[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2014年9月17日提交的美国临时专利申请序列号 62/051,885的权益，其全部以引用的方式并入本文。

[0003] 参考电子提交的序列表

[0004] 序列表的正式副本以电子方式通过EFS-Web作为ASCII格式的序列表提交，文件名为“3005.WO基因序列表.txt”，文件名为“3005.WO基因序列表.txt”，大小为488千字节，并且与说明书同时提交。该ASCII格式的文档中包含的序列表是说明书的一部分，其全部内容通过引用并入本文。

[0005] 本发明通常涉及融合蛋白，含有使所述融合蛋白靶向蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。本发明还涉及表达这种融合蛋白的重组
蜡样芽胞杆菌家族成员、含有重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂、使用重组蜡样芽胞杆菌
家族成员包覆的种子、和用于使用重组蜡样芽胞杆菌家族成员的方法(例如用于刺激植物
生长、保护植物免受病原体侵害、提高植物的胁迫抗性、在植物上固定重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子、刺激植物种子的发芽、和将核酸递送至植物)。本发明还涉及过表达蛋白酶或核酸酶的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中蛋白酶或核酸酶的过表达部分或完全灭活蜡样
芽胞杆菌家族成员的孢子，或使孢子更易于物理或化学灭活。本发明进一步涉及过表达外
孢壁蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员、使用这种重组蜡样芽胞杆菌家族成员包覆的种
子、和用于使用重组蜡样芽胞杆菌家族成员的方法(例如用于刺激植物生长、提高植物的胁迫抗性和保护植物免受病原体侵害)。

[0006] 本发明进一步涉及表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的各种修饰，包括：(i)在重组蜡样芽胞杆菌成员中调节融合蛋白的表达的调节子蛋白的过表达；(ii)重组蜡样芽胞杆菌家族成员的基因灭活；和(iii)允许含有融合蛋白的外孢壁片段收集的重组
蜡样芽胞杆菌家族成员的突变或其他基因改变。本发明还涉及用于使用外孢壁片段的各种
方法。

[0007] 本发明进一步涉及包含孢子外壳蛋白和目标蛋白或肽的融合蛋白、表达这种融合蛋白的重组细菌、使用这种重复细菌包覆的种子和用于使用这种重组细菌的方法(例如用
于刺激植物生长、保护植物免受病原体侵害、提高植物的胁迫抗性、在植物上固定重组细菌孢子、刺激植物种子的发芽、和将核酸递送至植物)。

[0008] 本发明进一步涉及细菌的新型菌株的生物学纯细菌培养基。

[0009] 本发明另外涉及使用下面包覆的植物种子：催化一氧化氮或超氧化物歧化酶产生的酶、或过表达催化一氧化氮或超氧化物歧化酶的酶的重组孢子-形成细菌。

[0010] 本发明还涉及用于将有益细菌和酶或疫苗递送至动物的方法、和其他使用方法。

[0011] 植物根部周围的区是被称为根际的区域。在根际中，细菌、真菌及其他有机体竞争营养素并且结合至植物的根结构。有害和有益细菌及真菌两者可占据根际。细菌、真菌及植物的根系都可能受到根际中的肽、酶及其他蛋白质的作用的影响。用这些肽、酶或其他蛋白质中的某些来加强土壤或处理植物将对有益的土壤细菌和真菌的总群体具有有益作用，形成用于植物生长的更健康的总体土壤环境，改善植物生长，并且提供植物针对某些细菌和
真菌病原体的保护。然而，早先将肽、酶及其他蛋白质引入土壤中以诱发对植物的这种有益作用的努力受到了酶、蛋白质及肽在土壤中的低存活率的阻碍。另外，天然地存在于土壤中的蛋白酶的流行导致土壤中蛋白质的降解。植物根部周围的环境(根际)是细菌、真菌、营养素及根的独特混合体，其具有与原土壤不同的质量。这些有机体之间的共生关系是独特的，并且可被更改以便更好地包含外源性蛋白质。在根际中高浓度的真菌和细菌造成蛋白质甚
至更大的降解，这是由于在土壤中异常高水平的蛋白酶及对蛋白质有害的其他元素。另外，被引入土壤中的酶及其他蛋白质可迅速地分散远离植物根部。

[0012] 因此，在本领域中存在对于以下的需要：用于向植物(例如向植物根系) 有效地递送肽、酶及其他蛋白质并且延长所述分子保持活性期间的时段的方法。此外，在本领域中存在对以下的需要：具体说来将所述肽、酶及蛋白质选择性地靶向根际以及植物叶片和植物
根部的方法。

[0013] 发明概述

[0014] 本发明的特征在所附权利要求和下面名称为“实施方案”章节中提供的实施方案列表中定义。其他目的和特征将在下文部分明确并部分指出。

[0015] 附图简述

[0016] 图1A和1B显示炭疽杆菌Sterne菌株BclA氨基端部分的氨基酸序列与蜡样芽胞杆菌家族成员多种外孢壁蛋白的相应区域的比对。

[0017] 图2显示含有与mCherry报告基因连接的多种外孢壁蛋白的融合蛋白在重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁上的表达的示例性荧光显微镜结果。

[0018] 图3提供了显示重组苏云金芽孢杆菌BT013A孢子的数据，其中所述孢子表达包含DNA结合蛋白的融合蛋白。

[0019] 图4是显示外孢壁片段和缺失了外孢壁的蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的透射电镜显微图，其中所述孢子利用具有CotE基因敲除突变的重组蜡样芽胞杆菌家族成员制备得
到。

[0020] 图5是SDS-PAGE凝胶图，其显示蛋白质分子量标准(泳道1)和来自外孢壁片段的蛋白(泳道2)，所述蛋白利用具有CotE基因敲除突变的重组蜡样芽胞杆菌家族成员制备得到。

[0021] 图6提供了阐述来自具有CotE基因敲除突变的蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁片段中酸性磷酸酶的酶活性的数据。

[0022] 图7提供了阐述蜡样芽胞杆菌家族成员EE349减少了除草剂对小扁豆根长度的抑制作用的数据。

[0023] 图8提供了阐述经修饰以过量表达酸性磷酸酶(AcpC)的蜡样芽胞杆菌家族成员中磷酸酶活性增加的数据。

[0024] 图9提供了显示表达CotC-内切葡聚糖酶融合蛋白的重组苏云金芽孢杆菌孢子中内切葡聚糖酶活性的数据。

[0025] 图10提供了显示重组苏云金芽孢杆菌孢子表面上RNA的检测的明场和荧光显微镜图像，其中所述重组苏云金芽孢杆菌孢子表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35以及结合至
单链RNA(ssRNA)或双链RNA (dsRNA)的SspC的融合蛋白。

[0026] 图11提供了显示微小RNA MIR319在利用重组苏云金芽孢杆菌孢子递送至大豆植株中后对大豆高度和根发育的影响的图，其中所述重组苏云金芽孢杆菌孢子表达包含SEQ 
ID NO:1的氨基酸20-35以及结合至 MIR319的SspC的融合蛋白。

[0027] 图12提供了显示线虫的肠中GFP和mCherry的检测的明场和荧光显微镜图像，其中所述线虫饲喂正常的OP50大肠杆菌细菌食品(右侧2 幅图)或者饲喂苏云金芽孢杆菌孢子
(左侧3幅图)，所述苏云金芽孢杆菌孢子表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35以及GFP或
mCherry的融合蛋白。

[0028] 图13提供了显示对从经苏云金芽孢杆菌EE-B00184处理的玉米植株内部分离得到的内生细菌进行检测的荧光显微镜图像，其中所述苏云金芽孢杆菌EE-B00184表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35和GFP的融合蛋白。箭头指示单个孢子。

[0029] 图14提供了显示含有重组蜡样芽胞杆菌家族成员的细菌菌落荧光的图，其中所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35和GFP的融合蛋白，其从
由涂覆了重组细菌的种子生长得到的玉米植株内部分离。

[0030] 图15提供了透射电镜显微图，其显示：(A)苏云金芽孢杆菌BT013A的完整孢子，其被附着的外孢壁包围；(B)苏云金芽孢杆菌BT013A CotE敲除菌株的孢子，其具有分开的外
孢壁；和(C)外孢壁片段的经纯化的外孢壁片段制备品，其来自苏云金芽孢杆菌BT013A 
CotE敲除菌株。

[0031] 定义

[0032] 除非另有陈述，否则当在本文中使用冠词“一个(种)”、“该”及“所述”时，意指“至少一个(种)”或“一个或多个(种)”。

[0033] 术语“农业上可接受的载体”和“载体”在本文中可互换使用。

[0034] 术语“动物”包括任何非人类动物以及人类。例如，如果本文使用术语“动物”，动物可以是哺乳动物(例如人、绵羊、山羊、牛、猪、鹿、羊驼、野牛、骆驼、驴、马、骡、骆马、兔、狗、或猫)、禽类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑或雉鸡)、鱼(例如、鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、金枪鱼、鲶鱼或鲤鱼)或甲壳类(例如虾、虾、龙虾、螃蟹或小龙虾)。

[0035] “生物学纯细菌培养物”是指一种细菌培养物，其不含有量足以妨碍培养物的复制或通过普通细菌技术可检测的其它细菌种类。换言之，它是一种培养物，其中所存在的实际上所有细菌细胞均属于所选菌株。

[0036] 术语“包含”、“包括”及“具有”意在是包括的且意指可能存在除了所列要素之外的额外要素。

[0037] 术语“生物活性肽”是指发挥生物活性的任何肽。“生物活性肽”可例如经由通过蛋白酶或肽酶裂解蛋白质、肽、原蛋白或前原蛋白而产生。

[0038] 术语“有效量”是指与对照处理植物的生长、蛋白质产量以及谷物产量相比足以产生植物的生长和/或蛋白质产量和/或谷物产量的统计显著性增加的量。

[0039] “植物生长刺激化合物的产生或活化中所涉及的酶”包括催化刺激植物生长或改变植物结构的化合物的生物合成途径中的任何步骤的任何酶，或催化刺激植物生长或改变
植物结构的非活性或活性较小的化合物衍生物转化为活性或活性较大形式的化合物的任
何酶。所述化合物包括例如但不限于小分子植物激素如生长素和细胞分裂素、生物活性肽
以及由根际中的细菌或真菌合成的小植物生长刺激分子(例如2,3-丁二醇)。

[0040] 如本文所用的术语“融合蛋白”是指具有包含来源于两种或更多种单独的蛋白质的序列的多肽序列的蛋白质。融合蛋白可通过以下方式产生：将编码第一多肽的全部或部
分的核酸分子与编码第二多肽的全部或部分的核酸分子连接在一起以产生核酸序列，所述
核酸序列当表达时，产生具有来源于每一种原始蛋白质的功能特性的单一多肽。

[0041] 如本文所用的术语“发芽率”是指在特定时间段内发芽的种子数量。例如，85％的发芽率表明在一定时期内100个种子中有85个发芽。

[0042] 如本文所用的，涉及重组蜡样芽孢杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的孢子失活的术语“灭活”是指孢子不能发芽，或者孢子可以发芽，但是损坏，使得发芽不会导致活菌。术语“部分失活”意味着一部分孢子是灭活的，但是一些孢子保留发芽并恢复活力、复制状态的能力。术语“基因灭活”是指通过孢子DNA的突变导致孢子完全或部分失活的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的孢子灭活。术语“物理灭活”和“化学灭活”是指使用任何物理或化学手段灭活孢子，例如通过热处理，γ照射、X射线照射、UV-A照射、UV-B照射或用溶剂处理例如戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂、氯仿或苯酚或其任何组合。

[0043] 术语“将重组蜡样芽孢杆菌家族成员孢子固定在植物上”和“将重组孢子-形成细菌孢子固定在植物上”是指蜡样芽孢杆菌家族成员孢子或重组孢子-形成细菌孢子结合到
植物，例如结合到植物的根部或植物的地上部分，如叶、茎、花或果实，以使得孢子维持在植物的根结构或地上部分，而不是分散到植物生长介质中或分散到植物地上部分周围的环境
中。

[0044] 如本发明中所描述的术语“菌剂”在若干联邦或州立法规中定义为：(1) “土壤或植物菌剂应包括被指出改善土壤或植物的生长、质量或产量的特定微生物或微生物混合物的任何载体或培养物，并且还应包括被指出用此类培养物接种的任何种子或肥料”(纽约州
10-A统一法律(New York State 10-A Consolidated Law))；(2)“不同于肥料的被制造、出售或指出用于改善土壤的物理条件或有助于植物生长或作物产量的物质”(加拿大肥料法
令 (Canada Fertilizers Act))；(3)“含有用于出于增强生长能力或抗病力或以其它方式改变最终植物或作物的性质的目的而处理种子、秧苗或其它植物繁殖材料的纯的活细菌、
真菌或病毒粒子或其预定混合物的制剂”(特设欧洲工作组(Ad hoc European Working 
Group)，1997)或(4)“意指具有物质混合物的任何化学或生物物质或用于土壤校正目的而
要施加于土壤、植物或种子中的以呈此状态分配的装置；或其旨在改善植物的萌芽、生长、质量、产量、产品质量、繁殖、风味或其它所需特征或其旨在在土壤中产生任何化学、生物化学、生物或物理变化”(加利福尼亚粮食和农业法典(California Food and Agriculture 
Code)第14513章节)。

[0045] “调节子蛋白”包括蛋白，当在表达本文所述的任何融合蛋白的蜡样芽胞杆菌家族成员中过表达时调节融合蛋白的表达，使得相比于在不过表达调节子蛋白的蜡样芽胞杆菌家族成员中表达融合蛋白，融合蛋白的表达增加或减少。

[0046] “植物生长介质”包括能支持植物生长的任何物质。

[0047] 如本文所用的“植物免疫系统增强蛋白或肽”包括对植物免疫系统具有有益作用的任何蛋白或肽。

[0048] 如本文所用的术语“植物生长刺激蛋白或肽”包括增强暴露于所述蛋白或肽的植物中的植物生长的任何蛋白或肽。

[0049] 如本文所用的术语“益生菌”是指微生物(例如细菌)，其在由动物消耗或施用时提供健康益处。

[0050] 术语“促进植物生长”和“刺激植物生长”在本文中可互换使用，并且是指增强或增加植物的高度、重量、叶尺寸、根尺寸或茎尺寸中的至少一种、增加植物的蛋白质产量或增加植物的谷物产量的能力。

[0051] 如本文所用的“保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽”包括使暴露于所述蛋白或肽的植物较不易受病原体感染的任何蛋白或肽。

[0052] 如本文所用的“提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽”包括使暴露于所述蛋白或肽的植物更具胁迫抗性的任何蛋白或肽。

[0053] 术语“植物结合蛋白或肽”是指能特异性地或非特异性地结合至植物的任何部分(例如，植物的根或地上部分，如叶片、茎、花、或果实)或结合至植物物质的任何肽或蛋白。

[0054] 术语“除虫菊酯酶”是指降解除虫菊酯或拟除虫菊酯的任何酶。

[0055] 术语“根际”可与“根区”互换使用，指示包围植物的根并且受其影响的土壤区段。

[0056] 如本文所用的术语“靶向序列”是指当作为更长的多肽或蛋白的部分存在时使所述更长多肽或蛋白定位在特定亚细胞位置中的多肽序列。本文所述的靶向序列使蛋白质在
蜡样芽孢杆菌家族成员的外孢壁中定位。

[0057] 发明详述

[0058] I.用于在蜡样芽胞杆菌家族成员中表达的融合蛋白和表达这种融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员

[0059] 本发明涉及融合蛋白、包含使所述融合蛋白靶向蜡样芽孢杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段以及至少一种目标蛋白或肽。当在蜡样芽孢杆
菌家族成员细菌中表达时，这些融合蛋白靶向孢子的外孢壁层且物理地定向以使得蛋白或
肽呈现于孢子之外。

[0060] 此杆菌属外孢壁呈现(BEMD)系统可用于向植物(例如，向植物叶、果实、花、茎或根)或向植物生长介质如土壤递送肽、酶及其他蛋白质。以此方式向土壤或另一植物生长介质递送的肽、酶及蛋白质在土壤中存留并展现活性持续延长的时期。将表达本文所述的融
合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员细菌引入土壤或植物的根际中引起在许多不同土壤
条件下植物生长的有益提高。使用BEMD产生这些酶允许所述酶在植物寿命的第一个月内持
续向植物和根际发挥其有益结果。

[0061] A.使目标蛋白或肽靶向蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白和外孢壁蛋白片段

[0062] 为了便于参考，可用于使目标蛋白或肽靶向蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白和外孢壁蛋白片段的氨基酸序列的描述和它们的SEQ ID NO在下表1中
列出。

[0063] 表1.用于使目标蛋白或肽靶向至蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的肽和蛋白序列

[0064]

[0065]

[0066]

[0067]

[0068]

[0069]

[0070]

[0071] AA＝氨基酸

[0072] *炭疽杆菌Sterne菌株BclA与苏云金芽孢杆菌BclA具有100％序列同一性。因此，SEQ ID NO:1、 2及95还分别表示苏云金芽孢杆菌BclA的氨基酸1-41、全长苏云金芽孢杆菌BclA以及苏云金芽孢杆菌BclA的氨基酸1-196。同样，SEQ ID NO:96还表示甲硫氨酸残基加苏云金芽孢杆菌BclA 的氨基酸20-35。

[0073] **蕈状芽孢杆菌假设蛋白TIGR03720与蕈状芽孢杆菌假设蛋白WP003189234具有100％序列同一性。因此，SEQ ID  NO:57和58还分别表示蕈状芽孢杆菌假设蛋白
WP003189234的氨基酸1-136 和全长蕈状芽孢杆菌假设蛋白WP003189234。

[0074] 杆菌属是杆状细菌属。细菌的蜡样芽孢杆菌家族包括能够产生外孢壁的任何杆菌属种。因此，细菌的蜡样芽孢杆菌家族包括以下种：炭疽杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、杆菌gaemokensis、韦氏芽孢杆菌以及Bacillustoyoiensis。在胁迫的环境条件下，蜡样芽孢杆菌家族细菌经历孢子形成并形成
椭圆形内生孢子，这些内生孢子可以保持休眠很长时间。内生孢子的最外层被称为外孢壁
且包含由毛发样突出物的外部绒毛包围的基底层。毛发样绒毛上的纤丝主要是由胶原样糖
蛋白BclA形成，而基底层是由许多不同的蛋白构成。另一种胶原相关蛋白BclB也存在于外
孢壁中并且暴露于蜡样芽孢杆菌家族成员的内生孢子上。BclA(表面绒毛的主要成分)被证
明附着于外孢壁上，其氨基端(N-端)位于基底层处且其羧基端(C-端)由孢子向外延伸。

[0075] 先前发现来自BclA和BclB的N端区域的某些序列可用于将肽或蛋白靶向蜡样芽孢杆菌内生孢子的外孢壁(参见美国专利申请2010/0233124和 2011/0281316，以及Thompson
等人,Targeting of the BclA and BclB proteins to the Bacillus anthracis spore 
surface,Molecular Microbiology 70(2):421-34(2008))。还发现炭疽杆菌的BetA/
BAS3290蛋白定位在外孢壁上。

[0076] 具体来说，发现来自炭疽杆菌Sterne菌株的BclA的氨基酸20-35被发现足以靶向外孢壁。BclA(SEQ ID NO:1)的氨基酸1-41与若干其他蜡样芽胞杆菌家族外孢壁蛋白和具
有相关序列的蜡样芽胞杆菌家族蛋白的相应N端区域的序列比对显示于图1A和1B中。如从
图1A和1B可见，在对应于BclA的氨基酸20-41的区域中的所有蛋白之中存在高同源性区域。
然而，在这些序列中，对应于BclA的氨基酸36-41的氨基酸含有二级结构且不是融合蛋白定位于外孢壁上所必需的。BclA的保守靶向序列区域(SEQ ID NO:1的氨基酸20-35)以粗体显
示于图1A和1B中且对应于定位到外孢壁上所需的最少靶向序列。在靶向序列内跨越BclA的
氨基酸 25-35的更高保守区域以下划线标注于图1A和1B的序列中，且是 ExsFA/BxpB/
ExsFB和同源物的识别序列，其指导并将所述蛋白装配到外孢壁表面上。图1A中的SEQ ID 
NO.3、5及7的氨基酸序列分别是炭疽杆菌Sterne菌株BetA/BAS3290的氨基酸1-33、甲硫氨
酸继之以炭疽杆菌Sterne菌株BAS4623的氨基酸2-43、以及炭疽杆菌Sterne菌株BclB 的氨
基酸1-34。(对于BAS4623，发现用甲硫氨酸替代天然蛋白的位置1 处存在的缬氨酸产生最
佳表达。)如从图1A可见，这些序列各自含有对应于BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO:1；以粗体显示)的保守区域、及对应于BclA的氨基酸20-35(加下划线)的更高保守区域。

[0077] 来自蜡样芽胞杆菌家族成员的另外蛋白还含有保守靶向区域。具体来说，在图1A和1B中，SEQ ID NO:9是炭疽杆菌Sterne菌株BAS1882 的氨基酸1-30，SEQ ID NO:11是韦氏芽孢杆菌KBAB4 2280基因产物的氨基酸1-39，SEQ ID NO:13是韦氏芽孢杆菌KBAB4 3572基
因产物的氨基酸1-39，SEQ ID NO:15是蜡样芽孢杆菌VD200外孢壁前导肽的氨基酸1-49，
SEQ ID NO:17是蜡样芽孢杆菌VD166外孢壁前导肽的氨基酸 1-33，SEQ ID NO:19是蜡样芽
孢杆菌VD200假设蛋白IKG_04663的氨基酸1-39，SEQ ID NO:21是韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTN
β-螺旋桨蛋白的氨基酸1-39，SEQ ID NO:23是韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白 bcerkbab4_
2363的氨基酸1-30，SEQID NO:25是韦氏芽孢杆菌KBAB4 假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基
酸1-30，SEQ ID NO:27是韦氏芽孢杆菌KBAB4含三螺旋重复胶原的氨基酸1-36，SEQ ID NO:
29是蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660的氨基酸1-39，SEQ ID NO:31 是蕈状芽
孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540的氨基酸1-30，SEQ ID NO:33是蕈状芽孢杆菌2048假
设蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1-21， SEQID NO:35是苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋
重复蛋白的氨基酸 1-22，SEQ ID NO:43是蜡样芽孢杆菌假设蛋白WP_69652的氨基酸1-35， SEQ ID NO:45是蜡样芽孢杆菌外孢壁前导WP016117717的氨基酸1-41，SEQ ID NO:47是蜡
样芽孢杆菌外孢壁肽WP002105192的氨基酸 1-49，SEQ ID NO:49是蜡样芽孢杆菌假设蛋白
WP87353的氨基酸1-38， SEQ ID NO:51是蜡样芽孢杆菌外孢壁肽02112369的氨基酸1-39，
SEQ ID NO:53是蜡样芽孢杆菌外孢壁蛋白WP016099770的氨基酸1-39，SEQ ID NO:55是苏
云金芽孢杆菌假设蛋白YP006612525的氨基酸1-36，SEQ ID NO:57是蕈状芽孢杆菌假设蛋
白TIGR03720的氨基酸1-136，SEQ ID NO:59是蜡样芽孢杆菌ATCC 10987胶原三螺旋重复结
构域蛋白的氨基酸1-36，SEQ ID NO:61是蜡样芽孢杆菌E33L胶原样蛋白的氨基酸1-39， 
SEQ ID NO:63是含有三螺旋重复的胶原的B.weihenstephanensis KBAB4的氨基酸1-41，
SEQ ID NO:65是苏云金芽孢杆菌str.Al Hakam 假设蛋白BALH_2230的氨基酸1-30，SEQ ID NO:67是含有三螺旋重复的胶原的蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的氨基酸1-33，SEQ ID NO:69
是蜡样芽孢杆菌胶原三螺旋重复的氨基酸1-44，SEQ ID NO:71是含有三螺旋重复的胶原的
蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的氨基酸1-38，SEQ ID NO: 73是蜡样芽孢杆菌E33L假设蛋白
BCZK1835的氨基酸1-30，SEQ  ID  NO:  75是含有三螺旋重复的胶原的
B.weihenstephanensis KBAB4的氨基酸 1-48，SEQ ID NO:77是含有三螺旋重复的胶原的
蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的氨基酸1-30，SEQ ID NO:79是蜡样芽孢杆菌ATCC 14579假设蛋
白BC4725的氨基酸1-39，SEQ ID NO:81是蜡样芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK4476的氨基酸1-
44，SEQ ID NO:83是含有三螺旋重复的胶原的炭疽杆菌str.‘Ames Ancestor’的氨基酸1-
40，SEQ ID NO:85是苏云金芽孢杆菌serovar konkukian str.97-27BclA蛋白的氨基酸1-
34，SEQ ID NO:87是蜡样芽孢杆菌ATCC 10987保守假设蛋白的氨基酸1-34， SEQ ID NO:89是含有三螺旋重复的胶原的蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的氨基酸1-34，SEQ ID NO:91是蜡样
芽孢杆菌外孢壁前导肽部分序列的氨基酸1-99，和SEQ ID NO:93是B.weihenstephanensis
假设蛋白 ER45_27600的氨基酸1-136。如图1A和1B所示，这些蛋白的N端区域各自含有与
BclA(SEQ ID NO:1)的氨基酸20-35保守的区域、及对应于BclA的氨基酸25-35的更高保守
区域。

[0078] 包括氨基酸20-35的BclA的任何部分都可使融合蛋白靶向外孢壁。另外，全长外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可用于将融合蛋白靶向外孢壁。因此，包括氨基酸20-35的全长
BclA或BclA片段可用于靶向外孢壁。例如，全长BclA(SEQ ID NO:2)或缺乏羧基端的BclA的中等尺寸片段如 SEQ ID NO:59(BclA的氨基酸1-196)可用于将融合蛋白靶向外孢壁。中等
尺寸片段如SEQ ID NO:59的片段具有比全长BclA更少的二级结构且被发现适用作靶向序
列。靶向序列还可包含BclA的短得多的部分，包括氨基酸20-35如SEQ ID NO:1(BclA的氨基酸1-41)、SEQ ID NO:1的氨基酸1-35、SEQ ID NO:1的氨基酸20-35或SEQ ID NO:96(与BclA的氨基酸20-35连接的甲硫氨酸残基)。仅包括氨基酸20-35中的一些的BclA的甚至更短的
片段也展现将融合蛋白靶向外孢壁的能力。例如，靶向序列可包含SEQ ID NO:1的氨基酸
22-31、SEQ ID NO:1的氨基酸22-33或SEQ ID NO:1的氨基酸20-31。

[0079] 或者，BetA/BAS3290、BAS4623、BclB、BAS1882、KBAB42280基因产物、KBAB43572基因产物、蜡样芽孢杆菌VD200外孢壁前导肽、蜡样芽孢杆菌VD166外孢壁前导肽、蜡样芽孢杆菌VD200假设蛋白 IKG_04663、韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白、韦氏芽孢杆菌 KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2363、韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白 bcerkbab4_2131、韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660、蕈状芽
孢杆菌2048假设蛋白 bmyc0001_22540、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510、苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白、蜡样芽孢杆菌假设蛋白 WP_69652、蜡样芽孢杆菌
外孢壁前导WP016117717、蜡样芽孢杆菌外孢壁肽WP002105192、蜡样芽孢杆菌假设蛋白
WP87353、蜡样芽孢杆菌外孢壁肽02112369、蜡样芽孢杆菌外孢壁蛋白WP016099770、苏云金芽孢杆菌假设蛋白YP006612525、蕈状芽孢杆菌假设蛋白TIGR03720、蜡样芽孢杆菌ATCC 
10987胶原三螺旋重复结构域蛋白、蜡样芽孢杆菌E33L胶原样蛋白、含有三螺旋重复的胶原的B.weihenstephanensis KBAB4、苏云金芽孢杆菌str.Al Hakam假设蛋白BALH_2230、含有三螺旋重复的胶原的蜡样芽孢杆菌ATCC 14579、蜡样芽孢杆菌胶原三螺旋重复、含有三螺
旋重复的胶原的蜡样芽孢杆菌ATCC 14579、含有三螺旋重复的胶原的蜡样芽孢杆菌E33L假
设蛋白BCZK1835,B. weihenstephanensis KBAB4、含有三螺旋重复的胶原的蜡样芽孢杆菌 ATCC 14579、蜡样芽孢杆菌ATCC 14579假设蛋白BC4725、蜡样芽孢杆菌E33L假设蛋白
BCZK4476、含有三螺旋重复的胶原的炭疽杆菌str. ‘Ames Ancestor’、苏云金芽孢杆菌
serovar konkukian str.97-27BclA蛋白、蜡样芽孢杆菌ATCC 10987保守假设蛋白、含有三螺旋重复的胶原的蜡样芽孢杆菌ATCC 14579、蜡样芽孢杆菌外孢壁前导肽部分序列或B. 
weihenstephanensis假设蛋白ER45_27600的包括对应于BclA的氨基酸 20-35的氨基酸的
任何部分都可充当靶向序列。

[0080] 如从图1A可见，BetA/BAS3290的氨基酸12-27、BAS4623的氨基酸23-38、BclB的氨基酸13-28、BAS1882的氨基酸9-24、KBAB42280 基因产物的氨基酸18-33、KBAB43572基因产物的氨基酸18-33、蜡样芽孢杆菌VD200外孢壁前导肽的氨基酸28-43、蜡样芽孢杆菌VD166
外孢壁前导肽的氨基酸12-27、蜡样芽孢杆菌VD200假设蛋白IKG_04663的氨基酸18-33、韦
氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白的氨基酸18-33、韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白
bcerkbab4_2363的氨基酸9-24、韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-
24、韦氏芽孢杆菌 KBAB4含有三螺旋重复的胶原的氨基酸15-30、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660的氨基酸18-33、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白 bmyc0001_22540的氨基
酸9-24、蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白 bmyc0001_21510的氨基酸1-15、苏云金芽孢杆菌
35646胶原三螺旋重复蛋白的氨基酸1-16、蜡样芽孢杆菌假设蛋白WP_69652的氨基酸14-
29、蜡样芽孢杆菌外孢壁前导WP016117717的氨基酸20-35、蜡样芽孢杆菌外孢壁肽
WP002105192的氨基酸28-43、蜡样芽孢杆菌假设蛋白WP87353的氨基酸17-32、蜡样芽孢杆
菌外孢壁肽02112369的氨基酸 18-33、蜡样芽孢杆菌外孢壁蛋白WP016099770的氨基酸18-
33、苏云金芽孢杆菌假设蛋白YP006612525的氨基酸15-30以及蕈状芽孢杆菌假设蛋白
TIGR03720的氨基酸115-130对应于BclA的氨基酸20-35。从图 1B中可见，蜡样芽孢杆菌
ATCC 10987胶原三螺旋重复结构域蛋白的氨基酸15-30、蜡样芽孢杆菌E33L胶原样蛋白的
氨基酸18-33、含有三螺旋重复的胶原的B.weihenstephanensis KBAB4的氨基酸20-35、苏
云金芽孢杆菌str.Al Hakam假设蛋白BALH_2230的氨基酸9-24、含有三螺旋重复的胶原的
蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的氨基酸12-27、蜡样芽孢杆菌胶原三螺旋重复的氨基酸23-38、
含有三螺旋重复的胶原的蜡样芽孢杆菌 ATCC 14579的氨基酸17-32、蜡样芽孢杆菌E33L假
设蛋白BCZK1835 的氨基酸9-24、含有三螺旋重复的胶原的B.weihenstephanensis KBAB4 
的氨基酸27-42、含有三螺旋重复的胶原的蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的氨基酸9-24、蜡样芽孢杆菌ATCC 14579假设蛋白BC4725的氨基酸 18-33、蜡样芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK4476
的氨基酸23-38、含有三螺旋重复的胶原的炭疽杆菌str.‘Ames Ancestor’的氨基酸19-34、苏云金芽孢杆菌serovar konkukian str.97-27 BclA蛋白的氨基酸13-28、蜡样芽孢杆菌
ATCC 10987保守假设蛋白的氨基酸13-28、含有三螺旋重复的胶原的蜡样芽孢杆菌ATCC 
14579的氨基酸13-28、蜡样芽孢杆菌外孢壁前导肽部分序列的氨基酸78-93、和
B.weihenstephanensis假设蛋白 ER45_27600的氨基酸115-130，对应于BclA的氨基酸20-
35。因此，包括以上所列的相应氨基酸的这些蛋白的任何部分都可充当靶向序列。

[0081] 另外，包含BclA的氨基酸20-35或以上所列的任何相应氨基酸的任何氨基酸序列都可充当靶向序列。

[0082] 因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35、SEQ ID NO:1 的氨基酸20-35、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:1的氨基酸22-31、SEQ ID NO:1的氨基酸22-33、或SEQ ID NO:1的氨基酸20-31。或者，靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸1-35、SEQ ID NO:1的氨基酸20-35、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:96。或者，靶向序列可由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸22-31、SEQ ID NO:1的氨基酸22-33或SEQ ID NO:1的氨基酸20-31。或者，外孢壁蛋白可以包含全长BclA(SEQ ID NO:2)，或者外孢壁蛋白片段可包含缺少羧基端的BclA的中间片段，例如SEQ ID NO:59(BclA的氨基酸1-196)。或者，外孢壁蛋白片段可由下列组成：SEQ ID NO:59。

[0083] 靶向序列可包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-35、SEQ ID NO:1的氨基酸5-35、SEQ ID NO:1的氨基酸8-35、SEQ ID NO:1的氨基酸10-35 或SEQ ID NO:1的氨基酸15-35。

[0084] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-27、SEQ ID NO:3的氨基酸12-27或SEQ ID NO:3，或者外孢壁蛋白可以包含全长 BetA/BAS3290(SEQ ID NO:4)。还发现连接BetA/
BAS3290的氨基酸 12-27的甲硫氨酸残基可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID 
NO: 97。靶向序列还可包含SEQ ID NO:3的氨基酸14-23、SEQ ID NO:3的氨基酸14-25或SEQ ID NO:3的氨基酸12-23。

[0085] 靶向序列可包含SEQ ID NO:3的氨基酸2-27、SEQ ID NO:3的氨基酸5-27、SEQ ID NO:3的氨基酸8-27或SEQ ID NO:3的氨基酸10-27。

[0086] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-38、SEQ ID NO:5的氨基酸23-38或SEQ ID NO:5或者外孢壁蛋白可以包含全长BAS4623 (SEQ ID NO:6)。

[0087] 靶向序列可包含SEQ ID NO:5的氨基酸2-38、SEQ ID NO:5的氨基酸5-38、SEQ ID NO:5的氨基酸8-38、SEQ ID NO:5的氨基酸10-38、 SEQ ID NO:5的氨基酸15-38或SEQ ID 
NO:5的氨基酸20-38。

[0088] 或者，靶向序列可包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-28、SEQ ID NO:7 的氨基酸13-28或SEQ ID NO:7或者外孢壁蛋白可以包含全长BclB (SEQ ID NO:8)。

[0089] 靶向序列可包含SEQ ID NO:7的氨基酸2-28、SEQ ID NO:7的氨基酸5-28、SEQ ID NO:7的氨基酸8-28或SEQ ID NO:7的氨基酸10-28。

[0090] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:9的氨基酸1-24、SEQ ID NO:9的氨基酸9-24、或SEQ ID NO:9或者外孢壁蛋白可以包含全长BAS1882 (SEQ ID NO:10)。连接BAS1882的氨基酸9-24的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:105。

[0091] 靶向序列可包含SEQ ID NO:9的氨基酸2-24、SEQ ID NO:9的氨基酸5-24或SEQ ID NO:9的氨基酸8-24。

[0092] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:11的氨基酸1-33、SEQ ID NO:11的氨基酸18-33或SEQ ID NO:11，或外孢壁蛋白可以包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4 2280基因产物(SEQ ID 
NO:12)。连接韦氏芽孢杆菌KBAB4 2280基因产物的氨基酸18-33的甲硫氨酸残基也可用作
靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:98。

[0093] 靶向序列可包含SEQ ID NO:11的氨基酸2-33、SEQ ID NO:11的氨基酸5-33、SEQ ID NO:11的氨基酸8-33、SEQ ID NO:11的氨基酸10-33 或SEQ ID NO:11的氨基酸15-33。

[0094] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:13的氨基酸1-33、SEQ ID NO:13的氨基酸18-33或SEQ ID NO:13，或外孢壁蛋白可以包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4 3572基因产物(SEQ ID 
NO:14)。连接韦氏芽孢杆菌KBAB4 3572基因产物的氨基酸18-33的甲硫氨酸残基也可用作
靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:99。

[0095] 靶向序列可包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33、SEQ ID NO:13的氨基酸5-33、SEQ ID NO:13的氨基酸8-33、SEQ ID NO:13的氨基酸10-33 或SEQ ID NO:13的氨基酸15-33。

[0096] 或者，靶向序列可包含SEQ ID NO:15的氨基酸1-43、SEQ ID NO:15 的氨基酸28-43或SEQ ID NO:15，或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌VD200外孢壁前导肽(SEQ ID NO:16)。

[0097] 靶向序列可包含SEQ ID NO:15的氨基酸2-43、SEQ ID NO:15的氨基酸5-43、SEQ ID NO:15的氨基酸8-43、SEQ ID NO:15的氨基酸10-43、 SEQ ID NO:15的氨基酸15-43、SEQ ID NO:15的氨基酸20-43或SEQ ID NO:15的氨基酸25-43。

[0098] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-27、SEQ ID NO:17 的氨基酸12-27或SEQ ID NO:17，或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌VD166外孢壁前导肽(SEQ ID NO:
18)。连接蜡样芽孢杆菌VD166外孢壁前导肽的氨基酸12-27的甲硫氨酸残基也可用作靶向
序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:100。

[0099] 靶向序列可包含SEQ ID NO:17的氨基酸2-27、SEQ ID NO:17的氨基酸5-27、SEQ ID NO:17的氨基酸8-27或SEQ ID NO:17的氨基酸 10-27。

[0100] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:19的氨基酸1-33、SEQ ID NO:19 的氨基酸18-33或SEQ ID NO:19，或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌VD200假设蛋白IKG_04663(SEQ 
ID NO:20)。

[0101] 靶向序列可包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-33、SEQ ID NO:19的氨基酸5-33、SEQ ID NO:19的氨基酸8-33、SEQ ID NO:19的氨基酸 10-33；或SEQ ID NO:19的氨基酸15-33。

[0102] 或者，靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸1-33、SEQ ID NO:21 的氨基酸18-33或SEQ ID NO:21，或外孢壁蛋白可以包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白(SEQ ID NO:22)。连接韦氏芽孢杆菌 KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白的氨基酸18-33的甲硫氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:101。

[0103] 靶向序列可包含SEQ ID NO:21的氨基酸2-33、SEQ ID NO:21的氨基酸5-33、SEQ ID NO:21的氨基酸8-33、SEQ ID NO:21的氨基酸 10-33或SEQ ID NO:21的氨基酸15-33。

[0104] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:23的氨基酸1-24、SEQ ID NO:23 的氨基酸9-24或SEQ ID NO:23，或外孢壁蛋白可以包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2363
(SEQ ID NO:24)。连接韦氏芽孢杆菌KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9-24的甲硫
氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:102。

[0105] 靶向序列可包含SEQ ID NO:23的氨基酸2-24、SEQ ID NO:23的氨基酸5-24或SEQ ID NO:23的氨基酸8-24。

[0106] 靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸1-24、SEQ ID NO:25的氨基酸9-24或SEQ ID NO:25，或外孢壁蛋白可以包含全长韦氏芽孢杆菌 KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2131(SEQ ID NO:26)。连接韦氏芽孢杆菌 KBAB4假设蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-24的甲硫氨酸残基
也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:103。

[0107] 靶向序列可包含SEQ ID NO:25的氨基酸2-24、SEQ ID NO:25的氨基酸5-24或SEQ ID NO:25的氨基酸8-24。

[0108] 或者，靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸1-30、SEQ ID NO:27 的氨基酸15-30或SEQ ID NO:27，或外孢壁蛋白可以包含全长韦氏芽孢杆菌KBAB4含有三螺旋重复的胶原
(SEQ ID NO:28)。

[0109] 靶向序列可包含SEQ ID NO:27的氨基酸2-30、SEQ ID NO:27的氨基酸5-30、SEQ ID NO:27的氨基酸8-30或SEQ ID NO:27的氨基酸 10-30。

[0110] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-33、SEQ ID NO:29的氨基酸18-33或SEQ ID NO:29，或外孢壁蛋白可以包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyco0001_21660
(SEQ ID NO:30)。

[0111] 靶向序列可包含SEQ ID NO:29的氨基酸2-33、SEQ ID NO:29的氨基酸5-33、SEQ ID NO:29的氨基酸8-33、SEQ ID NO:29的氨基酸 10-33或SEQ ID NO:29的氨基酸15-33。

[0112] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-24、SEQ ID NO:31 的氨基酸9-24或SEQ ID NO:31，或外孢壁蛋白可以包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_22540
(SEQ ID NO:32)。连接蕈状芽孢杆菌 2048假设蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9-24的甲硫
氨酸残基也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:104。

[0113] 靶向序列可包含SEQ ID NO:31的氨基酸2-24、SEQ ID NO:31的氨基酸5-24或SEQ ID NO:31的氨基酸8-24。

[0114] 或者，靶向序列包含SEQ ID NO:33的氨基酸1-15、SEQ ID NO:33、或外孢壁蛋白包含全长蕈状芽孢杆菌2048假设蛋白bmyc0001_21510 (SEQ ID NO:34)。

[0115] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:35的氨基酸1-16、SEQ ID NO:35，或外孢壁蛋白可以包含全长苏云金芽孢杆菌35646胶原三螺旋重复蛋白 (SEQ ID NO:36)。

[0116] 靶向序列可包含SEQ ID NO:43的氨基酸1-29、SEQ ID NO:43的氨基酸14-29或SEQ ID NO:43，或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌假设蛋白WP_69652(SEQ ID NO:44)。

[0117] 靶向序列可包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-29、SEQ ID NO:43的氨基酸5-29、SEQ ID NO:43的氨基酸8-29或SEQ ID NO:43的氨基酸 10-29。

[0118] 或者，靶向序列可包含SEQ ID NO:45的氨基酸、SEQ ID NO:45 的氨基酸20-35或SEQ ID NO:45，或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌外孢壁前导WP016117717(SEQ ID NO:46)。连接蜡样芽孢杆菌外孢壁前导WP016117717的氨基酸20-35的甲硫氨酸残基也可用
作靶向序列。因此，靶向序列可包含SEQ ID NO:106。

[0119] 靶向序列可包含SEQ ID NO:45的氨基酸2-35、SEQ ID NO:45的氨基酸5-35、SEQ ID NO:45的氨基酸8-35、SEQ ID NO:45的氨基酸 10-35或SEQ ID NO:45的氨基酸15-35。

[0120] 靶向序列可包含SEQ ID NO:47的氨基酸1-43、SEQ ID NO:47的氨基酸28-43或SEQ ID NO:47，或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌外孢壁肽WP002105192(SEQ ID NO:
48)。

[0121] 靶向序列可包含SEQ ID NO:47的氨基酸2-43、SEQ ID NO:47的氨基酸5-43、SEQ ID NO:47的氨基酸8-43、SEQ ID NO:47的氨基酸 10-43、SEQ ID NO:47的氨基酸15-43、SEQ ID NO:47的氨基酸20-43 或SEQ ID NO:47的氨基酸25-43。

[0122] 靶向序列可包含SEQ ID NO:49的氨基酸1-32、SEQ ID NO:49的氨基酸17-32或SEQ ID NO:49，或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌假设蛋白WP87353(SEQ ID NO:50)。

[0123] 靶向序列可包含SEQ ID NO:49的氨基酸2-32、SEQ ID NO:49的氨基酸5-32、SEQ ID NO:49的氨基酸8-32、SEQ ID NO:49的氨基酸 10-32或SEQ ID NO:49的氨基酸15-32。

[0124] 或者，靶向序列可包含SEQ ID NO:51的氨基酸1-33、SEQ ID NO: 51的氨基酸18-33或SEQ ID NO:51，或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌外孢壁肽02112369(SEQ ID 
NO:52)。

[0125] 靶向序列可包含SEQ ID NO:51的氨基酸2-33、SEQ ID NO:51的氨基酸5-33、SEQ ID NO:51的氨基酸8-33、SEQ ID NO:51的氨基酸 10-33或SEQ ID NO:51的氨基酸15-33。

[0126] 靶向序列可包含SEQ ID NO:53的氨基酸1-33、SEQ ID NO:53的氨基酸18-33或SEQ ID NO:53，或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌外孢壁蛋白WP016099770(SEQ ID NO:
54)。

[0127] 靶向序列可包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33、SEQ ID NO:53的氨基酸5-33、SEQ ID NO:53的氨基酸8-33、SEQ ID NO:53的氨基酸 10-33或SEQ ID NO:53的氨基酸15-33。

[0128] 或者，靶向序列可包含SEQ ID NO:55的氨基酸1-30、SEQ ID NO: 55的氨基酸15-30或SEQ ID NO:55，或外孢壁蛋白可以包含全长苏云金芽孢杆菌假设蛋白YP006612525
(SEQ ID NO:56)。

[0129] 靶向序列可包含SEQ ID NO:55的氨基酸2-30、SEQ ID NO:55的氨基酸5-30、SEQ ID NO:55的氨基酸8-30或SEQ ID NO:55的氨基酸 10-30。

[0130] 靶向序列还可包含SEQ ID NO:57的氨基酸1-130、SEQ ID NO:57 的氨基酸115-130或SEQ ID NO:57，或外孢壁蛋白可以包含全长蕈状芽孢杆菌假设蛋白TIGR03720(SEQ 
ID NO:58)。

[0131] 靶向序列可包含SEQ ID NO:57的氨基酸2-130、SEQ ID NO:57的氨基酸5-130、SEQ ID NO:57的氨基酸10-130、SEQ ID NO:57的氨基酸20-130、SEQ ID NO:57的氨基酸30-130、SEQ ID NO:57的氨基酸 40-130、SEQ ID NO:57的氨基酸50-130、SEQ ID NO:57的氨基酸 60-130、SEQ ID NO:57的氨基酸70-130、SEQ ID NO:57的氨基酸 80-130、SEQ ID NO:57的氨基酸90-130、SEQ ID NO:57的氨基酸 100-130或SEQ ID NO:57的氨基酸110-130。

[0132] 靶向序列可包含SEQ ID NO:59的氨基酸1-30或SEQ ID NO:59；或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌ATCC 10987胶原三螺旋重复结构域蛋白(SEQ ID NO:60)。

[0133] 靶向序列可包含SEQ ID NO:59的氨基酸2-30、SEQ ID NO:59的氨基酸4-30或SEQ ID NO:59的氨基酸6-30。

[0134] 靶向序列可包含SEQ ID NO:61的氨基酸1-33、SEQ ID NO:61的氨基酸18-33或SEQ ID NO:61；或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌E33L胶原样蛋白(SEQ ID NO:62)。

[0135] 靶向序列可包含SEQ ID NO:61的氨基酸2-33、SEQ ID NO:61的氨基酸5-33、SEQ ID NO:61的氨基酸10-33或SEQ ID NO:61的氨基酸15-33。

[0136] 靶向序列可包含SEQ ID NO:63的氨基酸1-35或SEQ ID NO:63；或外孢壁蛋白可以包含含有三螺旋重复的胶原的全长B. weihenstephanensis KBAB4(SEQ ID NO:64)。

[0137] 靶向序列可包含SEQ ID NO:63的氨基酸2-35、SEQ ID NO:63的氨基酸5-35、SEQ ID NO:63的氨基酸8-35、SEQ ID NO:63的氨基酸 10-35或SEQ ID NO:63的氨基酸15-35。

[0138] 靶向序列可包含SEQ ID NO:65的氨基酸1-24、SEQ ID NO:65的氨基酸9-24、SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:107；或外孢壁蛋白可以包含全长苏云金芽孢杆菌str.Al Hakam假
设蛋白BALH_2230(SEQ ID NO: 66)。

[0139] 靶向序列可包含SEQ ID NO:65的氨基酸2-24或SEQ ID NO:65的氨基酸5-24。

[0140] 靶向序列可包含SEQ ID NO:67的氨基酸1-27、SEQ ID NO:67的氨基酸12-27或SEQ ID NO:67；或者外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原
(SEQ ID NO:68)。

[0141] 靶向序列可包含SEQ ID NO:67的氨基酸2-27、SEQ ID NO:67的氨基酸5-27或SEQ ID NO:67的氨基酸10-27。

[0142] 靶向序列可包含SEQ ID NO:69的氨基酸1-38、SEQ ID NO:69的氨基酸23-38或SEQ ID NO:69；或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌胶原三螺旋重复(SEQ ID NO:70)。

[0143] 靶向序列可包含SEQ ID NO:69的氨基酸2-38、SEQ ID NO:69的氨基酸5-38、SEQ ID NO:69的氨基酸10-38或SEQ ID NO:69的氨基酸15-38。

[0144] 外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原(SEQ ID NO:72)。

[0145] 靶向序列可包含SEQ ID NO:73或者外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK1835(SEQ ID NO:74)。

[0146] 靶向序列可包含SEQ ID NO:75的氨基酸1-42、SEQ ID NO:75的氨基酸27-42或SEQ ID NO:75；或外孢壁蛋白可以包含含有三螺旋重复的胶原的全长B.weihenstephanensis 
KBAB4(SEQ ID NO:76)。

[0147] 靶向序列可包含SEQ ID NO:75的氨基酸2-42、SEQ ID NO:75的氨基酸5-42、SEQ ID NO:75的氨基酸10-42、SEQ ID NO:75的氨基酸 15-42、SEQ ID NO:75的氨基酸20-42或
SEQ ID NO:75的氨基酸25-42。

[0148] 靶向序列可包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-24、SEQ ID NO:7的氨基酸9-24或SEQ ID NO:77；或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌 ATCC 14579含有三螺旋重复的胶原(SEQ ID NO:78)。

[0149] 靶向序列可包含SEQ ID NO:7的氨基酸2-24或SEQ ID NO:7的氨基酸5-24。

[0150] 外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌ATCC 14579假设蛋白 BC4725(SEQ ID NO:80)。

[0151] 靶向序列可包含SEQ ID NO:81的氨基酸1-38、SEQ ID NO:81的氨基酸23-38或SEQ ID NO:81；或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌E33L假设蛋白BCZK4476(SEQ ID NO:
82)。

[0152] 靶向序列可包含SEQ ID NO:81的氨基酸2-38、SEQ ID NO:81的氨基酸5-38、SEQ ID NO:81的氨基酸10-38、SEQ ID NO:81的氨基酸 15-38或SEQ ID NO:81的氨基酸20-38。

[0153] 靶向序列可包含SEQ ID NO:83的氨基酸1-34或SEQ ID NO:83；或外孢壁蛋白可以包含含有三螺旋重复的胶原的全长炭疽杆菌str.‘Ames Ancestor’(SEQ ID NO:84)。

[0154] 外孢壁蛋白可以包含全长苏云金芽孢杆菌serovar konkukian str. 97-27BclA蛋白(SEQ ID NO:86)。

[0155] 靶向序列可包含SEQ ID NO:87的氨基酸1-28、SEQ ID NO:87的氨基酸13-28或SEQ ID NO:87；或外孢壁蛋白可以包含全长蜡样芽孢杆菌ATCC 10987保守假设蛋白(SEQ ID 
NO:88)。

[0156] 靶向序列可包含SEQ ID NO:87的氨基酸2-28、SEQ ID NO:87的氨基酸5-28或SEQ ID NO:87的氨基酸10-28。

[0157] 靶向序列可包含SEQ ID NO:89的氨基酸1-28或SEQ ID NO:89，或外孢壁蛋白可以包含含有三螺旋重复的胶原的全长蜡样芽孢杆菌ATCC 14579(SEQ ID NO:90)。

[0158] 靶向序列可包含SEQ ID NO:89的氨基酸2-28、SEQ ID NO:89的氨基酸5-28或SEQ ID NO:89的氨基酸10-28。

[0159] 靶向序列可包含SEQ ID NO:91的氨基酸1-93或SEQ ID NO:91，或外孢壁蛋白可以包含蜡样芽孢杆菌外孢壁前导肽部分序列(SEQ ID NO: 92)。

[0160] 靶向序列可包含SEQ ID NO:91的氨基酸2-93、SEQ ID NO:91的氨基酸10-93、SEQ ID NO:91的氨基酸20-93、SEQ ID NO:91的氨基酸30-93、SEQ ID NO:91的氨基酸40-93、SEQ ID NO:91的氨基酸50-93 或SEQ ID NO:91的氨基酸60-93。

[0161] 靶向序列可包含SEQ ID NO:93的氨基酸1-130或SEQ ID NO:93；或外孢壁蛋白可以包含B.weihenstephanensis)假设蛋白ER45_27600部分序列(SEQ ID NO:94)。

[0162] 靶向序列可包含SEQ ID NO:93的氨基酸2-130、SEQ ID NO:93的氨基酸10-130、SEQ ID NO:93的氨基酸20-130或SEQ ID NO:93的氨基酸30-130。

[0163] 另外，如下文提供的实施例中所描述，已经发现可以使用比BclA的氨基酸20-35更短的序列来使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁。具体来说，BclA的氨基
酸20-33、BclA的氨基酸20-31、BclA 的氨基酸21-33或BclA的氨基酸23-31可用于使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁。因此，靶向序列可由下列组成：SEQ ID NO: 1的氨基酸20-33、SEQ ID NO:1的氨基酸20-31、SEQ ID NO:1的氨基酸21-33或SEQ ID NO:1
的氨基酸23-31。图1A和1B中所示的任何 SEQ ID NO的相应区域也可用于使融合蛋白靶向
重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁。当序列和图1A和1B中所示的SEQ ID NO:1进行比对
时，“相应区域”是指和SEQ ID NO的氨基酸比对的其他氨基酸序列的区域是那些序列的“相应区域”。因此，例如，SEQ ID NO:3的氨基酸12-25、SEQ ID NO:5的氨基酸23-36、SEQ ID NO:7的氨基酸13-26等可用于使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁，因为
这些区域比对图1A 中所示的SEQ ID NO:1的氨基酸20-33。

[0164] 在BclA的氨基酸20-35内甚至更短区域也可用于使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁。具体来说，可以使用包含SEQ ID NO: 1的氨基酸25-30或图1A和1B中所示任何序列的相应氨基酸的任何氨基酸序列。技术人员将认识到，从SEQ ID NO:1的氨基酸25-30或图1A 和1B中所示的任何序列的相应区域开始，可以将另外的氨基酸加入到氨基
端、羧基末端或两者(氨基-和羧基末端)以产生靶向序列，这将有效地使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁。

[0165] 另外，从图1A和1B中的序列比对可以很容易地看出，虽然BclA的氨基酸20-35是保守的，而氨基酸25-35更保守，但是在该区域中可能会发生一定程度的变异，而不影响靶向序列使蛋白靶向外孢壁的能力。图1A 和1B列出了每个序列的每个相应氨基酸与BclA的氨
基酸20-35(“20-35％同一性”)和BclA的氨基酸25-35(“25-35％同一性”)的同一性百分比。
因此，例如，与BclA的氨基酸20-35相比，BetA/BAS3290的相应氨基酸约为81.3％同一性，BAS4623的相应氨基酸约为50.0％同一性，BclB的相应氨基酸约为43.8％同一性，BAS1882
的相应氨基酸约为62.5％同一性，KBAB4 2280基因产物的相应氨基酸约为81.3％同一性，
并且KBAB4 3572基因产物的相应氨基酸约为81.3％同一性。剩余序列的该区域的序列同一
性列在图1A和1B中。

[0166] 对于BclA的氨基酸25-35，BetA/BAS3290的相应氨基酸约90.9％同一性，BAS4623的相应氨基酸约为72.7％同一性，BclB的相应氨基酸约为54.5％同一性，BAS1882的相应氨基酸约为72.7％同一性，KBAB4 的相应氨基酸2280基因产物约90.9％同一性，KBAB4 3572
基因产物的相应氨基酸约为81.8％同一性。剩余序列的该区域的序列同一性列在图1A 和
1B中。

[0167] 因此，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约 43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约54％。或者，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由下列组成：16个氨基酸并且与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约
43％同一性，其中与氨基酸25-35的同一性至少约54％。

[0168] 靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。或者，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由下列组成：16个氨基酸并且与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约50％
同一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。

[0169] 靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约72％。或者，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由下列组成：16个氨基酸并且与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约50％同
一性，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。

[0170] 靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约63％。或者，靶向序列由下列组成：与SEQ ID NO:116的氨基酸20-35具有至少约 56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一
性为至少约63％。

[0171] 或者，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约 62％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约72％。靶向序列还可由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由下列组成：16个氨基酸并且与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约
62％同一性，其中与 SEQ ID NO:1的氨基酸25-35的同一性至少约72％。

[0172] 靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约81％。或者，靶向序列由下列组成：氨基酸序列16个氨基酸并且与SEQ ID NO:1的氨基酸 20-35具有至少68％同一性，其中与氨基酸25-35的同
一性为至少约81％。

[0173] 靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约72％。或者，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由下列组成：16个氨基酸并且与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同
一性，其中与SEQ ID NO:1的氨基酸25-35的同一性至少约72％。

[0174] 靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约81％。或者，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由下列组成：16个氨基酸并且与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同
一性，其中与SEQ ID NO:1的氨基酸25-35的同一性至少约81％。

[0175] 靶向序列还可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约81％。或者，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由下列组成：16个氨基酸并且与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约81％同
一性，其中与氨基酸25-35的同一性至少约81％。

[0176] 靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约90％。或者，靶向序列由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列由下列组成：16个氨基酸并且与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35,具有至少约81％同
一性，其中与氨基酸 25-35的同一性至少约90％。

[0177] 本领域技术人员将认识到以上序列的变体也可用作靶向序列，只要靶向序列包含BclA的氨基酸20-35、BetA/BAS3290、BAS4263、BclB、 BAS1882、KBAB42280基因产物或
KBAB3572基因产物的相应氨基酸，或存在包含与BclA的氨基酸20-35及25-35的以上所列的
任何序列同一性的序列。

[0178] 缺少和BclA的氨基酸25-35具有同源性的区域的某些蜡样芽胞杆菌家族外孢壁蛋白也可用于使肽或蛋白靶向蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁。具体来说，融合蛋白可以包
含外孢壁蛋白，包含SEQ ID NO:108(蕈状芽孢杆菌InhA)、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:109
(炭疽杆菌Sterne BAS1141(ExsY))、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:110(炭疽杆菌Sterne 
BAS1144(BxpB/ExsFA))、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:111(炭疽杆菌 Sterne BAS1145
(CotY))、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:112(炭疽杆菌 Sterne BAS1140)、外孢壁蛋白包含
SEQ ID NO:113(炭疽杆菌H9401 ExsFB)、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:114(苏云金芽孢杆菌
HD74 InhA1)、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:115(蜡样芽孢杆菌ATCC 10876 ExsJ)、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:116(蜡样芽孢杆菌ExsH)、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:117(炭疽杆菌
Ames YjcA)、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:118(炭疽杆菌YjcB)、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:
119(炭疽杆菌Sterne BclC)、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:120(苏云金芽孢杆菌 serovar 
konkukian str.97-27酸性磷酸酶)、外孢壁蛋白包含SEQ ID NO: 121(苏云金芽孢杆菌
HD74InhA2)、或外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:122 (蕈状芽孢杆菌InhA3)。在本文所述的融合蛋白中加入包含SEQ ID NO: 108-122中任一个的外孢壁蛋白将导致靶向蜡样芽孢杆菌家
族成员的外孢壁。

[0179] 而且，和上述全长外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段中任一个具有高度序列同一性的外孢壁蛋白也可用于使肽或蛋白靶向蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁。因此，融合蛋白可
以包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段包含与 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、
22、24、26、28、 30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、 66、68、70、72、74、76、
78、80、82、84、86、88、90、92、94、 95、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、 
119、120、121和122中任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列。或者，融合蛋白可以包含外孢壁蛋白与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、
46、48、 50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、 80、82、84、86、88、90、92、94、
95、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121和122中任一个具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。

[0180] 在表达本文所述的任一融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子形成过程中，靶向模体、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段被孢子外孢壁组件机械识别并导向至外孢壁，从
而导致在孢子的外部上呈现融合蛋白的目标蛋白或肽部分。

[0181] 如果下文提供的实施例中进一步描述，使用不同的靶向序列允许在蜡样芽胞杆菌家族成员表面上控制融合蛋白的表达水平。使用本文所述的某些靶向序列将导致融合蛋白
的更高水平的表达，而使用其他靶向序列将导致融合蛋白在孢子表面上的表达水平较低。

[0182] 在本文所述的任一融合蛋白中，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可在其羧基末端包含氨基酸序列GXT，其中X是任何氨基酸。

[0183] 在本文所述的任一融合蛋白中，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可在对应SEQ ID NO:1的氨基酸20的靶向序列位点处包含丙氨酸残基。

[0184] 在本文所述的任一融合蛋白中，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段还可在靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的第一氨基酸紧接前面的氨基酸位点或对应SEQ 
ID NO:1的氨基酸20的靶向序列位点处包含甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。

[0185] 用于在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中表达的融合蛋白

[0186] 本发明涉及融合蛋白，包含至少一种目标蛋白或肽和靶向序列或外孢壁蛋白。当目标蛋白或肽是任何目标蛋白或肽时，融合蛋白可以包含:(1) 靶向序列包含SEQ ID NO:
59的氨基酸1-30；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:59；(3)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:60具
有至少85％同一性的氨基酸序列；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸2-30；(5)靶向
序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸4-30；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸6-30；(7)
靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸1-33；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸18-
33；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:61； (10)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:62具有至少85％
同一性的氨基酸序列；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸2-33；(12)靶向序列包含 SEQ ID NO:61的氨基酸5-33；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸10-33；(14)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸15-33；(15)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸1-35；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:63；(17)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:64具有至少85％同一性的
氨基酸序列；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸2-35；(19)靶向序列包含SEQ ID 
NO:63的氨基酸5-35；(20)靶向序列包含SEQ ID NO: 63的氨基酸8-35；(21)靶向序列包含
SEQ ID NO:63的氨基酸10-35；(22) 靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸15-35；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸1-24；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸9-24；
(25)靶向序列包含SEQ ID NO:65；(26)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 66具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(27)靶向序列包含SEQ ID NO: 107；(28)靶向序列包含SEQ ID NO:65
的氨基酸2-24；(29)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸5-24；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸1-27；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸12-27；(32)靶向序列包含
SEQ ID NO:67；(33)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:68具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(34)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸2-27；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸
5-27；(36)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸10-27；(37)靶向序列包含SEQ ID NO: 69
的氨基酸1-38；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸23-38；(39) 靶向序列包含SEQ 
ID NO:69；(40)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:70具有至少85％同一性的氨基酸序列；(41)
靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸2-38；(42)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸5-
38；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸10-38；(44)靶向序列包含SEQ ID NO: 69的
氨基酸15-38；(45)外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:72；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:73；(47)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:74具有至少 95％同一性的氨基酸序列；(48)靶向序列包含
SEQ ID NO:75的氨基酸 1-42；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-42；(50)靶向
序列包含SEQ ID NO:75；(51)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:76具有至少 85％同一性的氨
基酸序列；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸 2-42；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:
75的氨基酸5-42；(54)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸10-42；(55)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸15-42；(56)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸20-42；(57)靶向序列
包含SEQ ID NO:75的氨基酸25-42；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-24；(59)靶
向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸9-24； (60)靶向序列包含SEQ ID NO:77；(61)外孢壁蛋
白包含与SEQ ID NO: 78具有至少85％同一性的氨基酸序列；(62)靶向序列包含SEQ ID 
NO:7 的氨基酸2-24；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-24；(64)外孢壁蛋白包含
与SEQ ID NO:80具有至少85％同一性的氨基酸序列；(65) 靶向序列包含SEQ ID NO:81的
氨基酸1-38；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸23-38；(67)靶向序列包含SEQ ID 
NO:81；(68)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:82具有至少85％同一性的氨基酸序列；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸2-38；(70)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸5-38；
(71)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸10-38；(72) 靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基
酸15-38；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸20-38；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:
83的氨基酸1-34； (75)靶向序列包含SEQ ID NO:83；(76)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 
84具有至少85％同一性的氨基酸序列；(77)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:86具有至少85％
同一性的氨基酸序列；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸1-28；(79)靶向序列包含
SEQ ID NO:87的氨基酸13-28； (80)靶向序列包含SEQ ID NO:87；(81)外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO: 88具有至少85％同一性的氨基酸序列；(82)靶向序列包含SEQ ID NO: 87的氨
基酸2-28；(83)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸5-28；(84) 靶向序列包含SEQ ID NO:
87的氨基酸10-28；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸1-28；(86)靶向序列包含SEQ ID NO:89；(87)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列；(88)
靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸2-28；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:89 的氨基酸5-
28；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸10-28；(91) 靶向序列包含SEQ ID NO:91的
氨基酸1-93；(92)靶向序列包含SEQ ID NO:91；(93)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:92具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸2-93；(95)靶向
序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸10-93；(96)靶向序列包含SEQ ID NO: 91的氨基酸20-93；
(97)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸30-93； (98)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基
酸40-93；(99)靶向序列包含 SEQ ID NO:91的氨基酸50-93；(100)靶向序列包含SEQ ID 
NO:91的氨基酸60-93；(101)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸1-130；(102) 靶向序列
包含SEQ ID NO:93；(103)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:94 具有至少85％同一性的氨基酸
序列；(104)靶向序列包含SEQ ID NO:93 的氨基酸2-130；(105)靶向序列包含SEQ ID NO:
93的氨基酸10-130； (106)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸20-130；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸30-130；或(108)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:122具有至少85％
同一性的氨基酸序列。

[0187] 例如，当目标蛋白或肽是任何目标蛋白或肽时，融合蛋白可以含有： (1)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸2-30；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸4-30；(3)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸 6-30；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸2-33；(5)靶向序列包含 SEQ ID NO:61的氨基酸5-33；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸10-
33；(7)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸15-33；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸2-35；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:63 的氨基酸5-35；(10)靶向序列包含SEQ ID NO:63
的氨基酸8-35；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸10-35；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸15-35；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸2-24； (14)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸5-24；(15)靶向序列包含 SEQ ID NO:67的氨基酸2-27；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸5-27；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸10-27；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸2-38；(19)靶向序列包含SEQ ID NO: 69的氨基酸5-
38；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸10-38；(21) 靶向序列包含SEQ ID NO:69的
氨基酸15-38；(22)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸2-42；(23)靶向序列包含SEQ ID 
NO:75的氨基酸5-42； (24)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸10-42；(25)靶向序列包含 SEQ ID NO:75的氨基酸15-42；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸20-42；(27)靶向
序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸25-42；(28)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸2-24；
(29)靶向序列包含SEQ ID NO: 7的氨基酸5-24；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸
2-38；(31) 靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸5-38；(32)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸10-38；(33)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸 15-38；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸20-38；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸2-28；(36)靶向序列包含
SEQ ID NO:87 的氨基酸5-28；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸10-28；(38) 靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸2-28；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸5-28；
(40)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸10-28； (41)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基
酸2-93；(42)靶向序列包含 SEQ ID NO:91的氨基酸10-93；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:
91的氨基酸20-93；(44)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸30-93；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸40-93；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸50-93；(47)靶向序列
包含SEQ ID NO:91的氨基酸 60-93；(48)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸2-130；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸10-130；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:93 的氨基酸
20-130；或(51)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸30-130。

[0188] 或者，当目标蛋白或肽是目标Y蛋白或肽时，融合蛋白可以包含：(1) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸20-33；(2)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸
21-33；(3)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸23-31；(4)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:96的氨基酸1-15；(5)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:96的氨基酸1-13；(6)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸12-25；(7)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸13-25；(8)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸15-23；(9)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:97的氨基酸1-15；(10)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-
13；(11) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸23-36；(12)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:5的氨基酸23-34；(13)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸24-36；(14)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸26-34；(15)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
7的氨基酸13-26；(16) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸13-24；(17)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸14-26；(18)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸16-24；(19)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-22；(20)靶向序列由下列组
成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-20；(21) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸10-22；
(22)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸12-20；(23)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:105的氨基酸1-15；(24)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:105 的氨基酸1-13；(25)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸 18-31；(26)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸18-29；(27) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸19-31；(28)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-15；(29)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-13；(30)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-31；(31)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-29； (32)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸19-
31；(33)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸21-29；(34)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:99的氨基酸1-15；(35)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 99的氨基酸1-13；
(36)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸 28-41；(37)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸28-39；(38) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸29-41；(39)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸31-39；(40)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:17的氨基酸12-25；(41)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 17的氨基酸13-25；(42)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:100的氨基酸1-15；(43)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸18-31；(44) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸18-29；(45)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸19-31；(46)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:19的氨基酸21-29；(47)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 21的氨基酸18-31；(48)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸 18-29；(49)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸
19-31；(50) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸21-29；(51)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:101的氨基酸1-15；(52)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:101的氨基酸1-
13；(53)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 23的氨基酸9-22；(54)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:23的氨基酸 9-20；(55)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸10-22；
(56)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸12-20；(57)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:102的氨基酸1-15；(58)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:102的氨基酸1-13；(59)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25 的氨基酸9-22；(60)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
25的氨基酸9-20； (61)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸10-22；(62)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸12-20；(63)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:103的氨基酸1-15；(64)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:103的氨基酸1-13；(65)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸15-28；(66)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸15-
26； (67)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸16-28；(68)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:27的氨基酸18-26；(69)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:104的氨基酸1-15；
(70)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:104的氨基酸1-13；(71)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:33的氨基酸1-13；(72)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:33的氨基酸1-11；(73) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:33的氨基酸3-11；(74)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸1-14；(75)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸1-12；(76)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸2-14；(77)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:43的氨基酸
14-27； (78)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:43的氨基酸14-25；(79)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:43的氨基酸15-27；(80)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸20-
33；(81)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸20-31；(82)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:45的氨基酸21-33；(83)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:106的氨基酸1-15；
(84)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:106的氨基酸1-13；(85)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:47的氨基酸28-41；(86)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:47的氨基酸28-39；(87)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸18-31；(88)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
53的氨基酸18-29；(89)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸19-31； (90)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸18-31；(91)靶向序列包含 SEQ ID NO:61的氨基酸18-29；
(92)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸19-31；(93)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基
酸9-22；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸9-20；(95)靶向序列包含SEQ ID NO: 65的氨基酸10-22；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-15； (97)靶向序列包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-13；(98)靶向序列包含 SEQ ID NO:67的氨基酸12-25；(99)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸12-23；(100)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸13-25；
(101) 靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸15-23；(102)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨
基酸23-36；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸 23-34；(104)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸24-36；(105)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸26-34；(106)靶向序列包含SEQ ID NO: 75的氨基酸27-40；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-38； 
(108)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸9-22；(109)靶向序列包含 SEQ ID NO:77的氨
基酸9-20；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸10-22；(111)靶向序列包含SEQ ID 
NO:77的氨基酸12-20；(112) 靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸23-36；(113)靶向序列
包含SEQ ID NO:81的氨基酸23-34；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸 24-36；
(115)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸26-34；(116)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨
基酸13-26；(117)靶向序列包含SEQ ID NO: 87的氨基酸13-24；或(118)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸 14-26。靶向序列还可由任何这些序列组成。

[0189] 本发明涉及融合蛋白，包含至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。目标蛋白或肽可以是催化一氧化氮产生或核酸结合蛋白或肽的酶。当目标
蛋白或肽包含催化一氧化氮产生或核酸结合蛋白或肽的酶时，靶向序列、外孢壁蛋白或外
孢壁蛋白片段可以是使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的exopsorium的任何靶
向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。例如，靶向序列外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可以是用于和任何目标蛋白或肽一起使用的上面段落[00166]-[00168]中列出的靶向序列、外
孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段中任一个，或(1)靶向序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35
具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约54％；(2)靶向
序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35；(3)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35； (4)
靶向序列包含SEQ ID NO:1；(5)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的氨
基酸序列；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-35；(7)靶向序列包含SEQ ID NO:1的
氨基酸5-35；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸8-35；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:1
的氨基酸10-35；(10)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸15-35；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-27；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸12-27；(13)靶向序列包含
SEQ ID NO:3；(14)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(15)靶向序列包含 SEQ ID NO:3的氨基酸2-27；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸 
5-27；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸8-27；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨
基酸10-27；(19)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-38；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸23-38；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:5；(22)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:6具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸 2-38；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸5-38；(25)靶向序列包含 SEQ ID NO:5的氨基酸8-38；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸 10-38；(27)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸15-
38；(28)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸20-38；(29)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-28；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸13-28；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:7；
(32)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的氨基酸序列；(33)靶向序列包
含SEQ ID NO:7的氨基酸 2-28；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-28；(35)靶向序列包含 SEQ ID NO:7的氨基酸8-28；(36)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 10-28；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸1-24；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸9-24；
(39)靶向序列包含SEQ ID NO:9；(40) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少85％同一
性的氨基酸序列； (41)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸2-24；(42)靶向序列包含SEQ 
ID NO:9的氨基酸5-24；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸8-24； (44)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸1-33；(45)靶向序列包含 SEQ ID NO:11的氨基酸18-33；(46)靶向
序列包含SEQ ID NO:11；(47) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:12具有至少85％同一性的氨
基酸序列； (48)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸2-33；(49)靶向序列包含 SEQ ID 
NO:11的氨基酸5-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33；(51)靶向序列包含
SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸15-33；(53)靶向
序列包含SEQ ID NO:13 的氨基酸1-33；(54)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸18-33；
(55) 靶向序列包含SEQ ID NO:13；(56)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:14具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(57)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸5-33；(59)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；(60)靶向序列包
含SEQ ID NO:13 的氨基酸10-33；(61)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(62) 
靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸1-43；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸28-
43；(64)靶向序列包含SEQ ID NO:15；(65)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:16具有至少85％
同一性的氨基酸序列；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸2-43；(67)靶向序列包含
SEQ ID NO:15 的氨基酸5-43；(68)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-43；(70)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；
(71)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸20-43； (72)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基
酸25-43；(73)靶向序列包含 SEQ ID NO:17的氨基酸1-27；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:
17的氨基酸12-27；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:17；(76)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:
18具有至少85％同一性的氨基酸序列；(77)靶向序列包含 SEQ ID NO:17的氨基酸2-27；
(78)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(79)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸
8-27；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸10-27；(81)靶向序列包含SEQ ID NO: 19
的氨基酸1-33；(82)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸18-33；(83) 靶向序列包含SEQ 
ID NO:19；(84)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:20具有至少85％同一性的氨基酸序列；(85)
靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-33；(86)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-
33；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸8-33；(88)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸10-33；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸15-33； (90)靶向序列包含SEQ ID 
NO:21的氨基酸1-33；(91)靶向序列包含 SEQ ID NO:21的氨基酸18-33；(92)靶向序列包含SEQ ID NO:21；(93) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:22具有至少85％同一性的氨基酸序列； (94)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸2-33；(95)靶向序列包含 SEQ ID NO:21的氨基
酸5-33；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸8-33；(97)靶向序列包含SEQ ID NO:21
的氨基酸10-33；(98)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸15-33；(99)靶向序列包含SEQ 
ID NO: 23的氨基酸1-24；(100)靶向序列SEQ ID NO:23的氨基酸9-24；(101) 靶向序列包
含SEQ ID NO:23；(102)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:24 具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:23 的氨基酸2-24；(104)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸5-24；(105) 靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(106)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸1-24；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸9-24；(108)靶向序列包含SEQ ID NO:25；(109)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:26具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(110)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸2-24；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基
酸5-24； (112)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-24；(113)靶向序列包含 SEQ ID 
NO:27的氨基酸1-30；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸15-30；(115)靶向序列包
含SEQ ID NO:27；(116)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:28具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(117)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸2-30；(118)靶向序列包含SEQ ID NO:27的
氨基酸5-30；(119)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸8-30；(120)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30；(121)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-33；(122)靶向序列包
含SEQ ID NO:29的氨基酸 18-33；(123)靶向序列包含SEQ ID NO:29；(124)外孢壁蛋白包
含与 SEQ ID NO:30具有至少85％同一性的氨基酸序列；(125)靶向序列包含 SEQ ID NO:
29的氨基酸2-33；(126)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(127)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(128)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；(129)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(130)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸 1-24；
(131)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸9-24；(132)靶向序列包含SEQ ID NO:31；(133)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:32具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(134)靶向序列包含
SEQ ID NO:31的氨基酸 2-24；(135)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸5-24；(136)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；(137)靶向序列包含SEQ ID NO:33 的氨基酸1-15；
(138)靶向序列包含SEQ ID NO:33；(139)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:34具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(140)靶向序列包含SEQ ID NO:35的氨基酸1-16；(141)靶向序列包含
SEQ ID NO:35； (142)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:36具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(143)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸1-29；(144)靶向序列包含SEQ ID NO:43的
氨基酸14-29；(145)靶向序列包含SEQ ID NO:43；(146)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:44具有至少85％同一性的氨基酸序列；(147)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-29；(148)
靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸5-29；(149)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-
29；(150)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸10-29；(151) 靶向序列包含SEQ ID NO:45
的氨基酸1-35；(152)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸20-35；(153)靶向序列包含SEQ ID NO:45；(154)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:46具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(155) 靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸2-35；(156)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨
基酸5-35；(157)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35； (158)靶向序列包含SEQ ID 
NO:45的氨基酸10-35；(159)靶向序列包含 SEQ ID NO:45的氨基酸15-35；(160)靶向序列
包含SEQ ID NO:47的氨基酸1-43；(161)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸28-43；(162) 靶向序列包含SEQ ID NO:47；(163)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:48 具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(164)靶向序列包含SEQ ID NO:47 的氨基酸2-43；(165)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(166) 靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(167)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸10-43；(168)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 15-43；
(169)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸20-43；(170)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨
基酸25-43；(171)靶向序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸1-32；(172)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸17-32； (173)靶向序列包含SEQ ID NO:49；(174)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:50具有至少85％同一性的氨基酸序列；(175)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸2-
32；(176)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32； (177)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(178)靶向序列包含 SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(179)靶向序列包含SEQ 
ID NO:49的氨基酸15-32；(180)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸1-33；(181) 靶向序
列包含SEQ ID NO:51的氨基酸18-33；(182)靶向序列包含SEQ ID NO:51；(183)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:52具有至少85％同一性的氨基酸序列；(184)靶向序列包含SEQ ID NO:
51的氨基酸2-33；(185) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(186)靶向序列包含
SEQ ID NO:51的氨基酸8-33；(187)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸 10-33；(188)靶
向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸15-33；(189)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸1-
33；(190)靶向序列包含SEQ ID NO: 53的氨基酸18-33；(191)靶向序列包含SEQ ID NO:53；
(192)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:54具有至少85％同一性的氨基酸序列；(193)靶向序列
包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33；(194)靶向序列包含SEQ ID NO: 53的氨基酸5-33；(195)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-33； (196)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸
10-33；(197)靶向序列包含 SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；(198)靶向序列包含SEQ ID NO:
55的氨基酸1-30；(199)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸15-30；(200) 靶向序列包含
SEQ ID NO:55；(201)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:56 具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(202)靶向序列包含SEQ ID NO:55 的氨基酸2-30；(203)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；(204) 靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；(205)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸10-30；(206)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 1-130；(207)靶向序列
包含SEQ ID NO:57的氨基酸115-130；(208)靶向序列包含SEQ ID NO:57；(209)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少85％同一性的氨基酸序列；(210)靶向序列包含SEQ ID NO:
57的氨基酸2-130；(211)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130；(212) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-130；(213)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸20-130；(214)
靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸30-130；(215)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸
40-130；(216) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(217)靶向序列包含SEQ ID 
NO:57的氨基酸60-130；(218)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130；(219)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130；(220) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；
(221)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸100-130；(222)靶向序列包含SEQ ID NO:57的
氨基酸110-130；(223)外孢壁蛋白片段包含与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸
序列；(224)靶向序列包含SEQ ID NO:96；(225)靶向序列包含SEQ ID NO:97；(226)靶向序列包含SEQ ID NO:98；(227)靶向序列包含SEQ ID NO:99；(228)靶向序列包含SEQ ID NO:
100；(229) 靶向序列包含SEQ ID NO:101；(230)靶向序列包含SEQ ID NO:102； (231)靶向序列包含SEQ ID NO:103；(232)靶向序列包含SEQ ID NO: 104；(233)靶向序列包含SEQ ID NO:105；(234)靶向序列包含SEQ ID NO:106；(235)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:108具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(236)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:109具有至少85％同一
性的氨基酸序列；(237)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:110具有至少 85％同一性的氨基酸
序列；(238)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:111具有至少85％同一性的氨基酸序列；(239)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:112 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(240)外孢壁蛋白包
含与SEQ ID NO: 113具有至少85％同一性的氨基酸序列；(241)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:114具有至少85％同一性的氨基酸序列；(242)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:115具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(243)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:116具有至少85％同一
性的氨基酸序列；(244)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:117具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(245) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:118具有至少85％同一性的氨基酸序列； (246)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:119具有至少85％同一性的氨基酸序列；(247)外孢壁蛋白包含
与SEQ ID NO:120具有至少85％同一性的氨基酸序列；(248)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
121具有至少85％同一性的氨基酸序列；(249)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-31； (250)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-33；(251)靶向序列包含 SEQ ID NO:1的氨基
酸20-31；(252)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸14-23；(253)靶向序列包含SEQ ID NO:
3的氨基酸14-25；或(254) 靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-23。

[0190] 例如，当目标蛋白或肽包含催化一氧化氮产生或核酸结合蛋白或肽的酶时，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可以是:(1)靶向序列包含 SEQ ID NO:1的氨基酸2-
35；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸 5-35；(3)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸
8-35；(4)靶向序列包含 SEQ ID NO:1的氨基酸10-35；(5)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨
基酸 15-35；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸2-27；(7)靶向序列包含 SEQ ID NO:3的氨基酸5-27；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸 8-27；(9)靶向序列包含SEQ ID 
NO:3的氨基酸10-27；(10)靶向序列包含 SEQ ID NO:5的氨基酸2-38；(11)靶向序列包含
SEQ ID NO:5的氨基酸 5-38；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸8-38；(13)靶向序列包含 SEQ ID NO:5的氨基酸10-38；(14)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸 15-38；(15)
靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸20-38；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸2-28；
(17)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-28；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸8-
28；(19)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸10-28；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:9 的氨
基酸2-24；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；(22)靶向序列包含SEQ ID NO:9
的氨基酸8-24；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸2-33；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-33； (25)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33；(26)靶向序列包含 SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(27)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸15-33；(28)靶向
序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；(29)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸5-33；
(30)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸
10-33； (32)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(33)靶向序列包含 SEQ ID NO:
15的氨基酸2-43；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸5-43；(35)靶向序列包含SEQ 
ID NO:15的氨基酸8-43；(36)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-43；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:15 的氨基酸15-43；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸20-43；(39) 
靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(40)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸2-
27；(41)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27； (42)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸8-27；(43)靶向序列包含 SEQ ID NO:17的氨基酸10-27；(44)靶向序列包含SEQ ID 
NO:19的氨基酸2-33；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-33；(46)靶向序列包含
SEQ ID NO:19的氨基酸8-33；(47)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸10-33；(48)靶向
序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸15-33； (49)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸2-33；
(50)靶向序列包含 SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(51)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基
酸8-33；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸10-33；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸15-33；(54)靶向序列包含SEQ ID NO: 23的氨基酸2-24；(55)靶向序列包含SEQ 
ID NO:23的氨基酸5-24；(56) 靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(57)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸2-24；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸5-24； (59)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-24；(60)靶向序列包含 SEQ ID NO:27的氨基酸2-30；
(61)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(62)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸
8-30；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30；(64)靶向序列包含SEQ ID NO: 29
的氨基酸2-33；(65)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(66) 靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(67)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；(68)靶向序列包含
SEQ ID NO:29的氨基酸 15-33；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸2-24；(70)靶向
序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸5-24；(71)靶向序列包含SEQ ID NO:31 的氨基酸8-24；
(72)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-29；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸
5-29；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:43的
氨基酸10-29； (76)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸2-35；(77)靶向序列包含 SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35；(79)靶向序列包含
SEQ ID NO:45的氨基酸10-35；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸15-35；(81)靶向
序列包含SEQ ID NO: 47的氨基酸2-43；(82)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；
(83) 靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(84)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基
酸10-43；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 15-43；(86)靶向序列包含SEQ ID NO:
47的氨基酸20-43；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(88)靶向序列包含SEQ ID NO:49 的氨基酸2-32；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(91)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(92)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸 15-32；(93)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸2-33；
(94)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(95)靶向序列包含SEQ ID NO:51 的氨基
酸8-33；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸10-33；(97) 靶向序列包含SEQ ID NO:
51的氨基酸15-33；(98)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33；(99)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸5-33； (100)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-33；(101)靶向序列包含 SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(102)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；
(103)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸2-30；(104) 靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨
基酸5-30；(105)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；(106)靶向序列包含SEQ ID 
NO:55的氨基酸 10-30；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸2-130；(108)靶向序列
包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130；(109)靶向序列包含SEQ ID NO: 57的氨基酸10-130；
(110)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 20-130；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:57的
氨基酸30-130；(112)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130；(113)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸60-130；(115)靶向
序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130；(116) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-
130；(117)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；(118)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸100-130；或(119)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-130。

