色。花朵较少、呈白色并且不能繁殖。栽培品种对常见疮痂病具有耐受性，并且易患镰刀菌萎蔫病(Fusarium wilts)和黄萎病(Verticillium wilts)、卷叶和网状坏死、马铃薯病毒Y和晚疫病。植物需要高和均匀的土壤水分和受控氮繁殖的以产生不含结节、尖端和两头集中的块茎。当植物经历压力时，块茎中产生胶状端和糖端。所产生的块茎是大型褐色皮肤和白色肉质，显示良好的长期储存特征，并且代表极佳烘烤和加工质量的标准。Russett Burbank种类具有较高的产生黑斑损伤的敏感性并且还具有高游离天冬酰胺含量和高衰老甜化潜力(美国马铃薯研究杂志(Am.J.Potato Res)(1966)43:305-314)。所述种类是无菌的并且在西北部和中西部广泛生长，尤其用于制备薯条。 [0092] 本发明提供具有显著市场价值的马铃薯种类，也就是褐色布尔班克，其经转型载体pSIM1278转型，接着经第二转型载体pSIM1678转型，使用聚合酶链反应而非标记物鉴别，并且成功繁殖。还提供由本发明的马铃薯植物种类W8的块茎制成的食物产品。由经济合作与发展组织(Organization for Economic Cooperation and Development/OECD)，马铃薯栽培品种W8具有以下独特植物种类标识符： [0093] 用原生DNA进行的靶向基因沉默降低马铃薯植物种类W8的块茎中靶向基因的RNA转录物含量。马铃薯栽培品种W8含有表达盒，其通过多种机制降低块茎中还原糖的含量。通过用pSIM1278进行的转型作用，引入淀粉相关基因(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的启动子的沉默盒，同时用pSIM1678进行的转型作用引入转化酶基因的沉默盒(VInv；叶(Ye)等人,2010)。总而言之，这些特性通过减缓淀粉和蔗糖转化成还原糖(葡萄糖和果糖)来发挥功能。 [0094] 因此，本发明的马铃薯植物种类W8的块茎合并有极合乎需要的特性，包括降低的游离酰胺氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺的比率，所述游离酰胺氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺与油炸或烘烤时丙烯酰胺形成减少有关。具体来说，本发明的马铃薯种类W8的特征在于游离天冬酰胺含量降低两倍到超过四倍，与黑斑损伤相关的褪色减少并且对晚疫病的抗性增加。此外，本发明的马铃薯种类W8显示淀粉在储存期间降解成还原糖葡萄糖和果糖的延迟。淀粉到糖转化的减少进一步减少衰老甜化和丙烯酰胺形成并且限制热诱导的褐变。 [0095] 因此，本发明的马铃薯种类W8在马铃薯工业和食品市场中极有价值，因为其块茎在热加工时产生显著更少的丙烯酰胺并且不携带任何潜在有害外来基因。 [0096] 实例 [0097] 本发明使用原生技术将原生非编码DNA整合到所选择的马铃薯植物种类的基因体中，以便研发新的基因内马铃薯植物种类。所述方法包括特性鉴别、载体设计、载体并入农杆菌中、选择受体马铃薯种类、植物转型、证明不存在开放阅读框架以及确保新马铃薯植物种类仅含有原生DNA。本发明的马铃薯栽培品种W8与其未经转型的对应物相比具有降低的形成丙烯酰胺的可能性、降低的蔗糖量以及更高的对黑斑损伤的抗性。此外，本发明的马铃薯栽培品种W8具有增加的对晚疫病的抗性。 [0098] 实例1.pSIM1278转型载体 [0099] 本发明中使用的转型载体pSIM1278来源于pSIM106，其通过接合0.4-kb马铃薯植物DNA片段(以GenBank寄存编号AY566555寄存)与pCAMBIA1301(澳大利亚堪培拉的坎比亚公司(CAMBIA,Canberra,Australia))的5.9-kb SacII-SphI片段产生，其携带来自质体pVS1和pBR322的细菌复制起点，以及用于对卡那霉素的细菌抗性的nptIII基因。将前面是Ubi-3启动子(加巴里诺(Garbarino)和贝尔纳普(Belknap),1994)并且后面是Ubi-3终止子的包含农杆菌ipt基因的表达盒以2.6-kb SacII片段形式引入载体主链中(罗门斯(Rommens)等人,2004)。将携带两个沉默盒的原生10-kb DNA区段插入pSIM106的DNA插入物中，产生pSIM1278。这一载体用于所有转型。pSIM1278载体图展示于图1中。载体主链区域是 9,512bp，其在位置10,149处开始并且在位置19,660bp处结束。主链DNA主要由细菌DNA组成并且提供植物转型作用之前DNA插入物的支持性维持。主链部分不转移到植物细胞中。主链的多种元件描述于表1中。pCAMBIA载体的通式结构图可见于http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html。 [0100] 表1 [0101] [0102] [0103] 实例2.pSIM1278植物DNA插入物和其开放阅读框架(ORF) [0104] pSIM1278中使用的pSIM1278DNA插入物区域(包括侧接边界序列)的长度是10,148bp，从1bp到10,148bp。pSIM1278DNA插入物仅由原生DNA组成并且稳定整合到马铃薯基因体中。pSIM1278DNA插入物或其功能性部分是整合到本发明的马铃薯植物种类中的载体pSIM1278的唯一基因材料。pSIM1278DNA插入物描述于图2和以下表2中。LB和RB序列(都是 25bp)经合成设计以与来自根癌农杆菌的T-DNA边界类似并且发挥类似功能。修改GenBank寄存编号AY566555以阐明用于边界区域的DNA的来源。在查瓦拉(Chawla)等人,2012中，描述为基因元件5和10的ASN1称为StAst1。 [0105] 表2 [0106] [0107] [0108] [0109] 表2中描述的用于产生本发明的马铃薯品系W8的DNA插入物不使相邻基因活化并且不会不利地影响马铃薯植物种类W8的表现型。此外，本发明的马铃薯植物种类W8不会产生与由DNA插入物编码的开放阅读框架相关的新型蛋白质。 [0110] 实例3.pSIM1678转型载体 [0111] 本发明中使用的转型载体pSIM1678是使用与实例1中关于pSIM1278所描述相同的方法转型。pSIM1678载体图展示于图3中。载体主链区域是9,512bp，其在位置9,091处开始并且在位置18,602bp处结束。主链DNA主要由细菌DNA组成并且提供植物转型作用之前DNA插入物的支持性维持。主链部分不转移到植物细胞中。主链的多种元件描述于表1中。尽管表1中展示的编号系统是基于pSIM1278，但主链序列可关于pSIM1678一致。 [0112] 实例4.pSIM1678植物DNA插入物和其开放阅读框架(ORF) [0113] pSIM1678中使用的pSIM1678DNA插入物区域(包括侧接边界序列)的长度是9,090bp(从1bp到9,090bp)。pSIM1678DNA插入物仅由原生DNA组成并且稳定整合到马铃薯基因体中。pSIM1678DNA插入物或其功能性部分是整合到本发明的马铃薯植物种类中的载体pSIM1678的唯一基因材料。pSIM1678DNA插入物描述于图3和以下表3中。在表3中，LB和RB序列(都是25bp)经合成设计以与来自根癌农杆菌的T-DNA边界类似并且发挥类似功能。修改GenBank寄存编号AY566555以阐明用于边界区域的DNA的来源。 [0114] 表3 [0115] [0116] [0117] 实例5.农杆菌菌株和转染 [0118] 通过精确删除过毒性质体pTiBo542的转移DNA来产生C58衍生的农杆菌菌株AGL1(拉佐(Lazo)等人1991)。经转型的植物在含有抗生素特美汀(timentin)(其防止农杆菌存活)的培养基上生长，并且因此选择不含农杆菌的植物。在选择之后，植物不含抗生素和农杆菌，其中马铃薯衍生的表达盒插入到植物的基因体中。 [0119] 储备植物保持在40ml半强度M516(非泰克公司(Phytotechnology))培养基的洋红色盒子中，所述培养基含有3％蔗糖和2g/l结冷胶(gelzan)(传播介质)。从四周龄植物切割四到六毫米的马铃薯节间区段，用携带pSIM1278的农杆菌AGL1菌株感染，并且转移到含有3％蔗糖和2g/l结冷胶的组织培养基(共同培养基)中。在两天之后，将受感染的外植体转移到含有3％蔗糖、2g/l结冷胶、300mg/l特美汀和1.2ml植物保护培养基(非泰克公司)的M404(非泰克公司)培养基中以消除农杆菌(不含激素的培养基)。通过在营养物培养液-酵母提取物(NBY培养基)上，在28℃下，在不存在外生长的情况下培育经转型的事件的茎干和/或叶子片段2第周(重复两次)来获得植物不含农杆菌的证据。仅在不存在活的农杆菌时在场地中输送和种植经转型的植物。所述方法的细节在其它地方描述(瑞秋(Richael)等人 2008)。 [0120] 尽管农杆菌在右边界(RB)位点处有效裂解，但其通常不能通过也在左边界(LB)位点处切割来从其质体载体完全释放DNA插入物(格尔文(Gelvin)2003)。因此，一些受感染的植物细胞接收DNA插入物本身以及其它含有主链标记基因异戊烯基转移酶(ipt)(对于植物激素细胞分裂素)的质体主链序列，所述主链标记基因通常调节植物中的生长和发育过程。过表达由于细胞分裂素过度产生而引起表现型发育不良、叶子异常或不能生根，其用于针对含有主链DNA的植物进行选择(瑞秋等人2008)。每隔两周，将受感染的外植体转移到不含任何合成激素的新鲜培养基中并且在珀西瓦尔(Percival)生长箱中，在16小时光周期下，在24o℃下培育，其中其开始形成嫩枝。许多嫩枝表达ipt基因并且显示细胞分裂素过度产生表现型；丢弃这些嫩枝并且不考虑进一步分析。PCR基因分型表明约0.3到1.5％其余嫩枝含有至少一部分DNA插入物，同时不含ipt基因。 [0121] 褐色布尔班克W8事件含有来源于具有不同质体的两个单独转型的插入物。第一插入物，质体pSIM1278，含有由经设计以使块茎中多达四种马铃薯基因(Asn1、Ppo5、R1和PhL)沉默的反向重复组成的两个盒子。类似地，第二质体，pSIM1678，含有由用于使块茎中的VInv基因沉默的反向重复组成的盒子，同时还在其原生马铃薯启动子下含有Rpi-vnt1基因的复本。 [0122] 与用于产生事件W8的由pSIM1278和pSIM1678进行的褐色布尔班克的转型相关的插入物的基因和结构表征表明两种转型都产生每个质体的单个整合位点。来源于pSIM1278的转型作用的DNA的结构相对于原始插入物的结构来说是复杂的。所插入的DNA似乎在转型期间经历重排，产生由Asn1/Ppo5沉默盒的串联重复，接着几乎整个pSIM1278构筑体以及含有pR1/pPhl沉默盒的复制品的反向重复和具有介入Phl序列的Gbss启动子的串联复制组成的结构。 [0123] 尽管这一结构比预期更复杂，但所复制的沉默盒是完整的并且仍受组织特异性启动子控制。所述结构不会不利地影响产物的安全性或特性功效。 [0124] W8还含有驻留在整合的单个基因座处的来自pSIM1678的DNA的单个复本。pSIM1678的DNA插入物含有几乎完整的具有330-bp缺失的DNA插入物，其移除整个T-DNA左边界和Rpi-vnt1启动子的137-bp。启动子中的这种小型缺失不影响基因提供晚疫病抗性的能力。并且，已使用RT-PCR证明与Rpi-vnt1基因相关的RNA表达。 [0125] 实例6.不存在载体骨架DNA的证据 [0126] 使用以下方法证明所研发用于市售目的的事件中不存在质体的主链部分：1)如果植物具有与质体主链中的阴性可选异戊烯基异构酶(ipt)标记基因相关的表现型，那么将其丢弃；2)用蛋白质印迹杂交确认不存在主链DNA；3)使用PCR确认不存在主链DNA的片段。总起来说，蛋白质印迹和PCR分析证实褐色布尔班克W8事件不含来自转型中使用的质体的主链。 [0127] 实例7.所插入的DNA的稳定性 [0128] 细菌T-DNA在插入植物之后并非始终稳定。所评估的不稳定性比率(0.5-5.9×10-4)与减数分裂相关(穆勒(Müller)等人1987；康纳(Conner)等人1998)，其与马铃薯无关，因为马铃薯以无性繁殖方式繁殖。因此，预期DNA插入是稳定的。使用块茎而非种子定义后代，因为块茎是商业上种植的。 [0129] 使用分子和表现型分析评估基因稳定性。使用通过三代W8马铃薯(G0-G3)分离的基因组DNA的蛋白质印迹分析证实插入物的结构是稳定的，而通过在第二代田间种植的块茎中测量多酚氧化酶活性来评估表现型稳定性。这一方法展示在向马铃薯的切割表面施用儿茶酚之后的PPO沉默的视觉证据。进行这些研究以确保W8中的所需基因变化在多个克隆循环中保持稳定，同时保持特性。 [0130] 通过使用蛋白质印迹比较三个连续克隆世代(G1、G2和G3)与原始转型体(G0)来评估DNA插入物的稳定性。预期稳定的DNA插入物在植物的多个世代中保持相同结构并且因此产生相同消化模式。为了测试W8事件中插入物的稳定性，使用与来自pSIM1278和pSIM1678的插入物的区域杂交的两个探针(GBS1和AGP)和对pSIM1678插入物具有特异性的两个探针(INV和VNT1)比较其消化模式。因为与这些探针杂交的DNA序列包含于马铃薯基因体中以及DNA插入物内，预期蛋白质印迹中存在内源性和插入物特异性色带。 [0131] 所有基因组DNA样品由限制酶EcoRV消化并且与对AGP或GBS1具有特异性的探针杂交。选择EcoRV用于这些研究，因为其在两种插入物内消化以提供独特显带模式，具有pSIM1278插入物中具有所预测的尺寸的内部色带(例如2.3kb)。对于两种探针，W8的所有样品之间的显带模式是彼此相同的。也在W8中发现在褐色布尔班克对照物中存在的多个色带，但W8还含有对应于pSIM1278和pSIM1678插入物的色带。这些色带在所分析的W8的所有世代之间类似地不变，表明两种插入物的基因稳定性。 [0132] 使用对pSIM1678插入物具有特异性的两个探针进行第二分析。对于这一分析，基因组DNA样品用限制酶XbaI消化并且与VNT1和INV探针杂交。选择XbaI作为用于这些研究的限制酶，因为其内部消化pSIM1678并且产生具有已知尺寸的色带(例如对于INV探针，4.6kb)。而且，检测到内源性和插入物特异性色带，其中所分析的三个世代之间的色带图案不变。基因和表现型分析表明由pSIM1278和pSIM1678的转型作用产生的插入物在三个世代内稳定。鉴于所证明的三个世代内的稳定性，可能在后续无性繁殖循环期间保持稳定性。 [0133] 实例8.基因沉默的功效和组织特异性 [0134] 通过引入含有来源于靶向沉默的基因和启动子的序列的反向重复来实现沉默。尽管存在许多涉及双股RNA介导的沉默的平行路径，但认为这些反向重复的转录是由涉及病毒防御的细胞机制处理(富萨罗(Fusaro)等人2006)。W8马铃薯含有三个独特的盒子，所述盒含有来自总共五种不同马铃薯基因的序列。pSIM1278构筑体由两个基因沉默盒组成(参见图4，上部构筑体)。一个盒子含有来自两种基因(天冬酰胺合成酶-1(Asn1)和多酚氧化酶-5(Ppo5))的序列的反向重复。第二个盒子包括来自淀粉相关基因R1(531-bp)和磷酸化酶-L(PhL)(508-bp)的启动子的序列。最终盒子通过pSIM1678构筑体引入，其包括反向重复，所述反向重复含有来自液泡转化酶(VInv)基因的序列(参见图4，下部构筑体)。 [0135] 所有三个沉默盒由来自马铃薯的Agp和Gbss基因的充分表征和组织特异性启动子的相同集合调节，其与光合活性组织和根相比在块茎中具有高活性(中田(Nakata)等人1994；维瑟(Visser)等人1991)。因此，预期表达和基因沉默在块茎中最有效并且主要受限于块茎。 [0136] 通过北方印迹分析来表征所有五种目标基因的表达，以便测定来自每个盒子的基因沉默的效用。在块茎中观察到Asn1、Ppo5和VInv的稳定沉默，而R1的沉默不太有效(图5)。PhL的沉默视为无效，因为未在对照物与W8样品之间观察到可测量的差异。在其它具有相同pSIM1278构筑体的事件中，观察到块茎中用于PhL和R1的启动子的部分沉默(科林奇(Collinge)和克拉克(Clark)2013)。 [0137] 前述研究显示Ppo基因沉默可使相关蛋白质的量降低到西方印迹分析不可检测的含量(略伦特(Llorente)等人2011)。类似地，R1基因的沉默将减少约160kDa蛋白质的聚集，所述蛋白质至少部分结合于淀粉颗粒(罗贝斯(Lorberth)等人1998)。 [0138] 在其它植物组织中评估目标基因表达以测定基因沉默的特异性。对从来自W8和褐色布尔班克对照物的叶子、茎干、根和花朵分离的RNA类似地进行北方印迹分析。如图6、7和8中所示，与褐色布尔班克对照物相比，叶子、茎干或根中不存在目标基因的沉默。除对应于VInv基因(其在所有叶子和茎干样品(包括对照物)中弱表达)的转录物以外，所有转录物可容易地检测。 [0139] 除块茎以外仅有的观察到其中一些目标沉默的组织是在花朵样品中。这些样品表明与褐色布尔班克对照物相比，W8中Asn1转录物的一些沉默，其可归因于所述组织中的一些泄露表达(图9)。 [0140] 引入褐色布尔班克中以产生W8事件的三个基因沉默盒中的两个极有效地使其用于RNAi介导的沉默的目标转录物沉默。这两个构筑体有效地使W8的块茎中的Asn1、Ppo5和VInv沉默。对块茎的沉默特异性表明极少数(如果存在)由RNAi机制产生的siRNA传播到其它组织或其含量不足以引起这些组织中的RNAi反应。块茎外部沉默的唯一证据是在花朵中，其中观察到较低含量的Asn1，但变化量值与块茎中相比显著较低。用PhL和R1进行的启动子沉默策略具有最小作用，其与其它含有相同pSIM1278构筑体的事件一致(科林奇和克拉克2013)。 [0141] 如所预期，进一步证实与Asn1、Ppo5和VInv相关的降低的RNA转录物的表达。此外，组成和农艺资料未显示任何将与显著脱靶作用或不希望的沉默相关的出人意料的表现型。举例来说，块茎中Asn1强沉默限制氨基酸天冬酰胺的聚集，而叶子或茎干中Asn1的沉默可不利地影响生长和发育，这是不希望看到的。因此，RNAi反应是有效和特异性的并且未表明使这些马铃薯基因沉默将影响杂草化或其它植物-害虫特征。 [0142] 实例9.马铃薯栽培品种W8表征概述 [0143] 马铃薯变种W8通过增加对晚疫病的抗性、降低可引起黑斑损伤的酶的表达和降低丙烯酰胺(通过降低反应物(即天冬酰胺和还原糖)的浓度)来解决马铃薯工业中改良质量的需求。马铃薯变种W8用对马铃薯植物基因体来说原生并且不含外来DNA、农杆菌DNA、病毒标记物或载体主链序列的核酸序列转型。此外，进行农艺研究以确保除与所述特性相关的特征以外，事件与常规对照物相同地生长。 [0144] 农艺特征 [0145] 保持农艺试验以确认当在代表美国用于马铃薯生产的主要区域的多个地区生长时，褐色布尔班克变种W8与对照物褐色布尔班克相比具有等效表现型。在2012年和2013年生长的W8和对照物的农艺特征、产量和定级特征的评估的概述展示于表4和5中。总的来说，结果证实关于这些特征，W8与对照物之间不存在主要差异。在以下表4和5中，第1栏展示特征，第2栏展示种类，第3栏展示所测试的植物的数目，第4栏展示特征的LS平均值，第5栏展示p值(粗体和下划线指示统计显著差异)，第6栏展示标准差(SD)，第7栏展示90％置信区间(CI)并且第8栏展示常规种类的平均值范围(CVR)。在表5中，比较油炸块茎条的颜色与USDA蒙赛尔比色卡(USDA Munsell color chart)。高糖是当与用于法式油炸马铃薯的蒙赛尔比色卡相比时，在最暗侧上具有3号或更暗的主要颜色的油炸条的块茎的百分比。