[0191] 提供融合蛋白，包含抗原或修复酶和靶向序列或外孢壁蛋白。靶向序列或外孢壁蛋白可以包含用于和任何目标蛋白或肽一起使用的上面段落 [00166]-[00168]中列出的
任何靶向序列或外孢壁蛋白，或：(1)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-35；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸5-35；(3)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸8-35；(4)靶向
序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸10-35；(5)靶向序列包含SEQ ID NO:1 的氨基酸15-35；(6)靶向序列包含氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸22-31； (7)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基
酸22-33；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-31；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:3的
氨基酸2-27； (10)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸5-27；(11)靶向序列包含SEQ ID 
NO:3的氨基酸8-27；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸10-27； (13)靶向序列包含
SEQ ID NO:3的氨基酸14-23；(14)靶向序列包含 SEQ ID NO:3的氨基酸14-25；(15)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-23；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸2-38；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸5-38；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸8-38；
(19)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸10-38；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸
15-38；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:5 的氨基酸20-38；(22)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸2-28；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-28；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:
7的氨基酸8-28；(25)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸10-28； (26)靶向序列包含SEQ 
ID NO:9的氨基酸1-24；(27)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸9-24；(28)靶向序列包含
SEQ ID NO:9；(29)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(30)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸2-24；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:9 的氨基酸
5-24；(32)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸8-24；(33)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸1-33；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸18-33；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:
11；(36)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:12具有至少85％同一性的氨基酸序列；(37)靶向序
列包含SEQ ID NO:11的氨基酸2-33；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(39)
靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33； (40)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸10-
33；(41)靶向序列包含 SEQ ID NO:11的氨基酸15-33；(42)靶向序列包含SEQ ID NO:13的
氨基酸1-33；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸18-33；(44)靶向序列包含SEQ ID 
NO:13；(45)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:14具有至少85％同一性的氨基酸序列；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸 2-33；(47)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸5-33；
(48)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸
10-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(51)靶向序列包含SEQ ID NO:15
的氨基酸1-43；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸28-43；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:15；(54)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:16具有至少85％同一性的氨基酸序列；(55)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸2-43；(56)靶向序列包含SEQ ID NO:15 的氨基酸5-43；
(57)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸
10-43；(59)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；(60)靶向序列包含SEQ ID NO:15
的氨基酸20-43； (61)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(62)靶向序列包含 SEQ ID NO:17的氨基酸1-27；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸12-27；(64)靶向序列包含SEQ ID NO:17；(65)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:18具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(66)靶向序列包含 SEQ ID NO:17的氨基酸2-27；(67)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(68)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸8-27；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:
17的氨基酸10-27；(70)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸1-33；(71)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸18-33；(72) 靶向序列包含SEQ ID NO:19；(73)外孢壁蛋白包含与SEQ 
ID NO:20具有至少85％同一性的氨基酸序列；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-
33；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-33；(76)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨
基酸8-33；(77)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸10-33；(78)靶向序列包含SEQ ID 
NO:19的氨基酸15-33； (79)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸1-33；(80)靶向序列包含 SEQ ID NO:21的氨基酸18-33；(81)靶向序列包含SEQ ID NO:21；(82) 外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO:22具有至少85％同一性的氨基酸序列； (83)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨
基酸2-33；(84)靶向序列包含 SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:
21的氨基酸8-33；(86)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸10-33；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸15-33；(88)靶向序列包含SEQ ID NO: 23的氨基酸1-24；(89)靶向序列
SEQ ID NO:23的氨基酸9-24；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:23；(91)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:24具有至少85％同一性的氨基酸序列；(92)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸2-
24；(93)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸5-24；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨
基酸8-24；(95)靶向序列包含SEQ ID NO:25 的氨基酸1-24；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:
25的氨基酸9-24；(97)靶向序列包含SEQ ID NO:25；(98)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:26
具有至少85％同一性的氨基酸序列；(99)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸2-24；(100)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸5-24；(101)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-
24；(102)靶向序列包含SEQ ID NO: 27的氨基酸1-30；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸15-30； (104)靶向序列包含SEQ ID NO:27；(105)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:28
具有至少85％同一性的氨基酸序列；(106)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸2-30；
(107)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30； (108)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨
基酸8-30；(109)靶向序列包含 SEQ ID NO:27的氨基酸10-30；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-33；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸18-33；(112) 靶向序列包含SEQ ID NO:29；(113)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:30 具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:29 的氨基酸2-33；(115)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(116) 靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(117)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；(118)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸 15-33；(119)靶向序列
包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-24；(120)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸9-24；(121)
靶向序列包含SEQ ID NO:31；(122)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:32具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(123)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸2-24；(124)靶向序列包含SEQ 
ID NO:31的氨基酸5-24；(125)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；(126)靶向序列
包含SEQ ID NO:33的氨基酸1-15； (127)靶向序列包含SEQ ID NO:33；(128)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:34具有至少85％同一性的氨基酸序列；(129)靶向序列包含SEQ ID NO:35
的氨基酸1-16；(130)靶向序列包含SEQ ID NO:35；(131)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:36
具有至少85％同一性的氨基酸序列；(132)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸1-29；
(133)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸14-29；(134)靶向序列包含SEQ ID NO:43；
(135)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:44具有至少85％同一性的氨基酸序列；(136) 靶向序
列包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-29；(137)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸5-29；
(138)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29； (139)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨
基酸10-29；(140)靶向序列包含 SEQ ID NO:45的氨基酸1-35；(141)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸20-35；(142)靶向序列包含SEQ ID NO:45；(143)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:46具有至少85％同一性的氨基酸序列；(144)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸2-
35；(145)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(146)靶向序列包含SEQ ID NO:45的
氨基酸8-35；(147)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸10-35；(148)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸15-35；(149)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸1-43；(150)靶向序列包
含SEQ ID NO:47的氨基酸28-43；(151)靶向序列包含SEQ ID NO:47；(152)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:48具有至少85％同一性的氨基酸序列；(153)靶向序列包含SEQ ID NO:47的
氨基酸2-43；(154)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(155)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(156)靶向序列包含SEQ ID NO: 47的氨基酸10-43；(157)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸15-43； (158)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸20-43；(159)靶向序列包含 SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(160)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸
1-32；(161)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸17-32；(162) 靶向序列包含SEQ ID NO:
49；(163)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:50 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(164)靶向序列包含SEQ ID NO:49 的氨基酸2-32；(165)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32；
(166) 靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(167)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨
基酸10-32；(168)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸 15-32；(169)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸1-33；(170)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸18-33；(171)靶向序列包
含SEQ ID NO: 51；(172)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:52具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(173)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸2-33；(174)靶向序列包含SEQ ID NO:51的
氨基酸5-33；(175)靶向序列包含SEQ ID NO: 51的氨基酸8-33；(176)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸10-33； (177)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸15-33；(178)靶向序列
包含 SEQ ID NO:53的氨基酸1-33；(179)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸18-33；
(180)靶向序列包含SEQ ID NO:53；(181)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:54具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(182)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33；(183)靶向序列包含
SEQ ID NO:53的氨基酸5-33；(184)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-33；(185)靶向
序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(186)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；
(187)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸1-30；(188)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基
酸15-30；(189)靶向序列包含SEQ ID NO:55；(190)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:56具有至少85％同一性的氨基酸序列；(191)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸2-30；(192)靶向
序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；(193)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；
(194)靶向序列包含SEQ ID NO: 55的氨基酸10-30；(195)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨
基酸1-130； (196)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸115-130；(197)靶向序列包含SEQ ID NO:57；(198)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少 85％同一性的氨基酸序列；
(199)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 2-130；(200)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨
基酸5-130；(201)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-130；(202)靶向序列包含SEQ ID NO: 57的氨基酸20-130；(203)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 30-130；(204)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130；(205)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；
(206)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸60-130；(207)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨
基酸70-130；(208)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130；(209) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；(210)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸100-130；(211)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-130；(212)靶向序列包含SEQ ID NO:97；(213)靶向序列包含 SEQ ID NO:98；(214)靶向序列包含SEQ ID NO:99；(215)靶向序列包含SEQ ID NO:
100；(216)靶向序列包含SEQ ID NO:101；(217)靶向序列包含SEQ ID NO:102；(218)靶向序列包含SEQ ID NO:103；(219)靶向序列包含SEQ ID NO:104；(220)靶向序列包含SEQ ID 
NO:105；(221) 靶向序列包含SEQ ID NO:106；(222)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 108具
有至少85％同一性的氨基酸序列；(223)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:109具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(224)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:110具有至少85％同一性的氨基
酸序列；(225)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:111具有至少85％同一性的氨基酸序列；(226)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:112具有至少85％同一性的氨基酸序列；(227) 外孢壁蛋白
包含与SEQ ID NO:113具有至少85％同一性的氨基酸序列； (228)外孢壁蛋白包含与SEQ 
ID NO:114具有至少85％同一性的氨基酸序列；(229)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:115具
有至少85％同一性的氨基酸序列；(230)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:116具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(231)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:117具有至少 85％同一性的氨基
酸序列；(232)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:118具有至少85％同一性的氨基酸序列；(233)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:119 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(234)外孢壁蛋白
包含与SEQ ID NO: 120具有至少85％同一性的氨基酸序列；或(235)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:121具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0192] 提供融合蛋白，包含适于在水力压裂流体中破裂乳液或胶体的酶、或抗菌性蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含用于和任何目标蛋白或肽一起使用的上面段落[00166]-[00168]中列出的任何靶向
序列或外孢壁蛋白，或：(1) 靶向序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％
同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约54％；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35；(3)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35；(4)靶向序列包含SEQ 
ID NO:1；(5)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的氨基酸序列；(6)靶向
序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-35；(7)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸5-35；(8) 靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸8-35；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸10-35；
(10)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸15-35； (11)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸
1-27；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-27；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:3；
(14)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的氨基酸序列；(15)靶向序列包
含SEQ ID NO:3的氨基酸2-27；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸5-27；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸8-27；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸10-27；(19)靶向序列包含SEQ ID NO: 5的氨基酸1-38；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸23-38；
(21) 靶向序列包含SEQ ID NO:5；(22)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:6具有至少85％同一
性的氨基酸序列；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸2-38；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸5-38；(25)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸8-38；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸10-38；(27)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸15-38；(28)靶向序列包
含SEQ ID NO:5的氨基酸20-38；(29)靶向序列包含SEQ ID NO: 7的氨基酸1-28；(30)靶向
序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸13-28；(31) 靶向序列包含SEQ ID NO:7；(32)外孢壁蛋白
包含与SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的氨基酸序列；(33)靶向序列包含SEQ ID NO:7的
氨基酸2-28；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-28；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:
7的氨基酸8-28；(36)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸10-28；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸1-24；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸9-24；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:9； (40)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少85％同一性的氨基酸序列；(41)
靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸2-24；(42)靶向序列包含 SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；
(43)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸 8-24；(44)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸
1-33；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸18-33；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:11； (47)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:12具有至少85％同一性的氨基酸序列；(48)靶向序列包
含SEQ ID NO:11的氨基酸2-33；(49)靶向序列包含 SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33；(51)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；
(52)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸15-33；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:13 的氨基
酸1-33；(54)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸18-33；(55) 靶向序列包含SEQ ID NO:
13；(56)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:14具有至少85％同一性的氨基酸序列；(57)靶向序
列包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸5-33；(59)
靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；(60)靶向序列包含SEQ ID NO:13 的氨基酸10-
33；(61)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(62) 靶向序列包含SEQ ID NO:15的
氨基酸1-43；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸28-43；(64)靶向序列包含SEQ ID 
NO:15；(65)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:16具有至少85％同一性的氨基酸序列；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸2-43；(67)靶向序列包含SEQ ID NO:15 的氨基酸5-43；
(68)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸
10-43；(70)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；(71)靶向序列包含SEQ ID NO:15
的氨基酸20-43； (72)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(73)靶向序列包含 SEQ ID NO:17的氨基酸1-27；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸12-27；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:17；(76)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:18具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(77)靶向序列包含 SEQ ID NO:17的氨基酸2-27；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(79)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸8-27；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:
17的氨基酸10-27；(81)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸1-33；(82)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸18-33；(83) 靶向序列包含SEQ ID NO:19；(84)外孢壁蛋白包含与SEQ 
ID NO:20具有至少85％同一性的氨基酸序列；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-
33；(86)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-33；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨
基酸8-33；(88)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸10-33；(89)靶向序列包含SEQ ID 
NO:19的氨基酸15-33； (90)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸1-33；(91)靶向序列包含 SEQ ID NO:21的氨基酸18-33；(92)靶向序列包含SEQ ID NO:21；(93) 外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO:22具有至少85％同一性的氨基酸序列； (94)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨
基酸2-33；(95)靶向序列包含 SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:
21的氨基酸8-33；(97)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸10-33；(98)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸15-33；(99)靶向序列包含SEQ ID NO: 23的氨基酸1-24；(100)靶向序列SEQ ID NO:23的氨基酸9-24；(101) 靶向序列包含SEQ ID NO:23；(102)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:24 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:23 的
氨基酸2-24；(104)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸5-24；(105) 靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(106)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸1-24；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸9-24； (108)靶向序列包含SEQ ID NO:25；(109)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:26具有至少85％同一性的氨基酸序列；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨
基酸2-24；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸5-24； (112)靶向序列包含SEQ ID 
NO:25的氨基酸8-24；(113)靶向序列包含 SEQ ID NO:27的氨基酸1-30；(114)靶向序列包
含SEQ ID NO:27的氨基酸15-30；(115)靶向序列包含SEQ ID NO:27；(116)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:28具有至少85％同一性的氨基酸序列；(117)靶向序列包含SEQ ID NO:27的
氨基酸2-30；(118)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(119)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸8-30；(120)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30；(121)靶向序列包
含SEQ ID NO:29的氨基酸1-33；(122)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸 18-33；(123)
靶向序列包含SEQ ID NO:29；(124)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:30具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(125)靶向序列包含 SEQ ID NO:29的氨基酸2-33；(126)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(127)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(128)靶向序列
包含SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；(129)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；
(130)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸 1-24；(131)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨
基酸9-24；(132)靶向序列包含SEQ ID NO:31；(133)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:32具有
至少 85％同一性的氨基酸序列；(134)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸2-24；(135)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸5-24；(136)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；
(137)靶向序列包含SEQ ID NO:33 的氨基酸1-15；(138)靶向序列包含SEQ ID NO:33；
(139)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:34具有至少85％同一性的氨基酸序列；(140)靶向序列
包含SEQ ID NO:35的氨基酸1-16；(141)靶向序列包含SEQ ID NO:35； (142)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:36具有至少85％同一性的氨基酸序列；(143)靶向序列包含SEQ ID NO:43
的氨基酸1-29；(144)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸14-29；(145)靶向序列包含SEQ ID NO:43； (146)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:44具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(147)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-29；(148)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基
酸5-29；(149)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(150)靶向序列包含SEQ ID NO:
43的氨基酸10-29；(151) 靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸1-35；(152)靶向序列包含
SEQ ID NO:45的氨基酸20-35；(153)靶向序列包含SEQ ID NO:45；(154)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:46具有至少85％同一性的氨基酸序列；(155) 靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨
基酸2-35；(156)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(157)靶向序列包含SEQ ID 
NO:45的氨基酸8-35； (158)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸10-35；(159)靶向序列包含 SEQ ID NO:45的氨基酸15-35；(160)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸1-43；(161)
靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸28-43；(162)靶向序列包含SEQ ID NO:47；(163)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:48具有至少85％同一性的氨基酸序列；(164)靶向序列包含SEQ 
ID NO:47的氨基酸2-43；(165)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(166)靶向序列
包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(167)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸10-43；(168)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 15-43；(169)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸
20-43；(170)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(171)靶向序列包含SEQ ID NO: 
49的氨基酸1-32；(172)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸17-32；(173)靶向序列包含
SEQ ID NO:49；(174)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 50具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(175)靶向序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸2-32；(176)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32； (177)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(178)靶向序列包含 SEQ 
ID NO:49的氨基酸10-32；(179)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸15-32；(180)靶向序
列包含SEQ ID NO:51的氨基酸1-33；(181) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸18-33；
(182)靶向序列包含SEQ ID NO:51；(183)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:52具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(184)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸2-33；(185) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(186)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸8-33；(187)靶向
序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸 10-33；(188)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸15-
33；(189)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸1-33；(190)靶向序列包含SEQ ID NO: 53的氨基酸18-33；(191)靶向序列包含SEQ ID NO:53；(192)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:54具有至少85％同一性的氨基酸序列；(193)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33；(194)
靶向序列包含SEQ ID NO: 53的氨基酸5-33；(195)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-
33； (196)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(197)靶向序列包含 SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；(198)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸1-30；(199)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸15-30；(200) 靶向序列包含SEQ ID NO:55；(201)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:56 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(202)靶向序列包含SEQ ID NO:55 的氨基
酸2-30；(203)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；(204) 靶向序列包含SEQ ID NO:
55的氨基酸8-30；(205)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸10-30；(206)靶向序列包含
SEQ ID NO:57的氨基酸 1-130；(207)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸115-130；(208)靶向序列包含SEQ ID NO:57；(209)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(210)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸2-130；(211)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130；(212) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-130；(213)靶向
序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸20-130；(214)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸30-
130；(215)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130；(216) 靶向序列包含SEQ ID NO:
57的氨基酸50-130；(217)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸60-130；(218)靶向序列包
含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130；(219)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130；
(220) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；(221)靶向序列包含SEQ ID NO:57的
氨基酸100-130；(222)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-130；(223)外孢壁蛋白片
段包含与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列；(224)靶向序列包含SEQ ID 
NO:96；(225)靶向序列包含SEQ ID NO:97；(226)靶向序列包含SEQ ID NO:98；(227)靶向序列包含SEQ ID NO:99；(228)靶向序列包含SEQ ID NO:100；(229) 靶向序列包含SEQ ID 
NO:101；(230)靶向序列包含SEQ ID NO:102； (231)靶向序列包含SEQ ID NO:103；(232)靶向序列包含SEQ ID NO: 104；(233)靶向序列包含SEQ ID NO:105；(234)靶向序列包含SEQ ID NO:106；(235)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:108具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(236)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:109具有至少85％同一性的氨基酸序列；(237)外孢壁
蛋白包含与SEQ ID NO:110具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(238)外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO:111具有至少85％同一性的氨基酸序列；(239)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
112 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(240)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 113具有至
少85％同一性的氨基酸序列；(241)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:114具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(242)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:115具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(243)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:116具有至少85％同一性的氨基酸序列；(244)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:117具有至少85％同一性的氨基酸序列；(245) 外孢壁蛋白包含
与SEQ ID NO:118具有至少85％同一性的氨基酸序列；(246)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
119具有至少85％同一性的氨基酸序列；(247)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:120具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(248)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:121具有至少85％同一性的
氨基酸序列；(249)靶向序列包含氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸 22-31；(250)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-33；(251)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-31；(252)靶向
序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸14-23；(253)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸14-25；
或 (254)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-23。

[0193] 当目标蛋白或肽包含抗原、修复酶、适于在水力压裂流体中破裂乳液或胶体的酶或抗菌性蛋白或肽时，优选靶向序列或外孢壁蛋白包含用于和任何目标蛋白或肽一起使用
的上面段落[00167]中列出的任何靶向序列或外孢壁蛋白，或(1)靶向序列包含SEQ ID NO:
1的氨基酸2-35；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸5-35；(3)靶向序列包含SEQ ID 
NO:1 的氨基酸8-35；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸10-35；(5)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸15-35；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸2-27；(7)靶向序列包含
SEQ ID NO:3的氨基酸5-27；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸8-27；(9)靶向序列包
含SEQ ID NO:3 的氨基酸10-27；(10)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸2-38；(11)靶向
序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸5-38；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸8-38；(13)
靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸10-38； (14)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸15-
38；(15)靶向序列包含 SEQ ID NO:5的氨基酸20-38；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨
基酸 2-28；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-28；(18)靶向序列包含 SEQ ID NO:
7的氨基酸8-28；(19)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 10-28；(20)靶向序列包含SEQ 
ID NO:9的氨基酸2-24；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；(22)靶向序列包含
SEQ ID NO:9的氨基酸8-24；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸2-33；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(25)靶向序列包含SEQ ID NO:11 的氨基酸8-33；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(27) 靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸15-
33；(28)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；(29)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨
基酸5-33； (30)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；(31)靶向序列包含 SEQ ID 
NO:13的氨基酸10-33；(32)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(33)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸2-43；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸5-43；(35)靶向序
列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43；(36)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-43； 
(37)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；(38)靶向序列包含 SEQ ID NO:15的氨基
酸20-43；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(40)靶向序列包含SEQ ID NO:
17的氨基酸2-27；(41)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(42)靶向序列包含SEQ 
ID NO: 17的氨基酸8-27；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸10-27；(44) 靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-33；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-33；(46)靶
向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸8-33； (47)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸10-
33；(48)靶向序列包含 SEQ ID NO:19的氨基酸15-33；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:21的
氨基酸2-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(51)靶向序列包含SEQ ID 
NO:21的氨基酸8-33；(52)靶向序列包含SEQ ID NO: 21的氨基酸10-33；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸15-33； (54)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸2-24；(55)靶向
序列包含 SEQ ID NO:23的氨基酸5-24；(56)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；
(57)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸2-24；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸
5-24；(59)靶向序列包含SEQ ID NO: 25的氨基酸8-24；(60)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸2-30；(61) 靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(62)靶向序列包含SEQ ID 
NO:27的氨基酸8-30；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30； (64)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸2-33；(65)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(66)靶向序
列包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(67)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；(68)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(69)靶向序列包含SEQ ID NO: 31的氨基酸2-
24；(70)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸5-24；(71) 靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；(72)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-29；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:
43的氨基酸5-29； (74)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(75)靶向序列包含 SEQ ID NO:43的氨基酸10-29；(76)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸2-35；(77)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35；(79)靶向
序列包含SEQ ID NO: 45的氨基酸10-35；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸15-35； (81)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸2-43；(82)靶向序列包含 SEQ ID NO:47的氨基
酸5-43；(83)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(84)靶向序列包含SEQ ID NO:47
的氨基酸10-43；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸15-43；(86)靶向序列包含SEQ 
ID NO: 47的氨基酸20-43；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸25-43； (88)靶向序
列包含SEQ ID NO:49的氨基酸2-32；(89)靶向序列包含 SEQ ID NO:49的氨基酸5-32；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(91)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸10-
32；(92)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸15-32；(93)靶向序列包含SEQ ID NO: 51的
氨基酸2-33；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(95) 靶向序列包含SEQ ID 
NO:51的氨基酸8-33；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸10-33；(97)靶向序列包含
SEQ ID NO:51的氨基酸 15-33；(98)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33；(99)靶向
序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸5-33；(100)靶向序列包含SEQ ID NO:53 的氨基酸8-33；
(101)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(102) 靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨
基酸15-33；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸2-30；(104)靶向序列包含SEQ ID 
NO:55的氨基酸5-30；(105)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；(106)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸10-30；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:57 的氨基酸2-130；(108)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130； (109)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-
130；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸20-130；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:57 的氨基酸30-130；(112)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130； (113)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸60-130；(115)
靶向序列包含SEQ ID NO:57 的氨基酸70-130；(116)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸
80-130； (117)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；(118)靶向序列包含SEQ ID 
NO:57的氨基酸100-130；(119)靶向序列包含SEQ ID NO: 57的氨基酸110-130。

[0194] 当目标蛋白或肽包含抗原、修复酶、适于在水力压裂流体中破裂乳液或胶体的酶或抗菌性蛋白或肽时，更优选靶向序列或外孢壁蛋白包含用于和任何目标蛋白或肽一起使
用的上面段落[00167]中列出的任何靶向序列或外孢壁蛋白，或：(1)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸2-24；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；(3)靶向序列包含SEQ ID NO: 9的氨基酸8-24；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸2-33；(5)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33；(7)靶向序列包含
SEQ ID NO:11的氨基酸10-33； (8)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸15-33；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；(10)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸 5-33；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸10-
33；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(14)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸2-43；(15)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸5-43；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:
15的氨基酸8-43；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-43； (18)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；(19)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸20-43；(20)靶向序列
包含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸2-27；(22)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(23)靶向序列包含SEQ ID NO: 17的氨基酸8-27；
(24)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸10-27；(25) 靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基
酸2-33；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-33；(27)靶向序列包含SEQ ID NO:19
的氨基酸8-33； (28)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸10-33；(29)靶向序列包含 SEQ ID NO:19的氨基酸15-33；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸2-33；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(32)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸8-33；(33)靶向
序列包含SEQ ID NO: 21的氨基酸10-33；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸15-33； (35)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸2-24；(36)靶向序列包含 SEQ ID NO:23的氨基
酸5-24；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:25
的氨基酸2-24；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸5-24；(40)靶向序列包含SEQ ID NO: 25的氨基酸8-24；(41)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸2-30；(42) 靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸8-30；(44)靶向序
列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30； (45)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸2-33；
(46)靶向序列包含 SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(47)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基
酸8-33；(48)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO: 31的氨基酸2-24；(51)靶向序列包含SEQ 
ID NO:31的氨基酸5-24；(52) 靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-29；(54)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸5-29； (55)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(56)靶向序列包含 SEQ ID NO:43的氨基酸10-29；
(57)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸2-35；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸
5-35；(59)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35；(60)靶向序列包含SEQ ID NO: 45的氨基酸10-35；(61)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸15-35； (62)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸2-43；(63)靶向序列包含 SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(64)靶向序列包含
SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(65)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸10-43；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸15-43；(67)靶向序列包含SEQ ID NO: 47的氨基酸20-43；
(68)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸25-43； (69)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基
酸2-32；(70)靶向序列包含 SEQ ID NO:49的氨基酸5-32；(71)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(72)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸15-32；(74)靶向序列包含SEQ ID NO: 51的氨基酸2-33；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(76) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸8-33；(77)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸10-33；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸 15-33；
(79)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸
5-33；(81)靶向序列包含SEQ ID NO:53 的氨基酸8-33；(82)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(83) 靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；(84)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸2-30；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30； (86)靶向序列包含
SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；(87)靶向序列包含 SEQ ID NO:55的氨基酸10-30；(88)靶向
序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸2-130；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130；
(90)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-130；(91)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基
酸20-130；(92)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 30-130；(93)靶向序列包含SEQ ID 
NO:57的氨基酸40-130；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(95)靶向序列包含SEQ ID NO: 57的氨基酸60-130；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130； 
(97)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130；(98)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基
酸90-130；(99)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸100-130；(100)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-130。

[0195] 当目标蛋白或肽包含抗原、修复酶、适于在水力压裂流体中破裂乳液或胶体的酶或抗菌性蛋白或肽时，甚至更优选靶向序列或外孢壁蛋白包含：(1)靶向序列包含SEQ ID 
NO:9的氨基酸5-24；(2)靶向序列包含 SEQ ID NO:9的氨基酸8-24；(3)靶向序列包含SEQ 
ID NO:11的氨基酸 5-33；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33；(5)靶向序列包含 SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸15-33；(7)靶向序
列包含SEQ ID NO:13的氨基酸5-33；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；(9)靶
向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸10-33；(10)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-
33；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸5-43；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨
基酸8-43；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-43； (14)靶向序列包含SEQ ID 
NO:15的氨基酸15-43；(15)靶向序列包含 SEQ ID NO:15的氨基酸20-43；(16)靶向序列包
含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸8-27；(19)靶向序列包含SEQ ID NO: 17的氨基酸10-27；
(20)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-33；(21) 靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基
酸8-33；(22)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸10-33；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸 15-33；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(25)靶向序列包含SEQ 
ID NO:21的氨基酸8-33；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:21 的氨基酸10-33；(27)靶向序列
包含SEQ ID NO:21的氨基酸15-33；(28) 靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸5-24；(29)
靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸5-
24； (31)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-24；(32)靶向序列包含 SEQ ID NO:27的
氨基酸5-30；(33)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸8-30；(34)靶向序列包含SEQ ID 
NO:27的氨基酸10-30；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(36)靶向序列包含
SEQ ID NO: 29的氨基酸8-33；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；(38) 靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸5-24；
(40)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24； (41)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基
酸5-29；(42)靶向序列包含 SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸10-29；(44)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35；(46)靶向序列包含SEQ ID NO: 45的氨基酸10-35；(47)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸15-35； (48)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(49)靶向
序列包含 SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸10-43；
(51)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸15-43；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基
酸20-43；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(54)靶向序列包含SEQ ID NO:
49的氨基酸5-32； (55)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(56)靶向序列包含 SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(57)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸15-32；(58)靶向序列
包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(59)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸8-33；(60)靶
向序列包含SEQ ID NO: 51的氨基酸10-33；(61)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸15-
33； (62)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸5-33；(63)靶向序列包含 SEQ ID NO:53的
氨基酸8-33；(64)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(65)靶向序列包含SEQ ID 
NO:53的氨基酸15-33；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；(67)靶向序列包含
SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；(68)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸10-30； (69)靶向
序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130；(70)靶向序列包含 SEQ ID NO:57的氨基酸10-
130；(71)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸20-130；(72)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸30-130；(73) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 60-130；(76)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130；(77)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130；
(78)靶向序列包含SEQ ID NO: 57的氨基酸90-130；(79)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨
基酸 100-130；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-130；(81)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸4-30；(82)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸6-30；(83)靶向序列包
含SEQ ID NO:61的氨基酸5-33； (84)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸10-33；(85)靶
向序列包含 SEQ ID NO:61的氨基酸15-33；(86)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸5-
35；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸8-35；(88)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨
基酸10-35；(89)靶向序列包含SEQ ID NO: 63的氨基酸15-35；(90)靶向序列包含SEQ ID 
NO:65的氨基酸5-24；(91) 靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸5-27；(92)靶向序列包含
SEQ ID NO:67的氨基酸10-27；(93)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸5-38； (94)靶向
序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸10-38；(95)靶向序列包含 SEQ ID NO:69的氨基酸15-38；
(96)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸5-42；(97)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸
10-42；(98)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸15-42；(99)靶向序列包含SEQ ID NO: 75的氨基酸20-42；(100)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸25-42； (101)靶向序列包含
SEQ ID NO:7的氨基酸5-24；(102)靶向序列包含 SEQ ID NO:81的氨基酸5-38；(103)靶向
序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸10-38；(104)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸15-38；
(105) 靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸20-38；(106)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨
基酸5-28；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸 10-28；(108)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸5-28；(109)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸10-28；(110)靶向序列包
含SEQ ID NO: 91的氨基酸10-93；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸20-93； 
(112)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸30-93；(113)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨
基酸40-93；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸50-93；(115)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸60-93；(116) 靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸10-130；(117)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸20-130；或(118)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸30-130。

[0196] 上述融合蛋白的目标蛋白或肽可包含抗原。

[0197] 上述融合蛋白的目标蛋白或肽可包含修复酶。

[0198] 上述融合蛋白的目标蛋白或肽可包含适于在水力压裂流体中破裂乳液或胶体的酶。

[0199] 上述融合蛋白的目标蛋白或肽可包括抗菌性蛋白或肽。

[0200] 表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员

[0201] 本发明还涉及表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。融合蛋白可以是上面章节I.B中所述的任何融合蛋白。

[0202] II.在通过Co-过表达调节子蛋白表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员中调节融合蛋白表达

[0203] 表达本文所述融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员在它们孢子的外部上呈现融合蛋白的目标蛋白或肽部分。已经发现，在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中某些外孢壁蛋
白(本文称为“调节子蛋白”)的过表达(也表达融合蛋白)允许调节(即，增加或减少)融合蛋白的表达水平，从而增加或减少在孢子外部呈现的目标蛋白或肽的量。控制在孢子外部上
呈现的目标蛋白或肽的量的能力是有益的，因为在某些情况下，期望增加所呈现的目标蛋
白或肽的量。例如，当目标蛋白是降解植物营养源的酶时，可能期望增加在孢子上呈现的酶的量，使得在向植物生长介质引入孢子时、或施加孢子到植物或植物种子或植物或植物种
子周围的区域时可实现更大的酶活性和较大的植物生长刺激。在其他情况下，希望减少所
呈现的目标蛋白或肽的量。例如，当目标蛋白或肽包含植物免疫系统增强蛋白或肽时，可能需要减少孢子上的蛋白或肽呈现的量，因为植物免疫系统的过度刺激可能导致不良影响

[0204] 如本文下面进一步描述的，表达调节子蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员可用于本文所述的任何各种领域和方法，以及本文所述的任何用途。例如，表达调节子蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员可用于刺激植物生长的方法；用于保护植物免受病原体侵害的方
法；提高植物的胁迫抗性的方法；在植物上固定重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的方法；刺激植物种子发芽方法；将核酸递送至植物的方法；向动物，昆虫，蠕虫(例如线虫)，真菌或原生动物递送核酸的方法；将酶递送至植物的方法；改变植物性质的方法；将蛋白或肽递送至动物的方法；在受试者中产生免疫原性应答的疫苗和方法；减少环境中污染物的方法；受污染土壤植物修复的方法；处理水力压裂流体以破裂流体内的乳液或胶体的方法；表面消毒
方法；并用于例如油脂、油脂或脂肪处理或脱胶；皮料加工；生物燃料、生物柴油或生物乙醇形成；糖加工或转化；淀粉处理；纸或亚麻加工；动物或真菌副产品处理或氨基酸回收；有针对性地消化设施废物；饲料或食品添加剂；膳食补充剂；动物营养；工业清洗；粮食加工；化妆品制造；气味对照食品或饮料加工；酿造增强剂或添加剂；洗涤剂添加剂或纺织或纱线加工。

[0205] 对于蛋白(例如酶)的许多应用，存在生物应答曲线，其中蛋白或酶的最佳浓度导致期望的效果，并且蛋白质的过量或太少的蛋白质的量将导致不期望的或不适当的效果减
弱。这种生物学曲线的一个例子证明是生物药物，例如用于糖尿病治疗的蛋白药物胰岛素
需要最佳剂量以降低糖尿病患者的血糖水平。太少的胰岛素导致不充分的反应和维持不希
望的升高的血糖水平和潜在的高钾血症。一大剂量的胰岛素会导致低血糖水平和潜在的低
钾血症和相关的发病率。

[0206] 对于本文所述的融合蛋白中包含的许多目标蛋白和肽，存在类似的生物应答曲线。因此，对于本文所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的各种使用领域和方法，可能期望调制外孢壁上的目标蛋白或肽的表达水平。通过增加或减少重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外
孢壁上的目标蛋白或肽的表达水平，可以优化表达水平以保持目标蛋白或肽在最有效浓度
的总体表达水平。

[0207] 例如，在目标蛋白或肽包含在植物中直接信号传导中涉及的蛋白或肽的情况下，需要调节融合蛋白的表达水平，例如鞭毛蛋白肽flg22和表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆
菌家族成员施加至植物，以为植物提供有益的作用。这种调节将有益于避免足够大的信号
应答，这将导致对植物的不利反应(例如对flg22可能导致坏死的反应太大)，或者足够低的信号应答，使其产生对肽的反应差或不足。

[0208] 生物应答曲线也将与表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员相关，其中目标蛋白或肽包含抗原。在这种情况下，需要调节含有抗原的融合蛋白的表达水平以达到在动
物中产生适当的免疫应答的最佳范围。剂量太大可能导致注射部位水肿和不想要的炎症，
而剂量太小可能导致疫苗接种不足或免疫应答。

[0209] 在重组蜡样芽孢杆菌家族成员的外孢壁上调节融合蛋白的表达水平也提供益处，例如，当重组蜡样芽胞杆菌家族成员用于在水力压裂流体中破乳液或胶体时。多糖凝胶常
用于水力压裂加工凝胶。这些凝胶需要断裂。当凝胶溶液准备破裂时，操作者将希望作为酶反应的断裂以特定的优化速率发生。打破凝胶太快可能会导致不良副作用例如汇集未消化
的凝胶片段。另一方面，打破凝胶太慢会导致漫长的等待时间和费用的增加。使用下文描述的技术，可以调节重组蜡样芽孢杆菌杆菌家族成员的外孢壁上表达融合蛋白的酶水平，包
含适合于在水力压裂流体中破裂乳液或胶体的酶，以确保优化的存在用于破碎凝胶的酶水
平，导致在现场使用时的优选结果。

[0210] 提供重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其表达：(i)融合蛋白，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外
孢壁蛋白片段；和(ii)调节子蛋白，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中
相比于调节子蛋白的表达，调节子蛋白的表达增强。当和重组蜡样芽胞杆菌家族成员中的
融合蛋白共表达时，相比于在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中融合蛋白的表达水平，融合蛋
白的表达增强或减弱，在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于调节子蛋白
的表达，重组蜡样芽胞杆菌家族成员在增强水平不表达调节子蛋白。

[0211] 调节子蛋白可包含ExsY蛋白、ExsFA/BxpB蛋白、CotY蛋白、CotO 蛋白、ExsFB蛋白、InhA1蛋白、InhA2蛋白、ExsJ蛋白、ExsH蛋白、 YjcA蛋白、YjcB蛋白、BclC蛋白、AcpC蛋白、InhA3蛋白、丙氨酸消旋酶1、丙氨酸消旋酶2、BclA蛋白、BclB蛋白、BxpA蛋白、BclE蛋白、BetA/BAS3290蛋白、CotE蛋白、ExsA蛋白、ExsK蛋白、ExsB蛋白、 YabG蛋白、Tgl蛋白、SODA1蛋白、SODA2蛋白、任意其变体或任意其组合。

[0212] 例如，当调节子蛋白在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中和融合蛋白共表达时，相比于在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中融合蛋白的表达水平，融合蛋白的表达增强，在相同条
件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于调节子蛋白的表达，重组蜡样芽胞杆菌家族
成员在增强水平不表达调节子蛋白。当调节子蛋白在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中和融合
蛋白共表达时，导致融合蛋白的这种增强表达，调节子蛋白可包含BclB蛋白、CotE 蛋白、BxpB蛋白、CotO蛋白、BclA蛋白、任意其变体或任意其组合。

[0213] 或者，当调节子蛋白在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中和融合蛋白共表达时，相比于在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中融合蛋白的表达水平，融合蛋白的表达减弱，在相同条
件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于调节子蛋白的表达，重组蜡样芽胞杆菌家族
成员在增强水平不表达调节子蛋白。当调节子蛋白在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中和融合
蛋白共表达时，导致融合蛋白的这种减弱表达，调节子蛋白可包含BclC蛋白、ApcC 蛋白、YjcB蛋白、任意其变体、或任意其组合。

[0214] 例如，调节子蛋白可包括CotO蛋白、BclB蛋白、ExsFA/BxpB蛋白、 YjcB蛋白、任意其变体、或任意其组合。

[0215] 为了便于参考，调节子蛋白及其SEQ ID NO的描述列在下表2中。表2.用于调节子蛋白的氨基酸序列

[0216]

[0217]

[0218] 许多调节子蛋白都有同源物、旁系同源物或遗传重排。因此，与上面表2中列出的任何调节子序列具有至少70％同源性的多种蛋白将保留作为调节子蛋白在重组蜡样芽孢
杆菌家族成员中过表达的能力，重组蜡样芽胞杆菌家族成员也表达本文所述的任何融合蛋
白。另外，许多调节子蛋白(例如BclA、BclB和BclE)具有在菌株之间可能有显着差异的内部重复区域。在内部重复区域的重复次数的增加或减少将影响总序列同源性，但只要蛋白质
的氨基-和羧基端区域的同源性与上表中列出的调节子蛋白的氨基酸序列保持至少75％的
序列同一性，预期该同系物将保留作为调节子蛋白的能力。

[0219] 因此，例如，调节子蛋白可包含与SEQ ID NO:123-156中的任一个具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

[0220] 调节子蛋白可包含与SEQ ID NO:123-156中的任一个具有至少75％序列同一性的氨基酸序列。

[0221] 调节子蛋白可包含与SEQ ID NO:123-156中的任一个具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

[0222] 调节子蛋白可包含与SEQ ID NO:123-156中的任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

[0223] 调节子蛋白可包含与SEQ ID NO:123-156中的任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

[0224] 调节子蛋白可包含与SEQ ID NO:123-156中的任一个具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。

[0225] 调节子蛋白可包含与SEQ ID NO:123-156中的任一个具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。

[0226] 调节子蛋白可包含与SEQ ID NO:123-156中的任一个具有至少 100％序列同一性的氨基酸序列。

[0227] 例如，调节子蛋白可包含SEQ ID NO:124、126、134、135、143 或144。

[0228] 表达调节子蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含编码调节子蛋白的载体。例如，载体可包括多拷贝质粒。多拷贝质粒允许调节子蛋白的高表达水平。

[0229] III.在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中用于表达融合蛋白的启动子和/或调节子蛋白

[0230] 当融合蛋白包含使融合蛋白靶向蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段时，编码融合蛋白的DNA在孢子形成启动子的控制下是合适的，这将引起融合蛋白在蜡样芽孢杆菌家族成员内生孢子的外孢壁上表达(例如来自蜡样芽孢
杆菌家族成员的天然bclA启动子)。

[0231] 因此，上面章节1.B中所述的任何融合蛋白可以在孢子形成启动子的控制下在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中表达，孢子形成启动子天然于融合蛋白的靶向序列、外孢壁蛋
白或外孢壁蛋白片段、或这种启动子的一部分。

[0232] 类似地，上面章节II中所述的任何调节子蛋白可在其天然启动子或其蛋白的控制下表达。

[0233] 任何融合蛋白或调节子蛋白可在高表达孢子形成启动子的控制下表达。

[0234] 高表达孢子形成启动子可包括σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列。

[0235] 为便于参考，下面表3提供可以用于在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中表达任何融合蛋白或任何调节子蛋白的启动子的示例性核苷酸序列连同它们的SEQ ID NO。表3还提供
多种启动子的示例性最小启动子序列。在表3中，在启动子中σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列由粗体和加下划线文本指示。几种序列具有彼此重叠的多个σK序列。重叠由表中的双下划线表示。启动子序列紧接着每个指定基因的起始密码子的上游。换句话说，在下面表3所示的序列中，启动子序列的最后核苷酸紧邻编码所指定的蛋白的基因编码区的起始
密码子的第一核苷酸之前。

[0236] 表3.用于在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中表达融合蛋白和调节子蛋白的启动子序列

[0237]

[0238]

[0239]

[0240]

[0241]

[0242]

[0243]

[0244]

[0245]

[0246]

[0247]

[0248]

[0249]

[0250]

[0251]

[0252]

[0253]

[0254]

[0255]

[0256] 在表3中所示的启动子序列中σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列导致在孢子形成期间融合蛋白或调节子蛋白的高表达水平。σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列的
共有序列为CATANNNTN；然而，该序列可以包含多达两个突变并仍然是功能性的。σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列通常发现位于核糖体结合位点(RBS)的上游。

[0257] 与上面表3中示出的任一序列具有高度序列同一性的启动子也可用于表达融合蛋白或调节子蛋白。

[0258] 例如，融合蛋白或调节子蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与 SEQ ID NO:157-231中任一个的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列。

[0259] 融合蛋白或调节子蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157-231中任一个的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列。

[0260] 融合蛋白或调节子蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157-231中任一个的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。

[0261] 融合蛋白或调节子蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157-231中任一个的核酸序列具有至少98％同一性的核酸序列。

[0262] 融合蛋白或调节子蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157-231中任一个的核酸序列具有至少99％同一性的核酸序列。

[0263] 融合蛋白或调节子蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157-231中任一个的核酸序列具有100％同一性的核酸序列。

[0264] 例如，调节子蛋白或融合蛋白可在BclA启动子(例如SEQ ID NO: 189、190、215、229或230)、CotY启动子(例如SEQ ID NO:161、162 或221)、ExsY启动子(例如SEQ ID NO:
157、158或220)或鼠李糖启动子(例如SEQ ID NO:225)的控制下表达。例如，融合蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157、158、161、162、189、190、 215、220、221、
225、229或230中任一个的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列。

[0265] 融合蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157、 158、161、162、189、190、215、220、221、225、229或230中任一个的核酸序列具有至少85％同一性的核酸序列。

[0266] 融合蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157、 158、161、162、189、190、215、220、221、225、229或230中任一个的核酸序列具有至少90％同一性的核酸序列。

[0267] 融合蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157、 158、161、162、189、190、215、220、221、225、229或230中任一个的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。

[0268] 融合蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157、158、161、162、189、190、215、220、221、225、229或230中任一个的核酸序列具有至少98％同一性的核酸序列。

[0269] 融合蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157、 158、161、162、189、190、215、220、221、225、229或230中任一个的核酸序列具有至少99％同一性的核酸序列。

[0270] 融合蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含与SEQ ID NO:157、 158、161、162、189、190、215、220、221、225、229或230中任一个的核酸序列具有100％同一性的核酸序列。

[0271] 融合蛋白或调节子蛋白可在启动子控制下表达，启动子包含σ-K孢子形成特异性聚合酶启动子序列，其中σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列与SEQ ID NO:157-231中
任一个的相应核苷酸具有100％同一性。

[0272] 融合蛋白可在天然于融合蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的启动子控制下表达。因此，例如，如果靶向序列衍生自BclA，融合蛋白可在天然BclA启动子(例如SEQ ID NO:189、190、215、229或230) 控制下表达。

[0273] 调节子蛋白可在它们天然启动子的控制下表达。因此，例如，如果调节子蛋白包含CotO，CotO可以在天然CotO启动子(例如SEQ ID NO:163 或226)的控制下表达。用于各调节子蛋白的天然启动子序列提供于上表 3。

[0274] 表3还提供用于各调节子蛋白的示例性最小启动子序列。调节子蛋白和融合蛋白可以在任何这些最小启动子序列下表达。例如，调节子蛋白可以在包含天然启动子序列的
一部分的最小启动子下表达。例如，如果调节子蛋白含有CotO，CotO可以在最小CotO启动子(SEQ ID NO:164)下表达。

[0275] 或者，调节子蛋白可以在包含σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列的任何启动子的控制下表达，而不管启动子是否为调节子蛋白的天然启动子。从表3可以看出，用于各调和子蛋白的天然启动子和最小启动子都包含至少一种σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动
子序列。因此，例如，当调节子蛋白是BxpB时，BxpB可以在BclA启动子(例如SEQ ID NO：189、 
190、215、229或230)或表3中列出的任何其他启动子的控制下表达。

[0276] 另外，调节子蛋白或融合蛋白可以在表3中列出的任何启动子的一部分下表达，只要启动子的这部分包括σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列。例如，调节子蛋白可以在启动子区域下表达，启动子区域包含起始密码子上游的前25个、50个、100个、150个、250个、
250个或300个核苷酸，只要该区域包含σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列。

[0277] IV.允许收集游离外孢壁的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的突变和其他基因改变

[0278] 如本文下面进一步所述，表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白
或外孢壁蛋白片段，所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员可用于将目标蛋白或肽递送至植物、
种子、植物生长介质、或种子或植物周围的区域(例如通过土壤灌溉，叶面施用或作为种子处理)。另外，重组蜡样芽胞杆菌家族成员可用于将核酸分子递送至动物、昆虫、蠕虫(例如线虫)、真菌和原生动物；将蛋白或肽递送至动物；在疫苗和制备免疫原性应答；补救；用于处理水力压裂流体以破裂流体内的乳液或胶体；消毒；以及下文描述的各种其它用途。然
而，在一些情况下，活微生物的存在可能是不期望的，而是期望将活孢子与孢子外表面上的外孔壁中的融合蛋白分离。例如，在一些应用中，期望增加酶活性而不关心孢子完整性。在这种情况下，外孢壁片段可能优于在其外孢壁上具有酶的活微生物。

[0279] 另外，对于一些用途，可能希望降低产品的密度。在这种情况下，需要将密孢子与外孢壁(含有融合蛋白)分离。在疫苗领域，可能需要将孢子与外孢壁(含有包含抗原的融合蛋白)分离，以从疫苗制剂中除去存在于孢子本身上的潜在抗原。另外，在某些情况下，活孢子的存在将导致产品中细菌生长的潜力，这对于一些应用(例如，动物饲料补充和皮革隐藏加工)是不期望的。

[0280] 突变或其他基因改变(例如蛋白的过表达)可引入重组蜡样芽胞杆菌家族成员，着允许游离外孢壁从重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子分离。这种分离过程产生含有融合蛋
白但基本上没有孢子本身的外孢壁片段。“基本上没有孢子”是指一旦游离外孢壁与孢子分离，则获得的配制物含有小于5 体积％的孢子，优选小于3体积％的孢子，甚至更优选小于1体积％的孢子，最优选不含孢子，或如果存在孢子它们是不可检测的。这些外孢壁片段可用于代替重组蜡样芽胞杆菌家族成员本身、或为本文所述的任何其他目，可用于将目标蛋白
或肽递送至植物、种子、植物生长介质或种子或植物周围的区域。

[0281] 因此，提供表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外
孢壁蛋白片段。重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含突变或表达蛋白，其中在相同条件下在野
生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于蛋白的表达，所述蛋白的表达增强。蛋白的突变或增
强的表达导致相比于野生型孢子的外孢壁，蜡样芽胞杆菌孢子具有更易于从孢子除去的外
孢壁。

[0282] 提供另外重组蜡样芽胞杆菌家族成员，表达融合蛋白，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢
壁蛋白片段。重组蜡样芽胞杆菌家族成员： (i)包含CotE基因中的突变；(ii)表达ExsY蛋
白，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于ExsY蛋白的表达，ExsY蛋
白的表达增强，和其中ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基端标签；(iii)表达BclB 蛋白，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于BclB 蛋白的表达，BclB蛋白的
表达增强；(iv)表达YjcB蛋白，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比
于YjcB蛋白的表达，YjcB蛋白的表达增强；(v)包含ExsY基因中的突变；(vi)包含CotY基因中的突变；(vii) 包含ExsA基因中的突变；或(viii)包含CotO基因中的突变。

[0283] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含CotE基因中的突变，例如CotE 基因或CotE基因的显性阴性形式的敲除。CotE基因中的突变可部分或完全抑制CotE使外孢壁附接孢子的
能力。

[0284] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可表达ExsY蛋白。ExsY蛋白包含含有球状蛋白的羧基端标签(例如绿色荧光蛋白(GFP)或其变体)，并且在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家
族成员中相比于ExsY蛋白的表达，ExsY蛋白的表达增强。球状蛋白可具有分子量为25kDA至
100kDa。ExsY蛋白的表达包含含有球状蛋白的羧基端标签，其也可抑制ExsY蛋白结合外孢
壁中的它的靶。

[0285] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可表达BclB蛋白，这可导致易碎外孢壁的形成。在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于BclB蛋白的表达，BclB蛋白的表达可增
强。

[0286] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可表达YjcB蛋白，其可使所述外孢壁形成碎片而不是完整结构。在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于YjcB蛋白的表达，YjcB
蛋白的表达可增强。

[0287] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含ExsY基因中的突变，例如ExsY 基因的敲除。ExsY基因中的突变可部分或完全抑制ExsY完全形成所述外孢壁或使所述外孢壁附接所述
孢子的能力。

[0288] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含CotY基因中的突变，例如CotY 基因的敲除。CotY基因中的突变可导致易碎外孢壁的形成。

[0289] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含ExsA基因中的突变，例如ExsA 基因的敲除。ExsA基因中的突变可导致易碎外孢壁的形成。

[0290] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含CotO基因中的突变，例如CotO 基因或CotO基因的显性阴性形式的敲除。CotO基因中的突变可使所述外孢壁形成条。

[0291] 外孢壁片段可以由任何这些重组蜡样芽胞杆菌家族成员制备，并用于下文进一步描述的各种目的。外孢壁片段包含融合蛋白。在从孢子纯化含有融合蛋白的外孢壁片段时，获得了细胞游离蛋白制剂，其中融合蛋白通过共价键稳定和支撑至外孢壁片段。

[0292] 由于融合蛋白和外孢壁碎片之间的较强共价键，融合蛋白变得耐热。结合exosproium片段的融合蛋白的耐热性允许它们用于需要耐热蛋白或酶的应用(例如在饲料
添加剂中)。

[0293] V.包括重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子的杆菌Genus细菌的孢子的灭活

[0294] genus杆菌细菌的孢子可以基因灭活。孢子的基因灭活可以是有利的，例如因为它允许将孢子递送到植物或植物生长介质，同时消除活细菌可能对植物具有的任何不利影
响。另外，使用灭活孢子可以提供许多相同的益处(例如预防产品中的细菌生长)，如上文关于使用外孢壁片段的章节IV 所述。

[0295] A.通过过表达蛋白酶或核酸酶来基因灭活

[0296] 提供表达蛋白酶或核酸酶的genus杆菌的重组细菌。在相同条件下在 genus杆菌的野生型细菌中相比于蛋白酶或核酸酶的表达，蛋白酶或核酸酶的表达增强。蛋白酶或核
酸酶的表达增强部分或全部灭活genus杆菌的重组细菌的孢子，或使genus杆菌的重组细菌
的孢子更易于物理或化学灭活。

[0297] genus杆菌的重组细菌优选重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[0298] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员还可表达融合蛋白，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白
片段。

[0299] genus杆菌的重组细菌可表达蛋白酶和核酸酶，其中在相同条件下在 genus杆菌的野生型细菌中相比于蛋白酶的表达，蛋白酶的表达增强；以及在相同条件下在genus杆菌的野生型细菌中相比于核酸酶的表达，核酸酶的表达增强。

[0300] 重组细菌的蛋白酶可包括非特异性蛋白酶。

[0301] 重组细菌的蛋白酶可包括丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、碱性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、组氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。

[0302] 重组细菌的蛋白酶可包括萌发孢子蛋白酶，例如枯草芽胞杆菌萌发孢子蛋白酶、蕈状芽孢杆菌萌发孢子蛋白酶或苏云金芽孢杆菌萌发孢子蛋白酶。

[0303] 萌发孢子蛋白酶可包含萌发孢子蛋白酶的活性形式。该蛋白酶在孢子中天然灭活。在发芽时，由于蛋白酶裂解成蛋白质活性形式，蛋白酶变活性。因此，重组细菌可以包含活性蛋白酶而不是天然不活泼的形式。活性蛋白酶可以在发芽前消化孢子中的保护性SASP
蛋白。

[0304] 重组细菌的核酸酶可包括核酸内切酶或核酸外切酶。核酸酶可包括非特异性核酸内切酶，例如枯草芽胞杆菌核酸内切酶1。例如，萌发孢子蛋白酶和核酸内切酶1可具有下面表4列出的氨基酸序列。

[0305] 表4.萌发孢子蛋白酶和核酸内切酶1的氨基酸序列

[0306]蛋白 SEQ ID NO.
核酸内切酶1,B.subtilis 168 232
GPR蛋白酶,B.subtilis 168 233
GPR蛋白酶,蜡样芽孢杆菌 234

[0307] 还可以使用蛋白酶或核酸酶，与表4中上面列出的序列具有高度氨基酸同一性。

[0308] 因此，例如，萌发孢子蛋白酶可包含与SEQ ID NO:233或234具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0309] 萌发孢子蛋白酶可包含与SEQ ID NO:233或234具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0310] 萌发孢子蛋白酶可包含与SEQ ID NO:233或234具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0311] 萌发孢子蛋白酶可包含与SEQ ID NO:233或234具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0312] 萌发孢子蛋白酶可包含与SEQ ID NO:233或234具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0313] 萌发孢子蛋白酶可包含与SEQ ID NO:233或234具有100％同一性的氨基酸序列。

[0314] 类似地，非特异性核酸内切酶可包含与SEQ ID NO:232具有至少 85％同一性的氨基酸。

[0315] 非特异性核酸内切酶可包含与SEQ ID NO:232具有至少90％同一性的氨基酸。

[0316] 非特异性核酸内切酶可包含与SEQ ID NO:232具有至少95％同一性的氨基酸。

[0317] 非特异性核酸内切酶可包含与SEQ ID NO:232具有至少98％同一性的氨基酸。

[0318] 非特异性核酸内切酶可包含与SEQ ID NO:232具有至少99％同一性的氨基酸。

[0319] 非特异性核酸内切酶可包含与SEQ ID NO:232具有100％同一性的氨基酸。

[0320] 蛋白酶或核酸酶可在包含σG启动子序列的启动子控制下表达。例如，启动子可具有下面表5中列出的一种序列。σG转录因子结合的共有序列是CATNNTA，其中N是任何核苷
酸。表5中启动子中的σG启动子序列由粗体和下划线文本表示。

[0321] 表5.具有σG序列的启动子序列

[0322]

[0323]

[0324]

[0325]

[0326] 核酸酶或蛋白酶在σG启动子下表达允许在前孢子中的核酸酶或蛋白酶的位点特异性表达，其中酶的活性指向前孢子，这定位细菌靶向DNA 的区域。前孢子DNA的深度裂解在细菌孢子开始发芽时是致命的。

[0327] 例如，如下文提供的实施例中进一步说明的，在孢子形成期间，蜡样芽胞杆菌家族成员的前孢子中的活性形式的萌发孢子蛋白酶(GPR)的过表达导致蛋白质在前孢子中的蛋白质裂解和孢子失活、和/或使孢子更为敏感以通过紫外线或γ辐射失活。类似地，在孢子形成期间，在前孢子中非特异性核酸内切酶的过表达破坏了孢子中的DNA，从而导致大量灭活的孢子颗粒。这些用于灭活蜡样芽孢杆菌家族成员孢子的方法可以单独使用，也可以与
其他孢子灭活方法联合使用。

[0328] 杆菌孢子中基因的表达通过特异性孢子形成σ因子的表达而紧密调节，这将RNA聚合酶引导至需要在孢子形成的每个阶段期间表达的基因。在细菌DNA和必需蛋白包装时，前孢子中的基因的晚期表达被σfactorσG 调控。在晚孢子形成期间，细菌DNA与称为小酸溶性蛋白(SASP)的保护性蛋白包装。这些SASP蛋白包括SASPα、SASPβ和SASPγ等。ASP 蛋白保护细菌DNA免受紫外线照射和其他攻击。在发芽时，前蛋白转换酶萌发孢子蛋白酶被活化并消化这些SASP蛋白。

[0329] 通过在σG启动子的控制下表达GPR，GPR在前孢子中表达，并且保护性SASP蛋白在孢子形成开始时降解，使得细菌DNA更易于降解。类似地，非特异性核酸酶在σG启动子的控制下表达导致宿主DNA的消化。由于孢子不能修复对其DNA的大规模损伤，因此最终导致了
孢子的死亡。 GPR和非特异性核酸内切酶的过表达可以一起使用，以降解保护性SASP 蛋白和宿主DNA。

[0330] 蛋白酶或核酸酶可在包含σG启动子序列的任何启动子控制下表达。

[0331] 因此，蛋白酶或核酸酶可在上面表5中列出的任一启动子控制下表达。另外，蛋白酶或核酸酶可在启动子控制下表达，启动子与表5中上面列出的启动子序列中的任一个具
有高度序列同一性。

[0332] 例如，启动子可包含与SEQ ID NO:235-246中任一个的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。

[0333] 启动子可包含与SEQ ID NO:235-246中任一个的核酸序列具有至少 98％同一性的核酸序列。

[0334] 启动子可包含与SEQ ID NO:235-246中任一个的核酸序列具有至少 99％同一性的核酸序列。

[0335] 启动子可包含与SEQ ID NO:235-246中任一个的核酸序列具有 100％同一性的核酸序列。

[0336] 在表达蛋白酶或核酸酶的任何genus杆菌的重组细菌中，相比于在相同条件下处理在genus杆菌的野生型细菌中蛋白酶或核酸酶的表达增强的水平下相同孢子不表达蛋白
酶或核酸酶，genus杆菌的重组细菌的孢子可更容易灭活，例如通过紫外线照射、γ照射或用漂白剂、过氧化氢、氯仿、苯酚或乙酸处理。

[0337] B.通过编码发芽受体、孢子核溶解酶、小酸溶性孢子蛋白(SASP)或孢子外壳蛋白的基因突变而基因灭活

[0338] 表达包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的融合蛋白的任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的孢子也可
以通过修改蜡样芽胞杆菌家族成员包含突变来基因灭活或更易于物理或化学灭活。

[0339] 这些突变包括在编码发芽受体的一个或多个基因中敲除或其他灭活突变。发芽受体基因包括例如GerA、GerB、GerK、GerH、GerI、GerG、 GerL、GerQ、GerR、GerS、GerN、GerU或GerX。

[0340] 这些突变还包括在孢子皮质裂解酶中敲除或其他灭活突变。例如，孢子皮质裂解酶SleB和CwJ可以突变以灭活孢子。这样的突变阻止了在发芽时孢子的自然结果并有效地
灭活孢子。

[0341] 这些突变进一步包括敲除或其他灭活突变SASP基因(例如SASPα、SASPβ或SASPγ)。这些突变消除孢子的紫外线保护，并使它们更易于通过紫外线照射和其他方法灭活。

[0342] 这些方法还包括在编码孢子包衣或皮质蛋白的基因中进行敲除或其他灭活突变(例如CotA、CotB或CotC)。这些突变使得孢子更容易被物理或化学方法灭活。例如暴露于紫外线照射、γ照射或用溶剂处理例如漂白剂、过氧化氢、氯仿、苯酚或乙酸。

[0343] 因此，本发明涉及表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋
白或外孢壁蛋白片段。重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含突变，其部分或全部灭活重组蜡样
芽胞杆菌家族成员的孢子或使重组蜡样芽胞杆菌家族的孢子相比于不包含突变的相同孢
子更易于物理或化学灭活。突变包括编码发芽受体的基因中的突变、编码孢子皮质裂解酶
的基因中的突变、编码小酸溶性孢子蛋白(SASP)的基因中的突变或编码孢子包衣或皮质蛋
白的基因中的突变。

[0344] 本发明进一步涉及表达上面章节I所述融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含突变，其部分或全部灭活重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢
子或使重组蜡样芽胞杆菌家族的孢子相比于不包含突变的相同孢子更易于物理或化学灭
活。

[0345] 表达蛋白酶或核酸酶的上面章节V.A中所述的任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员还可包含突变，其部分或全部灭活重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子或使重组蜡样芽胞杆菌
家族的孢子相比于不包含突变的相同孢子更易于物理或化学灭活。例如，突变包括编码发
芽受体的基因中的突变、编码孢子皮质裂解酶的基因中的突变、编码小酸溶性孢子蛋白
(SASP)的基因中的突变或编码孢子包衣或皮质蛋白的基因中的突变。

[0346] 例如，突变可包括编码发芽受体的基因中的突变，例如编码发芽受体的基因的敲除突变。发芽受体可包括GerA、GerB、GerK、GerH、GerI、 GerG、GerL、GerQ、GerR、GerS、GerN、GerU或GerX。

[0347] 例如，突变可包括编码孢子皮质裂解酶的基因中的突变，例如编码孢子皮质裂解酶的基因的敲除突变。孢子皮质裂解酶可包括SleB或CwlJ。

[0348] 例如，突变可包括编码SASP的基因中的突变，例如SspA基因突变、 SspB基因突变、SspC基因突变、SspD基因突变、SspE基因突变、SspF 基因突变、SspG基因突变、SspH基因突变、SspI基因突变、SspJ基因突变、SspK基因突变、SspL基因突变、SspM基因突变、SspN基因突变、SspO基因突变、SspP基因突变或其组合。SASP可包括SASPα、 SASPβ或SASPγ。相比于不包含编码SASP的基因中突变的相同的孢子，重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子可能更容易被紫外线照射或γ辐射灭活。

[0349] 例如，突变可包括编码孢子包衣或皮质蛋白的基因中的突变，例如编码孢子包衣或皮质蛋白的基因的敲除突变。孢子包衣或皮质蛋白可包含 CotA、CotB或CotC。相比于在相同条件下处理不含在孢子包衣或皮质蛋白中突变的相同的孢子，重组蜡样芽胞杆菌家族
成员的孢子可通过紫外线照射、γ辐射或通过使用漂白剂，过氧化氢，氯化物，苯酚或乙酸处理更易于灭活。

[0350] VI.过表达外孢壁酶也对植物或蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的发芽有益的重组蜡样芽胞杆菌家族成员

[0351] 还提供重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其过表达各种外孢壁蛋白以对植物或延迟孢子发芽提供有益的作用。

[0352] 提供表达外孢壁蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于外孢壁蛋白的表达，外孢壁蛋白的表达增强。外孢壁蛋白
可以包含外孢壁酶，其中外孢壁酶包括涉及营养物增溶的酶、肌苷-尿苷水解酶、蛋白酶、催化自由基降解的酶、精氨酸酶或丙氨酸消旋酶。或者，外孢壁蛋白可以包括BclA蛋白、BclB蛋白、 CotE蛋白、CotO蛋白、ExsY蛋白、ExsFA/BxpB蛋白、CotY蛋白、ExsFB 蛋白、ExsJ蛋白、ExsH蛋白、YjcA蛋白、YjcB蛋白、BclC蛋白、BxpA 蛋白、BclE蛋白、BetA/BAS3290蛋白、ExsA蛋白、ExsK蛋白、ExsB 蛋白、YabG蛋白或Tgl蛋白。

[0353] 外孢壁蛋白优选不是融合蛋白的部分。

[0354] 用于AcpC、InhA1、InhA2、InhA3、SODA1和SODA2的示例性氨基酸序列提供于上面表1和2。用于丙氨酸消旋酶1、丙氨酸消旋酶2、精氨酸酶、IunH1和IunH2的示例性序列由参照下面表6的SEQ ID NO提供。

[0355] 表6.用于外孢壁酶的示例性氨基酸序列

[0356]蛋白和菌株 SEQ ID NO.
丙氨酸消旋酶1,炭疽杆菌ΔSterne 247
丙氨酸消旋酶2,蜡样芽胞杆菌F837/78 248
精氨酸酶,苏云金芽孢杆菌pondicheriensis 4BA1 249
IunH1,蜡样芽孢杆菌Str.CI 250
IunH2,苏云金芽孢杆菌 251

[0357] 肌苷-尿苷水解酶和丙氨酸消旋酶的过表达阻碍孢子发芽的能力，从而保持了孢子处于休眠状态，并增加了孢子的稳定性。

[0358] SODA酶和精氨酸酶降解自由基。过表达酶的孢子具有增强的由自由基引起的胁迫抗性。

[0359] 如果外孢壁蛋白包括外孢壁酶，和外孢壁酶包括涉及营养物增溶的酶，涉及营养物增溶的酶可包括涉及磷酸酯增溶的酶，例如酸性磷酸酶(例如AcpC)。酸性磷酸酶可包含
与SEQ ID NO:137具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0360] 酸性磷酸酶可包含与SEQ ID NO:137具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0361] 酸性磷酸酶可包含与SEQ ID NO:137具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0362] 酸性磷酸酶可包含与SEQ ID NO:137具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0363] 酸性磷酸酶可包含与SEQ ID NO:137具有100％同一性的氨基酸序列。

[0364] 如果外孢壁蛋白包含外孢壁酶并且外孢壁酶包含肌苷-尿苷水解酶，肌苷-尿苷水解酶可包含IunH1或IunH2。肌苷-尿苷水解酶可包含与SEQ ID NO:250或251具有至少85％
同一性的氨基酸序列。

[0365] 肌苷-尿苷水解酶可包含与SEQ ID NO:250或251具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0366] 肌苷-尿苷水解酶可包含与SEQ ID NO:250或251具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0367] 肌苷-尿苷水解酶可包含与SEQ ID NO:250或251具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0368] 肌苷-尿苷水解酶可包含与SEQ ID NO:250或251具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0369] 肌苷-尿苷水解酶可包含与SEQ ID NO:250或251具有100％同一性的氨基酸序列。

[0370] 如果外孢壁蛋白包含外孢壁酶并且外孢壁酶包含蛋白酶，蛋白酶可以是金属蛋白酶(例如InhA1、InhA2或InhA3)。金属蛋白酶可包含与SEQ ID NO:114、121、122、129、130或
138具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0371] 金属蛋白酶可包含与SEQ ID NO:114、121、122、129、130或138 具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0372] 金属蛋白酶可包含与SEQ ID NO:114、121、122、129、130或138 具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0373] 金属蛋白酶可包含与SEQ ID NO:114、121、122、129、130或138 具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0374] 金属蛋白酶可包含与SEQ ID NO:114、121、122、129、130或138 具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0375] 金属蛋白酶可包含与SEQ ID NO:114、121、122、129、130或138 具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0376] 金属蛋白酶可包含与SEQ ID NO:114、121、122、129、130或138 具有100％同一性的氨基酸序列。

[0377] 如果外孢壁蛋白包括外孢壁酶，和外孢壁酶包括催化自由基降解的酶，催化自由基降解的酶可包括超氧化物歧化酶(例如超氧化物歧化酶1 (SODA1)或超氧化物歧化酶2
(SODA2))。超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少85％同一性的氨基酸序
列。

[0378] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0379] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0380] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0381] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0382] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有100％同一性的氨基酸序列。

[0383] 如果外孢壁蛋白包括外孢壁酶并且外孢壁酶包括精氨酸酶，精氨酸酶可包括苏云金芽孢杆菌精氨酸酶。精氨酸酶可包含与SEQ ID NO:249具有至少85％同一性的氨基酸序
列。

[0384] 精氨酸酶可包含与SEQ ID NO:249具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0385] 精氨酸酶可包含与SEQ ID NO:249具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0386] 精氨酸酶可包含与SEQ ID NO:249具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0387] 精氨酸酶可包含与SEQ ID NO:249具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0388] 精氨酸酶可包含与SEQ ID NO:249具有100％同一性的氨基酸序列。

[0389] 如果外孢壁蛋白包括外孢壁酶和外孢壁酶包括丙氨酸消旋酶，丙氨酸消旋酶可包括丙氨酸消旋酶1(ALR1)或丙氨酸消旋酶2(ALR2)。丙氨酸消旋酶可包含与SEQ ID NO:247
或248具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0390] 丙氨酸消旋酶可包含与SEQ ID NO:247或248具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0391] 丙氨酸消旋酶可包含与SEQ ID NO:247或248具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0392] 丙氨酸消旋酶可包含与SEQ ID NO:247或248具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0393] 丙氨酸消旋酶可包含与SEQ ID NO:247或248具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0394] 丙氨酸消旋酶可包含与SEQ ID NO:247或248具有100％同一性的氨基酸序列。

[0395] 外孢壁蛋白可以包含BclA蛋白、BclB蛋白、CotE蛋白、CotO蛋白、 ExsY蛋白、ExsFA/BxpB蛋白、CotY蛋白、ExsFB蛋白、ExsJ蛋白、 ExsH蛋白、YjcA蛋白、YjcB蛋白、BclC蛋白、BxpA蛋白、BclE蛋白、BetA/BAS3290蛋白、ExsA蛋白、ExsK蛋白、ExsB蛋白、YabG蛋白或 Tgl蛋白。外孢壁蛋白优选包括BclA蛋白、BclB蛋白、CotE蛋白或CotO 蛋白。用于这些外孢壁蛋白的示例性氨基酸序列可发现于上面表2。

[0396] 外孢壁蛋白可以包含BclA蛋白。BclA蛋白可以包含与SEQ ID NO: 141或142具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0397] BclA蛋白可以包含与SEQ ID NO:141或142具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0398] BclA蛋白可以包含与SEQ ID NO:141或142具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0399] BclA蛋白可以包含与SEQ ID NO:141或142具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0400] BclA蛋白可以包含与SEQ ID NO:141或142具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0401] BclA蛋白可以包含与SEQ ID NO:141或142具有100％同一性的氨基酸序列。

[0402] 外孢壁蛋白可以包含BclB蛋白。BclB蛋白可以包含与SEQ ID NO: 143或144具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0403] BclB蛋白可以包含与SEQ ID NO:143或144具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0404] BclB蛋白可以包含与SEQ ID NO:143或144具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0405] BclB蛋白可以包含与SEQ ID NO:143或144具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0406] BclB蛋白可以包含与SEQ ID NO:143或144具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0407] BclB蛋白可以包含与SEQ ID NO:143或144具有100％同一性的氨基酸序列。

[0408] 外孢壁蛋白可以包含CotE蛋白。CotE蛋白可以包含与SEQ ID NO: 149具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0409] CotE蛋白可以包含与SEQ ID NO:149具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0410] CotE蛋白可以包含与SEQ ID NO:149具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0411] CotE蛋白可以包含与SEQ ID NO:149具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0412] CotE蛋白可以包含与SEQ ID NO:149具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0413] CotE蛋白可以包含与SEQ ID NO:149具有100％同一性的氨基酸序列。

[0414] 外孢壁蛋白可以包含CotO蛋白。CotO蛋白可以包含与SEQ ID NO: 126具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0415] CotO蛋白可以包含与SEQ ID NO:126具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0416] CotO蛋白可以包含与SEQ ID NO:126具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0417] CotO蛋白可以包含与SEQ ID NO:126具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0418] CotO蛋白可以包含与SEQ ID NO:126具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0419] CotO蛋白可以包含与SEQ ID NO:126具有100％同一性的氨基酸序列。

[0420] 外孢壁蛋白可以包含ExsY蛋白。ExsY蛋白可以包含与SEQ ID NO: 123具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0421] 外孢壁蛋白可以包含ExsFA/BxpB蛋白。ExsFA/BxpB蛋白可以包含与SEQ ID NO:124具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0422] 外孢壁蛋白可以包含CotY蛋白。CotY蛋白可以包含与SEQ ID NO: 125具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0423] 外孢壁蛋白可以包含ExsFB蛋白。ExsFB蛋白可以包含与SEQ ID NO:127或128具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少 99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0424] 外孢壁蛋白可以包含ExsJ蛋白。ExJ蛋白可包含与SEQ ID NO:131 具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0425] 外孢壁蛋白可以包含ExsH蛋白。ExsH蛋白可包含与SEQ ID NO: 132具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0426] 外孢壁蛋白可以包含YjcA蛋白。YjcA蛋白可以包含与SEQ ID NO: 133具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0427] 外孢壁蛋白可以包含YjcB蛋白。YjcB蛋白可以包含与SEQ ID NO: 134或135具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0428] 外孢壁蛋白可以包含BclC蛋白。BclC蛋白可包含与SEQ ID NO:136 具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0429] 外孢壁蛋白可以包含BxpA蛋白。BxpA蛋白可以包含与SEQ ID NO: 145具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0430] 外孢壁蛋白可以包含BclE蛋白。BclE蛋白可以包含与SEQ ID NO: 146或147具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0431] 外孢壁蛋白可以包含BetA/BAS3290蛋白。BetA/BAS3290蛋白可包含与SEQ ID NO:148具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0432] 外孢壁蛋白可以包含ExsA蛋白。ExsA蛋白可以包含与SEQ ID NO: 150具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0433] 外孢壁蛋白可以包含ExsK蛋白。ExsK蛋白可包含与SEQ ID NO: 151具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0434] 外孢壁蛋白可以包含ExsB蛋白。ExsB蛋白可以包含与SEQ ID NO: 152具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0435] 外孢壁蛋白可以包含YabG蛋白。YabG蛋白可包含与SEQ ID NO: 153具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0436] 外孢壁蛋白可以包含Tgl蛋白。Tjl蛋白可包含与SEQ ID NO:156具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[0437] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员还可表达融合蛋白，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白
片段。

[0438] VII.融合蛋白在内生蜡样芽胞杆菌家族成员、能够降解除草剂或杀虫剂的蜡样芽胞杆菌家族成员或益生菌蜡样芽胞杆菌家族成员中表达

[0439] 包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的任何融合蛋白可在内生蜡样芽胞杆菌家族成员、
能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株或益生菌细菌菌株中表达。

[0440] 融合蛋白在内生细菌菌株中的表达提供将目标蛋白或肽递送到植物本身的能力。内生菌株可以使用各种方法递送到植物，例如内生菌株可以通过种子处理、植物生长介质
(例如土壤)的处理、灌溉、施加至植物本身(例如叶片应用于植物的空中部分)来递送。一旦进入植物，细菌繁殖并被植物的内部组织固定。

[0441] 如下面进一步解释，表达融合蛋白的细菌的益生菌菌株，特别是表达融合蛋白的益生菌和内生的菌株都可用于将目标蛋白或肽(例如酶)递送给动物的方法。

[0442] 尽管包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的任何融合蛋白可以在能降解除草剂或杀虫剂
的蜡样芽胞杆菌家族成员菌株中表达，如下面进一步解释，但是这些菌株在用除草剂和/或杀虫剂污染的环境去污的方法中特别有用。

[0443] 因此本发明涉及表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，包含：使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋
白或外孢壁蛋白片段，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括内生细菌菌株、能降解除草剂
或杀虫剂的细菌菌株、或益生菌细菌菌株。

[0444] 内生细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、或苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366、或蕈状芽孢杆菌 EE-B00363。

[0445] 例如，内生细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、或苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366或蕈状芽孢杆菌EE-B00363。

[0446] 能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366 或蕈状芽孢杆菌EE-B00363。

[0447] 益生菌细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417或蜡样芽胞杆菌EE444。

[0448] 本发明进一步涉及表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋
白或外孢壁蛋白片段，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括内生细菌菌株，和融合蛋白包
括上面章节I中所述的任一融合蛋白。

[0449] VIII.靶向序列、外孢壁蛋白和外孢壁蛋白片段用于:(a)表达融合蛋白和Co-过表达调节子蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员；(b)包含允许收集游离外孢壁的突变或其他
基因改变的重组蜡样芽胞杆菌家族成员；(c)过表达蛋白酶或核酸酶的重组蜡样芽胞杆菌
家族成员；(d)对植物有益的表达融合蛋白和过表达外孢壁蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族
成员；或(e)或表达融合蛋白的内生重组蜡样芽胞杆菌家族成员

[0450] 该章节中所述的任何靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白可以在下列的任何融合蛋白中：

[0451] (a)表达融合蛋白和过表达调节子蛋白的任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员，在上面章节II所述；

[0452] (b)表达融合蛋白和包含允许收集游离外孢壁的突变或其他基因改变的任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员，在上面章节IV所述；

[0453] (c)表达融合蛋白和过表达蛋白酶或核酸酶的任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员，在上面章节V.A所述；

[0454] (d)对植物有益的表达融合蛋白和过表达外孢壁蛋白的任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员，在上面章节VI所述；和

[0455] (e)表达融合蛋白的任何内生重组蜡样芽胞杆菌家族成员，在上面章节VII所述。

[0456] 在任何重组蜡样芽胞杆菌成员(a)至(e)中，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含:(1)靶向序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35 具有至少约43％同一性的氨
基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约54％；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35；(3)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:1；(5)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的氨基酸序列；(6)靶向序列包含SEQ 
ID NO:1的氨基酸2-35；(7)靶向序列包含SEQ ID NO: 1的氨基酸5-35；(8)靶向序列包含
SEQ ID NO:1的氨基酸8-35；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸10-35；(10)靶向序列
包含SEQ ID NO:1的氨基酸15-35；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-27； (12)靶
向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-27；(13)靶向序列包含 SEQ ID NO:3；(14)外孢壁蛋
白包含与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的氨基酸序列；(15)靶向序列包含SEQ ID NO:3
的氨基酸2-27；(16) 靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸5-27；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸8-27；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸10-27； (19)靶向序列包含
SEQ ID NO:5的氨基酸1-38；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸23-38；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:5；(22)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:6具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸2-38；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:5 的氨基酸5-38；(25)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸8-38；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:5的
氨基酸10-38；(27)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸15-38；(28)靶向序列包含SEQ ID 
NO:5的氨基酸20-38； (29)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-28；(30)靶向序列包含
SEQ ID NO:7的氨基酸13-28；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:7；(32)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的氨基酸序列；(33)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸2-
28；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:7 的氨基酸5-28；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸8-28；(36)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸10-28；(37)靶向序列包含SEQ ID NO: 9
的氨基酸1-24；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸9-24；(39) 靶向序列包含SEQ ID NO:9；(40)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少85％同一性的氨基酸序列；(41)靶向
序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸2-24；(42)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；(43)
靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸8-24；(44)靶向序列包含SEQ ID NO:11 的氨基酸1-
33；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸18-33；(46) 靶向序列包含SEQ ID NO:11；
(47)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:12具有至少85％同一性的氨基酸序列；(48)靶向序列包
含SEQ ID NO:11的氨基酸2-33；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(50)靶向
序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33；(51)靶向序列包含SEQ ID NO:11 的氨基酸10-33；
(52)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸15-33；(53) 靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基
酸1-33；(54)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸18-33；(55)靶向序列包含SEQ ID NO:
13；(56)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:14具有至少85％同一性的氨基酸序列；(57)靶向序
列包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:13 的氨基酸5-33；(59)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；(60)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸10-
33；(61)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(62)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸1-43； (63)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸28-43；(64)靶向序列包含 SEQ ID 
NO:15；(65)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:16具有至少85％同一性的氨基酸序列；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸2-43；(67) 靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸5-43；
(68)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸
10-43； (70)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；(71)靶向序列包含 SEQ ID NO:
15的氨基酸20-43；(72)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-27；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸12-27；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:17；(76)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:18具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(77)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸2-27；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨
基酸5-27；(79)靶向序列包含SEQ ID NO:17 的氨基酸8-27；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:
17的氨基酸10-27；(81) 靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸1-33；(82)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸18-33；(83)靶向序列包含SEQ ID NO:19；(84)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:20具有至少85％同一性的氨基酸序列；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-33；
(86)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸5-33；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基
酸8-33；(88) 靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸10-33；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:
19的氨基酸15-33；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸1-33； (91)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸18-33；(92)靶向序列包含 SEQ ID NO:21；(93)外孢壁蛋白包含与SEQ 
ID NO:22具有至少85％同一性的氨基酸序列；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸2-
33；(95) 靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(96)靶向序列包含SEQ IDNO:21的氨
基酸8-33；(97)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸10-33； (98)靶向序列包含SEQ ID 
NO:21的氨基酸15-33；(99)靶向序列包含 SEQ ID NO:23的氨基酸1-24；(100)靶向序列SEQ ID NO:23的氨基酸 9-24；(101)靶向序列包含SEQ ID NO:23；(102)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:24具有至少85％同一性的氨基酸序列；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸
2-24；(104)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸 5-24；(105)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(106)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸1-24；(107)靶向序列包含SEQ 
ID NO:25 的氨基酸9-24；(108)靶向序列包含SEQ ID NO:25；(109)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:26具有至少85％同一性的氨基酸序列；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸
2-24；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:25 的氨基酸5-24；(112)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-24；(113) 靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸1-30；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸15-30；(115)靶向序列包含SEQ ID NO:27；(116)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:28具有至少85％同一性的氨基酸序列；(117) 靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸
2-30；(118)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(119)靶向序列包含SEQ ID NO:27
的氨基酸8-30； (120)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30；(121)靶向序列包含 
SEQ ID NO:29的氨基酸1-33；(122)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸18-33；(123)靶向序列包含SEQ ID NO:29；(124)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:30具有至少85％同一性的氨
基酸序列；(125)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸2-33；(126)靶向序列包含SEQ ID 
NO:29的氨基酸5-33；(127)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(128)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；(129)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(130)靶
向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸 1-24；(131)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸9-
24；(132)靶向序列包含SEQ ID NO:31；(133)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:32具有至少 
85％同一性的氨基酸序列；(134)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸 2-24；(135)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸5-24；(136)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；
(137)靶向序列包含SEQ ID NO:33 的氨基酸1-15；(138)靶向序列包含SEQ ID NO:33；
(139)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:34具有至少85％同一性的氨基酸序列；(140)靶向序列
包含SEQ ID NO:35的氨基酸1-16；(141)靶向序列包含SEQ ID NO:35； (142)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:36具有至少85％同一性的氨基酸序列；(143)靶向序列包含SEQ ID NO:43
的氨基酸1-29；(144)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸14-29；(145)靶向序列包含SEQ ID NO:43； (146)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:44具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(147)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-29；(148)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基
酸5-29；(149)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(150)靶向序列包含SEQ ID NO:
43的氨基酸10-29；(151) 靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸1-35；(152)靶向序列包含
SEQ ID NO:45的氨基酸20-35；(153)靶向序列包含SEQ ID NO:45；(154)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:46具有至少85％同一性的氨基酸序列；(155) 靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨
基酸2-35；(156)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(157)靶向序列包含SEQ ID 
NO:45的氨基酸8-35； (158)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸10-35；(159)靶向序列包含 SEQ ID NO:45的氨基酸15-35；(160)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸1-43；(161)
靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸28-43；(162) 靶向序列包含SEQ ID NO:47；(163)外
孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:48 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(164)靶向序列包含
SEQ ID NO:47 的氨基酸2-43；(165)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(166) 靶
向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(167)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸10-
43；(168)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 15-43；(169)靶向序列包含SEQ ID NO:47
的氨基酸20-43；(170)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(171)靶向序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸1-32；(172)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸17-32； (173)靶向序列包含SEQ ID NO:49；(174)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:50具有至少85％同一性的氨基
酸序列；(175)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸2-32；(176)靶向序列包含SEQ ID NO:
49的氨基酸5-32； (177)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(178)靶向序列包含 
SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(179)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸15-32；(180)靶
向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸1-33；(181) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸18-
33；(182)靶向序列包含SEQ ID NO:51；(183)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:52具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(184)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸2-33；(185) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(186)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸8-33；
(187)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸 10-33；(188)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨
基酸15-33；(189)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸1-33；(190)靶向序列包含SEQ ID 
NO: 53的氨基酸18-33；(191)靶向序列包含SEQ ID NO:53；(192)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:54具有至少85％同一性的氨基酸序列；(193)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-
33；(194)靶向序列包含SEQ ID NO: 53的氨基酸5-33；(195)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-33； (196)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(197)靶向序列包含 SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；(198)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸1-30；(199)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸15-30；(200) 靶向序列包含SEQ ID NO:55；(201)外孢壁蛋白
包含与SEQ ID NO:56 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(202)靶向序列包含SEQ ID NO:
55 的氨基酸2-30；(203)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；(204) 靶向序列包含
SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；(205)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸10-30；(206)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 1-130；(207)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸115-
130；(208)靶向序列包含SEQ ID NO:57；(209)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(210)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸2-130；(211)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130；(212) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-130；
(213)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸20-130；(214)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨
基酸30-130；(215)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130；(216) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(217)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸60-130；(218)靶向
序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130；(219)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-
130；(220) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；(221)靶向序列包含SEQ ID NO:
57的氨基酸100-130；(222)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-130；(223)外孢壁蛋
白片段包含与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列；(224)靶向序列包含SEQ 
ID NO:96；(225)靶向序列包含SEQ ID NO:97；(226)靶向序列包含SEQ ID NO:98；(227)靶向序列包含SEQ ID NO:99；(228)靶向序列包含SEQ ID NO:100；(229) 靶向序列包含SEQ 
ID NO:101；(230)靶向序列包含SEQ ID NO:102； (231)靶向序列包含SEQ ID NO:103；
(232)靶向序列包含SEQ ID NO: 104；(233)靶向序列包含SEQ ID NO:105；(234)靶向序列
包含SEQ ID NO:106；(235)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:108具有至少85％同一性的氨基
酸序列；(236)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:109具有至少85％同一性的氨基酸序列；(237)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:110具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(238)外孢壁蛋白
包含与SEQ ID NO:111具有至少85％同一性的氨基酸序列；(239)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:112 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(240)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 113具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(241)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:114具有至少85％同一
性的氨基酸序列；(242)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:115具有至少85％同一性的氨基酸
序列；(243)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:116具有至少85％同一性的氨基酸序列；(244)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:117具有至少85％同一性的氨基酸序列；(245) 外孢壁蛋白包
含与SEQ ID NO:118具有至少85％同一性的氨基酸序列； (246)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:119具有至少85％同一性的氨基酸序列；(247)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:120具有至
少85％同一性的氨基酸序列；(248)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:121具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(249)靶向序列包含氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸 22-31；(250)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-33；(251)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-31；(252)靶
向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸14-23；(253)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸14-
25；(254) 靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-23；(255)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸1-30；(256)靶向序列包含SEQ ID NO:59；(257)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:60具
有至少85％同一性的氨基酸序列；(258) 靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸2-30；(259)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸4-30；(260)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸6-
30；(261)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸1-33；(262)靶向序列包含 SEQ ID NO:61的氨基酸18-33；(263)靶向序列包含SEQ ID NO:61； (264)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:62
具有至少85％同一性的氨基酸序列；(265)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸2-33；
(266)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸5-33；(267)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基
酸10-33；(268)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸15-33；(269) 靶向序列包含SEQ ID 
NO:63的氨基酸1-35；(270)靶向序列包含SEQ ID NO:63；(271)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:64具有至少85％同一性的氨基酸序列；(272)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸2-
35；(273)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸5-35；(274)靶向序列包含SEQ ID NO:63的
氨基酸8-35；(275)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸 10-35；(276)靶向序列包含SEQ 
ID NO:63的氨基酸15-35；(277)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸1-24；(278)靶向序列包含SEQ ID NO: 65的氨基酸9-24；(279)靶向序列包含SEQ ID NO:65；(280)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:66具有至少85％同一性的氨基酸序列；(281)靶向序列包含SEQ ID NO:
107；(282)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸 2-24；(283)靶向序列包含SEQ ID NO:65
的氨基酸5-24；(284)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸1-27；(285)靶向序列包含SEQ 
ID NO:67 的氨基酸12-27；(286)靶向序列包含SEQ ID NO:67；(287)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:68具有至少85％同一性的氨基酸序列；(288)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸
2-27；(289)靶向序列包含SEQ ID NO: 67的氨基酸5-27；(290)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸10-27； (291)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸1-38；(292)靶向序列包含 
SEQ ID NO:69的氨基酸23-38；(293)靶向序列包含SEQ ID NO:69； (294)外孢壁蛋白包含
与SEQ ID NO:70具有至少85％同一性的氨基酸序列；(295)靶向序列包含SEQ ID NO:69的
氨基酸2-38；(296)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸5-38；(297)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸10-38；(298)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸15-38；(299) 外孢壁蛋
白包含SEQ ID NO:72；(300)靶向序列包含SEQ ID NO:73； (301)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:74具有至少95％同一性的氨基酸序列；(302)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸1-
42；(303)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-42；(304)靶向序列包含SEQ ID NO:75； (305)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:76具有至少85％同一性的氨基酸序列；(306)靶向序列
包含SEQ ID NO:75的氨基酸2-42；(307)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸5-42；(308)
靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸10-42；(309)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸
15-42；(310) 靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸20-42；(311)靶向序列包含SEQ ID NO:
75的氨基酸25-42；(312)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 1-24；(313)靶向序列包含
SEQ ID NO:7的氨基酸9-24；(314)靶向序列包含SEQ ID NO:77；(315)外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO:78具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(316)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨
基酸 2-24；(317)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-24；(318)外孢壁蛋白包含与SEQ 
ID NO:80具有至少85％同一性的氨基酸序列；(319)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸
1-38；(320)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸23-38；(321)靶向序列包含SEQ ID NO:
81；(322)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:82具有至少85％同一性的氨基酸序列；(323)靶向
序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸2-38；(324)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸5-38；
(325)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸10-38； (326)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨
基酸15-38；(327)靶向序列包含 SEQ ID NO:81的氨基酸20-38；(328)靶向序列包含SEQ ID NO:83的氨基酸1-34；(329)靶向序列包含SEQ ID NO:83；(330)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:84具有至少85％同一性的氨基酸序列；(331)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:86具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(332)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸1-28；(333)靶向序
列包含SEQ ID NO: 87的氨基酸13-28；(334)靶向序列包含SEQ ID NO:87；(335)外孢壁蛋
白包含与SEQ ID NO:88具有至少85％同一性的氨基酸序列；(336)靶向序列包含SEQ ID 
NO:87的氨基酸2-28；(337)靶向序列包含SEQ ID NO: 87的氨基酸5-28；(338)靶向序列包
含SEQ ID NO:87的氨基酸10-28； (339)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸1-28；(340)
靶向序列包含 SEQ ID NO:89；(341)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(342)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸2-28； (343)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸5-28；(344)靶向序列包含 SEQ ID NO:89的氨基酸10-28；(345)靶向序
列包含SEQ ID NO:91的氨基酸1-93；(346)靶向序列包含SEQ ID NO:91；(347)外孢壁蛋白
包含与SEQ ID NO:92具有至少85％同一性的氨基酸序列；(348)靶向序列包含SEQ ID NO:
91的氨基酸2-93；(349)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸10-93；(350)靶向序列包含
SEQ ID NO:91的氨基酸20-93；(351) 靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸30-93；(352)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸40-93；(353)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸 50-
93；(354)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸60-93；(355)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸1-130；(356)靶向序列包含SEQ ID NO: 93；(357)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:94
具有至少85％同一性的氨基酸序列；(358)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸2-130；
(359)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸10-130；(360)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨
基酸20-130；(361)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸 30-130；(362)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:122具有至少85％同一性的氨基酸序列；(363)靶向序列由下列组成：SEQ ID 
NO:1的氨基酸20-33； (364)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸21-33；(365)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸23-31；(366)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:96的氨基酸1-15；(367)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:96的氨基酸1-13；(368)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸12-25；(369)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸
13-25； (370)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸15-23；(371)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:97的氨基酸1-15；(372)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-13；
(373)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸23-36；(374)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸23-34；(375)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸24-36； (376)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸26-34；(377)靶向序列由下列组成：SEQ ID 
NO:7的氨基酸13-26；(378)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸13-24；(379)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸14-26；(380)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸16-24；(381)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-22； (382)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-20；(383)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸
10-22；(384)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸12-20；(385)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:105的氨基酸1-15；(386)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:105的氨基酸1-
13；(387)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸18-31； (388)靶向序列由下列组
成：SEQ ID NO:11的氨基酸18-29；(389)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸19-
31；(390)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-15；(391)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:98的氨基酸1-13；(392)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-31；
(393)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-29； (394)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:13的氨基酸19-31；(395)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸21-29；
(396)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:99的氨基酸1-15；(397)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:99的氨基酸1-13；(398)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸28-41；(399)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸28-39； (400)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸29-41；(401)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸31-39；(402)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:17的氨基酸12-25；(403)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
17的氨基酸13-25；(404)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:100 的氨基酸1-15；(405)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸18-31；(406)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸18-29；(407) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸19-31；(408)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸21-29；(409)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:21的氨基酸18-31；(410)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 21的氨基酸18-29；(411)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸19-31；(412)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸21-29； (413)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:101的氨基酸1-15；(414)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:101的氨基酸1-13；(415)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸9-22；(416)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸9-20；(417)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸10-22；(418)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸
12-20； (419)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:102的氨基酸1-15；(420)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:102的氨基酸1-13；(421)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸9-
22；(422)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸9-20；(423)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:25的氨基酸10-22；(424)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸12-20； (425)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:103的氨基酸1-15；(426)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:103的氨基酸1-13；(427)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸15-28；(428)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸15-26；(429)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27 的氨基酸16-28；(430)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸 18-26；(431)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:104的氨基酸1-15；(432) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:104的氨基酸1-13；(433)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:33的氨基酸1-13；(434)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:33的氨基酸1-11；(435)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 
33的氨基酸3-11；(436)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸 1-14；(437)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸1-12；(438) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸2-14；(439)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:43的氨基酸14-27；(440)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:43的氨基酸14-25；(441)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 43的氨基酸15-27；(442)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸20-33；(443)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸20-31； (444)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸21-33；(445)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:106的氨基酸1-15；(446)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:106的氨基酸1-13；(447)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:47的氨基酸
28-41；(448)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:47 的氨基酸28-39；(449)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸 18-31；(450)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸
18-29；(451) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸19-31；(452)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸18-31；(453)靶向序列包含SEQ ID NO:61 的氨基酸18-29；(454)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸19-31； (455)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸9-22；
(456)靶向序列包含 SEQ ID NO:65的氨基酸9-20；(457)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨
基酸10-22；(458)靶向序列包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-15；(459) 靶向序列包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-13；(460)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸12-25；(461)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸 12-23；(462)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸13-25；(463)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸15-23；(464)靶向序列包含SEQ ID NO: 69的氨基酸
23-36；(465)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸23-34； (466)靶向序列包含SEQ ID NO:
69的氨基酸24-36；(467)靶向序列包含 SEQ ID NO:69的氨基酸26-34；(468)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-40；(469)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-38；(470) 靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸9-22；(471)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸9-20；
(472)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸 10-22；(473)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨
基酸12-20；(474)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸23-36；(475)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸23-34；(476)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸24-36； (477)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸26-34；(478)靶向序列包含 SEQ ID NO:87的氨基酸13-26；
(479)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸13-24；或(480)靶向序列包含SEQ ID NO:87的
氨基酸14-26。

[0457] 例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约 50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。

[0458] 例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％。

[0459] 例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约 50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。

[0460] 例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约 62％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。

[0461] 例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约 75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％。

[0462] 例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约 68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。

[0463] 例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约 75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。

[0464] 例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约 81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％。

[0465] 例如，靶向序列可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约 81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。

[0466] 例如，靶向序列可由下列组成：(a)氨基酸序列由下列组成：16个氨基酸并且与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性，其中与氨基酸25-35的同一性至少约54％；(b)SEQ ID NO:1的氨基酸1-35；(c) SEQ ID NO:1的氨基酸20-35；(d)SEQ ID NO:1；(e)SEQ ID NO:96；或 (f)SEQ ID NO:120。

[0467] 靶向序列可由下列组成：这些例子中所述的氨基酸序列。

[0468] 融合蛋白可以包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，包含与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、 34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、
66、68、 70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、 109、110、111、112、113、
114、115、116、117、118、119、120、 121和122具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0469] 融合蛋白可以包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，包含与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、 34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、
66、68、 70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、 109、110、111、112、113、
114、115、116、117、118、119、120、 121和122具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0470] 融合蛋白可以包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，包含与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、 34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、
66、68、 70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、 109、110、111、112、113、
114、115、116、117、118、119、120、 121和122具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0471] 融合蛋白可以包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，包含与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、 34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、
66、68、 70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、 109、110、111、112、113、
114、115、116、117、118、119、120、 121和122具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0472] 融合蛋白可以包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，包含与SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、 34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、
66、68、 70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、114、
115、116、117、118、119、120、 121和122具有100％同一性的氨基酸序列。

[0473] 融合蛋白可以包含外孢壁蛋白，包含与SEQ ID NO:60、62、64、66、 68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少 90％同一性的氨基酸序列。

[0474] 融合蛋白可以包含外孢壁蛋白，包含与SEQ ID NO:60、62、64、66、 68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少 95％同一性的氨基酸序列。

[0475] 融合蛋白可以包含外孢壁蛋白，包含与SEQ ID NO:60、62、64、66、 68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少 98％同一性的氨基酸序列。

[0476] 融合蛋白可以包含外孢壁蛋白，包含与SEQ ID NO:60、62、64、66、 68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有至少 99％同一性的氨基酸序列。

[0477] 融合蛋白可以包含外孢壁蛋白，包含与SEQ ID NO:60、62、64、66、 68、70、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94或122具有100％同一性的氨基酸序列。

[0478] 融合蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可以在其羧基末端包含氨基酸序列GXT，其中X是任何氨基酸。

[0479] 靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可在对应SEQ ID NO:1的氨基酸20的靶向序列的位置处包含丙氨酸残基。

[0480] 靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段还可在靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的第一氨基酸之前紧邻氨基酸位置或对应SEQ ID NO:1的氨基酸20的靶向序列的
位置处包含甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。

[0481] IX.包含目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白的融合蛋白、重组孢子-包衣形成细菌和使用重组孢子-包衣形成细菌包覆的种子

[0482] A.可用于使包含孢子外壳蛋白的融合蛋白靶向重组孢子-形成细菌的孢子表面的孢子外壳蛋白

[0483] 一些孢子外壳蛋白可用于在重组孢子-形成细菌的孢子表面上呈现目标蛋白或肽。这种细菌包括任何孢子-形成细菌，特别包括genuses杆菌、 Lysinibacillus、
Virginibacillus、Clostridia和Paenibacillus的孢子-形成细菌。genus杆菌的孢子-形成细菌包括蜡样芽胞杆菌家族成员以及其他不属于蜡样芽孢杆菌家族成员的杆菌种(例如缺
少外孢壁的杆菌种细菌)。这些孢子外壳蛋白包括CotB、CotC、CgeA、CotB/H、CotG、孢子外壳蛋白X和CotY。为了便于参考，可以用于将目标蛋白或肽靶向重组孢子形成细菌的示范性孢子外壳蛋白的氨基酸序列以及它们的SEQ ID NO的描述在下面的表7中提供。

[0484] 表7.用于使目标蛋白和肽靶向重组孢子-形成细菌的孢子表面孢子外壳蛋白序列

[0485]B.包括目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白的融合蛋白

[0486] 本发明还涉及融合蛋白，包含至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白，其中孢子外壳蛋白包括CotB/H蛋白、孢子蛋白X蛋白或CotY蛋白，其中CotY蛋白包含与SEQ ID NO:
258或259具有至少80％同一性的氨基酸序列。

[0487] 例如，孢子外壳蛋白可包含CotB/H蛋白。

[0488] 例如，孢子外壳蛋白可包括孢子蛋白X蛋白。

[0489] 例如，孢子外壳蛋白可包括CotY蛋白，其中CotY蛋白包含与SEQ ID NO:258或259具有至少80％同一性的氨基酸序列。

[0490] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:255、257、258或259具有至少 85％同一性的氨基酸序列。

[0491] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:255、257、258或259具有至少 90％同一性的氨基酸序列。

[0492] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:255、257、258或259具有至少 95％同一性的氨基酸序列。

[0493] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:255、257、258或259具有至少 98％同一性的氨基酸序列。

[0494] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:255、257、258或259具有至少 99％同一性的氨基酸序列。

[0495] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:255、257、258或259具有100％同一性的氨基酸序列。

[0496] B.表达融合蛋白的重组孢子-包衣形成细菌和使用重组孢子-包衣形成细菌包覆的植物种子

[0497] 提供表达章节IX.B中所述的任何融合蛋白的重组孢子-形成细菌。重组孢子-形成细菌可包括内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进性细菌菌
株。

[0498] 本发明进一步涉及表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌，包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白，其中孢子外壳蛋白包括CotB蛋
白、CotC蛋白、CgeA蛋白、CotB/H蛋白、CotG 蛋白、孢子外壳蛋白X蛋白或CotY蛋白；并且其中重组孢子-形成细菌包括内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株、或内生和植物生长-促进性的细菌菌株。

[0499] 融合蛋白在内生细菌菌株中的表达允许将目标蛋白或肽内部递送到植物。内生菌株可以使用各种方法递送到植物，例如内生菌株可以通过种子处理、植物生长介质(例如土壤)的处理、灌溉、施加至植物本身(例如叶片应用于植物的空中部分)来递送。一旦进入植物，细菌繁殖并被植物的内部组织固定。

[0500] 本发明还涉及使用重组孢子-形成细菌包覆的植物种子，其中表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌包含：使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子
外壳蛋白，其中孢子外壳蛋白包括cotB蛋白、CotC 蛋白、CgeA蛋白、CotB/H蛋白、Cot G蛋白、孢子蛋白X蛋白或cotY 蛋白。

[0501] 重组孢子-包衣形成细菌可包括genus杆菌或Lysinibacillus的细菌。

[0502] 本发明进一步涉genus杆菌的重组细菌，其中重组细菌包含重组孢子 -形成细菌，和其中表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一
种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白，其中孢子外壳蛋白包括CotB蛋白、CotC蛋白、CgeA蛋白、CotB/H蛋白、Cot G蛋白、孢子外壳蛋白X蛋白或CotY蛋白。重组孢子-包衣形成细菌表达蛋白酶或核酸酶，其中在相同条件下在genus杆菌的野生型细菌中相比于蛋白酶或核酸酶的
表达，蛋白酶或核酸酶的表达增强，并且其中蛋白酶或核酸酶的表达增强部分或全部灭活
genus杆菌的重组细菌的孢子，或使genus 杆菌的重组细菌的孢子更易于物理或化学灭活。
蛋白酶或核酸酶可以是上面章节V.A中所述的任何蛋白酶或核酸酶，并且可以在上面章节
V.A中所述的任何启动子的控制下表达。本发明进一步涉及使用这种孢子-形成细菌包覆的
植物种子。重组细菌可包括内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-
促进性细菌菌株。

[0503] 在该章节中所述的任何植物种子中，重组孢子-形成细菌可包括内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进性细菌菌株。

[0504] 在任何重组孢子-形成细菌或种子中，内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进性细菌菌株可包括巨大芽孢杆菌 EE385、杆菌EE387、环状芽孢杆
菌EE388、枯草芽胞杆菌EE405、 Lysinibacillus fusiformis EE442或Lysinibacillus 
sphaericus EE443、短小芽孢杆菌EE-B00143、枯草芽胞杆菌EE148、枯草芽胞杆菌EE218或巨大芽孢杆菌EE281。例如，内生细菌菌株可包括枯草芽胞杆菌EE405 或巨大芽孢杆菌
EE385。

[0505] 或者，内生菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进性细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员 EE439、苏云金芽孢杆菌
EE417、蜡样芽胞杆菌EE444或苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员 EE-B00377、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366、蕈状芽孢杆菌EE-B00363、蕈状芽孢杆菌BT155、蕈状芽孢杆菌EE118、蕈状芽孢杆菌EE141、蕈状芽孢杆菌BT46-3、蜡样芽胞杆菌家族成员EE128、苏云金芽孢杆菌 BT013A或蜡样芽胞杆菌家族成员EE349。

[0506] 在任何重组孢子-形成细菌或种子中，孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0507] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0508] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0509] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0510] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0511] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有100％同一性的氨基酸序列。

[0512] 还提供表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌，包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和蛋白。重组孢子-形成细菌不是重组蜡样芽胞杆菌家族成员。
使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35、SEQ ID NO:96或
与SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0513] 使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的蛋白可包含与SEQ ID NO:108、 SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121 具有至少90％同一性的氨基酸序
列。

[0514] 使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的蛋白可包含与SEQ ID NO:108、 SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121 具有至少95％同一性的氨基酸序
列。

[0515] 使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的蛋白可包含与SEQ ID NO:108、 SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121 具有至少98％同一性的氨基酸序
列。

[0516] 使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的蛋白可包含与SEQ ID NO:108、 SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121 具有至少99％同一性的氨基酸序
列。

[0517] 使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的蛋白可包含与SEQ ID NO:108、 SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121 具有100％同一性的氨基酸序列。

[0518] 例如，使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的蛋白可包含SEQ ID NO:1 的氨基酸20-35、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:120 或SEQ ID NO:121。

[0519] 重组-孢子形成细菌包括内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进性细菌菌株。例如，内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生
长-促进性细菌菌株包括巨大芽孢杆菌EE385、杆菌sp.EE387、环状芽孢杆菌EE388、枯草芽胞杆菌EE405、Lysinibacillusfusiformis EE442、Lysinibacillussphaericus EE443、杆菌 pumilus EE-B00143、枯草芽胞杆菌EE148、枯草芽胞杆菌EE218或巨大芽孢杆菌EE281。
内生细菌菌株优选包括杆菌sp.EE387。

[0520] X.制备融合蛋白的方法

[0521] 本文描述的任何融合蛋白可以使用本领域已知的标准克隆和分子生物学方法制备。例如，编码目标蛋白或肽的基因(例如编码植物生长刺激蛋白或肽的基因)可以通过聚
合酶链反应(PCR)扩增并连接到编码任何上述靶向序列的外部DNA孢囊蛋白、外孢壁蛋白片
段或孢子外壳蛋白，形成编码融合蛋白的DNA分子。编码融合蛋白的DNA分子可以克隆到任
何合适的载体中，例如质粒载体。载体合适地包含可以容易地插入编码融合蛋白的DNA分子的多克隆位点。载体还适当地含有选择表标记，例如抗生素抗性基因，使得可以容易地鉴定和分离转化，转染或与载体配对的细菌。当载体是质粒时，质粒合适地还包含复制起点。或者，融合蛋白的 DNA编码可以整合到蜡样芽孢杆菌家族成员或孢子形成细菌宿主的染色体
DNA中。

[0522] XI.可以纳入在融合蛋白中的标签、标记和接头

[0523] 本文所述任何融合蛋白还可包含另外的多肽序列，所述多肽序列不是靶向序列、外孢壁蛋白、外孢壁蛋白片段、或植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽、或植物结合蛋白或肽的部分。举例来说，融合蛋白可包括标签或标记以促进融合蛋白的纯化或可视(例如，聚组氨酸标签或荧光蛋白如GFP或
YFP) 或表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的可视。

[0524] 使用本文所述的靶向序列、外孢壁蛋白外孢壁蛋白片段和孢子外壳蛋白在蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁上或孢子-形成细菌的孢子表面上增强融合蛋白的表达，这是由
于在这些序列的氨基端中缺乏二级结构，这允许融合蛋白的天然折叠和活性的保留。适当
的折叠可通过在靶向序列、外孢壁蛋白、外孢壁蛋白片段、孢子外壳蛋白以及目标蛋白或肽之间纳入短的氨基酸接头来进一步增强。

[0525] 因此，本文所述的任何融合蛋白可在靶向序列、外孢壁蛋白、外孢壁蛋白片段、或孢子外壳蛋白以及目标蛋白或肽之间包含氨基酸接头。

[0526] 接头可包括聚丙氨酸接头或聚甘氨酸接头。还可使用包含丙氨酸与甘氨酸残基两者的混合物的接头。

[0527] 举例来说，在靶向序列包含SEQ IDNO:1的融合蛋白中，融合蛋白可具有以下结构中的一种：

[0528] 无接头:SEQ ID NO:1-POI

[0529] 丙氨酸接头:SEQ ID NO:1-An-POI

[0530] 甘氨酸接头:SEQ ID NO:1-Gn-POI

[0531] 混合丙氨酸和甘氨酸接头:SEQ ID NO:1-(A/G)n-POI

[0532] 其中An、Gn、及(A/G)n分别是任意数目的丙氨酸、任意数目的甘氨酸、或任意数目的丙氨酸与甘氨酸的混合物。例如，n可以是1至25，且优选地是6至10。当接头包含丙氨酸与甘氨酸残基的混合物时，可使用甘氨酸与丙氨酸残基的任何组合。在以上结构中，“POI”代表目标蛋白或肽。

[0533] 可选择地或另外，接头可包含蛋白酶识别位点。纳入蛋白酶识别位点允许在暴露于识别蛋白酶识别位点的蛋白酶后，便靶向移除目标蛋白或肽。

[0534] XII.目标蛋白和肽

[0535] 目标蛋白或肽可以包括Y蛋白或肽。

[0536] 本文所述融合蛋白中的目标蛋白或肽可包括例如:(a)植物生长刺激蛋白或肽；(b)保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽；(c)提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽；(d)植物结合蛋白或肽；(e)催化一氧化氮产生的酶；(f) 核酸结合蛋白或肽；或(g)改变植物成分的植物信号传导分子或蛋白或肽； (h)抗原；(i)修复酶；(j)适于在水力压裂流体中破裂乳液或胶体的酶；或(k) 抗菌性蛋白或肽。

[0537] A.植物生长刺激蛋白或肽

[0538] 目标蛋白或肽可包括植物生长刺激蛋白或肽，

[0539] 植物生长刺激蛋白或肽可包括肽激素、非-激素肽、涉及植物生长刺激化合物产生或活化的酶、或降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶。

[0540] 例如，植物生长刺激蛋白或肽可包括肽激素。

[0541] 肽激素可包括植物磺肽素(例如植物磺肽素-α)、clavata3(CLV3)、系统素、ZmlGF、或SCR/SP11。

[0542] 植物生长刺激蛋白或肽可包括非-激素肽。

[0543] 非-激素肽可包括RKN16D10、Hg-Syv46、eNOD40肽、蜂毒肽、肥大脱粒肽、Mas7、RHPP、POLARIS、或kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI)。

[0544] 植物生长刺激蛋白或肽可包括植物生长刺激化合物的产生或活化中所涉及的酶。植物生长刺激化合物的产生或活化中所涉及的酶可以是催化刺激植物生长或改变植物结
构的化合物的生物合成途径中的任何步骤的任何酶，或催化刺激植物生长或改变植物结构
的非活性或活性较小的化合物衍生物转化为活性或活性较大形式的化合物的任何酶。

[0545] 植物生长刺激化合物可包括由根际中的细菌或真菌产生的化合物，例如2,3-丁二醇。

[0546] 或者，植物生长刺激化合物可包括植物生长激素。

[0547] 植物生长激素可包括细胞分裂素或细胞分裂素衍生物、乙烯、生长素或生长素衍生物、赤霉酸或赤霉酸衍生物、脱落酸或脱落酸衍生物、或茉莉酸或茉莉酸衍生物。

[0548] 当植物生长刺激化合物包括细胞分裂素或细胞分裂素衍生物时，所述细胞分裂素或细胞分裂素衍生物可包括激动素、顺式-玉米素、反式-玉米素、6-苄氨基嘌呤、二羟基玉米素、N6-(D2-异戊烯基)腺嘌呤、玉米素核苷、N6-(D2-异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-顺式-玉米素核苷、顺式-玉米素核苷、反式-玉米素核苷、2-甲硫基-反式-玉米素核苷、玉米素核苷-
5-单磷酸、 N6-甲氨基嘌呤、N6-二甲氨基嘌呤、2'-脱氧玉米素核糖核苷、4-羟基-3- 甲基-反式-2-丁烯基氨基嘌呤、邻topolin、间topolin、苄基腺嘌呤、邻甲基topolin、间甲基
topolin、或其组合。

[0549] 当植物生长刺激化合物包括生长素或生长素衍生物时，所述生长素或生长素衍生物可包括活性生长素、非活性生长素、缀合生长素、天然存在的生长素、或合成生长素、或其组合。例如，生长素或生长素衍生物可包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-乙酰胺、吲哚-3- 乙腈、吲哚-3-乙醇、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-丁酸、苯乙酸、4-氯吲哚-3-乙酸、葡萄糖缀合的生长素或其组合。

[0550] 植物生长刺激化合物的产生或活化中所涉及的酶可包括乙偶姻还原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、二乙酰还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶(例如色氨酸氨基转移酶)、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶
(nitrilehydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、腺苷磷酸异戊烯转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、CYP735A、5'核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺式-反式异构酶、玉米素O-葡萄糖基转移酶、β-葡糖苷酶、顺式-羟化酶、CK顺式-羟化酶、CKN-葡萄糖基转移酶、2,5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉素2B/3B水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脱乙酰甲壳质酶、甲壳质酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、或产生nod 因子(例如nodA、nodB或nodI)中所涉及的酶。

[0551] 当所述酶包括蛋白酶或肽酶时，所述蛋白酶或肽酶可以是裂解蛋白、肽、原蛋白、或前原蛋白以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶。生物活性肽可以是发挥生物活性的任何肽。

[0552] 生物活性肽的实例包括RKN16D10和RHPP。

[0553] 裂解蛋白、肽、原蛋白、或前原蛋白以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶可包括枯草芽孢杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、或金属蛋白酶。

[0554] 蛋白酶或肽酶可裂解富含蛋白质的粗粉(例如，大豆粉或酵母提取物) 中的蛋白质。

[0555] 如果酶包括壳聚糖酶，壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有至少 85％同一性的氨基酸序列。

[0556] 壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0557] 壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0558] 壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0559] 壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0560] 壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有100％同一性的氨基酸序列。

[0561] 例如，融合蛋白可以包含BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO:1的氨基酸20-35)作为靶向序列，和氨基酸序列包含SEQ ID NO:313作为特异于细菌或真菌的细胞组分的酶。融合蛋白还可包含在靶向序列和酶之间的接头(例如聚丙氨酸接头)。

[0562] 植物生长刺激蛋白或肽可包括降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶。

[0563] 降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶可包括纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质酶、葡萄糖苷酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、尿素酶、木聚糖酶、以及铁载体。

[0564] 当被引入植物生长介质中或施用于植物、种子、或植物或植物种子周围的区域时，包含降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶的融合蛋白可有助于植物附近的营养素的加工并且增强植物或植物附近的有益的细菌或真菌对营养素的摄取。

[0565] 降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶可包括纤维素酶。

[0566] 纤维素酶可包括内切纤维素酶(例如内切葡聚糖酶，如枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶、苏云金芽孢杆菌内切葡聚糖酶、蜡样芽胞杆菌内切葡聚糖酶或杆菌clausii内切葡聚糖酶)、外切纤维素酶(例如Trichoderma reesei外切纤维素酶)或β-葡萄糖苷酶(例如枯草芽胞杆菌β-葡萄糖苷酶、苏云金芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶、蜡样芽胞杆菌β-葡萄糖苷酶或杆菌clausiiβ-葡萄糖苷酶)。纤维素酶优选包括枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶。

[0567] 内切葡聚糖酶可包含与SEQ ID NO:311具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0568] 内切葡聚糖酶可包含与SEQ ID NO:311具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0569] 内切葡聚糖酶可包含与SEQ ID NO:311具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0570] 内切葡聚糖酶可包含与SEQ ID NO:311具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0571] 内切葡聚糖酶可包含与SEQ ID NO:311具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0572] 内切葡聚糖酶可包含与SEQ ID NO:311具有100％同一性的氨基酸序列。

[0573] 例如，融合蛋白可以包含BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO:1的氨基酸20-35)作为靶向序列、以及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列作为降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶。融合蛋白还可包含在靶向序列和酶之间的接头(例如聚丙氨酸接头)。

[0574] 降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶可包括脂肪酶(例如枯草芽胞杆菌脂肪酶、苏云金芽孢杆菌脂肪酶、蜡样芽胞杆菌脂肪酶或杆菌clausii脂肪酶)。

[0575] 降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶可包括木质素氧化酶。例如，木质素氧化酶可包括木质素过氧化物酶、虫漆酶、乙二醛氧化酶、木质素酶以及锰过氧化物酶。

[0576] 降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶可包括蛋白酶。例如，蛋白酶可包括枯草芽孢杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶、肽酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸盐蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。

[0577] 降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶可包括磷酸酶。例如，磷酸酶可包括磷酸单酯水解酶、磷酸单酯酶(例如PhoA4)、磷酸二酯水解酶、磷酸二酯酶、三磷酸单酯水解酶、磷酰酸酐水解酶、焦磷酸酶、肌醇六磷酸酶(例如，枯草芽孢杆菌EE148肌醇六磷酸酶或苏云金芽孢杆菌BT013A 肌醇六磷酸酶)、三偏磷酸酶或三磷酸酶。

[0578] 降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶可包括固氮酶。例如固氮酶可包括Nif家族固氮酶(例如马赛类芽孢杆菌NifBDEHKNXV)。

[0579] 降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶可包括磷脂酶。例如，磷脂酶可包括磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D或溶血磷脂酶。磷脂酶优选包括磷脂酶C。

[0580] 磷脂酶C可包含与SEQ ID NO:312具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0581] 磷脂酶C可包含与SEQ ID NO:312具有至少90％同一性的氨基酸序列。.

[0582] 磷脂酶C可包含与SEQ ID NO:312具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0583] 磷脂酶C可包含与SEQ ID NO:312具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0584] 磷脂酶C可包含与SEQ ID NO:312具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0585] 磷脂酶C可包含与SEQ ID NO:312具有100％同一性的氨基酸序列。

[0586] 例如，融合蛋白可以包含BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO:1的氨基酸20-35)作为靶向序列以及包含SEQ ID NO:312的氨基酸序列作为降解或改变细菌、真菌或植物营养源
的酶。融合蛋白还可包含在靶向序列和酶之间的接头(例如聚丙氨酸接头)。

[0587] B.保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽

[0588] 目标蛋白或肽可包括保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽。

[0589] 保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽可包括植物免疫系统增强蛋白或肽。

[0590] 例如，植物免疫系统增强蛋白或肽可包括过敏蛋白、过敏蛋白样蛋白、α-弹性蛋白、β-弹性蛋白、系统素、苯丙氨酸解氨酶、激发素、防卫素、隐地蛋白、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白肽(例如flg22)。

[0591] 保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽可以是具有抗细菌活性、抗真菌活性、或抗细菌和抗真菌活性两者的蛋白或肽。此类蛋白和肽的实例包括细菌素、溶菌酶、溶菌酶肽
(例如LysM)、铁载体、非核糖体活性肽、伴清蛋白、白蛋白、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽(例如LfcinB)、以及TasA。

[0592] 保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽可以是具有杀虫活性、驱虫活性、抑制昆虫或蠕虫捕食、或其组合的蛋白或肽。例如，保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽可包括杀虫细菌毒素(例如，VIP杀虫蛋白)、内毒素、 Cry毒素(例如，来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素)、蛋白酶抑制剂蛋白或肽(例如，胰蛋白酶抑制剂或慈菇蛋白酶抑制剂)、半胱氨酸蛋白酶、或甲壳质酶。当Cry毒素是来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素时，Cry毒素可以是Cry5B蛋白或
Cry21A蛋白。Cry5B和Cry21A兼备杀虫和杀线虫活性。

[0593] 保护植物免受病原体侵害的蛋白可包括酶。例如，酶可包括蛋白酶或内酯酶。蛋白酶和内酯酶可对细菌信号传导分子(例如，细菌内酯高丝氨酸信号传导分子)有特异性。

[0594] 当酶包括内酯酶时，所述内酯酶可包括1,4-内酯酶、2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶、3-氧代己二酸烯醇-内酯酶、放线菌素内酯酶、脱氧柠檬酸 A-环-内酯酶、葡糖酸内酯酶L-鼠李糖-1,4-内酯酶、柠檬苦素-D-环-内酯酶、类固醇-内酯酶、三乙酸酯-内酯酶、或木质-1,4-内酯酶。

[0595] 所述酶还可包括对细菌或真菌的细胞组分有特异性的酶。例如，所述酶可包括β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、壳多糖酶、脱乙酰壳多糖酶样酶、溶细胞酶、肽酶、蛋白酶 (proteinase)、蛋白酶(protease)(例如，碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、或中性蛋白酶)、变溶菌素、葡萄球菌溶血素(stapholysin)、或溶菌酶。

[0596] 如果酶包括壳聚糖酶，壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有至少 85％同一性的氨基酸序列。

[0597] 壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0598] 壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0599] 壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0600] 壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0601] 壳聚糖酶可包含与SEQ ID NO:313具有100％同一性的氨基酸序列。

[0602] 例如，融合蛋白可以包含BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO:1的氨基酸20-35)作为靶向序列、以及包含SEQ ID NO:311的氨基酸序列作为对细菌或真菌的细胞成分具有特异
性的酶。融合蛋白还可包含在靶向序列和酶之间的接头(例如聚丙氨酸接头)。

[0603] 对于任何以上包含保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽的融合蛋白，病原体可包括保护植物免受细菌性病原体、真菌性病原体、蠕虫病原体或昆虫病原体侵害的目标蛋白
或肽。

[0604] 例如，细菌性病原体可包括α-类变形菌、β-类变形菌、γ-类变形菌、或其组合；或其中细菌性病原体包括根癌土壤杆菌、玉米细菌性枯萎病菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、茄科雷尔氏菌、丁香假单胞菌、绿脓假单胞菌、野油菜黄单胞菌、及其组合。

[0605] 保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽可包括保护植物免受蠕虫或昆虫病原体捕食的蛋白或肽。

[0606] 蠕虫或昆虫病原体可包括粘虫、小地老虎、欧洲玉米螟、草地贪夜蛾、切根虫、日本甲虫、小玉米茎蛀虫、玉米象虫、种蝇、结网虫、玉米草螟、南部玉米根虫、南部马铃薯金针虫、普通蛀茎夜蛾、甘蔗犀金龟、蛴螬、甘蓝粉纹夜蛾、棉铃象虫、黄色条纹粘虫、橙足负泥虫、高粱长蝽、蚜虫、甜菜夜蛾、墨西哥豆瓢虫、大豆夜蛾、大豆天牛、或其组合。

[0607] C.提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽

[0608] 目标蛋白或肽可包括提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽。

[0609] 例如，提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽可包括降解胁迫相关化合物的酶。胁迫相关化合物包括但不限于氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、活性氧物质、氧化氮、氧脂素、以及酚醛塑料。具体的活性氧物质包括羟基、过氧化氢、氧、以及超氧化物。

[0610] 降解胁迫相关化合物的酶可包括超氧化物歧化酶、氧化酶、过氧化氢酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、过氧化物酶、抗氧化酶、或抗氧化肽。

[0611] 当降解胁迫相关化合物的酶包括超氧化物歧化酶时，超氧化物歧化酶可包含超氧化物歧化酶1(SODA1)或超氧化物歧化酶2(SODA2)。

[0612] 超氧化物歧化酶可含包与SEQ ID NO:155或156具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0613] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0614] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0615] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0616] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0617] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有100％同一性的氨基酸序列。

[0618] 提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽可包括保护植物免于环境胁迫的蛋白或肽。环境胁迫可包括例如干旱、洪水、热、冰冻、盐、重金属、低pH、高pH或其组合。例如，保护植物免于环境胁迫的蛋白或肽可包括冰核蛋白、脯氨酰肽酶、苯丙氨酸解氨酶、异分支酸合酶、异分支酸丙酮酸裂解酶、或胆碱脱氢酶。

[0619] D.植物结合蛋白或肽

[0620] 目标蛋白或肽可包括植物结合蛋白或肽。植物结合蛋白或肽可以是能特异性地或非特异性地结合至植物的任何部分(例如，植物根部或植物的地上部分，如叶、茎、花或果实)或植物物质的任何蛋白或肽。因此，例如，植物结合蛋白或肽可以是根结合蛋白或肽、或叶结合蛋白或肽。

[0621] 适合的植物结合蛋白及肽包括粘附素(例如根钙粘素)、鞭毛蛋白、 omptin、外源凝集素、扩张蛋白、生物膜结构蛋白(例如TasA或YuaB)、菌毛蛋白、卷曲蛋白
(curlusprotein)、紧密粘附素、侵袭素、凝集素、以及非菌毛蛋白。

[0622] E.催化一氧化氮产生的酶

[0623] 许多植物种类本来不具有较高的发芽率。对于这样的植物，期望提高发芽率。一氧化氮是强大的发芽剂，当存在植物种子附近时会增加发芽。

[0624] 本发明涉及融合蛋白包含，本文所述靶向序列、外孢壁蛋白、外孢壁蛋白片段或孢子外壳蛋白中的任一个、和催化一氧化氮产生合酶的酶。因此，目标蛋白或肽可包括催化一氧化氮产生的酶。包含催化一氧化氮产生的酶的融合蛋白可以在重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌中表达，以将催化一氧化氮产生的酶递送至植物种子、植物、植物生长介质、或植物或植物种子周围的区域，从而刺激发芽。

[0625] 例如，催化一氧化氮产生的酶可包括一氧化氮合酶(例如苏云金芽孢杆菌一氧化氮合酶或枯草芽胞杆菌一氧化氮合酶，如来自苏云金芽孢杆菌 BT013A或枯草芽胞杆菌168
的一氧化氮合酶)或精氨酸酶。

[0626] 例如，一氧化氮合酶可包含下面表8中所述的一个氨基酸序列。

[0627] 表8.示例性一氧化氮合酶序列

[0628]一氧化氮合酶 SEQ ID NO.
枯草芽胞杆菌一氧化氮合成酶 260
苏云金芽孢杆菌一氧化氮合成酶 261

[0629] 一氧化氮合酶还可包含与上面表8所示的一氧化氮合酶序列具有高度序列同一性的序列。例如，一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261 具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

[0630] 一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

[0631] 一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

[0632] 一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。

[0633] 一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。

[0634] 一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261具有100％序列同一性的氨基酸序列。

[0635] 当目标蛋白或肽包括一氧化氮合酶时，融合蛋白可以包含下表9中所示的一种氨基酸序列。在下表9中所示的序列中，靶序列以粗体表示，六氨基酸丙氨酸接头由下划线表示，一氧化氮合酶的序列用纯文本表示。因此，融合蛋白可以包含SEQ ID NO:262或263。

[0636] 表9.包含一氧化氮合酶的示例性融合蛋白

[0637]

[0638] 来自多个种包括苏云金芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和蕈状芽孢杆菌的一氧化氮合酶可在融合蛋白中用作目标蛋白或肽。

[0639] F.核酸结合蛋白和肽

[0640] 将核酸递送到田地植物是理想的，但是在引入环境(例如植物生长介质例如土壤)时迅速降解，这受到核酸的不稳定性阻碍。

[0641] 本发明涉及包含本文所述任何靶向序列、外孢壁蛋白、外孢壁蛋白片段或孢子外壳蛋白的融合蛋白和核酸结合蛋白或肽。这种融合蛋白稳定核酸并可用于将核酸递送到土
壤和/或植物。

[0642] 因此，目标蛋白或肽可包括核酸结合蛋白或肽。例如，核酸结合蛋白或肽可包括RNA结合蛋白或肽或DNA结合蛋白或肽。

[0643] RNA结合蛋白或肽可包括非特异性RNA结合蛋白或肽或特异性 RNA结合蛋白或肽。

[0644] 例如，RNA结合肽可包含Hfq蛋白(例如苏云金芽孢杆菌Hqf蛋白)。

[0645] DNA结合蛋白或肽可包括小酸溶性孢子蛋白(SASP)。例如，SASP 可包括由下列基因编码的SASP：SspA基因SspB基因、SspC基因、SspD 基因、SspE基因、SspF基因、SspG基因、SspH基因、SspI基因、SspJ 基因、SspK基因、SspL基因、SspM基因、SspN基因、SspO基因或 SspP基因。例如，SASP可包括SASPα、SASPβ或SASPγ。SASP可包括苏云金芽孢杆菌SASP。

[0646] 核酸结合蛋白可包含下表10中所述的一种氨基酸序列。

[0647] 表10.示例性SASP和Hfq序列

[0648]融合蛋白 SEQ ID NO.
SASPα 264
SASPγ 265
Hfq 266

[0649] 核酸结合蛋白还可包含与上面表10中所示的任一序列具有高度序列同一性的序列。例如，核酸结合蛋白可包含与SEQ ID NO:264-266中任一个具有至少85％同一性的核酸序列。

[0650] 核酸结合蛋白可包含与SEQ ID NO:264-266中任一个具有至少90％同一性的核酸序列。

[0651] 核酸结合蛋白可包含与SEQ ID NO:264-266中任一个具有至少95％同一性的核酸序列。

[0652] 核酸结合蛋白可包含与SEQ ID NO:264-266中任一个具有至少98％同一性的核酸序列。

[0653] 核酸结合蛋白可包含与SEQ ID NO:264-266中任一个具有至少99％同一性的核酸序列。

[0654] 核酸结合蛋白可包含与SEQ ID NO:264-266中任一个具有100％同一性的核酸序列。

[0655] 例如，当目标蛋白或肽包含核酸结合蛋白或肽时，融合蛋白可以包含下表11中所示的一种氨基酸序列。在下表11中所示的序列中，靶序列以粗体表示，六氨基酸丙氨酸接头由下划线表示，核酸结合蛋白或肽(SASP α、SASPβ或Hfq)以纯文本显示。因此，例如，融合蛋白可以包含SEQ ID NO:267、268或269。

[0656] 表11.包含核酸结合蛋白的示例性融合蛋白

[0657]

[0658]

[0659] 核酸酶也可用于结合和切割核酸分子。核酸酶对RNA和DNA分子具有高亲和力，并通过将RNA和/或DNA分子切割成更小的RNA和/或DNA 片段来发挥其酶活性。核酸酶可以是
特异性，识别和切割特异性DNA或 RNA序列或非特异性，切割它们接触的任何DNA和/或RNA。
核酸酶可以分为核酸外切酶(从RNA和/或DNA分子的末端切割核苷酸的核酸酶) 或核酸内
切酶(在多核苷酸链中切割磷酸二酯键的核酸酶)。每个核酸酶具有包含特定的氨基酸的活
性位点，该氨基酸用于催化核酸分子的裂解。这些活性位点的突变可以使活性位点失活，并且允许核酸酶与其核酸底物的高亲和力结合，而不会裂解底物。因此，这种突变体可以结合并稳定核酸分子而不裂解核酸分子。

[0660] 因此，核酸结合蛋白可包含核酸酶(例如具有灭活活性位点的核酸酶)。

[0661] 当目标蛋白或肽包括核酸结合蛋白或肽时，核酸分子可结合核酸结合蛋白或肽。核酸分子可包括例如调节RNA分子、RNAi分子、微RNA、适配体、或编码调节RNA分子、RNAi分子、微小RNA或适体的DNA分子。

[0662] XIII.重组蜡样芽胞杆菌家族成员宿主

[0663] 如上所述，蜡样芽胞杆菌家族成员可以起到表达融合蛋白的宿主，融合蛋白包含使融合蛋白靶向蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片
段；起到表达调节子蛋白的宿主，调节子蛋白调节融合蛋白的表达；可以起到外孢壁酶过表达的宿主；可以基因灭活；或可包括允许收集游离外孢壁的突变或其他基因改变。

[0664] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可共表达上述融合蛋白中的两个或多个。例如，重组蜡样芽胞杆菌家族成员可共表达包括植物结合蛋白或肽的至少一种融合蛋白、连同包括植
物生长刺激蛋白或肽的融合蛋白、包括保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽的融合蛋白、
包括提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽的融合蛋白、包括催化一氧化氮产生的酶的融合蛋
白、或包括核酸结合蛋白或肽的融合蛋白。

[0665] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含能够产生外孢壁的任何杆菌种。例如，重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含炭疽杆菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、  Bacillusgaemokensis、韦氏芽孢杆菌、
Bacillustoyoiensis、或其组合。具体来说，重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。

[0666] 可使用本领域中已知的标准方法(例如电穿孔)将任何蜡样芽孢杆菌家族成员与编码融合蛋白的载体缀合、用所述载体转导或转化。随后可通过本领域中已知的任何方法
筛选细菌以鉴别转化株。例如，当载体包括抗生素抗性基因时，可就抗生素抗性对细菌进行筛选。或者，编码融合蛋白的 DNA可被整合到蜡样芽孢杆菌家族成员宿主的染色体DNA中。
重组蜡样芽孢杆菌家族成员可随后暴露于将诱发孢子形成的条件。用于诱发孢子形成的适
合的条件在本领域中是已知的。例如，可将重组蜡样芽孢杆菌家族成员铺板于琼脂板上，并且在约30℃的温度下孵育若干天(例如3天)。

[0667] 还可适当地使用任何以上种的失活菌株、无毒菌株、或遗传操作的菌株。例如，可使用缺乏Cry毒素的苏云金芽孢杆菌。或者或另外，一旦表达融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族孢子已经产生，它们便可失活以防止一旦使用时的进一步萌芽。可使用本领域中已知的使细菌孢子失活的任何方法。适合的方法包括但不限于热处理、γ辐射、x-射线辐射、UV-A辐射、 UV-B辐射、化学处理(例如，用戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂、或其任何组合处理)、或其组合。或者，可使用来源于非产毒菌株、或遗传上或物理上失活菌株的孢子。

[0668] 许多蜡样芽胞杆菌家族成员菌株具有固有的有益属性。例如，一些菌株具有植物生长促进效果。任何本文所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包括植物生长促进性细菌菌
株。

[0669] 植物生长促进性细菌菌株可包括产生杀虫毒素(例如Cry毒素)、产生杀真菌化合物(例如，β-1,3-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、溶细胞酶、或其组合)、产生杀线虫化合物(例如Cry毒素)、产生杀菌化合物、对一种或多种抗生素有抗性、包含一个或多个自由复制的质粒、结合至植物根部、定殖植物根部、形成生物膜、溶解营养素、分泌有机酸、或其任何组合的细菌菌株。

[0670] 例如，如果重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含植物生长促进性细菌菌株，植物生长-促进性细菌菌株可包括：(a)蕈状芽孢杆菌BT155(NRRL No.B-50921),(b)蕈状芽孢杆菌
EE118(NRRL No.B-50918),(c)蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL No.B-50916),(d)蕈状芽孢杆菌
BT46-3(NRRL No.B-50922),(e)蜡样芽胞杆菌家族成员EE128(NRRL No.B-50917),(f) 苏
云金芽孢杆菌BT013A(NRRL No.B-50924),(g)蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No.B-
50928),(h)蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377 (NRRL B-67119),(i)假蕈状芽孢杆菌EE-
B00366(NRRL B-67120)或(j) 蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)。菌株(a)至(g)各
自2014年3  月10日保藏在美国农业部(USDA)农业科研局(ARS)，地址 
1815NorthUniversityStreet,Peoria,Illinois61604U.S.A.，并且由以括号中提供的NRRL
保藏号鉴别。苏云金芽孢杆菌BT013A也称为苏云金芽孢杆菌4Q7。菌株(h)至(j)各自2015年
8月19日保藏在USDA ARS，并且由以括号中提供的NRRL保藏号鉴别。

[0671] 这些植物生长促进性菌株是从各种茁壮的植物根际中分离并且是由其16S rRNA序列(下面表12中列出)且经由生化测定来鉴别。借助于常规的生物化学和形态指标将菌株
至少鉴别为它们的属名称。用于证实格兰氏阳性菌株如杆菌的生化测定包括在PEA培养基
和营养琼脂上的生长、显微镜检查、在5％和7.5％NaCl培养基上的生长、在pH5和pH9下的生长、在42℃和50℃下的生长、用纤维二糖、乳糖、甘油、葡萄糖、蔗糖、d- 甘露醇以及淀粉发酵后便产生酸的能力；荧光颜料产生；明胶水解；硝酸盐还原作用；过氧化氢酶产生、淀粉水解；氧化酶反应、尿素酶产生及活力。这些菌株的鉴别及其植物生长促进作用的论证进一步在以下实施例中描述。

[0672] 表12.用于植物生长促进性蜡样芽胞杆菌家族成员的部分16S rRNA序列

[0673]菌株 部分16S核糖体RNA序列的SEQ ID NO.
蕈状芽孢杆菌EE118 270
蕈状芽孢杆菌EE141 271
蕈状芽孢杆菌BT46-3 272
蜡样芽胞杆菌家族成员EE128 273
苏云金芽孢杆菌BT013A 274
蜡样芽胞杆菌家族成员EE349 275
蕈状芽孢杆菌BT155 276

[0674] 例如，重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括植物生长促进性细菌菌株，可包括蕈状芽孢杆菌BT155、蕈状芽孢杆菌EE141或苏云金芽孢杆菌 BT013A。

[0675] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含内生细菌菌株。例如，内生细菌菌株可包含蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444或苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366；或蕈状芽孢杆菌EE-B00363。

[0676] 蜡样芽胞杆菌家族成员EE349也是植物生长促进性细菌菌株并且如上所述。如在下面实施例中进一步讨论的，也已经发现蜡样芽胞杆菌家族成员EE349是内生的。

[0677] 蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366；或蕈状芽孢杆菌EE-B00363在下面章节XIV进一步描述。

[0678] 内生细菌菌株可包含蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌 EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377；假蕈状芽孢杆菌 EE-B00366；或蕈状芽孢杆菌EE-B00363。

[0679] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株。如在下面实施例中进一步讨论的，蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366和蕈状芽孢杆菌EE-B00363已经发现能够降解除草剂和/或杀虫
剂。因此，当重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含能够降解除草剂的细菌菌株时，能够降解除草剂的细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377、假
蕈状芽孢杆菌EE-B00366或蕈状芽孢杆菌EE-B00363。

[0680] 能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株可降解磺酰脲除草剂(例如磺胺腙)、芳基三嗪除草剂、麦草畏2,4-D、苯氧基除草剂、除虫菊酯、拟除虫菊酯或其组合。

[0681] 能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株可以是能够降解除虫菊酯的细菌菌株。

[0682] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含益生菌细菌菌株。例如，益生菌细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417或蜡样芽胞杆菌EE444。

[0683] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可在其BclA基因、其CotE基因或其CotO 基因包含灭活突变(例如BclA基因、CotE基因或CotO基因的敲除)。例如，重组蜡样芽胞杆菌家族成员可在其BclA基因包含灭活突变(例如BclA 基因的敲除)。已经发现，融合蛋白在具有这种突变的重组蜡样芽胞杆菌家族成员中表达会导致融合蛋白的表达水平增强。

[0684] XIV.内生细菌菌株

[0685] 本发明进一步涉及内生细菌菌株。虽然根际的许多细菌与植物具有共生关系，但这些细菌中只有一小部分能够内化到植物中并生长内生。如下文实施例所述，从玉米幼苗
中分离出几种蜡样芽胞杆菌家族成员菌株和几种非蜡样芽胞杆菌家族成员细菌菌株，发现
其具有在植物中生长的能力。

[0686] A.内生蜡样芽胞杆菌家族成员

[0687] 本发明涉及具有内生生长能力的细菌的生物学纯细菌培养基。在这些细菌培养基的每个中的细菌菌株可以是:(a)蜡样芽胞杆菌家族成员 EE439(NRRL B-50979)；(b)苏云
金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50974)； (c)蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-50977)；(d)苏云金芽孢杆菌EE319 (NRRL B-50983),(e)苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122)；(f) 蜡样
芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；(g)假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-
67120)；或(h)蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)。菌株(a)至(c)各自2014年9月10日保藏在美国农业部(USDA) 农业科研局(ARS)，地址1815NorthUniversityStreet,Peoria, 
Illinois61604U.S.A.，并且由以括号中提供的NRRL保藏号鉴别。菌株 (d)2014年9月17日
保藏在USDA ARS，并且由以括号中提供的NRRL 保藏号鉴别。菌株(e)至(h各自2015年8月19日保藏在USDA ARS，并且由以括号中提供的NRRL保藏号鉴别。

[0688] 本文公开的新型菌株由16S核糖体RNA(rRNA)序列鉴定。因此，蜡样芽胞杆菌家族成员EE439具有与SEQ ID NO:277的序列具有至少 98％、至少99％或100％序列同一性的
16S核糖体RNA序列。苏云金芽孢杆菌EE417具有与SEQ ID NO:278的序列具有至少98％、至
少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。蜡样芽胞杆菌EE444具有与SEQ ID NO:
279的序列具有至少98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。苏云金芽孢
杆菌EE319具有与SEQ ID NO:280 的序列具有至少98％、至少99％或100％序列同一性的
16S核糖体RNA 序列。苏云金芽孢杆菌EE-B00184具有与SEQ ID NO:301的序列具有至少
98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。蜡样芽胞杆菌家族成员EE-
B00377具有与SEQ ID NO:304的序列具有至少 98％、至少99％或100％序列同一性的16S核
糖体RNA序列。假蕈状芽孢杆菌EE-B00366具有与SEQ ID NO:303的序列具有至少98％、至少 
99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。蕈状芽孢杆菌 EE-B00363(NRRL B-67121)
和细菌具有与SEQ ID NO:302的序列具有至少98％、至少99％或100％序列同一性的16S核
糖体RNA序列。16S rRNA序列列于下表13。

[0689] 表13.蜡样芽胞杆菌家族成员内生菌株的部分16S rRNA序列

[0690]

[0691]

[0692] 本发明进一步涉及生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌 EE444、苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366或蕈状芽孢杆菌EE-B00363的包含一种或多种突变的变体，其中细菌是内生的。

[0693] B.其他内生细菌菌株

[0694] 本发明还涉及具有内生生长能力的其他细菌的生物学纯细菌培养基 (非-蜡样芽胞杆菌家族成员)。这些菌株从玉米幼苗中分离，如下文实施例中详细描述的。

[0695] 在这些细菌培养基的每个中的细菌菌株可以是：(a)巨大芽孢杆菌 EE385(NRRL B-50980),(b)杆菌sp.EE387(NRRL B-50981),(c)环状芽孢杆菌EE388(NRRL B-50982),(d)
枯草芽胞杆菌EE405(NRRL B-50978),(e)Lysinibacillus fusiformis EE442(NRRL B-
50975),(f) Lysinibcaillus sphaericus EE443(NRRL B-50976)或(g)短小芽孢杆菌 EE-
B00143(NRRL B-67123)。菌株(a)至(f)各自2014年9月10日保藏在美国农业部(USDA)农业
科研局(ARS)，地址 1815NorthUniversityStreet,Peoria,Illinois61604U.S.A.，并且由
以括号中提供的NRRL保藏号鉴别。在保藏后杆菌sp.EE387确定为短小芽孢杆菌样菌株。菌
株(g)2015年8月19日保藏在USDA ARS，并且由以括号中提供的NRRL保藏号鉴别。

[0696] 本文公开的新型菌株由16S核糖体RNA(rRNA)序列鉴定。因此，巨大芽孢杆菌EE385具有与SEQ ID NO:281的序列具有至少98％、至少 99％或100％序列同一性的16S核糖体
RNA序列。杆菌sp.EE387具有与SEQ ID NO:282的序列具有至少98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。环状芽孢杆菌EE388具有与SEQ ID NO:283 的序列具有至少
98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA 序列。枯草芽胞杆菌EE405具有与SEQ ID NO:284的序列具有至少98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。
Lysinibacillus fusiformis EE442具有与SEQ ID NO:285的序列具有至少98％、至少99％
或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。Lysinibcaillus sphaericus EE443具有与SEQ 
ID NO:286的序列具有至少98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。短小
芽孢杆菌EE-B00143具有与 SEQ ID NO:305的序列具有至少98％、至少99％或100％序列同
一性的 16S核糖体RNA序列。16s rRNA序列列于下表14。

[0697] 表14.非-蜡样芽胞杆菌家族成员内生菌株的部分16S rRNA序列

[0698]菌株(SEQ ID NO) 部分16S rRNA序列的SEQ ID NO.
巨大芽孢杆菌EE385 281
杆菌sp.EE387 282
环状芽孢杆菌EE388 283
枯草芽胞杆菌EE405 284
Lysinibacillus fusiformis EE442 285
Lysinibcaillus sphaericus EE443 286
短小芽孢杆菌EE-B00143 305

[0699] 本发明进一步涉及生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是巨大芽孢杆菌EE385、杆菌sp.EE387、环状芽孢杆菌EE388、枯草芽胞杆菌EE405、Lysinibacillus 
fusiformis EE442或Lysinibcaillus sphaericus EE443的包含一种或多种突变的变体，
其中细菌是内生的。

[0700] 本发明还涉及生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是巨大芽孢杆菌EE385、杆菌sp.EE387、环状芽孢杆菌EE388、枯草芽胞杆菌EE405、Lysinibacillus 
fusiformis EE442或Lysinibcaillus sphaericus EE443的包含一种或多种突变的变体，
其中细菌是内生的。

[0701] XV.接种剂

[0702] 本发明进一步涉及任何上述部分所述的生物学纯细菌菌株的接种剂。接种剂施加于植物、植物种子、植物生长介质、或植物或植物种子周围的区域，其中接种物包含有效量的任何一种生物学纯细菌培养基和农业上可接受的载体。

[0703] 接种剂可以包含有效量的至少两种前面章节中所述生物学纯细菌培养基的混合物。

[0704] 接种剂可以进一步包含有效量的根茎细菌。根茎细菌可以是根细菌菌株的生物学纯细菌培养基。根瘤细菌可以包括Bradyrhizobium genus细菌(例如Bradyrhizobium 
japonicum)、Rhizobium genus细菌(例如  Rhizobium phaseoli、Rhizobium 
leguminosarum或其组合)或其组合。

[0705] XVI.使用催化一氧化氮产生的酶或过表达催化一氧化氮产生的酶的重组细菌包覆的植物种子

[0706] 还提供使用下列包覆的植物种子:(i)催化一氧化氮产生的酶；(ii)超氧化物歧化酶或(iii)表达催化一氧化氮产生的酶或超氧化物歧化酶的重组微生物，其中在相同条件
下在野生型微生物中相比于催化一氧化氮产生的酶或超氧化物歧化酶的表达，催化一氧化
氮产生的酶或超氧化物歧化酶的表达增强。

[0707] 催化一氧化氮产生的酶可包括一氧化氮合酶或精氨酸酶。

[0708] 催化一氧化氮产生的酶可包括一氧化氮合酶，例如来自苏云金芽孢杆菌BT013A或枯草芽胞杆菌168的一氧化氮合酶。

[0709] 例如，一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

[0710] 一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

[0711] 一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

[0712] 一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。

[0713] 一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。

[0714] 一氧化氮合酶可包含与SEQ ID NO:260或261具有100％序列同一性的氨基酸序列。

[0715] 超氧化物歧化酶可包含超氧化物歧化酶1(SODA1)或超氧化物歧化酶2(SODA2)。

[0716] 超氧化物歧化酶包含与SEQ ID NO:155或156具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0717] 超氧化物歧化酶包含与SEQ ID NO:155或156具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0718] 超氧化物歧化酶包含与SEQ ID NO:155或156具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0719] 超氧化物歧化酶包含与SEQ ID NO:155或156具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0720] 超氧化物歧化酶包含与SEQ ID NO:155或156具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0721] 超氧化物歧化酶包含与SEQ ID NO:155或156具有100％同一性的氨基酸序列。

[0722] 当植物种子包覆有重组微生物时，重组微生物可包括杆菌种、 Escherechia coli、Aspergillus种例如Aspergillus niger、或Sacchromyces 种例如Sacchromyces 
cerevisiae。

[0723] 例如，重组微生物可包括蜡样芽胞杆菌家族成员、枯草芽胞杆菌、地衣形芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。

[0724] 在上面表8中提供用于示例性一氧化氮合成酶的氨基酸序列。在上面表3中提供用于示例性超氧化物歧化酶的氨基酸序列。

[0725] XVII.制剂

[0726] 提供制剂，包含本文所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员、衍生自本文所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段、或本文所述重组孢子 -形成细菌、以及农业上可
接受的载体。

[0727] 农业上可接受的载体可包括添加剂，例如油、树胶、树脂、粘土、聚氧乙二醇、萜烯、粘性有机物、脂肪酸酯、硫酸化醇、烷基磺酸盐、石油磺酸盐、醇硫酸盐、烷基丁烷钠diamate、硫代丁烷二酸钠的聚酯、苯乙腈衍生物、蛋白质性材料或其组合。

[0728] 农业上可接受的载体可包括增稠剂，例如聚乙二醇的长链烷基磺酸酯、聚氧乙烯油酸酯或其组合；表面活性剂，例如重石油、重油馏出物、多元醇脂肪酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酯、芳基烷基聚氧乙二醇、烷基胺乙酸酯、烷基芳基磺酸酯、多元醇、烷基磷酸酯、或其组合；或抗结块剂，例如钠盐(例如一甲基萘磺酸盐的钠盐、二甲基萘磺酸盐的钠盐、亚硫酸钠、硫酸钠或其组合)、碳酸钙、硅藻土、或其组合。

[0729] 添加剂可包括蛋白质性材料，例如乳制品、小麦粉、大豆粉、血液、白蛋白、明胶、苜蓿粉、酵母提取物或其组合。

[0730] 农业上可接受的载体可包括蛭石、木炭、糖厂碳化压滤泥浆、米糠、羧甲基纤维素、泥炭、珍珠岩、细砂、碳酸钙、面粉、明矾、淀粉、滑石、聚乙烯吡咯烷酮或其组合。

[0731] 制剂可包括种子包被制剂、用于向植物或向植物生长介质施用的液体制剂、或用于向植物或植物生长介质施用的固体制剂。种子包被制剂可包括向种子施用的水基或油基
溶液，或者向种子施用的粉末或颗粒制剂。用于向植物或向植物生长介质施用的液体制剂
可包括浓缩制剂或即用制剂。用于向植物或向植物生长介质施用的固体制剂包括颗粒制剂
或粉末剂。

[0732] 制剂还可包含肥料、微量元素肥料、杀虫剂、除草剂、植物生长调理剂、杀真菌剂、杀虫剂、杀螺剂、杀藻剂、细菌菌剂、真菌菌剂或其组合。

[0733] 细菌菌剂可包括根瘤菌属的细菌菌剂、慢生根瘤菌属的细菌菌剂、中慢生根瘤菌属的细菌菌剂、固氮根瘤菌属的细菌菌剂、异根瘤菌属的细菌菌剂、中华根瘤菌属的细菌菌剂、克鲁维菌属的细菌菌剂、固氮菌属的细菌菌剂、假单胞菌属的细菌菌剂、固氮螺菌属的细菌菌剂、杆菌属的细菌菌剂、链霉菌属的细菌菌剂、类芽孢杆菌属的细菌菌剂、副球菌属的细菌菌剂、肠杆菌属的细菌菌剂、产碱杆菌属的细菌菌剂、分支杆菌属的细菌菌剂、木霉属的细菌菌剂、胶霉属的细菌菌剂、球囊霉属的细菌菌剂、克雷伯氏杆菌属的细菌菌剂或其组合。

[0734] 细菌菌剂可包括植物生长促进性细菌菌株。植物生长促进性细菌菌株可产生杀虫毒素、产生杀真菌化合物、产生杀线虫化合物、产生杀菌化合物、对一种或多种抗生素有抗性、包含一个或多个自由复制的质粒、结合至植物根部、定殖植物根部、形成生物膜、溶解营养素、分泌有机酸、或其任何组合的细菌菌株。

[0735] 例如，细菌菌剂可包括阿氏芽孢杆菌CAP53(NRRL号B-50819)、阿氏芽孢杆菌CAP56(NRRL号B-50817)、弯曲芽孢杆菌BT054(NRRL号 B-50816)、球形副球菌NC35(NRRL号B-
50820)、蕈状芽孢杆菌 BT155(NRRL号B-50921)、阴沟肠杆菌CAP12(NRRL号B-50822)、尼氏芽孢杆菌BOBA57(NRRL号NRRLB-50821)、蕈状芽孢杆菌 EE118(NRRL号B-50918)、枯草芽孢
杆菌EE148(NRRL号B-50927)、粪产碱菌EE107(NRRL号B-50920)、蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL
号 B-50916)、蕈状芽孢杆菌BT46-3(NRRL号B-50922)、蜡样芽孢杆菌家族成员EE128(NRRL
号B-50917)、苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRL号 B-50924)、马赛类芽孢杆菌BT23(NRRL号B-
50923)、蜡样芽孢杆菌家族成员EE349(NRRL号B-50928)、枯草芽孢杆菌EE218(NRRL号B-
50926)、巨大芽孢杆菌EE281(NRRL号B-50925)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL号
B-67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL 号B-67120)、蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL号B-67121)、短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL号B-67123)或苏云金芽孢杆菌EE-B00184 (NRRL
号B-67122)或其组合。这些菌株各自保藏在美国农业部(USDA)农业科研局(ARS)，地址在
1815NorthUniversityStreet,Peoria,Illinois61604 U.S.A.，于2013年3月7日(阿氏芽孢
杆菌CAP53、阿氏芽孢杆菌CAP56、弯曲芽孢杆菌BT054、球形副球菌NC35、阴沟肠杆菌CAP12和尼氏芽孢杆菌BOBA57)，于2014年3月10日(蕈状芽孢杆菌BT155、蕈状芽孢杆菌EE118、枯草芽胞杆菌EE148、粪产碱菌EE107、蕈状芽孢杆菌 EE141、蕈状芽孢杆菌BT46-3、蜡样芽胞杆菌家族成员EE128、苏云金芽孢杆菌BT013A、马赛类芽孢杆菌BT23、蜡样芽胞杆菌家族成员 EE349、枯草芽胞杆菌EE218和巨大芽孢杆菌EE281)，或于2015年8 月19日(蜡样芽胞杆
菌家族成员EE-B00377、假蕈状芽孢杆菌 EE-B00366、蕈状芽孢杆菌EE-B00363、短小芽孢杆菌EE-B00143或苏云金芽孢杆菌EE-B00184)，并且由以括号提供的NRRL号鉴别。

[0736] 这些植物生长促进性菌株从各种茁壮的植物的根际中分离并且通过其16SrRNA序列且经由生化测定来鉴别。借助于常规的生物化学和形态指标将菌株至少鉴别为它们的属
名称。用于证实革兰氏阴性菌株如球形副球菌、粪产碱菌及阴沟肠杆菌的生化测定包括在
麦康基氏培养基 (MacConkeymedium)和营养琼脂上生长、显微镜检查、在5％和7.5％NaCl 培养基上生长、在pH5和pH9下生长、在42℃和50℃下生长、用纤维二糖、乳糖、甘油、葡萄糖、蔗糖、d-甘露醇以及淀粉发酵后产生酸的能力；荧光颜料产生；明胶水解；硝酸盐还原作用；
淀粉水解；氧化酶反应、过氧化氢酶产生、尿素酶产生及活力。类似地，用于证实格兰氏阳性菌株如杆菌和类芽孢杆菌的生化测定包括在PEA培养基和营养琼脂上生长、显微镜检查、在
5％和7.5％NaCl培养基上生长、在pH5和pH 9下生长、在42℃和50℃下生长、用纤维二糖、乳糖、甘油、葡萄糖、蔗糖、d- 甘露醇以及淀粉发酵后产生酸的能力；荧光颜料产生；明胶水解；硝酸盐还原作用；过氧化氢酶产生、淀粉水解；氧化酶反应、尿素酶产生及活力。这些菌株的鉴别及其植物生长促进作用的论证进一步在以下实施例中描述。菌株蕈状芽孢杆菌
BT155、蕈状芽孢杆菌EE118、蕈状芽孢杆菌 EE141、蕈状芽孢杆菌BT46-3、蜡样芽胞杆菌家族成员EE128、苏云金芽孢杆菌BT013A和蜡样芽胞杆菌家族成员EE349的部分16S rRNA序列
提供在上面表12。菌株阿氏芽孢杆菌CAP53、阿氏芽孢杆菌CAP56、弯曲芽孢杆菌BT054、球形副球菌NC35、阴沟肠杆菌CAP12、尼氏芽孢杆菌BOBA57、枯草芽胞杆菌EE148、粪产碱菌
EE107、马赛类芽孢杆菌BT23、枯草芽胞杆菌EE218和巨大芽孢杆菌EE281的部分16S rRNA 
序列列于下面的表15。

[0737] 表15.用于另外细菌的植物生长促进性菌株的部分16S rRNA序列

[0738]菌株 部分16S核糖体RNA序列的SEQ ID NO.
阿氏芽孢杆菌CAP53 287
阿氏芽孢杆菌CAP56 288
弯曲芽孢杆菌BT054 289
球形副球菌NC35 290
阴沟肠杆菌CAP12 291
尼氏芽孢杆菌BOBA57 292
枯草芽胞杆菌EE148 293
粪产碱菌EE107 294
马赛类芽孢杆菌BT23 295
枯草芽胞杆菌EE218 296
巨大芽孢杆菌EE281 297

[0739] 例如，制剂包含植物生长促进性细菌菌株，包括球形副球菌NC35、阿氏芽孢杆菌CAP53或巨大芽孢杆菌EE281，其中制剂还包含本文所述任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员，
包括本文重组植物生长促进蜡样芽胞杆菌家族成员菌株(例如重组蕈状芽孢杆菌BT155,蕈
状芽孢杆菌EE141或苏云金芽孢杆菌BT013A)中的任一者。

[0740] 真菌菌剂可包括球囊霉科的真菌菌剂、克劳德球囊霉科 (Claroidoglomeraceae)的真菌菌剂、巨孢囊霉科的真菌菌剂、无梗囊霉科的真菌菌剂、小囊霉科的真菌菌剂、内养囊霉科的真菌菌剂、 Pacidsporaceae的真菌菌剂、多孢囊霉科的真菌菌剂、类球囊霉科的真菌菌剂、原囊霉科的真菌菌剂、地管囊霉科的真菌菌剂、两性囊霉科的真菌菌剂、盾巨孢囊霉科(Scutellosporaceae)的真菌菌剂、Dentiscultataceae 的真菌菌剂、
Racocetraceae的真菌菌剂、担子菌门的真菌菌剂、子囊菌门的真菌菌剂、接合菌门的真菌菌剂或其组合。

[0741] 孢子-形成细菌，单独或与杀虫剂组合，可以进一步包含有效量的至少一种杀真菌剂。

[0742] 典型的杀真菌成分还包括Captan(N-三氯甲基)硫代-4-环己烷-1,2- 二甲酰亚胺)、Fludioxoni 1(4-(2,2-二氟-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基) -1H-吡咯-3-甲氧基苯
胺、多菌灵异二氢二酮(以商品名Rovral.RTM商购)、戊唑醇、噻苯达唑、嘧菌酯、丙氯灵和恶唑酰基(N-(2,6-二甲基苯基) -2-甲氧基-N-(2-氧代-3-恶唑烷基)乙酰胺)。

[0743] 如果制剂、植物种子或接种物包含杀真菌剂，则杀真菌剂可以包括阿霉素、丙丙基、安非他明钾和安曲姆、苯唑嗪、氮杂唑、嘧菌酯、苯菌灵、苯达诺尼、苯菌灵、苯马那丙、苯丙氨酸异丁酯、双丙二酸、苦瓜酸、杀青素-S，boscalid、溴康唑、bupirimate、buthiobate、多硫化钙、capsimycin、 captafol、captan、多菌灵、carvon、quinomethionate、氯哌噻嗪、氯灭唑、氯酮、氯化苦参、百菌清、氯洛他定、clozylacon、cufraneb、cymoxanil、 
cyproconazole、cyprodinil、二氯酚、双氯芬酸、双氯芬酸、二氯咪嗪、二氯吗啉、二恶唑烷、二甲唑咪唑、烯酰吗啉、二恶唑酮、二菌唑、二苯唑唑-M、二硝基苯、二苯胺、二硫代硫酮、二氮草酮、二噻吩、十二聚体、乙嘧磺隆、etridiazole、famoxadon、fenapanil、fenarimol、fenbuconazole、 fenfuram、fenitropan、芬太尼、芬太尼、芬太尼、芬太尼、芬太尼、芬太芬、芬太芬、芬太芬、芬太芬、ferimzone、氟啶胺、flumetover、氟啶、氟康唑、氟苯咪唑、氟替唑、氟磺草胺、氟替尼尔、氟替芬、氟噻唑、氟西汀、呋喃草胺、呋喃、福康唑、呋喃康唑、顺式呋喃甲酸、考扎嗪、六氯苯、己康唑、赞姆沙唑、咪达唑仑、亚氨基辛胺、亚氨基辛胺三乙酸酯、碘代卡巴、异丙肾上腺素(IBP)、异丙肾上腺素、伊马替林、异硫辛烷、异戊二酮、春雷霉素、克雷肟甲酯、铜制剂如：氢氧化铜、环烷酸铜、氯氧化铜、硫酸铜、氧铜铜和波尔多混合物、mancopper、代森锰锌、麻布、 meferimzone、mepanipyrim、mepronil、甲霜灵、metconazole、 methasulfocarb、methfuroxam、metiram、metomeclam、metsulfovax、温霉素、
myclobutanil、myczzolin、二甲基二硫代氨基甲酸镍、硝基硫代异丙基、nararimol、羟肟酸、奥莫卡泊、奥昔康酸、氧卡马西泮、氧氟啶、多效唑、糠酸酯、penconazole、pcurcuron、phosdiphen、pimaricin、胡椒林、多嗪、多莫尼林、丙烯三唑、丙氯灵、腐霉菌、丙酰胺、丙酸钠、丙环唑、丙炔、丙硫嗪、吡喹啉、吡哆醛、嘧霉胺、焦宁碱、pyroxyfur、 quinconazole、quintozene(PCNB)、硫和硫制剂、tebuconazole、tecloftamam、替奈沙芬、tetcyclasis、四康唑、噻菌灵、噻糖、噻吗啉、甲基托布津-甲基、甲苯磺酰胺、三唑酮、三唑醇、三唑并噻唑、三唑盐、三氯丙啶、三环唑、三霉菌、肟菌酯、三氟菌唑、triricine、uniconazole、有效霉素A、伏立唑啉、伏立康唑、唑胺、嗪宁、齐拉姆以及Dagger G、 OK-8705、OK-8801、α-(1,1-二甲基乙基)-(3-(2-苯氧基乙基)-1H-1,2,4- 三唑-1-醇苯酚、α-(2,4-二氯苯基)-[3-3-氟-3-丙基-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、α-(2,4-二氯苯基)-[3-甲氧基-α-甲基-1H-三唑-1-乙醇、α-(5-甲基-1,3- 二恶烷-5-基)-[3-[[4-(三氟甲基)-苯基]-甲基]-1H-1,2,(5RS,6RS)-6- 
羟基-2,2,7,7-四甲基-5-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-3-辛酮、(E)-α-(甲氧基亚氨基)-N-甲
基-2-苯基1-苯基乙酰胺、1-异丙基{2-甲基-1-[[[1-(4-甲基苯基)-乙基]-氨基]-羰基]-
丙基}氨基甲酸叔丁酯、1-(2,4-二氯苯基)-2- (1H-1,2,4-三唑-1-基)-乙酮-O-(苯基甲
基)-肟、1-(2-甲基-1-萘基)-1H- 吡咯-2,5-二酮、1-(3,5-二氯苯基)-3-(2-丙烯基)-2,5-吡咯烷二酮、1-[(二碘甲基)磺酰基]-4-甲基苯、1-[[2-4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-2-
基]-甲基]-1H-咪唑、1-[[2-(4-氯苯基)-3-苯基环氧乙烷基〕甲基〕-1H-1,2，4- 三唑、1-[1-[2-[(2,4-二氯苯基)-甲氧基]-苯基]-乙烯基]-1H-咪唑、1-甲基 -5-壬基-2-(苯基甲
基)3-吡咯烷子基、2',6'-二溴-2-甲基-4'-三氟甲氧基-4'- 三氟-甲基-1,3-噻唑-甲酰苯
胺、2,2-二氯-N-[1-(4-氯苯基)-乙基]-1-乙基 -3-甲基-环丙烷甲酰胺、2,6-二氯-5-(甲
硫基)-4-嘧啶基-硫氰酸酯、2,6- 二氯-N-(4-三氟甲基苄基)-苯甲酰胺、2,6-二氯-N-[[4-(三氟甲基)-苯基]-甲基]-苯甲酰胺、2-(2,3,3-三碘-2-丙烯基)-2H-四唑、2-[(1-甲基乙
基)-膦酰基]-5-(三氯甲基)-1,3,4-噻二唑、2-[[6-脱氧-4-O-(4-O-甲基- (3-D-吡喃葡萄
糖基)-a-D-吡喃葡萄糖基]-氨基]-4-甲氧基-1H-吡咯并 [2,3-d]吡啶-5-甲腈、2-氨基丁
烷、2-溴-2-(溴甲基)戊二腈、2-氯-N-(2,3- 二氢-1,1,3-三甲基-1H-茚-4-基)-3-吡啶甲
酰胺、2-氯-N-(2,6-二甲基苯基) -N-(异硫氰酸基甲基)-乙酰胺、2-苯基苯酚(OPP)、3,4-二氯-1-[4-(二氟甲氧基)-苯基]-吡咯-2,5-二酮、3,5-二氯-N-[氰基[(1-甲基-2-丙炔基) -氧基]-甲基]-苯甲酰胺、3-(1,1-二甲基丙基-1-氧代-1H-茚-2-腈、3-[2-氯苯基)-5-乙氧基-3-异恶唑烷基]-吡啶、4-氯-2-氰基-N、N-二甲基-5-(4- 甲基苯基)-1H-咪唑-1-磺酰
胺、4-甲基-四唑[1,5-a]喹唑啉-5(4H)-酮、 8-(1,1-二甲基乙基)-N-乙基-N-丙基-1,4-二氧杂螺[4,5]癸烷-2-甲胺、8- 羟基喹啉硫酸盐、9H-呫吨-2-[(苯基氨基)-羰基]-9-羧酰
肼、双-(1-甲基乙基)顺-4-(4-氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-环庚醇、顺式-4-[3-[4- (1,1-二甲基丙基)-苯基-2-甲基丙基]-2,6-二甲基-吗啉盐酸盐、[(4-氯苯基)-偶氮]-氰
基乙酸乙酯、碳酸氢钾、甲基四硫醇钠盐、1-(2,3-二氢-2,2- 二甲基-茚-1-基)-1H-咪唑-
5-羧酸甲酯、N-(2,6-二甲基苯基)-N(5-异恶唑基羰基)-DL-丙氨酸甲酯、N-(氯乙酰基)-N-(2,6-二甲基苯基)-DL- 丙氨酸甲酯、N-(2,3-二氯-4-羟基苯基)-1-甲基-环己烷甲酰胺、
N-(2,6- 二甲基苯基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-呋喃基)-乙酰胺、N-(2,6- 二甲基苯
乙基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-噻吩基)-乙酰胺、N-(2- 氯-4-硝基苯基)-4-甲基-3-
硝基-苯磺酰胺、N-(4-环己基苯基)5,6-四氢 -2-嘧啶胺、N-(4-己基苯基)-1,4,5,6-四氢-
2-嘧啶胺、N-(5-氯-2-甲基苯基)-2-甲氧基-N-(2-氧代-3-恶唑烷基)-乙酰胺、N-(6-甲氧
基)-3-吡啶基)-环丙烷甲酰胺、N-[2,2,2-三氯-1-[(氯乙酰基)-氨基]-乙基]-苯甲酰胺、
N-[3-氯-4,5-双(2-丙酰氧基)-苯基]-N'-甲氧基-甲亚胺酰胺、N-甲酰基-N-羟基-DL-丙氨
酸钠盐、O-二乙基[2-(二丙基氨基)-2-氧代乙基]-乙基氨基硫代磷酸酯、甲基S-苯基苯基
丙基磷酰胺硫代磷酸酯、S-苯甲基噻二唑-7-硫代硫酸S-甲酯和螺[2H]-1-苯并吡喃-2,1'
(3'H)-异苯并呋喃]-3'-三氯甲基)硫代-4-环己烷-1,2-二甲酰亚胺、四甲基硫代过氧二碳
二酰胺、 N-(2,6-二甲基苯基)-N-(甲氧基乙酰基)-DL-丙氨酸甲酯、4-(2,2-二氟-1,2-二
氯-3-苯并间二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡咯-3-腈或其组合。

[0744] 另外，合适的杀真菌剂包括下列：(1)能够抑制核酸合成的化合物，如苯霜灵、苯菌灵-M、泛酸、双胍、吡哆醇、二甲苯咪唑、乙嘧磺隆、呋拉西林、咪咪唑、甲霜灵、甲霜灵-M；(2)能够抑制有丝分裂和细胞分裂的化合物，如苯菌灵、多菌灵、二乙基咔唑、依伏菌素、呋菌灵、焦耳菌素、噻虫灵甲基托布津甲酯、唑酰胺；(3)能够抑制呼吸的化合物，例如作为CI-呼吸抑制剂如二氟吗啉；作为CII呼吸抑制剂，如贝卡利、芬夫拉姆、flutolanil、furametpyr、furmecyclox、mepronil、oxycarboxine、 penthiopyrad、thifluzamide；作为CIII-呼吸抑制剂，如异青霉素、嘧菌酯、环唑酰胺、二恶霉素、依那司酮、famoxadone、fenamidone、fluoxastrobin、 kresoxim-methyl、metominostrobin、orysastrobin、picoxystrobin、 trifloxystrobin；(4)能够作为解偶联剂的化合物，如二氮烯、氟啶胺、三甲基脱氧皮子；(5)能够抑制ATP生成的化合物，如醋酸芬汀、氯芬芬、氢氧化芬汀；(6)能够抑制AA和蛋白质生物合成的化合物，如异丙肾上腺素、杀稻瘟素-S、cyprodin、春雷霉素、春雷霉素盐酸水合物、甲苯吡啶、嘧霉胺；(7)能够抑制信号转导的化合物，如芬替尼、喹喔啉；(8) 能够抑制脂质和膜合成的化合物，如联苯、氯洛芬酸、依芬非诺、 etridiazole、碘代卡巴、伊泊芬氟、异二氢噻吩、异环硫烷、腐霉菌、丙酰胺、盐酸普拉莫多、吡唑磷、甲苯磺酰甲基、伏立唑啉；(9)能够抑制麦角甾醇生物合成的化合物，如阿霉素、阿卡康唑、比特坦醇、溴康唑、环丙唑唑、双氯噻唑、二菌唑、迪康唑-M、dodemorph、dodemorph乙酸酯、依可康唑、依康唑、芬那立唑、芬博康唑、芬己酰胺、芬太啶、氟康唑、氟替卡松、氟康唑、氟康唑、氟康唑、氟康唑、顺唑、六氮康唑、咪达唑仑、西咪替尼、伊马替尼、咪康定、环丙唑胺、奈非曲坦、纳利莫尔、奥唑立唑、多效唑、糠酸、康唑、丙氯灵、丙环唑、丙硫菌唑、戊唑醇、特比萘芬、噻卡唑、三唑酮、三唑醇、三头孢烯、三氟菌唑、tripline、 uniconazole、维康唑、伏立康唑；(10)能够抑制细胞壁合成的化合物，如双胍二烯、烯酰吗啉、氟吗啉、异戊二酰胺、槲寄生、多氧霉素、多索莫林、有效霉素A；(11)能够抑制黑素生物合成的化合物如丙酰胺、二氯环己烷、芬诺昔尼、苯酞、焦宁、三环唑；(12)能够诱导宿主防御的化合物，如苯偶姻-S-甲基、丙烯唑、噻替尼；(13)能够具有波尔多混合物、卡泊他醇、克拉曼、百菌清、环烷酸铜、氧化铜、氯氧化铜、铜制剂如氢氧化铜、硫酸铜、二氯荧光体、二噻烷、十二烷、十二烷基游离碱、噻虫胺、氟虫腈、莫扎福特、莫扎福特、芬太尼、奎那他定、醋酸马替他啶、亚胺辛胺、阿米替丁、阿米替丁、三硝酸亚胺辛胺、人参皂甙、代森锰锌、芒硝、米替拉姆、米替米尔锌、牛铜、丙炔、硫和硫制剂、包括多硫化硫；(14)在下列列表中选择的化合物：(2E)-2-(2-{[6-(3-氯-2-甲基苯氧基)-5-氟嘧啶-4-基]氧基}苯基)-2-(甲氧基亚氨基)-N-甲基乙酰胺、(2E)-2-{2-[({[(1E)-1-(3-{[(E)-1-
氟-2-苯基乙烯基]氧基}苯基) 亚乙基]氨基}氧基)甲基]苯基}-2-(甲氧基亚氨基)-N-甲
基乙酰胺，1-(4- 氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基-基)环庚醇、1-[(4-甲氧基苯氧基)甲
基]-2,2-二甲基丙基-1H-咪唑-1-羧酸酯、2,3,5,6-四氯-4-(甲基磺酰基)吡啶、2-丁氧基-
6-碘-3-丙基-4H-色烯-4-酮、2-氯-N-(1,1,3-三甲基-2,3-二氢 -1H-茚-4-基)烟酰胺、3-
苯基苯酚和盐、3,4,5-三氯吡啶-2,6-二腈、3,4- 二氯-N-(2-氰基苯基)异噻唑-5-甲酰胺、
3-[5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基异恶唑烷-3-基]吡啶、5-氯-6-(2,4,6-三氟苯基)-N-[(1R)-
1,2,2-三甲基丙基][1,2,4]噻唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺、5-氯-7-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(2,
4,6- 三氟苯基)[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶、5-氯-N-[(1R)-1,2-二甲基丙基]-6- (2,4,
6-三氟苯基)[1,2,4]三唑并[1,5-a]胺、8-羟基喹啉线硫酸盐、苯并噻唑、丁嗪嗪、辣椒疫霉素、香芹酮、枸橼酸、cufraneb、cyflufenamid、 cymoxanil、dazomet、debacarb、二氯酚、双氯灭氨酸、二氯苯胺、二苯甲酸、二苯甲酸甲酯硫酸盐、二苯胺、ferimzone、flumetover、氟啶草胺、氟代酰亚胺、氟磺酰胺(2E)-2-{2-[({环丙基[(4-甲氧基苯基)亚氨基] 甲基}硫
基)甲基]苯基(甲基)苯基-甲氧基丙烯酸甲酯、1-(2,2-二甲基-2,3- 二氢-1H-茚-1-基)-
1H-咪唑-5-甲酸甲酯，异硫氰酸甲酯、甲泼尼龙、霉菌素、N-[2-(1,3-二甲基丁基)苯基]-5-氟-1,3-二甲基-1H-吡唑-4-碳酰胺、 N-(3'，4'-二氯-5-氟联苯-2-基)-3-(二氟甲基)-1-
甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺、N-(3-乙基-3,5,5-三甲基环己基)-3-(甲酰氨基)-2-羟基苯甲酸
N- (4-氯-2-硝基苯基)-N-乙基-4-甲基苯磺酰胺、N-(4-氯苄基)-3-[3-甲氧基-4-(丙-2-
炔-1-基氧基)苯基]丙酰胺、N-[(4-氯苯基)(氰基)甲基]-3- [3-甲氧基-4-(丙-2-炔-1-基
氧基)苯基]溴代-3-氯吡啶-2-基)甲基]-2,4- 二氯烟酰胺、N-[1-(5-溴-3-氯吡啶-2-基)
乙基]-2,4-二氯烟酰胺、N-[1- (5-溴-3-氯吡啶-2-基)乙基]-2-氟-4-碘烟酰胺、N-[2-(4-{[3-(4-氯苯基) 丙-2-炔-1-基]乙基]-N'-(甲基磺酰基)缬氨酰胺、N-{(Z)-[(环丙基甲氧
基)亚氨基][6-(二氟甲氧基)-2,3-二氟苯基]}-2-苯基乙酰胺、N-{2-[1,1'- 双(环丙基)-
2-基]苯基}-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺、{2-[3- 氯-5-(三氟甲基)吡啶-2-
基]乙基}-2-(三氟甲基)-苯甲酰胺、游霉素、 N-乙基-N-甲基-N'-{2-甲基-5-(三氟甲基)-
4-[3-(三甲基甲硅烷基)丙氧基]苯基}亚氨基甲酰胺、N-乙基-N-甲基-N'-{2-甲基-5-(二
氟甲基)-4-[3- 乙烯基甲硅烷基)丙氧基]苯基}亚氨基甲酰胺、二甲基二硫代氨基甲酸镍，硝基硫代异丙基、O-{1-[(4-甲氧基苯氧基)甲基]-2,2-二甲基丙基}1H- 咪唑-1-硫代碳酸
酯、五氯苯酚和其盐、亚磷酸及其盐、胡椒林、丙磺酸丙磺酸、丙酸、丙酸、吡喃硝胺、喹唑啉、替硝唑胺、替硝苯、三氮氧化物、三氯酰胺、valiphenal、zarilamid。

[0745] 杀真菌剂可包括取代苯、硫代氨基甲酸酯、乙烯双二硫代氨基甲酸酯、thiophthalidamide、铜化合物、有机汞化合物、有机锡化合物、镉化合物、敌菌灵、苯菌灵、环己酰亚胺、多果定、土菌灵、异菌脲、甲霜灵、 thiamimefon、嗪氨灵或其组合。

[0746] 如果制剂、植物种子或接种剂包含杀真菌剂，则杀真菌剂可以是Foliar 杀真菌剂。Foliar杀真菌剂包括铜、代森锰锌、五氯吡啶、三唑、环丙唑康唑、康康唑、丙环唑、丙硫菌唑、戊唑醇、嘧菌酯、吡拉西星、氟西沙星、吡肟菌酯、肟菌酯、硫磺酸、甲硫菌灵甲基、氯替尼、戊吡啶、嘧菌胺、氟唑胺、异丙肾上腺素、氟泼尼松、环唑酰胺、氟嘧菌胺、唑酰胺、槲寄生、甲基吗喃、丙酰胺、芬那胺、噻卡唑、氯萘、羟吗唑、甲苯磺隆和芬博康唑。

[0747] 如果制剂、植物种子或接种物包含芽孢杆菌属的细菌接种剂，则细菌接种物可以包括芽孢杆菌属芽孢杆菌、阿扎维亚芽孢杆菌、白僵菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus  coagulans)、内切芽孢杆菌、杆状芽孢杆菌(Bacillus 
endorhythmos)、Bacillus kurstaki、 Bacillus kurstaki、乳酸芽孢杆菌(Bacillus 
lacticola)、乳病杆菌(Bacillus lactimorbus)、乳杆菌(Bacillus lactis)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、缓死芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、Bacillus medusa、Bacillus metiens、纳豆芽孢杆菌(Bacillus nato)、
Bacillus nigrificans、Bacillus popillae、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌(Bacillus 
siamensis)、Bacillus sphearicus、杆菌属、枯草芽胞杆菌、苏云金芽孢杆菌、Bacillus unifagelatu或其组合，联合在Bergey's Manual of Systematic Bacteriology，First 
Ed.(1986)中列出的那些，全文作为参考。

[0748] 如果制剂、植物种子或接种剂包含杀虫剂，则杀虫剂可以是杀线虫剂。合适的杀线虫剂包括抗生素杀线虫剂例如阿维菌素；氨基甲酸酯杀线虫剂例如acetoprole、杆菌chitonosporus、三氯硝基甲、benclothiaz、苯菌灵、洋葱伯伯利胆、呋喃丹、碳硫磺和
cleothocard；dazomet、DBCP、DCIP、氨基甲酸酯、涕灭威、醛肟、氧草胺、二脒类、茯苓、加福他汀、磷酰胺、卡泊他司、毒死蜱、二氯磷酸、乐果、栀子、芬太尼、疟原虫、拟青霉、拟青霉、磷酸铍、terbufos、噻嗪、三唑磷、二氮唑、1,2-二氯丙烷、1,3- 二氯丙烯、糠醛、碘甲烷、甲基溴、甲基溴、甲基异硫氰酸酯和二甲苯酚。

[0749] 例如但不限于，杀线虫剂和杀虫剂可以以商业产品Avicta Duo的形式提供，Avicta Duo是从先正达市售的阿维菌素和噻虫嗪的混合物。

[0750] 如果制剂、植物种子或接种剂包含杀菌剂，则其可包括链霉素、青霉素、四环素、氨苄青霉素和奥克辛酸。

[0751] 肥料可以包含液体肥料。微量营养素肥料可以包括硼酸、硼酸盐、硼砂、硫酸铜、铜烧结物、铜螯合物、四硼酸钠十水合物、硫酸铁、氧化铁、硫酸铁、铁玻璃料、铁螯合物、硫酸锰、氧化锰、锰螯合物、氯化锰、锰玻璃料、钼酸钠、钼酸、硫酸锌、氧化锌、碳酸锌、锌玻璃料、磷酸锌、锌螯合物或其组合。

[0752] 肥料可以包括硫酸铵、硝酸铵、硝酸铵盐、氯化铵、硫酸氢铵、多硫化铵、硫代硫酸铵、氨水、无水氨、多磷酸铵、硫酸铝、硝酸钙、硝酸钙铵、硫酸钙、煅烧菱镁矿、钙石灰石、氧化钙、硝酸钙、白云石、石灰石、熟石灰、碳酸钙、磷酸二铵、磷酸二氢铵、硝酸镁、硫酸镁、硝酸钾、氯化钾、硫酸镁钾、硫酸钾、硝酸钠、镁石灰石、氧化镁、尿素、尿素-甲醛、尿素硝酸铵、硫化尿素、聚合物包被的尿素、异亚丁基二脲、 K2SO4-2MgSO4、冰晶石、硅藻土、硫酸镁石、Epsom盐、元素硫、油饼、鱼粪、血粉、磷酸磷酸盐、超级磷酸盐、矿渣、骨粉、木灰、粪便、蝙蝠泥炭苔、堆肥、绿砂、棉籽粉、羽毛粉、螃蟹粉、鱼乳、腐殖酸或其组合。

[0753] 制剂、植物种子或接种剂还可以包括选自(1)细菌，特别是孢子形成细菌的至少一种生物控制剂，(2)真菌或酵母，和(3)异黄酮。优选包含作为生物控制试剂的细菌，特别是孢子形成的根系定殖细菌或用作生物杀真菌剂的细菌，选自由下列组成的组：[组(1)]:
(1.1)Bacillus agri,(1.2)  Bacillus aizawai,(1.3)白色乳杆菌(Bacillus 
albolactis),(1.4)解淀粉芽孢杆菌,(1.5)蜡样芽胞杆菌,(1.6)凝结芽孢杆菌,(1.7)
Bacillus Endoparasiticus,(1.8)杆菌Endorhythmos,(1.9),(1.10)杆菌kurstaki, 
(1.11)乳酸芽孢杆菌,(1.12)乳病杆菌,(1.13)乳杆菌,(1.14)侧孢芽孢杆菌,(1.15)缓死
芽孢杆菌,(1.16)地衣形芽孢杆菌,(1.17)Bacillus medusa,(1.18)巨大芽孢杆菌,(1.19)
Bacillus metiens,(1.20)纳豆芽孢杆菌,(1.21)Bacillus nigrificans,(1.22)Bacillus 
popillae,(1.23)短小芽孢杆菌,(1.24)暹罗芽孢杆菌,(1.25)球形芽孢杆菌(Bacillus 
sphaericus) (也称为VectoLex.sup.S的产品),(1.26)枯草芽胞杆菌或B.subtillis var. 
amyloliquefaciens,(1.27)苏云金芽孢杆菌、特别苏云金芽孢杆菌var. israelensis(称
为VectoBac.RTM.的产品)或苏云金芽孢杆菌subsp. aizawa i菌株ABTS-1857(称为
XenTari的产品),或苏云金芽孢杆菌 subsp.kurstak i菌株HD-1(称为Dipel ES的产品),
(1.28)Bacillus uniflagelatus,(1.29)Delftia acidovorans、特别菌株RAY209(称为 
BioBoost),(1.30)Lysobacter antibioticus、特别菌株13-1(生物控制2008, 45,288-
296),(1.31)Lysobacter  enzymogenes、特别菌株3.1T8,(1.32) Pseudomonas 
cholororaphis、特别菌株MA 342(称为Cedomon的产品), (1.33)Pseudomonas proradix
(称为Proradix.RTM.的产品),(1.34) Streptomyces galbus、特别菌株K61(称为
Mycostop.RTM.,cf.Crop Protection 2006,25,468-475的产品),(1.35)Streptomyces 
griseoviridis (称为Mycostop.RTM.的产品)。

[0754] 进一步优选组合包含作为生物控制剂的真菌或酵母，选自由下列组成的组：[组(2)]:(2.1)Ampelomyces quisqualis、特别菌株AQ 10(称为AQ 10.RTM.的产品),(2.2)
Aureobasidium pullulans、特别菌株DSM14940 的芽生孢子或菌株DSM 14941的芽生孢子、或它们混合物(称为Blossom Protect.RTM.的产品),(2.3)Beauveria bassiana、特别菌株
ATCC 74040 (称为Naturalis.RTM.的产品),(2.4)Candida oleophila、特别菌株O(称为
Nexy的产品),(2.5)Cladosporium cladosporioides H39(cf.Eur.J.Plant Pathol.2009,
123,401-414),(2.6),(2.7)Dilophosphora alopecuri(称为 Twist Fungus的产品),
(2.8)Gliocladium catenulatum、特别菌株J1446  (称为Prestop的产品),(2.9)
Lecanicillium lecanii(简称为Verticillium lecanii)、特别菌株KV01的conidia(称为
Mycotal.RTM.,Vertalec.RTM. 的产品),(2.10)Metarhizium anisopliea(称为BIO 1020
的产品),(2.11) Metschnikovia fructicola、特别菌株NRRL Y-30752(称为Shemer.TM.的
产品),(2.12)Microsphaeropsis ochracea(称为Microx的产品),(2.13),  (2.14)
Nomuraea rileyi,(2.15),(2.16)Penicillium bilaii、特别菌株 ATCC22348(称为
JumpStart.RTM.,PB-50,Provide的产品),(2.17) Pichia anomala、特别菌株WRL-076,
(2.18)Pseudozyma flocculosa、特别菌株PF-A22UL(称为Sporodex L的产品),(2.19)
Pythium oligandrum DV74(称为Polyversum的产品),(2.20)Trichoderma asperellum、特
别菌株ICC 012(称为Bioten的产品),(2.21)Trichoderma harzianum、特别T.harzianum 
T39(例如称为Trichodex的产品)。

[0755] 进一步优选组合包含作为生物控制剂的异黄酮，选自由下列组成的组：[组(3)]：(3.1)染料木素、(3.2)鹰嘴豆素A10、(3.3)芒柄花黄素、(3.4)黄豆苷原、(3.5)黄豆黄素、(3.6)橙皮素、(3.7)柚皮素、(3.8) 查耳酮、(3.9)香豆素、(3.10)Ambiol(2-甲基-4-二甲基氨基甲基-5-羟基苯并咪唑二氢、(3.11)抗坏血酸盐和(3.12)普拉他辛及其盐和酯。

[0756] 如果制剂、植物种子或接种剂包含杀虫剂，则杀虫剂可以包括拟除虫菊酯、有机磷酸酯、卡拉马耶肟、吡唑、脒、卤代烃、新烟碱和氨基甲酸酯及其衍生物。特别合适的杀虫剂类别包括有机磷酸酯、苯基吡唑和吡虫啉。优选的杀虫剂是称为terbufos、毒死蜱、氯氧磷、三氟菊酯、呋喃丹和tebupirimff的那些。市售杀虫剂包括thiomethoxam，市售自先正达，商品名为Cruiser。

[0757] 杀虫剂可以包括有机磷酸盐、氨基甲酸盐、拟除虫菊酯、杀螨剂、邻苯二甲酸烷基酯、硼酸、硼酸盐、氟化物、硫、卤代芳族、取代的脲、烃酯、基于生物的杀虫剂或其组合。

[0758] 用于本文的合适的杀虫剂还包括以下：(1)乙酰胆碱受体激动剂/拮抗剂，例如氯烟碱/nconicotinoid、尼古丁、杀虫磺或卡特彼特。氯烟碱/新烟碱类的合适实例包括啶虫脒、二硝基呋喃、硝苯胺、硝基噻嗪、噻虫啉、噻虫嗪、咪唑并噻唑和(2E)-1-[(2-氯-1,3-噻唑-5-基)甲基]-3,5-二甲基 -N-硝基-1,3,5-三氮杂萘-2-胺；(2)乙酰胆碱酯酶(ACNE)抑
制剂，如氨基甲酸酯和有机磷酸酯。氨基甲酸酯的合适实例包括棉铃威、涕灭威、涕灭砜威、除害威、灭害威、恶虫威、安克力、丁苯氨酯、丁卡巴、布托卡莫肟、丁氧基卡波西泮、甲萘威、卡波呋呋喃、硫代卡巴酸、氯替卡宾、二甲硅烷、呋线威、灭扑威、威百亩、灭多虫、草氨酰、磷虫威、抗蚜威、猛杀威、残杀威、thiofanox、唑蚜威、混杀威、XMC和灭杀威。有机磷酸盐的合适实例包括乙酰甲胺磷、氮杂二磷、氮磷磷(-甲基-乙基)、溴磷 -乙基、溴芬尼夫(甲基)、丁硫磷、卡他啶、卡波硫铵、氯喹诺酮、氯芬芬磷、氯霉素、毒死蜱(甲基/乙基)、氰基磷、demeton-S-甲基、demeton-S- 甲基磺酸、氯亚胺硫磷、地亚农、除线磷、敌敌畏/DDVP、百治磷、乐果、甲基毒虫畏、蔬果磷、乙拌磷、EPN、乙硫磷、etroprophos、乙嘧硫磷、氨磺磷、fenamiphos、地虫磷、安果、丁苯硫磷、噻唑磷、蚜螨磷、碘硫磷、异稻瘟净、氯唑磷、异丙胺磷、O-水杨酸异丙基酯、异噁唑磷、马拉息昂、灭蚜磷、虫螨畏、多灭磷、杀扑磷、速灭磷、久效磷、二溴磷、氧乐果、甲基氧代内吸磷、对硫磷(-甲基/-乙基)、稻丰散、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、磷虫威、辛硫磷,嘧啶磷(-甲基/-乙基)、溴丙磷、丙虫磷、烯虫磷、丙硫磷、发果、吡唑硫磷、哒嗪硫磷、pyridathion、喹硫磷、硫线磷、治螟磷、硫灭克磷、丁基嘧啶磷、双硫磷、特丁磷、杀虫畏、甲基乙拌磷、三唑磷、triclorfon和蚜减多；(3)钠通道调节剂/电压门控钠通道阻断剂如拟除虫菊酯和恶二嗪。拟除虫菊酯的合适实例包括丙烯酸蛋白酶、烯丙
菊酯(d-顺-反,d-反)、β-氟氯氰菊酯、联苯菊酯、生物烯丙菊酯、生物烯丙菊酯-S-环戊基异构体、bioethanomethrin、右旋反二氯苯醚菊酯、生物梅毒素、氯洛匹芬、顺式氯菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、环丙菊酯、氟氯氰菊酯、联苯菊酯、滴滴涕、溴氰菊酯、菊酯(1R-异构体)、氰戊菊酯、恩曲芬、芬氟酸、甲氰菊酯、菲啶嘧啶、氰戊菊酯、氟虫酯、氟氰菊酯、氟泼尼松、氟菊酯、氟氰菊酯、咪达司汀、氯氰菊酯、氯氰菊酯、甲氯菊酯、氯菊酯(顺式-，反式)、苯醚菊酯(1R-反式异构体)、丙烯菊酯、藜芦素、protrifenbute、吡雷美辛、灭虫菊、RU 15525、
silafluofen、 tau-fluvalinate、四甲菊酯(1R-异构体)、tricocythrin、tralomethrin、 transfluthrin、ZXI 8901和除虫菊酯(除虫菊酯)。恶二嗪的合适实例包括吲草胺；(4)乙酰胆碱受体调节剂如多杀菌素。多杀菌素的合适实例包括多杀菌素；(5)GABA门控氯化物通道拮抗剂，如环二烯有机氯和苯基吡唑类。环二烯有机氯化物的合适实例包括毒杀芬、
chlordane、硫丹、γ-HCH、 HCH、七氯、林丹和甲氧基氯。油布的合适实例包括乙酰甲霜灵和香草酚； (6)氯化物通道激活剂如水凝胶。维生素的合适实例包括阿维菌素、除虫菌素、伊马替丁、伊马替丁-苯甲酸酯、伊维菌素、莱匹米克、米尔万霉素和米尔倍霉素；(7)保幼激素类似物，如二苯丙醚、epofenonane、苯氧威、氢化保幼素、丙诺保幼素、蒙五一五、吡丙醚、烯虫硫酯；(8)蜕皮激素激动剂/破坏剂如二酰基肼。二酰基肼的合适实例包括色烯酰肼、卤苯酰肼、甲氧基酰肼和甲酰苯肼；(9)几丁基合成抑制剂，例如苯甲酰脲、苯丙嗪和环丙嗪。苯甲酰脲的合适实例包括双三氟虫脲、氟啶脲、除虫脲、氟环脲、氟虫脲、氟铃脲、虱螨脲、氟酰脲、多氟脲、氟幼脲、氟苯脲以及杀铃脲；(10)氧化磷酸化抑制剂、ATP抑制剂如有机锡和丁醚脲。有机锡的合适实例包括三唑锡、三环锡和苯丁锡；(11)通过中断质子梯度而起作用的氧化磷酸化的解偶联剂类，例如吡咯和二硝基酚。吡咯的合适实例包括溴虫腈。二硝基酚的合适实例包括二萘啶、二丁酮、二氮磷和 DNOC；(12)位点I电子传递抑制剂，如METI、氢氯酸和三氯杀螨醇。 METI的合适实例包括喹螨醚、唑螨酯、嘧螨醚、哒螨灵、吡螨胺、唑虫酰胺；
(13)位点II电子传递抑制剂如鱼藤酮；(14)位置III电子传递抑制剂如灭螨醌和
fluacrypimim；(15)苏云金芽孢杆菌菌株等昆虫肠膜微生物破坏物；(16)脂质合成抑制剂，如特窗酸和特特拉姆酸。特窗酸的合适实例包括螺螨酯、螺甲螨酯和螺虫乙酯。特特拉姆酸的合适实例包括顺式-3-(2,5-二甲基苯基)-8-甲氧基-2-氧代-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-4-
基乙基碳酸酯(别名：碳酸，3-(2,5-二甲基苯基)-8-甲氧基-2-氧代-1-氮杂螺[4.5] 癸-3-烯-4-基乙酯(CAS登记号：382608-10-8)；(17)酰胺如氟马酰胺； (18)八聚胺能激动剂如阿米他唑；(19)镁刺激的ATP酶的抑制剂，例如炔丙酸盐；(20)兰诺乐汀受体激动剂，例如邻苯二甲酰胺或雷尼泊他啶。 2-[1,1-二甲基-2-(甲基磺酰基)乙基]-3-碘-N。[2-甲基-4-[1,
2,2,2-四氟-1- (三氟甲基))乙基]苯基]-1,2-苯二甲酰胺(即氟虫酰胺，CAS登记号： 
272451-65-7)；(21)雷毒素类似物如硫氰酸草酸氢盐和硫代尿钠；(22) 生物制剂，激素或信息素，如印苦楝子素、芽孢杆菌属、白僵菌、苹果小卷蛾性诱剂、Metarrhizium spec.、拟青霉属、拟南芥和轮枝孢属；(23) 具有未知或非指定作用机制的活性化合物，例如熏蒸剂、选择性进食抑制剂、螨生长抑制剂、酰胺基聚异戊二烯、苯丙胺酸、苯丙胺酸、溴硝酸酯、苯丙胺酸、二苯甲酸酯、溴丙酸酯、布比芬、氯化苦参酮、噻吗宁酸、氯苯腈、氯化苦参、噻虫啉、环戊烯、丁氟螨酯、环虫腈、芬诺沙星、fentrifanil、氟苯亚胺噻唑、嘧虫胺、flutenzin、棉红铃虫性诱剂、氟蚁腙、japonilure、噁虫酮、化合物3-甲基苯基丙基腈(Tsumacide Z)、化合物3-(5-氯-3-吡啶基)-8-(2,2,2-三氟乙基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-腈(CAS 
reg.No. 185982-80-3)和相应3-内异构体(CAS reg.No.185984-60-5)(cf.WO 96/37494,
WO 98/25923)、以及包含杀虫有效植物提取物、线虫、真菌或病毒的制剂。熏蒸剂的合适实例包括磷化铝、甲基溴和硫酰氟。选择性进食抑制剂的合适实例包括冰晶石、氟虫胺和吡蚜酮。螨生长抑制剂的合适实例包括氯芬太、依毒唑和己氧噻唑。