糖端是在测试3号或更暗的颜色时，关于条带的整个宽度，在条带的最暗侧上具有1/4英寸长度或更长的末端的油炸条的块茎的百分比(USDA AMS 1969)。Fry 0-Fry 4是当比较最暗侧的主要颜色与用于法式油炸马铃薯的蒙赛尔比色卡时，具有分别测定为0-4的颜色读数的油炸条的块茎的百分比。因此，所报导的数字是蒙赛尔图表上评分0、1、2、3或4的油炸物的百分比。评分越低颜色越好，0是最佳的。 [0146] 表4 [0147] [0148] [0149] 表5 [0150] [0151] [0152] 基于表4和5中呈现的关于马铃薯栽培品种W8的资料，总体上可得出除早期出现百分比和糖端百分比以外，未经转型的褐色布尔班克种类与马铃薯栽培品种W8之间不存在农艺特征、产量和评级以及生态相互作用方面的主要差异。因此，基于多年资料，褐色布尔班克种类W8不存在由杂草化或植物害虫可能性引起的环境的持久性的显著风险。 [0153] 晚疫病抗性 [0154] 许多马铃薯栽培品种易患晚疫病，其为一种由真菌类卵菌纲病原体致病疫霉引起的破坏性疾病。马铃薯的晚疫病通过叶子和茎干上可快速扩散并且变得坏死的黑色/褐色病灶鉴别。当致病疫霉在宿主作物上快速生长和繁殖时发生严重晚疫病传染性。 [0155] 已将称为Rpi-vnt1的马铃薯晚疫病抗性基因添加到W8中，成功地赋予晚疫病抗性。为了证明晚疫病抗性的功效，通过接种褐色布尔班克种类W8和对照物褐色布尔班克的簇叶和块茎来进行研究。 [0156] 在试验周期结束时，进行每个位点的评级并且概述于以下表6和7中。对马铃薯晚疫病的叶面抗性的结果展示于表6中。每个菌株位点视在所述区域中发现的菌株而具有不同菌株接种物，其包括US-8、US-22或US-23。表6，第1栏展示种类，第2栏展示叶面晚疫病感染LS平均百分比，第3栏展示p值，其中W8与对照物之间的显著差异标有粗体和下划线，并且第4栏展示常规种类范围，其是常规种类的平均值范围。 [0157] 表6 [0158]种类 叶面晚疫病感染平均百分比 P值 CVR 对照物 58.3 <0.0001 18.8-100 W8 0.50 . . [0159] 如表6中所示，与褐色布尔班克对照物相比，检测到W8的叶面晚疫病感染百分比的显著降低，其支持马铃薯晚疫病抗性基因赋予W8中对晚疫病的抗性和在簇叶中有效的结论。 [0160] 以下表7展示W8和对照物的块茎晚疫病感染率的结果，如通过感染百分比测定。表7，第1栏展示晚疫病分离物，第2栏展示种类，第3栏展示晚疫病块茎感染平均百分比并且第 4栏展示P值，其中W8与对照物褐色布尔班克之间的显著差异标有粗体和下划线。 [0161] 表7 [0162]分离物 种类 晚疫病块茎感染平均百分比 P值 US-22 对照物 100.0 . US-22 W8 51.0 <0.0001 US-8 对照物 67.0 US-8 W8 21.1 <0.0001 [0163] 如表7中所示，对于US-22和US-8分离物，与对照物相比，检测到W8的块茎中晚疫病感染百分比的显著降低。 [0164] 黑斑损伤耐受性 [0165] 黑斑损伤是一种影响受损块茎的变色，其代表马铃薯工业中最重要的质量问题之一。所述病状是多酚氧化酶(Ppo)从破损的质体泄漏到细胞质中的结果。在细胞质中，酶使多酚氧化，其接着形成黑色沉淀物。pSIM1278DNA插入物的两个沉默盒中的一个含有来自马铃薯野生种的在调节元件之间以反向重复形式安置的Ppo5基因的片段的两个复本。这一反向重复的表达触发马铃薯Ppo5基因的沉默并且显著降低黑斑损伤的发生率。 [0166] 以两种关于黑斑损伤耐受性的方式分析马铃薯栽培品种W8对照物褐色布尔班克种类的块茎，其易于发生黑斑损伤。 [0167] 块茎变色是由多酚氧化酶的活性引起，其使包括儿茶酚的苯酚氧化以产生快速聚合以产生颜料的化合物。一种测试黑斑损伤耐受性的间接方法是基于将1ml儿茶酚(25mM于50mM MOPS中，pH 6.5)抽吸到块茎的切割表面上并且监测深褐色沉淀物的Ppo依赖性产生。 在20分钟之后评估深褐色沉淀物的Ppo依赖性产生。马铃薯栽培品种W8的儿茶酚分析的结果展示于图10中。如图10中所见，褐色布尔班克对照物变成深褐色表明黑斑损伤，而马铃薯栽培品种W8未变成深褐色表明W8与未经转型的褐色布尔班克对照物相比对黑斑损伤的抗性更高，并且支持降低的黑斑特性的功效。 [0168] 第二种分析损伤耐受性的方法是用酶促分析来测量PPO活性。随时间推移通过测量Α474nm·ΔA474nm·min-1来监测L-DOPA转化成多巴色素的转化率，其转换成μmol·min-1·mg块茎干重-1。如表8中所示，酶促分析表明当与褐色布尔班克对照物相比时，W8具有PPO活性的90％降低(0.025μmol·min-1·mg块茎干重-1)。W8块茎中降低的活性通过Ppo5基因的沉默与减少的黑斑相关联。 [0169] 表8 [0170] [0171] 天冬酰胺和丙烯酰胺含量 [0172] 在收集时，马铃薯栽培品种W8的块茎与对照物相比含有较少的游离天冬酰胺，但含有较多天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸，如表9中所示。W8的游离天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸的平均值皆在耐受区间和组合文献范围内，并且因此视为在马铃薯的正常范围内。表9，第1栏展示氨基酸(mg/100g)，第2栏展示种类，第3栏展示LS平均值，第4栏展示P值，其中W8与对照物褐色布尔班克之间的显著差异标有粗体和下划线，第5栏展示所测试的植物数目，第6栏展示范围，第7栏展示耐受区间范围(TI)，第8栏展示组合文献范围(CLR)，由戴维斯(Davies)(1977),谢普德(Shepherd)等人(2010)和利辛斯卡(Lisinska)和列辛斯基(Leszczynski)(1989)获得。 [0173] 表9 [0174] [0175] 降低的天冬酰胺、果糖和葡萄糖含量引起经加工的马铃薯产物中丙烯酰胺的整体降低，因为其是丙烯酰胺形成中的反应物。为了证明减少丙烯酰胺的功效，在采集时和在正常(46℉)和冷藏(38℉)储存温度下储存3、6和9个月之后分析W8和对照物褐色布尔班克的田间种植块茎，其中结果展示于表10和11中。在测试丙烯酰胺之前，将W8和对照物褐色布尔班克制成薯条。表10展示在采集时和在46℉下储存之后的薯条丙烯酰胺含量(十亿分率；ppb)，并且表11展示在采集时和在38℉下储存之后的薯条丙烯酰胺含量(十亿分率；ppb)。 表10和11，第1栏展示在进行测试时的时序，第2栏展示化合物，第3栏展示种类，第4栏展示丙烯酰胺含量LS平均值(ppb)，第5栏展示P值，其中W8与对照物之间的显著差异标有粗体和下划线，第6栏展示在相同储存时间时，与对照物相比丙烯酰胺的降低百分比，第7栏展示所测试的块茎数目，第8栏展示丙烯酰胺范围(ppb)并且第9栏展示耐受区间(TI)。 [0176] 表10 [0177] [0178] 表11 [0179] [0180] 如表10中所示，在采集时，由W8块茎制成的薯条中所含的丙烯酰胺比对照物褐色布尔班克少85％。当马铃薯在46℉下储存九个月时，W8中的丙烯酰胺含量比对照物褐色布尔班克低78％至83.7％。如表11中所示，在38℉下储存6到9个月之后，W8薯条中的丙烯酰胺含量始终显著低于对照物。 [0181] 还原糖和转化酶沉默 [0182] 马铃薯栽培品种W8含有表达盒，其通过多种机制降低块茎中还原糖的含量。通过pSIM1278的转型作用，引入用于淀粉相关基因(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的启动子的沉默盒，而pSIM1678的转型作用引入用于转化酶基因的沉默盒(叶(Ye)等人2010)。总而言之，这些特性通过减缓淀粉和蔗糖转化成还原糖(葡萄糖和果糖)来发挥功能。当在采集之后一个月分析时，尽管R1和PhL的沉默引起还原糖含量降低(科林奇和克拉克2013)，但主要的还原糖降低似乎与转化酶沉默相关。使R1、PhL和VInv沉默的整体优势包括改良的质量，尤其与颜色对照物相关，并且因此有助于大部分薯条或晶片消费者要求的所需金褐色。而且，还原糖与氨基酸(如天冬酰胺)反应以产生梅纳产物，包括丙烯酰胺。 [0183] pSIM1678中的VInv基因沉默盒引起液泡转化酶含量降低，液泡转化酶是将蔗糖转化成葡萄糖和果糖的酶。当马铃薯中转化酶的含量降低时，还原糖葡萄糖和果糖在储存期间保持低含量而蔗糖增加，尤其当保持在低于薯条的典型储存温度46-48℉下时。在测试转化酶活性之前，块茎在39℉下储存一个月。使用W8和褐色布尔班克对照物中的每一个的三个复本进行分析并且通过葡萄糖聚集来测量活性(单位：nmol/min/gm块茎)。如表12中所示，与对照物褐色布尔班克相比，W8具有冷冻储存的块茎中的液泡转化酶活性降低85％。W8块茎中降低的液泡转化酶活性与由VInv基因和较低含量的还原糖葡萄糖和果糖引起的RNA聚集减少相关，如表13和14中所示。 [0184] 表12 [0185] [0186] 需要长期冷冻储存以保持高质量马铃薯的充分供应，以便在整年内加工成薯条和薯片，但也引起冷冻诱导的甜化(CIS)。CIS引起在高温下加工的马铃薯产物中不合需要的副作用，包括味道改变、不合需要的黑色和丙烯酰胺量升高。液泡酸转化酶(VInv)是一种在CIS过程中极其重要的酶，其增加在极低温度下储存的块茎中葡萄糖和果糖的量(茨伦纳(Zrenner)等人1996)。W8具有VInv基因的抑制表达，并且因此在冷冻储存时具有降低的葡萄糖和果糖含量且与褐色布尔班克对照物相比具有较少CIS。为了说明引起降低的还原糖的特性的功效，在采集时以及在正常(46℉)和冷冻(38℉)储存温度下分析W8和未经转型的对照物的田间种植块茎。 [0187] 在采集时并且接着在储存3、6和9个月之后测试W8中的还原糖葡萄糖加果糖以及非还原糖蔗糖。