[0759] 市售杀线虫成分包括阿维菌素，市售从先正达商品名Avicta。

[0760] 如果制剂、植物种子或接种剂包含除草剂，除草剂可以包括2,4-D、 2,4-DB、乙草胺、三氟醚、甲草胺、莠灭宁、莠去津、氨基吡哆醛、益生菌、苄嘧磺隆、bensulide、苯扎沙坦、溴西泮、溴嘧啶、丁酸盐、 carfentrazone、氯嘧磺隆、氯磺隆、克罗地芬、氯麦芽糖、氯吡啶、克洛司他姆、环酯、DCPA、desmedipham、麦草畏、二氯替苯尼、双氯芬酸、双氯灭氨酸、diflufenzopyr、二甲苯胺、diquat、敌草隆、EPTC、乙氟乐灵、ethofumesate、fenoxaprop、fluazifop-P、flucarbazone、flufenacet、 flumetsulam、flumiclorac、flumioxazin、fluometuron、fluroxypyr、 fomesafen、甲磺嘧磺隆、草铵膦、草甘膦、halosulfuron、hexazinone、 imazamethabenz、imazamox、imazapic、imazaquin、imazethapyr、异黄酮、孕激素、木犀草素、MCPA、MCPB、甲基磺草酮、异丙甲草胺、 metribuzin、甲磺隆、茉莉酸、MSMA、萘普生、naptalam、烟嘧磺隆、诺氟拉津、奥立唑林、恶二酮、氟氟芬、百草枯、壬酸、二甲戊乐灵、 phenmedipham、picloram、primisulfuron、prodiamine、prometryn、 pronamide、propanil、prosulfuron、吡嗪、吡噻硫、喹草酸、喹禾灵、环草隆、西马那啶、磺扎酮、磺胺甲龙、磺嘧磺隆、噻替隆、terbaci、噻唑啉、噻吩磺隆、噻苯甲腈、tralkoxydim、triallate、triasulfuron、tribenuron、 triclopyr、trifluralin、triflusulfuron或其组合。

[0761] 除草剂可包括氯苯氧基化合物、硝基苯酚化合物、硝基甲酚化合物、联吡啶化合物、乙酰胺、脂肪族酸、苯胺、苯甲酰胺、苯甲酸、苯甲酸衍生物、茴香酸、茴香酸衍生物、苯甲腈、苯并噻二嗪酮二氧化物、硫代氨基甲酸酯、氨基甲酸酯、苯基氨基甲酸酯、氯吡啶基、环己烯酮衍生物、二硝基氨基苯衍生物、氟二硝基甲苯胺化合物、异噁唑啉酮、烟酸、异丙胺、异丙胺衍生物、噁二唑啉酮、磷酸酯、邻苯二甲酸酯、皮考啉酸化合物、三嗪、三唑、尿嘧啶、尿素衍生物、草藻灭、氯酸钠、磺脲、芳基三嗪或其组合。

[0762] 制剂可包含除草剂和能够降解除草剂的细菌菌株。

[0763] 能够降解除草剂的细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349 (NRRL No.B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366
(NRRL B-67120)或蕈状芽孢杆菌 EE-B00363(NRRL B-67121)或其组合。

[0764] 待降解的除草剂可以包含磺酰脲例如磺胺腙、芳基三嗪、麦草畏、苯氧基除草剂、2,4-D、除虫菊酯、拟除虫菊酯或其组合。

[0765] 制剂中可包含粘合剂，例如羧基甲基纤维素和粉末，颗粒或胶乳形式的天然和合成聚合物，例如阿拉伯胶、甲壳素、聚乙烯醇和聚乙酸乙烯酯，以及天然磷脂，例如头孢氨酸和卵磷脂、以及合成磷脂。粘合剂包括优选由粘合剂聚合物组成的粘合剂聚合物，其可以是天然的或合成的，而不对待涂覆的种子具有植物毒性作用。可以包括的单独或组合的其它
粘合剂包括例如聚酯，聚醚酯，聚酐，聚酯氨酯，聚酯酰胺；聚乙酸乙烯酯；聚醋酸乙烯共聚物聚乙烯醇和酪氨酸；聚乙烯醇共聚物；聚乙烯吡咯烷酮；多糖，包括淀粉、改性淀粉和淀粉衍生物、糊精、麦芽糖糊精、藻酸盐、壳聚糖和纤维素、纤维素酯、纤维素醚和纤维素醚酯，包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基丙基纤维素和羧基甲基纤维素；脂肪油；
蛋白，包括酪蛋白、明胶和玉米蛋白；阿拉伯胶虫胶偏二氯乙烯和偏二氯乙烯共聚物；木质素磺酸盐，特别是木质素磺酸钙；聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯和丙烯酸共聚物；聚乙烯基丙烯酸酯；聚乙烯氧化物；聚丁烯、聚异丁烯、聚苯乙烯、聚丁二烯、聚乙烯胺、聚乙基烯酰胺；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚羟基乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺单体；和多氯前列腺。

[0766] 可以使用各种着色剂，包括分类为亚硝基、硝基、偶氮的有机发色团、包括单偶氮、双偶氮和多偶氮、二苯基甲烷、三芳基甲烷、呫吨、甲烷、吖啶、噻唑、噻嗪、茚满酮、靛酚、恶嗪、无花蒽和酞菁。

[0767] 可添加的其他添加剂包括痕量营养物，例如铁、锰、硼、铜、钴、钼和锌的盐。

[0768] 还可以包括一种或多种防腐剂(例如抗微生物剂或其它杀生物剂)用于制剂的保存和稳定化。合适的杀菌剂的实例包括基于二氯苯和苄基酒精半形式的那些(来自ICI的
或来自Thor Chemie的 RS 和来自Dow Chemical的 TM)和异噻
唑啉酮衍生物例如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑酮(来自Thor Chemie的 MBS)。
作为另外的实例，合适的防腐剂包括MIT(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)、BIT(1,2- 苯并异噻
唑啉-3-酮)，其可从Avecia，Inc.获得，Proxel GXL为溶于氢氧化钠和二丙基乙二醇)，5-氯-2-(4-氯苄基)-3(2H)-噻唑酮，5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮、5-氯-2-甲基-2H-异噻
唑-3-酮、5-氯-2-甲基-2H-异噻唑-3-酮盐酸盐、4,5-二氯-2-环己基-4-异噻唑啉-3-酮、4,
5-二氯-2-辛基-2H- 异噻唑-3-酮、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮、2-甲基-2H-异噻唑-3-酮氯化钙络合物、2-辛基-2H-异噻唑-3-酮和苄基乙醇缩甲醛。

[0769] 合适的配方的增稠剂的实例包括多糖，有机粘土或在水性介质中表现出假塑性的水溶性聚合物，例如阿拉伯树胶、刺梧桐树胶、黄蓍胶、瓜尔胶、刺槐豆胶、黄原胶胶体、角叉菜胶、藻酸盐、酪蛋白、葡聚糖、果胶、琼脂、2-羟基乙基淀粉、2-氨基乙基淀粉、2-羟基乙基纤维素、甲基纤维素、羧基甲基纤维素盐、聚丙烯酰胺、马来酸酐共聚物的碱金属盐、聚(甲基)丙烯酸酯的碱金属盐。

[0770] 用于制剂的合适的防冻成分包括例如但不限于乙二醇、1,2-丙基乙二醇、1,3-丙基乙二醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,4-戊二醇、 3-甲基-1,5-戊二醇、2,3-二甲基-2,3-丁二醇、三甲基丙烷、甘露醇、山梨糖醇、甘油、季戊四醇、1,4-环己烷二醇乙醇、二甲苯酚、双酚例如双酚 A等。另外，醚醇例如二乙二醇、三乙二醇、四乙烯二醇、聚氧乙烯或分子量高达约4000的聚氧丙烯二醇、二乙烯醇单甲醚、二乙烯醇单乙基醚、三乙二醇单甲基醚、丁氧基乙醇、丁二醇单丁醚、二季戊四醇、三季戊四醇、四季戊四醇、双甘油、三甘油、四甘油、五甘油、六甘油、七甘油，八甘油及其组合。

[0771] XVIII.植物种子

[0772] 本发明进一步涉及使用下列包覆的植物种子：本文所述任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员、本文所述任何重组孢子-形成细菌、本文所述任何生物学纯细菌培养基、本文所述任何接种剂、任何催化一氧化氮产生的酶、表达催化一氧化氮产生的酶的任何重组微生物、或除了本文所述疫苗之外的制剂。

[0773] XIX.涉及植物和植物种子的方法、延迟重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子发芽的方法、以及制备和使用外孢壁片段的方法

[0774] 本发明进一步涉及用于刺激植物生长的方法、保护植物免受侵害或提高植物的胁迫抗性的方法、在植物上固定重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子或重组孢子形成细菌的方
法、刺激植物种子发芽的方法、递送核酸至植物的方法、延迟重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子发芽的方法、制备和使用外孢壁片段的方法、以及递送有益细菌至动物的方法。

[0775] A.用于刺激植物生长的方法

[0776] 本发明涉及用于刺激植物生长的方法。

[0777] 本发明的一种用于刺激植物生长的方法包括向植物生长介质中引入上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员中的任一个、或包含上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂中的任一
个。或者，上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员中的任一个或包含上述重组蜡样芽胞杆菌家族
成员的制剂中的任一个可施加至植物、植物种子、或围绕植物或植物种子的区域。在这些方法中，表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含植物生长刺激蛋白或肽。植物生长
刺激蛋白或肽可物理附着于重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁。

[0778] 另一种用于刺激植物生长的方法包括向植物生长介质中引入上述重组孢子-形成细菌的任一个、或包含上述重组孢子-形成细菌的制剂中的任一个。或者，上述重组孢子-形成细菌的任一个、或包含上述重组孢子-形成细菌的制剂中的任一个可施加至植物、植物种子、或围绕植物或植物种子的区域。在这些方法中，表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌包含植物生长刺激蛋白或肽。植物生长刺激蛋白或肽可物理附着于重组孢子-形成细菌的孢
子包衣。

[0779] 又一种用于刺激植物生长的方法包括向植物生长介质中引入重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂。或者，重组蜡样芽胞杆菌家族成员或
制剂可施加至植物、植物种子、或围绕植物或植物种子的区域。重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达涉及营养物增溶的酶、蛋白酶、BclA蛋白、BclB蛋白、CotE蛋白、CotO蛋白、ExsY蛋白、 ExsFA/BxpB蛋白、CotY蛋白、ExsFB蛋白、ExsJ蛋白、ExsH蛋白、 YjcA蛋白、YjcB蛋白、BclC蛋白、BxpA蛋白、BclE蛋白、BetA/BAS3290 蛋白、ExsA蛋白、ExsK蛋白、ExsB蛋白、YabG蛋白或Tgl蛋白，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于涉及营养物增溶的
酶、蛋白酶、BclA蛋白、BclB蛋白、CotE蛋白、CotO蛋白、ExsY蛋白、ExsFA/BxpB蛋白、CotY蛋白、ExsFB蛋白、ExsJ蛋白、ExsH蛋白、YjcA蛋白、YjcB蛋白、BclC蛋白、BxpA蛋白、BclE蛋白、BetA/BAS3290 蛋白、ExsA蛋白、ExsK蛋白、ExsB蛋白、YabG蛋白或Tgl蛋白的表达，涉及营养物增溶的酶、蛋白酶、BclA蛋白、BclB蛋白、CotE蛋白、CotO 蛋白、ExsY蛋白、ExsFA/BxpB蛋白、CotY蛋白、ExsFB蛋白、ExsJ 蛋白、ExsH蛋白、YjcA蛋白、YjcB蛋白、BclC蛋白、BxpA蛋白、BclE 蛋白、BetA/BAS3290蛋白、ExsA蛋白、ExsK蛋白、ExsB蛋白、YabG 蛋白或Tgl蛋白的表达增强。

[0780] 另外用于刺激植物生长的方法包括使用衍生自重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁片段，将在下面描述。

[0781] B.保护植物免受病原体侵害或提高植物的胁迫抗性的方法

[0782] 本发明还涉及保护植物免受病原体侵害或提高植物的胁迫抗性的方法。

[0783] 保护植物免受病原体侵害或提高植物的胁迫抗性的方法的一种方法包括向植物生长介质中引入上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员中的任一个、或包含上述重组蜡样芽胞杆
菌家族成员的制剂中的任一个。或者，上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员中的任一个或包含
上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂中的任一个可施加至植物、植物种子、或围绕植物
或植物种子的区域。在这些方法中，表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含保护
植物免受病原体侵害的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽。保护植物免受病原体
侵害的蛋白或肽、或提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽可物理附着于重组蜡样芽胞杆菌家族
成员的外孢壁。

[0784] 保护植物免受病原体侵害或提高植物的胁迫抗性的方法的另一种方法包括向植物生长介质中引入重组孢子-形成细菌的任一个、或包含上述重组孢子-形成细菌的制剂中
的任一个。或者，重组孢子-形成细菌的任一个、或包含上述重组孢子-形成细菌的制剂中的任一个可施加至植物、植物种子、或围绕植物或植物种子的区域。在这些方法中，表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌包含保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽或提高植物的胁迫抗
性的蛋白或肽。保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽或提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽可
物理附着于重组孢子-形成细菌的孢子包衣。

[0785] 在保护植物免受病原体侵害的任一种方法中，在包含重组蜡样芽孢杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的植物生长介质中生长的植物与在不含重组蜡样芽孢杆菌家族成员
或重组孢子-形成细菌的相同植物生长介质中在相同条件下生长的植物相比较优选不易受
病原体的感染。

[0786] 在提高植物的胁迫抗性的任一种方法中，在包含重组蜡样芽孢杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的植物生长介质中生长的植物与在不含重组蜡样芽孢杆菌家族成员或重
组孢子-形成细菌的相同植物生长介质中在相同条件下生长的植物相比较优选不易受到胁
迫。

[0787] 提高植物的胁迫抗性的另一种方法包括向植物生长介质中引入重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂。或者，重组蜡样芽胞杆菌家族成员
或制剂可施加至植物、植物种子、或围绕植物或植物种子的区域。重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达超氧化物歧化酶或精氨酸酶，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中
相比于超氧化物歧化酶或精氨酸酶的表达，超氧化物歧化酶或精氨酸酶的表达增强。

[0788] 保护植物免受病原体侵害的另一种方法包括向植物生长介质中引入重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂。或者，重组蜡样芽胞杆菌家族
成员或制剂可施加至植物、植物种子、或围绕植物或植物种子的区域。重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达蛋白酶，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于蛋白酶的
表达，蛋白酶的表达增强。

[0789] 另外保护植物免受病原体侵害或提高植物的胁迫抗性的方法包括使用衍生自重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁片段，将在下面描述。

[0790] C.在植物上固定重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子或重组孢子形成细菌的方法

[0791] 本发明进一步涉及在植物上固定重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子或重组孢子形成细菌的方法。

[0792] 在植物上固定重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的一种方法包括向植物生长介质中引入上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员中的任一个、或包含上述重组蜡样芽胞杆菌家族成
员的制剂中的任一个。或者，上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员中的任一个或包含上述重组
蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂中的任一个可施加至植物、植物种子、或围绕植物或植物种
子的区域。在这些方法中，表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含植物结合蛋白
或肽。植物结合蛋白或肽可物理附着于重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁。

[0793] 在植物上固定重组孢子-形成细菌的孢子的另一种方法包括向植物生长介质中引入上述重组孢子-形成细菌中的任一个、或包含上述重组孢子- 形成细菌的制剂中的任一
个。或者，上述重组孢子-形成细菌中的任一个、或包含上述重组孢子-形成细菌的制剂中的任一个可施加至植物、植物种子、或围绕植物或植物种子的区域。在这些方法中，表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌包含植物结合肽，和植物结合蛋白或肽可物理附着于重组孢子-
形成细菌的孢子包衣。

[0794] 植物结合蛋白或肽优选在植物上选择性靶向和保持重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌。例如，植物结合蛋白或肽可在植物根部、根部的子结构、植物的地上部分或植物地上部分的子结构上选择性靶向和保持重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[0795] D.刺激植物种子发芽的方法

[0796] 1.刺激发芽的方法包括使用重组孢子-形成细菌的重组蜡样芽胞杆菌家族成员

[0797] 本发明还提供刺激植物种子发芽的方法。

[0798] 刺激植物种子发芽的一种方法包括向植物生长介质中引入上述任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的任何制剂。或者，上述任何重组
蜡样芽胞杆菌家族成员或包含上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的任何制剂可施加至植物
种子、或者围绕植物或植物种子的区域。在这些方法中，表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含催化一氧化氮产生的酶。催化一氧化氮产生的酶可物理附着于重组蜡样芽胞
杆菌家族成员的外孢壁。

[0799] 刺激植物种子发芽的另一方法包括向植物生长介质中引入上述任何重组孢子-形成细菌或包含上述重组孢子-形成细菌的任何制剂。或者，上述任何重组孢子-形成细菌或
包含上述重组孢子-形成细菌的任何制剂可施加至植物种子、或者围绕植物或植物种子的
区域。在这些方法中，表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌包含催化一氧化氮产生的酶，并且催化一氧化氮产生的酶可物理附着于重组孢子-形成细菌的孢子包衣。

[0800] 用于刺激植物种子发芽的上述方法优选包括施加重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或制剂至植物种子。

[0801] 上述刺激植物种子发芽的方法中的任一者还可包括将催化一氧化氮产生的酶的底物施加至植物生长介质、植物种子、植物、或者围绕植物或植物种子的区域。例如，该方法合适地还包括增加L-精氨酸至植物生长介质、植物种子、植物、或者围绕植物或植物种子的区域。例如，L-精氨酸可施加至植物的地上部分。L-精氨酸优选施加至植物种子。

[0802] L-精氨酸的存在增强了反应，并导致通过一氧化氮合酶对NO的更明显的输出。另外，在植物种子、植物生长介质或围绕植物的区域上的L-精氨酸可以作为通过天然细菌酶
产生的一氧化氮的底物。

[0803] 在上述刺激植物种子发芽的任一方法中，相比于在不含重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的相同植物生长介质中在相同条件下生长的种子、或者在相同条
件下未施加重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的种子，包含重组蜡样芽胞
杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的植物生长介质中的种子、或者已经施加重组蜡样芽
胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的种子优选具有增强的发芽率。

[0804] 在上述刺激植物种子发芽的任一方法中，相比于在不含重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的相同植物生长介质中在相同条件下生长的种子、或者在相同条
件下未施加重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的种子，包含重组蜡样芽胞
杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的植物生长介质中的种子、或者已经施加重组蜡样芽
胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的种子优选在发芽后具有更长的主根。

[0805] 下面描述刺激植物种子发芽的另外方法，包括使用衍生自重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁片段。

[0806] 2.通过向植物递送催化一氧化氮产生的酶或过表达这种酶的重组微生物来刺激发芽的方法

[0807] 刺激植物种子发芽的又一方法包括向植物生长介质中引入、或者向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加：(i)催化一氧化氮产生的酶；(ii)超氧化物歧化酶；或(iii)表达催化一氧化氮产生的酶或超氧化物歧化酶的重组微生物，其中相比于在相同条件下在野生型微生物中催化一氧化氮产生的酶或超氧化物歧化酶的表达，催化一氧化
氮产生的酶或超氧化物歧化酶的表达增强。

[0808] 该方法优选包括施加酶或微生物至植物种子。

[0809] 该方法还可包括将催化一氧化氮产生的酶的底物施加至植物生长介质、植物种子、植物、或者围绕植物或植物种子的区域。例如，该方法合适地还包括增加L-精氨酸至植物生长介质、植物种子、植物、或者围绕植物或植物种子的区域。例如，L-精氨酸可施加至植物的地上部分。L-精氨酸优选施加至植物种子。

[0810] 相比于在不含酶或微生物的相同植物生长介质中在相同条件下生长的种子、或者在相同条件下未施加酶或微生物的种子，包含酶或微生物的植物生长介质中的种子、或者
已经施加酶或微生物的种子优选具有增强的发芽率。

[0811] 相比于在不含酶或微生物的相同植物生长介质中在相同条件下生长的种子、或者在相同条件下未施加酶或微生物的种子，包含酶或微生物的植物生长介质中的种子、或者
已经施加酶或微生物的种子优选在发芽后具有更长的主根。

[0812] 催化一氧化氮产生的酶合酶可包括一氧化氮合酶或精氨酸酶。如果催化一氧化氮产生的酶包括一氧化氮合酶，一氧化氮合酶可包括例如来自苏云金芽孢杆菌BT013A或枯草
芽胞杆菌168的一氧化氮合酶。例如，一氧化氮合酶可与SEQ ID NO:260或261具有至少85％序列同一性。

[0813] 一氧化氮合酶可与SEQ ID NO:260或261具有至少90％序列同一性。

[0814] 一氧化氮合酶可与SEQ ID NO:260或261具有至少95％序列同一性。

[0815] 一氧化氮合酶可与SEQ ID NO:260或261具有至少98％序列同一性。

[0816] 一氧化氮合酶可与SEQ ID NO:260或261具有至少99％序列同一性。

[0817] 一氧化氮合酶可与SEQ ID NO:260或261具有100％序列同一性。

[0818] 超氧化物歧化酶可包括超氧化物歧化酶1(SODA1)或超氧化物歧化酶2(SODA2)。超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0819] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0820] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0821] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0822] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0823] 超氧化物歧化酶可包含与SEQ ID NO:155或156具有100％同一性的氨基酸序列。

[0824] 表达催化一氧化氮产生的酶的重组微生物可包含杆菌种(例如蜡样芽胞杆菌家族成员、枯草芽胞杆菌、地衣形芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌)、 Escherechia coli、Aspergillus种(例如Aspergillus niger)或Sacchromyces 种(例如Sacchromyces cerevisiae)。

[0825] 在上述任一方法中，酶或重组微生物可引入植物生长介质中、或在包含酶或重组微生物和农业上可接受的载体、以及本文讨论的其他成分的制剂中施加至植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域。

[0826] 催化一氧化氮产生的酶可纯化或未纯化递送、和可单独或联合其他其他有益蛋白、菌剂或化学品递送至植物种子、植物生长介质、或围绕植物或植物种子的区域。

[0827] E.递送核酸至植物的方法

[0828] 本发明还提供递送核酸至植物的方法。

[0829] 递送核酸至植物的方法包括向植物生长介质中引入上述任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的任何制剂。或者，上述任何重组蜡样芽
胞杆菌家族成员或包含上述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的任何制剂可施加至植物种子、或
者围绕植物或植物种子的区域。在这些方法中，表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成
员包含核酸结合蛋白。核酸结合蛋白或肽结合核酸分子。核酸结合蛋白或肽可物理附着于
重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁。

[0830] 在这些方法中，重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含内生细菌菌株。内生细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌
EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员 EE-B00377、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366或蕈状芽孢杆菌EE-B00363。例如，内生细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌
EE444、苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-
B00377、假蕈状芽孢杆菌 EE-B00366或蕈状芽孢杆菌EE-B00363。

[0831] 递送核酸至植物的另一方法包括向植物生长介质中引入上述任何重组孢子-形成细菌或包含上述重组孢子-形成细菌的任何制剂。或者，上述任何重组孢子-形成细菌或包
含上述重组孢子-形成细菌的任何制剂可施加至植物种子、或者围绕植物或植物种子的区
域。在这些方法中，表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌包含核酸结合蛋白。核酸结合蛋白或肽结合核酸分子。核酸结合蛋白或肽可物理附着于重组孢子-形成细菌的孢子包衣。

[0832] 重组孢子-形成细菌可包括内生细菌菌株。例如，内生细菌菌株可包括巨大芽孢杆菌EE385、杆菌sp.EE387、环状芽孢杆菌EE388、枯草芽胞杆菌EE405、Lysinibacillus 
fusiformis EE442、Lysinibacillus sphericus EE443或杆菌pumilus EE-B00143。

[0833] 在上述递送核酸至植物的方法的任一种中，核酸分子可包括调节RNA 分子、RNAi分子、微RNA、适配体、或编码调节RNA分子、RNAi分子、微小RNA或适体的DNA分子。

[0834] 待递送至植物的核酸分子可以通过任何已知的方法制备(例如化学合成、通过微生物重组制备等)。然后将核酸分子与本文所述的融合蛋白的核酸结合蛋白或肽部分结合，以准备递送这样的核酸到植物或植物。核酸结合蛋白和肽固定和稳定核酸，并允许它们完
整地输送到植物。待递送至植物的核酸分子可以是活性形式，或者是可以被植物加工成活
性形式的无活性形式。

[0835] 为了完成核酸分子与核酸结合蛋白或肽的结合，核酸分子可以与本文所述的任何表达含有核酸的结合蛋白或肽的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌成员或重组孢子形成细菌
一起温育。

[0836] 下面描述用于将核酸递送至植物的另外方法，其涉及使用源自重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁片段。

[0837] F.延迟重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子发芽的方法

[0838] 本发明进一步涉及延迟蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子发芽的方法。该方法包括调节蜡样芽胞杆菌家族成员以表达肌苷-尿苷水解酶或丙氨酸消旋酶，其中相比于在相同条
件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中肌苷- 尿苷水解酶或丙氨酸消旋酶的表达，肌苷-
尿苷水解酶或丙氨酸消旋酶的表达增强。

[0839] G.在使用前蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的灭活

[0840] 在使用重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子形成细菌的上述方法中的任一种中，该方法还可包括在引入植物生长介质或施加至植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域之前灭活重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌。

[0841] 例如，灭活可包括使重组蜡样芽孢杆菌家族成员或重组孢子形成细菌经历加热处理、伽马射线、x射线照射、UV-A照射、UV-B照射、用戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂、氯仿或苯酚处理、或其组合。

[0842] 可选择地或另外，灭活可包括修改重组蜡样芽胞杆菌家族成员重组或孢子-形成细菌以表达萌发孢子蛋白酶或非特异性核酸内切酶，其中相比于在相同条件下在野生型蜡
样芽胞杆菌家族成员中萌发孢子蛋白酶或非特异性核酸内切酶的表达，萌发孢子蛋白酶或
非特异性核酸内切酶的表达增强，和其中重组孢子-形成细菌包括genus杆菌的重组细菌。

[0843] H.制备和使用外孢壁片段的方法

[0844] 本发明进一步涉及制备和使用外孢壁片段的方法。这些方法涉及上面章节IV所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，即，包含允许收集游离外孢壁的突变或其他基因改变的重
组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[0845] 因此，本发明涉及从重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子除去外孢壁的方法。该方法包括使包含上文章节IV中描述的任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子的悬浮液进行
离心或过滤以产生从孢子分离出的外孢壁片段。外孢壁片段包括融合蛋白。

[0846] 从重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子除去外孢壁的方法可包括使包含孢子的悬浮液进行离心并收集上清液，其中上清液包含外孢壁的片段，并基本上不含孢子。

[0847] 或者，从重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子除去外孢壁的方法可包括使包含孢子的悬浮液进行过滤并收集滤液，其中滤液包含外孢壁的片段，并基本上不含孢子。

[0848] 在离心或过滤之前，可以搅动或机械破坏孢子的悬浮液。

[0849] 外孢壁片段也可以通过梯度离心、亲和纯化或通过使孢子沉淀出悬浮液与孢子分离。

[0850] 本发明进一步涉及使用外孢壁片段的方法。

[0851] 提供用于刺激植物生长的方法。该方法包括将外孢壁片段或包含外孢壁片段和农业上可接受的载体的制剂引入植物生长介质。或者，外孢壁片段或制剂直接可施加至植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域。外孢壁片段衍生自上面章节IV所述的重组蜡
样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白。融合蛋白包括植物生长刺激蛋白或肽。

[0852] 还提供保护植物免受病原体侵害提高植物的胁迫抗性的方法。该方法包括将外孢壁片段或包含外孢壁片段和农业上可接受的载体的制剂引入植物生长介质。或者，外孢壁
片段或制剂直接可施加至植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域。外孢壁片段衍生自上面章节IV所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白。融合蛋白
包括保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽或提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽。

[0853] 当方法是保护植物免受病原体侵害的方法时，融合蛋白包括保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽。

[0854] 在保护植物免受病原体侵害的方法中，在包含外孢壁片段的植物生长介质中生长的植物与在不含外孢壁片段的相同植物生长介质中在相同条件下生长的植物相比较优选
不易受病原体的感染。

[0855] 当方法是提高植物的胁迫抗性的方法时，融合蛋白包括提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽。

[0856] 在提高植物的胁迫抗性的方法中，在包含外孢壁片段的植物生长介质中生长的植物与在不含外孢壁片段的相同植物生长介质中在相同条件下生长的植物相比较优选不易
受到胁迫。

[0857] 还提供在植物上固定外孢壁片段的方法。该方法包括将外孢壁片段或包含外孢壁片段和农业上可接受的载体的制剂引入植物生长介质。或者，外孢壁片段或制剂直接可施
加至植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域。外孢壁片段衍生自上面章节IV所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白。融合蛋白包括植物生长刺激蛋
白或肽。

[0858] 植物结合蛋白或肽优选在植物上选择性靶向和保持外孢壁片段。例如，植物结合蛋白或肽可在植物根部、根部的子结构、植物的地上部分或植物地上部分的子结构上选择
性靶向和保持外孢壁片段。

[0859] 还提供刺激植物种子发芽的方法。该方法包括向植物生长介质中引入外孢壁片段或包含外孢壁片段的制剂。或者，外孢壁片段或制剂可施加至植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域。外孢壁片段衍生自上面章节 IV所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白。融合蛋白包括超氧化物歧化酶或催化一氧化氮产生的酶。

[0860] 在刺激发芽的方法中，该方法优选包括施加外孢壁片段至植物种子。

[0861] 刺激发芽的方法还可包括将催化一氧化氮产生的酶的底物施加至植物生长介质、植物种子、植物、或者围绕植物或植物种子的区域。例如，该方法合适地还包括增加L-精氨酸至植物生长介质、植物种子、植物、或者围绕植物或植物种子的区域。例如，L-精氨酸可施加至植物的地上部分。 L-精氨酸优选施加至植物种子。

[0862] L-精氨酸的存在增强了反应，并导致通过一氧化氮合酶对NO的更明显的输出。另外，在植物种子、植物生长介质或围绕植物的区域上的L-精氨酸可以作为通过天然细菌酶
产生的一氧化氮的底物。

[0863] 在刺激植物种子发芽的方法中，相比于在不含重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的相同植物生长介质中在相同条件下生长的种子、或者在相同条件下未施
加重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的种子，包含重组蜡样芽胞杆菌家族
成员或重组孢子-形成细菌的植物生长介质中的种子、或者已经施加重组蜡样芽胞杆菌家
族成员或重组孢子 -形成细菌的种子优选具有增强的发芽率。

[0864] 在刺激植物种子发芽的方法中，相比于在不含重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的相同植物生长介质中在相同条件下生长的种子、或者在相同条件下未施
加重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的种子，包含重组蜡样芽胞杆菌家族
成员或重组孢子-形成细菌的植物生长介质中的种子、或者已经施加重组蜡样芽胞杆菌家
族成员或重组孢子 -形成细菌的种子优选在发芽后具有更长的主根。

[0865] 还提供递送核酸至植物的方法。该方法包括将外孢壁片段或包含外孢壁片段和农业上可接受的载体的制剂引入植物生长介质。或者，外孢壁片段或制剂直接可施加至植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域。外孢壁片段衍生自上面章节IV所述的重组蜡
样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白。融合蛋白包含核酸结合蛋白或肽。核酸结合蛋白或肽结合核酸分子。

[0866] 在将核酸递送至植物的方法中，核酸分子可包括调节RNA分子、RNAi 分子、微RNA、适配体、或编码调节RNA分子、RNAi分子、微小RNA 或适体的DNA分子。

[0867] 待递送至植物的核酸分子可以通过任何已知的方法制备(例如化学合成、通过微生物重组制备等)。然后将核酸分子与本文所述的融合蛋白的核酸结合蛋白或肽部分结合，以准备递送这样的核酸到植物或植物。核酸结合蛋白和肽固定和稳定核酸，并允许它们完
整地输送到植物。待递送至植物的核酸分子可以是活性形式，或者是可以被植物加工成活
性形式的无活性形式。

[0868] 为了完成核酸分子与核酸结合蛋白或肽的结合，核酸分子可以与含有核酸结合蛋白或肽的融合蛋白的外孢壁片段一起温育。

[0869] I.植物生长介质

[0870] 在本文所述涉及使用植物生长介质的任何方法中，植物生长介质可包括土壤、水、水溶液、砂子、砂砾、多糖、腐土、堆肥、泥煤苔、秸秆、原木、粘土、大豆粉、酵母提取物、或其组合。

[0871] 另外，植物生长介质可补充有酶的底物或辅酶。例如，底物或辅酶可包括色氨酸、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷(例如，腺苷-3-三磷酸)、吲哚、三偏磷酸盐、铁氧还蛋白、乙偶姻、二乙酰、丙酮酸盐、乙酰乳酸、果胶、纤维素、甲基纤维素、淀粉、几丁质、果胶、蛋白粉、纤维素衍生物、磷酸盐、乙偶姻、脱乙酰壳多糖、吲哚-3-乙酸的非活性衍生物、赤霉酸的非活性衍生物、木聚糖、胆碱、胆碱衍生物、脯氨酸、聚脯氨酸、富含脯氨酸的粉、富含脯氨酸的蛋白、苯丙氨酸、分支酸、阿糖基木聚糖、脂肪、蜡、油、肌醇六磷酸、木质素、腐殖酸、胆碱、胆碱衍生物、脯氨酸、聚脯氨酸、富脯氨酸蛋白、富脯氨酸粉、苯基丙氨酸、分支酸、L-精氨酸、NADH、NADPH、ATP、GTP、细胞色素C、细胞色素p450或其组合。

[0872] J.施加方法

[0873] 本文所述方法可包括在种植之前，使用重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢壁片段、或含有重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢壁片段的制剂包覆种子。

[0874] 本文所述方法可包括将重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢壁片段、或含有重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢壁片段的制剂施加至植物的地上部分。

[0875] 在本文所述方法中，向植物生长介质中引入重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢壁片段可包括向介质施加含有重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-
形成细菌或外孢壁片段的液体或固体制剂。植物生长介质可包括土壤(例如盆栽土壤)、堆
肥、泥炭苔、沙子、酒母混合物或其组合。该方法可包括在植物生长介质中种植种子、幼苗、插条、球茎或植物之前、同时或之后将所述制剂施用于所述植物生长介质。

[0876] K.农用化学品

[0877] 在本文所述的方法中，该方法可以进一步包括将至少一种农用化学品引入植物生长介质或将至少一种农用用品施加于植物或种子。

[0878] 农用化学品可以包括肥料(例如液体肥料)、微量营养素肥料材料(例如硼酸、硼酸盐、硼砂、硫酸铜、铜烧结物、铜螯合物、四硼酸钠十水合物、硫酸铁、氧化铁、硫酸铁铵、铁料、铁螯合物、硫酸锰、氧化锰、锰螯合物、氯化锰、锰料、钼酸钠、钼酸、硫酸锌、锌氧化物、碳酸锌、锌料、磷酸锌、锌螯合物或其组合)、杀虫剂(例如有机磷酸盐、氨基甲酸盐、拟除虫菊酯、杀螨剂、邻苯二甲酸烷基酯、硼酸、硼酸盐、氟化物、硫、卤代芳基取代的脲、烃酯、基于生物的杀虫剂或其组合)、除草剂(例如氯苯氧基化合物、硝基酚化合物、硝基酚化合物、二吡啶基化合物、乙酰胺、脂肪酸、苯胺、苯甲酰胺、苯甲酸、苯甲酸衍生物、茴香酸茴香酸衍生物、苯甲腈、苯并噻二嗪酮二氧化物、硫代氨基甲酸酯、氨基甲酸酯、氨基苯甲酸酯、氯吡啶基、环己烯酮衍生物、二硝基氨基苯衍生物、氟二硝基甲苯胺化合物、异恶唑烷酮、烟酸、异丙胺、异丙基胺衍生物、恶二唑啉酮、磷酸酯、邻苯二甲酸酯、吡啶甲酸化合物、三嗪、三唑、尿嘧啶、尿素衍生物、内酯、氯酸钠或其组合)、杀真菌剂(例如取代的苯、硫代氨基甲酸酯、亚乙基二硫代氨基甲酸酯、硫代邻苯二甲酰胺、铜化合物、有机汞化合物、有机锡化合物、镉化合物、苯那嗪、苯菌灵、环己酰胺、十二烷胍、氯唑灵、异丙肾上腺素、metlaxyl、
thimeimefon、嗪胺灵或其组合)、软体动物杀灭剂、杀藻剂、植物生长修正剂、细菌菌剂(例如根瘤菌属的细菌菌剂、慢生根瘤菌属的细菌菌剂、中慢生根瘤菌属的细菌菌剂、 genus Azorhizobium的细菌菌剂、genus Allorhizobium的细菌菌剂、genus Sinorhizobium的细
菌菌剂、genus Kluyvera的细菌菌剂、genus Azotobacter的细菌菌剂、genus Pseudomonas的细菌菌剂、genus  Azospirillium的细菌菌剂、genus杆菌的细菌菌剂、genus 
Streptomyces 的细菌菌剂、genus Paenibacillus的细菌菌剂、genus Paracoccus的细菌
菌剂、genus Enterobacter的细菌菌剂、genus Alcaligenes的细菌菌剂、 genus 
Mycobacterium的细菌菌剂、genus Trichoderma的细菌菌剂、 genus Gliocladium的细菌
菌剂、genus Glomus的细菌菌剂、genus Klebsiella的细菌菌剂或其组合)、真菌菌剂(例如家族Glomeraceae的真菌菌剂、家族Claroidoglomeraceae的真菌菌剂、家族Gigasporaceae 的真菌菌剂、家族Acaulosporaceae的真菌菌剂、家族 Sacculosporaceae的真菌菌剂、家族Entrophosporaceae的真菌菌剂、家族Pacidsporaceae的真菌菌剂、家族Diversisporaceae的真菌菌剂、家族Paraglomeraceae的真菌菌剂、家族Archaeosporaceae的真菌菌剂、家族Geosiphonaceae的真菌菌剂、家族Ambisporaceae的真菌菌剂、家族Scutellosporaceae的
真菌菌剂、家族Dentiscultataceae的真菌菌剂、家族Racocetraceae的真菌菌剂、phylum Basidiomycota的真菌菌剂、phylum Ascomycota的真菌菌剂、phylum Zygomycota的真菌菌剂或其组合)或其组合。

[0879] 肥料可以包括硫酸铵、硝酸铵、硝酸铵盐、氯化铵、硫酸氢铵、多硫化铵、硫代硫酸铵、氨水、无水氨、多磷酸铵、硫酸铝、硝酸钙、硝酸钙铵、硫酸钙、煅烧菱镁矿、钙石灰石、氧化钙、硝酸钙、白云石、石灰石、熟石灰、碳酸钙、磷酸二铵、磷酸二氢铵、硝酸镁、硫酸镁、硝酸钾、氯化钾、硫酸镁钾、硫酸钾、硝酸钠、镁石灰石、氧化镁、尿素、尿素-甲醛、尿素硝酸铵、硫化尿素、聚合物包被的尿素、异亚丁基二脲、 K2SO4-2MgSO4、冰晶石、硅藻土、硫酸镁石、Epsom盐、元素硫、油饼、鱼粪、血粉、磷酸磷酸盐、超级磷酸盐、矿渣、骨粉、木灰、粪便、蝙蝠泥炭苔、堆肥、绿砂、棉籽粉、羽毛粉、螃蟹粉、鱼乳、腐殖酸或其组合。

[0880] 农用化学品可包含上面章节XVII所述的任何杀真菌剂、细菌菌剂或除草剂。

[0881] L.植物和种子

[0882] 在涉及植物的上述方法中的任一个中，植物可以是双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。

[0883] 例如，当植物是双子叶植物时，所述双子叶植物可选自由以下组成的组：豆、豌豆、番茄、胡椒、南瓜、苜蓿、杏仁、大茴香子、苹果、杏、 arracha、朝鲜蓟、鳄梨、班巴拉花生、甜菜、香柠檬、黑胡椒、黑荆树、黑莓、越桔、酸橙、白菜、巴西果、面包果、茎椰菜、蚕豆、抱子甘蓝、荞麦、卷心菜、亚麻荠、大白菜、可可、棱瓜、葛缕籽、刺菜蓟、角豆树、胡萝卜、腰果、木薯、蓖麻子、花椰菜、块根芹、芹菜、樱桃、栗、鹰嘴豆、菊苣、辣椒、菊花、肉桂、香橼、细皮小柑桔、丁香、苜蓿、咖啡、可乐果、菜籽、玉米、棉花、棉籽、豇豆、海甘蓝、蔓越橘、水芹、黄瓜、葡萄干、番荔枝、鼓槌树、地球豌豆、茄子、菊苣、茴香、胡芦巴、无花果、榛、亚麻、天竺葵、醋栗、葫芦、葡萄、葡萄柚、番石榴、大麻、大麻籽、指甲花、蛇麻、蚕豆、山葵、槐蓝、茉莉、菊芋、黄麻、羽衣甘蓝、木棉、红麻、球茎甘蓝、金橘、熏衣草、柠檬、小扁豆、胡枝子、莴苣、酸橙、甘草、荔枝、枇杷、羽扇豆、澳洲坚果、肉豆蔻、桔、大根甜菜、芒果、欧楂、甜瓜、薄荷、桑树、芥末、油桃、御佐油树、肉豆蔻、秋葵、橄榄、鸦片、橙、番木瓜、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、美洲山核桃、柿子、木豆、开心果、车前草、李子、石榴、文旦、罂粟子、马铃薯、白薯、干梅子、南瓜、白坚木、榅桲、金鸡纳树属的树、奎藜籽、萝卜、苎麻、油菜籽、覆盆子、苎麻、大黄、玫瑰、橡胶、芜菁甘蓝、红花、红豆草、婆罗门参、人参果、萨摩柑桔、鸦葱、芝麻、乳油木、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、芜菁、甜椒、柑橘、茶、画眉草、烟草、番茄、三叶草、油桐、萝卜、肖梵天花麻、野豌豆、胡桃、西瓜、巴拉圭茶、山芥、荠菜、水芹、独行菜、豆瓣菜、菥蓂、大茴香、月桂、月桂树、肉桂、阎浮树、莳萝、罗望子、胡椒薄荷、皮萨草、迷迭香、鼠尾草、刺果番荔枝、天胡荽、美珊瑚属、苦瓜、夏威夷核果、大溪地板栗、罗勒、黑果、木槿、鸡蛋果、金叶树、檫树、仙人掌、圣·约翰草、千屈菜、山楂、芜荽、咖喱草、猕猴桃、百里香、绿皮密生西葫芦、落葵、豆薯、田基麻、多刺猴桔、猪李、杨桃、猪苋菜、山嵛菜、山椒、黄李子、块茎金莲花、香椿、番杏、鲍尔菠菜、ugu、艾菊、鹅肠菜、jocote、莲雾、天神草、苣荬菜、山药、马芹、药用大蒜芥、剪秋罗、玛瑙、黑心树、蓟、地榆、星状醋栗、钾猪毛菜、海蓬子、酢浆草、银线花边蕨、绿叶羽衣甘蓝、报春花、驴蹄草、马齿苋、两耳草、松节油、树生菜、野生槟榔、西非胡椒、北美圣草、龙蒿、欧芹、雪维菜、陆生水芹、茴芹、蜂蜜药草 (honeyherb)、款冬、紫苏、水蓼、白苏白苏、苦豆、圆齿酢酱草、kampong、香芹、柠檬罗勒、泰国罗勒、水含羞草、雪维菜、卷心菜树、辣根树、麦卢卡树、鸵鸟蕨、稻田草、黄色稻田生菜、圆叶当归、胡椒草、玛咖、葫芦瓜、扁豆、蕹菜、猫耳菊、鱼腥草、冲绳菠菜、莲花甜味汁、小花牛膝菊、刺芹、芝麻菜、刺菜蓟、菜瓜、鸭儿芹、chipilin、海马齿、mampat、 ebolo、红瓜、卷心菜蓟、海甘蓝、驱虫苋、huauzontle、埃塞俄比亚芥、洋红spreen、亨利藜、土荆芥、羊腿藜、积雪草 (centellaplumedcockscomb)、山柑属、油菜花、大白菜、日本芜菁、中国皱叶甘蓝、开兰(kai-lan)、芥菜叶、木耳菜、牛皮菜、药蜀葵、攀援金合欢、青麻、红辣椒、胭脂树籽、绿薄荷、香薄荷、甘牛至草、欧莳萝、甘菊、蜜蜂花、多香果、越桔、番荔枝、云莓、西洋李子、火龙果、榴莲、接骨木果、费约果、木菠萝、蒲桃、枣、灯笼果、山竹、红毛丹、红醋栗、黑醋栗、沙龙白珠树莓、温州蜜橘、牙买加丑橘、红豆、扁豆、豇豆、菠罗蒂豆、菜豆、青豆、菜豆、利马豆、绿豆、菜豆、黑白斑豆、红花菜豆、嫩豌豆、甜豆、球花甘蓝、花茎甘蓝、荨麻、灯笼椒、菊苣、日本萝卜、白萝卜、泽芹、塌棵菜(tatsoi)、花椰菜苗、黑萝卜、牛蒡根、蚕豆、花椰菜(broccoliraab)、扁豆、羽扇豆、苹婆、绒毛豆、四棱豆、豆薯、澳大利亚围篱树、紫苑草、伞形金合欢、铁草(tjuntjula)、wakalpulka、 witchettybush、尖细金合欢树、野鼠尾草、山毛榉坚果、石栗、药西瓜、蜜果、玛雅坚果、洞果、ogbono坚果、猴胡桃、以及小木菠萝。

[0884] 当植物是单子叶植物时，所述单子叶植物可选自由以下组成的组：玉米、小麦、燕麦、水稻、大麦、粟、香蕉、洋葱、大蒜、芦笋、黑麦草、粟、fonio、raishan、海椰子草(nipagrass)、姜黄、藏红花、高良姜、细香葱、小豆蔻、海枣、菠萝、葱、韭菜、冬葱、荸荠、熊葱(ramp)、薏仁、竹、鸭脚粟、无瑕疵的无根萍(spotlesswatermeal)、剑叶血桐、塔希提菠菜、马尼拉麻、槟榔、珍珠粟、槟榔、稷、帚用高粱、香茅、椰子、芋头、玉米、芋、高粱、硬粒小麦、edo、菲奎叶纤维、formio、姜、鸭茅、芦苇草、苏丹草、高粱、马尼拉麻、灰叶剑麻、杂交玉米、高梁、柠檬草、龙舌兰、珍珠稗、龙爪稷、谷子、日本稷子、黍、新西兰麻、燕麦、油棕、扇叶树头榈、西谷椰子、小糠草、剑麻、高粱、斯卑尔脱小麦、甜玉米、高粱、芋头、画眉草、猫尾草、黑小麦、香子兰、小麦、以及薯蓣。

[0885] 当植物是裸子植物时，所述裸子植物可选自由以下组成的组：南洋杉科、波温苏铁科、粗榧科、柏科、苏铁科、麻黄科、银杏科、买麻藤科、松科、罗汉松科、紫杉科、杉科、千岁兰科以及泽米科。

[0886] 本文所述植物和植物种子可包括转基因植物或植物种子，例如转基因谷物(小麦、大米)、玉米、大豆、马铃薯、棉花、烟草、油菜和水果植物 (苹果、梨、柑橘类水果和葡萄的果实)优选转基因植物包括玉米、大豆、土豆、棉花、烟草和油菜。

[0887] 合适的转基因植物和种子可表征为植物的毒素形成，特别是苏云金芽孢杆菌遗传物质(例如基因CryIA(a)、CryIA(b)、CryIA(c)、CryIIA、 CryIIAA、CryIIIB2、Cry9c、
Cry2Ab、Cry3Bb、CryIF或其组合)。植物中毒素的形成增加了植物对昆虫、蜘蛛、线虫、和鼻涕虫、和蜗牛的抗性 (以下简称“Bt植物”)。Bt植物，例如以市售的YIELD (例如玉
米、棉花、大豆)、 (例如玉米)、 (例如玉米)、  (棉花)、
(棉花)和 (马铃薯)玉米品种、棉花品种、大豆品种和马铃薯品种。除
草剂耐受性植物包括以商品名Roundup  (草甘膦耐受性，例如玉米、棉花、大豆)、
(例如玉米)、Liberty (与草铵膦的耐受性，例如油籽油菜)、 (具有
咪唑不耐性)和 (对磺酰脲的耐受性，例如玉米)。

[0888] 如本文所述的植物种子可以基因修饰(例如导致基因修饰的植物或植物部分表达除草剂耐受性，对环境因素的耐受性的任何种子，例如水胁迫、干旱、病毒和氮生产或对细菌、真菌或昆虫毒素抗性)。合适的基因修饰的种子包括油菜作物、蔬菜、水果、树木、纤维作物、油料作物、块茎作物、咖啡、花、豆类、谷物以及单子叶植物和双子叶植物的其他植物。优选地，基因修饰的种子包括花生、烟草、草、小麦、大麦、黑麦、高粱、大米、油菜籽、甜菜、向日葵、番茄、胡椒、豆、莴苣、马铃薯和胡萝卜。最优选地，基因修饰的种子包括棉花、大豆和玉米(甜田种子或爆米花)。

[0889] 可以根据本发明处理的特别有用的转基因植物是含有转化事件或转化事件组合的植物，其例如在来自各国或地区管理机构的数据库中列出  (参见例如http://
gmoinfo.jrc.it/gmp_browse.aspx和http://www.agbios.com /dbase.php)。

[0890] XX.递送有益细菌和蛋白或肽至动物的方法

[0891] 本发明进一步涉及递送有益细菌和/或蛋白或肽至动物的方法。

[0892] 将即是益生菌也是内生的细菌菌株施加至植物允许细菌进入它们分裂和繁殖的植物中。内生和益生菌菌株可以使用各种方法递送到植物，例如例如内生和益生菌菌株可
以通过种子处理、植物生长介质(例如土壤) 的处理、灌溉、施加至植物本身(例如叶片应用于植物的空中部分)来递送。一旦进入植物，细菌繁殖并被植物的内部组织固定。然后将植物喂养到动物，其允许将益生菌细菌递送至动物。由于细菌的内生性质允许它们在植物中
分裂和繁殖，传统的将益生菌细菌递送给动物的方法的成本降低。通过最初向植物中提供
少量的益生菌和内生菌株，并允许细菌在植物内增加数量，剂量增加。另外，益生菌和内生菌株可以在收获和消化之前扩散到目标作物上。

[0893] 能够定植植物的叶面并且也是益生菌的细菌菌株也可以用于这些目的。能够植物植物叶片的菌株可以最初以小剂量递送到植物，然后将植物的外表面分开和定植。

[0894] 内生或叶面-定植的合适的细菌菌株和包括那些菌株的益生菌可以在植物中或植物上的田间复制并在摄入后为动物提供益处。益生菌细菌在动物中的益处包括但不限于动
物消化道的微生物群的调节、辅助消化植物材料的酶的分泌以及对动物免疫系统的刺激。
提供益处的消化增强酶的实例包括但不限于纤维素酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、木糖苷酶、脂肪酶、磷脂酶和木质素酶。

[0895] 杆菌和Lysinibacillusgenera是独特的，因为它们含有大量的物种，既是内生并定植植物，也可以作为脊椎动物中的益生菌。因此，杆菌和 Lysinibacillus种非常适于通过植物中的传代和生长将益生菌递送到动物。可以是内生和益生菌的常见杆菌种包括枯草
芽胞杆菌、杆菌坚果、杆菌解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、杆菌toyocerin、巨大芽孢杆菌、杆菌微生物和杆菌地衣芽孢杆菌。也可以使用内生和益生菌的Lysinibacillus种。

[0896] 提供向动物递送有益细菌的方法。该方法包括向动物喂养这样的植物，该植物被修改为包含这样水平的内生和益生菌细菌菌株，该水平大于在未经修改的相同植物中在相
同条件下生长的内生和益生菌细菌菌株的水平。

[0897] 向动物喂养的植物可包括：在含有内生和益生菌细菌菌株或包含内生和益生菌细菌菌株的制剂的植物生长介质中生长的植物、施加内生和益生菌细菌菌株的植物、从施加
内生和益生菌细菌菌株的植物种子生长的植物、在施加内生和益生菌细菌菌株的区域中生
长的植物、或在施加内生和益生菌细菌菌株的区域中生长的种子。

[0898] 内生和益生菌细菌菌株可包括杆菌或Lysinibacillus种。例如，杆菌种可包括枯草芽胞杆菌、杆菌firmus、杆菌amyloliquefaciens、蜡样芽胞杆菌、杆菌toyocerin、巨大芽孢杆菌、杆菌pumilus、杆菌licheniformis或其组合。

[0899] 内生和益生菌细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、巨大芽孢杆菌EE385、杆菌
sp.EE387、杆菌circulans EE388、枯草芽胞杆菌EE405、Lysinibacillusfusiformis 
EE442、Lysinibacillussphericus EE443、杆菌pumilus EE-B00143或其组合。

[0900] 另外，可通过下列方法向动物递送蛋白或肽(例如酶)：向动物喂养表达含有蛋白或肽的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员、包含这种融合蛋白的外孢壁片段、或表达
这种融合蛋白的重组孢子-形成细菌。重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌可
以是内生菌菌株或细菌菌株，其能够定植植物的叶面，其允许通过摄取已经被细菌定殖的
植物将蛋白或肽递送到动物。益生菌重组蜡样芽胞杆菌家族成员菌株或重组孢子-形成细
菌菌株也可使用，使得消化重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的动物获得
益生菌细菌的益处和蛋白或肽的益处。重组蜡样芽胞杆菌家族成员菌株、和内生或叶面定
植的重组孢子-形成细菌的菌株以及益生菌也可用于向动物递送蛋白或肽。

[0901] 因此，还提供将蛋白或肽递送至动物的方法。该方法包括向动物喂养表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成
员的外孢壁的目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。或者，该方法包括向动物喂养衍生自表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁片段，融合蛋白包
含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的目标蛋白或肽和靶向序列、外孢
壁蛋白或外孢壁蛋白片段。

[0902] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含表达融合蛋白的本文所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员中的任一种。

[0903] 外孢壁片段可包含衍生自上述章节IV的蜡样芽胞杆菌家族成员中的任一种的外孢壁片段。

[0904] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含内生细菌菌株。内生细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-
B00377、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366或蕈状芽孢杆菌EE-B00363。例如，内生细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366或蕈状芽孢杆菌EE-B00363。

[0905] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含益生菌细菌菌株。益生菌细菌菌株可包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRLNo.B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRLB-50979)、苏云金芽孢杆菌 EE417(NRRLB-50979)、蜡样芽胞杆菌EE444(NRRLB-50977)、苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRLNo.B-50924)或其组合。

[0906] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含在喂养动物的植物内。

[0907] 或者，重组蜡样芽胞杆菌家族可包含能够叶面定植植物的细菌菌株。例如，能够叶面定植植物的细菌菌株包括蕈状芽孢杆菌BT155、蕈状芽孢杆菌EE118、蕈状芽孢杆菌EE141、蕈状芽孢杆菌BT46-3、蜡样芽胞杆菌家族成员EE218、苏云金芽孢杆菌BT013A、蜡样芽胞杆菌家族成员 EE-B00377、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366或蕈状芽孢杆菌EE-B00363。

[0908] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可存在于喂养动物的植物的叶面。

[0909] 靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包括:(1)靶向序列包含与 SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至
少约54％；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:1 的氨基酸1-35；(3)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:1；(5)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少 
85％同一性的氨基酸序列；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-35； (7)靶向序列包
含SEQ ID NO:1的氨基酸5-35；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸8-35；(9)靶向序列
包含SEQ ID NO:1的氨基酸10-35； (10)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸15-35；(11)靶向序列包含 SEQ ID NO:3的氨基酸1-27；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸 12-27；
(13)靶向序列包含SEQ ID NO:3；(14)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(15)靶向序列包含SEQ ID NO: 3的氨基酸2-27；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸5-27；(17) 靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸8-27；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸10-27；(19)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-38； (20)靶向序列包
含SEQ ID NO:5的氨基酸23-38；(21)靶向序列包含 SEQ ID NO:5；(22)外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO:6具有至少85％同一性的氨基酸序列；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸
2-38；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸5-38；(25)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨
基酸8-38；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸10-38； (27)靶向序列包含SEQ ID NO:
5的氨基酸15-38；(28)靶向序列包含 SEQ ID NO:5的氨基酸20-38；(29)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-28；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸13-28；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:7；(32)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少 85％同一性的氨基酸序列；
(33)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 2-28；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸
5-28；(35)靶向序列包含 SEQ ID NO:7的氨基酸8-28；(36)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 10-28；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸1-24；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:
9的氨基酸9-24；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:9；(40) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少85％同一性的氨基酸序列； (41)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸2-24；(42)靶
向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸8-24； 
(44)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸1-33；(45)靶向序列包含 SEQ ID NO:11的氨基
酸18-33；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:11；(47) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:12具有至
少85％同一性的氨基酸序列；(48)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸2-33；(49)靶向序
列包含 SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33；(51)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸15-
33；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:13 的氨基酸1-33；(54)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸18-33；(55) 靶向序列包含SEQ ID NO:13；(56)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:14具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(57)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；(58)靶向
序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸5-33；(59)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；
(60)靶向序列包含SEQ ID NO:13 的氨基酸10-33；(61)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基
酸15-33；(62) 靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸1-43；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:
15的氨基酸28-43；(64)靶向序列包含SEQ ID NO:15；(65)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:16具有至少85％同一性的氨基酸序列；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸2-43；(67)
靶向序列包含SEQ ID NO:15 的氨基酸5-43；(68)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-
43；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-43；(70)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；(71)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸20-43； (72)靶向序列包含SEQ ID 
NO:15的氨基酸25-43；(73)靶向序列包含 SEQ ID NO:17的氨基酸1-27；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸12-27；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:17；(76)外孢壁蛋白包含与 
SEQ ID NO:18具有至少85％同一性的氨基酸序列；(77)靶向序列包含 SEQ ID NO:17的氨
基酸2-27；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(79)靶向序列包含SEQ ID NO:
17的氨基酸8-27；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸10-27；(81)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸1-33；(82)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸18-33；(83) 靶向序列包含SEQ ID NO:19；(84)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:20具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-33；(86)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨
基酸5-33；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸8-33；(88)靶向序列包含SEQ ID NO: 
19的氨基酸10-33；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸15-33； (90)靶向序列包含
SEQ ID NO:21的氨基酸1-33；(91)靶向序列包含 SEQ ID NO:21的氨基酸18-33；(92)靶向
序列包含SEQ ID NO:21；(93) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:22具有至少85％同一性的氨
基酸序列； (94)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸2-33；(95)靶向序列包含 SEQ ID 
NO:21的氨基酸5-33；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸8-33；(97)靶向序列包含
SEQ ID NO:21的氨基酸10-33；(98)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸15-33；(99)靶向
序列包含SEQ ID NO: 23的氨基酸1-24；(100)靶向序列SEQ ID NO:23的氨基酸9-24；(101) 靶向序列包含SEQ ID NO:23；(102)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:24 具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:23 的氨基酸2-24；(104)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸5-24；(105) 靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(106)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸1-24；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸9-24； (108)靶向序列包含SEQ ID NO:25；(109)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:26具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸2-24；(111)靶向序列包含SEQ 
ID NO:25的氨基酸5-24； (112)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-24；(113)靶向序列包含 SEQ ID NO:27的氨基酸1-30；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸15-30；
(115)靶向序列包含SEQ ID NO:27；(116)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:28具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(117)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸2-30；(118)靶向序列包含
SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(119)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸8-30；(120)靶向
序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30；(121)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-33；
(122)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸 18-33；(123)靶向序列包含SEQ ID NO:29；
(124)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:30具有至少85％同一性的氨基酸序列；(125)靶向序
列包含SEQ ID NO:29的氨基酸2-33；(126)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；
(127)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(128)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基
酸10-33；(129)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(130)靶向序列包含SEQ ID 
NO:31的氨基酸 1-24；(131)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸9-24；(132)靶向序列包
含SEQ ID NO:31；(133)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:32具有至少 85％同一性的氨基酸序
列；(134)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸 2-24；(135)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸5-24；(136)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；(137)靶向序列包含SEQ ID NO:33 的氨基酸1-15；(138)靶向序列包含SEQ ID NO:33；(139)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:34具有至少85％同一性的氨基酸序列；(140)靶向序列包含SEQ ID NO:35的氨基酸1-
16；(141)靶向序列包含SEQ ID NO:35； (142)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:36具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(143)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸1-29；(144)靶向序
列包含SEQ ID NO:43的氨基酸14-29；(145)靶向序列包含SEQ ID NO:43； (146)外孢壁蛋
白包含与SEQ ID NO:44具有至少85％同一性的氨基酸序列；(147)靶向序列包含SEQ ID 
NO:43的氨基酸2-29；(148)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸5-29；(149)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(150)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸10-29；(151) 靶
向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸1-35；(152)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸20-
35；(153)靶向序列包含SEQ ID NO:45；(154)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:46具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(155) 靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸2-35；(156)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(157)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35； 
(158)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸10-35；(159)靶向序列包含 SEQ ID NO:45的氨
基酸15-35；(160)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸1-43；(161)靶向序列包含SEQ ID 
NO:47的氨基酸28-43；(162) 靶向序列包含SEQ ID NO:47；(163)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:48 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(164)靶向序列包含SEQ ID NO:47 的氨基酸2-
43；(165)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(166) 靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(167)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸10-43；(168)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 15-43；(169)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸20-43；(170)靶向序列
包含SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(171)靶向序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸1-32；
(172)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸17-32； (173)靶向序列包含SEQ ID NO:49；
(174)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:50具有至少85％同一性的氨基酸序列；(175)靶向序列
包含SEQ ID NO:49的氨基酸2-32；(176)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32； (177)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(178)靶向序列包含 SEQ ID NO:49的氨基酸
10-32；(179)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸15-32；(180)靶向序列包含SEQ ID NO:
51的氨基酸1-33；(181) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸18-33；(182)靶向序列包含
SEQ ID NO:51；(183)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:52具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(184)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸2-33；(185) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨
基酸5-33；(186)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸8-33；(187)靶向序列包含SEQ ID 
NO:51的氨基酸 10-33；(188)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸15-33；(189)靶向序列
包含SEQ ID NO:53的氨基酸1-33；(190)靶向序列包含SEQ ID NO: 53的氨基酸18-33；
(191)靶向序列包含SEQ ID NO:53；(192)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:54具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(193)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33；(194)靶向序列包含
SEQ ID NO: 53的氨基酸5-33；(195)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-33； (196)靶
向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(197)靶向序列包含 SEQ ID NO:53的氨基酸15-
33；(198)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸1-30；(199)靶向序列包含SEQ ID NO:55的
氨基酸15-30；(200) 靶向序列包含SEQ ID NO:55；(201)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:56 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(202)靶向序列包含SEQ ID NO:55 的氨基酸2-30；
(203)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；(204) 靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨
基酸8-30；(205)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸10-30；(206)靶向序列包含SEQ ID 
NO:57的氨基酸 1-130；(207)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸115-130；(208)靶向序
列包含SEQ ID NO:57；(209)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少85％同一性的氨基
酸序列；(210)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸2-130；(211)靶向序列包含SEQ ID NO:
57的氨基酸5-130；(212) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-130；(213)靶向序列包
含SEQ ID NO:57的氨基酸20-130；(214)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸30-130；
(215)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130；(216) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的
氨基酸50-130；(217)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸60-130；(218)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130；(219)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130；(220) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；(221)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸100-
130；(222)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-130；(223)外孢壁蛋白片段包括与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列；(224)靶向序列包含SEQ ID NO:96；(225)靶
向序列包含SEQ ID NO:97；(226)靶向序列包含SEQ ID NO:98；(227)靶向序列包含SEQ ID NO:99；(228)靶向序列包含SEQ ID NO:100；(229) 靶向序列包含SEQ ID NO:101；(230)靶向序列包含SEQ ID NO:102； (231)靶向序列包含SEQ ID NO:103；(232)靶向序列包含SEQ ID NO: 104；(233)靶向序列包含SEQ ID NO:105；(234)靶向序列包含SEQ ID NO:106；
(235)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:108具有至少85％同一性的氨基酸序列；(236)外孢壁
蛋白包含与SEQ ID NO:109具有至少85％同一性的氨基酸序列；(237)外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO:110具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(238)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
111具有至少85％同一性的氨基酸序列；(239)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:112 具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(240)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 113具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(241)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:114具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(242)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:115具有至少85％同一性的氨基酸序列；(243)外
孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:116具有至少85％同一性的氨基酸序列；(244)外孢壁蛋白包含
与SEQ ID NO:117具有至少85％同一性的氨基酸序列；(245) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:118具有至少85％同一性的氨基酸序列； (246)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:119具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(247)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:120具有至少85％同一
性的氨基酸序列；(248)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:121具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(249)靶向序列包含氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸 22-31；(250)靶向序列包含SEQ ID 
NO:1的氨基酸22-33；(251)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-31；(252)靶向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸14-23；(253)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸14-25；(254) 靶
向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-23；(255)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸1-30；
(256)靶向序列包含SEQ ID NO:59；(257)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:60具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(258) 靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸2-30；(259)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸4-30；(260)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸6-30； (261)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸1-33；(262)靶向序列包含 SEQ ID NO:61的氨基酸18-33；
(263)靶向序列包含SEQ ID NO:61； (264)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:62具有至少85％
同一性的氨基酸序列；(265)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸2-33；(266)靶向序列包
含SEQ ID NO:61的氨基酸5-33；(267)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸10-33；(268)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸15-33；(269) 靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸1-
35；(270)靶向序列包含SEQ ID NO:63；(271)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:64具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(272)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸2-35；(273)靶向序
列包含SEQ ID NO:63的氨基酸5-35；(274)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸8-35；
(275)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸 10-35；(276)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨
基酸15-35；(277)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸1-24；(278)靶向序列包含SEQ ID 
NO: 65的氨基酸9-24；(279)靶向序列包含SEQ ID NO:65；(280)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:66具有至少85％同一性的氨基酸序列；(281)靶向序列包含SEQ ID NO:107；(282)靶向
序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸 2-24；(283)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸5-24；
(284)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸1-27；(285)靶向序列包含SEQ ID NO:67 的氨
基酸12-27；(286)靶向序列包含SEQ ID NO:67；(287)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:68具有至少85％同一性的氨基酸序列；(288)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸2-27；(289)靶
向序列包含SEQ ID NO: 67的氨基酸5-27；(290)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸10-
27； (291)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸1-38；(292)靶向序列包含 SEQ ID NO:69
的氨基酸23-38；(293)靶向序列包含SEQ ID NO:69； (294)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
70具有至少85％同一性的氨基酸序列；(295)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸2-38；
(296)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸5-38；(297)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基
酸10-38；(298)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸15-38；(299) 外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:72；(300)靶向序列包含SEQ ID NO:73； (301)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:74具有至
少95％同一性的氨基酸序列；(302)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸1-42；(303)靶向
序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-42；(304)靶向序列包含SEQ ID NO:75； (305)外孢壁
蛋白包含与SEQ ID NO:76具有至少85％同一性的氨基酸序列；(306)靶向序列包含SEQ ID 
NO:75的氨基酸2-42；(307)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸5-42；(308)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸10-42；(309)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸15-42；(310) 靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸20-42；(311)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸25-
42；(312)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 1-24；(313)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸9-24；(314)靶向序列包含SEQ ID NO:77；(315)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:78具有
至少 85％同一性的氨基酸序列；(316)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 2-24；(317)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-24；(318)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:80具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(319)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸1-38；(320)靶向序
列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸23-38；(321)靶向序列包含SEQ ID NO:81；(322)外孢壁蛋
白包含与SEQ ID NO:82具有至少85％同一性的氨基酸序列；(323)靶向序列包含SEQ ID 
NO:81的氨基酸2-38；(324)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸5-38；(325)靶向序列包
含SEQ ID NO:81的氨基酸10-38； (326)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸15-38；(327)靶向序列包含 SEQ ID NO:81的氨基酸20-38；(328)靶向序列包含SEQ ID NO:83的氨基酸
1-34；(329)靶向序列包含SEQ ID NO:83；(330)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:84具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(331)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:86具有至少85％同一性的
氨基酸序列；(332)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸1-28；(333)靶向序列包含SEQ ID NO: 87的氨基酸13-28；(334)靶向序列包含SEQ ID NO:87；(335)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:88具有至少85％同一性的氨基酸序列；(336)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸2-
28；(337)靶向序列包含SEQ ID NO: 87的氨基酸5-28；(338)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸10-28； (339)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸1-28；(340)靶向序列包含 SEQ ID NO:89；(341)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(342)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸2-28； (343)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨
基酸5-28；(344)靶向序列包含 SEQ ID NO:89的氨基酸10-28；(345)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸1-93；(346)靶向序列包含SEQ ID NO:91；(347)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:92具有至少85％同一性的氨基酸序列；(348)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸2-
93；(349)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸10-93；(350)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸20-93；(351) 靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸30-93；(352)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸40-93；(353)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸 50-93；(354)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸60-93；(355)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸1-130；
(356)靶向序列包含SEQ ID NO: 93；(357)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:94具有至少85％
同一性的氨基酸序列；(358)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸2-130；(359)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸10-130；(360)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸20-130；
(361)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸 30-130；(362)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
122具有至少85％同一性的氨基酸序列；(363)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸
20-33； (364)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸21-33；(365)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸23-31；(366)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:96的氨基酸1-15；
(367)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:96的氨基酸1-13；(368)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸12-25；(369)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸13-25； (370)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸15-23；(371)靶向序列由下列组成：SEQ ID 
NO:97的氨基酸1-15；(372)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-13；(373)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸23-36；(374)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸23-34；(375)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸24-36； (376)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸26-34；(377)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸
13-26；(378)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸13-24；(379)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸14-26；(380)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸16-24；
(381)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-22； (382)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-20；(383)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸10-22；(384)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸12-20；(385)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
105的氨基酸1-15；(386)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:105的氨基酸1-13；(387)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸18-31； (388)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸18-29；(389)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸19-31；(390)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-15；(391)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-13；(392)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-31；(393)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-29； (394)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸19-31；(395)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸21-29；(396)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:99的氨基酸1-15；(397)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:99的氨基酸1-
13；(398)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸28-41；(399)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:15的氨基酸28-39； (400)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸29-41；
(401)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸31-39；(402)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:17的氨基酸12-25；(403)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:17的氨基酸13-25；(404)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:100 的氨基酸1-15；(405)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸 18-31；(406)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸18-29；(407) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸19-31；(408)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸21-29；(409)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:21的氨基酸18-31；(410)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 21的氨基酸18-29；(411)靶向序列由下列组成：SEQ ID 
NO:21的氨基酸19-31；(412)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸21-29； (413)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:101的氨基酸1-15；(414)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
101的氨基酸1-13；(415)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸9-22；(416)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸9-20；(417)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸10-22；(418)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸12-20； (419)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:102的氨基酸1-15；(420)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:102的氨基酸1-13；(421)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸9-22；(422)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸9-20；(423)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸
10-22；(424)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸12-20； (425)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:103的氨基酸1-15；(426)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:103的氨基酸
1-13；(427)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸15-28；(428)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸15-26；(429)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27 的氨基酸16-
28；(430)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸 18-26；(431)靶向序列由下列组
成：SEQ ID NO:104的氨基酸1-15；(432) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:104的氨基酸1-
13；(433)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:33的氨基酸1-13；(434)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:33的氨基酸1-11；(435)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 33的氨基酸3-11；
(436)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸 1-14；(437)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸1-12；(438) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸2-14；(439)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:43的氨基酸14-27；(440)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:43的氨基酸14-25；(441)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 43的氨基酸15-27；(442)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸20-33；(443)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
45的氨基酸20-31； (444)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸21-33；(445)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:106的氨基酸1-15；(446)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
106的氨基酸1-13；(447)靶向序列由下列组成：SEQID NO:47的氨基酸28-41；(448)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:47 的氨基酸28-39；(449)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸18-31；(450)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸18-29；(451) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸19-31；(452)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸
18-31；(453)靶向序列包含SEQ ID NO:61 的氨基酸18-29；(454)靶向序列包含SEQ ID NO:
61的氨基酸19-31； (455)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸9-22；(456)靶向序列包含 SEQ ID NO:65的氨基酸9-20；(457)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸10-22；(458)靶向序列包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-15；(459) 靶向序列包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-
13；(460)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸12-25；(461)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸 12-23；(462)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸13-25；(463)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸15-23；(464)靶向序列包含SEQ ID NO: 69的氨基酸23-36；(465)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸23-34； (466)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸24-36；
(467)靶向序列包含 SEQ ID NO:69的氨基酸26-34；(468)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨
基酸27-40；(469)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-38；(470) 靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸9-22；(471)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸9-20；(472)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸 10-22；(473)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸12-20；(474)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸23-36；(475)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸23-
34；(476)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸24-36； (477)靶向序列包含SEQ ID NO:81
的氨基酸26-34；(478)靶向序列包含 SEQ ID NO:87的氨基酸13-26；(479)靶向序列包含
SEQ ID NO:87的氨基酸13-24；或(480)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸14-26。

[0910] 例如，靶向序列可包含或由下列组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸 20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约63％。

[0911] 靶向序列可包含或由下列组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35的具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约72％。

[0912] 靶向序列可包含或由下列组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约 63％。

[0913] 靶向序列可包含或由下列组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约62％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约 72％。

[0914] 靶向序列可包含或由下列组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约 81％。

[0915] 靶向序列可包含或由下列组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约 72％。

[0916] 靶向序列可包含或由下列组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约 81％。

[0917] 靶向序列可包含或由下列组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约 81％。

[0918] 靶向序列可包含或由下列组成：与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性至少约 90％。

[0919] 靶向序列可由下列组成:(a)氨基酸序列由下列组成：16个氨基酸并且与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性，其中与氨基酸25-35的同一性至少约54％；(b)SEQ ID NO:1的氨基酸1-35；(c)SEQ ID NO:1的氨基酸20-35；(d)SEQ ID NO:1；(e)SEQ ID NO:96；或(f) SEQ ID NO:120。

[0920] 外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、 48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、76、78、
80、 82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、
120、121和122具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0921] 外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、 48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、76、78、
80、 82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、
120、121和122具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0922] 外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、 48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、76、78、
80、 82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、
120、121和122具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0923] 外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、 48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、76、78、
80、 82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、
120、121和122具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0924] 外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、 48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、76、78、
80、 82、84、86、88、90、92、94、95、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、
120、121和122具有至少100％同一性的氨基酸序列。

[0925] 靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可在其羧基末端包含氨基酸序列GXT，其中X是任何氨基酸。

[0926] 靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可在对应SEQ ID NO:1的氨基酸20的靶向序列的位置处包含丙氨酸残基。

[0927] 靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段还可在靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的第一氨基酸紧接前面的氨基酸位点或对应SEQ ID NO:1的氨基酸20的靶向序列
位点处包含甲硫氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基。

[0928] 融合蛋白还可包含在靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段、和目标蛋白或肽之间的氨基酸接头。接头可以是上述章节XI中所述的任何接头。

[0929] 融合蛋白可以在天然于融合蛋白或其蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的孢子形成启动子的控制下、和/或高表达孢子形成启动子的控制下表达。启动子可以是上面章节III中所述任何启动子。

[0930] 还提供将蛋白或肽递送至动物的另外方法。该方法包括向动物喂养重组孢子-形成细菌。重组孢子-形成细菌可以是上面章节IX中所述任何重组孢子-形成细菌。

[0931] 重组孢子-形成细菌可以包含在喂养动物的植物内。

[0932] 重组孢子-形成细菌可包括内生和益生菌细菌菌株。例如，内生和益生菌细菌菌株可包括巨大芽孢杆菌EE385(NRRL B-50980)、杆菌sp. EE387(NRRL B-50981)、环状芽孢杆
菌EE388(NRRL B-50982)、枯草芽胞杆菌EE405(NRRL B-50978)、Lysinibacillus 
fusiformis EE442 (NRRL B-50975)、或Lysinibacillus sphaericus EE443(NRRL B-
50976)、短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL B-67123)或其组合。

[0933] 在上述方法中的任一个中，植物可以在喂养动物前进行处理。

[0934] 在上述涉及向动物喂养植物的方法中的任一个中，该方法还可包括将内生细菌菌株或包含内生细菌菌株的制剂引入植物生长介质。或者，该方法可包括将内生细菌菌株或
包含内生细菌菌株的制剂施加至植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域。向动物喂养的植物可包括：在含有内生和益生菌细菌菌株或包含内生和益生菌细菌菌株的制剂的
植物生长介质中生长的植物、施加内生和益生菌细菌菌株的植物、从施加内生和益生菌细
菌菌株的植物种子生长的植物、在施加内生和益生菌细菌菌株的区域中生长的植物、或在
施加内生和益生菌细菌菌株的区域中生长的种子。

[0935] 在上述递送蛋白或肽至动物的方法中的任一个中，目标蛋白或肽包括酶。例如，酶可包括木聚糖酶、木糖苷酶、肌醇六磷酸酶、磷酸酶、蛋白酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶(例如α-淀粉酶或β-淀粉酶)、脂肪酶、磷脂酶、转葡糖基酶、半乳聚糖酶、α- 半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、果胶酶、生物素酶、多聚半乳糖醛酸酶、木质素酶或其组合物。脂肪酶可以包含磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D、溶血磷脂酶或其组合。酶优选包括木聚糖酶或肌醇六磷酸酶。

[0936] 在包括将植物喂给动物的任何方法中，植物可以在喂养动物之前加工。

[0937] 在包括将细菌、蛋白或肽递送到动物的任何上述方法中，动物可以是哺乳动物(例如羊、山羊、牛、猪、鹿、羊驼、野牛、骆驼、驴、马、骡子、美洲驼、兔子、狗或猫)、禽(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑或野鸡)、鱼(例如鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、金枪鱼、鲶鱼或鲤鱼)、或甲壳类(例如虾、虾、龙虾、螃蟹或小龙虾)。

[0938] XXI.将有益核酸递送至动物、昆虫、蠕虫、真菌和原生动物的方法

[0939] 本发明进一步涉及将核酸分子递送至动物、昆虫、蠕虫、真菌和原生动物的方法。

[0940] 该方法可以包括向动物、昆虫或蠕虫喂养植物，所述植物被修饰为包含这样水平的核酸分子，该水平大于在在相同条件下生长的在未被修饰的相同植物中的核酸分子的水
平。

[0941] 提供另外向动物、昆虫或蠕虫递送核酸分子的方法。该方法可以包括向动物、昆虫或蠕虫喂养表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白
片段。或者，该方法可以包括向动物、昆虫或蠕虫喂养表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌，融合蛋白包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白。
目标蛋白或肽包括核酸结合蛋白或肽和核酸分子结合DNA或 RNA结合蛋白或肽。核酸结合
蛋白或肽可物理附着于重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁或重组孢子-形成细菌的孢子
包衣。

[0942] 提供另一向动物、昆虫或蠕虫递送核酸分子的方法。该方法可以包括向动物、昆虫或蠕虫喂养衍生自重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁片段。外孢壁片段衍生自本文上面章节IV中所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白。融合蛋白包括核
酸结合蛋白或肽，和其中核酸结合蛋白或肽结合核酸分子。

[0943] 蠕虫优选是线虫。

[0944] 提供向真菌或原生动物递送核酸分子的方法。该方法包括使真菌或原生动物接触表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞
杆菌家族成员的外孢壁的目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。或者，该方法包括真菌或原生动物接触表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌，融合蛋白包含使融
合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白。目标蛋白或肽包括
核酸结合蛋白或肽，和核酸分子结合核酸结合蛋白或肽。

[0945] 提供另外向真菌或原生动物递送核酸分子的方法。该方法包括使真菌或原生动物接触外孢壁片段。外孢壁片段衍生自本文上面章节IV中所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员
的孢子，并且包含融合蛋白。融合蛋白包括核酸结合蛋白或肽，和其中核酸结合蛋白或肽结合核酸分子。

[0946] 核酸分子可以包含调节RNA分子、RNAi分子、微RNA、适配体、或编码调节RNA分子、RNAi分子、微小RNA或适体的DNA分子。

[0947] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含表达融合蛋白的任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[0948] 融合蛋白可以包含本文所述任何融合蛋白，并且包括核酸结合蛋白。

[0949] 孢子外壳蛋白包含CotB蛋白、CotC蛋白、CgeA蛋白、CotB/H蛋白、CotG蛋白、孢子外壳蛋白X蛋白或CotY蛋白。

[0950] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少85％同一性的氨基酸序列。

[0951] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。

[0952] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少95％同一性的氨基酸序列。

[0953] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少98％同一性的氨基酸序列。

[0954] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少99％同一性的氨基酸序列。

[0955] 孢子外壳蛋白可包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少100％同一性的氨基酸序列。

[0956] 上述方法可用于多种用途。例如，这些方法可以用于向动物递送RNA 或DNA，以降低动物对疾病或治疗动物疾病的易感性(例如中风、糖尿病、心脏病和退行性疾病的有机疾病)。RNA和DNA也被证明对消除或治疗动物病原体引起的疾病有效，例如细菌、病毒、蠕虫(例如线虫)和真菌。 RNA和DNA可以直接作用于病原体，或者可以与动物的免疫系统一起起作用或增加免疫反应。

[0957] 另外，上述方法可用于消除虫害，包括昆虫、蠕虫(例如线虫)、真菌和原生动物。将特异性RNA或DNA递送至病虫害可导致有害生物感染宿主的能力下降(例如植物宿主)，减少对目标宿主或植物的摄食，通过阻断关键基因直接杀死或其他各种效果。

[0958] XXII.产生免疫原性应答的疫苗和方法

[0959] 提供了疫苗，其包含药学上可接受的载体和表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子，如上文章节I的段落[00171]、[00173]-[00176]所述，其中目标蛋白或肽是抗原或免疫原。

[0960] 提供了另外疫苗，其包含药学上可接受的载体和外孢壁片段。外孢壁片段衍生自本文上面章节IV中所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白。融合蛋
白包含抗原。

[0961] 提供了另一疫苗，其包含药学上可接受的载体和重组蜡样芽胞杆菌家族成员。重组蜡样芽胞杆菌家族成员是如上面章节II中所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[0962] 在包含如上面章节II中所述的外孢壁片段或重组蜡样芽胞杆菌家族成员的疫苗中，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含任何本文所述的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。具体来说，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含上面段落
[00782]-[00801]所述的任何靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。

[0963] 融合蛋白可在天然于融合蛋白或其蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的孢子形成启动子控制下和/或高表达孢子形成启动子控制下表达。启动子可以是上面
章节III中所述任何启动子。

[0964] 当目标蛋白或肽是抗原时，在孢子外部或外孢壁片段上呈现抗原提供免疫系统响应，以实现针对各种病原体或疾病的接种。合适的抗原或小分子是当在杆菌孢子的外部表
达或在外孢壁片段上呈现时，已知或预期会违法所需的免疫应答足以产生治疗或保护作用
的抗原或小分子。一旦将重组抗原结合到外孢壁中，即通过免疫系统检测重组分子的抗原
部分，大部分的适应性将通过三维结构中的折叠来确定。

[0965] 可以衍生抗原的病原体或疾病包括但不限于：由鲍氏不动杆菌引起的不动杆菌感染；放线菌病，由以色列放线菌、放线菌放线菌和丙酸丙酸杆菌引起；非洲昏睡病，由布鲁斯锥虫引起；获得免疫缺陷综合征(AIDS)，由人类免疫缺陷病毒引起；阿米巴病，由溶组织内阿米巴引起；边虫病，由Anaplasma genus引起；炭疽，由炭疽杆菌引起；溶血隐秘杆菌感染，由Arcanobacterium haemolyticum引起；阿根廷出血热，由Junin病毒引起；蛔虫病，由蛔虫引起；星状病毒感染，由Astroviradae家族引起；巴贝虫属(Babesiosis)，巴贝虫属
(Babesia)属蜡状芽孢杆菌感染，由蜡状芽孢杆菌引起；细菌性肺炎细菌性阴道炎；由细菌属引起的拟杆菌感染； Balantidiasis，由大肠杆菌引起；贝蛔虫感染，由Baylisascaris genus引起；BK病毒感染，由BK病毒引起；黑色毛结节菌病，由Piedraia hortae 引起；由人囊虫引起的人囊虫感染；由Blastomyces dermatitidis引起的芽孢杆菌病；玻利维亚出血
热，由麻疹病毒引起；由疏螺旋体属引起的疏螺旋体感染；由肉毒杆菌毒素摄入引起的肉毒杆菌(和婴儿肉毒杆菌病)；巴西出血热引起萨比亚；由布鲁杆菌属引起的布鲁氏菌病伯克
霍尔德氏菌感染；由通常的伯克霍尔德氏菌和其他伯克霍尔德氏菌物种引起；布鲁利溃疡，由溃疡分枝杆菌引起；由杯状病毒科家族引起的杯状病毒感染(诺如病毒和痘病毒)；弯曲
杆菌属引起的弯曲杆菌病；通常由白色念珠菌和其他念珠菌属引起的念珠菌病
(Monidasis；Thrush)；猫咬伤病，由巴氏杆菌引起；由通常A组链球菌和葡萄球菌引起的蜂窝织炎；奇格病(美洲锥虫病)，由克氏锥虫引起；嗜血杆菌，由嗜血杆菌引起；水痘，由水痘带状疱疹病毒(VZV)引起；衣原体，由沙眼衣原体引起；肺炎衣原体感染，由肺炎衣原体引起；霍乱弧菌引起的霍乱；色素芽孢杆菌病；通常由 Fonsecaea pedrosoi引起；中华支气管炎引起的嗜铬细胞瘤艰难梭菌感染，由艰难梭菌引起；球孢子菌病，由球孢子虫
(Coccidioides immitis) 和球孢子虫(Coccidioides posadasii)引起；科罗拉多蜱热
(CTF)，由科罗拉多州蜱热病毒(CTFV)引起；普通感冒(急性病毒性鼻咽炎；急性鼻炎)，由通常的鼻病毒和冠状病毒引起；Creutzfeldt-Jakob病(CJD)，由CJD 朊病毒引起；克里米亚-刚果出血热(CCHF)，由克里米亚-刚果出血热病毒引起；由隐球菌新生隐球菌引起的隐球菌病；隐孢子虫病由隐孢子虫属引起；皮肤幼虫(CLM)，由通常的Ancylostoma braziliense和多种其他寄生虫引起；环孢子虫由环孢子虫引起；猪囊虫病，由绦虫引起；由巨细胞病毒引起的巨细胞病毒感染；登革热引起登革热病毒(DEN-1、DEN-2、DEN-3 和DEN-4)-病毒感染；
Dientamoebiasis，由脆弱的丹参粉刺引起；白喉由白喉棒状杆菌引起；由紫花苜蓿引起的紫花苜蓿Dracunculiasis，由 Dracunculus medinensis引起；埃博拉病毒出血热由埃博拉病毒(EBOV) 引起；包虫病，由棘球绦虫属引起；埃里希体病，由埃氏杆菌属引起；肠虱病(蛔虫感染)，由蠕虫引起；肠球菌感染，由肠球菌属引起；由肠道病毒属引起的肠道病毒感染；
由立克次体引起的流行性斑疹伤寒红细菌感染(第五病)，由细小病毒B19引起；人类疱疹病毒6(HHV-6)和人疱疹病毒7(HHV-7)引起的白藜芦醇；Fasciolopsis buski引起的筋膜病、
由Fasciola hepatica和Fasciola gigantica引起的筋膜炎病毒致命性家族性失眠(FFI)、
由FFI朊病毒引起；丝虫病引起丝虫病超家族；由产气荚膜梭菌引起的食物中毒；自由生活的阿米巴感染；由杆菌属引起的杆菌感染；气管坏疽(Clostridial myonecrosis)，由通常产气荚膜梭菌或其他梭菌属引起；Geotrichum candidum引起的地热病 Gerstmann-
Straussler-Scheinker综合征(GSS)，由GSS朊病毒引起；贾第鞭毛虫，由贾第鞭毛虫引起；
由伯克霍尔德氏菌引起的腺体 Gnathostomiasis，由Gnathostoma spinigerum和
Gnathostoma hispidum 引起；淋病奈瑟菌引起淋病；肉芽肿肉芽肿(Donovanosis)，由克雷伯杆菌肉芽肿引起；A型链球菌感染，由化脓性链球菌引起；B型链球菌感染，由无乳链球菌引起；流感嗜血杆菌感染，由流感嗜血杆菌引起；由肠道病毒引起的手足口病(HFMD)，主要是柯萨奇A病毒和肠病毒71(EV71)；汉诺威病毒肺炎综合征(HPS)，由Sin Nombre病毒引起；
由幽门螺杆菌引起的幽门螺杆菌感染；溶血性尿毒综合征(HUS)，由大肠杆菌O157:H7 引
起；出血热与肾综合征(HFRS)，由布尼瓦病毒科引起；甲型肝炎由甲型肝炎病毒引起；乙型肝炎，由乙型肝炎病毒引起；丙型肝炎，由丙型肝炎病毒引起；丙型肝炎病毒引起的乙型肝炎；戊型肝炎，由戊型肝炎病毒引起；单纯疱疹病毒由单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)引起；组织胞浆菌病由组织胞浆菌引起；钩虫感染，由十二指肠十二指肠和美洲N 虫引起；人类bocavirus(HBoV)引起的人类bocavirus感染；人类ewingii ehrlichiosis，由Ehrlichia ewingii引起；人类粒细胞性无性淀粉病(HGA)，由无精蛋白噬菌体引起；人类偏肺病毒
(hMPV)引起的人类肺炎病毒感染；人类单核细胞埃里希体病，由埃里希氏杆菌引起；人乳头状瘤病毒 (HPV)引起的人乳头状瘤病毒(HPV)感染；由人副流感病毒(HPIV) 引起的人类副
流感病毒感染；膜壳绦虫病，由短膜壳绦虫和长膜壳绦虫引起；爱泼斯坦-巴尔病毒传染性单核细胞增多症(Mono)，由Epstein-Ban 病毒(EBV)引起；流感(flu)，由正粘病毒科家族引起；Isospora Belli引起的孢子虫病川崎病(原因不明，但有证据表明它是传染性的)；角膜炎金缕梅感染，由金缕梅引起；Kuru由Kuru朊病毒引起；拉沙热引起拉沙病毒；由嗜肺军团菌引起的军团病(Legionelaiisis，Legionelairesis)军团菌(庞蒂亚热)，由嗜肺军团菌引起；利什曼病由利什曼原虫属引起；麻风病，由麻风分枝杆菌和前列腺分枝杆菌引起；钩端螺旋体属钩端螺旋体病利斯特氏菌病，由单核细胞增生利斯特氏菌引起；莱姆病(Lyme 
borreliosis)，由通常的Borrelia burgdorferi和其他Borrelia种引起；淋巴丝虫病
(Elephantiasis)，由Wuchereria bancrofti和Brugia malayi引起；由淋巴细胞性脉络丛
脑膜炎病毒(LCMV)引起的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎由疟原虫属引起的疟疾；马尔堡出血热
(MHF)，由马尔堡病毒引起；麻疹由麻疹病毒引起；白念菌病(Whitmore's disease)，由伯氏假单胞菌引起；脑膜炎；脑膜炎球菌病引起脑膜炎奈瑟菌；后殖吸虫病，由通常的 
Metagonimus yokagawai引起；微孢子虫病由微孢子虫门引起；由传染性软疣病毒(MCV)引
起的传染性软体动物(MC)；腮腺炎，由腮腺炎病毒引起；鼠伤寒(地方性斑疹伤寒)，由立克次体感染引起；支原体肺炎，由肺炎支原体引起；由多种细菌(Actinomycetoma)和真菌
(Eumycetoma) 引起的Mycetoma；寄生虫蝇幼虫引起的蝇蛆病新生儿结膜炎(Ophthalmia 
neonatorum)，由最常见的沙眼衣原体和淋病奈瑟菌引起；(新)变体 Creutzfeldt-Jakob病(vCJD，nvCJD)，由vCJD朊病毒引起；诺卡氏菌属由诺卡氏菌(Nocardia asteroides)和其他诺卡氏菌(Nocardia)种类引起；盘尾丝虫病(River blindness)，由Onchocerca卷曲引起；
由 Paracoccidioides brasiliensis引起的副球孢子菌病(南美芽孢杆菌病)；肺吸虫病，
由通常的Paragonimus westermani和其他Paragonimus物种引起；出血性败血病，由
Pasteurella genus引起；由头虱引起的头虱病 (虱子)；由耻垢病毒(Phthirus pubis)引
起的Pediculosis耻骨(阴茎虱、螃蟹虱)盆腔炎(PID)；百日咳百日咳(百日咳)由百日咳杆
菌引起；由鼠疫耶尔森氏菌引起的瘟疫；由肺炎链球菌引起的肺炎球菌感染；肺囊虫肺炎
(PCP)，由肺孢子虫引起；肺炎；由脊髓灰质炎病毒引起的脊髓灰质炎普雷沃氏菌属感染，由Prevotella属引起；原发性阿米巴脑膜脑炎 (PAM)，由通常的奈格列菌引起；由JC病毒引起的进行性多灶性白质脑病；鹦鹉热衣原体引起的鹦鹉病；Q发烧，由Coxiella burnetii引
起；狂犬病是由狂犬病毒引起的大鼠咬热，由链球菌和螺旋体减少引起；呼吸道合胞病毒感染，呼吸道合胞病毒(RSV)引起；Rhinosporidium seeberi 引起的鼻孢杆菌病；鼻病毒感染由鼻病毒引起；立克次体感染引起的立克次体感染；立克次体引起立克次体裂谷热病
(RVF)，由裂谷热病毒引起；落矶山脉发烧(RMSF)，由立克次体立克次体引起；由轮状病毒引起的轮状病毒感染；风疹，由风疹病毒引起；由沙门氏菌属引起的沙门氏菌病；由SARS冠状病毒引起的SARS(严重急性呼吸综合征)；疥疮，由耻骨痂病引起；由血吸虫病引起的血吸虫病；脓毒症；志贺氏菌属(杆菌性痢疾)，由志贺氏菌属引起；带状疱疹(带状疱疹)，由水痘带状疱疹病毒(VZV) 引起；天花(天花)，由天花或天马未成年人引起；由孢镰刀菌引起的孢子丝虫病；葡萄球菌食物中毒，由葡萄球菌属引起；由葡萄球菌属引起的葡萄球菌感染；由强直肠炎引起的强直肠炎；梅毒，由梅毒螺旋体引起；绦虫属，由绦虫属引起；破伤风
(Lockjaw)，由破伤风梭菌引起；由通常的毛癣菌属引起的豚鼠(理发瘙痒)头癣(头皮癣)，由普通毛癣菌引起；癣菌(身体的癣菌)，由通常的毛癣菌属引起；癣疮(Jock itch)，由通常的表皮癣菌，红色毛癣菌和引致毛癣菌引起；癣菌(手癣)，由红色毛癣菌引起；疣黑，由通常的霍耳，虫引起；足癣(运动员脚)，由普通毛癣菌属引起；癣(甲癣)，由普通毛癣菌属引起；
由马拉色氏菌属引起的花斑癣(疣状糠疹)由Toxocara canis或Toxocara cati引起的毒蛾
(Ocular Larva Migrans(OLM)))由Toxocara canis或Toxocara cati引起的毒蕈病(内脏
幼虫(VLM))由弓形虫引起的弓形体病由旋毛虫引起的旋毛虫病；滴虫病是由阴道毛滴虫引
起的；恙虫病(鞭虫感染)，由Trichuris trichiura引起；肺结核，由通常的结核分枝杆菌引起；由土拉弗朗西斯菌引起的图雷雷米亚解脲支原体感染，由解脲脲原体引起；委内瑞拉马脑炎，由委内瑞拉马脑炎病毒引起；委内瑞拉出血热，由瓜纳里托病毒引起；病毒性肺炎；西尼罗河病引起西尼罗病毒；白秃疮(Tinea blanca)，由 Trichosporon beigelii引起；耶尔森氏菌结核分枝杆菌感染，由耶尔森氏菌结核分枝杆菌引起；耶尔森酵母菌引起的小肠结
肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)黄热病，由黄热病病毒；由粘多糖序列
(Mucalycosis)和 Entomophthorales顺序(Entomopharoramycosis)引起的接合菌病。