使用两种不同储存温度，46°F，其通常用于指定用于冷冻薯条的褐色布尔班克马铃薯，和38°F，由使VInv沉默而实现的较低温度，可能在不存在高还原糖含量的情况下实现更好的质量。在采集时和在所有储存时间点和温度下，W8块茎与对照物相比含有较低含量的还原糖果糖和葡萄糖，如表13和14中所示。W8在采集时的所有糖值皆在耐受区间内，表明与对照物在组成上等效。表13展示在采集时和在46℉下储存3、6或9个月之后，果糖加葡萄糖和蔗糖的马铃薯糖含量，并且表14展示当在38℉下储存6或9个月时，果糖加葡萄糖和蔗糖的马铃薯糖含量。表13和14，第1栏展示在进行测试时的时序，第2栏展示种类，第3栏展示糖含量LS平均值(mg/100g)，第4栏展示P值，其中W8与对照物之间的显著差异标有粗体和下划线，第5栏展示所测试的块茎数目，第6栏展示糖范围(mg/100g)并且第7栏展示耐受区间(TI)。 [0188] 表13 [0189] [0190] 表14 [0191] [0192] 如表13和14中所示，在38°F和46°F下，在采集时和在多个储存时间点之后，所有W8块茎与对照样品相比含有更多的蔗糖。使W8中VInv基因沉默的最终结果是较低含量的还原糖和较高含量的蔗糖。在采集时和在长达9个月的整个存储周期内观察到这些变化。W8中的还原糖随储存时间而增加，但始终保持低于褐色布尔班克对照物。当在38°F下储存时，与对照物相比，在W8中观察到显著更低含量的还原糖，表明对W8可实行更低的温度储存。在所有情况下，还原糖的显著降低与较高含量的蔗糖偶合。预期较低的温度储存引起呼吸损耗较少，但也将降低由疾病引起的损失。 [0193] 褐色布尔班克马铃薯栽培品种W8通过增加对晚疫病的抗性、降低可引起黑斑的酶的表达、通过降低天冬酰胺和降低还原糖含量来减少丙烯酰胺来解决马铃薯工业中改良质量的需要。 [0194] 本发明的其它实施例 [0195] 产生可组合上文提及的有利特征的马铃薯种类的研究大部分是凭经验的。这种研究需要投入大量时间、劳动力和金钱。从温室到市售用途，马铃薯栽培品种的研发通常可耗费长达八年或更长时间。育种从谨慎选择优良亲本开始，以将最重要的特征并入后代。因为所有所需特性通常不会仅在一次杂交后呈现，育种必须是累积的。 [0196] 现有育种技术继续使用亲本纯系的受控授粉作用。通常，在明胶胶囊中收集花粉以供稍后用于对雌性亲本授粉。在温室中播种杂交种子并且从数千个个别幼苗收集和保留块茎。第二年，在田间种植来自每个所得幼苗的一到四个块茎，其中非常注意避免病毒和疾病的传播。由这种第一年幼苗作物，保留在选择过程中存活的来自每个杂交个体的若干“种子”块茎以用于后一年的种植。在第二年之后，收集样品以用于密度测量和油炸测试，以便测定块茎对市售使用的合适性。接着，在第三年，以扩增量种植在这点上在选择过程中存活的植物，以用于更全面的油炸测试和密度测定系列。在研发的第四年阶段，存活选择在若干状态下经历田间试验以测定其对不同生长条件的适应性。最终，将具有优良质量的种类转移到其它农场并且种子增加到市售规模。通常，到这时，已经尝试投资八年或更长时间的种植、采集和测试以研发新的和改良的马铃薯栽培品种。 [0197] 随着允许编码特异性蛋白质产物的基因的分离和表征的分子生物技术出现，植物生物学领域的科学家对工程改造植物的基因体以含有和表达外来基因或其它基因，或原生基因的经修饰版本或内源性基因(可能由不同启动子驱动)以便以特异性方式改变植物的特性产生强烈兴趣。这类外来其它和/或经修饰基因在本文中统称为“转基因”。在最近十五到二十年，已研发若干种用于产生转基因植物的方法，并且在特定实施例中，本发明也涉及所要求的种类或品系的经转型版本。 [0198] 植物转型涉及将在植物细胞中发挥功能的表达载体的构筑。这类载体包含DNA，其包含受调节元件(例如启动子)控制或可操作地连接于调节元件的基因。表达载体可含有一或多个这类可操作地连接的基因/调节元件组合。载体可呈质体形式，并且单独或与其它质体组合使用，使用如下文所述的转型方法将转基因并入马铃薯植物的基因材料，以便提供经转型的马铃薯植物。 [0199] 传统植物育种通常依赖于植物染色体的随机再结合，以产生具有新的和改良的特征的种类。根据标准、众所周知的技术，将包含基因和调节元件的基因“表达盒”插入农杆菌分离的转移DNA(“T-DNA”)的边界内并且整合到植物基因组中。农杆菌介导的T-DNA物质的转移通常包含以下标准程序：(1)基因元件的活体外再结合，其中至少一个基因元件是外来来源，以便产生用于转型作用的选择的表达盒，(2)将这一表达盒(通常与至少一个含有外来DNA的其它表达盒)一起插入双运载体的T-DNA区域，所述T-DNA区域通常由数百个由T-DNA边界序列侧接的农杆菌DNA的碱基对组成，(3)将位于T-DNA边界之间的序列(通常伴有来自农杆菌的一些或全部其它双运载体序列)转移到植物细胞中，和(4)选择显示所需特性的经稳定转型的植物细胞，如产量增加、活力改良、对疾病和昆虫的抗性增强或更大的在应力下的存活能力。 [0200] 因此，遗传工程改造方法依赖于外来、非原生核酸(包括调节元件，如启动子和终止子)和涉及新特性的表达或充当用于转型体的鉴别和选择的标记物(来自病毒、细菌和植物)的基因的引入。标记物基因通常来源于细菌来源并且提供抗生素或除草剂抗性。经典育种方法是费力和耗时的，并且新种类通常仅显示相对适度的改良。 [0201] 在“反义”技术中，颠倒原生基因的序列以使转基因植物中基因的表达沉默。然而，反向DNA通常含有插入在启动子与终止子之间的新的和未表征的开放阅读框架，其编码可能不合需要的外来氨基酸序列，因为其干扰植物发育和/或降低其营养价值。 [0202] 用于马铃薯转型的表达载体：标记基因 [0203] 表达载体包括至少一种基因标记物，其可操作地连接于调节元件(例如启动子)，所属调节元件允许通过阴性选择(即，抑制不含有可选标记基因的细胞的生长)或阳性选择(即，筛选由基因标记物编码的产物)回收含有所述标记物的经转型细胞。许多用于植物转型的常用可选标记基因是转型技术中众所周知的，并且包括例如编码可以代谢方式使选择性化学试剂(其可以是抗生素或除草剂)解毒的酶的基因，或编码对抑制剂不敏感的改变的目标的基因。所属领域中也已知少数阳性选择方法。 [0204] 一种用于植物转型的常用可选标记基因是新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，其受植物调节信号控制，提供对卡那霉素(kanamycin)的抗性。弗雷利(Fraley)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.),80:4803(1983)。另一种常用可选标记基因是潮霉素磷酸转移酶基因，其提供对抗生素潮霉素的抗性。范登艾尔泽(Vanden Elzen)等人,植物分子生物学(Plant Mol.Biol.),5:299(1985)。 [0205] 提供对抗生素的抗性的细菌来源的其它可选标记基因包括健大霉素(gentamycin)乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶和氨基糖苷-3'-腺苷转移酶(博莱霉素(bleomycin)抗性决定子)。海福德(Hayford)等人,植物生理学(Plant Physiol.)86:1216(1988)，琼斯(Jones)等人,分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.),210:86(1987)，斯瓦伯(Svab)等人,植物分子生物学14:197(1990)，希尔(Hille)等人,植物分子生物学7:171(1986)。其它可选标记基因提供对除草剂(如草甘膦(glyphosate)、草铵膦(glufosinate)或溴苯腈(bromoxynil))的抗性。科麦(Comai)等人,自然(Nature)317:741-744(1985)，戈登-卡姆(Gordon-Kamm)等人,植物细胞(Plant Cell)2:603-618(1990)和斯德克(Stalker)等人,科学(Science)242:419-423(1988)。 [0206] 非细菌来源的用于植物转型的可选标记基因包括例如小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶和植物乙酰乳酸合成酶。艾科茨(Eichholtz)等人,体细胞分子遗传学(Somatic Cell Mol.Genet.)13:67(1987)，沙阿(Shah)等人,科学233:478(1986)，查尔斯特(Charest)等人,植物细胞报告(Plant Cell Rep.)8:643(1990)。 [0207] 另一种用于植物转型的标记物基因需要筛选假设转型的植物细胞，而非用于对毒性物质(如抗生素)的抗性的经转型细胞的直接遗传选择。这些基因尤其适用于定量或观察特异性组织中基因的表达的空间模式并且通常称为报导子基因，因为其可与用于基因表达的研究的基因或基因调节序列融合。用于筛选假设转型细胞的常用基因包括β-葡糖苷酸酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、英光素酶和氯霉素乙酰转移酶。杰佛森(Jefferson,R.A.),植物分子生物学报导5:387(1987)，泰里(Teeri)等人,欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)8:343(1989)，孔茨(Koncz)等人,美国国家科学院院刊84:131(1987)，德布劳克(DeBlock)等人，欧洲分子生物学杂志3:1681(1984)。 [0208] 用于观察GUS活性的活体内方法无需破坏可使用的植物组织。分子探针公司(Molecular Probes)公开案2908，IMAGENE GREEN,第1-4页(1993)和奈尔维(Naleway)等人,细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)115:151a(1991)。然而，由于低敏感性、高荧光背景和与使用萤光素酶基因作为可选标记相关的局限性，未证明这些用于观察GUS活性的活体内方法适用于回收经转型的细胞。 [0209] 最近，已使用编码绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein/GFP)的基因作为用于原核和真核细胞中的基因表达的标记物。查尔菲(Chalfie)等人,科学263:802(1994)。可使用GFP和GFP的突变体作为可筛选标记物。 [0210] 用于马铃薯转型的表达载体：启动子 [0211] 表达载体中包括的基因必须由包含调节元件(例如启动子)的核苷酸序列驱动。若干类型的启动子以及其它可单独或与启动子组合使用的调节元件在转型技术中是众所周知的。 [0212] 如本文中所使用，“启动子”包括对来自转录起始并且涉及RNA聚合酶和其它用于起始转录的蛋白质的识别和结合的DNA上游区域的参考。“植物启动子”是能够引起植物细胞中的转录的启动子。在研发控制下的启动子的实例包括优先起始某些组织中的转录(如叶子、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织)的启动子。这类启动子称为“组织优选”。仅起始某一组织中的转录的启动子称为“组织特异性”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动一或多种器官中某些细胞类型(例如根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”启动子是受环境控制的启动子。可以通过诱导型启动子实现转录的环境条件的实例包括厌氧条件或存在光。组织特异性、组织优选、细胞类型特异性和诱导型启动子组成“非组成性”启动子类别。“组成性”启动子是在大部分环境条件下具有活性的启动子。 [0213] A.诱导型启动子 [0214] 诱导型启动子可操作地连接于用于马铃薯中的表达的基因。任选地，诱导型启动子可操作地连接于编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列可操作地连接于用于马铃薯中的表达的基因。在诱导型启动子情况下，转录率回应于诱导剂而增加。 [0215] 本发明可使用任何诱导型启动子。参见沃德(Ward)等人,植物分子生物学22:361-366(1993)。例示性诱导型启动子包括(但不限于)来自ACEI系统的对铜起反应的启动子(米特(Mett)等人,美国国家科学院院刊90:4567-4571(1993))；来自玉米的对苯磺酰胺除草剂安全剂起反应的In2基因(赫胥(Hershey)等人,分子基因遗传学(Mol.Gen Genetics)227: 229-237(1991)和加茨(Gatz)等人,分子基因遗传学243:32-38(1994))或来自Tn10的Tet抑制剂(加茨等人,分子基因遗传学227:229-237(1991))。尤其优选诱导型启动子是对诱导剂起反应的启动子，其中植物通常不对所述诱导剂起反应。例示性诱导型启动子是来自类固醇激基因的诱导型启动子，其转录活性是由糖皮类固醇激素诱导。斯赫纳(Schena)等人,美国国家科学院院刊88:0421(1991)。 [0216] B.组成型启动子 [0217] 组成型启动子可操作地连接于用于马铃薯中的表达的基因或组成型启动子可操作地连接于编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列可操作地连接于用于马铃薯中的表达的基因。 [0218] 本发明中可使用许多不同的组成型启动子。例示性组成型启动子包括(但不限于)来自植物病毒的启动子，如来自CaMV的35S启动子(奥德尔(Odell)等人,自然313:810-812(1985))和来自如大米肌动蛋白的基因的启动子(麦克尔罗伊(McElroy)等人,植物细胞2:163-171(1990))；泛素(克里斯滕森(Christensen)等人,植物分子生物学12:619-632(1989)和克里斯滕森等人,植物分子生物学18:675-689(1992))；pEMU(拉斯特(Last)等人,理论应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)81:581-588(1991))；MAS(费尔滕(Velten)等人,欧洲分子生物学杂志3：2723-2730(1984))和玉米H3组蛋白(勒珀蒂(Lepetit)等人,分子基因遗传学231:276-285(1992)和安塔索瓦(Atanassova)等人,植物杂志(Plant Journal)2(3):291-300(1992))。 [0219] ALS启动子，对于甘蓝型油菜(Brassica napus)ALS3结构基因位于5'的Xba1/Ncol片段(或与所述Xba1/Ncol片段类似的核苷酸序列)，代表尤其适用的组成型启动子。参见PCT申请案WO 96/30530。 [0220] C.组织特异性或组织优选启动子 [0221] 组织特异性启动子可操作地连接于用于马铃薯中的表达的基因。任选地，组织特异性启动子可操作地连接于编码信号序列的核苷酸序列，所述信号序列可操作地连接于用于马铃薯中的表达的基因。可操作地连接于组织特异性启动子的经相关基因转型的植物独占地或优选地在特定组织中产生转基因的蛋白质产物。 [0222] 本发明中可使用任何组织特异性或组织优选启动子。例示性组织特异性或组织优选启动子包括(但不限于)根优选启动子，如来自菜豆蛋白基因的启动子(穆雷(Murai)等人,科学23:476-482(1983)和森古普塔-格帕兰(Sengupta-Gopalan)等人,美国国家科学院院刊82:3320-3324(1985))；叶子特异性和光诱导的启动子，如来自cab或核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(辛普森(Simpson)等人,欧洲分子生物学杂志4(11):2723-2729(1985)和蒂姆科(Timko)等人,自然318:579-582(1985))；花药特异性启动子，如来自LAT52的启动子(特维尔(Twell)等人,分子基因遗传学217:240-245(1989))；花粉特异性启动子，如来自Zm13的启动子(格雷罗(Guerrero)等人,分子基因遗传学244:161-168(1993))或小孢子优选启动子，如来自apg的启动子(特维尔等人,有性植物繁殖(Sex.Plant Reprod.)6:217-224(1993))。 [0223] 用于使蛋白质靶向亚细胞隔室的信号序列 [0224] 借助于使编码信号序列的核苷酸序列可操作地连接于编码相关蛋白质的基因的5'和/或3'区域来实现将由转基因产生的蛋白质传递到亚细胞隔室(如叶绿体、液泡、过氧化体、乙醛酸循环体、细胞壁或线粒体)或分泌到非原质体(apoplast)中。可在蛋白质合成和处理期间测定结构基因的5'和/或3'端的靶向序列，其中最终分隔经编码的蛋白质。 [0225] 存在信号序列可将多肽引导到细胞内细胞器或亚细胞隔室或分泌到非原质体中。许多信号序列是所属领域中已知的。参见例如贝克尔(Becker)等人,植物分子生物学20:49(1992)；克罗斯(Close,P.S.),硕士论文(Master's Thesis),爱荷华州立大学(Iowa State University)(1993)；克诺克斯(Knox,C.)等人,植物分子生物学9:3-17(1987)；莱内尔(Lerner)等人,植物生理学91:124-129(1989)；方特斯(Frontes)等人，植物细胞3:483-496(1991)；松冈(Matsuoka)等人,美国国家科学院院刊88:834(1991)；古尔德(Gould)等人,细胞生物学杂志(J.Cell.Biol.)108:1657(1989)；克里森(Creissen)等人,植物杂志(Plant J.)2:129(1991)；卡尔德隆(Kalderon)等人,细胞(Cell)39:499-509(1984)；斯特非尔(Steifel)等人,植物细胞2:785-793(1990)。 [0226] 外来蛋白质基因和农艺基因 [0227] 在本发明的转基因植物情况下，可产生市售量的外来蛋白质。因此，用于经转型的植物的选择和繁殖的技术(其在所属领域中良好理解)产生多种转基因植物，其以常规方式收集，并且接着可从相关组织或整个生物提取外来蛋白质。从植物生物的蛋白质提取可通过已知方法实现，其由例如亨利(Heney)和奥尔(Orr),分析生物化学(Anal.Biochem.)114:92-6(1981)。 [0228] 根据优选实施例，提供用于外来蛋白质的商业制备的转基因植物是马铃薯植物。在另一个优选实施例中，相关生物是种子或块茎。对于展示较高表达量的相对较少数目的转基因植物，可产生基因图，主要通过常规RFLP、PCR和SSR分析，其鉴别所整合的DNA分子的大致染色体位置。对于这方面的例示性方法，参见格里克(Glick)和汤普森(Thompson),植物分子生物学和生物技术CRC挤压中的方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology CRC Press),波卡拉顿(Boca Raton)269:284(1993)。关于染色体位置的图信息适用于标的转基因植物的所有权保护。如果进行未经授权的繁殖并且与其它胚质杂交，可比较整合区域的图与可疑植物的类似图，以便测定可疑植物是否与标的植物具有共同起源。图比较将涉及杂交、RFLP、PCR、SSR和测序，其皆是常规技术。 [0229] 类似地，借助于本发明，可在经转型的植物中表达农艺基因。