[0966] 如果目标蛋白或肽是抗原，可以使用任何蜡样芽胞杆菌家族成员表达融合蛋白。优选苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。

[0967] 为了制备疫苗，将目标抗原通过已知方法掺入融合蛋白中，例如通过重叠延伸的PCR剪接、限制性核酸内切酶消化和连接、或de novO基因合成。然后通过转染、转化、共轭、电穿孔或其他已知方法将融合蛋白基因导入重组蜡样芽胞杆菌家族成员中。然后将重组蜡
样芽胞杆菌家族成员生长在培养基(例如最小液体培养基)中，并允许要孢子在孢子收集和
储存之前，优选孢子形成继续完成。可以通过离心或从生长板上吸取孢子并将其引入液体
培养基(例如PBS或水)中收集孢子，然后离心并将所得孢子沉淀物在液体培养基中洗涤。在使用前，孢子颗粒可以重新悬浮在液体介质中以达到所需的浓度以供使用或注射。在疫苗
要包括外孢壁片段的情况下，可以使用上述章节XIX.H中所述的任何方法制备外孢壁片段。

[0968] 疫苗中重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子或外孢壁片段的期望浓度是基于受试者的大小，孢子表面上的活性抗原的量以及佐剂的存在和浓度在疫苗制剂中。本发明的疫苗
可以含有常规的佐剂，包括药学上可接受的载体。

[0969] 提供了一种在受试者中产生免疫原性应答的方法。该方法包括给予本文所述的包含融合蛋白的融合蛋白或外孢壁片段的重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的疫苗。

[0970] 如本文所述的疫苗适用于静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、局部、口服、鼻内、皮内、经上皮内施用或通过吸入。

[0971] 疫苗可以施用于人、鼠、禽、猪、牛、绵羊、猫科动物、犬、马、山羊、爬行动物或非灵长类动物的受试者。受试者优选哺乳动物，最优选人。

[0972] XXIII.补救

[0973] 当目标蛋白或肽是补救蛋白或肽时，有毒物质被补救蛋白或者肽催化转化为非毒性或毒性较小的物质。

[0974] 当补救蛋白或肽包含酶时，酶在孢子外部被呈现和稳定，并且可以以对目标污染物或目标化学物质有活性的形式递送到污染的土壤或污染的水中。

[0975] 合适的酶依赖于补救目标的污染物或化学物质。

[0976] 为了制备补救组合物，通过已知的方法将感兴趣的酶并入融合蛋白，例如通过重叠延伸的PCR剪接、限制性核酸内切酶消化和连接或de novO 基因合成，然后将融合蛋白基因引入通过转染、转化、共轭、电穿孔或其他已知方法，重组蜡样芽胞杆菌家族成员，然后在培养基(例如最小液体培养基)中生长并使其形成孢子。在孢子收集和储存之前，优选孢子
形成继续完成。可以通过离心或从生长板上吸取孢子并将其引入液体培养基 (例如PBS或
水)中收集孢子，然后离心并将所得孢子沉淀物在液体培养基中洗涤。使用前，孢子颗粒可以重新悬浮在液体介质中至所需的浓度以供使用。或者，孢子颗粒可以以期望的浓度配制
成颗粒，以用于污染环境。外孢壁片段用于补救时，可以使用上述章节XIX.H中所述的任何方法制备外孢壁片段。

[0977] 提供一种在环境中减少污染物的方法。方法包括将污染的环境暴露于表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子中，如上面章节I的段落 [00171]、[00173]-[00175]
和[00177]所述，其中目标蛋白或肽包括修复酶。

[0978] 提供另外一种降低环境中污染物的方法。该方法包括将受污染的环境暴露于外孢壁片段。外孢壁片段衍生自上文章节IV中描述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，并且包含融
合蛋白。融合蛋白包含修复酶。

[0979] 提供又一种减少环境中污染物的方法。该方法包括将受污染的环境暴露于重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子中。重组蜡样芽胞杆菌家族成员是上面章节II中所述的重组蜡
样芽胞杆菌家族成员。

[0980] 在减少污染物的方法中，包括将受污染的环境暴露于如上面章节II中所述的外孢壁片段或重组蜡样芽胞杆菌家族成员，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可以是任
何本文所述的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。具体来说，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含上面段落[00782]-[00801]所述的任何靶向序列、外孢壁蛋白或
外孢壁蛋白片段。

[0981] 融合蛋白可在天然于融合蛋白或其蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的孢子形成启动子控制下和/或高表达孢子形成启动子控制下表达。启动子可以是上面
章节III中所述任何启动子。

[0982] 当目标蛋白或肽是修复酶时，可以使用任何蜡样芽胞杆菌家族成员来表达融合蛋白。优选苏云金芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌或蕈状芽孢杆菌。

[0983] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子可包含用于植物补救的内生细菌菌株，例如蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444或苏云金芽孢杆菌EE319。

[0984] 待处理的污染环境可以是气体、液体、半液体、凝胶、薄膜、半固体或固体。固体环境可以是土壤，例如表面土壤和地下土壤、堆肥、作物残渣、叶子、覆盖物、切割树木、生物膜、泥土层、霉菌、污泥、沙子、矿渣、沉积物、污水、废石、核废料、军火、医院废物、汽车零件、金属切割、绝缘废物、食品废物、石棉、电池、工业废料、垃圾填埋废物、木材废料、纺织废物、玻璃废物、皮革废料、橡胶废料、塑料废料、电子元件废物、农业废弃物、摄影废物、陶瓷废物、医药废物、蜡、废催化剂或其组合。液体环境可以是饮用水、地下水、地表水、盐水、储罐、泻湖、水生系统、工业废水、酸性矿井排水、废自流体、废电镀浴、脱脂溶液、干洗液、机器冷却剂、钻井液废液、切削液废料、水力压裂流体废物、润滑剂废料、油漆、灰水、油性废水、纸浆水处理系统、化粪系统、下水道系统、降水泻湖、保存池塘、湖泊、河流或其组合。气体环境可以是空气，例如烟电、发电厂、废物焚化炉、火葬场或炼油厂的排放物、工艺废气流、填埋气体、天然气、丙烷气体或其组合。

[0985] 受污染的环境可能被各种污染物污染，包括但不限于包含沙林(GB、 o-异丙基甲基膦酰氟)的化学战剂；索曼(GD、邻-频那基甲基膦酰氟)；环磷酰胺(GF、邻环己基甲基膦酰氟)；VX(O-乙基S-[2-(二异丙基氨基)乙基]甲基膦酰硫酸酯)；Tabun(GA、N,N-二甲基乙基磷酰胺脒基)、 DFP(二异丙基膦酰氟化物)或芥子剂；包括砷、锑、钡、铍、镉、铬、铜、铁、铅、锰、汞、镍、硒、银、锡、铊、铀、锌或其组合的无机化合物；包括多环芳烃(PAH)、氯化芳香族化合物、氯化脂肪族化合物、硝基芳香族化合物(NAC)、酚类化合物、氰基化合物、二恶英或其组合的有机化合物；原油、成品油、燃料油、柴油、汽油、液压油、煤油、或挥发性成分，例如苯、甲苯、乙基苯、二甲苯或萘；爆炸物、化肥、杀虫剂、杀虫剂或除草剂。

[0986] 处理受污染环境所需的重组孢子或外孢壁片段的浓度是基于以下因素，包括：待处理的体积或面积、目标化学品的程度、存在的污染物或有机物质、处理时间、以及活性酶在孢子表面的量。

[0987] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子或外孢壁片段可以通过将孢子或外孢壁片段并入含有污染物的物流接触污染环境、将含有污染物的物流与含有孢子或将外孢壁片段(例
如过滤器、膜、海绵或盒)、将孢子或外孢壁片段合并成颗粒以与受污染的环境混合、将孢子或外孢壁片段喷洒到污染环境、将孢子或外孢壁片段注入污染的环境、或用孢子或外孢壁
片段浸润受污染的环境。

[0988] 孢子可以与细菌菌剂、化学品、溶剂和其他可以加速分解过程的产品相结合。

[0989] 修复酶包括但不限于磷酸酯结合蛋白、蛋白酶、碳水化合物水解酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、营养结合蛋白、纤维素酶、氧化还原酶、单加氧酶、二氧加氧酶、漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、过氧化物酶、脱卤素酶、过氧化氢酶、淀粉酶、还原酶、氧化酶、酰胺酶、木质素酶、木聚糖酶、果胶酶、木糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、生物膜抑制肽、除草剂降解酶、杀虫剂降解酶(例如除虫菊酯酶) 或其组合。

[0990] 当酶包括除草剂-降解酶或杀虫剂-降解酶时，重组蜡样芽胞杆菌家族成员合适地包括能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株。例如，能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株可包括
蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No. B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377
(NRRL B-67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)或蕈状芽孢杆菌EE-B00363 
(NRRL B-67121)。

[0991] 还提供了污染土壤植物补救的方法。该方法包括将重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子引入受污染的土壤中；或将重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子施加于种植在污染土壤中的
植物，或施加于种植在污染土壤中的植物种子、植物或植物种子周围的污染土壤；其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子表达融合蛋白，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成
员的外孢壁孢子的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其
中融合蛋白是上述融合蛋白，其中目标蛋白或肽包括修复酶，和其中重组蜡样芽胞杆菌家
族成员包括内生细菌菌株或根部定殖细菌菌株。例如，重组孢子-形成细菌可包括内生细菌菌株。

[0992] 提供另一种植物补救污染土壤的方法。该方法包括在蜡样芽胞杆菌家族成员孢子中表达修复酶，其中在重组蜡样芽孢杆菌家族成员孢子中修复酶的表达相对于修复酶在野
生型蜡样芽胞杆菌家族成员中孢子中的表达增强。

[0993] 还提供了另一种植物补救污染土壤的方法。该方法包括将重组孢子- 形成细菌引入受污染的土壤；或将重组孢子-形成细菌施用于种植在污染土壤中的植物、或种植在污染土壤中的植物种子、或者围绕植物或植物种子的污染土壤区域。表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白。
孢子外壳蛋白包括CotB蛋白、CotC蛋白、CgeA蛋白、CotB/H蛋白、Cot G蛋白、孢子外壳蛋白X蛋白或CotY蛋白。重组孢子-形成细菌包括内生细菌菌株或根部定殖细菌菌株。目标蛋白或肽包括修复酶。

[0994] 还提供了又一种植物补救污染土壤的方法。该方法包括将外孢壁片段引入受污染的土壤；或将外孢壁片段施用于种植在污染土壤中的植物、或种植在污染土壤中的植物种
子、或者围绕植物或植物种子的污染土壤区域。外孢壁片段衍生自上面章节IV所述的重组
蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白。融合蛋白包括修复酶。

[0995] 还提供了再一种植物补救污染土壤的方法。该方法包括将重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子引入受污染的土壤。或者，该方法包括将重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子施
用于种植在污染土壤中的植物、或种植在污染土壤中的植物种子、或者围绕植物或植物种
子的污染土壤区域。重组蜡样芽胞杆菌家族成员是如上面章节II中所述的重组蜡样芽胞杆
菌家族成员，并且融合蛋白包括修复酶。

[0996] 在植物补救污染土壤的方法中，包括使用如上面章节II中所述的外孢壁片段或重组蜡样芽胞杆菌家族成员，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含任何本文所述
的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。具体来说，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含上面段落 [00782]-[00801]所述的任何靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白
片段。

[0997] 融合蛋白可在天然于融合蛋白或其蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的孢子形成启动子控制下和/或高表达孢子形成启动子控制下表达。启动子可以是上面
章节III中所述任何启动子。

[0998] 修复酶呈现在孢子外部和植物内，使得植物和孢子都可以转化目标污染物。植物可以占据目标污染物，而孢子将污染物转化为植物或其根系统内的非毒性或毒性较小的形
式。

[0999] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子可包含内生细菌菌株，例如蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌 EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、或苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377、假蕈状芽孢杆菌 EE-B00366或蕈状芽孢杆菌EE-B00363。

[1000] 孢子或外孢壁片段可以施加至植物或植物种子，并且植物或从植物种子生长的植物对待污染土壤的目标污染物具有耐受性。

[1001] 在植物补救方法中，重组蜡样芽胞杆菌家族成员在植物内进行孢子形成。

[1002] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子可以通过各种方法引入植物生长介质中，例如土壤浸种在种植时。孢子也可以作为种子处理剂涂在植物种子上。

[1003] 优选地，用修复酶处理的植物对目标污染物是耐受的，使得植物不被目标污染物损伤。

[1004] 植物补救方法所需的重组孢子的浓度基于下列因素，包括以所要处理的体积或面积、内生菌株定植植物根系的能力、目标污染物的存在量、以及活性酶在孢子表面的量。

[1005] 还提供了一种降低环境中污染物的方法。该方法包括将受污染的环境暴露于能够除去除草剂或杀虫剂的蜡样芽胞杆菌家族成员菌株的孢子中。环境中的污染物包括除草
剂、杀虫剂或其组合。能降解除草剂或杀虫剂的蜡样芽胞杆菌家族成员菌株包括蜡样芽胞
杆菌家族成员EE349(NRRL No. B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-
67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)、蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-
67121)或其组合。

[1006] 能降解除草剂或杀虫剂的蜡样芽胞杆菌家族成员菌株可包括表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外
孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。目标蛋白或肽
优选包括除草剂-降解酶、杀虫剂-降解酶或其组合。

[1007] 这样，可以获得双重杀虫剂或除草剂降解活性，因为融合蛋白中的蜡样芽胞杆菌家族成员菌株和除草剂降解酶或杀虫剂-降解酶都将发挥杀虫剂-和/或除草剂-降解活性。
除草剂和/或杀虫剂可以与除草剂相同或不同于蜡样芽细杆菌家族菌株和/或杀虫剂，被除
草剂降解-降解酶或杀虫剂-降解酶。因此，如果环境被单一类除草剂或杀虫剂污染，则可以获得针对该单一除草剂或杀虫剂的双重降解作用。或者，如果环境被多种类型的除草剂或
杀虫剂污染，则可以获得对两种或多种不同除草剂或杀虫剂的双重降解作用。

[1008] 在降低环境中污染物的方法中，包括使用本文所述蜡样芽胞杆菌家族成员菌株中的一种，其能降解除草剂或杀虫剂，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包括任何本文所述的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。具体来说，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包括上面段落[00782]-[00801]中所述的任何靶向序列、外孢壁蛋白或外
孢壁蛋白片段。

[1009] XXIV.在水力压裂流体中破裂乳液或胶体

[1010] 提供在流体内处理水力压裂流体以破裂乳液或胶体的方法。该方法包括增加重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的孢子至水力压裂流体。表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家
族成员包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁孢子的至少一种目标蛋
白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。上述这种融合蛋白，其中目标蛋白或肽包括适于破裂乳液或胶体的酶。

[1011] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员可包含表达融合蛋白的本文所述的任何重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[1012] 还提供在流体内处理水力压裂流体以破裂乳液或胶体的另外方法。该方法包括增加外孢壁片段至水力压裂流体。外孢壁片段衍生自上面章节IV 所述的重组蜡样芽胞杆菌
家族成员的孢子，并且包含融合蛋白。融合蛋白包括适于破裂乳液或胶体的酶。

[1013] 基于待处理的目标乳液或胶体和水力压裂流体的pH来选择酶。酶包括但不限于半纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、碳水化合物水解酶、纤维素酶、琼脂糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、内切葡聚糖酶或其组合。

[1014] 乳剂或胶体含有酶可以消化的聚合物或其它组分。乳液或胶体可以包括聚合物、阿拉伯糖胶、琼脂、黄原胶、纤维素、羧基甲基纤维素、羧基甲基羟基乙基纤维素、羟基乙基甲基纤维素、瓜尔胶、瓜尔胶衍生物或其组合。

[1015] 当目标蛋白或肽是破乳或凝胶的酶时，任何蜡样芽胞杆菌家族成员均可用于表达融合蛋白。优选苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。

[1016] 孢子或外孢壁片段可以注入与地下含烃地层例如砂岩储层或碳酸盐储层接触的井中。

[1017] 所需的孢子或外孢壁片段的浓度是基于以下因素，包括：待处理的孔的大小、乳液或胶体的类型、孢子表面上的活性酶的量或外孢壁片段、以及用酶递送的佐剂的存在和浓度。

[1018] 酶可以消化乳液或胶体内的聚合物或其它组分，或者可以溶解这些组分，使得水力压裂流体可以从孔中泵出。

[1019] 在流体内处理水力压裂流体以破裂乳液或胶体的方法中，可以使用任何本文所述的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。具体来说，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包括上面段落[00759]-[00778]中所述的任何靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋
白片段。

[1020] 融合蛋白可在天然于融合蛋白或其蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的孢子形成启动子控制下和/或高表达孢子形成启动子控制下表达。启动子可以是上面
章节III中所述任何启动子。

[1021] XXV.原料加工

[1022] 原料是从为生物量收获的植物产生的，并且被加工成饲料(腌制、青贮饲料、挤出、造粒等)。由于材料的纤维性质，构成原料的植物生物质通常难以消化。酶的存在可以极大地有助于这种纤维材料的降解，导致更易消化和更容易加工的材料。传统上，在原料被处理之后和递送到摄入原料的生物体时，酶被添加。原料中提供的酶可以改善目标动物的健康和体重增加，并减少饲喂这种酶补充饲料的动物的废物对环境的影响。

[1023] 这些相同的系统可用于预处理生物燃料生产的原料，包括加工成生物乙醇、生物柴油或其他生物燃料。

[1024] 许多种类的孢子具有长期持续存在于叶面的能力，例如叶、茎和果实。通过使用本文所述的孢子呈现技术来呈现这些孢子上的酶，将活性酶提供给原料，其将在收获原料时存在。这些目标酶也可以通过在植物种子上递送重组孢子或将重组孢子递送到植物生长介
质或植物周围的区域，在种植时将其递送至原料植物。

[1025] 提供将酶递送至植物的方法。该方法包括向植物生长介质引入表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含本文所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂，融合蛋白包
含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向
序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段；或向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂。目标蛋白或
肽包括酶。酶可物理附着于重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁。

[1026] 提供将酶递送至植物的另外方法。该方法包括向植物生长介质引入重组孢子-形成细菌或包含重组孢子-形成细菌的制剂；或向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加重组孢子-形成细菌或包含重组孢子- 形成细菌的制剂。重组孢子-形成细菌表
达融合蛋白，包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋
白。孢子外壳蛋白包括CotB蛋白、CotC蛋白、CgeA蛋白、CotB/H蛋白、Cot G蛋白、孢子外壳蛋白X蛋白或CotY蛋白。重组孢子-形成细菌包括内生细菌菌株。目标蛋白或肽包括酶，并且酶物理附着于重组孢子-形成细菌的孢子包衣。

[1027] 提供将酶递送至植物的又一方法。该方法包括向植物生长介质引入外孢壁片段或包含外孢壁片段的制剂；或向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加外孢壁片段或包含外孢壁片段的制剂。外孢壁片段衍生自上面章节IV所述的重组蜡样芽胞杆菌家
族成员的孢子，并且包含融合蛋白。目标蛋白或肽包括酶。

[1028] 当递送酶至植物的方法包括使用外孢壁片段时，该方法还可以包括使用渗透剂、表面活性剂、洗涤剂、油或其组合来处理植物。

[1029] 用于这些方法的任选细菌菌株包括但不限于蜡样芽胞杆菌家族成员，包括蜡样芽胞杆菌、蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和假蕈状芽孢杆菌、以及其他杆菌孢子形式，包括巨大芽孢杆菌、杆菌firmus、弯曲芽孢杆菌、枯草芽胞杆菌clade成员、杆菌pumilus、杆菌licheniformis和Bacilllus subtilis。

[1030] 可以直接应用于植物材料，任选地与佐剂结合使用，例如非离子或其它表面活性剂。重组蜡样芽胞杆菌家族成员可以在收获之前应用于植物的叶子，例如通过喷洒到叶子
上。

[1031] 对植物种子的应用通常作为种子浸渍、浆料或基于聚合物的种子包衣来进行。任选地，应用可以与种子施用的菌剂、杀真菌剂、杀虫剂或杀线虫剂一起进行。

[1032] 适用于植物生长介质或植物周围的区域可以在种植、种植或后种植种子之后，任选地与肥料、杀真菌剂、除草剂或杀虫剂结合进行。

[1033] 酶适于降解生物质、消化纤维素材料、辅助消化在植物可以饲养的目标动物的消化系统中、或用于生物燃料生产(例如用于生产生物乙醇或生物柴油)。

[1034] 酶包括但不限于非特异性蛋白酶、金属蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、磷酸酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、果胶酶、木糖苷酶、脂肪酶、磷脂酶或其组合。

[1035] 酶的选择可以取决于原料和原料的预期用途。酶优选是降解酶。

[1036] 蛋白酶家族中的目标酶包括非特异性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶、组氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶以及金属蛋白酶。

[1037] 纤维素酶家族中的目标酶包括外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-1,3 葡萄糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、a-葡萄糖苷酶。

[1038] 木聚糖酶家族中的目标酶包括木糖苷酶、内切木聚糖酶、外切木聚糖酶、果胶酶、甲基果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶。

[1039] 磷酸酶中的目标酶包括酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、多磷酸酶、肌醇六磷酸酶、单磷酸酶和二磷酸酶。

[1040] 这些酶中的多种也有益于植物生长。

[1041] 这些酶不仅可以“预先消化”一些原料以增加原料进料的目标动物对关键营养物的吸收，而且还可以帮助消化目标动物的消化系统。

[1042] 收获期间纤维素材料的“预先消化”可以在生物乙醇和生物燃料生产的加工过程中释放游离纤维素，以及用于生物燃料生产的油的预处理。

[1043] 细菌可以是内生细菌。内生重组细菌的选择将允许细菌进入植物，但也在植物组织内定植和生长。这将在植物中建立越来越多的重组孢子形成生物体，因为它在种子上种
植或使用种子时使用相当少量的重组孢子。在收获植物生物质材料后，细菌将经历孢子形
成，在植物中产生新的酶，它们在收获，运输和利用时在原料上具有活性，例如作为动物饲料或生物燃料生产。这可以显着降低降解酶的输入成本，相对于现有技术。这是在工业加工前向生物质提供消化酶的独特方法。

[1044] 尽管任选细菌菌株如上所述，选择内生菌株将增加效果。优选地，内生细菌包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、巨大芽孢杆菌EE385、杆菌sp.EE387、杆菌circulans EE388、枯草芽胞杆菌EE405、 Lysinibacillus fusiformis EE442、Lysinibacillus sphaericus EE443或其组
合。

[1045] 该植物可以是选自玉米、苜蓿、小麦、放牧作物、饲料作物、大豆、柳枝稷、茉莉、甜高粱、甘蔗或其组合等生物燃料和生物乙醇原料的作物。

[1046] 对于将酶递送到植物的方法，可以使用任何本文所述的靶序列，外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。

[1047] XXVI.孢子在改变靶植物性质中的用途

[1048] 本文所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员和重组孢子-形成细菌允许影响生物化学途径的表面呈现信号分子的相互作用，以及有益于植物健康的许多其他蛋白质。孢子呈现蛋
白或肽的存在可导致目标植物代谢的改变，导致植物的组成、其果实或其它性质或特征的
变化。

[1049] 融合蛋白的表达可直接用于改变目标植物的组成。不同酶的选择导致对目标植物的不同影响。

[1050] 提供改变植物性质的方法。该方法包括向植物生长介质引入表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含本文所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂，融合蛋白包含
使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序
列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段；或向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂。目标蛋白或肽
包括影响植物组成的植物信号传导分子或酶，并且目标蛋白或肽可物理附着于重组蜡样芽
胞杆菌家族成员的外孢壁。

[1051] 提供改变植物性质的另外方法。该方法包括向植物生长介质引入重组孢子-形成细菌或包含重组孢子-形成细菌的制剂；或向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加重组孢子-形成细菌或包含重组孢子- 形成细菌的制剂。重组孢子-形成细菌表达
融合蛋白，包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋
白。孢子外壳蛋白包括CotB蛋白、CotC蛋白、CgeA蛋白、CotB/H蛋白、Cot G蛋白、孢子外壳蛋白X蛋白或CotY蛋白。重组孢子-形成细菌包括内生细菌菌株。目标蛋白或肽包括影响植物
组成的植物信号传导分子或酶，并且目标蛋白或肽可物理附着于重组孢子-形成细菌的孢
子包衣。

[1052] 提供改变植物性质的又一方法。该方法包括向植物生长介质引入外孢壁片段或包含外孢壁片段的制剂；或向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加外孢壁片段或包含外孢壁片段的制剂。外孢壁片段衍生自上面章节IV所述的重组蜡样芽胞杆菌家族
成员的孢子，并且包含融合蛋白。目标蛋白或肽包括影响植物组成的植物信号传导分子或
酶。

[1053] 当改变植物性质的方法使用外孢壁片段时，该方法还可以包括使用渗透剂、表面活性剂、洗涤剂、油或其组合来处理植物。

[1054] 目标细菌优选在环境和目标植物的根部存活或繁荣。这些方法的最佳细菌菌株包括但不限于蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员439、苏云金芽孢杆菌
EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、巨大芽孢杆菌 EE385、杆菌sp.EE387、环状芽孢杆菌EE388、枯草芽胞杆菌EE405、 Lysinibacillus fusiformis EE442或Lysinibacillus sphaericus 
EE443。

[1055] 植物信号传导分子或酶也可以通过在植物种子上传送重组孢子或将重组孢子递送至植物生长介质或植物周围的区域，在种植时将其送至植物。

[1056] 可以直接施加在植物材料上，任选地与佐剂结合，例如非离子或其它表面活性剂。重组蜡样芽胞杆菌家族成员，重组孢子-形成细菌或外孢壁片段可以在收获前应用于植物
的叶子，例如喷洒在树叶上。

[1057] 植物种子的施加通常作为种子浸渍、浆料或基于聚合物的种子包衣来进行。任选地，应用可以与种子施用的菌剂、杀真菌剂、杀虫剂或杀线虫剂一起进行。

[1058] 施加于植物生长介质或植物周围的区域可以在种植、种植或种植种子之后，任选地与肥料、杀真菌剂、除草剂或杀虫剂结合进行。

[1059] 酶包括但不限于内切葡聚糖酶、蛋白酶、磷脂酶、氨基羧基-1-丙二醇酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、脂肪酶或其组合。

[1060] 植物信号传导分子包括但不限于flg22和鞭毛蛋白肽、隐地蛋白、 harpins、harpin样蛋白、或降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶、或其组合。

[1061] 酶或植物信号传导分子可以引起对宿主植物的期望的代谢变化，包括通过扩大根系统增加植物组织的大量营养素和微量营养素摄取或含量，增加植物的蛋白含量，例如谷
物、荞麦和水果通过修改代谢和增加氮摄入量，以及对油菜籽、油菜籽、大豆和向日葵中的油含量的改变，葡萄、甘蔗、柳枝稷、甜高粱和其他生物燃料原料中的糖含量(蔗糖)，药物化合物含量和在大麻中的大麻素含量。这些变化不仅增加了植物的价值，而且增加了这些植
物在各行业的效用，例如生物燃料形成、糖生产和原料生产。

[1062] 对于改变植物性质的方法，可以使用任何本文所述的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。

[1063] XXVII.消毒

[1064] 提供消毒表面的方法。该方法包括将表面暴露于如章节I的段落 [00170]-[00173]和[00177]中所述的表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中目标蛋白或
肽包括抗菌性蛋白或肽。

[1065] 提供消毒表面的另外方法。该方法包括将表面暴露于外孢壁片段。外孢壁片段衍生自上面章节IV所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白。融合蛋白
包含抗菌性蛋白或肽。

[1066] 提供消毒表面的又一方法。该包括将表面暴露于重组蜡样芽胞杆菌家族成员。重组蜡样芽胞杆菌家族成员是如上面章节II中所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[1067] 在提供消毒表面的方法中，包括将表面暴露于如上面章节II中所述的外孢壁片段或重组蜡样芽胞杆菌家族成员，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可以是任何本文
所述的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。具体来说，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段上面段落[00759]-[00778]中
所述的任一个。

[1068] 融合蛋白可在天然于融合蛋白或其蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的孢子形成启动子控制下和/或高表达孢子形成启动子控制下表达。启动子可以是上面
章节III中所述任何启动子。

[1069] 抗菌性蛋白或肽最小化或防止病毒剂、细菌、变形虫、害虫或霉菌在表面上形成或结合。

[1070] 抗菌性蛋白或肽包括但不限于蛋白酶、核酸酶、抗菌肽、LysM、LfcinB、溶葡萄球菌素、白蛋白、防御素、细菌素、脂肽、先天免疫系统肽、溶菌酶、裂解酶或其组合。

[1071] 重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子可与其他抗微生物剂一起使用，包括消毒剂、清洁剂、抗生素、抗真菌剂和抗病毒剂。

[1072] 虽然可以使用任何蜡样芽胞杆菌家族来表达融合蛋白，但优选苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。

[1073] 对于这些方法，可以使用任何本文所述的靶向序列，外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。

[1074] XXVIII.其他应用

[1075] 融合蛋白其中目标蛋白或肽是酶或重组蜡样芽胞杆菌成员，其中目标蛋白或肽是可用于下列的酶：油脂、油脂或脂肪处理或脱胶；皮料加工；生物燃料、生物柴油或生物乙醇形成；糖加工或转化；淀粉处理；纸或亚麻加工；动物或真菌副产品处理或氨基酸回收；有针对性地消化设施废物；饲料或食品添加剂；膳食补充剂；动物营养；工业清洗；粮食加工；化妆品制造；气味对照、食品或饮料加工；酿造增强剂或添加剂；洗涤剂添加剂；或纺织或纱线加工。

[1076] 通过在孢子外部或外孢壁片段上呈现酶，酶可以被稳定化、固定化、并且能够重复使用。

[1077] 工业过程通常包括苛刻的条件，包括高温、溶剂的存在和大量的有机物质。这些条件阻碍了传统的酶。目标酶在孢子表面上或外孢壁片段上的表达允许耐高温和恶劣条件，并允许酶被再分离和重新使用。

[1078] 感兴趣的关键酶包括：β-内酰胺酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、果胶酶、木质素酶、淀粉酶(例如α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶)、多聚半乳糖醛酸酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、碳水化合物水解酶、细胞壁水解酶、核酸酶、半纤维素酶、木聚糖酶、甘露酶、漆酶、乳糖酶、酯酶(例如果胶甲基酯酶)、肌醇六磷酸酶、磷酸酶、转化酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、溶解酶、乙酰乳酸脱羧酶和脲酶。

[1079] 用于油脂、油或脂肪处理或脱胶、或用于化妆品制造的优选酶包括脂肪酶、磷脂酶、酯酶和蛋白酶。

[1080] 用于皮革加工的优选酶包括脂肪酶、蛋白酶、肽酶、胶原酶和磷脂酶。

[1081] 用于生物燃料、生物柴油或生物乙醇形成的优选酶可以包括但不限于脂肪酶和酯酶。

[1082] 用于糖加工或转化、用于谷物加工和用于纺织或纱线加工的优选酶包括碳水化合物水解酶、淀粉酶、甘露酶、葡糖淀粉酶、转化酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果胶甲基酯酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、漆酶、乳糖酶、过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。

[1083] 淀粉处理的优选酶包括淀粉酶和葡糖淀粉酶。

[1084] 用于纸或亚麻加工的优选酶包括纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、漆酶、木质素酶、外切葡聚糖酶、肌醇六磷酸酶、过氧化氢酶和葡萄糖苷酶。

[1085] 用于动物或真菌副产物处理或氨基酸回收的优选酶包括蛋白酶、肽酶、脂肪酶、溶解酶、细胞壁水解酶、磷脂酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶和碳水化合物水解酶。

[1086] 用于目标消化设备废物、工业清洁剂、洗涤剂添加剂和气味对照的优选酶包括脂肪酶、磷脂酶、蛋白酶、肽酶、淀粉酶、溶解酶、细胞壁水解酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、酯酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、漆酶、乳糖酶、脲酶、肌醇六磷酸酶、磷酸酶和碳水化合物水解酶。

[1087] 饲料或食品添加剂、膳食补充剂、动物营养、酿造添加剂、饮料添加剂或葡萄酒加工的优选酶包括甘露酶、漆酶、溶解酶、蛋白酶、肽酶、碳水化合物水解酶、果胶酶、果胶甲基酯酶、酯酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、磷酸酶、转化酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、乳糖酶、过氧化氢酶、葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、乙酰乳酸脱羧酶和葡萄糖氧化酶。

[1088] 尽管可以使用任何蜡样芽胞杆菌家族来表达这些用途的融合蛋白，但优选苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。

[1089] 使用融合蛋白包含酶作为目标蛋白或肽或重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达融合蛋白包含酶作为目标蛋白或肽。融合蛋白可以是上述章节I的段落[00169]-[00173]、
[00175]和[00177]中所述的任何融合蛋白。用途可用于油脂、油脂或脂肪处理或脱胶；皮料加工；生物燃料，生物柴油或生物乙醇形成；糖加工或转化；淀粉处理；纸或亚麻加工；动物或真菌副产品处理或氨基酸回收；有针对性地消化设施废物；饲料或食品添加剂；膳食补充剂；动物营养；工业清洗；粮食加工；化妆品制造；气味对照、食品或饮料加工；酿造增强剂或添加剂；洗涤剂添加剂或纺织或纱线加工。

[1090] 还提供外孢壁片段的用途。用途可用于油脂、油或脂肪处理或脱胶；皮料加工；生物燃料、生物柴油或生物乙醇形成；糖加工或转化；淀粉处理；纸或亚麻加工；动物或真菌副产品处理或氨基酸回收；有针对性地消化设施废物；饲料或食品添加剂；膳食补充剂；动物营养；工业清洗；粮食加工；化妆品制造；气味对照；食品或饮料加工；酿造增强剂或添加剂；洗涤剂添加剂；或纺织品或纱线加工。外孢壁片段衍生自上述章节IV中描述的重组蜡样芽
胞杆菌家族成员，并且包含融合蛋白。融合蛋白包括酶。

[1091] 提供重组蜡样芽胞杆菌家族成员的另外用途。重组蜡样芽胞杆菌家族成员是如上面章节II中所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。用途可用于油脂、油或脂肪处理或脱胶；皮料加工；生物燃料、生物柴油或生物乙醇形成；糖加工或转化；淀粉处理；纸或亚麻加工；动物或真菌副产品处理或氨基酸回收；有针对性地消化设施废物；饲料或食品添加剂；膳食补充剂；动物营养；工业清洗；粮食加工；化妆品制造；气味控制；食品或饮料加工；酿造增强剂或添加剂；洗涤剂添加剂；或纺织或纱线加工。融合蛋白包含酶。

[1092] 如上面章节II中所述在使用外孢壁片段或重组蜡样芽胞杆菌家族成员中，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可以是本文所述的任何靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁
蛋白片段。具体来说，靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段可包含上面段落[00759]-
[00778]所述的任何靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。

[1093] 融合蛋白可以在天然于融合蛋白或其蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的孢子形成启动子的控制下、和/或高表达孢子形成启动子的控制下表达。启动子可以是上面章节III中所述任何启动子。

[1094] 已经详细描述了本发明，显而易见的是，在不脱离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以进行修改和变化。
实施例

[1095] 提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。

[1096] 实施例1.使用呈现脂肪酶或内切葡聚糖酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来刺激大豆的植株生长

[1097] 枯草芽孢杆菌脂肪酶和内切葡聚糖酶基因使用如下表16中所示的以下引物经由聚合酶链式反应(PCR)来扩增：

[1098] 表16

[1099]

[1100] 为了产生融合构建体，使用通过重叠延伸(SOE)技术的剪接将基因融合至编码BclA的开头35个氨基酸(SEQ ID NO:1的氨基酸1-35)的苏云金芽孢杆菌DNA的天然bclA启
动子。将正确扩增子克隆到大肠杆菌/杆菌穿梭载体pHP13中，并且通过DNA测序对正确的克隆进行筛选。将正确的克隆电穿孔至苏云金芽孢杆菌(Cry-、质粒-)中并且针对氯霉素抗性进行筛选。使正确的转化株在30℃下在脑心浸液肉汤中生长过夜，铺于营养琼脂板上，并且在30℃下孵育3天。通过在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤将表达融合构建体的孢子(BEMD孢
子)从板上收集下来并且通过离心纯化且在PBS中再洗涤。以相同方式产生非转化的对照苏
云金芽孢杆菌 (B.t.)孢子。

[1101] 将大豆(菌株Jake011-28-04)种植于用标准壤土表层土填充的10cm 深的盆中的2.54cm深处。将孢子在50ml水中稀释至1×104个/ml的浓度并且在种植时施用于每个种子。
植物在使用T5灯(54瓦特)的理想光下生长，并且在15.5-25.5℃之间的控制温度条件下暴
露于11小时光/天。在两周试验内每3天向植物浇水至饱和。在两周结束时，测量每株植物的高度并且将测量值根据对照苏云金芽孢杆菌孢子进行归一化。进行两个独立试验。

[1102] 结果以及平均标准误差显示于表4中。在两次试验中，在呈现脂肪酶或内切葡聚糖酶的BEMD孢子存在下生长的大豆比对照B.t.孢子处理的大豆显著更高(经由t检验测定的
统计分析)。

[1103] 表17

[1104]

[1105]

[1106] 实施例2.使用呈现内切葡聚糖酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来刺激玉米的植株生长

[1107] 表达内切葡聚糖酶的BEMD孢子以如上与实施例1中所述相同的方式产生。将非甜质玉米种植于用标准壤土表层土填充的10cm深的盆中的 3.8cm深处。将对照孢子和表达内
切葡聚糖酶的BEMD孢子在50ml水中稀释至1×104个/ml的浓度并且在种植时施用于每株植
物。还包括仅水的对照。植物在使用T5灯(54瓦特)的理想光下生长，并且在15.5-25.5℃之间的控制温度条件下暴露于11小时光/天。在一周试验内每3天向植物浇水至饱和。在一周
结束时，测量每株植物的高度，并且将测量值根据对照苏云金芽孢杆菌孢子进行归一化。

[1108] 结果以及平均标准误差显示于表18中。在呈现内切葡聚糖酶的 BEMD孢子存在下生长的玉米比对照B.t.孢子处理的大豆和仅水对照的植物两者显著更高(经由t检验测定
的统计分析)。

[1109] 表18.

[1110]

[1111] 实施例3.使用呈现内切葡聚糖酶或蛋白酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来刺激小麦的植株生长

[1112] 表达内切葡聚糖酶的BEMD芽孢以如上实施例1中所述的相同方式形成。使用与以上实施例1中所述类似的方法及以下引物产生表达大肠杆菌蛋白酶PtrB的BEMD孢子：
ggatccatgctaccaaaagcc(正向，SEQ ID NO: 41)和ggatccttagtccgcaggcgtagc(反向，SEQ ID NO:42).

[1113] 将冬季硬质小麦种植于用标准壤土表层土填充的10cm深的盆中的 2.54cm深处。将对照孢子和表达内切葡聚糖酶或蛋白酶的BEMD孢子在 50ml水中稀释至1×104个/ml的
浓度并且在种植时施用于每株植物。还包括仅水的对照。植物在使用T5灯(54瓦特)的理想
光下生长，并且在 15.5-25.5℃之间的控制温度条件下暴露于11小时光/天。在一周试验内每3天向植物浇水至饱和。在一周结束时，测量每株植物的高度，并且将测量值根据仅对照水的植物进行归一化。

[1114] 结果以及平均标准误差显示于表19中。在呈现内切葡聚糖酶或蛋白酶的BEMD孢子存在下生长的小麦比对照B.t.孢子处理的或水对照大豆显著更高(经由t检验测定的统计
分析)。

[1115] 表19.

[1116]

[1117] 实施例4.使用呈现内切葡聚糖酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来刺激黑麦草的植株生长

[1118] 表达内切葡聚糖酶的BEMD孢子以如上与实施例1中所述相同的方式产生。将多年生黑麦草种植于用标准壤土表层土填充的10cm深的盆中的 6.4mm深处。将对照孢子和表达
葡聚糖内切酶的BEMD孢子在50ml水中稀释至1×104个/ml的浓度并且在种植时施用于每株
植物。还包括仅水的对照。植物在使用T5灯(54瓦特)的理想光下生长，并且在15.5-25.5℃之间的控制温度条件下暴露于11小时光/天。在两周试验内每3天向植物浇水至饱和。在两
周结束时，测量每株植物的高度，并且将测量值根据仅对照水的植物进行归一化。

[1119] 结果以及平均标准误差显示于表20中。在呈现内切纤维素酶的 BEMD孢子存在下生长的黑麦草比对照B.t.孢子处理的或水对照黑麦草显著更高(经由t检验测定的统计分
析)。

[1120] 表20.

[1121]

[1122] 实施例5.使用呈现植物激素合成或活化中所涉及的酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来刺激植物生长

[1123] BEMD系统还可用于呈现植物激素的合成中所涉及的酶。例如，植物激素吲哚-3-乙酸是植物中的强效生长刺激物。吲哚-3-乙酸通过色氨酸单加氧酶和吲哚-3-乙酰胺水解酶
在体内从色氨酸合成。吲哚-3-乙酸及其他生长素激素还可通过以下酶在体内从色氨酸和/
或吲哚合成：腈水解酶、色氨酸转氨酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、胺氧化酶、色氨酸脱羧酶以及色氨酸侧链氧化酶。

[1124] BEMD系统还可用于呈现植物生长激素被修饰为生物活性或非活性形式中所涉及的酶。例如，腈水解酶可在BEMD系统上表达以催化吲哚 -3-乙腈转化成生物活性的吲哚-3-乙酸。另外，非活性形式的植物激素如吲哚-3-乙腈可添加至含有BEMD表达的腈水解酶的植物生长介质中，以提供活性激素向植物生长介质中的逐渐释放。许多其他非活性或活性较
低形式的植物激素可使用其相应的酶来修饰。

[1125] 相关植物生长激素(生长素)包括吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-乙酰胺、吲哚-3-乙腈、吲哚-3-乙醇、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丁酸、苯乙酸、4-氯吲哚-3-乙酸、以及吲哚-3-乙醛肟。这些激素经由以下酶在体内从色氨酸和/或吲哚合成：色氨酸单加氧
酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、腈水解酶(nitrilase)、腈水解酶(nitrilehydrolase)、乙酰乳酸合成酶、α乙酰乳酸脱羧酶、色氨酸转氨酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、胺氧化酶、色氨酸脱羧酶以及色氨酸侧链氧化酶。

[1126] 细胞分裂素家族的生长激素还可由在BEMD系统中表达的酶合成。细胞分裂素的实例包括激动素、玉米素(顺式和反式)、6-苄氨基嘌呤、二羟基玉米素、N6-(D2-异戊烯基)腺嘌呤、玉米素核苷、N6-(D2-异戊烯基) 腺苷、2甲硫基-顺式-玉米素核苷、顺式玉米素核苷、玉米素核苷-5-单磷酸、N6-甲氨基嘌呤、N6-二甲基氨基嘌呤、2'-脱氧玉米素核糖核苷、4- 羟基-3-甲基-反式-2-丁烯基氨基嘌呤、邻topolin、间topolin、苄基腺嘌呤、邻甲基
topolin、以及间甲基topolin。这些植物生长刺激化合物是通过包括以下的酶在体内从甲
羟戊酸或腺苷单/二/三磷酸来合成：腺苷磷酸异戊烯基转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、CYP735A、 5'核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺式-反式异构酶、玉米素 O-葡糖基转移酶、β-葡萄糖苷酶、顺式-羟化酶、CK顺式-羟化酶、CKN- 葡糖基转移酶、2,5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶以及玉米素还原酶。

[1127] 使用类似于如上实施例1中所述的方法，任何这些酶都可并入BEMD 系统中以便通过产生包含酶和靶向序列的融合构建体呈现于BEMD孢子上，所述靶向序列在当融合构建体
在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达时将所表达的酶靶向外孢壁。表达所述构建体的重组蜡样
芽孢杆菌家族成员然后可被添加到土壤或其他植物生长介质中或使用类似于如上实施例1
中所述的方法直接施用于植物叶片上以刺激植物生长。

[1128] 植物生长介质可补充有酶的辅酶或底物。例如，植物生长介质可补充有色氨酸、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷或吲哚。这些底物的适合浓度在100nM与100μM之间。

[1129] 实施例6.使用呈现将蛋白质、肽、原蛋白、或前原蛋白裂解成生物活性肽的蛋白酶或肽酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来刺激植物生长

[1130] 蛋白酶和肽酶可在BEMD系统中表达，所述酶可将植物生长介质中可利用的蛋白酶促裂解成可直接或间接地作用于植物的生物活性肽。实例包括大豆粉、酵母提取物、或添加到植物生长介质中的其他富含蛋白质的粗粉被酶促裂解成可直接地刺激植物生长的活性
肽。通过酶促裂解蛋白质粗粉产生的生物活性肽包括RHPP和RKN16D10，它们是植物根部发
育的强效刺激物。另外，原蛋白或前原蛋白可通过BEMD表达的蛋白酶和肽酶裂解成其生物
活性形式。非活性的原蛋白或前原蛋白可被添加到植物生长介质中以促进通过BEMD蛋白酶
对其的逐渐裂解并缓慢释放生物活性蛋白。

[1131] 使用类似于如上实施例1中所述的方法，任何这些蛋白酶和肽酶都可并入BEMD系统中，以便通过产生包含蛋白酶或肽酶和靶向序列的融合构建体呈现于BEMD孢子上，所述
靶向序列在当融合构建体在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达时将所表达的酶靶向外孢壁。表
达所述构建体的重组蜡样芽孢杆菌家族成员可随后被添加到补充有大豆粉、酵母提取物或
用于刺激植物生长的另一种富含蛋白质的粗粉的土壤或其他植物生长介质中。大豆粉、酵
母提取物或其他富含蛋白质的粗粉以液体组合物形式适当地添加到植物生长介质中，所述
液体组合物包含约10μg/L至约100mg/L的蛋白质粗粉、酵母提取物或其他富含蛋白质的粗
粉。

[1132] 实施例7.使用表达蛋白酶PtrB的BEMD孢子来刺激植物生长

[1133] 表达大肠杆菌蛋白酶PtrB的BEMD孢子如上在实施例3中所述而产生。将大豆种子种植于用标准壤土表层土填充的10cm深的盆中的2.54cm 深处。将对照孢子和表达蛋白酶
的BEMD孢子在50ml水中稀释至1×104个/ml的浓度并且在种植时施用于每株植物。还包括
仅水的对照。25mg/ 盆的大豆粉在种植时添加到水中。使用T5灯(54瓦特)使植物在理想的
光下生长，并且在15.5-25.5℃之间的控制温度条件下暴露于13小时光/天。在一周试验内
每3天向植物浇水至饱和。在两周结束时，测量每株植物的高度，并且将测量值根据仅对照水的植物进行归一化。

[1134] 结果以及表示为水对照百分比的平均标准误差显示于表21中。在呈现蛋白酶的BEMD孢子存在下生长的大豆比对照B.t.孢子处理的或水对照的大豆显著更高(经由t检验
测定的统计分析)。大豆粉添加到水对照或苏云金芽孢杆菌对照植株中几乎没有作用。相
反，在大豆粉和BEMD蛋白酶系统存在下，大豆植株在所有其他处理中有明显的应答。

[1135] 表21.

[1136]

[1137] 实施例8.使用呈现植物生长的刺激中所涉及的蛋白或肽的重组蜡样芽孢杆菌家族成员

[1138] BEMD系统还可用于呈现植物生长的促进中直接涉及的蛋白或肽。例如，刺激植物生长的植物肽激素或非激素肽可在BEMD系统中表达。例如，直接结合并活化植物受体的非
激素肽可在BEMD系统中表达，以直接作用于植物和目标植物根部中的受体。所述肽激素和
非激素肽包括植物磺肽素、calcalva3(CLV3)、系统素、RKN16D10、Hg-Syv46、eNOD40、NOD 家族蛋白、ZmlGF、SCR/SP11家族蛋白和肽、RHPP、POLARIS以及 KTI。这些肽和相关肽可在BEMD系统中表达并且被递送到植物生长介质中或直接施用于叶片以刺激植物生长。

[1139] 使用类似于如上实施例1中所述的方法，任何这些蛋白或肽都可并入 BEMD系统中，以便通过产生包含酶和靶向序列的融合构建体呈现于 BEMD孢子上，所述靶向序列在当融合构建体在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达时将所表达的酶靶向外孢壁。表达所述构建体
的重组蜡样芽孢杆菌家族成员然后可被添加到土壤或其他植物生长介质中或使用类似于
如上实施例1中所述的方法直接施用于植物叶片上用于刺激植物生长。

[1140] 实施例9.使用表达POLARIS或KTI的BEMD孢子来刺激植物生长

[1141] 表达植物肽POLARIS和大豆肽KTI的BEMD孢子是通过合成编码与 SEQIDNO:96的靶向序列连接的POLARIS或KIT肽的基因而产生。然后将基因引入苏云金芽孢杆菌中并且如实
施例1中所述来制备孢子。将大豆种子种植于用标准壤土表层土填充的10cm深的盆中的
2.54cm深处。将表达POLARIS或KTI的BEMD孢子在50ml水中稀释至1×104个/ml的浓度并且
在种植时施用于每株植物。还包括仅水的对照。还测试纯的 POLARIS和KTI肽在0.05mg/盆
下对大豆的作用。使用T5灯(54瓦特) 使植物在理想的光下生长，并且在15.5-25.5℃之间
的控制温度条件下暴露于13小时光/天。在两周试验内每3天向植物浇水至饱和。在两周结
束时，测量每株植物的高度，测量根部，并且将测量值根据仅对照水的植物进行归一化。

[1142] 结果以及表示为水对照百分比的平均标准误差显示于表22中。在呈现POLARIS的BEMD孢子存在下生长的大豆与水对照大豆相比长得更高并且根发育具有稍微的增加。游离
KTI肽的存在导致植物的显著矮化，损失其高度的6-8％，但根长度增加15％。KTI在BEMD系统上的表达产生根生长益处，但对植物高度没有矮化作用。重要的是，具有游离KTI肽的苏云金芽孢杆菌对照孢子的存在不能防止KTI的矮化作用，而具有KTI 的BEMD不会展现这种
矮化。

[1143] 表22.

[1144]

[1145] 实施例10.使用呈现降解或改变细菌、真菌、或植物营养素来源的酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来刺激植物生长和/或加工营养素

[1146] BEMD系统还可用于呈现降解或有利地改变存在于土壤或另一种植物生长介质中的细菌、真菌、或植物营养素来源的酶。此类酶将存在于土壤或其他植物生长介质中的产物降解成可容易地被植物和/或根际的有益细菌和/或真菌吸收的形式。此类酶包括例如降解
复合碳水化合物的葡糖苷水解酶、降解纤维素的纤维素酶；降解脂质包括油、脂肪以及蜡的脂肪酶；降解木质素和腐殖酸的木质素氧化酶；降解多肽的蛋白酶；降解膜的磷脂酶；回收氮的酰胺酶和固氮酶；加工淀粉的淀粉酶；回收核苷酸的核酸酶、分解果胶的果胶酶、回收硫的硫酸酯酶以及分解木聚糖和阿糖基木聚糖的木聚糖酶。所得产物，包括单糖、氨基酸、脂肪酸及其他营养素，将容易地获得以便由植物直接摄取和/或用于刺激有益的细菌和/或
真菌在植物根际中生长和繁殖。

[1147] 另外，可使用酶及其他生物分子以释放或螯合磷酸盐、氮及其他关键基本营养素，以便于植物从土壤中摄取其各种有机和无机形式。例如，磷酸酶可用于将环境中的磷酸盐降解成可用的无机磷酸盐以便于植物使用。磷酸盐可以是存在于植物生长介质中的天然存
在的磷酸盐。可选择地或另外，植物生长介质可补充有磷酸盐如三偏磷酸盐，它是一种常见的农用调理物。有用的磷酸酶的实例包括磷酸单酯水解酶、磷酸单酯酶、磷酸二酯水解酶、磷酸二酯酶、三磷酸单酯水解酶、磷酰酸酐水解酶、焦磷酸酶、肌醇六磷酸酶、三偏磷酸酶以及三磷酸酶。例如，三偏磷酸酯酶、三磷酸酶以及焦磷酸酶将三偏磷酸盐依次地分解成可用的无机磷酸。

[1148] 酶的固氮酶家族将大气氮(N2)转化成氨，由此将否则植物便难以获得的氮转化成可用的形式。适合的酶属于固氮酶的Nif家族。

[1149] 化学能还可直接添加到植物生长介质中，如腺苷-3-三磷酸、铁氧还蛋白(ferrodoxin)或使所述能量在BEMD系统中形成的另外的酶。它们是用于固氮酶的辅助因子
且在土壤中受限制。因此，所述辅助因子可添加到土壤中以提高如上所述的应答。

[1150] 可添加到植物生长介质中的其他补充剂包括淀粉、纤维素和纤维素衍生物、果胶、木聚糖和阿糖基木聚糖、脂肪、蜡、油、肌醇六磷酸、木质素、腐殖酸以及以上酶类别对其发挥活性的其他营养素来源。

[1151] 使用类似于如上实施例1中所述的方法，任何这些酶都可并入BEMD 系统中，以便通过产生包含酶和靶向序列的融合构建体而呈现于BEMD 孢子上，所述靶向序列用于将融
合构建体靶向蜡样芽孢杆菌家族成员的外孢壁。融合构建体然后可在蜡样芽孢杆菌家族成
员中表达，并且可使用类似于如上实施例1中所述的方法将此重组蜡样芽孢杆菌家族成员
添加到土壤或另一种植物生长介质中用于刺激植物生长。

[1152] 实施例11.使用表达磷酸酶的BEMD孢子来刺激植物生长

[1153] 表达枯草芽孢杆菌磷酸酶A4(PhoA4)的BEMD孢子是通过合成编码与SEQIDNO:96的靶向序列连接的PhoA4的基因而产生。然后将此基因引入苏云金芽孢杆菌中并且如实施例1
中来制备孢子。将玉米种植于用标准壤土表层土填充的10cm深的盆中的2.54cm深处。将表
达PhoA4的 BEMD孢子在50ml水中稀释至1×104个/ml的浓度并且在种植时施用于每株植
物。还包括仅水的对照。将多磷酸盐以0.5mg/盆的比率以液体形式添加到盆中。使用T5灯
(54瓦特)使植物在理想的光下生长，并且在 15.5-25.5℃之间的控制温度条件下暴露于13
小时光/天。在两周试验内每 3天向植物浇水至饱和。在两周结束时，测量每株植物的高度，并且将测量值根据仅对照水的植物进行归一化。

[1154] 结果显示于表23中。在呈现PhoA4的BEMD孢子存在下生长的玉米展现增强的生长，特别是在添加的多磷酸盐存在下。此作用大于单独多磷酸盐的作用。

[1155] 表10.

[1156]处理 添加剂 生长，与水相比
水 无 100％
水 多磷酸盐 110.8％
BEMD PhoA4 无 108.3％
BEMD PhoA4 多磷酸盐 114.8％

[1157] 实施例12.使用呈现2,3-丁二醇的合成或赤霉酸的合成或活化中所涉及的酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来刺激植物生长

[1158] BEMD系统还可用于呈现植物生长促进化合物2,3-丁二醇的合成中所涉及的酶。在体内，2,3-丁二醇是通过根际中的有益细菌和真菌从乙偶姻、二乙酰、乙酰乳酸或丙酮酸盐通过以下酶来合成：乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、二乙酰还原酶、丁二醇脱氢酶以及乙偶姻还原酶。

[1159] BEMD系统还可用于呈现植物生长促进化合物赤霉酸的合成或活化中所涉及的酶。赤霉酸可经由包括但不限于以下的酶作用由非活性或较低活性形式产生：羟胺还原酶、2-
酮戊二酸双加氧酶、赤霉素2B/3B水解酶、赤霉素3-氧化酶以及赤霉素20-氧化酶。

[1160] 任何这些酶都可使用类似于如上实施例1中所述的方法并入BEMD系统中，以便在BEMD孢子上呈现。可制备包含酶和靶向序列的融合构建体，所述靶向序列在当融合构建体
在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达时将所述酶靶向外孢壁。融合构建体然后在蜡样芽孢杆菌
家族成员中表达，并且将所述蜡样芽孢杆菌家族成员添加到土壤或另一种植物生长介质中
用于刺激植物生长。

[1161] 为了增强呈现在BEMD上的酶的作用，土壤可补充有酶的底物。举例来说，土壤或其他植物生长介质可补充有乙偶姻，其是乙偶姻还原酶的底物；丙酮酸，其是丙酮酸脱羧酶的底物；二乙酰，其是二乙酰还原酶的底物；和/或乙酰乳酸，其是乙酰乳酸脱羧酶的底物。可选择地或另外，土壤或其他植物生长介质可补充有有效性较低或非活性形式的赤霉酸，其将通过土壤或其他植物生长介质中如上所述的酶转化成更具活性的形式。实施例13.使用
呈现蛋白酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来保护植物免受病原体侵害

[1162] BEMD系统还可用于呈现保护植物免受一种或多种病原体侵害的蛋白酶。举例来说，某些细菌性病原体可经由分泌细菌内酯高丝氨酸或相关信号传导分子而在个体成员之
间通信。因此，对细菌内酯高丝氨酸信号传导分子有特异性的蛋白酶可通过中断细菌之间
的通信(细菌分泌毒素和上调毒力因子所必需的步骤)来保护植物免受所述细菌性病原体
的侵害。对细菌内酯高丝氨酸信号传导分子有特异性的适合的蛋白酶包括内肽酶和外肽
酶。

[1163] 对细菌内酯高丝氨酸信号传导分子有特异性的蛋白酶可使用类似于如上实施例1中所述那些的方法并入BEMD系统中。可制备包含蛋白酶和靶向序列的融合构建体，所述靶
向序列在当融合构建体在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达时将所述蛋白酶靶向外孢壁。融合
构建体然后在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达，并且将所述蜡样芽孢杆菌家族成员添加到土
壤或另一种植物生长介质中。蛋白酶可然后降解细菌内酯高丝氨酸信号传导分子，阻断这
些生物体的毒力中的关键步骤且由此帮助保护植物免受这些病原体的侵害。其他蛋白酶和
肽酶在此能力方面有效地在BEMD系统上发挥作用，如以上实施例6和7中所论证。

[1164] 实施例14.使用呈现抗微生物蛋白和肽的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来保护植物免受病原体侵害

[1165] BEMD系统还可用于呈现展现抗细菌和/或抗真菌活性的酶，其可帮助保护植物免受一种或多种病原体的侵害。例如，抗微生物蛋白和肽如细菌素、溶菌酶(例如LysM)、铁载体、伴清蛋白、白蛋白、乳铁蛋白(例如LfcinB)或TasA全部都可在BEMD系统中表达，以发挥其对植物的细菌和真菌病原体的作用。细菌素、白蛋白、伴清蛋白、溶菌酶以及乳铁蛋白对其目标发挥直接的抗微生物作用，而铁载体结合病原体毒力所需的必需营养素。例如，乳铁蛋白的肽LfcinB当在BEMD系统的表面上表达时将溶解对植物生长介质中的乳铁蛋白肽敏
感的细菌细胞。这些蛋白和肽对选择的微生物具有特异性作用，并且可选择性地靶向病原
体群，而不会妨碍植物生长介质中的所有微生物。

[1166] 可使用与如上实施例1中所述类似的方法将任何这些蛋白或肽并入 BEMD系统中，以便在BEMD孢子上呈现。可制备包含酶和靶向序列的融合构建体，所述靶向序列在当融合
构建体在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达时将所述酶靶向外孢壁。融合构建体然后在蜡样芽
孢杆菌家族成员中表达，并且将所述蜡样芽孢杆菌家族成员添加到土壤或另一种植物生长
介质中用于保护植物免受一种或多种病原体的侵害。

[1167] 实施例15.使用表达抗微生物肽的BEMD孢子来保护植物免受细菌侵害

[1168] 在BclA启动子(SEQIDNO:215)控制下合成编码与BclA靶向序列 (SEQIDNO:96)连接的两种抗微生物肽LfcinB(来源于牛乳铁蛋白)和 LysM(来源于鸡溶菌酶)中的任一种的
基因。将基因引入苏云金芽孢杆菌 BT013A中并且通过使转化的芽孢杆菌培养物在脑心浸
液肉汤中生长过夜，在30℃下铺于营养琼脂板上并且允许生长3天来制得孢子。将孢子从板上洗下来并且在PBS中冲洗3次。使表皮葡萄球菌培养物在37℃下在TSB肉汤中生长过夜。然后将过夜的培养物沉淀，在PBS中洗涤，并且在Abs595＝0.2下再悬浮于PBS中。将1×104个
表达LysM或LfcinB 肽的BEMD在37℃下在具有表皮葡萄球菌的PBS中振荡孵育3小时。将表
皮葡萄球菌的对照样品留着不处理(不含BEMD孢子)。3小时孵育之后，制得表皮葡萄球菌的稀释板并且在37℃下孵育过夜。第二天对表皮葡萄球菌培养物进行计数，并且定量杀灭％。
在以下表24中，记录杀灭活性的资料。表达肽的BEMD杀灭相当多数量的表皮葡萄球菌细胞。
这将直接转化为杀灭根际、种子或其他植物体上的细菌。选择对某些类别细菌有特异性的
肽还可以有利的方式使微生物群体偏斜靠近植物，或可选择性地靶向关键病原体。

[1169] 表24.

[1170]处理 存活率 杀灭％
无 100％ 0％
BEMD LysM 71％ 29％
BEMD LfcinB 23％ 77％

[1171] 实施例16.使用呈现酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来保护植物免受病原体侵害

[1172] BEMD系统还可用于呈现保护植物免受一种或多种病原体侵害的酶。例如，酵母和霉菌细胞壁被酶如β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、壳多糖酶、脱乙酰壳多糖酶样蛋白以及溶解酶所降解。细菌细胞壁被选自蛋白酶类、蛋白
酶、变溶菌素、链球菌溶血素以及溶菌酶的酶所降解。这些降解细胞壁的酶可各自在BEMD系统上表达并且添加到植物生长介质中以用于选择性抑制根际中的病原微生物。

[1173] BEMD系统还可用于呈现例如通过抑制昆虫和/或蠕虫捕食所需植物来保护植物免受昆虫或蠕虫病原体侵害的酶或蛋白。所关注的此类蛋白和酶的实例包括内毒素、Cry毒
素、其他杀虫蛋白毒素、蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶、Cry5B蛋白、Cry21A蛋白、壳多糖酶、蛋白酶抑制剂蛋白、蛋白酶抑制剂肽、胰蛋白酶抑制剂以及慈菇蛋白酶抑制剂。

[1174] 任何这些蛋白或可使用与如上实施例1中所述类似的方法并入 BEMD系统中，以便在BEMD孢子上呈现。可制备包含酶和靶向序列的融合构建体，所述靶向序列在当融合构建
体在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达时将所述酶靶向外孢壁。融合构建体然后在蜡样芽孢杆
菌家族成员中表达，并且将所述蜡样芽孢杆菌家族成员添加到土壤或另一种植物生长介质
中以用于保护植物免受病原体的侵害。

[1175] 实施例17.使用表达抗真菌酶的BEMD孢子来保护植物以及针对酵母属的功效的论证

[1176] 在BclA启动子(SEQIDNO:215)控制下合成编码与BclA靶向序列 (SEQIDNO:96)连接的抗真菌酶，即来自枯草芽孢杆菌的β-1,3-葡聚糖酶的基因。将基因引入苏云金芽孢杆菌BT013A中并且通过使转化的杆菌培养物在脑心浸液肉汤中生长过夜，在30℃下铺于营养
琼脂板上并且允许生长3天来制备孢子。将孢子从板上洗下来并且在PBS中冲洗3次。酿酒酵母培养物在37℃下在YZ肉汤中生长过夜。然后将过夜的培养物沉淀，在PBS中洗涤，并且在Abs595＝0.2下再悬浮于PBS中。在37℃下将1x104个表达β-1,3-葡聚糖酶的BEMD在具有酵
母的PBS中振荡孵育1小时。将酵母的对照样品留着不处理(不含BEMD孢子)。3小时孵育之
后，制得酵母的稀释板并且在37℃下孵育过夜。第二天对酵母培养物进行计数，并且定量杀灭％。在以下表25中显示表达β-1,3-葡聚糖酶的 BEMD孢子的杀灭活性。BEMD表达的酶杀灭相当多数量的酵母细胞。这将直接转化为杀灭根际、种子或其他植物物质上的真菌微生物。
选择对某些真菌类别有特异性的蛋白还可以有利的方式使微生物群体偏斜靠近植物，或可
选择性地靶向关键真菌病原体。

[1177] 表25.

[1178]

[1179]

[1180] 实施例18.使用呈现植物免疫系统刺激肽或蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来保护植物免受病原体侵害

[1181] BEMD系统还可用于呈现植物免疫系统增强肽和蛋白。这些蛋白可在BEMD孢子之外表达并且被递送到植物生长介质中，以刺激植物免疫系统，允许植物保护自身免受植物病
原体的侵害。蛋白和肽的实例包括过敏蛋白、α-弹性蛋白、β-弹性蛋白、系统素、苯丙氨酸解氨酶、激发素、防卫素、隐地蛋白以及鞭毛蛋白蛋白和肽。植物暴露于这些蛋白和肽将刺激植物对许多植物病原体的抗性。

[1182] 任何这些蛋白或肽可使用与如上实施例1中所述类似的方法并入 BEMD系统中，以便在BEMD孢子上呈现。可制备包含酶和靶向序列的融合构建体，所述靶向序列在当融合构
建体在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达时将所述酶靶向外孢壁。融合构建体然后在蜡样芽孢
杆菌家族成员中表达，并且将所述蜡样芽孢杆菌家族成员添加到土壤或另一种植物生长介
质中以用于保护植物免受病原体的侵害。

[1183] 实施例19.使用呈现根或叶结合蛋白或肽的重组蜡样芽孢杆菌家族成员来将重组蜡样芽孢杆菌家族成员固定在植物的根系或植物叶片上

[1184] 根和叶结合蛋白和肽也可并入BEMD系统中，以允许将BEMD孢子固定在植物的根系或叶上。在BEMD孢子上呈现此类根或叶结合配体允许将孢子靶向植物的根系或根系的子结
构或者叶或叶的子结构，以便使 BEMD孢子保持在使其他呈现的生物分子和酶有效的最佳
位置。

[1185] 例如，根钙粘素是结合至根毛的根结合配体。因此，根钙粘素在 BEMD孢子上的呈现由此使孢子靶向根毛。可用于选择性结合至植物根或叶的另外的蛋白质包括粘附素、鞭
毛蛋白、omptin、外源凝集素、伞毛蛋白、卷曲蛋白、紧密粘附素、侵袭素、凝集素、非菌毛蛋白、TasA或 YuaB。

[1186] 可使用与如上实施例1中所述类似的方法将所述根或叶结合蛋白和肽并入BEMD系统中。可制备包含根或叶结合蛋白或肽和靶向序列的融合构建体，所述靶向序列在当融合
构建体在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达时将所述蛋白或肽靶向外孢壁。含有根或叶结合配
体的融合构建体然后在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达。所述融合构建体可与包含本文论述
的任何有利的酶(例如，植物激素的合成中所涉及的酶、降解营养素来源的酶或保护植物免受病原体侵害的蛋白酶)的一种或多种另外的融合构建体共表达。将重组蜡样芽孢杆菌家
族成员添加至土壤或另一种植物生长介质中，或施用于植物的叶上。根或叶结合配体将蜡
样芽孢杆菌家族成员靶向植物的根系或植物的叶并且将其固定在那里，由此允许共表达的
融合构建体紧靠着根或叶系发挥其作用。

[1187] 实施例20.使用呈现提高植物的胁迫抗性的蛋白或酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员

[1188] 可将提高植物的胁迫抗性的蛋白质、肽、以及酶并入BEMD系统中并且经由添加至根、叶、植物生长介质中递送至目标植物。在胁迫期间，植物释放胁迫相关化合物，包括氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、活性氧物质等，从而导致对植物生长的消极影响。BEMD系统可用于呈现降解所述胁迫相关化合物的酶，如氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、超氧化物歧化酶、氧化酶、过氧化氢酶以及其他作用于活性氧物质的酶。此类酶减少这些胁迫相关化合物的量并且允
许植物继续生长且甚至在胁迫条件下茁壮成长。

[1189] 可使用与如上实施例1中所述类似的方法将任何这些蛋白或肽并入BEMD系统中以便在BEMD孢子上呈现。可制备包含酶和靶向序列的融合构建体，所述靶向序列在当融合构
建体在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达时将所述酶靶向外孢壁。融合构建体然后在蜡样芽孢
杆菌家族成员中表达，并且将所述蜡样芽孢杆菌家族成员添加到土壤或另一种植物生长介
质中或施用于植物的叶片以用于提高目标植物的胁迫抗性。

[1190] 实施例21.制备表达保护性酶过氧化氢酶的BEMD孢子

[1191] 在BetA启动子(SEQIDNO:197)控制下合成编码与BetA靶向序列 (SEQ ID NO:97)连接的来自蜡样芽孢杆菌的保护性酶过氧化氢酶的基因。将此基因引入苏云金芽孢杆菌
BT013A中。通过使转化的芽孢杆菌和野生型菌株培养物在脑心浸液肉汤中生长过夜，在30
℃下铺于营养琼脂板上并且允许生长3天来制备孢子。将孢子从板上洗下来并且在PBS中冲
洗3 次。添加3滴过氧化氢到每个孢子沉淀中。过氧化氢酶将过氧化氢转化成水和氧气。对照孢子不鼓泡，而BEMD过氧化氢酶孢子容易鼓泡，证明孢子表面上的酶活性。其他保护酶可以类似方式呈现并且递送给植物以作用于胁迫期间由植物产生的自由基。

[1192] 实施例22.使用呈现保护种子或植物免于环境胁迫的蛋白或酶的重组蜡样芽孢杆菌家族成员

[1193] 可将保护植物免受环境胁迫的蛋白质、肽以及酶并入BEMD系统中并且经由添加至根、叶、果实或植物生长介质中递送给目标植物。冷冻期间，植物可受到冰作用的损伤。BEMD系统可用于呈现保护植物免受所述作用的肽、蛋白质或酶。例如，BEMD系统可用于呈现胆碱脱氢酶，其通过产生保护植物或种子免受霜冻的保护性产物而起作用。这些酶的底物 (例
如胆碱和/或胆碱衍生物)也可添加至植物生长介质中。添加所述底物可提高在植物环境中
由BEMD表达的酶产生的保护剂(甜菜碱及相关化学物质)的量。已知甜菜碱衍生物保护种子
免受寒冷胁迫。

[1194] 可使用与如上实施例1中所述类似的方法将任何这些蛋白或肽并入 BEMD系统中以便在BEMD孢子上呈现。可制备包含酶和靶向序列的融合构建体，所述靶向序列在当融合
构建体在蜡样芽孢杆菌家族成员中表达时将所述酶靶向外孢壁。融合构建体然后在蜡样芽
孢杆菌家族成员中表达，并且将所述蜡样芽孢杆菌家族成员添加到土壤或另一种植物生长
介质中或施用于植物的叶片以用于保护植物免受环境胁迫和因素。

[1195] 实施例23.通过利用增强或替代的启动子元件增加融合构建体在BEMD系统上的表达

[1196] 使用本文所述的一个或多个靶向序列，BEMD系统可以呈现广泛范围的蛋白质、肽以及酶。这些靶向序列中的一些对外孢壁具有高亲和力，这将对融合蛋白表达有益，但其低融合蛋白表达水平限制其在BEMD系统上的使用。对于此类融合蛋白和序列，可使用替代的
高表达孢子形成启动子来代替天然启动子。

[1197] 例如，SEQ ID NO:13(韦氏芽孢杆菌KBAB4基因3572的氨基酸 1-39)提供非常有效的N端序列以用于将蛋白质递送给蜡样芽孢杆菌家族成员的外孢壁，如以下表26中所示。合成如本文所述的所有基因的完整形式(包括启动子区域和编码融合蛋白的区域)。当韦氏芽
孢杆菌KBAB4基因3572(SEQ ID NO:217)的天然启动子元件用于表达包含融合至β-半乳糖
苷酶(来自大肠杆菌)的SEQ ID NO:13的靶向序列的融合蛋白时，表达低水平的融合蛋白，
从而导致孢子表面上酶活性的降低。酶活性是通过10 分钟内0.5M邻硝基苯基半乳糖苷在
溶液中的转化来测量。用分光光度计在ABS540下测量酶转化。用SEQ ID NO:197(炭疽杆菌
BetA/BAS3290) 或SEQ ID NO:218(韦氏芽孢杆菌KBAB4YVTNβ-螺旋桨蛋白)的高表达启动
子代替韦氏芽孢杆菌KBAB4基因3572的天然启动子元件导致孢子酶促活性的显著提高。另
一方面，用产自于炭疽杆菌Sterne BAS1882(SEQ ID NO:216)的启动子代替韦氏芽孢杆菌
KBAB4基因3572的天然启动子元件导致孢子酶促活性的下降。融合至β-半乳糖苷酶的SEQ 
ID NO:13的靶向序列的表达水平在由BAS1882的启动子(SEQ ID NO:216)驱动时要低得多
(0.38X)，并且在由BetA启动子(SEQ ID NO:197)或YVTN蛋白启动子(SEQ ID NO:218)驱动
时得到极大的改善。

[1198] 表26.

[1199]

[1200]

[1201] 实施例24.植物生长促进细菌菌株的分离和鉴别

[1202] 收集来自最健康且最耐受的马铃薯(Solanumtuberosum)、黄西葫芦(Cucurbitapepo)、番茄(Solanumlycopersicum)以及架菜豆(多花菜豆) 的根际的土壤样
品，将其在无菌水中稀释，并且铺展到营养琼脂板上。选出显示高生长速率且能够传代并繁殖的细菌分离株用于进一步研究。使所选的菌株在基本培养基(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、
NH4Cl 1g、NaCl 0.50g、 MgSO4 7H2O 0.15g、CaCl2 2H2O 0.013g以及葡萄糖1g，每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，且再悬浮于等量的蒸馏水中。
将每次处理10个生菜种子种植在被过筛以除去大碎石的壤土表土(Columbia,MO)中的1cm
深处。将种子在种植于4cm盆中时用 0.5μl再悬浮于水(混合至10ml H2O)中的细菌接种。10
3 3
毫升H2O足以将细菌递送至3in (7.62cm)土壤中并且使土壤饱和以使种子适当萌芽。使植
物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下以11小时光/天生长，且每3天浇水 5ml。一周之后，收集植物高度和叶片直径以及植物的总体健康情况。根际分离株的初始筛选造成从四种植物
的根际获得大于200种不同的细菌和真菌物种。一些细菌物种描述于表27中。鉴别的菌株是通过其适当的细菌鉴别来指示。其他菌株是通过其未知的鉴别号来指示。给出接近对照结
果(+/-2％)的菌剂未被纳入表中。

[1203] 表27

[1204]

[1205]

[1206] 在初始莴苣试验中对总体植物健康情况和植物高度产生最大作用的细菌菌株进行进一步的鉴别。使细菌菌株在37℃下在Luria Bertani肉汤中生长过夜，并且将过夜培养物在离心机中离心。倾析培养基并且使用 Qiagen细菌染色体DNA分离试剂盒(Qiagen 
Bacterial Chromosomal DNA Isolation kit)对剩余的细菌沉淀进行染色体DNA分离。使
用引物 E338F 5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’(SEQ IDNO:298)、 E1099RA 5’-GGG TTG CGC TCG TTG C-3’(SEQIDNO:299)以及 E1099RB 5’-GGG TTG CGC TCG TTA C-3’
(SEQIDNO:300)对染色体 DNA进行16S rRNA编码区域的PCR扩增。使用Promega PCR纯化试
剂盒来纯化PCR扩增子，并且将所得的扩增子稀释并送到密苏里大学 DNA中心(University of Missouri DNA Core)进行DNA测序。将DNA序列与细菌分离株的NCBI BLAST数据库相比，并且通过与已知菌株的直接比较鉴别出属和种。上面鉴别出的物种示于表27中。在很多情
况下，16S rRNA DNA序列仅能界定所选细菌菌株的属。在直接鉴别没有出现的情况下，使用本领域中标准的方法进行另外的生物化学分析以在物种和菌株水平下区分菌株，并且列在
表28中。

[1207] 表28

[1208]

[1209]

[1210] 实施例25.另外的植物生长促进细菌菌株的分离和鉴别

[1211] 从堪萨斯州的Gas附近的农田收集土壤样品，将其在无菌水中稀释，并且铺展在营养琼脂板上。选出显示高生长速率且能够传代并繁殖的细菌分离株用于进一步研究。使所
选的菌株在基本培养基(KH2PO4 3g、 Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、NaCl 0.50g、MgSO4 7H2O 
0.15g、CaCl2 2H2O 0.013g以及葡萄糖1g，每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃) 离心，倾析出培养基，且再悬浮于等量的蒸馏水中。将玉米种子用与单独水混合的商用种子聚合物(每个种子总计1.6μl)或用含有所选菌株的商用种子聚合物(每个种子总计1.6
μl)包被。将包被种子种植于(3英寸)7.62cm直径盆中的被过筛以除去大碎石的壤土表土
(Columbia,MO)中的1英寸

[1212] (2.54cm)深处。使植物在18-24℃(65-75°F)之间的温度下以11小时光/ 天生长，种植时浇水50ml且每3天浇水。两周之后，收集植物高度和叶片直径以及植物的总体健康情况。对于萌芽测定和测定3天根长，将种子如上所示进行包被并且均匀地散布，每张纸巾10个种子。将纸巾用10ml 水润湿，卷起，置于小塑料袋中并且在30℃下孵育或置于27-30℃ (80-85°F)下的萌芽热垫上。3天之后记录根测量数据。根际分离株的初始筛选造成从根际
获得大于100种不同的细菌和真菌物种。一些细菌物种描述于表29中。鉴别的菌株是通过其适当的细菌鉴别来指示。

[1213] 表29

[1214]

[1215]

[1216] 对植物健康产生最大作用的菌株描述于表29中。使细菌菌株在 37℃下在Luria Bertani肉汤中生长过夜，并且将过夜培养物在离心机中离心。倾析培养基并且使用Qiagen细菌染色体DNA分离试剂盒(Qiagen Bacterial Chromosomal DNA Isolation kit)对剩余
的细菌沉淀进行染色体DNA分离。使用引物E338F 5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’ (SEQ IDNO:298)、E1099RA 5’-GGG TTG CGC TCG TTG C-3’ (SEQIDNO:299)以及E1099RB 
5’-GGG TTG CGC TCG TTA C-3’ (SEQIDNO:300)对染色体DNA进行16S rRNA编码区域的PCR扩增。使用Promega PCR纯化试剂盒来纯化PCR扩增子，并且将所得的扩增子稀释并送到密
苏里大学DNA中心(University of Missouri DNA Core)进行DNA测序。将DNA序列与细菌分
离株的NCBI BLAST数据库相比，并且通过与已知菌株的直接比较鉴别出属和种。上面鉴别
出的物种示于表 16中。在很多情况下，16S rRNA DNA序列仅能界定所选细菌菌株的属。在直接鉴别没有出现的情况下，使用本领域中标准的方法进行另外的生物化学分析以在物种
和菌株水平下区分菌株，并且列在表30中。

[1217] 表30

[1218]

[1219]

[1220] wk＝弱生长或低生长

[1221] 实施例26.植物生长促进细菌菌株在苜蓿上的测试

[1222] 使所选的菌株在基本培养基(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、 NaCl 0.50g、MgSO4 7H2O 0.15g、CaCl2 2H2O 0.013g以及葡萄糖1g，每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，且将细菌再悬浮于等量的蒸馏水中。将每次处理10个
zeba-包被苜蓿种子种植在被过筛以除去大碎石的壤土表土(Columbia,MO)中的0.6cm深
处。将种子在种植时用0.5μl再悬浮于水(混合至10mlH2O)中的细菌接种。10 毫升H2O足以将细菌递送至3in3(7.62cm3)土壤中并且使土壤饱和用于种子的适当萌芽。使植物在65-75°F
(18-24℃)之间的温度下以11小时光/ 天生长，且每3天浇水5ml。使苜蓿生长1周以分析在
所述条件下植物的出苗和初始分枝。通过其适当的细菌鉴别和最终高度数据所示的鉴别的
菌株列于表31中。

[1223] 表31

[1224]苜蓿    
细菌接种剂 平均高度(cm) 比较 SEM
未接种 4.82 - .008
阿氏芽孢杆菌CAP56 4.85 101.20％ .016
尼氏芽孢杆菌BOBA57 4.86 101.70％ .021
阴沟肠杆菌CAP12 5.6 116.23％ .020

[1225] 实施例27.植物生长促进细菌菌株在黄瓜上的测试

[1226] 使所选的菌株在基本培养基(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、 NaCl 0.50g、MgSO4 7H2O 0.15g、CaCl2 2H2O 0.013g以及葡萄糖1g，每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，且再悬浮于等量的蒸馏水中。将每次处理10个黄瓜种子种植在被过筛以除去大碎石的壤土表土(Columbia,MO)中的1cm深处。将种子在种植时用
0.5μl再悬浮于水(混合至10ml H2O)中的细菌接种。10毫升H2O足以将细菌递送至3in3
(7.62cm3)土壤中并且使土壤饱和以使种子适当萌芽。使植物在65-75°F(18-24℃)之间的
温度下以11小时光/天生长，且每3天浇水5ml。允许黄瓜生长2周以分析在所述条件下植物
的出苗和初始分枝。通过其适当的细菌鉴别和最终高度数据所示的鉴别的菌株列于表32
中。

[1227] 表32

[1228]

[1229] 实施例28.植物生长促进细菌菌株在黄色南瓜上的测试

[1230] 使所选的菌株在基本培养基(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、 NaCl 0.50g、MgSO4 7H2O 0.15g、CaCl2 2H2O 0.013g以及葡萄糖1g，每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，且再悬浮于等量的蒸馏水中。将每次处理10个黄色南瓜种子种植在被过筛以除去大碎石的壤土表土(Columbia,MO)中的1cm深处。将种子在种植时
用0.5μl再悬浮于水(混合至10ml H2O)中的细菌接种。10毫升H2O 足以将细菌递送至3in3
(7.62cm3)土壤中并且使土壤饱和以使种子适当萌芽。使植物在65-75°F(18-24℃)之间的
温度下以11小时光/天生长，且每 3天浇水5ml。允许南瓜生长2周以分析在所述条件下植物的出苗和初始分枝。通过其适当的细菌鉴别、最终高度数据以及最终叶片直径(通过两片叶子的跨距)数据所示的鉴别的菌株列于表33中。

[1231] 表33

[1232]

[1233] 实施例29.植物生长促进细菌菌株在黑麦草上的测试

[1234] 使所选的菌株在基本培养基(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、 NaCl 0.50g、MgSO4 7H2O 0.15g、CaCl2 2H2O 0.013g以及葡萄糖1g，每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，且再悬浮于等量的蒸馏水中。将每次处理30个黑麦草种子种植在被过筛以除去大碎石的壤土表土(Columbia,MO)中的0.3cm深处。将种子在种植时
3
用0.5μl再悬浮于水(混合至10ml H2O)中的细菌接种。10毫升H2O 足以将细菌递送至3in
(7.62cm3)土壤中并且使土壤饱和以使种子适当萌芽。使植物在65-75°F(18-24℃)之间的
温度下以11小时光/天生长，且每 3天浇水5ml。允许黑麦草生长1.5周以分析在所述条件下植物的出苗和初始分枝。通过其适当的细菌鉴别和高度数据所示的鉴别的菌株列于表34 
中。

[1235] 表34

[1236]  黑麦草  
细菌接种剂 平均高度(cm) 比较 SEM
未接种 1.61 - .023
阿氏芽孢杆菌CAP53 2.01 124.70％ .012
弯曲芽孢杆菌BT054 2.21 137.30％ .034
蕈状芽孢杆菌BT155 2.29 142.20％ .049
阿氏芽孢杆菌CAP56 2.19 136.00％ .009
尼氏芽孢杆菌BOBA57 2.29 142.40％ .045
阴沟肠杆菌CAP12 1.98 122.50％ .015

[1237] 实施例30.植物生长促进细菌菌株在玉米上的测试

[1238] 使所选的菌株在基本培养基(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、 NaCl 0.50g、MgSO4 7H2O 0.15g、CaCl2 2H2O 0.013g以及葡萄糖1g，每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，且再悬浮于等量的蒸馏水中。将每次处理10个玉米种子种植在被过筛以除去大碎石的壤土表土(Columbia,MO)中的2.5cm深处。将种子在种植时用
0.5μl再悬浮于水(混合至10ml H2O)中的细菌接种。10毫升H2O足以将细菌递送至3in3
3
(7.62cm)土壤中并且使土壤饱和以使种子适当萌芽。使植物在65-75°F(18-24℃)之间的
温度下以11小时光/天生长，且每3天浇水5ml。允许玉米生长2周以分析在所述条件下植物
的出苗和初始分枝。通过其适当的细菌鉴别和最终高度数据所示的鉴别的菌株列于表35
中。

[1239] 表35

[1240]

[1241] 实施例31.植物生长促进细菌菌株在大豆上的测试

[1242] 使所选的菌株在基本培养基(KH2PO4 3g、Na2HPO4 6g、NH4Cl 1g、 NaCl 0.50g、MgSO4 7H2O 0.15g、CaCl2 2H2O 0.013g以及葡萄糖1g，每L干重，或对于慢生根瘤菌属或根瘤菌属在酵母甘露醇培养基上)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，且再悬浮于等量的蒸馏水中。将每次处理10个大豆种子种植在被过筛以除去大碎石的
壤土表土(Columbia,MO)中的2.5cm深处。将种子在种植时用0.5μl再悬浮于水(混合至10ml H2O)中的细菌接种。当测试两种菌株时，将0.5μl 每种再悬浮的细菌与10mlH2O混合。10毫升H2O足以将细菌递送至 3in3(7.62cm3)土壤中并且使土壤饱和以使种子适当萌芽。使植物在 
65-75°F(18-24℃)之间的温度下以11小时光/天生长，且每3天浇水5ml。允许大豆生长2周
以分析在所述条件下植物的出苗和初始分枝。通过其适当的细菌鉴别和最终高度数据所示
的鉴别的菌株列于表36中。本发明中的细菌菌株与慢生根瘤菌属种或根瘤菌属种成员的共
同接种导致与任一接种剂单独相比植物生长增加。

[1243] 表36

[1244]

[1245]

[1246] 实施例32.具有植物生长促进属性的蜡样芽孢杆菌家族成员

[1247] 使蕈状芽孢杆菌菌株BT155、蕈状芽孢杆菌菌株EE118、蕈状芽孢杆菌菌株EE141、蕈状芽孢杆菌菌株BT46-3、蜡样芽孢杆菌家族成员菌株EE349、苏云金芽孢杆菌菌株BT013A以及巨大芽孢杆菌菌株EE281 在37℃下在Luria Bertani肉汤中生长，并且将过夜的培养
物离心，倾析出培养基，且再悬浮于等量的蒸馏水中。将每次处理20个玉米种子种植在被过筛以除去大碎石的壤土表土(Columbia,MO)中的2.5cm深处。将种子在种植时用0.5μl再悬
浮于水(混合至50ml H2O)中的细菌接种。50ml H2O足以将细菌递送至29in3(442.5cm3)土壤中并且使土壤饱和以使种子适当萌芽。使植物在65-72°F之间的温度下以13小时光/天生
长，且每3 天浇水5ml。允许秧苗生长2周以分析在所述条件下植物的出苗和初始分枝。通过其适当的细菌鉴别和最终高度数据所示的鉴别的菌株列于表37 中。

[1248] 表37

[1249]

[1250] 所测试的所有植物生长促进细菌在所述条件下在两周时对玉米高度具有有利的作用。蜡样芽孢杆菌家族成员EE128菌株在此试验中具有最大作用，在玉米高度上有大于
14％提高。

[1251] 实施例33.蜡样芽孢杆菌家族成员的增强选择，用以筛选植物生长促进及其他有益活性作为BEMD表达宿主

[1252] 可使用本文所述的任何靶向序列将BEMD系统用于呈现广泛范围的蛋白质、肽、以及酶以提供有利的农用效果。另外的有利效果可通过选择具有固有的有利属性的表达宿主
(蜡样芽孢杆菌家族成员)而获得。蜡样芽孢杆菌家族成员的许多菌株具有植物生长促进益
处。另外，许多蜡样芽孢杆菌家族成员菌株经由直接的杀真菌、杀虫、杀线虫、或其他保护性活性而具有保护作用。通过使用此类菌株作为BEMD系统的表达宿主，最终孢子产物将在农
业中具有积极益处的组合。

[1253] 表38提供了实验结果，其中融合蛋白在各种蜡样芽孢杆菌家族成员菌株中表达。所有菌株都表达包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35和来自枯草芽孢杆菌的磷酸酶PhoA4的融
合蛋白，磷酸酶PhoA4是提高磷酸盐在玉米中的摄取的有利酶。合成所述基因，将其克隆至pMK4载体中，并且引入以下表38中所示的每个芽孢杆菌属种中。通过在30℃下在含有 10μg/ml氯霉素的营养琼脂板上孵育3天，使菌株形成孢子。将孢子收集、洗涤并且在种植时以在每个7.62cm直径盆的50ml水中1×105个CFU/ml 的比率施用于玉米，其中每盆5mg多磷酸
盐。使玉米在粉砂壤土中生长两周。使用T5灯(54瓦特)使植物在理想的光下生长，并且在
15.5-25.5℃之间的控制温度条件下暴露于13小时光/天。在两周试验内每3天向植物浇水
至饱和。在两周结束时，测量每株植物的高度并且将测量值根据对照苏云金芽孢杆菌孢子
进行归一化。SEQ ID NO:1-磷酸酶融合蛋白的表达使得玉米高度在2周时增加，与所选的表达宿主菌株无关。如表38中所示，使用植物生长促进蜡样芽孢杆菌家族成员进一步提高玉
米高度。

[1254] 表38.

[1255]杆菌种 菌株 融合蛋白 2周时的高度，归一化
苏云金芽孢杆菌 菌株BT013A 无 100％
苏云金芽孢杆菌 菌株BT013A SEQ ID NO:1-磷酸酶 117.4％
蕈状杆菌 菌株EE141 无 107.3％
蕈状杆菌 菌株EE141 SEQ ID NO:1-磷酸酶 123.3％
蜡样芽孢杆菌家族成员 菌株EE128 无 124.1％
蜡样芽孢杆菌家族成员 菌株EE128 SEQ ID NO:1-磷酸酶 131.7％
蕈状杆菌 菌株BT155 无 104.8％
蕈状杆菌 菌株BT155 SEQ ID NO:1-磷酸酶 121.9％

[1256] 实施例34.使用各种靶向序列以在苏云金芽孢杆菌的表面上表达β-半乳糖苷酶

[1257] 与BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO:1的氨基酸20-35)具有高度同源性的广泛多种靶向序列可用于在蜡样芽孢杆菌家族成员表面上呈现酶、蛋白质、以及肽。若干靶向序列是通过制备含有与枯草芽孢杆菌脂肪酶连接的靶向序列的融合蛋白来比较。使用靶向序列的
天然启动子合成融合构建体，克隆到复制质粒pMK4中，并且引入苏云金芽孢杆菌BT013A中。
通过在30℃下在含有10μg/ml氯霉素的营养琼脂板上孵育3天将菌株用于孢子形成中。将孢子收集，洗涤，并且以1×108/ml的比率再悬浮于PBS 中。将每种融合构建体孢子的1×105个孢子悬浮在400μl dH2O中。将反应与反应组分一起温至所需反应温度(40℃)。添加200μl工作缓冲液(9:1 溶液A:溶液B)。溶液A是50mMTrispH10和13.6mM脱氧胆酸且溶液B 是3mg/ml
于异丙醇中的对硝基苯基棕榈酸。将反应物在40℃下孵育10 分钟并置于冰上，离心以除去孢子，并且记录在420nm下的吸光率。结果显示于以下表39中。根据包含融合至枯草芽孢杆菌脂肪酶的SEQ ID NO:1的氨基酸1-35的对照融合蛋白对活性进行归一化。

[1258] 表39.

[1259]

[1260]

[1261] 与脂肪酶连接的若干靶向序列在孢子表面上产生更高的表达水平和酶活性。具体说来，SEQ ID NO.96、98以及100(各自含有较短的靶向序列)在BEMD孢子表面上产生增加的融合表达。所有含有测试的靶向序列的融合蛋白都导致脂肪酶的表面呈现。

[1262] 实施例35.使用各种外孢壁序列以在苏云金芽孢杆菌表面上表达脂肪酶并且论证融合蛋白在外孢壁表面上的定位

[1263] 广泛多种外孢壁蛋白可用于在蜡样芽孢杆菌家族成员表面上呈现酶、蛋白质、以及肽。若干不同的外孢壁蛋白是通过如实施例34中所述制备含有与枯草芽孢杆菌脂肪酶连
接的外孢壁蛋白的融合蛋白来比较。使用以下表40中所示外孢壁蛋白的天然启动子合成融
合构建体，克隆到复制质粒pMK4中，并且引入苏云金芽孢杆菌BT013A中。呈现各种外孢壁蛋白-枯草芽孢杆菌168脂肪酶融合体的孢子通过使转化的细菌在脑心浸液肉汤中在来自10μ
g/ml氯霉素的选择压力下生长，铺于营养琼脂板上，并且在30℃下孵育3天来制备。3天之
后，将孢子从板上洗下来，通过离心纯化，并且以1×108个CFU/ml再悬浮于PBS中。

[1264] 将每种融合构建体的1×105个孢子再悬浮在400μl dH2O中。将反应与反应组分一起温至所需反应温度(40℃)。添加200μl工作缓冲液(9:1 溶液A:溶液B)。溶液A是50mM 
Tris pH10和13.6mM脱氧胆酸，溶液B 是异丙醇中的3mg/ml对硝基苯基棕榈酸。将反应物在
40℃下孵育10分钟并置于冰上，离心以除去孢子，并且记录在420nm下的吸光率。结果显示于以下表40中。根据与脂肪酶连接的SEQ ID NO:109对活性进行归一化。

[1265] 表40.

[1266]

[1267] 使用SEQ ID NO.109和110的外孢壁蛋白在孢子上产生最高酶活性。所有含有外孢壁蛋白的融合蛋白都产生活性枯草芽孢杆菌168脂肪酶的表面呈现，但是在不同水平下。

[1268] 使用荧光报道基因mCherry证明另外的外孢壁蛋白使融合蛋白靶向外孢壁。产生含有与mCherry报道子连接的SEQ ID NO.111、120以及110的外孢壁蛋白的融合构建体。孢
子生长1.5天，收集，并且如上所述再悬浮。将7μl的荧光孢子置于NikonE1000显微镜下并且在晚期孢子形成期间成像。环中的圆形定位指示外部孢子层定位，且外观与外孢壁蛋白的
相匹配。荧光显微镜结果显示于图2中。图2A、2B以及2C是孢子的荧光显微镜图像，其分别表达包含SEQ ID NO.111、120以及110的外孢壁蛋白和mCherry报道基因的融合蛋白。所有三
个融合体都显示高水平的荧光和外孢壁定位，表明其对在外孢壁表面上表达外源蛋白的潜
在效用。

[1269] 实施例36.使用各种靶向序列和外孢壁蛋白以在枯草芽孢杆菌孢子中表达磷酸酶以及表达磷酸酶的孢子在大豆中的作用。

[1270] 表达枯草芽孢杆菌EE148磷酸酶A4(PhoA4)的BEMD孢子是通过在其与PhoA4连接的天然启动子控制下合成编码各种靶向序列和外孢壁蛋白的基因来产生。合成的基因被克隆
到pMK4中并引入苏云金芽孢杆菌BT013A中。呈现各种外孢壁蛋白-枯草芽孢杆菌
EE148PhoA4融合体的孢子通过使转化的细菌在脑心浸液肉汤中在来自10μg/ml氯霉素的选
择压力下生长，铺于营养琼脂板上，并且在30℃下孵育3天来制备。3 天之后，将孢子从板上
8
洗下来，通过离心纯化，并且以1×10个CFU/ml 再悬浮于PBS中。

[1271] 将大豆种植于用标准壤土表层土填充的10cm深的盆中的2.54cm 深处。将表达PhoA4的BEMD孢子在50ml水中稀释至1×104个/ml的浓度并且在种植时施用于每株植物。还
包括仅水的对照。将多磷酸盐以 0.5mg/盆的比率以液体形式添加到盆中。使用T5灯(54瓦
特)使植物在理想的光下生长，并且在15.5-25.5℃之间的控制温度条件下暴露于13小时
光/天。在两周试验内每3天向植物浇水至饱和。在两周结束时，测量每株植物的高度，并且将测量值根据仅对照水的植物进行归一化。

[1272] 结果显示于表41中。在表达含有与各种靶向序列和外孢壁蛋白(其与PhoA4具有不同的融合伴侣)连接的PhoA4的融合蛋白的BEMD孢子存在下生长的大豆全部都展现增强的
生长，但作用程度根据所用的靶向序列或外孢壁蛋白而变化。

[1273] 表41.

[1274]

[1275]

[1276] 实施例37.BEMD孢子与种子处理、液体肥料及其他添加剂的共同施用

[1277] 测试表达融合蛋白的BEMD孢子与不同种子处理的相容性。BEMD 孢子表达包含与枯草芽孢杆菌EE148磷酸酶(PhoA4)或POLARIS肽连接的SEQ ID NO:1的氨基酸1-35的靶向
序列的融合蛋白。合成的基因被克隆到pMK4中并引入苏云金芽孢杆菌BT013A中。呈现各种
外孢壁蛋白- 枯草芽孢杆菌EE148PhoA4或POLARIS融合体的孢子通过使转化的细菌在脑心
浸液肉汤中在来自10μg/ml氯霉素的选择压力下生长，铺于营养琼脂板上，并且在30℃下孵育3天来制备。3天之后，将孢子从板上洗下来，通过离心纯化，并且以1×108个CFU/ml再悬浮于PBS中。

[1278] 使用T5灯(54瓦特)使植物在理想的光下生长，并且在15.5-25.5℃之间的控制温度条件下暴露于13小时光/天。在两周试验内每3天向植物浇水至饱和。在两周结束时，测量每株植物的高度，并且将测量值根据仅对照水的植物进行归一化。结果显示于以下表42中。
浸透(drench)＝以50ml/盆施用于土壤。聚合物＝仅ACCELERON种皮聚合物。以1×104个细
胞/50ml添加BEMD孢子用于浸透施用。以1.3×104个/细胞/种子添加BEMD孢子用于种皮施
用。10-34-0和6-24-6是标准商用播种肥料组合物。10-34-0是液体磷酸铵。6-24-6是具有
邻/多制剂的低盐液体磷酸盐肥料。着色剂＝Becker Underwood红色种皮着色剂。MACHO、
APRON 以及CRUISER是用于种子的商用杀真菌剂。MACHO含有活性成分吡虫啉，APRON含有活性成分精甲霜灵，CRUISER含有活性成分噻虫嗪、精甲霜灵以及咯菌腈的混合物。发现孢子与许多种子施用相容并且保留其刺激玉米的植株生长的能力。

[1279] 表42.

[1280]

[1281]

[1282] 发现BEMD孢子与测试的所有种皮调理物相容。当BEMDPhA4孢子与着色剂和聚合物单独组合时活性存在稍微下降，但孢子在与其他杀真菌剂组合的着色剂时恢复全部活性。
BEMD孢子在液体肥料时也工作良好。播种肥料很可能经由直接营养素补充促进植物生长。
BEMD孢子在两种播种肥料下发挥作用，表明磷酸酶活性也可造成在过量营养素存在下增强
的植物生长。BEMD孢子与杀真菌剂的组合展现比单独BEMD孢子更大的植物生长增强，这可
能是由于在早期生长期间给予嫩玉米植株的保护。

[1283] 实施例38.所述使用BEMD孢子作为叶添加剂用于减轻玉米生长的胁迫抑制

[1284] BEMD孢子呈现系统可用于递送酶，所述酶可减轻在野外或温室中生长的植物的一定程度的胁迫。为此目的，选择对土壤中的活性氧物质选择性地作用的酶。活性氧物质是植物中的关键胁迫标记。

[1285] 产生表达融合蛋白的BEMD孢子，所述融合蛋白包含与脱乙酰壳多糖酶、过氧化物歧化酶、过氧化氢酶或来自苏云金芽孢杆菌BT013A的β-1,3葡聚糖酶连接的SEQ ID NO:1的氨基酸1-35的靶向序列。合成的基因被克隆到pMK4中并引入苏云金芽孢杆菌BT013A中。呈
现各种蛋白融合体的孢子通过使转化的细菌在脑心浸液肉汤中在来自10μg/ml氯霉素的选
择压力下生长，铺于营养琼脂板上，并且在30℃下孵育3天来制备。 3天之后，将孢子从板上洗下来，通过离心纯化，并且以1×108个CFU/ml 再悬浮于PBS中。

[1286] 使用T5灯(54瓦特)使在V5阶段的三周龄玉米植株在理想的光下生长，并且在15.5-25.5℃之间的控制温度条件下暴露于13小时光/天。在试验过程中每3天向植物浇水
至饱和。当植物达到V5时，将BEMD孢子或阳性对照化学品以1×105个BEMD孢子/ml或在为化
学品推荐的比率下喷洒在叶片上。总共1ml喷洒剂个别地施用于每株植物。在临施用叶片喷洒剂之前记录植物高度。然后通过温至32.2℃并将浇水减少到每周一次来使玉米植株受到
胁迫。植物保持在胁迫条件下两周。两周结束时，再次测量植物高度，并且记录视觉外观。在这些胁迫条件下，植物生长在对照处理中最少。继续在胁迫条件下生长的能力是通过在两
周跨度内与仅水对照相比的植物高度的增加来测量。结果显示于以下表43中。

[1287] 表43.

[1288]

[1289] 使用BEMD系统将若干去胁迫酶施用于玉米，如以上表43中所示。对照孢子没有显著影响(植物高度下降-1.6％)。BEMD壳聚糖酶当与其壳聚糖组合时具有积极的作用。两种
效果最佳的酶是BEMDβ-1,3-葡聚糖酶和BEMD过氧化氢酶。BEMDβ-1,3-葡聚糖酶具有基本的抗真菌活性，但也可对植物具有直接作用。水杨酸和BTH是用于叶片测定的阳性对照，且在两者中都见到了积极的应答。此叶片递送方法可用于在不同的季节时间下将去胁迫酶递送
给植物。

[1290] 实施例39.使用各种含σ-K的启动子的融合蛋白的表达水平

[1291] 如以上实施例23中所示，替代靶向序列、外孢壁蛋白、或外孢壁蛋白片段的天然启动子可极大地影响在蜡样芽孢杆菌家族孢子外孢壁上表达的融合蛋白的水平。举例来说，用BclB启动子替代天然的BclA启动子极大地降低蜡样芽孢杆菌家族成员孢子表面上的融
合蛋白水平。或者，用BclA启动子替代天然的BclB启动子显著地提高外孢壁上的融合蛋白
水平。

[1292] 各种外孢壁蛋白在其天然孢子形成启动子控制下的相对启动子表达水平是从来自Bergman等人,2008的微阵列数据处获得。在晚期孢子形成时间里(实验开始之后300分
钟)测定相对表达水平，此时σK启动子的活性最大。σK启动子是外孢壁定位基因及相关蛋白表达的关键启动子。相对表达是在所有给定时间时基因表达水平与染色体所有其他基因的
平均值相比的增加。以下表44显示在蜡样芽孢杆菌家族成员中多种σK驱动基因的相对表达水平。

[1293] 表44.

[1294]

[1295]

[1296] 实施例40.表达包含一氧化氮合成酶的融合蛋白的BEMD孢子的制备和测试以及所述孢子用于刺激植物种子发芽的用途

[1297] 制备表达含有BclA的氨基酸20–35、6-丙氨酸接头和来自枯草芽孢杆菌168的一氧化氮合酶的融合蛋白的BEMD孢子。来自枯草芽孢杆菌 168的一氧化氮合酶(NOS)基因合成
至BclA启动子、核糖体结合位点 (RBS)、起始密码子和BclA的氨基酸20–35。加入6-丙氨酸接头以将BclA 靶向序列与NOS酶分开。这些融合蛋白的氨基酸序列，包括由BclA起始密码
子编码的甲硫氨酸、BclA的氨基酸20–35、6-氨基酸接头和NOS酶，在以上表9中提供。这些克隆通过用XhoI消化并连接到pHP13的SalI 位点从而亚克隆入穿梭载体pHP13中。正确的构
建体经测序和验证，转化入大肠杆菌细胞中。所得质粒转化入苏云金芽孢杆菌BT013A和蕈
状芽孢杆菌EE155中。

[1298] 然后通过在营养琼脂板上涂抹细菌并使板在30℃孵育72小时，使用编码NOS重组蛋白的质粒转化的重组苏云金芽孢杆菌BT013A和蕈状芽孢杆菌EE155诱导形成孢子。72小
时后，通过涂抹到灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)中从板上收集细菌孢子，并密度梯度离心3次进
行纯化。

[1299] 然后将孢子以1×105个孢子/种子的比率用于玉米和大豆的商业杂交种子。大豆杂交品种是BECK 335NR，其含有胞囊线虫保护基因、 ROUNDUP READY草甘膦抗性基因和用
于疫霉属抗性的K-gene。玉米杂交品种为BECK 5540RR，其含有ROUNDUP READY草甘膦抗性
基因。然后将种子用L-精氨酸轻轻粉碎。对照组种子用L-精氨酸粉碎，但没有孢子。然后将种子放在两片纸巾之间，用25ml H2O润湿纸巾。然后将纸巾卷起，放入小自封袋中，并紧紧密封。然后将这些袋放置在30℃的培养箱中并使其发芽24或48小时。测量每个时间点发芽
的种子数，结果与未处理和对照种子相比。这些实验的结果示于下表45和46中。

[1300] 表45.经表达含有一氧化氮合酶的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子处理的杂交大豆种子中发芽比率增加。

[1301]

[1302] 表46.经表达含有一氧化氮合酶的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子处理的杂交玉米种子中发芽比率增加。

[1303]

[1304] 从表45和46可以看出，用L-精氨酸和表达含有一氧化氮合酶的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员处理种子在大豆和玉米中均导致发芽种子数量增加。

[1305] 实施例41.表达包含核酸结合蛋白的融合蛋白的BEMD孢子的制备和测试

[1306] 制备表达含有BclA的氨基酸20-35、8-丙氨酸接头和来自枯草芽胞杆菌168的非特异性DNA结合蛋白SASPα或来自枯草芽胞杆菌168的非特异性DNA结合蛋白SASPγ的融合蛋
白的BEMD孢子。基因合成编码 SASPα和SASPγ的DNA，其与BclA启动子、RBS、BclA起始密码子和 BclA的氨基酸20-35处于相同读码框。在Bcl靶向序列和RNA/DNA结合蛋白之间加入8-
丙氨酸接头。接头允许融合蛋白更大的灵活性和蛋白折叠。这些融合蛋白的氨基酸序列，包括由BclA起始密码子编码的甲硫氨酸、BclA的氨基酸20-35、八氨基酸接头和SASPα或SASPγ蛋白，提供于以下表11中。合成的基因用XhoI消化，连接至pHP13的SalI位点，以生成质粒pHP13-BclA20-35-SASPα和pHP13-BclA20-25-SASPγ。 pHP13是具有氯霉素和红霉素抗性
盒的良好表征的5.5kbp穿梭载体质粒。其通过质粒pE194、pC194和pUC9的连接构建。

[1307] 对正确的克隆进行DNA测序，并转化到大肠杆菌SCS110菌株中。然后纯化质粒DNA，并转化到苏云金芽孢杆菌BT013A中。然后通过涂抹到营养琼脂平板上在30℃下孵育72小时来诱导这些细菌形成孢子。如前一个实施例中所述收集和纯化孢子。

[1308] 为了评估重组孢子结合核酸的能力，随后将用编码SASPα和SASP γ融合蛋白的质粒转化的重组蜡样芽胞杆菌家族成员在PBS中与5'端含有荧光素标签的随机DNA引物孵育。
实验中还包括使用非重组孢子的对照。将孢子与50mM标记的DNA孵育10分钟，然后以10,
000rpm离心1分钟进行洗涤。除去上清液，将孢子重悬于1ml PBS中。将孢子再次沉淀，离心后除去上清液，然后进行分析。在E600尼康荧光显微镜下检查经荧光素标记的DNA处理的孢子，并通过与不含DNA结合融合蛋白的对照孢子相比总体全部荧光的变化来确定DNA结合。
该测定的结果显示于下面表47中。

[1309] 表47.表达包含DNA结合蛋白的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的DNA结合

[1310]

[1311]

[1312] 另外，图3显示了通过荧光素标记的DNA结合测得DNA与孢子的结合。在图3中，“对照”是指非重组苏云金芽孢杆菌BT013A孢子(非重组)，“SASPa”是指表达BclA-SASPα融合蛋白的苏云金芽孢杆菌BT013A孢子，SASPc是指表达BclA-SASPγ融合蛋白的苏云金芽孢杆菌BT013A孢子。

[1313] 从表47和图3所示的数据可以看出，表达SASPα或SASPγ融合蛋白的孢子比非重组孢子结合显著更大量的DNA，表明这些孢子与DNA 有很强的亲和性。

[1314] 实施例42.表达包含核酸酶的融合蛋白的BEMD孢子的制备和测试

[1315] 除了在前一个实施例中讨论的非特异性DNA和RNA结合蛋白之外，核酸酶也可以用于结合和切割核酸分子。制备表达含有BclA的氨基酸20-35的融合蛋白的BEMD孢子，并测定其结合和切割DNA的能力。

[1316] 对枯草芽胞杆菌核酸内切酶1进行PCR扩增并融合以与BclA启动子、RBS、起始密码子和BclA的氨基酸20-35处于相同读码框。然后将该构建体克隆到pHP13质粒中，以产生质
粒pHP13-BclA20-35-核酸内切酶。将该构建体测序，转化入大肠杆菌中并在大肠杆菌中繁
殖。然后从大肠杆菌中分离质粒DNA，并引入苏云金芽孢杆菌BT013A中。如上面实施例40所述制备和纯化孢子。

[1317] 通过将表达核酸内切酶融合蛋白的重组孢子和非重组对照孢子 (PBS中，浓度为18
×10个孢子/ml PBS)与300ng鲑鱼精子DNA和1μg/ml DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)DNA
染料孵育，测定核酸内切酶活性。使反应在37℃下继续进行10分钟。10分钟后，使用荧光计测定上清液中经切割的DNA。当DNA被切割时，DAPI染料从单个游离核苷酸中释放出来，因此可以通过DAPI染料随时间的流失来测定切割。该测定的结果示于下表48中。

[1318] 表48.表达核酸内切酶融合蛋白的BEMD孢子的核酸酶活性和DNA结合

[1319]

[1320] 表48中提供的数据显示，核酸内切酶融合蛋白表达于苏云金芽孢杆菌BT013A孢子的外孢壁上，并且能够切割鲑鱼精子DNA，如上清液中 DAPI信号的流失所证实。令人惊讶的是，一部分核酸内切酶紧密结合DNA，但并不切割DNA，即使在清洗孢子以除去多余DNA后，孢子上仍保留有DAPI荧光信号。这表明并非所有的DNA都被处理，并且在孢子外表达的核酸酶可以紧密结合DNA。为了增加这种效果，可以在融合蛋白中使用具有失活的活性位点的核酸酶，这将导致DNA的切割更少，甚至在孢子上结合更多DNA。

[1321] 实施例43.表达含有核酸结合蛋白或肽的融合蛋白的孢子的农业用途

[1322] 表达包含核酸结合蛋白或肽的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族或重组孢子-形成细菌成员可用于农业中，向植物生长介质(例如土壤)和 /或植物递送核酸。例如，重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌可以通过种子处理、在沟/土壤浸透处理或叶面
处理递送到植物。另外，包含核酸结合蛋白或肽的融合蛋白可以在本文所述的任何内生蜡
样芽胞杆菌家族成员或任何其他内生杆菌种中表达，使得能够将结合到核酸结合蛋白的核
酸内部传递到植物，在那里它们将更有效地达到其靶细胞。例如，包含核酸结合蛋白的融合蛋白可以在内生菌株蜡样芽胞杆菌家族成员 EE349中表达。另一种在该菌株中的融合蛋白
(包含内切葡聚糖酶作为目标蛋白)的表达在下文的实施例51中描述，说明在该内生菌株中
表达的融合蛋白被内部递送到植物中。因此，在内生蜡样芽胞杆菌家族成员菌株例如蜡样
芽胞杆菌家族成员EE349中表达包含SASPα、SASPγ、Hfq或具有失活活性位点的核酸酶的融合蛋白可以提供内部递送RNA和DNA (例如RNAi或rDNA)到植物的工具。其他非特异性结合
核酸结合蛋白或肽也可用于融合蛋白中。

[1323] 实施例44.表达融合蛋白以及还过量表达调节所述融合蛋白表达的蛋白的BEMD孢子的制备

[1324] 在表达本文所述任何融合蛋白的重组蜡样芽孢杆菌家族成员中各种外孢壁蛋白(本文中称为“调节蛋白”)的过表达可以调节(增加或减少) 融合蛋白的表达水平。这些调节蛋白包括ExsY、ExsFA/BxpB、CotY、 CotO、ExsFB、InhA1、InhA2、ExsJ、ExsH、YjcA、YjcB、BclC、AcpC、 InhA3、丙氨酸消旋酶1、丙氨酸消旋酶2、BclA、BclB、BxpB、BclE、 BetA/BAS3290、CotE、ExsA、ExsK、ExsB、YabG、Tg1、超氧化物歧化酶1(SODA1)和超氧化物歧化酶2(SODA2)。

[1325] 控制融合蛋白表达水平的能力允许控制在重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子外侧上呈现的融合蛋白的目标蛋白或肽的量。例如，当融合蛋白的目标蛋白或肽包含植物生
长刺激蛋白或肽(例如降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶)时，表达融合蛋白的重组
蜡样芽胞杆菌家族成员产生孢子，当其应用于种子、植物或植物生长介质时由于植物生长
刺激蛋白或肽的作用而对植物有益。调节融合蛋白的表达水平导致对在重组蜡样芽孢杆菌
家族成员的孢子外侧上呈现的目标肽或蛋白质的水平的调节。在某些情况下，增加融合蛋
白表达的水平将是有益的(例如，希望增加酶的表达，从而增加可以递送到植物的每个孢子的酶量)。在其他情况下，降低融合蛋白表达的水平将是有益的(例如，希望减少蛋白的表
达，从而减少递送到植物的每个孢子的蛋白量，例如，高水平的蛋白会对植物产生不利影响时)。

[1326] 为了制备用于在蜡样芽胞杆菌家族成员中表达融合蛋白的质粒，制备含有BclA启动子(SEQ ID NO：85)、起始密码子和BclA的氨基酸20-35 的PCR片段，其与来自大肠杆菌
DH5α的枯草芽胞杆菌168内切葡聚糖酶或β-半乳糖苷酶基因融合于相同读码框中。将这些PCR片段用XhoI 消化，分别连接到pSUPER质粒中，以制备质粒pSUPER-BclA 20-35- 内切葡聚糖酶和pSUPER-BclA 20-35-βgal。pSUPER质粒通过将pUC57 质粒(含有氨苄青霉素抗性
盒)与来自杆菌的pBC16-1质粒(含有四环素抗性)融合而制备。该5.5kbp的质粒可以在大肠
杆菌和杆菌中复制。

[1327] 将pSUPER-BclA 20-35-内切葡聚糖酶和pSUPER-BclA 20-35-βgal质粒转化入Dam甲基化酶阴性的大肠杆菌菌株中并在其中繁殖。通过DNA测序验证pSUPER-BclA 20-35-内
切葡聚糖酶和 pSUPER-BclA 20-35-βgal质粒的序列。

[1328] 将pSUPER-BclA 20-35-内切葡聚糖酶和pSUPER-BclA 20-35-βgal质粒转化入宿主菌株苏云金芽孢杆菌BT013A(用于 pSUPER-BclA 20-35-Endo)或蕈状芽孢杆菌BT155
(pSUPER-BclA 20-35-βgal)中。这些转化的菌株在孢子外部表达β-半乳糖苷酶或内切葡聚糖酶。

[1329] 为了制备用于过表达调节蛋白的质粒，制备含有天然启动子区域和编码ExsFA/BxpB、CotO、ExsFB、YjcB、BclC、AcpC、BclA、BclB、 BxpB和CotE的基因的PCR片段，用SalI消化，并连接到pHP13质粒中。上面表3中提供了天然启动子区域的核苷酸序列。pHP13质粒是多拷贝质粒，因此当将质粒转化入蜡样芽胞杆菌家族成员宿主细胞时，使得表达高水平的
编码的调节蛋白。含有启动子区域和编码ExsFA/BxpB、 CotO、ExsFB、YjcB、BclC、AcpC、BclA、BclB、BxpB、BclE、BclB、 BxpB、BclE、BetA/BAS3290和CotE的基因的pHP13质粒在本文中分别被称为pHP13-ExsFA/BxpB、pHP13-CotO、pHP13-ExsFB、 pHP13-YjcB、pHP13-BclC、pHP13-AcpC、pHP13-BclA、pHP13-BclB、 pHP13-BxpB和pHP13-CotE。

[1330] 将含有启动子区域和编码调节蛋白的基因的pHP13质粒转化入大肠杆菌菌株中并在其中繁殖。通过DNA测序验证这些质粒的序列。

[1331] 将编码调节蛋白的pHP13质粒转化入含有pSUPER-BclA 20-35-内切葡聚糖酶的苏云金芽孢杆菌BT013A或含有pSUPER-BclA 20-35-βgal的蕈状芽孢杆菌BT155中。将所得的
重组细菌铺在含有10μg/ml氯霉素的营养琼脂平板上以选择pHP13质粒，和含有10μg/ml四环素的平板上以选择pSUPER质粒。含有两种质粒的细菌在脑心脏输注肉汤中与四环素和氯
霉素一起生长过夜，然后将过夜培养物涂抹到营养琼脂上，并使细菌在30℃下72小时以形
成孢子。72小时后，通过涂抹到无菌PBS中从板上收集细菌孢子，并通过密度离心三次纯化。
然后将纯的孢子稀释至1×108 CFU/ml，并使用1×108菌落形成单位(CFU)的群体测定酶活
性。

[1332] 实施例45.通过过量表达调节融合构建体表达的蛋白从而使BEMD系统上的融合蛋白的表达增强或降低

[1333] 测定前一个实施例中如上所述生成的孢子重组蕈状芽孢杆菌菌株 EE155的β-半乳糖苷酶活性，并测定前一个实施例中如上所述生成的重组苏云金芽孢杆菌BT013A孢子的
内切葡萄聚糖酶活性。

[1334] 通过测定显色底物邻硝基苯基-β-半乳糖苷(ONPG)的水解来测定β-半乳糖苷酶活性。使用商业来源的β-半乳糖苷酶制备标准品(由100μg/ mL原液制备0.2μg、0.4μg、0.8μg)。将250μl孢子制剂沉淀并将孢子重悬于50μL酶稀释缓冲液(10mM TRIS，pH 7.6、0.2M NaCl2、5％甘油) 中。将含有1.14mg/mL ONPG的600μl预热37℃的底物混合物(10mM KCl，
1mM MgSO4·7H2O，100mM NaH2PO 4，pH7.5)加入到每个样品和标准品中。每个反应物在室温下孵育2分钟。加入250μl 1M碳酸钠以停止反应。将溶液以14,000×g离心5分钟以从吸光度读数中除去孢子。使用IMPLEN纳米分光光度计型号P330在420nm测定吸光度。样品一式三份进行，每次反应一份空白。测定结果如下表49所示。

[1335] 表49.过表达外孢壁蛋白对BclA20–35-βgal表达水平的作用。

[1336]

[1337]

[1338] 从表49中显示的结果可以看出，CotO、CotE、BclA、BclB和BxpB 的过量表达增加了含有β-半乳糖苷酶的融合蛋白的表达，使得孢子的酶活性增加。相比之下，YjcB或AcpC的过量表达降低了含有β-半乳糖苷酶的融合蛋白的表达，使得孢子的酶活性降低。

[1339] 通过使用羧基甲基纤维素(CMC)底物和二硝基水杨酸(DNS试剂)测定纤维素酶活性，进行内切葡聚糖酶活性的测定。使用商业来源的纤维素酶在50mM柠檬酸缓冲液(pH4.8)中制备标准品。在50mM柠檬酸缓冲液(pH4.8)中制备1％CMC(羧甲基纤维素钠盐)，以用作反应底物。将250μl孢子制剂沉淀，并将孢子重悬于150μL 50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4.8)中。用
1％DNS、1％NaOH、0.05％Na2SO 4、0.2％苯酚和 18.2％罗谢尔盐组成的试剂进行该反应。
将150μl样品与250μl 1％CMC 底物混合，并在50℃的水浴中孵育15分钟。加入300μl DNS试剂，并将样品在100℃下煮沸10分钟，然后在冰上冷却。将溶液以14,000×g离心 5分钟以从吸光度读数中除去孢子。使用IMPLEN纳米分光光度计型号 P330在540nm测定吸光度。样品
一式三份进行，每次反应一份空白。测定结果示于下表50中。

[1340] 表50.过表达外孢壁蛋白对BclA20–35-内切葡聚糖酶表达水平的作用。

[1341]

[1342]

[1343] 如表50所示，CotO、CotE、BclB和BxpB的过量表达增加了含有内切葡聚糖酶的融合蛋白的表达，使得孢子的酶活性增加。另一方面， YjcB、AcpC或BclC的过量表达降低了融合蛋白的表达，使得孢子的酶活性降低。

[1344] 总之，CotO、CotE、BclB或BxpB的过量表达增加了融合蛋白的表达，使得表达BclA 20-35-βgal或BclA 20-35-内切葡聚糖酶融合蛋白的孢子上β-半乳糖苷酶和内切葡聚糖酶的活性增加。另一方面，YjcB或AcpC 的过量表达降低了两种融合蛋白的表达，使得表达
BclA 20-35-βgal或 BclA 20-35-内切葡聚糖酶融合蛋白的孢子上β-半乳糖苷酶和内切葡聚糖酶的活性降低。带有eGFP标签的BclC和BclA20-35的过量表达也降低了BclA 20-35-内
切葡聚糖酶融合蛋白的表达，而BclA的过量表达增加了 BclA 20-35-βgal融合蛋白的表
达。

[1345] 实施例46.表达融合蛋白并且过量表达调节蛋白的BEMD孢子对玉米生长的作用

[1346] 对玉米应用表达包含枯草芽胞杆菌168内切葡聚糖酶的融合蛋白的重组苏云金芽孢杆菌BT103A和蕈状芽孢杆菌BT155孢子使得幼苗生长力和生长应答在两周内增加。通过
在这些孢子中如前一个实施例中如上所述过量表达调节蛋白改变包含内切葡聚糖酶的融
合蛋白表达水平，使得 BEMD孢子对玉米生长的作用中发生相应变化。

[1347] 为了证明这一点，在苏云金芽孢杆菌BT013A中共表达 pSUPER-BclA 20-35-内切葡聚糖酶和pHP13-CotO或pHP13-BclB。如实施例40所述，在营养琼脂上产生孢子。将孢子稀释至浓度为1×104个孢子/50ml水，并且在种植时将50ml水加入到灌封土壤中的商业杂交
玉米种子中。玉米杂交品种为BECK 5540RR，含有ROUNDUP READY草甘膦抗性基因。玉米种子用杀真菌剂和生物接种剂包被。

[1348] 植物在人造光下每天生长14小时，测定10天期间植物的生长。在实验过程中每3天浇灌植物。10天后，测量植物的高度并根据未处理的玉米植株进行归一化。这些实验的结果示于下表51中。

[1349] 表51.表达包含内切葡聚糖酶的融合蛋白并且过量表达调节蛋白的BEMD 孢子对玉米生长的作用。

[1350]

[1351]

[1352] 如表51中所示，过量表达外孢壁蛋白CotO和BclB在第10天时增加了BclA 20–35-内切葡聚糖酶融合蛋白对玉米幼苗和活力的作用。这些作用与表达BclA 20–35-内切葡聚
糖酶和pHP13-CotO或pHP13-BclB 的BEMD孢子中融合蛋白的表达水平相关，表明对玉米幼
苗和活力的作用是由于调节蛋白对融合蛋白表达水平的改变。

[1353] 实施例47.蜡样芽胞杆菌家族成员的基因失活以及这种失活的蜡样芽胞杆菌家族成员用于表达融合蛋白的用途

[1354] 如上所述，孢子形成过程中萌发孢子蛋白酶(GPR)的活性形式在蜡样芽胞杆菌家族成员前孢子中的过量表达导致蛋白在前孢子中的蛋白水解裂解和孢子失活。类似地，在
孢子形成过程中非特异性核酸内切酶的过量表达破坏了孢子中的DNA，从而导致孢子种群
的一部分为失活孢子粒子。

[1355] 制备了编码在σG启动子控制下的非特异性核酸内切酶的质粒。基因合成了来自枯草芽胞杆菌168的非特异性核酸内切酶1和σG启动子 (SEQ ID NO：235)，并使用SalI位点连接到pHP13质粒中，以生成质粒pHP13-SigG-核酸酶。对正确克隆进行测序，转化并扩增到大肠杆菌细胞中。从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA，并转化入苏云金芽孢杆菌BT013A 中。通过PCR验证正确的克隆。枯草芽胞杆菌168内切核酸酶的氨基酸序列如上面表4所示。

[1356] 如上面实施例40中所述在营养琼脂平板上产生表达σG核酸内切酶的苏云金芽孢杆菌细胞并纯化。使用血细胞计数器目测定量孢子，稀释并将稀释液铺至营养琼脂平板上。
通过确定从目视计数到平板计数的变化来计算活孢子与杀死的孢子的比率。每个测定中包
括对照孢子(未处理的)。另外，使用手持式UV灯将1×108个孢子紫外线照射10分钟，并重复测定。再次比较目测计数和平板计数以评估孢子杀伤。这些测定的结果示于下表52中。

[1357] 表52.表达σG启动子控制下的非特异性核酸内切酶的蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的活力

[1358]

[1359] 从表52可以看出，σG启动子控制下核酸内切酶1的表达在没有暴露于UV照射的孢子中使细胞活力降低了约30％，在暴露于紫外线照射的孢子中使细胞活力降低了约75％。

[1360] 萌发孢子蛋白酶和σG启动子控制下非特异性核酸内切酶的共表达将预期进一步降低孢子活力。

[1361] 实施例48.来自包含CotE基因敲除的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁片段的制备

[1362] 构建质粒pUCpE，其含有能够在大肠杆菌中复制的pUC19骨架以及来自pE194的红霉素抗性盒复制起始位点。该构建体能够在大肠杆菌和杆菌菌株中复制。从炭疽杆菌Δ
Sterne中PCR扩增相应于CotE基因上游区域的1kb DNA区域和相应于基因CotE下游区域的
1kb区域。然后利用剪接通过重叠延伸经由对应于相对PCR扩增子的15bp同源悬端将两个 
1kb区域剪接到一起。将该2kb片段用XhoI(外部引物中)消化并连接到 pUCpE的SalI位点。
通过消化和DNA测序证实该质粒构建体。将革兰氏阳性ω-卡那霉素抗性基因用BamHI消化
并置于两个1-kb区域之间。对最终的构建体再次进行PCR验证和测序，并将最终的质粒引入到炭疽杆菌Δ Sterne中。通过寻找红霉素抗性和卡那霉素抗性来筛选正确的克隆。

[1363] 在卡那霉素(25μg/ml)存在下，在脑心脏输液肉汤中在高温(40℃) 下传代克隆，并常规地将其分离到含有卡那霉素的LB琼脂平板上，并在 30℃下生长。将单个菌落用牙签挑到含有5μg/ml红霉素的LB琼脂平板上，并在30℃下生长。保持卡那霉素抗性但失去红霉素抗性(意味着质粒的损失，但是CotE基因的重组和除去)的克隆在脑心脏输注肉汤加卡那
霉素中生长，并使用Qiagen染色体DNA分离试剂盒分离染色体DNA。通过CotE基因区域的PCR扩增和CotE的损失以及卡那霉素抗性盒的获得来确定CotE基因的适宜缺失。

[1364] 制备构建体(pHP13-AcpC-eGFP)，其编码与荧光报告基因蛋白 eGFP(增强型绿色荧光蛋白)读码框融合的外孢壁蛋白ApcC(酸性磷酸酶)。pHP13-ApcC-eGFP构建体包括天然
的ApcC启动子、核糖体结合位点和与eGFP(来自pGFPuv)读码框融合的ApcC(来自炭疽杆菌
Δ Sterne)的编码序列。该构建体通过使用包含相对于替代扩增子的15bp 重叠区域的相
应引物进行单个AcpC和eGFP基因的PCR扩增产生。然后纯化两种PCR扩增子，并结合使用含
有XhoI位点的外部引物进行第二次PCR反应。两种扩增子与其相容的末端相互引导，产生融合PCR扩增子，纯化并在37℃下用XhoI消化1小时。将剪接的PCR产物克隆到pHP13 的SalI位点，并将正确克隆进行序列验证并转化到SCS110大肠杆菌中，随后从大肠杆菌中分离出质
粒DNA，并引入到如上所述制备的炭疽杆菌Δ SterneCotE::Kan中，其在30℃下在含有10μg/ml氯霉素的脑心脏输液肉汤中培养过夜。将1毫升该培养物接种于有挡板的烧瓶中的营
养肉汤  (50ml)中，并在30℃下培养3天。通过10,000×g离心5分钟收集孢子，通过100,
000Da膜过滤器过滤上清液(含有破碎的外孢壁片段)，得到含有融合蛋白的纯化外孢壁片
段。

[1365] 图4中示出了CotE敲除孢子的透射电子显微照片。封闭的箭头表示已经从孢子分离的外孢壁的片段，而开放的箭头表示已经从外孢壁去除的孢子。

[1366] 外孢壁片段的纯化如下进行：将CotE::kan孢子在30℃下在脑心脏输注肉汤中培养过夜，涂抹到营养琼脂平板上，并在30℃下生长3天。 3天后，通过用PBS润湿的棉签擦拭板，收集孢子，并在微量离心管中重新悬浮于1ml PBS中。通过离心从培养物中分离孢子，并通过0.22μM过滤器过滤含有外孢壁片段的上清液以除去残留的孢子。然后将滤液通过 
100kDa过滤器过滤以收集外孢壁片段，但允许freE蛋白通过过滤器。洗涤100kDa的过滤器，将收集的外孢壁片段在SDS缓冲液中煮沸5分钟，并通过SDS-PAGE电泳分离。图5提供了SDS-PAGE凝胶的照片，显示纯化的外孢壁片段(泳道2)和蛋白标记物标准物(泳道1)。泳道2中所示的外孢壁片段代表构成外孢壁片段的个体蛋白。在整个孢子SDS-PAGE 制备物中通常看
到的条带的仅仅一部分是明显的。

[1367] 在磷酸酶分析中测试含有AcpC-eGFP融合蛋白的10微升外孢壁片段制备物对pNPP(对硝基苯基多磷酸酯)的活性。通过分光光度法，基于通过磷酸酶活性而导致的对硝基苯
酚从磷酸盐的释放而检测酸性磷酸酶活性。简言之，将1ml pH6.0的磷酸盐缓冲液中的10mM pNPP与外孢壁片段在1ml微量离心管中孵育，并使其在37℃下孵育10分钟。10 分钟后，将管离心1分钟以除去过量的孢子，并将上清液在分光光度计上在420nm下读取，得到游离的对
硝基苯酚。发现纯化的外孢壁片段能够有效地从pNPP中释放磷酸酯基团，表明ApcC存在于
外孢壁片段中。该测定的结果示于图6。在图6中，“CotE对照孢子”是指仅CotE敲除孢子(不表达AcpC-eGFP融合蛋白)，“CotE Acp-eGFP”是指表达AcpC-eGFP融合蛋白的CotE敲除孢
子，“CotE AcpC-eGFP片段”是指如上所述从表达 AcpC-eGFP融合蛋白的CotE敲除孢子中获得的外孢壁片段。

[1368] 这些结果证实了破坏外孢壁的突变，例如CotE基因敲除突变，可以用于产生基本上没有孢子的外孢壁片段，并且证明这些外孢壁片段含有靶向外孢壁的融合蛋白。

[1369] 实施例49.能够降解除草剂的重组蜡样芽胞杆菌家族成员中融合蛋白的表达以及这种重组蜡样芽胞杆菌家族成员用于刺激植物生长的用途

[1370] 表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员可以对植物健康和生长产生有效的影响，如上例实施例1-4、7、9、11、33、36、37和38所示，包含本文所述靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的融合蛋白可用于蜡样芽胞杆菌家族中的许多不同物种和菌株，包括炭
疽杆菌，蜡样芽胞杆菌、苏云金芽杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、 Bacillus gaemokensis、韦氏芽孢杆菌和Bacillus toyoiensis。蜡样芽胞杆菌家族的许多成员是环境中有机和无机材料的有效降解剂，一些蜡样芽胞杆菌家族成员具有降解除草剂
的能力。融合蛋白在这种菌株中的表达将是有利的，因为这将提供除草剂降解活性，从而除了刺激植物生长或赋予对植物健康的其它益处(这取决于所选择的包含在融合蛋白中的肽
或蛋白) 外，还减轻了使用除草剂对植物施加的压力。

[1371] 如实施例25所述对蜡样芽胞杆菌家族成员EE349进行分离、鉴定和表征，发现其具有刺激植物生长的能力。该菌株进一步被发现具有降解多种除草剂的能力，包括磺酰脲类
和芳基三嗪类。

[1372] 为了展示蜡样芽胞杆菌家族成员EE349降解除草剂的能力，将1× 105个蜡样芽胞杆菌家族成员EE349孢子涂于种植在含有各种浓度的磺胺腙的土壤中的扁豆上。允许种子
在24℃下以13小时的日/夜循环生长3周，每3天浇水一次。3周后，测量植物的根生长。无蜡样芽胞杆菌家族成员 EE349的对照种子在相同的条件下种植。

[1373] 实验结果见图7。在图7中，“保护”是指用蜡样芽胞杆菌家族成员 EE349处理的种子，“未保护”是指未处理的种子。y轴显示相对于仅水的对照的根长度。图7显示随着除草剂浓度的增加，根系生长的抑制也增加。然而，对种子应用蜡样芽胞杆菌家族成员EE349减少了大部分这种抑制，即使在土壤中除草剂为完全强度时。因此，从图7可以看出，蜡样芽胞杆菌家族成员EE349可以作为安全剂。

[1374] 此外，下面的实施例51说明了蜡样芽胞杆菌家族成员EE349表达融合蛋白的能力。因此，蜡样芽胞杆菌家族成员EE349可用作双重用途的安全剂和用于表达包含靶向序列、外孢壁蛋白或靶向融合蛋白至外孢壁的外孢壁蛋白片段的融合蛋白的宿主。

[1375] 实施例50.过量表达外孢壁酶的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制备以及这种重组蜡样芽胞杆菌家族成员对植物的作用

[1376] 蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁天然含有对植物有益的多种天然酶。例如，蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁含有涉及营养增溶的酶(例如酸性磷酸酶，如AcpC)、肌苷尿苷
水解酶、蛋白酶(例如金属蛋白酶，如 InhA1，InhA2和InhA3)、催化自由基降解的酶(例如超氧化物歧化酶例如SODA1和SODA2)、精氨酸酶和丙氨酸消旋酶。在蜡样芽胞杆菌家族成员中过量表达这些酶可以提供当应用于种子、植物、植物生长培养基或植物或植物种子周围的
区域时将具有有益效果的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[1377] 金属蛋白酶InhA2和InhA3、酸性磷酸酶(AcpC)和超氧化物歧化酶1和2利用其天然启动子通过引物进行PCR扩增，所述引物含有XhoI 位点(用于InhA2、InhA3、AcpC、SODA1和SODA 2的氨基酸序列在表1和表2中提供，用于这些蛋白的天然启动子的核苷酸序列在表3
提供)。 PCR产物用XhoI消化，并通过SalI位点克隆到大肠杆菌/杆菌穿梭载体 pHP13中。通过PCR和DNA测序验证正确的克隆。将质粒引入苏云金芽孢杆菌BT013A和蕈状芽孢杆菌
EE155中。通过涂于含有氯霉素的LB 琼脂平板上筛选正确的克隆。使正确克隆的过夜培养
物生长在含有氯霉素的脑心脏输液肉汤中，将1ml该过夜培养物接种到50ml营养肉汤中，并在30℃下培养3天。通过光学显微镜验证孢子形成。然后将孢子进行酶测定。

[1378] 测定过量表达AcpC的蕈状芽孢杆菌EE155孢子(即含有 pHP13-AcpC(酸性磷酸酶)质粒)的孢子)的磷酸酶活性。将1毫升孢子形成培养物沉淀并将沉淀重新悬浮于1ml PBS
中，并如实施例48所述在磷酸酶测定中对pNPP(对硝基苯基多磷酸盐)进行测试。AcpC过量
表达的孢子具有高得多的磷酸酶活性，如图8所示。在图8中，y轴表示磷酸酶活性的单位，其由对硝基苯酚的释放表示。

[1379] 经修饰而过量表达AcpC的蕈状芽孢杆菌EE155孢子中观察到的增加的酸性磷酸酶活性可以在将这种孢子添加到植物生长介质或将这种孢子应用于植物种子、植物或植物或
植物种子周围的区域后，溶解环境中的营养物质。由于磷酸盐是植物生长和发育中非常重
要的营养成分，因此可以增加植物生长，为植物健康提供有益的作用。

[1380] 类似地，超氧化物歧化酶是一种非常强大的抗氧化蛋白。蜡样芽胞杆菌家族成员中超氧化物歧化酶的过量表达将提供具有降解对植物施加压力的自由基的能力的孢子。去
除自由基会减轻一些这种压力，并导致在压力条件下植物活力的增加。可以对过量表达
SODA1和SODA2的苏云金芽孢杆菌BT013A孢子(即分别用pHP13-SODA1和pHP13-SODA2 质粒
转化的孢子)进行酶分析。可以将1毫升孢子形成培养物沉淀并重新悬浮在1ml含有黄嘌呤
的dH2O中。然后可以将黄嘌呤氧化酶以及细胞色素C加入反应混合物中。该测定中细胞色素C降解的抑制表明超氧化物歧化酶的活性。

[1381] 对过量表达锌金属蛋白酶的蕈状芽孢杆菌EE155(即用 pHP13-InhA2质粒转化的孢子)进行酶分析。将1毫升孢子形成培养物沉淀并将沉淀重悬于1ml PBS中。然后将孢子与
0.5％偶氮酪蛋白(蛋白酶底物)反应5分钟。将这些反应混合物用TCA(三氯乙酸)沉淀以除
去未消化的酪蛋白，并在ABS595读取剩余的游离偶氮染料的吸光度。与非重组蕈状芽孢杆
菌EE155孢子相比，过量表达的InhA2的孢子产生的蛋白酶活性高出211％。

[1382] 上述实施例3和7说明在蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁上表达蛋白酶可以对植物提供有益的作用。将苏云金芽孢杆菌BT013A孢子InhA1、 InhA2或InhA3引入植物生长介
质中或者应用于植物种子、植物或植物或植物种子周围的区域具有相似的作用。

[1383] 实施例51.内生蜡样芽胞杆菌家族菌株中融合蛋白的表达

[1384] 蜡样芽胞杆菌家族成员EE349被发现具有内生生长的能力，并能够作为BEMD系统的宿主菌株。为了证明蜡样芽胞杆菌家族成员EE349 内生生长并作为BEMD系统的宿主菌株
的能力，用pSUPER-BclA 20-35- 内切葡聚糖酶质粒(如实施例44中所述)转化蜡样芽胞杆
菌家族成员 EE349。如实施例40中所述制备和纯化孢子。

[1385] 将这些孢子稀释至浓度为1×105个孢子/50ml水，然后将50ml水加入盆栽土壤中的商业杂交玉米种子上。玉米种子用杀真菌剂和生物接种剂包被。玉米杂交品种为BECK 
5475RR，含有ROUNDUP READY草甘膦抗性基因和AQUAMAX抗旱基因。植物在人造光下每天生
长14小时，测定10天期间的植物生长。在实验过程中，每3天浇灌植物。10天后，测量植物高度，并根据未处理的玉米植株进行归一化。这些实验的结果示于表53中。

[1386] 表53.表达BclA 20-35-内切葡聚糖酶融合蛋白的内生蜡样芽胞杆菌家族成员对玉米幼苗生长的作用

[1387]

[1388]

[1389] 从表53所示的数据可以看出，与未处理的植物或用蜡样芽胞杆菌家族成员EE349单独处理的植物相比，内生菌株蜡样芽胞杆菌家族成员 EE349中表达pSUPER-BclA 20-35-
内切葡聚糖酶导致玉米生长增加。

[1390] 然后从玉米植物的内部分离表达BclA 20-35-内切葡聚糖酶的蜡样芽胞杆菌家族成员349。从土壤中提取10日龄的植物，并洗涤以除去多余的碎屑。然后将植物倒置，暴露于
5％漂白剂10分钟，在水中洗涤，暴露于过氧化氢(10％)10分钟，再次在水中洗涤，并用无菌剃刀刀片切开茎。将茎的切开两部分朝下放置在营养琼脂平板上2小时。两小时后，将茎除去，琼脂平板在30℃下孵育48小时。48小时后，检查培养板的菌落形态，将植物内部发现的蜡样芽胞杆菌家族成员用牙签挑至营养琼脂板和加入四环素的营养琼脂板(用于选择含有
pSUPER-20-35BclA-内切葡聚糖酶质粒的细菌)上。蜡样芽胞杆菌家族成员349菌落数量的
增加如表54 所示。这些结果证明了通过在蜡样芽胞杆菌家族的内生菌株中表达而将 BEMD
系统引入目标植物的能力。

[1391] 表54:对蜡样芽胞杆菌家族成员EE349的内生测试

[1392]

[1393] 将四环素抗性杆菌克隆在30℃下在脑心脏输注肉汤加四环素中生长过夜，并以10,000xg离心5分钟。除去上清液，并将沉淀在-20℃下冷冻过夜。然后从每个克隆中提取染色体DNA，并通过将染色体DNA(含有质粒)转化到DH5α大肠杆菌细胞中并在涂于加氨苄青霉素的LB上，确定pSUPER-20-35BclA-内切葡聚糖酶质粒的存在。对正确克隆进行 DNA序列分析，证实蜡样芽胞杆菌家族成员349位于植物内部，并含有质粒。

[1394] 在玉米幼苗中发现许多内生细菌，以及在对照和EE349处理的植物内部发现的蜡样芽胞杆菌家族内许多不同的菌种和种类。四环素抗性蜡样芽胞杆菌家族成员(表明存在
pSUPER-20-35BclA-内切葡聚糖酶质粒) 仅在处理的玉米幼苗中发现，并且都具有与原始
表达宿主蜡样芽胞杆菌家族成员EE349相同的菌落形态。使用独特的引物通过PCR扩增验证
了 pSUPER 20-35BclA-内切葡聚糖酶质粒的存在。

[1395] 实施例52.内生蜡样芽胞杆菌家族细菌菌株的分离、鉴定和表征

[1396] 除了前一个实施例中所述的内生菌菌蜡样芽胞杆菌家族成员349以外，几种具有内生生长能力的蜡样芽胞杆菌家族成员也被鉴定：蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、苏云金芽孢杆菌EE319、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蕈状芽孢杆菌 EE-B00363、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366和蜡样芽胞杆菌家族成员EE -B00377。

[1397] 为了获得这些额外的蜡样芽胞杆菌家族成员，将商业杂交玉米种子种植在盆栽土壤中并允许生长。玉米种子用杀真菌剂和生物接种剂包被。植物在人造光下每天生长14小
时，确定14天期间植物的生长。在实验过程中，每3天浇灌植物。14天后，从土壤中提取植物并洗涤以除去多余的碎屑。然后将植物倒置，暴露于5％漂白剂10分钟，在水中洗涤，暴露于过氧化氢(10％)10分钟，再次在水中洗涤，并用无菌剃刀刀片切开茎。将茎的切开部分朝下放置在营养琼脂平板上2小时。两小时后，将茎除去，琼脂平板在30℃下孵育48小时。48小时后，检查培养板的菌落形态，将植物内部发现的蜡样芽细胞杆菌家族成员用牙签挑到营养
琼脂上。然后将它们在30℃下在脑心脏输注肉汤中生长过夜，并以10,000xg离心5分钟。除去上清液，将沉淀物在-20℃冷冻过夜。然后从每个克隆中提取染色体 DNA，使用16S rRNA引物通过PCR验证每个菌落的身份，并将扩增子送样进行DNA测序和鉴定。这些菌株的16S 
rRNA序列如上表13所示。实施例53.额外的内生细菌菌株(非蜡样芽胞杆菌家族成员)的分
离、鉴定和表征

[1398] 从玉米幼苗中分离内生细菌菌株巨大芽孢杆菌EE385、杆菌 EE387、环状芽孢杆菌EE388、枯草芽胞杆菌EE405、Lysinibacillus fusiformis EE442、Lysinibacillus 
spp.EE443和短小芽孢杆菌 EE-B00143。首先对2周龄的玉米幼苗灭菌。将植物从土壤中提
取出来并洗涤以除去多余的碎屑。然后将植物倒置，暴露于5％漂白剂10分钟，在水中洗涤，暴露于过氧化氢(10％)10分钟，并再次在水中洗涤。然后用无菌剃刀刀片将茎切开。将茎的切开部分朝下放置在营养琼脂平板上2小时。2小时后，将植物茎从板上取出，然后将板在30℃温育48小时。选择内生的芽孢杆菌进行进一步分析。将这些菌株在脑心脏输注肉汤中在 
30℃下生长过夜，并使用Qiagen染色体DNA试剂盒将培养物提取DNA。 PCR扩增得到16S 
rRNA基因，并送样进行DNA测序。所得到的序列利用NCBI数据库进行BLAST搜索以确定芽孢
杆菌的身份。16S rRNA序列如上表14所示。

[1399] 实施例54.内生杆菌细菌菌株中包含孢子外壳蛋白的融合蛋白的表达

[1400] 将内生细菌菌株苏云金芽孢杆菌EE319、强固芽孢杆菌A30和地衣形芽孢杆菌A4转化，以含有编码与与内切葡聚糖酶融合的多种孢子外壳蛋白的质粒。产生质粒pHP13-CotC-内切葡聚糖酶和pHP13-CgeA-内切葡聚糖酶。这些质粒的每个编码孢子外壳蛋白(CotC或
CgeA)，其与含有8个丙氨酸残基的多聚丙氨酸接头和内切葡聚糖酶以相同读码框融合。多
聚丙酸接头和内切葡聚糖酶融合到孢子外壳蛋白的羧基末端。

[1401] 为了产生编码融合蛋白的质粒，将来自枯草芽胞杆菌168的内切葡聚糖酶基因进行PCR扩增。还从枯草芽胞杆菌168(CotC)或解淀粉芽孢杆菌(CgeA)的染色体DNA中扩增了
编码孢子外壳蛋白的CotC和 CgeA的基因。然后通过重叠延伸PCR对正确的扩增子进行剪
接，以通过同源的15bp悬突退火来产生融合蛋白DNA片段。外部引物各自被设计成含有XhoI位点。扩增子用Promega PCR清洗试剂盒清洗，DNA用XhoI 消化，并连接到pHP13的SalI位
点。然后对质粒DNA进行测序，转化到大肠杆菌细胞中，并将DNA引入各种内生杆菌菌株中。

[1402] 通过将过夜培养物涂抹到营养琼脂平板上，然后在30℃下孵育72 小时，产生表达融合蛋白的每种重组杆菌的孢子。72小时后，通过擦拭到无菌PBS中从板收集细菌孢子。将孢子通过密度离心3次纯化，稀释至1 ×108CFU/ml，并如实施例45所述测定内切酶活性。测定结果示于下表 55和图9中。

[1403] 表55.表达融合蛋白CotC-内切葡聚糖酶或CgeA-内切葡聚糖酶的杆菌孢子中的内切葡聚糖酶活性

[1404]质粒 表达菌株 酶读数/活性
孢子对照 强固芽孢杆菌A30 .201
孢子对照 苏云金芽孢杆菌BT013A .206
pHP13-CgeA-内切葡聚糖酶 强固芽孢杆菌A30 .818
pHP13-CotC-内切葡聚糖酶 苏云金芽孢杆菌EE319 1.738
pHP13-CotC-内切葡聚糖酶 地衣形芽孢杆菌A4 0.414

[1405] 在图9中，CotC1、CotC2和CotC3是3次分开的实验中的 pHP13-CotC-Endo苏云金芽孢杆菌EE319的孢子形成培养物。

[1406] 实施例55.表达融合蛋白CotC-内切葡聚糖酶、CotB-内切葡聚糖酶或 CgeA-内切葡聚糖酶的杆菌孢子对玉米和大豆种子生长的作用

[1407] 可以对表达包含孢子外壳蛋白和内切葡聚糖酶的融合蛋白(例如前一个实施例中描述的CotC-内切葡聚糖酶、CotB-内切葡聚糖酶或CgeA- 内切葡萄聚糖酶融合蛋白)的重
组杆菌孢子进行如下测试其对植物(例如玉米和大豆)生长的作用。如前一个实施例中所述
产生孢子，洗涤，在水中稀释至1×108CFU/ml，并以1×105-7个孢子/种子的比率施用于植物种子(例如玉米和大豆种子)。然后可以将孢子作为种子处理或作为土壤浸泡施用。植物可
以种植于1个“4深度(deep in 4)”盆，并在18.3℃生长13 小时光/黑暗循环。两周后，可以确定植株的高度和根长度。

[1408] 实施例56.通过用包含益生菌细菌的植物饲喂动物，递送益生菌细菌到动物

[1409] 可以通过将益生菌细菌应用于植物种子、应用于植物生长介质(例如通过犁沟施用于土壤中)、应用于植物(例如通过叶片施用)或者应用于物或植物种子周围的区域，然后用这种植物或由植物种子生长成的植物饲喂动物，从而将益生菌细菌递送至动物(例如牲
畜、鱼或其他动物)。细菌可以在植物生长时应用于植物叶或茎，并在叶面(叶和茎表面)定殖。在饲喂动物之前，可将植物加工成动物饲料。

[1410] 在这种方法中使用内生菌株细菌允许细菌在植物组织中存活并持续存在，使得动物在从植物摄取植物物质时被大量摄入。例如，菌株蜡样芽胞杆菌家族成员EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444、杆菌巨蛋EE385、杆菌EE387、环状芽孢杆菌EE388、枯草芽胞杆菌EE405、Lysinibacillus fusiformis EE442、
Lysinibacillus spp.EE443和短小芽孢杆菌EE-B00143被认为是益生菌并且是内生的，可
以用于这些方法中。

[1411] 可以使这些菌株或其他益生菌和内生菌株中的任何一种生长，并且如上文实施例40中所述产生孢子。然后将孢子应用于植物生长介质、植物种子、植物或植物种子周围的区域。在植物生长介质中生长的植物、从植物种子生长的植物、应用了细菌的植物，或者在应用细菌的区域中生长的植物或植物种子可以生长并随后饲喂给动物。内生细菌可以在植物
的内部组织中定殖，并在植物内部繁殖至大量。细菌将在使用传统的收获方法后形成孢子，使得植物物质(例如干草或青贮饲料)长期储存，其可以随后饲喂给目标动物。

[1412] 这些方法中只需要少量的细菌，因为内生细菌会在植物和植物中自然地定殖和增殖。

[1413] 实施例57.通过用包含重组蜡样芽胞杆菌家族成员或表达包含有益酶的融合蛋白的其他重组细菌的植物饲喂动物，递送有益酶到动物

[1414] 本文中所述表达包含目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或将融合蛋白靶向至外孢壁的外孢壁蛋白片段的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员还可以用于递送有益
酶到动物。可以将重组蜡样芽胞杆菌家族成员直接饲喂给动物(例如通过将重组蜡样芽胞
杆菌家族成员混合到随后饲喂给动物的动物饲料中)。或者，前一个实施例中如上所述用于递送细菌到动物的方法可以与表达包含在动物中具有有益效果的蛋白或肽(例如帮助消化
植物物质的酶)的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员联合使用。

[1415] 存在于牲畜、鱼类和其他动物的饲料中的酶可以影响摄入酶的动物的营养摄取、产量和健康。有益于动物健康的酶包括例如木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、磷酸酶、蛋白酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶、转葡糖基酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、淀粉酶、果胶酶、生物素酶和多聚半乳糖醛酸酶等。BEMD系统可用于将这些酶表达在外孢壁表面。表达包含这些酶之一的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员可以应用于
植物生长介质、植物种子、植物或者植物或植物种子周围的区域。类似地，表达包含这些酶之一和将融合蛋白靶向细菌孢子表面的孢子外壳蛋白的融合蛋白的重组细菌可以用于这
些方法中。重组细菌可以应用于植物生长介质、植物种子、植物或者植物或植物种子周围的区域。在植物生长介质中生长的植物、从植物种子生长的植物、应用了细菌的植物或者在应用细菌的区域中生长的植物或植物种子可以生长并随后饲喂动物，并且由此将有益酶递送
到动物。使用传统的收获方法，细菌将形成孢子，使得植物物质(例如干草或青贮饲料)长期储存，其随后可以饲喂给目标动物。

[1416] 蜡样芽胞杆菌家族成员的内生菌株可用作用于表达融合蛋白的宿主，所述融合蛋白包含目标蛋白或肽(例如在动物中具有有益效果的酶) 和靶向序列、外孢壁蛋白或将融
合蛋白靶向外孢壁的和外孢壁蛋白片段。例如，本文所述内生菌株蜡样芽胞杆菌家族成员
EE349、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、苏云金芽孢杆菌EE417、蜡样芽胞杆菌EE444和苏云金芽孢杆菌EE319可用作宿主。

[1417] 可以选择额外的蜡样芽胞杆菌家族成员应用于植物的地上部分，因为这些细菌不必是内生来定殖叶面。例如，蕈状芽孢杆菌BT155、蕈状芽孢杆菌EE118、蕈状芽孢杆菌
EE141、蕈状芽孢杆菌BT46-3、蜡样芽胞杆菌家族成员EE218、苏云金芽孢杆菌BT013A、苏云金芽孢杆菌 EE-B00184、蕈状芽孢杆菌EE-B00363、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366或蜡样芽胞
杆菌家族成员EE-B00377可用于此目的。

[1418] 类似地，重组细菌的内生菌株可用作用于表达融合蛋白的宿主，所述融合蛋白包含目标蛋白或肽和将融合蛋白靶向细菌孢子表面的孢子外壳蛋白。例如，内生菌株巨大芽
孢杆菌EE385、杆菌属EE387、环状芽孢杆菌EE388、枯草芽胞杆菌EE405、Lysinibacillus fusiformis EE442， Lysinibacillus spp.EE443或短小芽孢杆菌EE-B00143可用作宿主。

[1419] 在这些方法中使用细菌的内生菌株允许细菌在植物组织中存活并持续存在，使得细菌和由细菌表达的融合蛋白在动物从植物摄取植物物质时将被大量摄取。因此，通过在
种植时简单添加重组蜡样芽胞杆菌家族成员或其他重组细菌，有益的酶可以传播到整个植
物组织中，并且在动摄入植物物质时被递送到动物。

[1420] 实施例58:靶向序列用于在蜡样芽胞杆菌家族成员孢子表面表达内切葡聚糖酶的用途以及这些孢子用于促进植物生长的用途

[1421] 通过如上面实施例44所述，通过使BclA启动子、起始密码子和 BclA的的氨基酸20-35(SEQ ID NO：1的氨基酸20-35)与枯草芽胞杆菌168内切葡聚糖酶融合于相同读码框
中的同源重组克隆PCR产生的片段，从而修饰pSUPER质粒(pSUPER-BclA 20-35-Endo)。然后将该质粒进行反向PCR以扩增整个质粒骨架，但不扩增对应于BclA的氨基酸20- 35的序列。
将该反向PCR产物与扩增来自SEQ ID NO：5、15、25、81、 85、87或SEQ ID NO：1的氨基酸20-
33中每一个的等同区域的PCR产物组合。因此，构建了包含以下与枯草芽胞杆菌168内切葡
聚糖酶融合于相同读码框的每个下列靶向序列的构建体：(1)SEQ ID NO：1的氨基酸20-35；
(2)SEQ ID NO：5的氨基酸23-38；(3)SEQ ID NO：15的氨基酸28-43；(4)SEQ ID NO：25的氨基酸9-24；(5)SEQ ID NO：81 的氨基酸23-38；(6)SEQ ID NO：85的氨基酸13-28；(7)SEQ ID NO： 87的氨基酸13-28和(8)SEQ ID NO：1的氨基酸20-33。每个构建体含有野生型BclA启动子和起始密码子处的甲硫氨酸，随后是与枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶基因融合于相同读码
框的靶向序列。将这些构建体中的每一个转化到大肠杆菌中并铺板，以在加入氨苄青霉素
(100μg/ml)的 Luria平板上获得单个菌落。将来自每个单个菌落的质粒在加入氨苄青霉素的Luria肉汤过夜培养物中生长，并使用WIZARD SV微量制备试剂盒纯化，并通过Sanger测
序验证序列。还通过分光光度法定量DNA，并将 DNA引入苏云金芽孢杆菌BT013A中。另外，将pSUPER-BclA-20-35 Endo构建体引入到通过同源重组从其基因组中除去天然BclA蛋白
(BclA 敲除“BclA KO”)的苏云金芽孢杆菌BT013A中。通过在含有抗生素(四环素10μg/ml)的营养肉汤板上铺板来筛选正确的菌落。使每个阳性菌落在脑心脏输注肉汤(含有抗生素)
在30℃下以300rpm生长，纯化基因组 DNA并再次测序以获得基因纯度。使经验证的菌落在
具有10μg/ml四环素的脑心脏输液肉汤中生长过夜，并通过基于酵母提取物的培养基中的
孢子形成诱导形成孢子。

[1422] 在生成孢子后48小时收集基于酵母提取物的培养基中的每个生产运行(production runs)，并使用实施例45中所述方法对所得孢子进行酶比较。使用IMPLEN纳米光度计型号P330在540nm处测定吸光度。每次反应有三份样品和一份空白。酶读数的结果如表56所示。

[1423] 对于玉米，将每个构建体的每份全肉汤的1μl置于每个种子上。对于西葫芦，将每个构建体的2μl全肉汤置于每个种子上。为了达到这个目的，将50粒种子置于50ml锥形底聚丙烯管中，并使用涡旋混合器轻轻涡旋。对于这种漩涡的种子，将50μl(用于玉米)或100μl(用于西葫芦) 含有重组孢子的肉汤慢慢地移入管中，并且涡旋作用使种子包覆有每个构建体的全肉汤均匀涂层。然后将这些种子用39.6厘米3(15.6英寸3)的种植盆种植在1”深的土壤中，每盆栽2粒种子。然后将盆浇水至饱和，使植物发芽。植物在控制生长室中生长，白天设定为70°F，晚上设定为60°F，人造光照条件下的光照时间为14小时/天，光照14天。14天后，根据仅种子上接受水处理的对照组对结果进行归一化。

[1424] 表56.酶水平和植物生长表型。

[1425]

[1426]

[1427] AA＝氨基酸

[1428] ND＝未测定

[1429] 上面数据显示，这些构建体中的每一个都能够刺激植物生长，并且显示使用不同的靶向序列允许控制在孢子外部的酶的表达水平。

[1430] 使用SEQ ID NO：1的氨基酸20-35或SEQ ID NO：85的氨基酸 13-28作为靶向序列导致产生最高水平的酶。考虑到这些靶向序列之间的低度同一性(靶向序列的全长具有
43.8％的同一性)，这是令人惊讶的。使用SEQ ID NO：15的氨基酸28-43或SEQ ID NO：25的氨基酸9-24 导致两种植物类型中最大的植物应答。在BT013A BclA KO宿主中表达含有SEQ ID NO：1的氨基酸20-25作为靶向序列的融合蛋白导致与野生型菌株中表达相同融合蛋白
相比，在孢子表面上的酶活性大量增加 (263.8％)。

[1431] 实施例59：多种靶向序列和外孢壁蛋白用于在蜡样芽胞杆菌家族成员孢子表面表达磷脂酶、脂肪酶和内切葡聚糖酶的用途以及这些孢子用于促进植物生长的用途

[1432] 通过如上面实施例44所述，通过克隆PCR产生的片段(XhoI消化和连接)，从而修饰pSUPER质粒，所述克隆使BclA启动子、起始密码子和BclA的氨基酸20-35(SEQ ID NO：1的氨基酸20-35)、随后的六丙氨酸接头序列与苏云金芽孢杆菌磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C基因 
(PC-PLC)(pSUPER-BclA 20-35-PL)或枯草芽胞杆菌脂肪酶LipA (pSUPER-BclA-20-35-脂
肪酶)或枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶eglS (pSUPER-BclA-20-35-Endo)融合于相同读码框
中。然后将这些质粒进行反向PCR以扩增整个质粒骨架，但不扩增对应于BclA的氨基酸20-
35 的序列。将该反向PCR产物与扩增来自SEQ ID NO：5(即SEQ ID NO： 5的氨基酸23-38)、
15(即SEQ ID NO：15的氨基酸28-43)和25(即 SEQ ID NO：25的氨基酸9-24)中每一个的等
同区域；SEQ ID NO：120、 111、121、104和114的全长外孢壁蛋白；或者SEQ ID NO：1的氨基酸20-33、20-31、21-33、23-33或23-31的PCR产物组合。这些构建体的每一个含有野生型
BclA启动子、起始密码子处的甲硫氨酸，随后是与苏云金芽孢杆菌磷脂酰胆碱特异性磷脂
酶C、枯草芽胞杆菌168脂肪酶 LipA或枯草芽胞杆菌168eglS内切葡聚糖酶基因融合于相同
读码框中的靶向序列或外孢壁蛋白。如上述实施例58所述对这些构建体的每一个筛选正确
的转化体。

[1433] 在生成孢子后48小时收集基于酵母提取物的培养基中的每个生产运行，并对所得孢子进行酶比较。如上面实施例58所述进行内切葡聚糖酶的酶数据的测定。对于磷脂酶C酶测定，将1ml重组孢子以10,000×g 沉淀3分钟，除去上清液并弃去。然后将孢子沉淀重悬于
500μl反应缓冲液(0.25mM Tris-HCL，60％甘油，20mM邻硝基苯基磷酸胆碱，pH7.2) 中。酶测定的阴性对照含有无酶表达的BT013A孢子。将每个样品在37℃下孵育18小时，再次离心
以除去孢子，以1:1在水中稀释，并使用分光光度计读取Abs540。将其与商业购买的磷脂酶和脂肪酶对照的标准曲线进行比较，以确定U/ml活性。酶读数的结果示于表57和表58中。

[1434] 表57.内切葡聚糖酶的酶水平

[1435]

[1436]

[1437] AA＝氨基酸

[1438] 许多靶向序列和外孢壁蛋白能够在孢子表面上呈现大量的活性酶，包括SEQ ID NO：108、111、114、120和121。SEQ ID NO：1的氨基酸20-31、21-33和23-31提供了与SEQ ID NO：1的氨基酸20-35类似的酶表达水平，表明较小的片段足以在孢子表面上呈现酶。只有
SEQ ID NO：1的氨基酸23-33在孢子上表现出酶水平降低。

[1439] 表58.磷脂酶的酶水平

[1440]

[1441]

[1442] AA＝氨基酸

[1443] 类似于上述表57中所示的结果，当使用SEQ ID NO：1的氨基酸20-35、SEQ ID NO：5的氨基酸23-38或SEQ ID NO：120的外孢壁蛋白序列时，观察到在孢子表面上最高水平的磷脂酶或脂肪酶。

[1444] 表达数个这些构建体的这些孢子对大豆结瘤的作用如下表59所示。

[1445] 表59.磷脂酶植物应答

[1446]

[1447] 大豆植物如上所述被涂覆，但是测定进行了3周的时间。仔细取出植物，轻轻地从根部洗涤污垢，并计算每株植物的结瘤。如表59所示，加入在大豆种子上呈现磷脂酶的孢子使得植物上结瘤数量增加，这是早期生长以及大豆产量最终增加的积极迹象。

[1448] 实施例60:MIR319 RNA和随机RNA 1与表达含有核酸结合蛋白的融合蛋白的蜡样芽胞杆菌孢子的结合以及这些孢子用于递送RNA到植物的用途

[1449] DNA和RNA可以结合到表达含有靶向序列和核酸结合蛋白或外孢壁肽的融合蛋白的蜡样芽胞杆菌家族成员孢子，如上述实施例和详述中所述。孢子作为传递机制，将目标核酸(例如miRNA)递送给目标植物。为了证明重组蜡样芽孢杆菌杆菌家族成员孢子的这种能
力，使用表达含有 SEQ ID NO：1的氨基酸20-35(与已知DNA结合基因SspC融合于相同读码
框)的融合蛋白的孢子将普通miRNA MIR319递送到大豆中。MIR319 在不同植物中对植物表
型有不同的影响，甚至在同一植物的不同部位也有不同的影响。例如，在一些物种中，用
MIR319处理叶子会导致叶片卷曲，而在其他物种中，MIR319的应用导致抗压力。MIR319在植物基因组中是普遍存在的，是普遍的通路调控因子，其递送到多种植物中会导致多种表型。

[1450] 表60:本研究中使用的RNA

[1451]

[1452] 设计了来自Glycine max(大豆)的合成MIR319微小RNA，以匹配miRBase(miRBase.org，microRNA序列的中央储存库)中可用的 MIR319序列。通过Integrated DNA Technologies(IDT，Iowa)合成两个部分互补的单链序列，以表示已知存在于体内的3'和5'成熟基因产物(使用了5'序列的两种不同版本)。同样地，在大豆基因组中作为对照，合成了具有与大豆基因组中任何序列不匹配的随机序列的两条单链RNA作为对照。通过在95℃下
将两种单链(ss)产物混合10分钟，然后在室温下缓慢冷却以进行退火，制备双链(ds)基因
产物。通过如上面实施例58 所述的标准克隆步骤制备表达融合蛋白的苏云金芽孢杆菌，所述融合蛋白含有BclA启动子、起始密码子处的甲硫氨酸残基和与已知DNA结合基因 SspC
(α/β型SASP，苏云金芽孢杆菌BT013A的小的酸性可溶性孢子蛋白C)融合于相同读码框的
SEQ ID NO：1的氨基酸20-35。将该构建体 (SspC-BclA)在大肠杆菌中产生，转化入苏云金芽孢杆菌BT013A，并通过DNA测序验证克隆。通过使转化的细菌在酵母提取物基培养基中在脑心脏输注肉汤(BHI)中过夜生长2天，直到密度达到2×108个/秒/毫升 (ml)(不到1％的
营养细胞)，获得表达SspC-BclA的苏云金芽孢杆菌孢子。从母本BHI培养物的等分物中提取DNA，并进行测序以确认 SspC-BclA质粒的掺入。为了制备用于种子处理的孢子，通过离心沉淀出酵母提取物基培养基中的1ml孢子培养物，并重悬于100μl水中。计数浓缩的悬浮液，以6×108个/ml的浓度使用孢子。对于每个大豆种子，将1μl 孢子与10μl 10μM的RNA混合，并在30℃下孵育2小时(对于多个种子加倍)。孵育后，将孢子(携带结合的RNA)沉淀，弃去上清液中未结合的过量RNA，将沉淀重悬于10μl水中。将样品按如下方式施加到种子上：在每个锅中制备39.6cm3(15.6英寸3)的Timberline牌商品顶层土壤，并制成1英寸的压痕，其中施加2ml水，将单个种子置于顶部。通过微量滴定将10μl孢子+结合的RNA样品直接施加到种子的顶部。将种子放置 30分钟，然后将相邻的土壤推开以松散地覆盖种子。允许种子在具有13/11 小时光照/日循环的人造光植物生长室中在21℃/15℃夜间温度范围内发芽4天。
在第14天，大豆植物被连根拔起，拍照并测量。根据水对照处理的植物对高度进行归一化
(见表61)。

[1453] 实施例41描述了SspC-BclA重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子结合并保持DNA的能力。为了评估表达SspC-BclA的孢子的RNA结合能力，通过IDT合成生物素标记的随机RNA序
列，与如上所述的处理完全一样与孢子一起孵育(6×108个孢子/ml的1μl孢子+10μl 10μM的RNA在30℃下2小时，沉淀并重悬于10μl水中)。将缀合有荧光素(FITC)(Life 
Technologies)的抗生物素蛋白以20μg/ml终浓度加入到10μl孢子+RNA 样品中，在黑暗中室温孵育1小时。已知抗生物素蛋白结合生物素，FITC 是荧光示踪剂。将孢子再次沉淀以除去过量未结合的抗生物素蛋白FITC，并重悬于用PBS制成的4％多聚甲醛中，在4℃下在黑暗中储存过夜。检查孢子的荧光并拍照(参见表62)。另外，如图10所示，Sspc-BclA标记的孢子能够结合并保留ssRNA和dsRNA，如在与生物素结合的ssRNA 或dsRNA存在下FITC-抗生物素
蛋白标记的孢子所示。为了产生如图10 所示的结果，孢子与用生物素标记的双链或单链
RNA(随机序列)孵育，并用缀合有荧光素(FITC)的抗生物素蛋白检测。在仅与水孵育的孢子上没有检测到荧光。用40X物镜和10X镜头拍摄明场和相应的荧光图像。

[1454] 从下表61可以看出，MIR319作为种子处理对大豆的主要影响是根生长和总体高度。卷曲根被定义为具有至少两个180°的扭转。沿着主茎测量高度。当大豆植物被连根拔起并测定“卷曲根”的存在时，我们小组观察到大豆特异性的型，在水对照、BT013A菌株对照、单独双链RNA(dsRNA) 或单独孢子(载体对照)中没有发现卷曲根的证据。当用dsRNA将 
SspC-BclA孢子(载体)递送到种子时，注意到卷曲根的唯一证据(60％卷曲根)(还参见图
10)。图11还显示当暴露于与ds MIR319RNA结合的SspC-BclA孢子时，大豆植物的表型发生
变化。当使用孢子来递送RNA 时，RNA的影响被放大，导致图11中发育迟钝和卷曲根表型增加。为了产生如图11所示的结果，大豆种子用双链(ds)MIR319处理，事先结合或者不结合表达SspC-BclA的苏云金芽孢杆菌孢子。dsMIR319的应用导致产生平均较高的植物；然而，
dsMIR319与孢子结合的应用导致产生定义为具有至少两个180°扭转的“卷曲”根以及整体
较小的高度。显示了每次实验条件的中值样本。使用数码相机拍摄图像，植物一起放在单张图像中。

[1455] 作为RNA对照，将一组随机的ssRNA(单链)和dsRNA应用于大豆。在这些实验中，当单独施用时，随机ssRNA不起作用，而当递送到种子时，dsRNA对植物的高度具有迟缓作用。
在这两种情况下，当孢子 (载体)与随机ssRNA或dsRNA结合使用时，迟缓表型显着增加(分
别为迟缓33％和27.8％)。这种迟缓在单独孢子(载体对照)的样本中不明显。这些数据一起显示了孢子放大的能力，通过应用于种子将ssRNA和 dsRNA特异性递送到植物，并证明了两种不同RNA(随机#1和MIR319) 在当通过表达含有DNA/RNA结合蛋白的融合蛋白的蜡样芽胞
杆菌孢子递送时影响表型的能力。

[1456] 表61:MIR319对大豆发育的根和高度的作用

[1457]

[1458]

[1459] 表62:对与生物素标记的RNA结合的SspC-BclA表达孢子的荧光检测

[1460]

[1461] 如表62中可见，不存在RNA的孢子上未检测到荧光。孢子上均检测到单链(ss)和双链(ds)RNA两者。

[1462] 实施例61:通过表达融合蛋白的重组苏云金芽孢杆菌的摄取将核酸递送到秀丽隐杆线虫

[1463] 将RNA和DNA递送到线虫在植物科学，动物健康和基础研究中都有很大的应用。线虫对重要作物的商业和非商业性生长作业造成大量的损害和产量损失，并且寄生线虫在世
界许多贫困地区的人类和其他动物中造成高发病率。RNA和DNA的递送有可能减轻和治疗许
多线虫问题，并且RNA和DNA构建体的递送已经被证明可用于影响目标线虫。本实施例说明
了上述实施例60中所述的RNA/DNA递送机制在将孢子递送到线虫中的用途。

[1464] 野生型秀丽隐杆线虫购自Carolina Biological(北卡罗来纳州)，并在包覆有OP50大肠杆菌(用作食物)的NGM-Lite琼脂平板上维持在23℃。通过标准克隆方法对两种不
同的苏云金芽孢杆菌BT013A菌株进行改造，以表达与绿色荧光蛋白(GFP)或mCherry融合到
相同读码框中的SEQ ID NO：1的氨基酸20-35，以追踪肠道中孢子的存在。通过在BHI(脑心浸液肉汤)培养基中过夜生长，随后在基于酵母提取物的培养基中培养3天，直至达到不到
1％的营养细胞中每毫升(ml)约2×108个孢子的密度，从而获得这些绿色或红色荧光标记
的孢子。为了制备用于饲喂线虫的孢子，通过离心将1ml培养基中的孢子培养物沉淀，并重悬于 100μl水中以除去多余的培养基。计数浓缩的悬浮液，并稀释至1×108个孢子/ml。为了用孢子饲喂蠕虫，将含有红色和绿色荧光标记的孢子的1μl 孢子悬浮液加入到含有10μlPBS(磷酸盐缓冲盐水)的60mm NGM-lite 琼脂平板中，以有助于扩散。没有其他可利用的
食物来源。将各种年龄的 20条野生型线虫立即转移到板上。5小时后使用标准荧光显微镜
检查活体线虫摄取孢子的情况。

[1465] 从图12和表63可以看出，饲喂表达含有靶向序列和GFP的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子时，线虫的中部肠发荧光，而当饲喂OP50大肠杆菌时(标准食物)时，肠道不发荧光。拍摄了4X物镜和10X目镜的活线虫图像。这表明这些孢子可以同时摄取和递送目标蛋白的“货物”，例如绿色荧光蛋白蛋白。其他外孢壁蛋白和靶蛋白也可以与靶向序列互换使用，以将RNA和DNA递送到线虫或其他靶生物。由于外孢壁的高度保守性质及其产生
于孢子表面上，还可以使用其他重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子。

[1466] 表63:肠道中检测到的秀丽隐杆线虫荧光

[1467]

[1468] 实施例62:外孢壁片段的构建、纯化和应用

[1469] 敲除(KO)突变体：为了制备苏云金芽孢杆菌BT013A的exsY 和cotE敲除(KO)突变菌株，构建了质粒pKOKI穿梭和整合载体，其含有能够在大肠杆菌中复制的pUC57骨架，以及来自pE194的红霉素抗性盒复制起始位点。该构建体能够在大肠杆菌和杆菌菌株中复制。从苏云金芽孢杆菌BT013A中PCR扩增对应于cotE基因的上游区域的1kb DNA 区域和对应于基
因cotE的下游区域的1kb区域。制备了第二个构建体，其包含对应于exsY基因的上游区域的
1kb DNA区域和对应于基因exsY 的下游区域的1kb区域，两者均从苏云金芽孢杆菌BT013A
中PCR扩增得到。对于每个构建体，然后使用pKOKI质粒重叠区域的同源重组将两个 1kb区
域剪接在一起。通过消化和DNA测序证实质粒构建体。通过寻找红霉素抗性筛选克隆。

[1470] 克隆在脑心浸液肉汤中在高温(40℃)下传代。将单个菌落用牙签挑在含有5μg/ml的红霉素的LB琼脂平板上，在30℃下生长，并通过菌落PCR筛选作为游离质粒的pKOKI质粒
的存在。继续传代发生整合事件的菌落，以筛选失去红霉素抗性的单个菌落(表示质粒损
失，但重组和除去了exsY或cotE基因)。通过PCR扩增和染色体靶区域的测序来确认验证的
缺失。将pSUPER-BclA 20-35Endo质粒(在实施例58中描述的)转化到每个exsY和cotE KO突
变体中。如实施例48所述，还用 pSUPER BclA 20-35eGFP质粒(如实施例44中所述制备，但通过同源重组将内切葡聚糖酶替换为eGFP)转化cotE KO突变体。

[1471] 显性负性突变体：为了产生显性负性突变体，我们PCR扩增了分别含有氨基酸1-81和81-199的CotO(Seq ID NO：126)N-末端半部分和C-末端半部分，并使用同源重组将这些
片段克隆到pHP13载体中 (pHP13载体在实施例1中描述)。通过Sanger测序验证正确的克
隆。将两种CotO显性负性突变体的每一种引入含有pSUPER-BclA 20-35 Endo构建体的苏云
金芽孢杆菌BT013A中，如实施例58中所示，其在孢子表面上产生内切葡聚糖酶。

[1472] 外孢壁片段的产生：对于两种KO突变体的每一种和两种显性负性突变体，使过夜培养物在含有抗生素选择的挡板烧瓶中在30℃、 300rpm下在BHI培养基中生长。将1毫升该过夜培养物接种到挡板烧瓶中的酵母提取物介质(50ml)中，并在30℃下生长3天。除去一部分孢子，加入1％吐温，涡旋搅拌1分钟以振荡孢子。通过10,000×g离心5 分钟收集孢子，将含有外孢壁片段的上清液过滤通过0.22μM的过滤器，以去除任何残留的孢子。将上清液(含有破碎的外孢壁片段)过滤通过 100,000Da膜过滤器，得到含有融合蛋白的经纯化的外孢壁片段。
传达通过100kDa过滤器，去除较小的MW蛋白。在上清液的滤液或渗出物中没有发现孢子。

[1473] 透射电子显微照片如图15所示，其显示了由附着的外孢壁包围的苏云金芽孢杆菌BT013A的完整孢子(图A)，以及苏云金芽孢杆菌 BT013A CotE敲除突变体的孢子(外孢壁已
经脱离)(图B)。图15的图 A中的箭头表示完整孢子的外孢壁，而图15的图B中的箭头表示与孢子分离的外孢壁。图15的图C显示了苏云金芽孢杆菌BT013A CotE敲除突变体的经纯化的
外孢壁片段制备物(如上所述通过涡旋、离心和上清液过滤而制备)的透射电子显微照片，
其通过阴性染色显现。在JEOL JEM 1400 透射电子显微镜上拍摄图像。当对照孢子(CotE未敲除的表达BclA 20-35 Endo融合蛋白的苏云金芽孢杆菌BT013A，数据未显示)进行上述相
同的涡旋、离心、过滤步骤时，未观察到可见的外孢壁片段。.