更具体地说，植物可经基因工程改造以表达具有农艺利益的多种表现型。与这方面有关的例示性基因包括(但不限于)以下分类的基因： [0230] 1.提供对害虫或疾病的抗性并且编码以下各者的基因： [0231] A.植物疾病抗性基因。植物防御通常由植物中的疾病抗性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互相用活化。植物种类可用克隆的抗性基因转型以工程改造对特定病原体菌株具有抗性的植物。参见例如琼斯等人,科学266:789(1994)(用于对黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)的抗性的番茄Cf-9基因的克隆)；马丁(Martin)等人,科学262:1432(1993)(用于对番茄细菌性斑点病(Pseudomonas syringae pv.tomato)的抗性的番茄Pto基因编码蛋白质激酶)；米德诺斯(Mindrinos)等人,细胞78: 1089(1994)(用于对丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性的芥菜属RSP2基因)。 [0232] B.提供对害虫(如大豆异皮线虫(soybean cyst nematode))的抗性的基因。参见例如PCT申请案WO 96/30517；PCT申请案WO 93/19181。 [0233] C.苏力菌(Bacillus thuringiensis)蛋白质，其衍生物或其模型化合成多肽。参见例如盖泽(Geiser)等人,基因(Gene)48:109(1986)，其披露Btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可从弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,Virginia)购买，例如以ATCC寄存编号40098、67136、31995和31998。 [0234] D.凝集素。参见例如范达美(Van Damme)等人,植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)24:25(1994)，其披露若干君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列。 [0235] E.维生素结合蛋白质，如抗生物素蛋白。参见PCT申请案US 93/06487，其教示抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同系物作为针对昆虫害虫的杀幼虫剂的用途。 [0236] F.酶抑制剂，例如蛋白酶或蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。参见例如亚伯(Abe)等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262:16793(1987)(大米半胱氨酸蛋白酶抑制剂的核苷酸序列)、胡伯(Huub)等人,植物分子生物学21:985(1993)(编码烟草蛋白酶抑制剂I的cDNA的核苷酸序列)、萨米塔尼(Sumitani)等人 ,生物科学生物技术生物化学(Biosci.Biotech.Biochem.)57:1243(1993)(海洋放线菌(Streptomyces nitrosporeus)α-淀粉酶抑制剂的核苷酸序列)和美国专利案第5,494,813号(希弗(Hepher)和阿特金森(Atkinson),1996年2月27日颁布)。 [0237] G.昆虫特异性激素或信息素，如蜕皮类固酸或保幼激素、其变异体、基于其的模拟剂或其拮抗剂或促效剂。参见例如哈姆莫克(Hammock)等人,自然344:458(1990)中关于经克隆的保幼激素酯酶(一种保幼激素的失活剂)的杆状病毒表达的公开内容。 [0238] H.昆虫特异性肽或其神经肽，其在表达时干扰受影响的害虫的生理机能。举例来说，参见里根(Regan),生物化学杂志269:9(1994)(表达克隆产生编码昆虫利尿剂激素受体的 D N A) 和普 拉 特 (P r a t t) 等 人 ,生 物 化 学 与 生 物 物 理 研 究 通 讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)163:1243(1989)(在太平洋折翅蠊(Diploptera puntata)中鉴别的抑咽侧体神经肽)的公开内容。还可以参见颁予托马斯基(Tomalski)等人的美国专利案第5,266,317号，其公开编码昆虫特异性、麻痹性神经毒素的基因。 [0239] I.本质上由蛇、黄蜂等产生的昆虫特异性毒液。例如参见潘(Pang)等，基因(Gene)116:165(1992)，关于编码蝎昆虫毒性肽的基因在植物中的异源表达的公开内容。 [0240] J.引起单萜、倍半萜、类固醇、氧肟酸、苯丙素衍生物或另一种具有杀昆虫活性的非蛋白质分子的超累积的酶。 [0241] K.涉及生物学活性分子的修饰(包括翻译后修饰)中的酶；例如糖分解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、壳质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是合成的。参见PCT申请案WO 93/02197(斯科特(Scott)等人)，其披露了纤维二糖酶(callase)基因的核苷酸序列。含有壳质酶编码序列的DNA分子可以例如以寄存编号39637和67152从ATCC获得。还可参见克拉默(Kramer)等人，昆虫生物化学分子生物学(Insect Biochem.Molec.Biol.)23:691(1993)(其教示了编码烟草钩虫壳质酶的cDNA的核苷酸序列)和卡瓦尼克(Kawalleck)等人，植物分子生物学21:673(1993)(其提供欧芹ubi4-2聚泛素基因的核苷酸序列)。 [0242] L.刺激信号转导的分子。例如参见博特拉(Botella)等人，植物分子生物学24:757(1994)(其关于绿豆钙调蛋白cDNA纯系的核苷酸序列)和格里斯(Griess)等人，植物生理学104:1467(1994)(其提供了玉米钙调蛋白cDNA纯系的核苷酸序列)的公开内容。 [0244] N.膜通透酶、通道形成剂或通道阻断剂。例如参见杰恩斯(Jaynes)等人，植物科学(Plant Sci.)89:43(1993)的公开内容，其关于异源表达杀菌肽-β-溶解肽类似物以给予对茄假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)有抗性的转基因烟草植物。 [0245] O.病毒侵袭性蛋白质或由其衍生的复合毒素(complex toxin)。例如，病毒外壳蛋白质在经转型的植物细胞中的积累赋予对由衍生外壳蛋白基因的病毒以及相关病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。参见比奇(Beachy)等人,植物病理学综述(Ann.Rev.Phytopathol.)28:451(1990)。已经对经转型的植物赋予针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白质介导的抗性。 [0246] P.由其衍生的昆虫特异性抗体或免疫毒素。因此，靶向昆虫肠中至关重要的代谢功能的抗体会使受影响的酶失活，杀死昆虫。参见泰勒(Taylor)等人,497号摘要,关于分子植物-微生物相互作用的第七次国际会议(Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions)(苏格兰爱丁堡(Edinburgh,Scotland)(1994))(在转基因烟草中经由单链抗体片段的产生进行的酶促失活)。 [0247] Q.病毒特异性抗体。参见例如特拉多奇(Tavladoraki)等人，自然366:469(1993)，其展示表达重组型抗体基因的转基因植物免于病毒攻击。 [0248] R.本质上由病原体或寄生物产生的发育阻滞蛋白质。因此，真菌内-α-1，4-D-聚半乳糖醛酶通过使植物细胞壁同-α-1，4-D-半乳糖醛酶溶解来促进真菌定殖和植物营养物释放。参见拉姆(Lamb)等人,生物技术(Bio/Technology)10:1436(1992)。图巴特(Toubart)等人，植物杂志(Plant J.)2:367(1992)描述了编码豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白质的基因的克隆和表征。 [0249] S.本质上由植物产生的发育阻滞蛋白质。举例来说，罗格曼(Logemann)等人，生物技术10:305(1992)证实表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的对真菌疾病的抗性。 [0250] T.涉及系统性后天性抗性(SAR)反应和/或发病机理相关基因的基因。布里格斯(Briggs),当代生物学(S.Current Biology)5(2)(1995)。 [0251] U.抗真菌基因。参见科内利森(Cornelissen)和梅尔彻斯(Melchers),植物生理学,101:709-712(1993)；帕里斯基(Parijs)等人,植物学(Planta)183:258-264(1991)和布什内尔(Bushnell)等人,植物路径的研究(Can.J.of Plant Path)20(2):137-149(1998)。 [0252] V.提供对疫病(Phytophthora blight)的抗性的基因，如R1、R2、R3、R4和其它抗性基因。参见奈斯(Naess,S.K.)