[1474] 来自CotE和ExsY敲除和CotO显性负性突变体的外孢壁片段收集物中BclA 20-35内切葡聚糖酶的存在：如上所述产生和纯化含有 pSUPER BclA 20-35-Endo质粒的外孢壁
片段，所述质粒产生在孢子表面上含有内切葡聚糖酶的外孢壁。由cotE敲除突变体孢子、
exsY敲除突变体孢子、CotO N-末端显性突变体孢子或CotO C-末端显性突变体孢子制备含
有该构建体的外孢壁片段。在这些实验的每个中，将外孢壁片段上的内切葡聚糖酶的活性
量定量为总体酶水平的百分比。将这些结果与不含任何突变体但含有pSUPER BclA 20-35-
Endo质粒的野生型构建体进行比较。

[1475] 外孢壁片段对植物生长的影响：将这些外孢壁片段作为种子处理递送到大豆种子上(如上文实施例59所述)。将野生型对照(表达BclA 20-35Endo构建体的苏云金芽孢杆菌
BT013A)也涂覆在大豆种子上。对于每个实验，将每个构建物的1μl外孢壁片段，或片段的1:
2、1:4或1:8 稀释液施加到每个种子。

[1476] 表64:外孢壁片段酶活性和植物生长应答

[1477]

[1478]

[1479] 这些结果表明，破坏外孢壁的突变，例如cotE或exsY基因中的敲除突变或CotO蛋白中的显性负性突变，可以用于产生基本上不含孢子的外孢壁片段，并且表明这些外孢壁
片段含有靶向外孢壁的融合蛋白。这些片段可以用于促进植物生长和其他应用中。无突变
并且表达BclA 20-35Endo构建体(BT013A BclA 20-35Endo)的BT013菌株的外孢壁片段制
备物中具有少量的背景内切葡聚糖酶活性。这是意想不到的，其可能代表低水平的不稳定
的外孢壁从孢子释放并在外孢壁片段收集过程中被捕获。CotE和ExsY KO菌株在外孢壁片
段级分中含有最高量的酶。表达融合蛋白的CotO显性负性突变体在外孢壁片段级分中也具
有升高的酶水平。

[1480] CotE和ExsY突变体(不表达BclA 20-35Endo)的外孢壁片段直接施用于植物对生长有负面作用，并从本实验中除去。当BT013A BclA 20-35Endo的外孢壁片段应用于大豆
时，存在负生长表型。当将表达BclA 20-35Endo融合蛋白的CotE或ExsY突变体的外孢壁片
段添加到大豆中时，发生增长速率显着增加(比BT013A BclA 20-35Endo片段+ 28.3％和+
14.8％)。CotE突变体外孢壁片段在1:4稀释下仍然具有活性，但是ExsY外孢壁片段在这种
稀释度下对大豆不再产生生长益处。与 BT013A BclA 20-35Endo相比，表达BclA 20-
35Endo融合蛋白的CotO 显性负性突变体使大豆生长较少增加，分别使生长增加了+6.5％
和+ 2.7％。

[1481] 实施例63:使用内生蜡样芽胞杆菌家族成员和其他重组杆菌菌种将肽、蛋白和酶内生地递送到植物的额外说明

[1482] 发现苏云金芽孢杆菌EE417、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌EE439和杆菌EE387具有内生生长能力，并能够用作BEMD系统的宿主菌株(参见实施例52和53)。为了证明这些芽孢杆菌内生生长和作为BEMD系统宿主菌株的能力，用pMK4-BclA 20-35-eGFP 质
粒(上述实施例62中描述)转化这些菌株。如实施例40所述制备和纯化孢子。

[1483] 将这些孢子稀释至1×108/ml的浓度，然后将1μl全细胞培养液加入到种植灌封土壤中的商业杂交玉米种子中。玉米种子用杀真菌剂和生物接种剂包被。玉米杂交品种为
BECK 6175YE，其含有ROUNDUP READY草甘膦抗性基因和AQUAMAX抗旱基因。植物在人造光下每天生长14小时，确定10天期间植物的生长情况。在实验过程中，每3天对植物进行浇水。

[1484] 然后从玉米植物的内部分离表达BclA 20-35-eGFP的苏云金芽孢杆菌EE417、苏云金芽孢杆菌EE-B00184、蜡样芽胞杆菌EE439和杆菌EE387。从土壤中提取十日龄的植物，并洗涤以除去多余的碎屑。然后将植物倒置，在水中洗涤，暴露于5％漂白剂10分钟，在水中洗涤，暴露于70％乙醇10分钟，再次在水中洗涤，并用无菌剃刀刀片切开茎。将茎的切开部分面朝下放置在营养琼脂平板上30℃下2小时。两小时后，将茎除去，琼脂平板在30℃下孵育
48小时。48小时后，对板进行菌落形态学检测，将植物内部发现的杆菌菌落分别用牙签挑在营养琼脂和营养琼脂加氯霉素平板上(以选择含有pMK4-20-35BclA-eGFP质粒的细菌)。结
果示于表65。这些结果证明了通过在蜡样芽胞杆菌家族的内生菌株中表达而将BEMD系统引
入目标植物的能力。如荧光显微镜所证实，图13还显示了苏云金芽孢杆菌EE-B00184在孢子上表达eGFP的能力。在图13中，箭头表示单个孢子。图14显示了从植物中分离的细菌菌落发出绿色荧光的能力，表明它们确实将目标蛋白(此处是eGFP)递送到了植物内部。图14显示
了板上从玉米植株内部分离的内生细菌菌落的荧光，其用GFP 过滤灯照射。

[1485] 表65:“货物”蛋白的内生性递送

[1486]

[1487]

[1488] 为了进一步证明这些内生菌株在孢子表面上表达蛋白的能力，将以下构建体引入到杆菌EE387中：具有与以下一种融合的内切葡聚糖酶的pHP13质粒：BclA 20-35、CotB、
CotG、CotC、CgeA、InhA、InhA2、 InhA1、CotY或AcpC(SEQ ID NO：1的氨基酸20-25或分别为SEQ ID NO：252、256、253、254、108、121、114、111和120)。实施例58 中所述的pSUPER BclA-
20-35Endo构建体也被引入到另一内生菌株苏云金芽孢杆菌EE-B00184中。转化的细胞通过
PCR和Sanger测序进行筛选。通过在BHI加选择剂(氯霉素)中生长产生过夜培养物，制备这
些构建体中每一个的孢子，并将500μl每种培养物涂抹到营养肉汤琼脂平板上，在30℃下孵育3天。3天后，将孢子刮下到PBS中，稀释至浓度为 1×108/ml，离心以回收孢子，并如实施例58所述进行孢子的酶测定。酶浓度以每个构建体的mU/ml计算。杆菌EE387在其孢子表面
上表达融合蛋白的能力由酶的水平表示。杆菌EE387能够在其表面上表达所有的孢子融合
蛋白，但AcpC(SEQ ID NO：120)是该菌株的优良融合蛋白。这个发现是令人惊讶的，因为杆菌EE387不是蜡样芽胞杆菌家族成员菌株，其没有外孢壁，而是表现出含有外孢壁蛋白或来自外孢壁蛋白(例如 CotY、AcpC和SEQ ID NO：1的氨基酸20-35)的靶向序列的融合蛋白的
表面表达。

[1489] 表66:表达融合蛋白的内生菌株杆菌EE387(EE387)和苏云金芽孢杆菌EE-B00184(EE-B00184)

[1490]

[1491] 这些内生菌株也可以通过添加到植物生长介质中施用给植物，包括土壤、灌溉和颗粒制剂。内生菌株也可以通过植物的地上部分进入目标植物。这些创造了一种独特而有
效的递送机制，用于将感兴趣的蛋白和肽递送到植物中，或者在DNA和RNA结合蛋白的情况
下，将RNA和DNA 递送到植物中。

[1492] 杆菌EE387中的这些数据还证明了BclA(SEQ ID NO：1) 的氨基酸20-35和SEQ ID NO：108、121和120都在蜡样芽胞杆菌家族以外的杆菌菌株中都有显著的阳性数据。苏云金芽孢杆菌EE-B00184也是一个特殊的宿主表达系统。这些水平都是显著的和阳性的，表明其他杆菌种中可能存在这些蛋白的附着的保守机制。

[1493] 苏云金芽孢杆菌EE-B00184的孢子表面表达。用pSUPER BclA 20-35eGFP转化苏云金芽孢杆菌EE-B00184，并如上所述进行孢子形成。将孢子沉淀，洗涤并进行荧光显微镜观察，以证明图13中负载有 eGFP蛋白的孢子表面。

[1494] 实施例64:降解除草剂和杀虫剂的蜡样芽胞杆菌家族成员菌株中融合蛋白的表达

[1495] 上面实施例49和51证明了除草剂降解菌株蜡样芽胞杆菌家族成员EE349在降解除草剂并用作宿主菌株以表达连接其孢子的外孢壁的融合蛋白中的作用。为了进一步证明除
草剂降解菌株在其孢子上产生负载外孢壁的酶的能力，我们将pHP13CotC-Endo(SEQ ID 
NO：253)、 pSUPER AcpC-Endo(SEQ ID NO：120)、pSUPER InhA2-Endo(SEQ ID NO：121)和pSUPER 23-38SEQ ID NO：5-Endo)引入蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377中。pHP13CotC-
Endo的描述可以在实施例54 中找到，pSUPER AcpC-Endo和pSUPER InhA2-Endo的描述可以
在实施例59中找到，pSUPER 23-38SEQ ID NO：5-Endo的描述可以在实施例58中找到。蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377被鉴定为强效的除虫菊酯、麦草畏和2,4-D降解剂。通过以除
草剂或杀虫剂作为氮源的生长，以及除草剂或杀虫剂降解菌株的存在下麦草畏和2,4-D的
减少，来证实除草剂和杀虫剂的降解。与上述实施例48相同制备质粒并转化细胞。通过 
Sanger测序验证每个构建体。通过使用实施例48中概述的孢子形成介质和条件产生孢子。
酶活性也按照上面实施例58进行.

[1496] 表67:杀虫剂降解菌株蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377中融合蛋白的酶表达水平

[1497]表达构建体 内切葡聚糖酶活性(mU/ml)
CotC-Endo(SEQ ID NO:253) 46.9
AcpC-Endo(SEQ ID NO:120) 4.3
pSUPER 23–38SEQ ID NO:5-Endo 108

[1498] 从表67可以看出，蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377能够产生内切葡聚糖酶，并使用几种不同的外孢壁蛋白或靶向序列能够在其外孢壁上呈现内切葡聚糖酶。在测试的构建
体中，SEQ ID NO：5的氨基酸23-38 或SEQ ID NO：253在该菌株中产生最高的酶水平。

[1499] 本实施例证明了孢子呈现系统在除草剂和杀虫剂降解菌株中表达的能力。该系统可以用于在孢子表面上表达其他靶蛋白，包括对除草剂或杀虫剂本身起作用的那些，例如
除草剂降解酶、杀虫剂降解酶、代谢酶、还原酶、氧化酶以及用于单独或在植物存在下分解杀虫剂的其他有用酶。

[1500] 实施例65:游离一氧化氮合酶(NOS)和结合NOS的孢子增强植物萌发的用途

[1501] 实施例40表明，当附着于蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁时，来自枯草芽胞杆菌168的一氧化氮合成酶(NOS)能够刺激萌发，并将 NOS-孢子蛋白融合物递送到种子或种子
附近。在本实施例中，来自苏云金芽孢杆菌BT013A(SEQ ID NO：261)的游离NOS和游离eNOS(来自牛嗜中性粒细胞的上皮NOS，Sigma-Aldrich，Cat No N1533)还可以帮助诱导萌发或
增加暴露于NOS的孢子的生长。以与实施例40中所述 pHP13BclA-BS NOS相同的方式制备
pHP13BclA-BT NOS、pHP13 BclA-BS NOS和pHP13BclA-SODA(超氧化物歧化酶)质粒，并转化入苏云金芽孢杆菌BT013A中。pHP13BclA-BT NOS含有BclA启动子、起始密码子、BclA氨基酸
20-35、6丙氨酸接头和苏云金芽孢杆菌BT013A NOS基因(见表9，SEQ ID NO：263)。
pHP13BclA-BS NOS含有BclA 启动子、起始密码子、BclA氨基酸20-35、6丙氨酸接头和枯草芽胞杆菌 168NOS基因(见表9，SEQ ID NO：264)。pHP13BclA-SODA含有 BclA启动子、BclA氨基酸20-35、6丙氨酸接头和蜡样芽胞杆菌超氧化物歧化酶1(SODA1)基因(SEQ ID NO：155)。

[1502] 表68显示了土壤萌发测定的结果。在该测定中，商业品种BECK'S 294NR(ROUNDUP READY)用1μl水(对照)或1μl掺有34.2mU牛嗜中性粒细胞eNOS的水包被。然后按照实施例58中所述种植和种植每种50粒种子，但每盆栽4粒种子。7天后，测量植物的高度。从表68可以看出，eNOS的存在使得种子的生长增长，导致经处理的大豆的枝条高度增加30.7％。

[1503] 表68:大豆中游离eNOS对植物高度的影响

[1504]

[1505] 除了上述的土壤萌发试验之外，如实施例40所述进行标准萌发试验。对于大豆，我们选择具有较低萌发率的2年龄大豆种子，并在处理中使每种50粒种子包被1μl。处理是H2O对照(水)、L-精氨酸、苏云金芽孢杆菌BT013A(菌株对照)、含有pHP13BclA-BT NOS的苏云金芽孢杆菌BT013A和含有pHP13BclA BS NOS苏云金芽孢杆菌BT013A。大豆的结果如下表69所示。

[1506] 表69:大豆中孢子呈现的NOS对萌发的影响

[1507]

[1508] 如上所述对高粱的商业杂交种进行标准萌发测定。处理中在每种50粒种子上用0.5μl包被每个高梁种子。处理是H2O对照(水)、L- 精氨酸、苏云金芽孢杆菌BT013A(菌株对照)、含有pHP13BclA-BS NOS 苏云金芽孢杆菌BT013A、含有pHP13BclA-BT NOS苏云金芽孢
杆菌 BT013A。4天后，测量种子的枝条高度和根长度，以检查种子生长的增长，所有数据根据水对照进行归一化。结果示于下表70。加入BT NOS 或BS NOS导致根长度和枝条生长显著增加，其中BS NOS处理中差异最明显。

[1509] 表70:结合NOS的孢子和高梁生长的增加

[1510]

[1511] 重复上述高粱实验，但处理方式略有不同。处理为H2O对照(水)，苏云金芽孢杆菌BT013A(菌株对照)、含有pHP13BclA–SODA 的苏云金或游离牛eNOS。4天后，测量种子的枝条高度和根长度，观察种子生长的增长，所有数据根据水对照进行归一化。结果示于表71。添加 BT SODA或游离NOS(eNOS)导致根长度和枝条生长显著增加。

[1512] 71:结合SODA的孢子和游离NOS以及高梁生长的增加

[1513]

[1514] 总之，这些结果表明，在土壤和传统萌发方法中，可以将来自多种来源的过量表达的一氧化氮合成酶添加到种子中，增加其萌发率和种子生长。当向种子中添加游离NOS时也可以观察到这种效果。孢子中添加超氧化物歧化酶也导致种子的生长增加。L-精氨酸在单独使用时辅助萌发率增加，或与NOS酶混合时在较小程度上辅助。

[1515] NOS基因在各种微生物中是普遍的，并且这些微生物可以通过基因修饰来增强其在植物生长培养基中在种子或种子附近表达NOS的能力。NOS在孢子上的表达提供了优越的
递送系统，因为营养微生物更脆弱，并且不能长时间存活于种子上。本文中所述使用靶向序列、外孢壁蛋白、外孢壁蛋白片段和孢子外壳蛋白在孢子上的表达将是将NOS递送到种子的可行方法。

[1516] 实施例66:酶表达和植物生长的调节

[1517] 如实施例44、45和46所示，调节蛋白在共表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员中的过量表达可以导致掺入外孢壁的融合蛋白水平增加和减少。如实施例44和45中所
述制备融合蛋白和构建物并形成孢子。如实施例46中所述进行生长分析。

[1518] 从表72可以看出，使用SEQ ID NO：1的氨基酸20-35作为靶序列的苏云金芽孢杆菌BT013A孢子表面上pSUPER BclA 20-35Endo 融合蛋白的表达在玉米、大豆和南瓜中导致生
长增加。当第二种外孢壁蛋白过量表达时，可以增加这种效果。CotO、BxpB和YjcB过量表达的菌株对玉米、大豆和/或南瓜生长有显著影响，其中玉米增加最为突出。

[1519] 表72:结合SODA的孢子和游离NOS以及高梁生长的增加

[1520]

[1521]

[1522] 其他调节蛋白的过量表达还可以调节融合蛋白表达水平以及植物生长效应，包括本文中以及上面实施例44和45中描述的那些。这些中的每个可以用于将酶水平改变或调整
至期望的有效水平。

[1523] 实施例67:外孢壁蛋白的过表达和对植物的作用

[1524] 天然发生的孢子和外孢壁蛋白的过量表达可以影响植物生长促进型、内生型和其他蜡样芽胞杆菌家族成员对植物的作用。各种外孢壁蛋白表达为融合蛋白的一部分或者表
达为游离酶的表达可以对植物产生有益作用，如上对于磷酸酶(实施例11和36)、一氧化氮
合成酶(实施例 65)和蛋白酶例如InhA(实施例3、6、7、13)所述。其他外孢壁和孢子蛋白，例如丙氨酸消旋酶和肌苷尿苷优选水解酶，可以预防或延缓孢子的萌发，而且其过量表达会
使孢子不易快速萌发(在使用许多类型的孢子时不希望的副作用)。最后，过量表达某些外
孢壁蛋白的孢子可以改变外孢壁的总体装配，导致孢子与植物结合的变化。示例如下表73
所示。

[1525] 根据实施例58中对于苏云金芽孢杆菌BT013A所述产生孢子。通过对每个玉米种子放置来自每个构建体的1μl全细胞肉汤或者对每个南瓜种子放置2μl，进行生长测定。种子处理、种植和数据记录按照实施例 58进行。

[1526] 如实施例44所述，用过量表达质粒转化蕈状芽孢杆菌菌株 EE155，蜡样芽胞杆菌家族一种植物生长促进菌株。该菌株中外孢壁蛋白的过量表达直接导致孢子与植物结合，
并且导致更高的植物生长促进。特别地，BclB、BclA、CotO、CotE的过量表达导致植物生长促进的增强。可以过量表达导致外孢壁结构发生改变的其他外孢壁蛋白，包括ExsY、ExsFA/
BxpB、CotY、CotO、ExsFB、InhA1、InhA2、ExsJ、ExsH、 YjcA、YjcB、BclC、AcpC、InhA3、丙氨酸消旋酶1、丙氨酸消旋酶2、 BclA、BclB、BxpA、BclE、BetA/BAS3290、CotE、ExsA、ExsK、ExsB、 YabG、Tg1、超氧化物歧化酶1(SODA1)和超氧化物歧化酶2(SODA2)。这些基因中任何一种的过量表达或突变将导致外孢壁结构发生改变，并且增强与蜡样芽胞杆菌家族成员相关的植
物生长益处。

[1527] 表73:蕈状芽孢杆菌EE155中外孢壁蛋白的过量表达

[1528]

[1529] 实施例68:通过使用外孢壁呈现的结合蛋白与植物组织结合

[1530] 用于呈现外源和内源蛋白的孢子可以用作融合伴侣，以增强孢子与表面(包括植物组织)的结合。为了证明此属性，用质粒pSUPER BclA 20-35TasA、pSUPER BclA 20-
35Expansin、pSUPER BclA 20-35Endo 和pSUPER BclA 20-35对照转化苏云金芽孢杆菌
BT013A孢子。TasA和 expansin是植物结合蛋白。对照质粒含有BclA启动子、起始密码子和SEQ ID NO：1的氨基酸20-35，但不包括融合伴侣。按照与上述实施例58中所述那些相同的方式制备这些构建体。

[1531] 为了进行组织结合测定，如实施例58所述使2周龄玉米植物和3周龄大豆植物生长，但没有任何种子处理。然后用含有上述每种构建体的1ml孢子擦拭植物的主叶和第一复叶(first trifoliate)。使叶子干燥，从植物中剪下，放入含有10ml水的50ml锥形管中，并剧烈涡旋。在血细胞计数器上对从叶片释放到水中的孢子进行计数，并将数值与预期没有
孢子结合到叶子上的那些相比较。将该实验重复10次，并进行第二项实验，其中包括将水置于抗生素平板(四环素加营养琼脂)上在30℃下过夜。最后的计数如表74所示。

[1532] 表74:在孢子上表达结合蛋白使植物组织的结合增加

[1533]

[1534] 从表74可以看出，对照BT013A孢子对于大豆的BT013A孢子具有高亲和力，为对照的孢子结合的58.3％和65.2％。尽管如此，在孢子表面上表达内切葡聚糖酶、expansin或
TasA导致孢子与大豆叶片的结合增加，其中许多孢子制备物接近100％结合到叶子上。在玉米中，对照孢子的结合要小得多，特别是在平板测定中。平板测定的结果是最显著的，其中每个表达构建体均增加，其中TasA在该测定中具有100％的孢子结合。

[1535] 利用本文所述的任何表达系统或融合伴侣，这些结合蛋白还可用于任何重组孢子形成微生物中。该系统还可以与外孢壁带一起使用，以构建无细胞且紧密结合叶片的蛋白
递送系统。

[1536] 实施例69:表达含有Cot/CgE蛋白和促进植物生长的酶的融合蛋白的重组孢子形成细菌的用途

[1537] 外壳蛋白形成蛋白层，其发现于迄今为止描述的所有杆菌菌种孢子以及相关菌种Virginibacillus、Lysinibacillus、Clostridia和 Paenibacillus上。目标蛋白或肽融合到外壳蛋白上允许在孢子表面上表达外源蛋白，并将这些目标蛋白或肽递送到植物。为了
证明外壳蛋白向植物递送酶的能力，构建了一系列构建体。使用来自BacillusGenetic 
Stock Culture中心的pHP13质粒利用其天然启动子元件进行同源重组，从而将下面描述的
每个构建体克隆到多克隆位点中。

[1538] 将来自枯草芽胞杆菌M01099的CotB、CotG和CotC或来自解淀粉芽孢杆菌的CgeA与来自枯草芽胞杆菌168的内切葡聚糖酶eglS 基因、来自枯草芽胞杆菌168的lipA脂肪酶基
因或来自苏云金芽孢杆菌 BT013A的pc-plc基因融合于相同读码框中。将这些构建体通过
同源重组克隆到pHP13中，通过Sanger测序验证，并转化入枯草芽胞杆菌EE405、枯草芽胞杆菌A09、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439、杆菌EE398或苏云金芽孢杆菌EE-B00184中。每个转化体也通过Sanger测序筛选出正确的克隆。在确认克隆后，使每个克隆在加入四环素(10μg/ml)的脑心浸汤(BHI)中在30℃下生长，并将100μl过夜培养物涂抹到加入四环素的营养琼
脂平板上。将这些板在30℃下孵育3天，用水洗棉签擦拭收集孢子并重新悬浮于水中。

[1539] 然后将用于内切葡聚糖酶测定的孢子在水中稀释至1×108CFU /ml，并通过利用发色团4氯2硝基苯基纤维素(4C2NC，水中3mM)测定酶活性。对于该方法，将50μl孢子置于96孔板中，向每个板中加入50 μl的300nM 4C2NC溶液。然后将板在30℃下孵育，0.5小时后读取410nm 处的吸光度。在所有情况下，从每个克隆的总体吸光度中减去相应的菌株对照吸
光度，以消除任何背景活性。

[1540] 将用于脂肪酶测定的孢子在水中稀释至1×108CFU/ml，并且使用发色团4-硝基苯基棕榈酸酯(4NP，水中3mM)在第二种方法中测定酶活性。对于该方法，将50μl孢子置于96孔板中，并向每个板中加入 50μl的300nM 4NP溶液。然后将板在30℃下孵育，0.5小时后读取
410nm 处的吸光度。在所有情况下，从每个克隆的总体吸光度中减去相应的菌株对照吸光
度，以消除任何背景活性。

[1541] 将用于磷脂酶测定的孢子在水中稀释至1×108CFU/ml，并且如实施例58中对于磷脂酶所述对酶活性进行测定。在所有情况下，从每个克隆的总体吸光度中减去相应的菌株
对照吸光度，以消除任何背景活性。

[1542] 植物生长应答和处理按照上述实施例58中对于南瓜所述进行应用和收集。根据孢子上未呈现酶的菌株对照对所有高度进行归一化。

[1543] 表75:外壳蛋白的融合及其酶表达水平

[1544]

[1545]

[1546] N/A＝不适用

[1547] ND＝未测定

[1548] 表75中的数据证实，外壳蛋白在蜡样芽胞杆菌家族成员(EE184、 EE439)和非蜡样芽胞杆菌家族成员(此处和实施例65的EE405、A09 和EE387)中对一些植物有益酶广泛起作
用。加入孢子呈现酶，在本实施例中为内切葡聚糖酶，在大多数情况下导致植物生长表型增加。

[1549] 实施方案

[1550] 为了进一步说明，以下提供本发明的另外非限制性实施方案。

[1551] 实施方案1是融合蛋白，包含至少一种目标蛋白或肽和:(1)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸1-30；(2)靶向序列包含SEQ ID NO: 59；(3)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
60具有至少85％同一性的氨基酸序列；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸2-30；(5)
靶向序列包含 SEQ ID NO:59的氨基酸4-30；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸6-
30；(7)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸1-33；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基
酸18-33；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:61；(10) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:62具有至少
85％同一性的氨基酸序列； (11)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸2-33；(12)靶向序列包含 SEQ ID NO:61的氨基酸5-33；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸10-33；(14)
靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸15-33；(15)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸1-
35；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:63；(17)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:64具有至少85％
同一性的氨基酸序列；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸2-35；(19)靶向序列包含
SEQ ID NO:63的氨基酸5-35；(20)靶向序列包含SEQ ID NO: 63的氨基酸8-35；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸10-35；(22) 靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸15-35；
(23)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸1-24；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸
9-24； (25)靶向序列包含SEQ ID NO:65；(26)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 66具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(27)靶向序列包含SEQ ID NO: 107；(28)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸2-24；(29)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸5-24；(30)靶向序列包含
SEQ ID NO:67的氨基酸1-27；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸12-27；(32)靶向序列包含SEQ ID NO:67；(33)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:68具有至少85％同一性的氨基酸
序列；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸2-27；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:67的
氨基酸5-27；(36)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸10-27；(37)靶向序列包含SEQ ID 
NO: 69的氨基酸1-38；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸23-38；(39) 靶向序列包
含SEQ ID NO:69；(40)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:70具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(41)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸2-38；(42)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨
基酸5-38；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸10-38；(44)靶向序列包含SEQ ID NO: 
69的氨基酸15-38；(45)外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:72；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:73；
(47)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:74具有至少 95％同一性的氨基酸序列；(48)靶向序列
包含SEQ ID NO:75的氨基酸 1-42；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-42；(50)
靶向序列包含SEQ ID NO:75；(51)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:76具有至少 85％同一性
的氨基酸序列；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸 2-42；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸5-42；(54)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸10-42；(55)靶向序列包含
SEQ ID NO:75的氨基酸15-42；(56)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸20-42；(57)靶向
序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸25-42；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-24；
(59)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸9-24； (60)靶向序列包含SEQ ID NO:77；(61)外
孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 78具有至少85％同一性的氨基酸序列；(62)靶向序列包含SEQ ID NO:7 的氨基酸2-24；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-24；(64)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:80具有至少85％同一性的氨基酸序列；(65) 靶向序列包含SEQ ID NO:81
的氨基酸1-38；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸23-38；(67)靶向序列包含SEQ ID NO:81；(68)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:82具有至少85％同一性的氨基酸序列；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸2-38；(70)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸5-38；
(71)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸10-38；(72) 靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基
酸15-38；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸20-38；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:
83的氨基酸1-34； (75)靶向序列包含SEQ ID NO:83；(76)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 
84具有至少85％同一性的氨基酸序列；(77)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:86具有至少85％
同一性的氨基酸序列；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸1-28；(79)靶向序列包含
SEQ ID NO:87的氨基酸13-28； (80)靶向序列包含SEQ ID NO:87；(81)外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO: 88具有至少85％同一性的氨基酸序列；(82)靶向序列包含SEQ ID NO: 87的氨
基酸2-28；(83)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸5-28；(84) 靶向序列包含SEQ ID NO:
87的氨基酸10-28；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸1-28；(86)靶向序列包含SEQ ID NO:89；(87)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列；(88)
靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸2-28；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:89 的氨基酸5-
28；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸10-28；(91) 靶向序列包含SEQ ID NO:91的
氨基酸1-93；(92)靶向序列包含SEQ ID NO:91；(93)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:92具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸2-93；(95)靶向
序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸10-93；(96)靶向序列包含SEQ ID NO: 91的氨基酸20-93；
(97)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸30-93； (98)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基
酸40-93；(99)靶向序列包含 SEQ ID NO:91的氨基酸50-93；(100)靶向序列包含SEQ ID 
NO:91的氨基酸60-93；(101)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸1-130；(102) 靶向序列
包含SEQ ID NO:93；(103)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:94 具有至少85％同一性的氨基酸
序列；(104)靶向序列包含SEQ ID NO:93 的氨基酸2-130；(105)靶向序列包含SEQ ID NO:
93的氨基酸10-130； (106)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸20-130；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸30-130；或(108)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:122具有至少85％
同一性的氨基酸序列。

[1552] 实施方案2是实施方案1所述的融合蛋白，其中融合蛋白包含: (1)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸2-30；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸4-30；(3)靶向序列
包含SEQ ID NO:59的氨基酸 6-30；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸2-33；(5)靶向序列包含 SEQ ID NO:61的氨基酸5-33；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸10-33；
(7)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸15-33；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸
2-35；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:63 的氨基酸5-35；(10)靶向序列包含SEQ ID NO:63的
氨基酸8-35；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸10-35；(12)靶向序列包含SEQ ID 
NO:63的氨基酸15-35；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸2-24； (14)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸5-24；(15)靶向序列包含 SEQ ID NO:67的氨基酸2-27；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸5-27；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸10-27；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸2-38；(19)靶向序列包含SEQ ID NO: 69的氨基酸5-
38；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸10-38；(21) 靶向序列包含SEQ ID NO:69的
氨基酸15-38；(22)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸2-42；(23)靶向序列包含SEQ ID 
NO:75的氨基酸5-42； (24)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸10-42；(25)靶向序列包含 SEQ ID NO:75的氨基酸15-42；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸20-42；(27)靶向
序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸25-42；(28)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸2-24；
(29)靶向序列包含SEQ ID NO: 7的氨基酸5-24；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸
2-38；(31) 靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸5-38；(32)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸10-38；(33)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸 15-38；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸20-38；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸2-28；(36)靶向序列包含
SEQ ID NO:87 的氨基酸5-28；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸10-28；(38) 靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸2-28；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸5-28；
(40)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸10-28；(41)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基
酸2-93；(42)靶向序列包含 SEQ ID NO:91的氨基酸10-93；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:
91的氨基酸20-93；(44)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸30-93；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸40-93；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸50-93；(47)靶向序列
包含SEQ ID NO:91的氨基酸 60-93；(48)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸2-130；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸10-130；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:93 的氨基酸
20-130；或(51)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸30-130。

[1553] 实施方案3是融合蛋白包含至少一种目标蛋白或肽，并且:(1) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸20-33；(2)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸21-33；
(3)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸23-31；(4)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:96的氨基酸1-15；(5)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:96的氨基酸1-13；(6)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸12-25；(7)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸
13-25；(8)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸15-23；(9)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:97的氨基酸1-15；(10)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-13；(11) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸23-36；(12)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
5的氨基酸23-34；(13)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸24-36；(14)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸26-34；(15)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸
13-26；(16) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸13-24；(17)靶向序列由下列组
成：SEQ ID NO:7的氨基酸14-26；(18)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸16-24；
(19)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-22；(20)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-20；(21) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸10-22；(22)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸12-20；(23)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:105的氨基酸1-15；(24)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:105 的氨基酸1-13；(25)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸 18-31；(26)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸
18-29；(27) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸19-31；(28)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-15；(29)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-13；
(30)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-31；(31)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-29； (32)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸19-31；(33)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸21-29；(34)靶向序列由下列组成：SEQ ID 
NO:99的氨基酸1-15；(35)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 99的氨基酸1-13；(36)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸 28-41；(37)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸28-39；(38) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸29-41；(39)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸31-39；(40)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:17的氨基酸12-25；(41)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 17的氨基酸13-25；(42)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:100的氨基酸1-15；(43)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸18-
31；(44) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸18-29；(45)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:19的氨基酸19-31；(46)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:19的氨基酸21-29；
(47)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 21的氨基酸18-31；(48)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸 18-29；(49)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸19-31；(50) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸21-29；(51)靶向序列由下列组成：SEQ ID 
NO:101的氨基酸1-15；(52)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:101的氨基酸1-13；(53)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 23的氨基酸9-22；(54)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸 9-20；(55)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸10-22；(56)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸12-20；(57)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:102的氨基酸1-15；(58)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:102的氨基酸1-13；(59)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25 的氨基酸9-22；(60)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸9-20； (61)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸10-22；(62)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸12-20；(63)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:103的氨基酸1-15；(64)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:103的氨基酸1-13；(65)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
27的氨基酸15-28；(66)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸15-26； (67)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸16-28；(68)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸18-26；(69)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:104的氨基酸1-15；(70)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:104的氨基酸1-13；(71)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:33的氨基酸
1-13；(72)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:33的氨基酸1-11；(73) 靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:33的氨基酸3-11；(74)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸1-14；(75)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸1-12；(76)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
35的氨基酸2-14；(77)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:43的氨基酸14-27； (78)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:43的氨基酸14-25；(79)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:43的氨基酸15-27；(80)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸20-33；(81)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸20-31；(82)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸21-
33；(83)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:106的氨基酸1-15； (84)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:106的氨基酸1-13；(85)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:47的氨基酸28-41；
(86)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:47的氨基酸28-39；(87)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸18-31；(88)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸18-29；(89)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸19-31； (90)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨
基酸18-31；(91)靶向序列包含 SEQ ID NO:61的氨基酸18-29；(92)靶向序列包含SEQ ID 
NO:61的氨基酸19-31；(93)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸9-22；(94)靶向序列包含
SEQ ID NO:65的氨基酸9-20；(95)靶向序列包含SEQ ID NO: 65的氨基酸10-22；(96)靶向
序列包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-15； (97)靶向序列包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-13；
(98)靶向序列包含 SEQ ID NO:67的氨基酸12-25；(99)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基
酸12-23；(100)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸13-25；(101) 靶向序列包含SEQ ID 
NO:67的氨基酸15-23；(102)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸23-36；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸 23-34；(104)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸24-36；(105)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸26-34；(106)靶向序列包含SEQ ID NO: 75的氨基酸
27-40；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-38； (108)靶向序列包含SEQ ID NO:
77的氨基酸9-22；(109)靶向序列包含 SEQ ID NO:77的氨基酸9-20；(110)靶向序列包含
SEQ ID NO:77的氨基酸10-22；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸12-20；(112) 靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸23-36；(113)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸23-
34；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸 24-36；(115)靶向序列包含SEQ ID NO:81
的氨基酸26-34；(116)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸13-26；(117)靶向序列包含SEQ ID NO: 87的氨基酸13-24；或(118)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸 14-26。

[1554] 实施方案4是融合蛋白包含催化一氧化氮产生的酶或核酸结合蛋白或肽，并且:(1)靶向序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其
中与氨基酸25-35的同一性至少约 54％；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35；(3)靶向序列包含 SEQ ID NO:1的氨基酸20-35；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:1；(5)外孢壁蛋
白包含与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的氨基酸序列；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:1
的氨基酸2-35；(7)靶向序列包含SEQ ID NO:1 的氨基酸5-35；(8)靶向序列包含SEQ ID 
NO:1的氨基酸8-35；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸10-35；(10)靶向序列包含SEQ ID NO: 1的氨基酸15-35；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-27；(12) 靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-27；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:3；(14)外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的氨基酸序列；(15)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸
2-27；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸5-27；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨
基酸8-27；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸10-27；(19)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-38；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:5 的氨基酸23-38；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:5；(22)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:6具有至少85％同一性的氨基酸序列；(23)靶向序列包含 SEQ ID NO:5的氨基酸2-38；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸 5-38；(25)
靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸8-38；(26)靶向序列包含 SEQ ID NO:5的氨基酸10-
38；(27)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸 15-38；(28)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨
基酸20-38；(29)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-28；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸13-28；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:7；(32)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:8具
有至少85％同一性的氨基酸序列；(33)靶向序列包含 SEQ ID NO:7的氨基酸2-28；(34)靶
向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 5-28；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸8-28；
(36)靶向序列包含 SEQ ID NO:7的氨基酸10-28；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸
1-24；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸9-24；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:9；(40)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(41)靶向序列包含
SEQ ID NO:9的氨基酸 2-24；(42)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸8-24；(44)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸1-33；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸18-33；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:11；(47)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:12具有至少85％同一性的氨基酸序列；(48)靶向序列包含SEQ ID NO:11
的氨基酸2-33；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33；(51)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(52)靶向序列包含
SEQ ID NO:11的氨基酸15-33；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸1-33；(54)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸18-33；(55)靶向序列包含SEQ ID NO:13；(56)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:14具有至少85％同一性的氨基酸序列；(57)靶向序列包含SEQ ID NO:13的
氨基酸2-33；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:13 的氨基酸5-33；(59)靶向序列包含SEQ ID 
NO:13的氨基酸8-33；(60)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸10-33；(61)靶向序列包含
SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(62)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸1-43； (63)靶向
序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸28-43；(64)靶向序列包含 SEQ ID NO:15；(65)外孢壁蛋
白包含与SEQ ID NO:16具有至少85％同一性的氨基酸序列；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:
15的氨基酸2-43；(67) 靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸5-43；(68)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-43； (70)靶向序列
包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；(71)靶向序列包含 SEQ ID NO:15的氨基酸20-43；(72)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-
27；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸12-27；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:17；
(76)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:18具有至少85％同一性的氨基酸序列；(77)靶向序列包
含SEQ ID NO:17的氨基酸2-27；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(79)靶向
序列包含SEQ ID NO:17 的氨基酸8-27；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸10-27；
(81) 靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸1-33；(82)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基
酸18-33；(83)靶向序列包含SEQ ID NO:19；(84)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:20具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-33；(86)靶向序列
包含SEQ ID NO: 19的氨基酸5-33；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸8-33；(88) 
靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸10-33；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸15-
33；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸1-33； (91)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸18-33；(92)靶向序列包含 SEQ ID NO:21；(93)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:22具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸2-33；(95) 靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸8-33；
(97)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸10-33； (98)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基
酸15-33；(99)靶向序列包含 SEQ ID NO:23的氨基酸1-24；(100)靶向序列SEQ ID NO:23的氨基酸 9-24；(101)靶向序列包含SEQ ID NO:23；(102)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:24具有至少85％同一性的氨基酸序列；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸2-24；(104)
靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸 5-24；(105)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-
24；(106)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸1-24；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:25 的氨基酸9-24；(108)靶向序列包含SEQ ID NO:25；(109)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:26具
有至少85％同一性的氨基酸序列；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸2-24；(111)
靶向序列包含SEQ ID NO:25 的氨基酸5-24；(112)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-
24；(113) 靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸1-30；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸15-30；(115)靶向序列包含SEQ ID NO:27；(116)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:28具有至少85％同一性的氨基酸序列；(117) 靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸2-30；(118)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(119)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸8-
30； (120)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30；(121)靶向序列包含 SEQ ID NO:29的氨基酸1-33；(122)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸18-33；(123)靶向序列包含SEQ ID NO:29；(124)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:30具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(125)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸2-33；(126)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基
酸5-33；(127)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(128)靶向序列包含SEQ ID NO:
29的氨基酸10-33；(129)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(130)靶向序列包含
SEQ ID NO:31的氨基酸 1-24；(131)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸9-24；(132)靶向序列包含SEQ ID NO:31；(133)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:32具有至少 85％同一性的氨
基酸序列；(134)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸 2-24；(135)靶向序列包含SEQ ID 
NO:31的氨基酸5-24；(136)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；(137)靶向序列包含SEQ ID NO:33 的氨基酸1-15；(138)靶向序列包含SEQ ID NO:33；(139)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:34具有至少85％同一性的氨基酸序列；(140)靶向序列包含SEQ ID NO:35的氨
基酸1-16；(141)靶向序列包含SEQ ID NO:35； (142)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:36具有至少85％同一性的氨基酸序列；(143)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸1-29；(144)靶
向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸14-29；(145)靶向序列包含SEQ ID NO:43； (146)外孢
壁蛋白包含与SEQ ID NO:44具有至少85％同一性的氨基酸序列；(147)靶向序列包含SEQ 
ID NO:43的氨基酸2-29；(148)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸5-29；(149)靶向序列
包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(150)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸10-29；(151) 靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸1-35；(152)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸20-
35；(153)靶向序列包含SEQ ID NO:45；(154)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:46具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(155) 靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸2-35；(156)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(157)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35； 
(158)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸10-35；(159)靶向序列包含 SEQ ID NO:45的氨
基酸15-35；(160)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸1-43；(161)靶向序列包含SEQ ID 
NO:47的氨基酸28-43；(162) 靶向序列包含SEQ ID NO:47；(163)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:48 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(164)靶向序列包含SEQ ID NO:47 的氨基酸2-
43；(165)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(166) 靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(167)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸10-43；(168)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 15-43；(169)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸20-43；(170)靶向序列
包含SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(171)靶向序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸1-32；
(172)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸17-32； (173)靶向序列包含SEQ ID NO:49；
(174)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:50具有至少85％同一性的氨基酸序列；(175)靶向序列
包含SEQ ID NO:49的氨基酸2-32；(176)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32； (177)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(178)靶向序列包含 SEQ ID NO:49的氨基酸
10-32；(179)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸15-32；(180)靶向序列包含SEQ ID NO:
51的氨基酸1-33；(181) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸18-33；(182)靶向序列包含
SEQ ID NO:51；(183)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:52具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(184)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸2-33；(185) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨
基酸5-33；(186)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸8-33；(187)靶向序列包含SEQ ID 
NO:51的氨基酸 10-33；(188)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸15-33；(189)靶向序列
包含SEQ ID NO:53的氨基酸1-33；(190)靶向序列包含SEQ ID NO: 53的氨基酸18-33；
(191)靶向序列包含SEQ ID NO:53；(192)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:54具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(193)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33；(194)靶向序列包含
SEQ ID NO: 53的氨基酸5-33；(195)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-33； (196)靶
向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(197)靶向序列包含 SEQ ID NO:53的氨基酸15-
33；(198)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸1-30；(199)靶向序列包含SEQ ID NO:55的
氨基酸15-30；(200) 靶向序列包含SEQ ID NO:55；(201)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:56 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(202)靶向序列包含SEQ ID NO:55 的氨基酸2-30；
(203)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；(204) 靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨
基酸8-30；(205)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸10-30；(206)靶向序列包含SEQ ID 
NO:57的氨基酸 1-130；(207)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸115-130；(208)靶向序
列包含SEQ ID NO:57；(209)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少85％同一性的氨基
酸序列；(210)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸2-130；(211)靶向序列包含SEQ ID NO:
57的氨基酸5-130；(212) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-130；(213)靶向序列包
含SEQ ID NO:57的氨基酸20-130；(214)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸30-130；
(215)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130；(216) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的
氨基酸50-130；(217)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸60-130；(218)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130；(219)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130；(220) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；(221)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸100-
130；(222)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-130；(223)外孢壁蛋白片段包含与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列；(224)靶向序列包含SEQ ID NO:96；(225)靶
向序列包含SEQ ID NO:97；(226)靶向序列包含SEQ ID NO:98；(227)靶向序列包含SEQ ID NO:99；(228)靶向序列包含SEQ ID NO:100；(229) 靶向序列包含SEQ ID NO:101；(230)靶向序列包含SEQ ID NO:102； (231)靶向序列包含SEQ ID NO:103；(232)靶向序列包含SEQ ID NO: 104；(233)靶向序列包含SEQ ID NO:105；(234)靶向序列包含SEQ ID NO:106；
(235)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:108具有至少85％同一性的氨基酸序列；(236)外孢壁
蛋白包含与SEQ ID NO:109具有至少85％同一性的氨基酸序列；(237)外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO:110具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(238)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
111具有至少85％同一性的氨基酸序列；(239)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:112 具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(240)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 113具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(241)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:114具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(242)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:115具有至少85％同一性的氨基酸序列；(243)外
孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:116具有至少85％同一性的氨基酸序列；(244)外孢壁蛋白包含
与SEQ ID NO:117具有至少85％同一性的氨基酸序列；(245) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:118具有至少85％同一性的氨基酸序列； (246)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:119具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(247)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:120具有至少85％同一
性的氨基酸序列；(248)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:121具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(249)靶向序列包含氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸 22-31；(250)靶向序列包含SEQ ID 
NO:1的氨基酸22-33；(251)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-31；(252)靶向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸14-23；(253)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸14-25；或 (254)
靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-23。

[1555] 实施方案5是融合蛋白，包含抗原或修复酶，并且:(1)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-35；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸5-35；(3)靶向序列包含SEQ ID NO:
1的氨基酸8-35；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸10-35；(5)靶向序列包含SEQ ID 
NO:1 的氨基酸15-35；(6)靶向序列包含氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸22-31； (7)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-33；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-31；(9)靶向
序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸2-27； (10)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸5-27；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸8-27；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸10-27； (13)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸14-23；(14)靶向序列包含 SEQ ID NO:3的氨基酸
14-25；(15)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-23；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:5的
氨基酸2-38；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸5-38；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:
5的氨基酸8-38；(19)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸10-38；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸15-38；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:5 的氨基酸20-38；(22)靶向序列包含
SEQ ID NO:7的氨基酸2-28；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-28；(24)靶向序列
包含SEQ ID NO:7的氨基酸8-28；(25)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸10-28； (26)靶
向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸1-24；(27)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸9-24；
(28)靶向序列包含SEQ ID NO:9；(29)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少85％同一
性的氨基酸序列；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸2-24；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:9 的氨基酸5-24；(32)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸8-24；(33)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸1-33；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸18-33；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:11；(36)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:12具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸2-33；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨
基酸5-33；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33； (40)靶向序列包含SEQ ID NO:
11的氨基酸10-33；(41)靶向序列包含 SEQ ID NO:11的氨基酸15-33；(42)靶向序列包含
SEQ ID NO:13的氨基酸1-33；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸18-33；(44)靶向序列包含SEQ ID NO:13；(45)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:14具有至少85％同一性的氨基酸
序列；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸 2-33；(47)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸5-33；(48)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；(49)靶向序列包含SEQ ID 
NO:13的氨基酸10-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(51)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸1-43；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸28-43；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:15；(54)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:16具有至少85％同一性的氨基酸
序列；(55)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸2-43；(56)靶向序列包含SEQ ID NO:15 的氨基酸5-43；(57)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43；(58)靶向序列包含SEQ ID 
NO:15的氨基酸10-43；(59)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；(60)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸20-43； (61)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(62)靶向序列包含 SEQ ID NO:17的氨基酸1-27；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸12-27；
(64)靶向序列包含SEQ ID NO:17；(65)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:18具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(66)靶向序列包含 SEQ ID NO:17的氨基酸2-27；(67)靶向序列包含
SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(68)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸8-27；(69)靶向序
列包含SEQ ID NO:17的氨基酸10-27；(70)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸1-33；
(71)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸18-33；(72) 靶向序列包含SEQ ID NO:19；(73)
外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:20具有至少85％同一性的氨基酸序列；(74)靶向序列包含
SEQ ID NO:19的氨基酸2-33；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-33；(76)靶向序
列包含SEQ ID NO:19的氨基酸8-33；(77)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸10-33；
(78)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸15-33； (79)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基
酸1-33；(80)靶向序列包含 SEQ ID NO:21的氨基酸18-33；(81)靶向序列包含SEQ ID NO:
21；(82) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:22具有至少85％同一性的氨基酸序列； (83)靶向
序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸2-33；(84)靶向序列包含 SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；
(85)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸8-33；(86)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸
10-33；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸15-33；(88)靶向序列包含SEQ ID NO: 23的氨基酸1-24；(89)靶向序列SEQ ID NO:23的氨基酸9-24；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:
23；(91)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:24具有至少85％同一性的氨基酸序列；(92)靶向序
列包含SEQ ID NO:23的氨基酸2-24；(93)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸5-24；(94)
靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(95)靶向序列包含SEQ ID NO:25 的氨基酸1-
24；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸9-24；(97)靶向序列包含SEQ ID NO:25；(98)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:26具有至少85％同一性的氨基酸序列；(99)靶向序列包含
SEQ ID NO:25的氨基酸2-24；(100)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸5-24；(101)靶向
序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-24；(102)靶向序列包含SEQ ID NO: 27的氨基酸1-30；
(103)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸15-30； (104)靶向序列包含SEQ ID NO:27；
(105)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:28具有至少85％同一性的氨基酸序列；(106)靶向序列
包含SEQ ID NO:27的氨基酸2-30；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30； (108)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸8-30；(109)靶向序列包含 SEQ ID NO:27的氨基酸
10-30；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-33；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸18-33；(112) 靶向序列包含SEQ ID NO:29；(113)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
30 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:29 的氨基酸2-33；
(115)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(116) 靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨
基酸8-33；(117)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；(118)靶向序列包含SEQ ID 
NO:29的氨基酸 15-33；(119)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-24；(120)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸9-24；(121)靶向序列包含SEQ ID NO:31；(122)外孢壁蛋白包含
与SEQ ID NO:32具有至少85％同一性的氨基酸序列；(123)靶向序列包含SEQ ID NO:31的
氨基酸2-24；(124)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸5-24；(125)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；(126)靶向序列包含SEQ ID NO:33的氨基酸1-15； (127)靶向序列包
含SEQ ID NO:33；(128)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:34具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(129)靶向序列包含SEQ ID NO:35的氨基酸1-16；(130)靶向序列包含SEQ ID NO:35；
(131)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:36具有至少85％同一性的氨基酸序列；(132)靶向序列
包含SEQ ID NO:43的氨基酸1-29；(133)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸14-29；(134)靶向序列包含SEQ ID NO:43；(135)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:44具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(136) 靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-29；(137)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸5-29；(138)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29； (139)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸10-29；(140)靶向序列包含 SEQ ID NO:45的氨基酸1-35；
(141)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸20-35；(142)靶向序列包含SEQ ID NO:45；
(143)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:46具有至少85％同一性的氨基酸序列；(144)靶向序列
包含SEQ ID NO:45的氨基酸2-35；(145)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(146)
靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35；(147)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸10-
35；(148)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸15-35；(149)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 1-43；(150)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸28-43；(151)靶向序列包含SEQ 
ID NO:47；(152)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:48具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(153)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸2-43；(154)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基
酸5-43；(155)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(156)靶向序列包含SEQ ID NO: 
47的氨基酸10-43；(157)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸15-43； (158)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸20-43；(159)靶向序列包含 SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(160)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸1-32；(161)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸17-
32；(162) 靶向序列包含SEQ ID NO:49；(163)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:50 具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(164)靶向序列包含SEQ ID NO:49 的氨基酸2-32；(165)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32；(166) 靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；
(167)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(168)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨
基酸 15-32；(169)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸1-33；(170)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸18-33；(171)靶向序列包含SEQ ID NO: 51；(172)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:52具有至少85％同一性的氨基酸序列；(173)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸2-
33；(174)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(175)靶向序列包含SEQ ID NO: 51的氨基酸8-33；(176)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸10-33； (177)靶向序列包含SEQ 
ID NO:51的氨基酸15-33；(178)靶向序列包含 SEQ ID NO:53的氨基酸1-33；(179)靶向序
列包含SEQ ID NO:53的氨基酸18-33；(180)靶向序列包含SEQ ID NO:53；(181)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:54具有至少85％同一性的氨基酸序列；(182)靶向序列包含SEQ ID NO:
53的氨基酸2-33；(183)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸5-33；(184)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-33；(185)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(186)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；(187)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸 1-30；
(188)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸15-30；(189)靶向序列包含SEQ ID NO:55；
(190)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:56具有至少85％同一性的氨基酸序列；(191)靶向序列
包含SEQ ID NO:55的氨基酸2-30；(192)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；(193)
靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；(194)靶向序列包含SEQ ID NO: 55的氨基酸
10-30；(195)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸1-130； (196)靶向序列包含SEQ ID NO:
57的氨基酸115-130；(197)靶向序列包含SEQ ID NO:57；(198)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:58具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(199)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 2-
130；(200)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130；(201)靶向序列包含SEQ ID NO:57
的氨基酸10-130；(202)靶向序列包含SEQ ID NO: 57的氨基酸20-130；(203)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 30-130；(204)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130；(205)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(206)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸
60-130；(207)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130；(208)靶向序列包含SEQ ID 
NO:57的氨基酸80-130；(209) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；(210)靶向序
列包含SEQ ID NO:57的氨基酸100-130；(211)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-
130；(212)靶向序列包含SEQ ID NO:97；(213)靶向序列包含 SEQ ID NO:98；(214)靶向序列包含SEQ ID NO:99；(215)靶向序列包含SEQ ID NO:100；(216)靶向序列包含SEQ ID NO:
101；(217)靶向序列包含SEQ ID NO:102；(218)靶向序列包含SEQ ID NO:103；(219)靶向序列包含SEQ ID NO:104；(220)靶向序列包含SEQ ID NO:105；(221) 靶向序列包含SEQ ID 
NO:106；(222)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 108具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(223)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:109具有至少85％同一性的氨基酸序列；(224)外孢壁
蛋白包含与 SEQ ID NO:110具有至少85％同一性的氨基酸序列；(225)外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO:111具有至少85％同一性的氨基酸序列；(226)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
112具有至少85％同一性的氨基酸序列；(227) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:113具有至少
85％同一性的氨基酸序列； (228)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:114具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(229)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:115具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(230)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:116具有至少85％同一性的氨基酸序列；(231)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:117具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(232)外孢壁蛋白包含
与SEQ ID NO:118具有至少85％同一性的氨基酸序列；(233)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
119 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(234)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 120具有至
少85％同一性的氨基酸序列；或(235)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:121具有至少85％同一
性的氨基酸序列。

[1556] 实施方案6是实施方案1-3中任一项所述的融合蛋白，其中目标蛋白或肽包括抗原或修复酶。

[1557] 实施方案7是实施方案1-3中任一项所述的融合蛋白，其中目标蛋白或肽包括适于在水力压裂流体中破裂乳液或胶体的酶、或抗菌性蛋白或肽。

[1558] 实施方案8是融合蛋白，包含适于在水力压裂流体中破裂乳液或胶体的酶或抗菌性蛋白或肽，并且:(1)靶向序列包含与SEQ ID NO:1 的氨基酸20-35具有至少约43％同一
性的氨基酸序列，其中与氨基酸 25-35的同一性至少约54％；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:
1的氨基酸 1-35；(3)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-35；(4)靶向序列包含 SEQ ID NO:1；(5)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的氨基酸序列；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-35；(7)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸5-35；(8)靶向序
列包含SEQ ID NO: 1的氨基酸8-35；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸10-35；(10) 
靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸15-35；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-27；
(12)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-27； (13)靶向序列包含SEQ ID NO:3；(14)外
孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:4 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(15)靶向序列包含SEQ 
ID NO:3的氨基酸2-27；(16)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸5-27；(17)靶向序列包含
SEQ ID NO:3的氨基酸8-27；(18)靶向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸10-27；(19)靶向序
列包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-38；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸23-38；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:5；(22)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:6具有至少85％同一性的氨基
酸序列；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸2-38；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:5的
氨基酸5-38；(25)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸8-38；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:
5的氨基酸10-38；(27)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸15-38；(28)靶向序列包含SEQ 
ID NO:5的氨基酸20-38；(29)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-28；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸13-28；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:7；(32)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的氨基酸序列；(33)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸2-
28；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-28；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基
酸8-28；(36)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸10-28；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸1-24；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸9-24；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:
9；(40)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:10具有至少85％同一性的氨基酸序列；(41)靶向序列包含 SEQ ID NO:9的氨基酸2-24；(42)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸 5-24；(43)靶
向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸8-24；(44)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸1-33；
(45)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸18-33；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:11；(47)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:12具有至少85％同一性的氨基酸序列；(48)靶向序列包含 
SEQ ID NO:11的氨基酸2-33；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(50)靶向序
列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33；(51)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:11 的氨基酸15-33；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸1-
33；(54) 靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸18-33；(55)靶向序列包含SEQ ID NO:13；
(56)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:14具有至少85％同一性的氨基酸序列；(57)靶向序列包
含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸5-33；(59)靶向
序列包含SEQ ID NO:13 的氨基酸8-33；(60)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸10-33；
(61) 靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(62)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基
酸1-43；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸28-43； (64)靶向序列包含SEQ ID NO:
15；(65)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 16具有至少85％同一性的氨基酸序列；(66)靶向序列包含SEQ ID NO: 15的氨基酸2-43；(67)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸5-43；(68) 靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-
43；(70)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43； (71)靶向序列包含SEQ ID NO:15的
氨基酸20-43；(72)靶向序列包含 SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-27；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸12-27；(75)靶向序列包含
SEQ ID NO:17；(76)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:18具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(77)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸 2-27；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基
酸5-27；(79)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸8-27；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:17
的氨基酸10-27；(81)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸1-33；(82)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸18-33；(83)靶向序列包含SEQ ID NO:19；(84)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:20具有至少85％同一性的氨基酸序列；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-33；
(86)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-33；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:19 的氨基
酸8-33；(88)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸10-33；(89) 靶向序列包含SEQ ID NO:
19的氨基酸15-33；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸1-33；(91)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸18-33； (92)靶向序列包含SEQ ID NO:21；(93)外孢壁蛋白包含与SEQ 
ID NO: 22具有至少85％同一性的氨基酸序列；(94)靶向序列包含SEQ ID NO: 21的氨基酸
2-33；(95)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(96) 靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸8-33；(97)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸10-33；(98)靶向序列包含SEQ ID 
NO:21的氨基酸 15-33；(99)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸1-24；(100)靶向序列 
SEQ ID NO:23的氨基酸9-24；(101)靶向序列包含SEQ ID NO:23；(102) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:24具有至少85％同一性的氨基酸序列； (103)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨
基酸2-24；(104)靶向序列包含 SEQ ID NO:23的氨基酸5-24；(105)靶向序列包含SEQ ID 
NO:23的氨基酸8-24；(106)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸1-24；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸9-24；(108)靶向序列包含SEQ ID NO:25；(109)外孢壁蛋白包含与
SEQ ID NO:26具有至少85％同一性的氨基酸序列；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨
基酸2-24；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸5-24；(112)靶向序列包含SEQ ID 
NO:25的氨基酸8-24；(113)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸1-30； (114)靶向序列包
含SEQ ID NO:27的氨基酸15-30；(115)靶向序列包含 SEQ ID NO:27；(116)外孢壁蛋白包
含与SEQ ID NO:28具有至少85％同一性的氨基酸序列；(117)靶向序列包含SEQ ID NO:27
的氨基酸2-30；(118)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(119)靶向序列包含 SEQ ID NO:27的氨基酸8-30；(120)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30；(121)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-33；(122)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸18-33；(123)靶向序列包含SEQ ID NO:29；(124)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:30具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(125)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸2-33；(126)靶向序列包含SEQ 
ID NO:29的氨基酸5-33；(127)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(128)靶向序列
包含SEQ ID NO:29的氨基酸 10-33；(129)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；
(130)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-24；(131)靶向序列包含SEQ ID NO: 31的氨
基酸9-24；(132)靶向序列包含SEQ ID NO:31；(133)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:32具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(134)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸2-24；(135)靶
向序列包含SEQ ID NO: 31的氨基酸5-24；(136)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-
24； (137)靶向序列包含SEQ ID NO:33的氨基酸1-15；(138)靶向序列包含 SEQ ID NO:33；
(139)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:34具有至少85％同一性的氨基酸序列；(140)靶向序列
包含SEQ ID NO:35的氨基酸1-16； (141)靶向序列包含SEQ ID NO:35；(142)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:36具有至少85％同一性的氨基酸序列；(143)靶向序列包含SEQ ID NO:43
的氨基酸1-29；(144)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸 14-29；(145)靶向序列包含SEQ ID NO:43；(146)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:44具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(147)靶向序列包含 SEQ ID NO:43的氨基酸2-29；(148)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨
基酸5-29；(149)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(150)靶向序列包含SEQ ID 
NO:43的氨基酸10-29；(151)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸1-35；(152)靶向序列包
含SEQ ID NO:45的氨基酸 20-35；(153)靶向序列包含SEQ ID NO:45；(154)外孢壁蛋白包
含与 SEQ ID NO:46具有至少85％同一性的氨基酸序列；(155)靶向序列包含SEQ ID NO:45
的氨基酸2-35；(156)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(157)靶向序列包含SEQ 
ID NO:45的氨基酸8-35；(158)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸10-35；(159)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸15-35；(160)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 1-43；
(161)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸28-43；(162)靶向序列包含SEQ ID NO:47；
(163)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:48具有至少85％同一性的氨基酸序列；(164)靶向序列
包含SEQ ID NO:47的氨基酸2-43；(165)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(166)
靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(167)靶向序列包含SEQ ID NO: 47的氨基酸
10-43；(168)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸15-43； (169)靶向序列包含SEQ ID NO:
47的氨基酸20-43；(170)靶向序列包含 SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(171)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸1-32；(172)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸17-32；(173) 靶
向序列包含SEQ ID NO:49；(174)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:50 具有至少85％同一性的
氨基酸序列；(175)靶向序列包含SEQ ID NO:49 的氨基酸2-32；(176)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32；(177) 靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(178)靶向序列包
含SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(179)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸 15-32；(180)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸1-33；(181)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸18-
33；(182)靶向序列包含SEQ ID NO: 51；(183)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:52具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(184)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸2-33；(185)靶向序
列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(186)靶向序列包含SEQ ID NO: 51的氨基酸8-33；
(187)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸10-33； (188)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨
基酸15-33；(189)靶向序列包含 SEQ ID NO:53的氨基酸1-33；(190)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸18-33；(191)靶向序列包含SEQ ID NO:53；(192)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:54具有至少85％同一性的氨基酸序列；(193)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-
33；(194)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸5-33；(195)靶向序列包含SEQ ID NO:53的
氨基酸8-33；(196)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(197)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；(198)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸 1-30；(199)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸15-30；(200)靶向序列包含SEQ ID NO:55；(201)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:56具有至少85％同一性的氨基酸序列；(202)靶向序列包含SEQ ID NO:55的
氨基酸2-30；(203)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；(204)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；(205)靶向序列包含SEQ ID NO: 55的氨基酸10-30；(206)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸1-130； (207)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸115-130；
(208)靶向序列包含SEQ ID NO:57；(209)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少 85％
同一性的氨基酸序列；(210)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 2-130；(211)靶向序列
包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130；(212)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-130；
(213)靶向序列包含SEQ ID NO: 57的氨基酸20-130；(214)靶向序列包含SEQ ID NO:57的
氨基酸 30-130；(215)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130；(216)靶向序列包含
SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(217)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸60-130；(218)
靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130；(219)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸
80-130；(220) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；(221)靶向序列包含SEQ ID 
NO:57的氨基酸100-130；(222)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-130；(223)外孢壁蛋白片段包含与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸序列；(224)靶向序列包含SEQ ID NO:96；(225)靶向序列包含SEQ ID NO:97；(226)靶向序列包含SEQ ID NO:98；(227)靶向序列包含SEQ ID NO:99；(228)靶向序列包含SEQ ID NO:100；(229) 靶向序列包含SEQ 
ID NO:101；(230)靶向序列包含SEQ ID NO:102； (231)靶向序列包含SEQ ID NO:103；
(232)靶向序列包含SEQ ID NO: 104；(233)靶向序列包含SEQ ID NO:105；(234)靶向序列
包含SEQ ID NO:106；(235)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:108具有至少85％同一性的氨基
酸序列；(236)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:109具有至少85％同一性的氨基酸序列；(237)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:110具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(238)外孢壁蛋白
包含与SEQ ID NO:111具有至少85％同一性的氨基酸序列；(239)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:112 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(240)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 113具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(241)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:114具有至少85％同一
性的氨基酸序列；(242)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:115具有至少85％同一性的氨基酸
序列；(243)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:116具有至少85％同一性的氨基酸序列；(244)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:117具有至少85％同一性的氨基酸序列；(245) 外孢壁蛋白包
含与SEQ ID NO:118具有至少85％同一性的氨基酸序列； (246)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:119具有至少85％同一性的氨基酸序列；(247)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:120具有至
少85％同一性的氨基酸序列；(248)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:121具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(249)靶向序列包含氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸 22-31；(250)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-33；(251)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-31；(252)靶
向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸14-23；(253)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸14-
25；或 (254)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-23。

[1559] 实施方案9是实施方案5-8中任一项所述的融合蛋白，其中靶向序列包含:(1)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-35；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸5-35；(3)靶
向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸8-35；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸10-35；(5)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸15-35；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸2-27；
(7)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸5-27；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸8-
27；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸10-27；(10)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸2-38；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸5-38；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:5的
氨基酸8-38；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸10-38； (14)靶向序列包含SEQ ID 
NO:5的氨基酸15-38；(15)靶向序列包含 SEQ ID NO:5的氨基酸20-38；(16)靶向序列包含
SEQ ID NO:7的氨基酸 2-28；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-28；(18)靶向序列包含 SEQ ID NO:7的氨基酸8-28；(19)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 10-28；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸2-24；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；
(22)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸8-24；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸
2-33；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(25)靶向序列包含SEQ ID NO:11 的氨基酸8-33；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(27) 靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸15-33；(28)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；(29)靶向序列包含
SEQ ID NO:13的氨基酸5-33； (30)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；(31)靶向序列包含 SEQ ID NO:13的氨基酸10-33；(32)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；
(33)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸2-43；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸
5-43；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43；(36)靶向序列包含SEQ ID NO:15的
氨基酸10-43； (37)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；(38)靶向序列包含 SEQ 
ID NO:15的氨基酸20-43；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(40)靶向序列
包含SEQ ID NO:17的氨基酸2-27；(41)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(42)靶
向序列包含SEQ ID NO: 17的氨基酸8-27；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸10-
27；(44) 靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-33；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-33；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸8-33； (47)靶向序列包含SEQ ID NO:
19的氨基酸10-33；(48)靶向序列包含 SEQ ID NO:19的氨基酸15-33；(49)靶向序列包含
SEQ ID NO:21的氨基酸2-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(51)靶向序
列包含SEQ ID NO:21的氨基酸8-33；(52)靶向序列包含SEQ ID NO: 21的氨基酸10-33；
(53)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸15-33； (54)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基
酸2-24；(55)靶向序列包含 SEQ ID NO:23的氨基酸5-24；(56)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(57)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸2-24；(58)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸5-24；(59)靶向序列包含SEQ ID NO: 25的氨基酸8-24；(60)靶向序列包含
SEQ ID NO:27的氨基酸2-30；(61) 靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(62)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸8-30；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30； 
(64)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸2-33；(65)靶向序列包含 SEQ ID NO:29的氨基
酸5-33；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(67)靶向序列包含SEQ ID NO:29
的氨基酸10-33；(68)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(69)靶向序列包含SEQ 
ID NO: 31的氨基酸2-24；(70)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸5-24；(71) 靶向序列
包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；(72)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-29；(73)靶
向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸5-29； (74)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；
(75)靶向序列包含 SEQ ID NO:43的氨基酸10-29；(76)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基
酸2-35；(77)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:45
的氨基酸8-35；(79)靶向序列包含SEQ ID NO: 45的氨基酸10-35；(80)靶向序列包含SEQ 
ID NO:45的氨基酸15-35； (81)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸2-43；(82)靶向序列
包含 SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(83)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(84)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸10-43；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸15-
43；(86)靶向序列包含SEQ ID NO: 47的氨基酸20-43；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:47的
氨基酸25-43； (88)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸2-32；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(91)靶向序列包含
SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(92)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸15-32；(93)靶向
序列包含SEQ ID NO: 51的氨基酸2-33；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；
(95) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸8-33；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基
酸10-33；(97)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸 15-33；(98)靶向序列包含SEQ ID NO:
53的氨基酸2-33；(99)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸5-33；(100)靶向序列包含SEQ ID NO:53 的氨基酸8-33；(101)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(102) 靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸2-30；
(104)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸 5-30；(105)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨
基酸8-30；(106)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸10-30；(107)靶向序列包含SEQ ID 
NO:57 的氨基酸2-130；(108)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130； (109)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-130；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸20-130；
(111)靶向序列包含SEQ ID NO:57 的氨基酸30-130；(112)靶向序列包含SEQ ID NO:57的
氨基酸40-130； (113)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(114)靶向序列包含
SEQ ID NO:57的氨基酸60-130；(115)靶向序列包含SEQ ID NO:57 的氨基酸70-130；(116)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130； (117)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸
90-130；(118)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸100-130；或(119)靶向序列包含SEQ ID NO: 57的氨基酸110-130。

[1560] 实施方案10是实施方案9所述的融合蛋白，其中靶向序列包含:(1)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸2-24；(2)靶向序列包含 SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；(3)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸 8-24；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸2-33；(5)靶向序
列包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33；(7)靶
向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(8)靶向序列包含 SEQ ID NO:11的氨基酸15-
33；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；(10)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸5-33；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:13
的氨基酸10-33；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(14)靶向序列包含SEQ 
ID NO:15的氨基酸2-43；(15)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸5-43；(16)靶向序列包
含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43； (17)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-43；(18)靶
向序列包含 SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；(19)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸20-
43；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸2-27；(22)靶向序列包含SEQ ID NO: 17的氨基酸5-27；(23)靶向序列包含SEQ ID NO:
17的氨基酸8-27；(24) 靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸10-27；(25)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-33；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-33； (27)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸8-33；(28)靶向序列包含 SEQ ID NO:19的氨基酸10-33；(29)靶
向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸15-33；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸2-33；
(31)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(32)靶向序列包含SEQ ID NO: 21的氨基
酸8-33；(33)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸10-33；(34) 靶向序列包含SEQ ID NO:
21的氨基酸15-33；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸2-24；(36)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸5-24； (37)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(38)靶向序列包含 SEQ ID NO:25的氨基酸2-24；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸5-24；(40)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-24；(41)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸2-30；
(42)靶向序列包含SEQ ID NO: 27的氨基酸5-30；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基
酸8-30；(44) 靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:
29的氨基酸2-33；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(47)靶向序列包含SEQ 
ID NO:29的氨基酸8-33；(48)靶向序列包含 SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；(49)靶向序列
包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸2-24；(51)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸5-24；(52)靶向序列包含SEQ ID NO: 31的氨基酸8-24；
(53)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-29；(54) 靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基
酸5-29；(55)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(56)靶向序列包含SEQ ID NO:43
的氨基酸10-29； (57)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸2-35；(58)靶向序列包含 SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(59)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35；(60)靶向序列包
含SEQ ID NO:45的氨基酸10-35；(61)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸15-35；(62)靶
向序列包含SEQ ID NO: 47的氨基酸2-43；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；
(64) 靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(65)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基
酸10-43；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 15-43；(67)靶向序列包含SEQ ID NO:
47的氨基酸20-43；(68)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:49 的氨基酸2-32；(70)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32；(71)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(72)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸 15-32；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸2-33；
(75)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(76)靶向序列包含SEQ ID NO:51 的氨基
酸8-33；(77)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸10-33；(78) 靶向序列包含SEQ ID NO:
51的氨基酸15-33；(79)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸5-33； (81)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-33；(82)靶向序列包含 SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(83)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；(84)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸2-30；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；
(86)靶向序列包含SEQ ID NO: 55的氨基酸8-30；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基
酸10-30；(88) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸2-130；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:
57的氨基酸5-130；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 10-130；(91)靶向序列包含
SEQ ID NO:57的氨基酸20-130；(92)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸30-130；(93)靶
向序列包含SEQ ID NO: 57的氨基酸40-130；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-
130； (95)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸60-130；(96)靶向序列包含 SEQ ID NO:57的氨基酸70-130；(97)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130；(98)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；(99) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸100-130；或(100)靶向序列包含 SEQ ID NO:57的氨基酸110-130。

[1561] 实施方案11是实施方案5-10中任一项所述的融合蛋白，其中靶向序列包含：(1)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸8-24；(3)
靶向序列包含SEQ ID NO:11 的氨基酸5-33；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-
33；(5)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸15-33；(7)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸5-33； (8)靶向序列包含SEQ ID NO:13
的氨基酸8-33；(9)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸10-33；(10)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸 15-33；(11)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸5-43；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-43；(14)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸15-43；(15)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸20-43；
(16)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基
酸5-27； (18)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸8-27；(19)靶向序列包含 SEQ ID NO:
17的氨基酸10-27；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸5-33；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸8-33；(22)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸10-33；(23)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸15-33；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(25) 靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸8-33；(26)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸10-33；
(27)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸 15-33；(28)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基
酸5-24；(29)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:25 的氨基酸5-24；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-24；(32)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(33)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸8-30；(34)靶向序列包含
SEQ ID NO:27的氨基酸10-30； (35)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(36)靶向
序列包含 SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；
(38)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基
酸5-24；(40)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；(41)靶向序列包含SEQ ID NO:43
的氨基酸5-29； (42)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(43)靶向序列包含 SEQ 
ID NO:43的氨基酸10-29；(44)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸10-35；(47)靶向序列包含SEQ ID NO: 45的氨基酸15-35；(48)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；
(49) 靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基
酸10-43；(51)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 15-43；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:
47的氨基酸20-43；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(54)靶向序列包含SEQ ID NO:49 的氨基酸5-32；(55)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(56)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(57)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸15-32；(58)靶
向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33； (59)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸8-33；
(60)靶向序列包含 SEQ ID NO:51的氨基酸10-33；(61)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基
酸15-33；(62)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸5-33；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-33；(64)靶向序列包含SEQ ID NO: 53的氨基酸10-33；(65)靶向序列包含SEQ 
ID NO:53的氨基酸15-33； (66)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；(67)靶向序列
包含 SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；(68)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸10-30；(69)
靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130；(70)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-
130；(71)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸20-130；(72)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 30-130；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(75)靶向序列包含SEQ ID NO: 57的氨基酸60-130；(76)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130； (77)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130；
(78)靶向序列包含 SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；(79)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨
基酸100-130；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-130； (81)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸4-30；(82)靶向序列包含 SEQ ID NO:59的氨基酸6-30；(83)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸5-33；(84)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸10-33；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸15-33；(86)靶向序列包含SEQ ID NO: 63的氨基酸5-35；
(87)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸8-35；(88) 靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基
酸10-35；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸15-35；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:
65的氨基酸5-24； (91)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸5-27；(92)靶向序列包含 SEQ ID NO:67的氨基酸10-27；(93)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸5-38；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸10-38；(95)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸15-38；(96)靶
向序列包含SEQ ID NO: 75的氨基酸5-42；(97)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸10-
42；(98) 靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸15-42；(99)靶向序列包含SEQ ID NO:75的
氨基酸20-42；(100)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸 25-42；(101)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-24；(102)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸5-38；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:81 的氨基酸10-38；(104)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸15-38； 
(105)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸20-38；(106)靶向序列包含 SEQ ID NO:87的氨
基酸5-28；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸10-28；(108)靶向序列包含SEQ ID 
NO:89的氨基酸5-28；(109)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸10-28；(110)靶向序列包
含SEQ ID NO:91的氨基酸10-93；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸 20-93；(112)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸30-93；(113)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸
40-93；(114)靶向序列包含SEQ ID NO: 91的氨基酸50-93；(115)靶向序列包含SEQ ID NO:
91的氨基酸60-93； (116)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸10-130；(117)靶向序列包
含SEQ ID NO:93的氨基酸20-130；或(118)靶向序列包含SEQ ID NO: 93的氨基酸30-130。

[1562] 实施方案12是实施方案5和9-11中任一项所述的融合蛋白，其中目标蛋白或肽包括抗原。

[1563] 实施方案13是实施方案5和9-11中任一项所述的融合蛋白，其中目标蛋白或肽包括修复酶。

[1564] 实施方案14是实施方案7-11中任一项所述的融合蛋白，其中目标蛋白或肽包括适于在水力压裂流体中破裂乳液或胶体的酶。

[1565] 实施方案15是实施方案7-11中任一项所述的融合蛋白，其中目标蛋白或肽包括抗菌性蛋白或肽。

[1566] 实施方案16是重组蜡样芽胞杆菌家族成员，表达实施方案 1-15中任一项所述的融合蛋白。

[1567] 实施方案17是重组蜡样芽胞杆菌家族成员，表达:

[1568] (i)融合蛋白，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段；和

[1569] (ii)调节子蛋白，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于调节子蛋白的表达，调节子蛋白的表达增强；以及

[1570] 其中和重组蜡样芽胞杆菌家族成员中的融合蛋白共表达，相比于在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中融合蛋白的表达水平，融合蛋白的表达增强或减弱，在相同条件下在野生
型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于调节子蛋白的表达，重组蜡样芽胞杆菌家族成员在增强
水平不表达调节子蛋白。

[1571] 实施方案18是实施方案17所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中调节子蛋白可包含ExsY蛋白、ExsFA/BxpB蛋白、CotY蛋白、CotO 蛋白、ExsFB蛋白、InhA1蛋白、InhA2蛋白、ExsJ蛋白、ExsH蛋白、YjcA蛋白、YjcB蛋白、BclC蛋白、AcpC蛋白、InhA3蛋白、丙氨酸消旋酶
1、丙氨酸消旋酶2、BclA蛋白、BclB蛋白、BxpA蛋白、BclE蛋白、 BetA/BAS3290蛋白、CotE蛋白、ExsA蛋白、ExsK蛋白、ExsB蛋白、 YabG蛋白、Tgl蛋白、SODA1蛋白、SODA2蛋白、任意其变体或任意其组合。

[1572] 实施方案19是实施方案17或18所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中当调节子蛋白在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中和融合蛋白共表达时，相比于在重组蜡样芽胞杆菌家族
成员中融合蛋白的表达水平，融合蛋白的表达增强，在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌
家族成员中相比于调节子蛋白的表达，重组蜡样芽胞杆菌家族成员在增强水平不表达调节
子蛋白

[1573] 实施方案20是实施方案19所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中调节子蛋白包含BclB蛋白、CotE蛋白、BxpB蛋白、CotO蛋白、 BclA蛋白、任意其变体或任意其组合。

[1574] 实施方案21是实施方案17或18所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中当调节子蛋白在重组蜡样芽胞杆菌家族成员中和融合蛋白共表达时，相比于在重组蜡样芽胞杆菌家
族成员中融合蛋白的表达水平，融合蛋白的表达减弱，在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆
菌家族成员中相比于调节子蛋白的表达，重组蜡样芽胞杆菌家族成员在增强水平不表达调
节子蛋白。

[1575] 实施方案22是实施方案21所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中调节子蛋白包含BclC蛋白、ApcC蛋白、YjcB蛋白、任意其变体、或任意其组合。

[1576] 实施方案23是实施方案17或18所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中调节子蛋白包括CotO蛋白、BclB蛋白、ExsFA/BxpB蛋白、 YjcB蛋白、任意其变体、或任意其组合。

[1577] 实施方案24是实施方案17-23中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中调节子蛋白包含与SEQ ID NO:123-156中的任一个具有具有至少70％、至少75％、至少
85％、至少90％、至少95％、至少 98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

[1578] 实施方案25是实施方案17-24中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中调节子蛋白包含SEQ ID NO:124、126、134、135、 143或144。

[1579] 实施方案26是实施方案17-25中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，包含编码调节子蛋白的载体。

[1580] 实施方案27是实施方案26所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中载体包括多拷贝质粒载体。

[1581] 实施方案28是表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、
外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段；其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含突变，其部分或全部
灭活重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子或使重组蜡样芽胞杆菌家族的孢子相比于不包含
突变的相同孢子更易于物理或化学灭活，并且其中突变包括编码发芽受体的基因中的突
变、编码孢子皮质裂解酶的基因中的突变、编码小酸溶性孢子蛋白(SASP)的基因中的突变
或编码孢子包衣或皮质蛋白的基因中的突变。

[1582] 实施方案29是实施方案1-15中任一项所述的表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含突变，其部分或全部灭活重组蜡样芽胞杆
菌家族成员的孢子或使重组蜡样芽胞杆菌家族的孢子相比于不包含突变的相同孢子更易
于物理或化学灭活。

[1583] 实施方案30是表达蛋白酶或核酸酶的genus杆菌的重组细菌，其中在相同条件下在genus杆菌的野生型细菌中相比于蛋白酶或核酸酶的表达，蛋白酶或核酸酶的表达增强，并且其中蛋白酶或核酸酶的表达增强部分或全部灭活genus杆菌的重组细菌的孢子，或使
genus杆菌的重组细菌的孢子更易于物理或化学灭活。

[1584] 实施方案31是实施方案30所述的重组细菌，其中genus杆菌的重组细菌包括重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[1585] 实施方案32是实施方案30或31所述的genus杆菌的重组细菌，其中genus杆菌的重组细菌表达蛋白酶和核酸酶，其中在相同条件下在genus杆菌的野生型细菌中相比于蛋白
酶的表达，蛋白酶的表达增强，并且在相同条件下在genus杆菌的野生型细菌中相比于核酸酶的表达，核酸酶的表达增强。

[1586] 实施方案33是实施方案30-32中任一项所述的genus杆菌的重组细菌，其中蛋白酶包括非特异性蛋白酶。

[1587] 实施方案34是实施方案30-33中任一项所述的genus杆菌的重组细菌，其中蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、碱性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、组氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。

[1588] 实施方案35是实施方案30、32和34中任一项所述的genus 杆菌的重组细菌，其中蛋白酶包括萌发孢子蛋白酶。

[1589] 实施方案36是实施方案35所述的genus杆菌的重组细菌，其中萌发孢子蛋白酶包括萌发孢子蛋白酶的活性形式。

[1590] 实施方案37是实施方案35或36所述的genus杆菌的重组细菌，其中萌发孢子蛋白酶包括枯草芽胞杆菌萌发孢子蛋白酶、蕈状芽孢杆菌萌发孢子蛋白酶或苏云金芽孢杆菌萌
发孢子蛋白酶。

[1591] 实施方案38是实施方案35-37中任一项所述的genus杆菌的重组细菌，其中萌发孢子蛋白酶包含与SEQ ID NO:233或234具有至少 85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1592] 实施方案39是实施方案30-38中任一项所述的genus杆菌的重组细菌，其中核酸酶包括核酸内切酶或核酸外切酶。

[1593] 实施方案40是实施方案39所述的genus杆菌的重组细菌，其中核酸酶包括非特异性核酸内切酶。

[1594] 实施方案41是实施方案40所述的genus杆菌的重组细菌，其中非特异性核酸内切酶包括枯草芽胞杆菌核酸内切酶1。

[1595] 实施方案42是实施方案40或41所述的genus杆菌的重组细菌，其中非特异性核酸内切酶包含与SEQ ID NO:232具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或
100％同一性的氨基酸。

[1596] 实施方案43是实施方案30-42中任一项所述的genus杆菌的重组细菌，其中核酸酶或蛋白酶在包含σG启动子序列的启动子控制下表达。

[1597] 实施方案44是实施方案43所述的genus杆菌的重组细菌，其中启动子包含与SEQ ID NO:235-246的任一核酸序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸
序列。

[1598] 实施方案45是实施方案30-44中任一项所述的genus杆菌的重组细菌，其中相比于在相同条件下处理在genus杆菌的野生型细菌中蛋白酶或核酸酶的表达增强的水平下相同
孢子不表达蛋白酶或核酸酶，genus杆菌的重组细菌的孢子更容易通过紫外线照射、γ照射或用漂白剂、过氧化氢、氯仿、苯酚或乙酸处理灭活。

[1599] 实施方案46是实施方案31-45中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员还包含突变，其部分或全部灭活重组蜡样芽胞杆菌家族成员的
孢子或使重组蜡样芽胞杆菌家族的孢子相比于不包含突变的相同孢子更易于物理或化学
灭活。

[1600] 实施方案47是实施方案46所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中突变包括编码发芽受体的基因中的突变、编码孢子皮质裂解酶的基因中的突变、编码小酸溶性孢子蛋白
(SASP)的基因中的突变或编码孢子包衣或皮质蛋白的基因中的突变。

[1601] 实施方案48是实施方案28、29或47所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中突变包含编码发芽受体的基因中的突变。

[1602] 实施方案49是实施方案48所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中编码发芽受体的基因中的突变包括编码发芽受体的基因的敲除突变。

[1603] 实施方案50是实施方案48或49所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中发芽受体包含GerA、GerB、GerK、GerH、GerI、GerG、 GerL、GerQ、GerR、GerS、GerN、GerU或GerX。

[1604] 实施方案51是实施方案28、29和47-50中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中突变包括编码孢子皮质裂解酶的基因中的突变。

[1605] 实施方案52是实施方案51所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中编码孢子皮质裂解酶的基因中的突变包括编码孢子皮质裂解酶的基因的敲除突变。

[1606] 实施方案53是实施方案51或52所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中孢子皮质裂解酶包含SleB或CwlJ。

[1607] 实施方案54是实施方案28、29和47-53中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中突变包括编码SASP的基因中的突变。

[1608] 实施方案55是实施方案54所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中编码SASP的基因中的突变包括编码SASP的基因的敲除突变。

[1609] 实施方案56是实施方案54或55所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中编码SASP的基因中的突变包括SspA基因突变、SspB基因突变、SspC基因突变、SspD基因突变、SspE基因突变、SspF基因突变、SspG基因突变、SspH基因突变、SspI基因突变、SspJ基因突变、 SspK基因突变、SspL基因突变、SspM基因突变、SspN基因突变、SspO 基因突变、SspP基因突变或其组合。

[1610] 实施方案57是实施方案54-56中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中SASP包括SASPα、SASPβ或SASPγ。

[1611] 实施方案58是实施方案54-57中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中相比于不包含编码SASP的基因中突变的相同的孢子，重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子更
容易被紫外线照射或γ辐射灭活。

[1612] 实施方案59是实施方案28、29和47-58中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中突变包括编码孢子包衣或皮质蛋白的基因中的突变

[1613] 实施方案60是实施方案59所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中编码孢子包衣或皮质蛋白的基因中的突变包括编码孢子包衣或皮质蛋白的基因的敲除突变。

[1614] 实施方案61是实施方案59或60所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中孢子包衣或皮质蛋白包含CotA、CotB或CotC。

[1615] 实施方案62是实施方案59-61中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中相比于在相同条件下处理不含在孢子包衣或皮质蛋白中突变的相同的孢子，重组蜡样芽胞
杆菌家族成员的孢子通过紫外线照射、γ辐射或通过使用漂白剂、过氧化氢、氯仿、苯酚或乙酸处理更易于灭活。

[1616] 实施方案63是实施方案31-62中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员还表达融合蛋白，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族
成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。

[1617] 实施方案64是表达外孢壁蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中相比于在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中外孢壁蛋白的表达，外孢壁蛋白的表达增强，并
且其中外孢壁蛋白包括：

[1618] 外孢壁酶，其中外孢壁酶包括涉及营养物增溶的酶、肌苷-尿苷水解酶、蛋白酶、催化自由基降解的酶、精氨酸酶或丙氨酸消旋酶；或

[1619] BclA蛋白、BclB蛋白、CotE蛋白、CotO蛋白、ExsY蛋白、ExsFA/BxpB 蛋白、CotY蛋白、ExsFB蛋白、ExsJ蛋白、ExsH蛋白、YjcA蛋白、YjcB 蛋白、BclC蛋白、BxpA蛋白、BclE蛋白、BetA/BAS3290蛋白、ExsA 蛋白、ExsK蛋白、ExsB蛋白、YabG蛋白或Tgl蛋白。

[1620] 实施方案65是实施方案64所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁蛋白是融合蛋白的一部分。

[1621] 实施方案66是实施方案64或65所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁蛋白包括外孢壁酶，其中外孢壁酶包括涉及营养物增溶的酶、肌苷-尿苷水解酶、蛋白酶、催化自由基降解的酶、精氨酸酶或丙氨酸消旋酶。

[1622] 实施方案67是实施方案66所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中涉及营养物增溶的酶包括涉及磷酸酯增溶的酶。

[1623] 实施方案68是实施方案67所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中涉及磷酸酯增溶的酶包括酸性磷酸酶。

[1624] 实施方案69是实施方案68所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中酸性磷酸酶包含AcpC。

[1625] 实施方案70是实施方案68或69所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中酸性磷酸酶包含与SEQ ID NO:137具有至少85％、至少 90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1626] 实施方案71是实施方案64或65所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁酶包括肌苷-尿苷水解酶。

[1627] 实施方案72是实施方案71所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中肌苷-尿苷水解酶包括IunH1或IunH2。

[1628] 实施方案73是实施方案71或72所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中肌苷-尿苷水解酶包含与SEQ ID NO:250或251具有至少 85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1629] 实施方案74是实施方案64或65所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁酶包括蛋白酶。

[1630] 实施方案75是实施方案74所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中蛋白酶包括金属蛋白酶。

[1631] 实施方案76是实施方案75所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中金属蛋白酶包含InhA1、InhA2或InhA3。

[1632] 实施方案77是实施方案75或76所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中金属蛋白酶包含氨基酸序列与SEQ ID NO:114、121、122、 129、130或138具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％同一性。

[1633] 实施方案78是实施方案64或65所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中催化自由基降解的酶包括超氧化物歧化酶。

[1634] 实施方案79是实施方案78所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中超氧化物歧化酶包含超氧化物歧化酶1(SODA1)或超氧化物歧化酶2(SODA2)。

[1635] 实施方案80是实施方案78或79所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中超氧化物歧化酶包含与SEQ ID NO:155或156具有至少 85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1636] 实施方案81是实施方案64或65所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁酶包括精氨酸酶。

[1637] 实施方案82是实施方案81所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中精氨酸酶包括苏云金芽孢杆菌精氨酸酶。

[1638] 实施方案83是实施方案81或82所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中精氨酸酶包含与SEQ ID NO:249具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1639] 实施方案84是实施方案64或65所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁酶包括丙氨酸消旋酶。

[1640] 实施方案85是实施方案84所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中丙氨酸消旋酶包括丙氨酸消旋酶1(ALR1)或丙氨酸消旋酶2 (ALR2)。

[1641] 实施方案86是实施方案84或85所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中丙氨酸消旋酶包含与SEQ ID NO:247或248具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1642] 实施方案87是实施方案64或65所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁蛋白包含BclA蛋白、BclB蛋白、CotE蛋白、CotO 蛋白、ExsY蛋白、ExsFA/BxpB蛋白、CotY蛋白、ExsFB蛋白、ExsJ 蛋白、ExsH蛋白、YjcA蛋白、YjcB蛋白、BclC蛋白、BxpA蛋白、BclE 蛋白、BetA/BAS3290蛋白、ExsA蛋白、ExsK蛋白、ExsB蛋白、YabG 蛋白或Tgl蛋白。

[1643] 实施方案88是实施方案87所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁蛋白包括BclA蛋白、BclB蛋白、CotE蛋白或CotO蛋白。

[1644] 实施方案89是实施方案87或88所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁蛋白包括BclA蛋白。

[1645] 实施方案90是实施方案89所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中BclA蛋白包含与SEQ ID NO:141或142具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1646] 实施方案91是实施方案87或88所述的蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁蛋白包括BclB蛋白。

[1647] 实施方案92是实施方案91所述的蜡样芽胞杆菌家族成员，其中BclB蛋白包含与SEQ ID NO:143或144具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1648] 实施方案93是实施方案87或88所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁蛋白包括CotE蛋白。

[1649] 实施方案94是实施方案93所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中CotE蛋白包含与SEQ ID NO:149具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1650] 实施方案95是实施方案87或88所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁蛋白包括CotO蛋白。

[1651] 实施方案96是实施方案95所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中CotO蛋白包含与SEQ ID NO:126具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1652] 实施方案97是实施方案87所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁蛋白包括ExsY蛋白、ExsFA/BxpB蛋白、CotY蛋白、ExsFB 蛋白、ExsJ蛋白、ExsH蛋白、YjcA蛋白、YjcB蛋白、BclC蛋白、BxpA 蛋白、BclE蛋白、BetA/BAS3290蛋白、ExsA蛋白、ExsK蛋白、ExsB 蛋白、YabG蛋白或Tgl蛋白。

[1653] 实施方案98是实施方案97所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中外孢壁蛋白包含:

[1654] ExsY蛋白，其中ExsY蛋白包含与与SEQ ID NO:123具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1655] ExsFA/BxpB蛋白，其中ExsFA/BxpB蛋白包含与SEQ ID NO:124 具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1656] CotY蛋白，其中CotY蛋白包含与SEQ ID NO:125具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1657] ExsFB蛋白，其中ExsFB蛋白包含与SEQ ID NO:127或128具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1658] ExsJ蛋白，其中ExJ蛋白包含与SEQ ID NO:131具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1659] ExsH蛋白，其中ExsH蛋白包含与SEQ ID NO:132具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1660] YjcA蛋白，其中YjcA蛋白包含与SEQ ID NO:133具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1661] YjcB蛋白，其中YjcB蛋白包含与SEQ ID NO:134或135具有至少 85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1662] BclC蛋白，其中BclC蛋白包含与SEQ ID NO:136具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1663] BxpA蛋白，其中BxpA蛋白包含与SEQ ID NO:145具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1664] BclE蛋白，其中BclE蛋白包含与SEQ ID NO:146或147具有至少 85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1665] BetA/BAS3290蛋白，其中BetA/BAS3290蛋白包含与SEQ ID NO: 148具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1666] ExsA蛋白，其中ExsA蛋白包含与SEQ ID NO:150具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1667] ExsK蛋白，其中ExsK蛋白包含与SEQ ID NO:151具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1668] ExsB蛋白，其中ExsB蛋白包含与SEQ ID NO:152具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；

[1669] YabG蛋白，其中YabG蛋白包含与SEQ ID NO:153具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；或

[1670] Tjl蛋白，其中Tjl蛋白包含与SEQ ID NO:156具有至少85％、至少 90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1671] 实施方案99是实施方案64-98中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员还表达融合蛋白，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族
成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段。

[1672] 实施方案100是表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外
孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段；其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含突变或表达蛋白，其中
相比于在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中蛋白的表达，所述蛋白的表达增
强，并且其中所述蛋白的突变或增强的表达导致具有这样外孢壁的蜡样芽胞杆菌孢子，该
外孢壁相比于野生型孢子的外孢壁更容易从所述孢子除去。

[1673] 实施方案101是表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，所述融合蛋白包含：至少一种目标蛋白或肽；以及使所述融合蛋白靶向所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢
壁的靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段；其中所述重组蜡样芽胞杆菌家族成员：

[1674] (i)包含CotE基因中的突变；

[1675] (ii)表达ExsY蛋白，其中相比于在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中ExsY蛋白的表达，ExsY蛋白的表达增强，并且其中所述ExsY 蛋白包含含有球状蛋白的羧基端标签；

[1676] (iii)表达BclB蛋白，其中相比于在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中BclB蛋白的表达，BclB蛋白的表达增强；

[1677] (iv)表达YjcB蛋白，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于YjcB蛋白的表达，YjcB蛋白的表达增强；

[1678] (v)包含ExsY基因中的突变；

[1679] (vi)包含CotY基因中的突变；

[1680] (vii)包含ExsA基因中的突变；或

[1681] (viii)包含CotO基因中的突变。

[1682] 实施方案102是实施方案100或101所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含CotE基因中的突变。

[1683] 实施方案103是实施方案102所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中CotE基因中的突变部分或完全抑制CotE使所述外孢壁附接所述孢子的能力。

[1684] 实施方案104是实施方案102或103所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中CotE基因中的突变包含CotE基因或CotE基因的显性阴性形式的敲除。

[1685] 实施方案105是实施方案100-104中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达ExsY蛋白，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家
族成员中相比于ExsY蛋白的表达，ExsY蛋白的表达增强，并且其中所述ExsY蛋白包含含有
球状蛋白的羧基端标签。

[1686] 实施方案106是实施方案105所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中球状蛋白分子量为25kDA和100kDa。