等人,(2000)野生墨西哥土豆(Solanum bulbocastanum)中对晚疫病的抗性映射到染色体8.遗传学理论应用(Theor.Appl.Genet.)101:697-704和李(Li,X.)等人,(1998)使用常用AFLP标记物的同源四倍体和基因映射：提供对致病疫霉的抗性的R2等位基因映射到马铃薯染色体4上。遗传学理论应用96:1121-1128。 [0253] 2.提供对除草剂的抗性的基因，例如： [0254] A.抑制生长点或分生组织的除草剂，如咪唑啉酮或磺酰脲。这种类别中的例示性基因编码突变体ALS和AHAS，如例如分别由李(Lee)等人,欧洲分子生物学杂志7:1241(1988)和三木(Miki)等人,遗传学理论应用80:449(1990)描述。 [0255] B.草甘膦(分别由突变体5-烯醇丙酮酰-3-磷酸合成酶(EPSP)和aroA基因减弱的抗性)和其它膦酰基化合物(如草铵膦(glufosinate)(草丁膦乙酰基转移酶(PAT)和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)PAT bar基因)和吡啶氧(pyridinoxy)或苯氧丙酸和环己烷(cyclohexones)(ACC酶抑制剂编码基因)。参见例如美国专利案第4,940,835号，其披露了可提供草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变型aroA基因的DNA分子可以按ATCC寄存编号39256获得，而突变型基因的核苷酸序列披露于颁予科麦的美国专利案第4,769,061号中。颁予熊田(Kumada)等人的欧洲专利申请案第0 333 033号和美国专利案第 4,975,374号披露了提供对除草剂(如L-草丁膦)的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。颁予李曼斯(Leemans)等人的欧洲申请案第0 242 246号中提供PAT基因的核苷酸序列。 迪格里夫(DeGreef)等人，生物技术7:61(1989)描述表达编码草丁膦乙酰基转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。提供对苯氧基丙酸和环己烷(如稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop))的抗性的基因的例子是由马歇尔(Marshall)等人，遗传学理论应用83:435(1992)描述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc2-S3基因。 [0256] C.抑制光合作用的除草剂，如三嗪(psbA和gs+基因)和苯甲腈(腈水解酶基因)。普茨比拉(Przibilla)等人，植物细胞(Plant Cell)3:169(1991)描述用编码突变型psbA基因的质体转型衣藻属(Chlamydomonas)。用于腈水解酶基因的核苷酸序列披露于颁予斯德克的美国专利案第4,810,648号并且含有这些基因的DNA分子可按ATCC寄存编号53435、67441和67442获得。海斯(Hayes)等人，生物化学杂志285:173(1992)描述编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。 [0257] D.已将乙酰羟酸合成酶引入多种植物中，发现表达这种酶的植物对多种除草剂具有抗性。参见哈托利(Hattori)等人,分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)246:419,1995。其它提供对除草剂的耐受性的基因包括编码大鼠细胞色素P4507A1的嵌合蛋白质和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的基因(盐田(Shiota)等人,植物生理学,106:17, 1994)、谷胱甘肽还原酶和超氧化歧化酶的基因(奥诺(Aono)等人,植物细胞生理学36: 1687,1995)和多种磷酸转移酶的基因(达塔(Datta)等人,植物分子生物学20:619,1992)。 [0258] E.原卟啉原氧化酶(protox)是产生叶绿素所必需的，叶绿素是所有植物存活所必需的。原卟啉原氧化酶充当多种除草化合物的目标。这些除草剂还抑制所有存在的不同植物物种的生长，引起其完全破坏。含有经改变的原卟啉原氧化酶活性的对这些除草剂具有抗性的植物的产生描述于美国专利案第6,288,306号；第6,282,837号；第5,767,373号；以及国际公开案WO 01/12825中。 [0259] 3.提供或促进附加值特性的基因，如： [0260] A.经修饰的脂肪酸代谢，例如通过用十八烷酰-ACP去饱和酶的反义基因转型植物以增加植物的硬脂酸含量来进行。参见克鲁尔宗(Knultzon)等人,美国国家科学院院刊89:2625(1992)。 [0261] B.降低的肌醇六磷酸含量，1)引入植酸酶编码基因将增强肌醇六磷酸的分解，为经转型的植物增加更多的游离磷酸。举例来说，关于黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶基因的核苷酸序列的公开内容，参见范哈金斯特(Van Hartingsveldt)等人,基因127:87(1993)。2)可引入可降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉米中，举例来说，这可通过克隆并且接着再引入与可引起由低含量植酸表征的玉米突变的单个等位基因相关的DNA来实现。参见雷波伊(Raboy)等人,美迪卡(Maydica)35:383(1990)。 [0262] C.经修饰的碳水化合物组合物，其通过用编码可改变淀粉的分支模式的酶的基因使植物转型而实现。参见什罗扎(Shiroza)等人,细菌学杂志(J.Bacteriol.)170:810(1988)(链球菌突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)、施泰因梅茨(Steinmetz)等人,分子遗传学与普通遗传学20:220(1985)(枯草杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)、潘(Pen)等人,生物技术10:292(1992)(表达藓杨芽胞杆菌(Bacillus lichenifonnis)α-淀粉酶的转基因植物的产生)、艾略特(Elliot)等人,植物分子生物学21:515(1993)(番茄转化酶基因的核苷酸序列)、苏加德 等人,生物化学杂志268: 22480(1993)(大麦α-淀粉酶基因的定点突变诱发)和费舍尔(Fisher)等人,植物生理学 102:1045(1993)(玉米内胚乳淀粉分支酶II)。 [0263] D.通过FAD-2基因修饰增加油酸和/或通过FAD-3基因修饰减少亚麻酸。参见美国专利案第6,063,947号；第6,323,392号；和国际公开案WO 93/11245。 [0264] 4.控制雄性无菌性的基因 [0265] A.在tapetum特异性启动子的控制下引入脱乙酰基酶基因并且施用化学N-Ac-PPT。参见国际公开案WO 01/29237。 [0266] B.引入多种花蕊特异性启动子。参见国际公开案WO 92/13956和WO 92/13957。 [0267] C.引入芽胞杆菌RNA酶和芽胞杆菌RNA酶抑制剂基因。参见保罗(Paul)等人,植物分子生物学19:611-622,1992。 [0268] 用于马铃薯转型的方法 [0269] 已研发许多用于植物转型的方法，包括生物和生理植物转型方案。参见例如三木等人,“用于将外来DNA引入植物的程序”,植物分子生物学和生物技术中的方法,格里克(Glick,B.R.)和汤普森(Thompson,J.E.)编(CRC出版公司(CRC Press,Inc.),波卡拉顿(Boca Raton),1993),第67-88页。此外，可使用用于植物的植物细胞或组织转型和再生的表达载体和活体外培养方法。参见例如格鲁伯等人“, 用于植物转型的载体”,植物分子生物学和生物技术中的方法,格里克和汤普森编(CRC出版公司,波卡拉顿,1993),第89-119页。 [0270] A.农杆菌介导的转型作用，一种用于将表达载体引入植物中的方法是基于农杆菌的天然转型系统。参见例如霍施(Horsch)等人,科学227:1229(1985)。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤细菌，其以遗传方式转型植物细胞。根癌农杆菌和发根农杆菌的Ti和Ri质体分别携带负责植物的基因转型的基因。参见例如卡多(Kado,C.I.),植物科学重要综述(Crit.Rev.Plant Sci.)10:1(1991)。关于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的说明由格鲁伯等人,见上文、三木等人,见上文和莫洛尼等人,植物细胞报告(Plant Cell Reports)8:238(1989)提供。还参见美国专利案第5,563,055号(唐森德(Townsend)和托马斯(Thomas)),1996年10月8日颁布。 [0271] B.直接基因转移，已研发统称为直接基因转移的若干种植物转型方法作为农杆菌介导的转型的替代方案。微粒子弹的植物表面的通常适用的方法测量1到4μm。用生物弹射击装置将表达载体引入植物组织，所述生物弹射击装置促进微粒子弹的速度达到300到600m/s，其足以渗透植物细胞壁和细胞膜。桑福德(Sanford)等人,科学技术部分 (Part.Sci.Technol.)5:27(1987)；桑福德(Sanford,J.C.)趋势生物技术(Trends Biotech)6:299(1988)；克莱因(Klein)等人,生物技术6:559-563(1988)；桑福德植物生理学7:206(1990)；克莱因等人,生物技术10:268(1992)。还参见美国专利案第5,015,580号(赫里斯图(Christou)等人),1991年5月14日颁布和美国专利案第5,322,783号(托姆斯(Tomes)等人),1994年6月21日颁布。 [0272] 另一用于将DNA物理传递到植物中的方法是目标细胞的超声波处理。张(Zhang)等人,生物技术9:996(1991)。或者，已使用脂质体和球形质体融合物将表达载体引入植物。德赛(Deshayes)等人,欧洲分子生物学杂志4:2731(1985)；赫里斯图等人,美国国家科学院院刊84:3962(1987)。还报导使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接捕捉到原生质体中。哈因(Hain)等人,分子遗传学与普通遗传学199:161(1985)和德雷珀(Draper)等人,植物细胞生理学23:451(1982)。还描述原生质体以及完全全细胞和组织的电穿孔。唐(Donn)等人,植物细胞和组织培养物的第七次国际会议的摘要(IAPTC),A2-38,第53页(1990)；德哈因(D'Halluin)等人,植物细胞4:1495-1505(1992)和斯潘塞(Spencer)等人,植物分子生物学24:51-61(1994)。 [0273] 在马铃薯目标组织的转型作用之后，上述可选标记基因的表达允许优先选择经转型的细胞、组织和/或植物，使用所属领域中众所周知的再生和选择方法。 [0274] 前述用于转型作用的方法将典型地用于产生转基因种类。转基因种类可接着与另一种(未经转型或经转型)种类杂交以产生新的转基因种类。或者，已使用前述转型技术工程改造成特定马铃薯品系的基因特性可使用植物育种技术中众所周知的传统的回交技术移动到另一品系中。举例来说，回交方法可用于使经工程改造的特性从公共、非精华种类移动到精华种类中，或从在基因体中含有外来基因的种类移动到不含有所述基因的种类。如本文中所使用，视情形而定，“杂交”可指简单的X与Y杂交或回交过程。 [0275] 所属领域的一般技术人员将认识到，当在本发明的情形中使用术语马铃薯植物时，这也包括保留W8的基本区别性特征的衍生物种类，如所述种类的基因转化植物或其中合并有一或多个附加值基因(如除草剂或害虫抗性)的转基因衍生物。回交方法可与本发明一起使用以改良特征或将特征引入所述种类中。如本文所使用，术语“回交”指杂交后代再与再现亲本重复杂交1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多次。有助于一或多种所需特征的基因的亲本马铃薯植物称为非再现或供体亲本。这一术语指非再现亲本在回交方案中使用一次并且因此不再现的事实。接受来自非再现亲本的基因转移的亲本马铃薯植物称为再现性亲本，因为其在回交方案中用于若干轮次。在典型回交方案中，相关原始种类(再现性亲本)与携带待转移的相关基因的第二种类(非再现亲本)杂交。来自这一杂交的所得后代接着再与再现性亲本杂交并且重复所述过程直到获得其中再现性亲本的实质上所有所需形态和生理学特征在经转化的植物中恢复的马铃薯植物(除从非再现亲本转移的一或多种基因以外)。 [0276] 对于成功回交程序，适合的再现性亲本的选择是重要步骤。回交方案的目标是改变或取代原始种类中的一或多种特性或特征。为了实现这个目标，用来自非再现亲本的所需基因修饰、取代或补充再现性种类的一或多种基因，同时保留实质上所有其余所需基因，并且因此保留原始种类的所需生理学和形态构造。特定非再现亲本的选择将取决于回交的目的。一个主要目的是为植物添加一些商业上合乎需要、农艺学上重要的特性。确切回交方案将取决于经改变或添加以测定适合的测试方案的特征或特性。尽管回交方法在所转移的特征是显性等位基因时简化，但也可以转移隐性等位基因。在这种情况下，可能需要引入后代的测试以测定是否已成功地转移所需特征。 [0277] 类似地，可使用所属领域的技术人员众所周知的多种现有重组方法中的任一种将转基因引入植物，如：格里希尔(Gressel),1985,提供农作物中的除草剂抗性的生物技术：当前现实(Biotechnologically Conferring Herbicide Resistance in Crops:The Present Realities),植物基因体的分子形成和功能(Molecular Form and Function of the Plant Genome),范沃登-道亭(L.van Vloten-Doting)(编),纽约普雷纳姆出版社(Plenum Press,New York)；赫特纳(Huttner,S.L.)等人,1992,遗传修饰植物的修正监管(Revising Oversight of Genetically Modified Plants),生物技术；克里(Klee,H.)等人,1989,植物基因载体和基因转型作用：基于植物的根癌农杆菌、细胞培养物和体细胞遗传的使用的植物转型系统(Plant Gene Vectors and Genetic Transformation:Plant Transformation Systems Based on the use of Agrobacterium tumefaciens,Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)；孔茨(Koncz,C.)等人,1986,TL-DNA基因5的启动子控制由新型农杆菌双运载体携带的嵌合基因的组织特异性表达(The Promoter of TL-DNA Gene 5 Controls the Tissue-Specific Expression of Chimeric Genes Carried by a Novel Type of Agrobacterium Binary Vector)；分子和普通遗传学(Molecular and General Genetics)；劳森(Lawson,C.)等人,1990,市售马铃薯栽培品种中对混合病毒感染的工程改造抗性：转基因褐色布尔班克中对马铃薯病毒X和马铃薯病毒Y的抗性(Engineering Resistance to Mixed Virus Infection in a Commercial Potato Cultivar:Resistance to Potato Virus X and Potato Virus Y in Transgenic褐色布尔班克),生物技术；米茨基(Mitsky,T.A.)等人,1996,针对PLRV感染的植物抗性，美国专利案第5,510,253号；纽厄尔(Newell,C.A.)等人,1991,马铃薯褐色布尔班克的农杆菌介导的转型作用(Agrobacterium-Mediated Transformation of Solanum tuberosum L.Cv.褐色布尔班克),植物细胞报告(Plant Cell Reports)；佩尔拉克(Perlak,F.J.)等人,1993,遗传改良马铃薯：避免科罗拉多马铃薯甲虫的损害(Protection from Damage by Colorado Potato Beetles),植物分子生物学(Plant Molecular Biology)；其皆以引用的方式并入本文中以用于这一目的。 [0278] 已经鉴别不在新种类的生产中固定选择的许多特性，但其可通过回交和遗传工程改造技术改良。这些特性可以是或可以不是转基因；这些特性的实例包括(但不限于)：除草剂抗性；对细菌、真菌或病毒疾病的抗性；昆虫抗性；淀粉和其它碳水化合物的浓度的均匀性或增加；营养质量增强；块茎损坏趋势降低；以及淀粉转化成糖的转化率降低。这些基因通常通过细胞核遗传。这些特性中的若干种描述于美国专利案第5,500,365号、美国专利案第5,387,756号、美国专利案第5,789,657号、美国专利案第5,503,999号、美国专利案第5,589,612号、美国专利案第5,510,253号、美国专利案第5,304,730号、美国专利案第5,382, 429号、美国专利案第5,503,999号、美国专利案第5,648,249号、美国专利案第5,312,912号、美国专利案第5,498,533号、美国专利案第5,276,268号、美国专利案第4,900,676号、美国专利案第5,633,434号和美国专利案第4,970,168号中。 [0279] 寄存信息 [0280] 已由美国典型培养物保藏中心(ATCC)(弗吉尼亚州马纳萨斯10801大学大道(10801 University Boulevard,Manassas,Virginia))20110进行上文披露和所附权利要求书中所述的杰.尔.辛普洛公司(J.R.Simplot Company)所有权POTATO CULTIVAR W8的块茎寄存。寄存日期是2014年3月11日。在本申请案的申请日之前，从由杰.尔.辛普洛公司保存的相同寄存物获得25个微管小瓶的寄存物。当授予专利权时，所有限制将不可撤销地移除，并且寄存物意图符合37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求。ATCC寄存编号是PTA-121079。寄存物将在最后一次请求之后保存在保藏中心三十年或五年时间或专利权的强制寿命(无论哪个更长)，并且将在所述周期期间视需要更换。 [0281] 尽管上文已讨论许多例示性方面和实施例，但所属领域的技术人员将识别某些修改、置换、添加和其子组合。因此，预期以下所附权利要求书以及下文引入的权利要求书解释为包括在它们的真实精神和范畴内的所有这类修改、置换、添加和子组合。 |
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