[1687] 实施方案107是实施方案105或106所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中球状蛋白包括绿色荧光蛋白(GFP)或其变体。

[1688] 实施方案108是实施方案105-107中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中ExsY蛋白的表达包含含有球状蛋白的羧基端标签的ExsY蛋白的表达抑制所述ExsY蛋白
在外孢壁中结合其靶。

[1689] 实施方案109是实施方案100-108中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达BclB蛋白，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家
族成员中相比于BclB蛋白的表达， BclB蛋白的表达增强。

[1690] 实施方案110是实施方案109所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中BclB蛋白的表达导致易碎外孢壁的形成。

[1691] 实施方案111是实施方案100-110中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达YjcB蛋白，其中其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆
菌家族成员中相比于YjcB蛋白的表达，YjcB蛋白的表达增强。

[1692] 实施方案112是实施方案111所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中YjcB蛋白的表达使所述外孢壁形成碎片而不是完整结构。

[1693] 实施方案113是实施方案100-112中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含ExsY基因中的突变。

[1694] 实施方案114是实施方案113所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中ExsY基因中的突变部分或完全抑制ExsY完全形成所述外孢壁或使所述外孢壁附接所述孢子的能力。

[1695] 实施方案115是实施方案113或114所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中ExsY基因中的突变包含ExsY基因的敲除。

[1696] 实施方案116是实施方案100-115中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含CotY基因中的突变。

[1697] 实施方案117是实施方案116所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中CotY基因中的突变包含CotY基因的敲除。

[1698] 实施方案118是实施方案116或117所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中CotY基因中的突变导致易碎外孢壁的形成。

[1699] 实施方案119是实施方案100-118中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含ExsA基因中的突变。

[1700] 实施方案120是实施方案119所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中ExsA基因中的突变包含ExsA基因的敲除。

[1701] 实施方案121是实施方案119或120所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中ExsA基因中的突变导致易碎外孢壁的形成。

[1702] 实施方案122是实施方案100-121中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含CotO基因中的突变。

[1703] 实施方案123是实施方案122所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中CotO基因中的突变包含CotO基因或CotO基因的显性阴性形式的敲除。

[1704] 实施方案124是实施方案122或123所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中CotO基因中的突变使外孢壁形成条。

[1705] 实施方案125是表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外
孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括内生细菌菌株、能降解
除草剂或杀虫剂的细菌菌株或益生菌细菌菌株。

[1706] 实施方案126是实施方案125所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中内生菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No. B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRL 
B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)、蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-50977)、苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL B-50983)、苏云金芽孢杆菌EE-B00184 (NRRL B-67122)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)、
或蕈状芽孢杆菌 EE-B00363(NRRL B-67121)。

[1707] 实施方案127是实施方案125所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中内生菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRL B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)、
蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-50977),或苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL B-50983)、苏云金芽
孢杆菌 EE-B00184(NRRL B-67122)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)或蕈状芽孢杆菌 EE-B00363(NRRL B-67121)。

[1708] 实施方案128是实施方案125所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员 EE349(NRRL No.B-50928)、蜡样芽胞
杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)或蕈
状芽孢杆菌 EE-B00363(NRRL B-67121)。

[1709] 实施方案129是实施方案125所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中益生菌细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No. B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439
(NRRL B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)或蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-
50977)。

[1710] 实施方案130是实施方案16-28、48-63和99-129中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段包含:(1)靶向序列包含与SEQ 
ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一
性至少约54％； (2)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35；(3)靶向序列包含SEQ ID 
NO:1的氨基酸20-35；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:1；(5)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的氨基酸序列；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-35；(7)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸5-35；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸8-35；(9)靶向
序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸10-35；(10)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸15-35；
(11)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-27；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸
12-27；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:3；(14)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的氨基酸序列；(15)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸2-27；(16)靶向序列包含
SEQ ID NO:3的氨基酸5-27；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸8-27；(18)靶向序列
包含SEQ ID NO:3的氨基酸10-27；(19)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-38；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:5 的氨基酸23-38；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:5；(22)外孢壁蛋白
包含与SEQ ID NO:6具有至少85％同一性的氨基酸序列；(23)靶向序列包含 SEQ ID NO:5
的氨基酸2-38；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸 5-38；(25)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸8-38；(26)靶向序列包含 SEQ ID NO:5的氨基酸10-38；(27)靶向序列包含
SEQ ID NO:5的氨基酸 15-38；(28)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸20-38；(29)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-28；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸13-28；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:7；(32)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的氨
基酸序列；(33)靶向序列包含 SEQ ID NO:7的氨基酸2-28；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 5-28；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸8-28；(36)靶向序列包含 SEQ ID NO:7的氨基酸10-28；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸1-24；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸9-24；(39)靶向序列包含SEQ ID NO:9；(40)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:10具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(41)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸 2-
24；(42)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基
酸8-24；(44)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸1-33；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:11
的氨基酸18-33；(46)靶向序列包含SEQ ID NO:11；(47)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:12具有至少85％同一性的氨基酸序列；(48)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸 2-33；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-33；
(51)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基
酸15-33；(53)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸1-33；(54)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸18-33；(55)靶向序列包含SEQ ID NO:13；(56)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:14具有至少85％同一性的氨基酸序列；(57)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；(58)靶
向序列包含SEQ ID NO:13 的氨基酸5-33；(59)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸8-33；
(60)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸10-33；(61)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基
酸15-33；(62)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸1-43； (63)靶向序列包含SEQ ID NO:
15的氨基酸28-43；(64)靶向序列包含 SEQ ID NO:15；(65)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
16具有至少85％同一性的氨基酸序列；(66)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸2-43；
(67) 靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸5-43；(68)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基
酸8-43；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-43； (70)靶向序列包含SEQ ID NO:
15的氨基酸15-43；(71)靶向序列包含 SEQ ID NO:15的氨基酸20-43；(72)靶向序列包含
SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-27；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸12-27；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:17；(76)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:18具有至少85％同一性的氨基酸序列；(77)靶向序列包含SEQ ID NO:17的
氨基酸2-27；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(79)靶向序列包含SEQ ID 
NO:17 的氨基酸8-27；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸10-27；(81) 靶向序列包
含SEQ ID NO:19的氨基酸1-33；(82)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸18-33；(83)靶向序列包含SEQ ID NO:19；(84)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:20具有至少85％同一性的氨基
酸序列；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-33；(86)靶向序列包含SEQ ID NO: 19的氨基酸5-33；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸8-33；(88) 靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸10-33；(89)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸15-33；(90)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸1-33；(91)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸18-33；(92)靶向序列包含 SEQ ID NO:21；(93)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:22具有至少85％同一性的氨基
酸序列；(94)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸2-33；(95) 靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸5-33；(96)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸8-33；(97)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸10-33； (98)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸15-33；(99)靶向序列包
含 SEQ ID NO:23的氨基酸1-24；(100)靶向序列SEQ ID NO:23的氨基酸 9-24；(101)靶向
序列包含SEQ ID NO:23；(102)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:24具有至少85％同一性的氨
基酸序列；(103)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸2-24；(104)靶向序列包含SEQ ID 
NO:23的氨基酸 5-24；(105)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(106)靶向序列包
含SEQ ID NO:25的氨基酸1-24；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:25 的氨基酸9-24；(108)靶向序列包含SEQ ID NO:25；(109)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:26具有至少85％同一性的
氨基酸序列；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸2-24；(111)靶向序列包含SEQ ID NO:25 的氨基酸5-24；(112)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-24；(113) 靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸1-30；(114)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸15-30；(115)靶向序列包含SEQ ID NO:27；(116)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:28具有至少85％同一性的
氨基酸序列；(117) 靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸2-30；(118)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(119)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸8-30； (120)靶向序列包
含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30；(121)靶向序列包含 SEQ ID NO:29的氨基酸1-33；(122)
靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸18-33；(123)靶向序列包含SEQ ID NO:29；(124)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:30具有至少85％同一性的氨基酸序列；(125)靶向序列包含SEQ 
ID NO:29的氨基酸2-33；(126)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(127)靶向序列
包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(128)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸10-33；(129)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(130)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸 
1-24；(131)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸9-24；(132)靶向序列包含SEQ ID NO:31；
(133)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:32具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(134)靶向序
列包含SEQ ID NO:31的氨基酸2-24；(135)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸5-24；
(136)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24；(137)靶向序列包含SEQ ID NO:33 的氨
基酸1-15；(138)靶向序列包含SEQ ID NO:33；(139)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:34具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(140)靶向序列包含SEQ ID NO:35的氨基酸1-16；(141)靶
向序列包含SEQ ID NO:35； (142)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:36具有至少85％同一性的
氨基酸序列；(143)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸1-29；(144)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸14-29；(145)靶向序列包含SEQ ID NO:43； (146)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:44具有至少85％同一性的氨基酸序列；(147)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸2-
29；(148)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸5-29；(149)靶向序列包含SEQ ID NO:43的
氨基酸8-29；(150)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸10-29；(151) 靶向序列包含SEQ 
ID NO:45的氨基酸1-35；(152)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸20-35；(153)靶向序列包含SEQ ID NO:45；(154)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:46具有至少85％同一性的氨基酸
序列；(155) 靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸2-35；(156)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(157)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35； (158)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸10-35；(159)靶向序列包含 SEQ ID NO:45的氨基酸15-35；(160)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸1-43；(161)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸28-43；
(162) 靶向序列包含SEQ ID NO:47；(163)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:48 具有至少85％
同一性的氨基酸序列；(164)靶向序列包含SEQ ID NO:47 的氨基酸2-43；(165)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(166) 靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-43；(167)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸10-43；(168)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 15-
43；(169)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸20-43；(170)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(171)靶向序列包含SEQ ID NO: 49的氨基酸1-32；(172)靶向序列包含SEQ 
ID NO:49的氨基酸17-32；(173)靶向序列包含SEQ ID NO:49；(174)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:50具有至少85％同一性的氨基酸序列；(175)靶向序列包含SEQ IDNO:49的氨基酸2-
32；(176)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32； (177)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(178)靶向序列包含 SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(179)靶向序列包含SEQ 
ID NO:49的氨基酸15-32；(180)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸1-33；(181) 靶向序
列包含SEQ ID NO:51的氨基酸18-33；(182)靶向序列包含SEQ ID NO:51；(183)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:52具有至少85％同一性的氨基酸序列；(184)靶向序列包含SEQ ID NO:
51的氨基酸2-33；(185) 靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(186)靶向序列包含
SEQ IDNO:51的氨基酸8-33；(187)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸 10-33；(188)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸15-33；(189)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸1-33；
(190)靶向序列包含SEQ ID NO: 53的氨基酸18-33；(191)靶向序列包含SEQ ID NO:53；
(192)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:54具有至少85％同一性的氨基酸序列；(193)靶向序列
包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33；(194)靶向序列包含SEQ ID NO: 53的氨基酸5-33；(195)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-33； (196)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸
10-33；(197)靶向序列包含 SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；(198)靶向序列包含SEQ ID NO:
55的氨基酸1-30；(199)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸15-30；(200) 靶向序列包含
SEQ ID NO:55；(201)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:56 具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(202)靶向序列包含SEQ ID NO:55 的氨基酸2-30；(203)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸5-30；(204) 靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；(205)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸10-30；(206)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸1-130；(207)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸115-130；(208)靶向序列包含SEQ ID NO:57；(209)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少85％同一性的氨基酸序列；(210)靶向序列包含SEQ ID NO:57
的氨基酸2-130；(211)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130；(212) 靶向序列包含
SEQ ID NO:57的氨基酸10-130；(213)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸20-130；(214)
靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸30-130；(215)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸
40-130；(216) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(217)靶向序列包含SEQ ID 
NO:57的氨基酸60-130；(218)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-130；(219)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130；(220) 靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸90-130；
(221)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸100-130；(222)靶向序列包含SEQ ID NO:57的
氨基酸110-130；(223)外孢壁蛋白片段包含与SEQ ID NO:95具有至少85％同一性的氨基酸
序列；(224)靶向序列包含SEQ ID NO:96；(225)靶向序列包含SEQ ID NO:97；(226)靶向序列包含SEQ ID NO:98；(227)靶向序列包含SEQ ID NO:99；(228)靶向序列包含SEQ ID NO:
100；(229) 靶向序列包含SEQ ID NO:101；(230)靶向序列包含SEQ ID NO:102； (231)靶向序列包含SEQ ID NO:103；(232)靶向序列包含SEQ ID NO: 104；(233)靶向序列包含SEQ ID NO:105；(234)靶向序列包含SEQ ID NO:106；(235)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:108具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(236)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:109具有至少85％同一
性的氨基酸序列；(237)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:110具有至少 85％同一性的氨基酸
序列；(238)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:111具有至少85％同一性的氨基酸序列；(239)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:112 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(240)外孢壁蛋白包
含与SEQ ID NO: 113具有至少85％同一性的氨基酸序列；(241)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:114具有至少85％同一性的氨基酸序列；(242)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:115具有
至少85％同一性的氨基酸序列；(243)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:116具有至少85％同一
性的氨基酸序列；(244)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:117具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(245) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:118具有至少85％同一性的氨基酸序列；(246)外
孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:119具有至少85％同一性的氨基酸序列；(247)外孢壁蛋白包含
与SEQ ID NO:120具有至少85％同一性的氨基酸序列；(248)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
121具有至少85％同一性的氨基酸序列；(249)靶向序列包含氨基酸SEQ ID NO:1的氨基酸 
22-31；(250)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-33；(251)靶向序列包含SEQ ID NO:1
的氨基酸20-31；(252)靶向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸14-23；(253)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸14-25；(254) 靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸12-23；(255)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸1-30；(256)靶向序列包含SEQ ID NO:59；(257)外孢壁蛋白包
含与SEQ ID NO:60具有至少85％同一性的氨基酸序列；(258) 靶向序列包含SEQ ID NO:59
的氨基酸2-30；(259)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸4-30；(260)靶向序列包含SEQ 
ID NO:59的氨基酸6-30； (261)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸1-33；(262)靶向序列包含 SEQ ID NO:61的氨基酸18-33；(263)靶向序列包含SEQ ID NO:61； (264)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:62具有至少85％同一性的氨基酸序列；(265)靶向序列包含SEQ ID NO:
61的氨基酸2-33；(266)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸5-33；(267)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸10-33；(268)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸15-33；(269) 靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸1-35；(270)靶向序列包含SEQ ID NO:63；(271)外孢壁蛋白
包含与SEQ ID NO:64具有至少85％同一性的氨基酸序列；(272)靶向序列包含SEQ ID NO:
63的氨基酸2-35；(273)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸5-35；(274)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸8-35；(275)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸 10-35；(276)靶向序
列包含SEQ ID NO:63的氨基酸15-35；(277)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸1-24；
(278)靶向序列包含SEQ ID NO: 65的氨基酸9-24；(279)靶向序列包含SEQ ID NO:65；
(280)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:66具有至少85％同一性的氨基酸序列；(281)靶向序列
包含SEQ ID NO:107；(282)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸2-24；(283)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸5-24；(284)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸1-27；(285)靶向
序列包含SEQ ID NO:67 的氨基酸12-27；(286)靶向序列包含SEQ ID NO:67；(287)外孢壁
蛋白包含与SEQ ID NO:68具有至少85％同一性的氨基酸序列；(288)靶向序列包含SEQ ID 
NO:67的氨基酸2-27；(289)靶向序列包含SEQ ID NO: 67的氨基酸5-27；(290)靶向序列包
含SEQ ID NO:67的氨基酸10-27； (291)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸1-38；(292)
靶向序列包含 SEQ ID NO:69的氨基酸23-38；(293)靶向序列包含SEQ ID NO:69； (294)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:70具有至少85％同一性的氨基酸序列；(295)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸2-38；(296)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸5-38；(297)靶向序列
包含SEQ ID NO:69的氨基酸10-38；(298)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸15-38；
(299) 外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:72；(300)靶向序列包含SEQ ID NO:73； (301)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:74具有至少95％同一性的氨基酸序列；(302)靶向序列包含SEQ ID 
NO:75的氨基酸1-42；(303)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-42；(304)靶向序列包
含SEQ ID NO:75； (305)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:76具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(306)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸2-42；(307)靶向序列包含SEQ ID NO:75的
氨基酸5-42；(308)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸10-42；(309)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸15-42；(310) 靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸20-42；(311)靶向序列
包含SEQ ID NO:75的氨基酸25-42；(312)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 1-24；(313)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸9-24；(314)靶向序列包含SEQ ID NO:77；(315)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:78具有至少 85％同一性的氨基酸序列；(316)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 2-24；(317)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-24；(318)外孢壁蛋白包
含与SEQ ID NO:80具有至少85％同一性的氨基酸序列；(319)靶向序列包含SEQ ID NO:81
的氨基酸1-38；(320)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸23-38；(321)靶向序列包含SEQ ID NO:81；(322)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:82具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(323)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸2-38；(324)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨
基酸5-38；(325)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸10-38； (326)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸15-38；(327)靶向序列包含 SEQ ID NO:81的氨基酸20-38；(328)靶向序列
包含SEQ ID NO:83的氨基酸1-34；(329)靶向序列包含SEQ ID NO:83；(330)外孢壁蛋白包
含与SEQ ID NO:84具有至少85％同一性的氨基酸序列；(331)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:86具有至少85％同一性的氨基酸序列；(332)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸1-
28；(333)靶向序列包含SEQ ID NO: 87的氨基酸13-28；(334)靶向序列包含SEQ ID NO:87；
(335)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:88具有至少85％同一性的氨基酸序列；(336)靶向序列
包含SEQ ID NO:87的氨基酸2-28；(337)靶向序列包含SEQ ID NO: 87的氨基酸5-28；(338)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸10-28； (339)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸
1-28；(340)靶向序列包含 SEQ ID NO:89；(341)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:90具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(342)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸2-28； (343)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸5-28；(344)靶向序列包含 SEQ ID NO:89的氨基酸10-28；
(345)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸1-93；(346)靶向序列包含SEQ ID NO:91；(347)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:92具有至少85％同一性的氨基酸序列；(348)靶向序列包含
SEQ ID NO:91的氨基酸2-93；(349)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸10-93；(350)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸20-93；(351) 靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸30-
93；(352)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸40-93；(353)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸 50-93；(354)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸60-93；(355)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸1-130；(356)靶向序列包含SEQ ID NO: 93；(357)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:94具有至少85％同一性的氨基酸序列；(358)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸
2-130；(359)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸10-130；(360)靶向序列包含SEQ ID NO:
93的氨基酸20-130；(361)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸 30-130；(362)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:122具有至少85％同一性的氨基酸序列；(363)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸20-33； (364)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸21-33；(365)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸23-31；(366)靶向序列由下列组成：SEQ ID 
NO:96的氨基酸1-15；(367)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:96的氨基酸1-13；(368)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸12-25；(369)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸13-25； (370)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸15-23；(371)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:97的氨基酸1-15；(372)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-13；(373)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸23-36；(374)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸23-34；(375)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸24-36； (376)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸26-34；(377)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸13-26；(378)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸13-24；(379)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸14-26；(380)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸16-24；(381)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-22； (382)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-20；(383)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸10-22；(384)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸12-20；(385)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:105的氨基酸1-15；(386)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:105的氨基酸
1-13；(387)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸18-31； (388)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸18-29；(389)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸19-
31；(390)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-15；(391)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:98的氨基酸1-13；(392)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-31；
(393)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-29； (394)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:13的氨基酸19-31；(395)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸21-29；
(396)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:99的氨基酸1-15；(397)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:99的氨基酸1-13；(398)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸28-41；(399)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸28-39； (400)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸29-41；(401)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸31-39；(402)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:17的氨基酸12-25；(403)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
17的氨基酸13-25；(404)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:100 的氨基酸1-15；(405)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸 18-31；(406)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
19的氨基酸18-29；(407) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸19-31；(408)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸21-29；(409)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:
21的氨基酸18-31；(410)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 21的氨基酸18-29；(411)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸19-31；(412)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸21-29； (413)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:101的氨基酸1-15；(414)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:101的氨基酸1-13；(415)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸9-22；(416)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸9-20；(417)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸10-22；(418)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸
12-20； (419)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:102的氨基酸1-15；(420)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:102的氨基酸1-13；(421)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸9-
22；(422)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸9-20；(423)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:25的氨基酸10-22；(424)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸12-20；
(425)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:103的氨基酸1-15；(426)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:103的氨基酸1-13；(427)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸15-28；(428)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸15-26；(429)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27 的氨基酸16-28；(430)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸 18-26；(431)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:104的氨基酸1-15；(432) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:104的氨基酸1-13；(433)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:33的氨基酸1-13；(434)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:33的氨基酸1-11；(435)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 
33的氨基酸3-11；(436)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸 1-14；(437)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸1-12；(438) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸2-14；(439)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:43的氨基酸14-27；(440)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:43的氨基酸14-25；(441)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 43的氨基酸15-27；(442)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸20-33；(443)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸20-31； (444)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸21-33；(445)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:106的氨基酸1-15；(446)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:106的氨基酸1-13；(447)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:47的氨基酸
28-41；(448)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:47 的氨基酸28-39；(449)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸 18-31；(450)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸
18-29；(451) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸19-31；(452)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸18-31；(453)靶向序列包含SEQ ID NO:61 的氨基酸18-29；(454)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸19-31； (455)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸9-22；
(456)靶向序列包含 SEQ ID NO:65的氨基酸9-20；(457)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨
基酸10-22；(458)靶向序列包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-15；(459) 靶向序列包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-13；(460)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸12-25；(461)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸 12-23；(462)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸13-25；(463)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸15-23；(464)靶向序列包含SEQ ID NO: 69的氨基酸
23-36；(465)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸23-34； (466)靶向序列包含SEQ ID NO:
69的氨基酸24-36；(467)靶向序列包含 SEQ ID NO:69的氨基酸26-34；(468)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-40；(469)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-38；(470) 靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸9-22；(471)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸9-20；
(472)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸 10-22；(473)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨
基酸12-20；(474)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸23-36；(475)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸23-34；(476)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸24-36； (477)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸26-34；(478)靶向序列包含 SEQ ID NO:87的氨基酸13-26；
(479)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸13-24；或(480)靶向序列包含SEQ ID NO:87的
氨基酸14-26。

[1711] 实施方案131是实施方案4、8和12-15中任一项所述的融合蛋白或实施方案16或130所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中靶向序列包括：

[1712] 与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％；

[1713] 与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约50％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％；

[1714] 与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约56％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约63％；

[1715] 与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约62％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％；

[1716] 与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约68％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％；

[1717] 与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约72％；

[1718] 与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约75％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％；

[1719] 与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约81％；或

[1720] 与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约81％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35的同一性为至少约90％。

[1721] 实施方案132是实施方案4、8和12-15中任一项所述的融合蛋白或实施方案16或130所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中靶向序列由下列组成:

[1722] (a)由下列组成的氨基酸序列：16个氨基酸并且具有至少约43％同一性与SEQ ID NO:1的氨基酸20-35，其中与氨基酸25-35的同一性至少约54％；

[1723] (b)SEQ ID NO:1的氨基酸1-35；

[1724] (c)SEQ ID NO:1的氨基酸20-35；

[1725] (d)SEQ ID NO:1；

[1726] (e)SEQ ID NO:96；或

[1727] (f)SEQ ID NO:120。

[1728] 实施方案133是实施方案131所述的融合蛋白或重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中靶向序列由氨基酸序列组成。

[1729] 实施方案134是实施方案4、8和12-15中任一项所述的融合蛋白或实施方案16或130所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中融合蛋白包含外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、 46、48、
50、52、54、56、58、95、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120和121具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1730] 实施方案135是实施方案1所述的融合蛋白或实施方案16或 130所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中融合蛋白包含外孢壁蛋白，包含与SEQ ID NO:60、62、64、66、68、
70、76、78、80、82、84、 86、88、90、92、94或122具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1731] 实施方案136是实施方案1-15和131-135中任一项所述的融合蛋白或实施方案16-29、48-63和99-135中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段在其羧基末端包含氨基酸序列GXT，其中X是任何氨基酸。

[1732] 实施方案137是实施方案1-15和131-136中任一项所述的融合蛋白或实施方案16-29、48-63和99-136中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段在对应SEQ ID NO:1的氨基酸20的靶向序列的位置处包含丙氨酸残
基。

[1733] 实施方案138是实施方案1-15和131-137中任一项所述的融合蛋白或实施方案16-29、48-63和99-137中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段还在靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段的第一氨基酸紧接前面
的氨基酸位点或对应SEQ ID NO:1的氨基酸20的靶向序列位点处包含甲硫氨酸、丝氨酸或
苏氨酸残基。

[1734] 实施方案139是实施方案1-15和131-138中任一项所述的融合蛋白或实施方案16-29、48-63和99-138中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中融合蛋白还包含在靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段、和目标蛋白或肽之间的氨基酸接头。

[1735] 实施方案140是实施方案139所述的融合蛋白或重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中接头包括聚丙氨酸接头、聚甘氨酸接头、或包含丙氨酸与甘氨酸残基两者的混合物的接头。

[1736] 实施方案141是实施方案139或140所述的融合蛋白或重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中接头包含蛋白酶识别位点。

[1737] 实施方案142是融合蛋白，包含至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白，其中孢子外壳蛋白包括CotB/H蛋白、孢子蛋白X蛋白或CotY 蛋白，其中CotY蛋白包含与SEQ ID NO:
258或259具有至少80％同一性的氨基酸序列。

[1738] 实施方案143是实施方案142所述的融合蛋白，其中孢子外壳蛋白包括CotB/H蛋白。

[1739] 实施方案144是实施方案142所述的融合蛋白，其中孢子外壳蛋白包括孢子蛋白X蛋白。

[1740] 实施方案145是实施方案142所述的融合蛋白，其中孢子外壳蛋白包括CotY蛋白，其中CotY蛋白包含与SEQ ID NO:258或259具有至少80％同一性的氨基酸序列。

[1741] 实施方案146是实施方案142-145中任一项所述的融合蛋白，其中孢子外壳蛋白包含与SEQ ID NO:255、257、258或259具有至少 85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少
99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1742] 实施方案147是表达实施方案142-146中任一项所述的融合蛋白的重组孢子-形成细菌。

[1743] 实施方案148是实施方案147所述的重组孢子-形成细菌，其中重组孢子-形成细菌包括内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进性细菌菌株。

[1744] 实施方案149是表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌，融合蛋白包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白，其中孢子外壳蛋白包括CotB
蛋白、CotC蛋白、CgeA蛋白、 CotB/H蛋白、CotG蛋白、孢子外壳蛋白X蛋白或CotY蛋白；和其中重组孢子-形成细菌包括内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株、或内生和植物生长-促进性的细菌菌株。

[1745] 实施方案150是重组孢子-形成细菌包覆的植物种子，其中表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌包含：使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳
蛋白，其中孢子外壳蛋白包括cotB蛋白、CotC蛋白、CgeA蛋白、CotB/H蛋白、Cot G蛋白、孢子蛋白X蛋白或cotY蛋白。

[1746] 实施方案151是实施方案147、148或149所述的重组孢子- 形成细菌或实施方案150所述的植物种子，其中重组孢子-形成细菌包括 genus杆菌、Lysinibacillus、
Virginibacillus、Clostridia或Paenibacillus 的细菌。

[1747] 实施方案152是实施方案30-45中任一项所述的genus杆菌的重组细菌，其中重组细菌包括重组孢子-形成细菌，和其中重组孢子-形成细菌还表达融合蛋白，包含使融合蛋
白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白，其中孢子外壳蛋白包括
CotB蛋白、CotC 蛋白、CgeA蛋白、CotB/H蛋白、Cot G蛋白、孢子外壳蛋白X蛋白或 CotY蛋白。

[1748] 实施方案153是实施方案152所述的genus杆菌的重组细菌，其中重组细菌包括内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进性细菌菌株。

[1749] 实施方案154是包覆实施方案152或153所述的重组孢子-形成细菌的植物种子。

[1750] 实施方案155是实施方案150、151或154所述的植物种子，其中重组孢子-形成细菌包括内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进性细菌菌株。

[1751] 实施方案156是实施方案148、149或153所述的重组孢子- 形成细菌或者实施方案155所述的种子，其中内生细菌菌株、植物生长- 促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进
性的细菌菌株包括巨大芽孢杆菌 EE385(NRRL B-50980)、杆菌sp.EE387(NRRL B-50981)、
环状芽孢杆菌EE388(NRRL  B-50982)、枯草芽胞杆菌EE405(NRRL  B-50978)、 
Lysinibacillus fusiformis EE442(NRRL B-50975)、Lysinibacillus sphaericus EE443
(NRRL B-50976)、短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL B-67123)、枯草芽胞杆菌EE148(NRRL B-
50927)、枯草芽胞杆菌EE218 (NRRL B-50926)或巨大芽孢杆菌EE281(NRRL B-50925)。

[1752] 实施方案157是实施方案156所述的重组孢子-形成细菌或种子，其中内生细菌菌株包括枯草芽胞杆菌EE405(NRRL B-50978)或巨大芽孢杆菌EE385(NRRL B-50980)。

[1753] 实施方案158是实施方案148、149或153所述的重组孢子- 形成细菌或实施方案155所述的种子，其中内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进性的细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No.B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员
EE439 (NRRL B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)、蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-50977)、苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL B-50983)、苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-
67122)、蜡样芽胞杆菌家族成员 EE-B00377(NRRL B-67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366
(NRRL B-67120)、蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)、蕈状芽孢杆菌 BT155(NRRL 
No.B-50921)、蕈状芽孢杆菌EE118(NRRL No. B-50918)、蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL No.B-
50921)、蕈状芽孢杆菌 BT46-3(NRRL No.B-50922)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE128(NRRL 
No. B-50917)、苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRL No.B-50924)或蜡样芽胞杆菌家族成员EE349
(NRRL No.B-50928)。

[1754] 实施方案159是实施方案149、151、152、153和156-158 中任一项所述的重组孢子-形成细菌或实施方案150、151和154-158中任一项所述的种子，其中孢子外壳蛋白包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或
100％同一性的氨基酸序列。

[1755] 实施方案160是表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌，融合蛋白包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和蛋白，其中重组孢子-形成细菌不是重组蜡
样芽胞杆菌家族成员,并且使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的蛋白包含SEQ ID NO:1的氨
基酸20-35、SEQ ID NO:96、或者与SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:114、 SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121具有至少85％、至少90％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1756] 实施方案161是实施方案160所述的重组孢子-形成细菌，其中使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸 20-35、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:108、
SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121。

[1757] 实施方案162是实施方案160或161所述的重组孢子-形成细菌，其中重组-孢子形成细菌包括内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进性细菌菌
株。

[1758] 实施方案163是实施方案162所述的重组孢子-形成细菌，其中内生细菌菌株、植物生长-促进性细菌菌株或内生和植物生长-促进性细菌菌株包括巨大芽孢杆菌EE385(NRRL 
B-50980)、杆菌sp.EE387 (NRRL B-50981)、环状芽孢杆菌EE388(NRRL B-50982)、枯草芽胞杆菌 EE405(NRRL B-50978)、Lysinibacillus fusiformis EE442(NRRL B-50975)、
Lysinibacillus sphaericus EE443(NRRL B-50976)、短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL B-
67123)、枯草芽胞杆菌EE148(NRRL B-50927)、枯草芽胞杆菌EE218(NRRL B-50926)或巨大
芽孢杆菌EE281 (NRRL B-50925)。

[1759] 实施方案164是实施方案163所述的重组孢子-形成细菌，其中内生细菌菌株包括杆菌sp.EE387(NRRL B-50981)。

[1760] 实施方案165是实施方案142-146中任一项所述的融合蛋白、实施方案147-149、151-153和156-164中任一项所述的重组孢子-形成细菌、或者实施方案150、151和154-159
中任一项所述的种子，其中融合蛋白还包含孢子外壳蛋白和目标蛋白或肽之间的氨基酸接
头。

[1761] 实施方案166是实施方案165所述的融合蛋白、重组孢子-形成细菌或种子，其中接头包括聚丙氨酸接头、聚甘氨酸接头、或包含丙氨酸与甘氨酸残基两者的混合物的接头。

[1762] 实施方案167是实施方案166所述的融合蛋白、重组孢子-形成细菌或种子，其中接头包含蛋白酶识别位点。

[1763] 实施方案168是实施方案1-3和142-146中任一项所述的融合蛋白、实施方案16-29、48-63和99-141中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员、实施方案147-149、151-
153和156-167中任一项所述的重组孢子-形成细菌、或者实施方案150、151和154-167中任
一项所述的植物种子，其中目标蛋白或肽包括植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原
体侵害的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽、植物结合蛋白或肽、催化一氧化氮产生的酶或核酸结合蛋白或肽。

[1764] 实施方案169是实施方案168所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中目标蛋白或肽包括植物生长刺激蛋白或肽。

[1765] 实施方案170是实施方案169所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物生长刺激蛋白或肽包括肽激素、非-激素肽、涉及植物生长刺激化合物产生或活化的酶、或降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶。

[1766] 实施方案171是实施方案170所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物生长刺激蛋白或肽包括肽激素。

[1767] 实施方案172是实施方案171所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中肽激素包括植物磺肽素、clavata3(CLV3)、系统素、ZmlGF、或SCR/SP11。

[1768] 实施方案173是实施方案172所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物磺肽素包括植物磺肽素-α。

[1769] 实施方案174是实施方案170所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物生长刺激蛋白或肽包括非-激素肽。

[1770] 实施方案175是实施方案174所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中非-激素肽包括RKN 16D10、Hg-Syv46、eNOD40肽、蜂毒肽、肥大脱粒肽、Mas7、RHPP、 POLARIS或kunitz胰蛋白酶抑制剂(KTI)。

[1771] 实施方案176是实施方案170所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物生长刺激蛋白或肽包括植物生长刺激化合物的产生
或活化中所涉及的酶。

[1772] 实施方案177是实施方案176所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物生长刺激化合物包括由根际中的细菌或真菌产生的
化合物。

[1773] 实施方案178是实施方案177所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中由根际中的细菌或真菌产生的化合物包括2,3-丁二醇。

[1774] 实施方案179是实施方案176所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物生长刺激化合物包括植物生长激素。

[1775] 实施方案180是实施方案179所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物生长激素包括细胞分裂素或细胞分裂素衍生物、乙
烯、生长素或生长素衍生物、赤霉酸或赤霉酸衍生物、脱落酸或脱落酸衍生物、或茉莉酸或茉莉酸衍生物。

[1776] 实施方案181是实施方案180所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物生长激素包括细胞分裂素或细胞分裂素衍生物，并且细胞分裂素或细胞分裂素衍生物包括激动素、顺式-玉米素、反式-玉米素、6-苄氨基嘌呤、二羟基玉米素、N6-(D2- 异戊烯基)腺嘌呤、玉米素核苷、N6-(D2-异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-顺式- 玉米素核苷、顺式-玉米素核苷、反式-玉米素核苷、2-甲硫基-反式-玉米素核苷、玉米素核苷-5-单磷酸、N6-甲氨基嘌呤、N6-二甲氨基嘌呤、2'-脱氧玉米素核糖核苷、4-羟基-3-甲基-反式-2-丁烯基氨基嘌呤、邻topolin、间topolin、苄基腺嘌呤、邻甲基topolin、间甲基topolin、或其组合；或其中植物生长激素包括活性生长素、非活性生长素、缀合生长素、天然存在的生长素、或合成生长素、或其组合。

[1777] 实施方案182是实施方案180或181所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物生长激素包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-乙酰胺、吲哚-3-乙腈、吲哚-3-乙醇、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-丁酸、苯乙酸、4-氯吲哚-3-乙酸、葡萄糖缀合的生长素或其组合。

[1778] 实施方案183是实施方案176-182中任一项所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物生长刺激蛋白或肽包括乙偶姻还原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸单加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、丙酮酸脱羧酶、二乙酰还原酶、丁二醇脱氢酶、氨基转移酶、色氨酸脱羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脱羧酶、吲哚-3-乙醛脱氢酶、色氨酸侧链氧化酶、腈水解酶、腈水解酶、肽酶、蛋白酶、腺苷磷酸异戊烯转移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、CYP735A、5'核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素顺式-反式异构酶、玉米素O-葡萄糖基转移酶、β-葡糖苷酶、顺式-羟化酶、CK顺式-羟化酶、CKN-葡萄糖基转移酶、2,5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素还原酶、羟胺还原酶、2-酮戊二酸双加氧酶、赤霉素2B/3B水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脱乙酰甲壳质酶、甲壳质酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6- 葡聚糖酶、氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、或产生nod因子中所涉及的酶。

[1779] 实施方案184是实施方案183所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中涉及植物生长刺激化合物产生或活化的酶包括产生nod因
子中所涉及的酶，并且所述产生nod 因子中所涉及的酶包括nodA、nodB或nodI；或其中涉及植物生长刺激化合物产生或活化的酶包括氨基转移酶，并且氨基转移酶包括色氨酸氨基转
移酶。

[1780] 实施方案185是实施方案183所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中涉及植物生长刺激化合物产生或活化的酶包括裂解蛋白、肽、原蛋白、或前原蛋白以产生生物活性肽的蛋白酶或肽酶。

[1781] 实施方案186是实施方案183所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中蛋白酶或肽酶包括枯草芽孢杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、或金属蛋白酶。

[1782] 实施方案187是实施方案185或186所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中生物活性肽包括RKN16D10或RHPP。

[1783] 实施方案188是实施方案185-187中任一项所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中蛋白酶或肽酶裂解富含蛋白质的粗粉中的蛋白质。

[1784] 实施方案189是实施方案188所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中富含蛋白质的粗粉是大豆粉或酵母提取物。

[1785] 实施方案190是实施方案183所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中涉及植物生长刺激化合物产生或活化的酶包括壳聚糖酶，其中壳聚糖酶包含与SEQ ID NO:313 具有至少85％、至少95％、至少98％、至少99％或
100％同一性的氨基酸序列。

[1786] 实施方案191是实施方案170所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物生长刺激蛋白或肽包括降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶。

[1787] 实施方案192是实施方案191所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶包括纤维素酶、脂肪酶、木质素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木质酶、葡萄糖苷酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、果胶酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、尿素酶、木聚糖酶、以及铁载体。

[1788] 实施方案193是实施方案192所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中磷脂酶包括磷脂酶 A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D或溶血磷脂酶。

[1789] 实施方案194是实施方案193所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中磷脂酶包括磷脂酶C 并且磷脂酶C包含与SEQ ID NO:312
具有至少85％、至少95％、至少 98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1790] 实施方案195是实施方案192所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶包括纤维素酶，并且纤维素酶包括内切纤维素酶、外切纤维素酶或β-葡萄糖苷酶。

[1791] 实施方案196是实施方案195所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子其中纤维素酶包括内切纤维素酶，并且内切纤维素酶包括内切
葡聚糖酶。

[1792] 实施方案197是实施方案195或196所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中纤维素酶包括内切纤维素酶，并且内切纤维素酶包括枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶、苏云金芽孢杆菌内切葡聚糖酶、蜡样芽胞杆菌内切葡聚糖酶
或杆菌clausii 内切葡聚糖酶。

[1793] 实施方案198是实施方案197所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中纤维素酶包括枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶，并且枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶包含与SEQ ID NO:311具有至少85％、至少95％、至少98％、至少99％或
100％同一性的氨基酸序列。

[1794] 实施方案199是实施方案195所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中纤维素酶包括外切纤维素酶，并且外切纤维素酶包括
Trichoderma reesei外切纤维素酶。

[1795] 实施方案200是实施方案195所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶，并且β-葡萄糖苷酶包括枯草芽胞杆菌β-葡萄糖苷酶、苏云金芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶、蜡样芽胞杆菌β-葡萄糖苷酶或杆菌clausiiβ-葡萄糖苷酶。

[1796] 实施方案201是实施方案192所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶包括脂肪酶，并且脂肪酶包括枯草芽胞杆菌脂肪酶、苏云金芽孢杆菌脂肪酶、蜡样芽胞杆菌脂肪酶或杆菌
clausii脂肪酶。

[1797] 实施方案202是实施方案192所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶包括木质素氧化酶，并且木质素氧化酶包括木质素过氧化物酶、虫漆酶、乙二醛氧化酶、木质素酶或锰过氧化物酶。

[1798] 实施方案203是实施方案192所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶包括蛋白酶，并且蛋白酶包括枯草芽孢杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白酶、肽酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸盐蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。

[1799] 实施方案204是实施方案192所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶包括磷酸酶，并且磷酸酶包括磷酸单酯水解酶、磷酸单酯酶、磷酸二酯水解酶、磷酸二酯酶、三磷酸单酯水解酶、磷酰酸酐水解酶、焦磷酸酶、肌醇六磷酸酶、三偏磷酸酶或三磷酸酶。

[1800] 实施方案205是实施方案204所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶包括磷酸单酯
酶，并且磷酸单酯酶包括PhoA4；或其中降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶包括肌醇六磷酸酶，并且肌醇六磷酸酶包括枯草芽胞杆菌EE148肌醇六磷酸酶或苏云金芽孢杆菌 
BT013A肌醇六磷酸酶。

[1801] 实施方案206是实施方案192所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中降解或改变细菌、真菌或植物营养源的酶包括固氮酶，和固氮酶包括Nif家族固氮酶。

[1802] 实施方案207是实施方案206所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中Nif家族固氮酶包括马赛类芽孢杆菌NifBDEHKNXV。

[1803] 实施方案208是实施方案168所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中目标蛋白或肽包括保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽。

[1804] 实施方案209是实施方案208所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽包括植物免疫系统
增强蛋白或肽。

[1805] 实施方案210是实施方案209所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物免疫系统增强蛋白或肽包括过敏蛋白、过敏蛋白样蛋白、α-弹性蛋白、β-弹性蛋白、系统素、苯丙氨酸解氨酶、激发素、防卫素、隐地蛋白、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白肽。

[1806] 实施方案211是实施方案210所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中鞭毛蛋白肽包括 flg22。

[1807] 实施方案212是实施方案208所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽具有抗细菌活性、抗真菌活性、或抗细菌和抗真菌活性两者。

[1808] 实施方案213是实施方案212所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽包括细菌素、溶菌
酶、溶菌酶肽、铁载体、非核糖体活性肽、伴清蛋白、白蛋白、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽或TasA。

[1809] 实施方案214是实施方案213所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中溶菌酶肽包括LysM 或其中乳铁蛋白肽包括LfcinB。

[1810] 实施方案215是实施方案208所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽具有杀虫活性、驱虫活性、抑制昆虫或蠕虫捕食、或其组合。

[1811] 实施方案216是实施方案215所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽包括杀虫细菌毒素、内毒素、Cry毒素、蛋白酶抑制剂蛋白或肽、半胱氨酸蛋白酶或甲壳质酶。

[1812] 实施方案217是实施方案216所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽包括杀虫细菌毒素，并且杀虫细菌毒素包括VIP杀虫蛋白；其中保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽包括蛋白
酶抑制剂蛋白或肽，并且蛋白酶抑制剂蛋白或肽包括胰蛋白酶抑制剂慈菇蛋白酶抑制剂；
或其中保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽包括Cry毒素，并且Cry毒素包括来自苏云金芽
孢杆菌的Cry毒素。

[1813] 实施方案218是实施方案217所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中Cry毒素包括来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素，并且包括来自苏云金芽孢杆菌的Cry毒素的 Cry毒素包括是Cry5B蛋白或Cry21A蛋白。

[1814] 实施方案219是实施方案208所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中保护植物免受病原体侵害的蛋白包括酶。

[1815] 实施方案220是实施方案219所述的合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中酶包括蛋白酶或内酯酶。

[1816] 实施方案221是实施方案220所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中蛋白酶或内酯酶对细菌信号传导分子有特异性。

[1817] 实施方案222是实施方案221所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中细菌信号传导分子包括细菌内酯高丝氨酸信号传导分子。

[1818] 实施方案223是实施方案220-222中任一项所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中酶包括 1,4-内酯酶、2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶、3-氧代己二酸烯醇-内酯酶、放线菌素内酯酶、脱氧柠檬酸A-环-内酯酶、葡糖酸内酯酶L-鼠李糖-1,4-内酯酶、柠檬苦素-D-环-内酯酶、类固醇-内酯酶、三乙酸酯-内酯酶或木质-1,4- 内酯酶。

[1819] 实施方案224是实施方案219所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中酶对细菌或真菌的细胞组分有特异性。

[1820] 实施方案225是实施方案224所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中酶包括β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、壳多糖酶、脱乙酰壳多糖酶样酶、溶细胞酶、肽酶、蛋白酶、蛋白酶、变溶菌素、葡萄球菌溶血素或溶菌酶。

[1821] 实施方案226是实施方案225所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中酶包括壳聚糖酶，其中壳聚糖酶包含与SEQ ID NO:313具
有至少85％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1822] 实施方案227是实施方案225所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中蛋白酶包括碱性蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶。

[1823] 实施方案228是实施方案208-227中任一项所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽保护植物免受细菌性病原体、真菌性病原体、蠕虫病原体或昆虫病原体侵害。

[1824] 实施方案229是实施方案228所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中细菌病原菌包括根癌土壤杆菌、玉米细菌性枯萎病菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、茄科雷尔氏菌、丁香假单胞菌、绿脓假单胞菌、野油菜黄单胞菌或其组合。

[1825] 实施方案230是实施方案228所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽保护植物免受蠕虫
或昆虫病原体捕食。

[1826] 实施方案231是实施方案228或230所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中包括粘虫、小地老虎、欧洲玉米螟、草地贪夜蛾、切根虫、日本甲虫、小玉米茎蛀虫、玉米象虫、种蝇、结网虫、玉米草螟、南部玉米根虫、南部马铃薯金针虫、普通蛀茎夜蛾、甘蔗犀金龟、蛴螬、甘蓝粉纹夜蛾、棉铃象虫、黄色条纹粘虫、橙足负泥虫、高粱长蝽、蚜虫、甜菜夜蛾、墨西哥豆瓢虫、大豆夜蛾、大豆天牛、或其组合。

[1827] 实施方案232是实施方案168所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中目标蛋白或肽包括至少一种提高植物的胁迫抗性的蛋白
或肽。

[1828] 实施方案233是实施方案232所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽包括降解胁迫相关化合
物的酶。

[1829] 实施方案234是实施方案233所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或种子，其中胁迫相关化合物包括氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、活性氧物质、氧化氮、氧脂素、酚醛塑料或其组合。

[1830] 实施方案235是实施方案233或234所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中降解胁迫相关化合物的酶包括超氧化物歧化酶、氧化酶、过氧化氢酶、氨基环丙烷-1- 羧酸脱氨酶、过氧化物酶、抗氧化酶、或抗氧化肽。

[1831] 实施方案236是实施方案235所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中降解胁迫相关化合物的酶包括超氧化物歧化酶。

[1832] 实施方案237是实施方案235或236所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中超氧化物歧化酶包含超氧化物歧化酶1(SODA1)或超
氧化物歧化酶2(SODA2)。

[1833] 实施方案238是实施方案237所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中超氧化物歧化酶包含与SEQ ID NO:155或156具有至少
85％、至少95％、至少98％、至少 99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1834] 实施方案239是实施方案232所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽包括保护植物免于环境
胁迫的蛋白或肽。

[1835] 实施方案240是实施方案239所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中环境胁迫包括例如干旱、洪水、热、冰冻、盐、重金属、低pH、高pH或其组合。

[1836] 实施方案241是实施方案239或240所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中保护植物免于环境胁迫的蛋白或肽包括冰核蛋白、脯氨酰肽酶、苯丙氨酸解氨酶、异分支酸合酶、异分支酸丙酮酸裂解酶、或胆碱脱氢酶。

[1837] 实施方案242是实施方案168所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中融合蛋白包括至少一种植物结合蛋白或肽。

[1838] 实施方案243是实施方案242所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物结合蛋白或肽包括粘附素、鞭毛蛋白、omptin、外源凝集素、扩张蛋白、生物膜结构蛋白、菌毛蛋白、卷曲蛋白、紧密粘附素、侵袭素、凝集素、以及非菌毛蛋白。

[1839] 实施方案244是实施方案243所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中植物结合蛋白包括粘附素，并且粘附素包括根钙粘素；或其中植物结合蛋白包括生物膜结构蛋白，并且生物膜结构蛋白包括TasA或YuaB。

[1840] 实施方案245是实施方案4所述融合蛋白、或实施方案168 所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中目标蛋白或肽包括催化一氧化氮产生的酶。

[1841] 实施方案246是实施方案245所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中催化一氧化氮产生的酶包括一氧化氮合酶或精氨酸酶。

[1842] 实施方案247是实施方案245所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中，其中催化一氧化氮产生的酶包括一氧化氮合酶。

[1843] 实施方案248是实施方案247所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中一氧化氮合酶包含苏云金芽孢杆菌一氧化氮合酶或枯草
芽胞杆菌一氧化氮合酶。

[1844] 实施方案249是实施方案248所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中一氧化氮合酶包含来自苏云金芽孢杆菌BT013A或枯草芽
胞杆菌168的一氧化氮合酶。

[1845] 实施方案250是实施方案245-249中任一项所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中一氧化氮合酶包含与SEQ ID NO:260或261具有至少85％、至少90％、至少 95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

[1846] 实施方案251是实施方案245-250中任一项所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中融合蛋白包含SEQ ID NO:262或263。

[1847] 实施方案252是实施方案4所述的融合蛋白、或实施方案168 所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中目标蛋白或肽包括核酸结合蛋白或肽。

[1848] 实施方案253是实施方案252所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中核酸结合蛋白或肽包括RNA结合蛋白或肽、或者DNA结合蛋白或肽。

[1849] 实施方案254是实施方案253所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中核酸结合蛋白或肽包含RNA结合蛋白或肽。

[1850] 实施方案255是实施方案254所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中RNA结合蛋白或肽包括非特异性RNA结合蛋白或肽。

[1851] 实施方案256是实施方案254所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中RNA结合蛋白或肽包括特异性RNA结合蛋白或肽。

[1852] 实施方案257是实施方案254所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中RNA结合蛋白或肽包括Hfq蛋白。

[1853] 实施方案258是实施方案257所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中Hfq蛋白包括苏云金芽孢杆菌Hqf蛋白。

[1854] 实施方案259是实施方案253所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中核酸结合蛋白或肽包括DNA结合蛋白或肽。

[1855] 实施方案260是实施方案259所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中DNA结合蛋白或肽包括小酸溶性孢子蛋白(SASP)。

[1856] 实施方案261是实施方案260所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中SASP包括由下列基因编码的SASP：SspA基因SspB基因、
SspC基因、SspD基因、SspE 基因、SspF基因、SspG基因、SspH基因、SspI基因、SspJ基因、SspK 基因、SspL基因、SspM基因、SspN基因、SspO基因或SspP基因。

[1857] 实施方案262是实施方案261所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中SASP包括SASPα、 SASPβ或SASPγ。

[1858] 实施方案263是实施方案260-262中任一项所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中SASP 包括苏云金芽孢杆菌SASP。

[1859] 实施方案264是实施方案252-263中任一项所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中核酸结合蛋白或肽包含与SEQ ID NO:264-
266中任一个具有至少85％。至少 90％。至少95％。至少98％。至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[1860] 实施方案265是实施方案252-264中任一项所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、或重组孢子-形成细菌、或植物种子，其中融合蛋白包括SEQ ID NO:267、268或269。

[1861] 实施方案266是实施方案252-254和259中任一项所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中核酸结合蛋白或肽包括具有灭活活性位点的核酸酶。

[1862] 实施方案267是实施方案252-266中任一项所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子,还包含结合核酸结合蛋白或肽的核酸分子。

[1863] 实施方案268是实施方案267所述的融合蛋白、重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或植物种子，其中核酸分子包括调节 RNA分子、RNAi分子、微RNA、适配体、或编码调节RNA分子、RNAi 分子、微小RNA或适体的DNA分子。

[1864] 实施方案269是实施方案4所述的融合蛋白、或实施方案 16-29、48-63、99-141和168-268中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或植物种子，其中靶向序列包含SEQ 
ID NO:96。

[1865] 实施方案270是共表达至少一种融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含实施方案168-241和245-269中任一项所述的植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受
病原体侵害的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽、催化一氧化氮产生的酶或核酸
结合蛋白或肽，并且至少一种融合蛋白包含实施方案242-244和269中任一项所述的植物结
合蛋白或肽。

[1866] 实施方案271是实施方案16-141和168-270中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括炭疽杆菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、Bacillusgaemokensis、韦氏芽孢杆菌、杆菌toyoiensis 或其组合。

[1867] 实施方案272是实施方案271所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括苏云金芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌。

[1868] 实施方案273是实施方案271或272所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含植物生长促进性细菌菌株。

[1869] 实施方案274是实施方案273所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中植物生长促进性细菌菌株产生杀虫毒素、产生杀真菌化合物、产生杀线虫化合物、产生杀菌化合物、对一种或多种抗生素有抗性、包含一个或多个自由复制的质粒、结合至植物根部、定殖植物根部、形成生物膜、溶解营养素、分泌有机酸、或其组合。

[1870] 实施方案275是实施方案274所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中杀线虫化合物包括Cry毒素；其中杀真菌化合物包括β-1,3-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、溶细胞酶或其组合；或其中杀线虫化合物包括 Cry毒素。

[1871] 实施方案276是实施方案273-275中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中植物生长促进性细菌菌株包括蕈状芽孢杆菌BT155 (NRRL No.B-50921)、蕈状芽孢杆菌
EE118(NRRL No.B-50918)、蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL No.B-50921)、蕈状芽孢杆菌BT46-3
(NRRL No. B-50922)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE128(NRRL No.B-50917)、苏云金芽孢杆菌
BT013A(NRRL No.B-50924)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE349 (NRRL No.B-50928)；蜡样芽胞
杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)；或
蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)。

[1872] 实施方案277是实施方案276所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中植物生长促进性细菌菌株包括蕈状芽孢杆菌BT155(NRRL No. B-50921)、蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL 
No.B-50921)或苏云金芽孢杆菌 BT013A(NRRL No.B-50924)。

[1873] 实施方案278是实施方案16-141和168-275中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括内生细菌菌株。

[1874] 实施方案279是实施方案278的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中内生细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No. B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRL 
B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)、蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-50977)、或苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL B-50983)、苏云金芽孢杆菌EE-B00184 (NRRL B-67122)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-
67120)、或蕈状芽孢杆菌 EE-B00363(NRRL B-67121)。

[1875] 实施方案280是实施方案279所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中内生细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRL B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-
50979)、蜡样芽胞杆菌 EE444(NRRL B-50977)、苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL B-50983)、苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122)、蜡样芽胞杆菌家族成员 EE-B00377(NRRL B-
67119)；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)；或蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-
67121)。

[1876] 实施方案281是实施方案16-141和186-275中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株。

[1877] 实施方案282是实施方案281所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员 EE349(NRRL No.B-50928)、蜡样芽胞
杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)；或
蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)。

[1878] 实施方案283是实施方案125、128、281和282中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株降解磺酰脲除草剂、芳基三嗪除草剂、麦草畏2,4-D、苯氧基除草剂、除虫菊酯、拟除虫菊酯或其组合。

[1879] 实施方案284是实施方案283所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中磺酰脲除草剂包括磺胺腙。

[1880] 实施方案285是实施方案282或283所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中能降解杀虫剂的细菌菌株降解除虫菊酯。

[1881] 实施方案286是实施方案16-141和186-275中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括益生菌细菌菌株。

[1882] 实施方案287是实施方案286中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中益生菌细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349 NRRL No.B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成
员EE439(NRRL B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)或蜡样芽胞杆菌EE444
(NRRL B-50977)。

[1883] 实施方案288是16-141和168-287所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含其。

[1884] 实施方案289是实施方案288所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中BclA基因中的失活突变包括BclA基因的敲除。

[1885] 实施方案290是实施方案16-29、48-63、99-141和168-289 中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中融合蛋白在天然于融合蛋白或其蛋白的靶向序列、外孢壁蛋白
或外孢壁蛋白片段的孢子形成启动子控制下表达。

[1886] 实施方案291是实施方案17-27中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中调节子蛋白在其天然启动子或其蛋白控制下表达。

[1887] 实施方案292是实施方案16-29、48-63、99-141和168-291 中任一项所述的所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中融合蛋白或调节子蛋白在高表达孢子形成启动子控制下
表达。

[1888] 实施方案293是实施方案292所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中高表达孢子形成启动子包含σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列。

[1889] 实施方案294是实施方案290-293中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中孢子形成启动子包含与SEQ ID NO:157-231中任一项所述的核酸序列具有至少80％、至
少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。

[1890] 实施方案295是实施方案290-293中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中启动子包含与SEQ ID NO:157、158、161、162、 189、190、215、220、221、225、229或230具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核酸序列。

[1891] 实施方案296是实施方案293-295中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中σ-K孢子形成-特异性聚合酶启动子序列与SEQ ID NO:157-231中任一个的相应核苷酸具
有100％同一性。

[1892] 实施方案297是生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌为：

[1893] (a)蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRL B-50979)；

[1894] (b)苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)；

[1895] (c)蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-50977)；

[1896] (d)苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL B-50983)；

[1897] (e)苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122)；

[1898] (f)蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；

[1899] (g)假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)；或

[1900] (h)蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)。

[1901] 实施方案298是实施方案297所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRL B-50979)，并且细菌具有与SEQ ID NO:277的序列
具有至少98％、至少 99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1902] 实施方案299是实施方案297所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)，并且细菌具有与SEQ ID NO:278的序列具有至
少98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1903] 实施方案300是实施方案297所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-50977)，并且细菌具有与SEQ ID NO:279的序列具有至少
98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1904] 实施方案301是实施方案297所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL B-50983)，并且细菌具有与SEQ ID NO:280的序列具有至
少98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1905] 实施方案302是实施方案297所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122)，并且细菌具有与SEQ ID NO:301的序列具
有至少98％、至少99％或 100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1906] 实施方案303是实施方案297所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)，并且细菌具有与SEQ ID NO:304的
序列具有至少98％、至少 99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1907] 实施方案304是实施方案297所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)，并且细菌具有与SEQ ID NO:303的序列具
有至少98％、至少99％或 100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1908] 实施方案305是实施方案297所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)，并且细菌具有与SEQ ID NO:302的序列具有
至少98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1909] 实施方案306是生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是实施方案297-305中任一项所述的细菌的变体，包含一种或多种突变，其中细菌是内生的。

[1910] 实施方案307是生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是:

[1911] (a)巨大芽孢杆菌EE385(NRRL B-50980)；

[1912] (b)杆菌sp.EE387(NRRL B-50981)；

[1913] (c)环状芽孢杆菌EE388(NRRL B-50982)；

[1914] (d)枯草芽胞杆菌EE405(NRRL B-50978)；

[1915] (e)Lysinibacillus fusiformis EE442(NRRL B-50975)；

[1916] (f)Lysinibacillus sphaericus EE443(NRRL B-50976)；或

[1917] (g)短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL B-67123)。

[1918] 实施方案308是实施方案307所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是巨大芽孢杆菌EE385(NRRL B-50980)，并且细菌具有与SEQ ID NO:281的序列具有至少
98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1919] 实施方案309是实施方案307所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是杆菌sp.EE387(NRRL B-50981)，并且细菌具有与SEQ ID NO:282的序列具有至少98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1920] 实施方案310是实施方案307所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是环状芽孢杆菌EE388(NRRL B-50982)，并且细菌具有与SEQ ID NO:283的序列具有至少
98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1921] 实施方案311是实施方案307所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是枯草芽胞杆菌EE405(NRRL B-50978)，并且细菌具有与SEQ ID NO:284的序列具有至少
98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1922] 实施方案312是实施方案307所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是Lysinibacillus fusiformis EE442(NRRL B-50975)，并且细菌具有与SEQ ID NO:285
的序列具有至少98％、至少 99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1923] 实施方案313是实施方案307所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是Lysinibacillus sphaericus EE443(NRRL B-50976)，并且细菌具有与SEQ ID NO:286
的序列具有至少98％、至少 99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1924] 实施方案314是实施方案307所述的生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL B-67123)，并且细菌具有与SEQ ID NO:305的序列具有
至少98％、至少99％或100％序列同一性的16S核糖体RNA序列。

[1925] 实施方案315是生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是实施方案307-314中任一项所述的细菌的变体，包含一种或多种突变，其中细菌是内生的。

[1926] 实施方案316是生物学纯细菌培养基，其中细菌培养基中的细菌是实施方案307-315中任一项所述的细菌的变体，包含一种或多种突变，其中细菌是益生菌。

[1927] 实施方案317是施加于植物、植物种子、植物生长介质、或植物或植物种子周围的区域的接种剂，其中接种剂有效量的实施方案 297-316中任一项所述的生物学纯细菌培养
基和农业上可接受的载体。

[1928] 实施方案318是实施方案317所述的接种剂，其中接种剂包含有效量的至少两种实施方案297-316中任一项所述的生物学纯细菌培养基的混合物。

[1929] 实施方案319是实施方案317或318所述的接种剂，其中接种剂进一步包含有效量的根茎细菌。

[1930] 实施方案320是实施方案319所述的接种剂，其中根茎细菌是根茎细菌菌株的生物学纯细菌培养基。

[1931] 实施方案321是实施方案319或320所述的接种剂，其中根茎细菌包括Bradyrhizobium genus细菌、Rhizobium genus细菌或其组合。

[1932] 实施方案322是实施方案321所述的接种剂，其中 Bradyrhizobium genus细菌包括Bradyrhizobium japonicum。

[1933] 实施方案323是实施方案322所述的接种剂，其中Rhizobium genus细菌包括Rhizobium phaseoli、Rhizobium leguminosarum或其组合。

[1934] 实施方案324是包覆下列的植物种子:(i)催化一氧化氮产生的酶；(ii)超氧化物歧化酶；或(iii)表达催化一氧化氮产生的酶或超氧化物歧化酶的重组微生物，其中在相同条件下在野生型微生物中相比于催化一氧化氮产生的酶或超氧化物歧化酶的表达，催化一
氧化氮产生的酶或超氧化物歧化酶的表达增强。

[1935] 实施方案325是实施方案324所述的植物种子，其中植物种子包覆有催化一氧化氮产生的酶。

[1936] 实施方案326是实施方案324或325所述的植物种子，其中植物种子包覆有表达催化一氧化氮产生的酶的重组微生物。

[1937] 实施方案327是实施方案324-326中任一项所述的植物种子，其中催化一氧化氮产生的酶包括一氧化氮合酶或精氨酸酶。

[1938] 实施方案328是实施方案327所述的植物种子，其中催化一氧化氮产生的酶包括一氧化氮合酶。

[1939] 实施方案329是实施方案328所述的植物种子，其中一氧化氮合酶包含来自苏云金芽孢杆菌BT013A或枯草芽胞杆菌168的一氧化氮合酶。

[1940] 实施方案330是实施方案328或329所述的植物种子，其中一氧化氮合酶包含与SEQ ID NO:260或261具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

[1941] 实施方案331是实施方案324-330中任一项所述的植物种子，其中植物种子包覆有超氧化物歧化酶。

[1942] 实施方案332是实施方案324-331中任一项所述的植物种子，其中植物种子包覆有表达超氧化物歧化酶份重组微生物。

[1943] 实施方案333是实施方案324-332中任一项所述的植物种子，其中超氧化物歧化酶包含超氧化物歧化酶1(SODA1)或超氧化物歧化酶 2(SODA2)。

[1944] 实施方案334是实施方案331-333中任一项所述的植物种子，其中超氧化物歧化酶包含与SEQ ID NO:155或156具有至少85％、至少 90％、至少95％、至少98％、至少99％或
100％同一性的氨基酸序列。

[1945] 实施方案335是实施方案324-334中任一项所述的植物种子，其中重组微生物包括杆菌种、Escherechia coli、Aspergillus species或 Sacchromyces species。

[1946] 实施方案336是实施方案335所述的植物种子，其中杆菌种包括蜡样芽胞杆菌家族成员、枯草芽胞杆菌、地衣形芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。

[1947] 实施方案337是实施方案335所述的植物种子，其中 Aspergillus种包括Aspergillus niger或其中Sacchromyces种包括 Sacchromyces cerevisiae。

[1948] 实施方案338是制剂，包含实施方案16-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或实施方案147-149、152-154和 156-268中任一项所述的重组孢子-形成
细菌、以及农业上可接受的载体。

[1949] 实施方案339是制剂，包含衍生自实施方案100-124、130-141 和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段和农业上可接受的载体。

[1950] 实施方案340是实施方案150、151和154-268中任一项所述的植物种子，其中种子包覆有包含重组孢子-形成细菌和农业上可接受的载体的制剂。

[1951] 实施方案341是实施方案324-337中任一项所述的植物种子，其中种子包覆有包含酶或重组微生物和农业上可接受的载体的制剂。

[1952] 实施方案342是实施方案338或339所述的制剂、实施方案 340或341所述的植物种子、或实施方案317-323中任一项所述的接种剂，其中农业上可接受的载体包括分散剂、表面活性剂、添加剂、水、增稠剂、抗结块剂、残渣分解剂、堆肥配方、颗粒应用、硅藻土、油、着色剂、稳定剂、防腐剂、聚合物、涂料或其组合。

[1953] 实施方案343是实施方案342所述的制剂、植物种子或接种剂，其中农业上可接受的载体包括添加剂，并且添加剂包括油、树胶、树脂、粘土、聚氧乙二醇、萜烯、粘性有机物、脂肪酸酯、硫酸化醇、烷基磺酸盐、石油磺酸盐、醇硫酸盐、烷基丁烷钠diamate、硫代丁烷二酸钠的聚酯、苯乙腈衍生物、蛋白质性材料或其组合；农业上可接受的载体包括增稠剂，并且增稠剂包括聚乙二醇的长链烷基磺酸酯、聚氧乙烯油酸酯或其组合；农业上可接受的载
体包括表面活性剂，并且表面活性剂包括重石油、重油馏出物、多元醇脂肪酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酯、芳基烷基聚氧乙二醇、烷基胺乙酸酯、烷基芳基磺酸酯、多元醇、烷基磷酸酯、或其组合；或农业上可接受的载体包括抗结块剂，并且抗结块剂包括钠盐、碳酸钙、硅藻土或其组合。

[1954] 实施方案344是实施方案343所述的制剂、植物种子或接种剂，其中添加剂包括蛋白质性材料，并且蛋白质性材料包括乳制品、小麦粉、大豆粉、血液、白蛋白、明胶、苜蓿粉、酵母提取物或其组合；或抗结块剂包括钠盐，并且钠盐包括一甲基萘磺酸盐的钠盐、二甲基萘磺酸盐的钠盐、亚硫酸钠、硫酸钠或其组合。

[1955] 实施方案345是实施方案338-344中任一项所述的制剂、植物种子、或实施方案317-323和342-344中任一项所述的接种剂，其中农业上可接受的载体包括蛭石、木炭、糖厂碳化压滤泥浆、米糠、羧甲基纤维素、泥炭、珍珠岩、细砂、碳酸钙、面粉、明矾、淀粉、滑石、聚乙烯吡咯烷酮或其组合。

[1956] 实施方案346是实施方案338-345中任一项所述的制剂、植物种子、或实施方案317-323和342-345中任一项所述的接种剂，其中制剂或接种剂包括种子包被制剂、用于向
植物或向植物生长介质施用的液体制剂、或用于向植物或植物生长介质施用的固体制剂。

[1957] 实施方案347是实施方案346所述的制剂、植物种子或接种剂，其中种子包被制剂包括向种子施用的水基或油基溶液，或者向种子施用的粉末或颗粒制剂。

[1958] 实施方案348是实施方案346所述的制剂、植物种子或接种剂，其中于向植物或向植物生长介质施用的液体制剂包括浓缩制剂或即用制剂。

[1959] 实施方案349是实施方案346所述的制剂、植物种子或接种剂，其中用于向植物或向植物生长介质施用的固体制剂包括颗粒制剂或粉末剂。

[1960] 实施方案350是实施方案338和342-349中任一项所述的制剂、实施方案340或341所述的植物种子、或实施方案317-323和342-349 中任一项所述的接种剂，其中制剂或接种剂还包含农用化学品，农用化学品包括肥料、微量元素肥料、杀虫剂、除草剂、植物生长调理剂、杀真菌剂、杀虫剂、杀螺剂、杀藻剂、细菌菌剂、真菌菌剂或其组合。

[1961] 实施方案351是实施方案350所述的制剂、植物种子或接种剂，其中制剂或接种剂包含细菌菌剂，并且细菌菌剂包括植物生长促进性细菌菌株。

[1962] 实施方案352是实施方案351所述的制剂、植物种子或接种剂，其中植物生长促进性细菌菌株产生杀虫毒素、产生杀真菌化合物、产生杀线虫化合物、产生杀菌化合物、对一种或多种抗生素有抗性、包含一个或多个自由复制的质粒、结合至植物根部、定殖植物根
部、形成生物膜、溶解营养素、分泌有机酸、或其组合。

[1963] 实施方案353是实施方案352所述的制剂、植物种子或接种剂，其中杀线虫化合物包括Cry毒素；其中杀真菌化合物包括β-1,3-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、溶细胞酶或其组合；或其中杀线虫化合物包括Cry毒素。

[1964] 实施方案354是实施方案351-353中任一项所述的制剂、植物种子或接种剂，其中植物生长促进性细菌菌株包括阿氏芽孢杆菌CAP53 (NRRL No.B-50819)、阿氏芽孢杆菌
CAP56(NRRL No.B-50817)、弯曲芽孢杆菌BT054(NRRL No.B-50816)、球形副球菌NC35(NRRL No. B-50820)、蕈状芽孢杆菌BT155(NRRL No.B-50921)、阴沟肠杆菌 CAP12(NRRL No.B-
50822)、尼氏芽孢杆菌BOBA57(NRRL No.NRRL B-50821)、蕈状芽孢杆菌EE118(NRRL No.B-
50918)、枯草芽胞杆菌 EE148(NRRL No.B-50927)、粪产碱菌EE107(NRRL No.B-50920)、蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL NO.B-50916)、蕈状芽孢杆菌BT46-3(NRRL No.B-50922)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE128(NRRL No.B-50917)、苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRL No.B-50924)、马赛类芽孢杆菌BT23 (NRRL No.B-50923)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No. B-50928)、枯草芽胞杆菌EE218(NRRL No.B-50926)、巨大芽孢杆菌 EE281(NRRL No.B-50925)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)、
蕈状芽孢杆菌 EE-B00363(NRRL B-67121)、短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL B-67123) 或苏
云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122)或其组合。

[1965] 实施方案355是实施方案354所述的制剂、植物种子或接种剂，其中植物生长促进性细菌菌株包括球形副球菌NC35(NRRL No. B-50820)、阿氏芽孢杆菌CAP53(NRRL No.B-
50819)或巨大芽孢杆菌 EE281(NRRL No.B-50925)，并且制剂还包含实施方案276或277所
述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[1966] 实施方案356是包覆下列的植物种子：实施方案16-141和 168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员、衍生自实施方案 100-124、130-141和168-296中任一项所
述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子的外孢壁片段、实施方案147-149、151-153、和156-
268中任一项所述的重组孢子-形成细菌、实施方案297-316中任一项所述的生物学纯细菌
培养基、实施方案317-323和342-355中任一项所述的接种剂、或实施方案338、339和342-
355中任一项所述的制剂。

[1967] 实施方案357是用于刺激植物生长的方法，包括：

[1968] 向植物生长介质中引入实施方案16-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员
的制剂；或

[1969] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 16-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所
述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；

[1970] 其中表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含植物生长刺激蛋白或肽。

[1971] 实施方案358是用于刺激植物生长的方法，包括：

[1972] 向植物生长介质中引入实施方案147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组孢子-形成细菌的制
剂；或

[1973] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项
所述的重组孢子-形成细菌的制剂；

[1974] 其中重组孢子-形成细菌表达融合蛋白包含植物生长刺激蛋白或肽。

[1975] 实施方案359是保护植物免受病原体侵害或提高植物的胁迫抗性的方法，包括：

[1976] 向植物生长介质中引入实施方案16-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员
的制剂；或

[1977] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 16-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所
述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；

[1978] 其中表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽或提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽。

[1979] 实施方案360是保护植物免受病原体侵害或提高植物的胁迫抗性的方法，包括：

[1980] 向植物生长介质中引入实施方案147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组孢子-形成细菌的制
剂；或

[1981] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项
所述的重组孢子-形成细菌的制剂；

[1982] 其中重组孢子-形成细菌表达融合蛋白包含保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽或提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽。

[1983] 实施方案361是实施方案359或360所述的方法，其中方法是保护植物免受病原体侵害的方法，并且在包含重组蜡样芽孢杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的植物生长介
质中生长的植物与在不含重组蜡样芽孢杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的相同植物生
长介质中在相同条件下生长的植物相比较优选不易受病原体的感染。

[1984] 实施方案362是实施方案359或360所述的方法，其中方法是提高植物的胁迫抗性的方法，并且在包含重组蜡样芽孢杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的植物生长介质中
生长的植物与在不含重组蜡样芽孢杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的相同植物生长介
质中在相同条件下生长的植物相比较优选不易受到胁迫。

[1985] 实施方案363是在植物上固定重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的方法，包括：

[1986] 向植物生长介质中引入实施方案16-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员
的制剂；或

[1987] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 16-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所
述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；

[1988] 其中表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含植物结合蛋白或肽。

[1989] 实施方案364是在植物上固定重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子的方法，包括：

[1990] 向植物生长介质中引入实施方案147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组孢子-形成细菌的制
剂；或

[1991] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项
所述的重组孢子-形成细菌的制剂；

[1992] 其中表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌包含植物结合肽。

[1993] 实施方案365是刺激植物种子发芽的方法，包括：

[1994] 向植物生长介质中引入实施方案16-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员
的制剂；或

[1995] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 16-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所
述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；

[1996] 其中表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含超氧化物歧化酶或催化一氧化氮产生的酶。

[1997] 实施方案366是刺激植物种子发芽的方法，包括：

[1998] 向植物生长介质中引入实施方案147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组孢子-形成细菌的制
剂；或

[1999] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项
所述的重组孢子-形成细菌的制剂；

[2000] 其中表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌包含超氧化物歧化酶或催化一氧化氮产生的酶。

[2001] 实施方案367是实施方案357-360和363-366中任一项所述的方法，其中植物生长刺激蛋白或肽、保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽、提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽、植物结合蛋白或肽或超氧化物歧化酶或催化一氧化氮产生的酶物理附着于重组蜡样芽胞杆
菌家族成员的外孢壁或重组孢子-形成细菌的孢子包衣。

[2002] 实施方案368是实施方案365-367中任一项所述的方法，其中方法包括向植物种子施加重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或制剂。

[2003] 实施方案369是实施方案365-371中任一项所述的方法，还包括向植物生长介质、植物种子、植物、或者围绕植物或植物种子的区域施加L-精氨酸。

[2004] 实施方案370是实施方案369所述的方法，其中方法包括L- 精氨酸施加至植物的地上部分。

[2005] 实施方案371是实施方案369所述的方法，其中方法包括L- 精氨酸施加至植物种子。

[2006] 实施方案372是实施方案365-371中任一项所述的方法，其中相比于在不含重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的相同植物生长介质中在相同条件下生长的种
子、或者在相同条件下未施加重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的种子，包含重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的植物生长介质中的种子、或者已经
施加重组蜡样芽胞杆菌家族成员或重组孢子-形成细菌的种子优选具有增强的发芽率。

[2007] 实施方案373是递送核酸至植物的方法，包括：

[2008] 向植物生长介质中引入实施方案16-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员
的制剂；或

[2009] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 16-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所
述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；

[2010] 其中表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含核酸结合蛋白，并且其中核酸结合蛋白或肽结合核酸分子。

[2011] 实施方案374是实施方案373所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括内生细菌菌株。

[2012] 实施方案375是实施方案374所述的方法，其中内生细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No.B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRL B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)、蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-50977)、或苏云金芽孢杆菌 
EE319(NRRL B-50983)、苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122)、蜡样芽胞杆菌家族成
员EE-B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢杆菌 EE-B00366(NRRL B-67120)；或蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)。

[2013] 实施方案376是实施方案375所述的方法，其中内生细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRL B-50979)、苏云金芽孢杆菌 EE417(NRRL B-50979)、蜡样芽胞杆菌
EE444(NRRL B-50977)、或苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL B-50983)、苏云金芽孢杆菌EE-
B00184 (NRRL B-67122)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢
杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)；或蕈状芽孢杆菌 EE-B00363(NRRL B-67121)。

[2014] 实施方案377是递送核酸至植物，包括：

[2015] 向植物生长介质中引入实施方案147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组孢子-形成细菌的制
剂；或

[2016] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项
所述的重组孢子-形成细菌的制剂；

[2017] 其中重组孢子-形成细菌表达融合蛋白包含核酸结合蛋白,并且其中核酸结合蛋白或肽结合核酸分子。

[2018] 实施方案378是实施方案377所述的方法，其中重组孢子-形成细菌包含内生细菌菌株。

[2019] 实施方案379是实施方案378所述的方法，其中内生细菌菌株包括巨大芽孢杆菌EE385(NRRL B-50980)、杆菌sp.EE387(NRRL B-50981)、环状芽孢杆菌EE388(NRRL B-
50982)、枯草芽胞杆菌EE405 (NRRL B-50978)、Lysinibacillus fusiformis EE442(NRRL B-50975)、或 Lysinibacillus sphaericus EE443(NRRL B-50976)或短小芽孢杆菌 EE-
B00143(NRRL B-67123)。

[2020] 实施方案380是将核酸分子递送至动物、昆虫或蠕虫的方法，包括向动物、昆虫或蠕虫喂养植物，所述植物被修饰为包含这样水平的核酸分子，该水平大于在在相同条件下
生长的在未被修饰的相同植物中的核酸分子的水平。

[2021] 实施方案381是将核酸分子递送至动物、昆虫或蠕虫的方法，包括向动物、昆虫或蠕虫喂养植物：

[2022] 表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片
段；或

[2023] 表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌，融合蛋白包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白；

[2024] 其中目标蛋白或肽包括核酸结合蛋白或肽，并且核酸分子结合核酸结合蛋白或肽。

[2025] 实施方案382是实施方案380或381所述的方法，其中蠕虫是线虫。

[2026] 实施方案383是向真菌或原生动物递送核酸分子的方法，方法包括使真菌或原生动物接触：

[2027] 表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片
段；或

[2028] 表达融合蛋白的重组孢子-形成细菌，融合蛋白包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白；

[2029] 其中目标蛋白或肽包括核酸结合蛋白或肽并且核酸分子结合核酸结合蛋白或肽。

[2030] 实施方案384是实施方案373-379和381-383中任一项所述的方法，其中核酸结合蛋白或肽物理附着于重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁或重组孢子-形成细菌的孢子包
衣。

[2031] 实施方案385是实施方案373-384中任一项所述的方法，其中核酸分子包括调节RNA分子、RNAi分子、微RNA、适配体、或编码调节RNA分子、RNAi分子、微小RNA或适体的DNA分子。

[2032] 实施方案386是实施方案381-385中任一项所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括实施方案16-29、48-63、100-141和 186-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[2033] 实施方案387是实施方案381-386中任一项所述的方法，其中融合蛋白包括实施方案252-266中任一项所述的融合蛋白。

[2034] 实施方案388是实施方案381-385中任一项所述的方法，其中孢子外壳蛋白包括CotB蛋白、CotC蛋白、CgeA蛋白、CotB/H蛋白、 CotG蛋白、孢子外壳蛋白、X蛋白或CotY蛋白。

[2035] 实施方案389是实施方案388所述的方法，其中孢子外壳蛋白包含与SEQ ID NO:252-259中任一个具有至少85％、至少90％、至少 95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[2036] 实施方案390是用于刺激植物生长的方法，包括：

[2037] 向植物生长介质中引入实施方案64-70、74-77和87-99中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或者包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家
族成员的制剂；

[2038] 或向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 64-70、74-77和87-99中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或者包含实施方案338和342-355中
任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；

[2039] 其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达涉及营养物增溶的酶、蛋白酶、 BclA蛋白、BclB蛋白、CotE蛋白、CotO蛋白、ExsY蛋白、ExsFA/BxpB 蛋白、CotY蛋白、ExsFB蛋白、ExsJ蛋白、ExsH蛋白、YjcA蛋白、YjcB 蛋白、BclC蛋白、BxpA蛋白、BclE蛋白、BetA/BAS3290蛋白、ExsA 蛋白、ExsK蛋白、ExsB蛋白、YabG蛋白或Tgl蛋白，其中其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于涉及营养物增溶的酶、蛋白酶、BclA蛋白、BclB蛋白、CotE蛋白、CotO蛋白、ExsY蛋白、 ExsFA/BxpB蛋白、CotY蛋白、ExsFB蛋白、ExsJ蛋白、ExsH蛋白、 YjcA蛋白、YjcB蛋白、BclC蛋白、BxpA蛋白、BclE蛋白、BetA/BAS3290 蛋白、ExsA蛋白、ExsK蛋白、ExsB蛋白、YabG蛋白或Tgl蛋白的表达，涉及营养物增溶的酶、蛋白酶、BclA蛋白、BclB蛋白、CotE蛋白、CotO 蛋白、ExsY蛋白、ExsFA/BxpB蛋白、CotY蛋白、ExsFB蛋白、ExsJ 蛋白、ExsH蛋白、YjcA蛋白、YjcB蛋白、BclC蛋白、BxpA蛋白、BclE 蛋白、BetA/BAS3290蛋白、ExsA蛋白、ExsK蛋白、ExsB蛋白、YabG 蛋白或Tgl蛋白的表达增强。

[2040] 实施方案391是提高植物的胁迫抗性的方法，包括：

[2041] 向植物生长介质中引入实施方案64、65和78-83中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或者包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员
的制剂；

[2042] 或向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案64、65和78-83中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或者包含实施方案338和342-355中任一项
所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；

[2043] 其中表达超氧化物歧化酶或精氨酸酶的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于超氧化物歧化酶或精氨酸酶的表达，超氧
化物歧化酶或精氨酸酶的表达增强。

[2044] 实施方案392是保护植物免受病原体侵害的方法，包括：

[2045] 向植物生长介质中引入实施方案64、65和74-77中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或者包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员
的制剂；

[2046] 或向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案64、65和74-77中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或者包含实施方案338和342-355中任一项
所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；

[2047] 其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员表达蛋白酶，其中在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中相比于蛋白酶的表达，蛋白酶的表达增强。

[2048] 实施方案393是延迟蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子发芽的方法，包括调节蜡样芽胞杆菌家族成员以表达肌苷-尿苷水解酶或丙氨酸消旋酶，其中相比于在相同条件下在野
生型蜡样芽胞杆菌家族成员中肌苷-尿苷水解酶或丙氨酸消旋酶的表达，肌苷-尿苷水解酶
或丙氨酸消旋酶的表达增强。

[2049] 实施方案394是实施方案357-379和381-393中任一项所述的方法，还包括在引入植物生长介质或施加至植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域之前灭活重组蜡
样芽胞杆菌家族成员或重组孢子- 形成细菌。

[2050] 实施方案395是实施方案394所述的方法，其中灭活包括使重组蜡样芽孢杆菌家族成员或重组孢子形成细菌经历加热处理、伽马射线、 x射线照射、UV-A照射、UV-B照射、用戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂、氯仿或苯酚处理、或其组合。

[2051] 实施方案396是实施方案394或395所述的方法，其中灭活包括修改重组蜡样芽胞杆菌家族成员重组或孢子-形成细菌以表达萌发孢子蛋白酶或非特异性核酸内切酶，其中
相比于在相同条件下在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中萌发孢子蛋白酶或非特异性核酸
内切酶的表达，萌发孢子蛋白酶或非特异性核酸内切酶的表达增强，和其中重组孢子-形成细菌包括genus杆菌的重组细菌。

[2052] 实施方案397是从重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子除去外孢壁的方法，包括：

[2053] 使包含实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子的悬浮液进行离心或过滤以产生从孢子分离出的外孢壁片段；

[2054] 其中外孢壁片段包含融合蛋白。

[2055] 实施方案398是实施方案397所述的方法，其中方法包括使包含孢子的悬浮液进行离心，并还包括收集上清液，其中上清液包含外孢壁的片段，并基本上不含孢子。

[2056] 实施方案399是实施方案397所述的方法，其中方法包括使包含孢子的悬浮液进行过滤，并还包括收集滤液，其中滤液包含外孢壁的片段，并基本上不含孢子。

[2057] 实施方案400是用于刺激植物生长的方法，包括：

[2058] 向植物生长介质中引入实施方案339所述的外孢壁片段或制剂；或

[2059] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案339 所述的外孢壁片段或制剂；

[2060] 其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白，和融合蛋白包括植物生长刺激蛋白或肽。

[2061] 实施方案401是保护植物免受病原体侵害提高植物的胁迫抗性的方法，包括：

[2062] 向植物生长介质中引入实施方案339所述的外孢壁片段或制剂；或

[2063] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案339 所述的外孢壁片段或制剂；

[2064] 其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白，和融合蛋白包括保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽或
提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽。

[2065] 实施方案402是实施方案401所述的方法，其中方法是保护植物免受病原体侵害的方法，并且其中融合蛋白包括保护植物免受病原体侵害的蛋白或肽。

[2066] 实施方案403是实施方案402所述的保护植物免受病原体侵害的方法，其中在包含外孢壁片段的植物生长介质中生长的植物与在不含外孢壁片段的相同植物生长介质中在
相同条件下生长的植物相比较优选不易受病原体的感染。

[2067] 实施方案404是实施方案401所述的方法，其中方法是提高植物的胁迫抗性的方法，并且其中融合蛋白包括提高植物的胁迫抗性的蛋白或肽。

[2068] 实施方案405是实施方案404所述的提高植物的胁迫抗性的方法，其中在包含外孢壁片段的植物生长介质中生长的植物与在不含外孢壁片段的相同植物生长介质中在相同
条件下生长的植物相比较优选不易受到胁迫。

[2069] 实施方案406是在植物上固定外孢壁片段的方法，包括：

[2070] 向植物生长介质中引入实施方案339所述的外孢壁片段或制剂；或

[2071] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 339所述的外孢壁片段或制剂；

[2072] 其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白，和融合蛋白包括植物结合蛋白或肽。

[2073] 实施方案407是实施方案363、364和406中任一项所述的方法，其中植物结合蛋白或肽在植物上选择性靶向和保持重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢
壁片段。

[2074] 实施方案408是实施方案407所述的方法，其中植物结合蛋白或肽在植物根部、根部的子结构、植物的地上部分或植物地上部分的子结构上选择性靶向和保持重组蜡样芽胞
杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢壁片段。

[2075] 实施方案409是刺激植物种子发芽的方法，包括：

[2076] 向植物生长介质中引入实施方案339所述的外孢壁片段或制剂；或

[2077] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案339 所述的外孢壁片段或制剂；

[2078] 其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，并且包含融合蛋白，和融合蛋白包括超氧化物歧化酶或催化一氧化氮产生的酶。

[2079] 实施方案410是实施方案409所述的方法，其中方法包括施加外孢壁片段至植物种子。

[2080] 实施方案411是实施方案409或410所述的方法，还包括施加L- 精氨酸至植物生长介质、植物种子、或者围绕植物种子的区域。

[2081] 实施方案412是实施方案411所述的方法，其中方法包括施加L- 精氨酸至植物种子。

[2082] 实施方案413是实施方案409-412中任一项所述的方法，其中相比于在不含外孢壁片段的相同植物生长介质中在相同条件下生长的种子、或者在相同条件下未施加外孢壁片
段的种子，包含外孢壁片段的植物生长介质中的种子、或者已经施加外孢壁片段的种子具
有增强的发芽率或在发芽后具有更长的主根。

[2083] 实施方案414是递送核酸至植物的方法，包括：

[2084] 向植物生长介质中引入实施方案339所述的外孢壁片段或制剂；或

[2085] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案339 所述的外孢壁片段或制剂；

[2086] 其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，并且包含融合蛋白，和融合蛋白包括核酸结合蛋白或肽，并且其中核酸结合蛋白或肽结合核酸分子。

[2087] 实施方案415是将核酸分子递送至动物、昆虫或蠕虫的方法，包括向动物、昆虫或蠕虫喂养外孢壁片段，其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样
芽胞杆菌家族成员，并且包含融合蛋白，其中融合蛋白包括核酸结合蛋白或肽，并且其中核酸结合蛋白或肽结合核酸分子。

[2088] 实施方案416是实施方案415所述的方法，其中蠕虫是线虫。

[2089] 实施方案417是向真菌或原生动物递送核酸分子的方法，方法包括使真菌或原生动物接触外孢壁片段，其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样
芽胞杆菌家族成员，并且包含融合蛋白，其中融合蛋白包括核酸结合蛋白或肽，并且其中核酸结合蛋白或肽结合核酸分子。

[2090] 实施方案418是实施方案414-417中任一项所述的方法，其中核酸分子包括调节RNA分子、RNAi分子、微RNA、适配体、或编码调节RNA 分子、RNAi分子、微小RNA或适体的DNA分子。

[2091] 实施方案419是实施方案414-418中任一项所述的方法，其中融合蛋白包括实施方案253-266中任一项所述的融合蛋白。

[2092] 实施方案420是刺激植物种子发芽的方法，包括向植物生长介质中引入、或者向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加：(i)催化一氧化氮产生的酶；(ii)超氧化物歧化酶；或(iii)表达催化一氧化氮产生的酶或超氧化物歧化酶的重组微生物，其中相比于在相同条件下在野生型微生物中催化一氧化氮产生的酶或超氧化物歧化酶的表达，催
化一氧化氮产生的酶或超氧化物歧化酶的表达增强。

[2093] 实施方案421是实施方案420所述的方法，其中方法包括施加酶或微生物至植物种子。

[2094] 实施方案422是实施方案420或421所述的方法，还包括施加L- 精氨酸至植物生长介质、植物种子、或者围绕植物种子的区域。

[2095] 实施方案423是实施方案422所述的方法，其中方法包括施加L- 精氨酸至植物种子。

[2096] 实施方案424是实施方案420-423中任一项所述的方法，其中相比于在不含酶或微生物的相同植物生长介质中在相同条件下生长的种子、或者在相同条件下未施加酶或微生
物的种子，包含酶或微生物的植物生长介质中的种子、或者已经施加酶或微生物的种子具
有增强的发芽率或在发芽后具有更长的主根。

[2097] 实施方案425是实施方案420-424中任一项所述的方法，其中催化一氧化氮产生的酶合酶包含一氧化氮合酶或精氨酸酶。

[2098] 实施方案426是实施方案425所述的方法，其中催化一氧化氮产生的酶包括一氧化氮合酶。

[2099] 实施方案427是实施方案426所述的方法，其中一氧化氮合酶包含来自苏云金芽孢杆菌BT013A或枯草芽胞杆菌168的一氧化氮合酶。

[2100] 实施方案428是实施方案426或427所述的方法，其中一氧化氮合酶包含与SEQ ID NO:260或261具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

[2101] 实施方案429是实施方案420-438中任一项所述的方法，其中超氧化物歧化酶包含超氧化物歧化酶1(SODA1)或超氧化物歧化酶2 (SODA2)。

[2102] 实施方案430是实施方案429所述的方法，其中超氧化物歧化酶包含与SEQ ID NO:155或156具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。

[2103] 实施方案431是实施方案420-430中任一项所述的方法，其中重组微生物包括杆菌种、Escherechia coli、Aspergillus种或Sacchromyces 种。

[2104] 实施方案432是实施方案431所述的方法，其中杆菌种包括蜡样芽胞杆菌家族成员、枯草芽胞杆菌、地衣形芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。

[2105] 实施方案433是实施方案431所述的方法，其中Aspergillus种包括Aspergillus niger或其中Sacchromyces种包括Sacchromyces cerevisiae。

[2106] 实施方案434是实施方案420-433中任一项所述的方法，其中酶或重组微生物在包含酶或重组微生物和农业上可接受的载体的制剂中引入植物生长介质、或施加至植物、植
物种子、或者围绕植物或植物种子的区域。

[2107] 实施方案435是递送酶至植物的方法，包括：

[2108] 向植物生长介质中引入实施方案16-141和168-296所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；或

[2109] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 16-141和168-296所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338 和342-355中任一项所述的重
组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；

[2110] 其中目标蛋白或肽包括酶。

[2111] 实施方案436是递送酶至植物的方法，包括：

[2112] 向植物生长介质中引入实施方案147-149、151-153、和156-268 中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组孢子-形成细菌的
制剂；或

[2113] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 147-149、151-153、和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一
项所述的重组孢子-形成细菌的制剂；

[2114] 其中目标蛋白或肽包括酶。

[2115] 实施方案437是实施方案435或436所述的递送酶至植物的方法，其中酶物理附着于重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁或重组孢子-形成细菌的孢子包衣。

[2116] 实施方案438是递送酶至植物的方法，包括：

[2117] 向植物生长介质中引入实施方案339所述的外孢壁片段或制剂；或

[2118] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案339 所述的外孢壁片段或制剂；

[2119] 其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，和包含融合蛋白，并且目标蛋白或肽包括酶。

[2120] 实施方案439是实施方案438所述的方法，其中方法还包括使用渗透剂、表面活性剂、洗涤剂、油或其组合来处理植物。

[2121] 实施方案440是实施方案435-441中任一项所述的方法，其中酶适于降解生物质、消化纤维素材料、辅助消化在植物可以饲养的目标动物的消化系统中、或用于生物燃料生
产。

[2122] 实施方案441是实施方案440所述的方法，其中酶包括非特异性蛋白酶、金属蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、磷酸酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、果胶酶、木糖苷酶、脂肪酶、磷脂酶或其组合。

[2123] 实施方案442是实施方案434-441中任一项所述的方法，其中植物是选自玉米、苜蓿、小麦、放牧作物、饲料作物、大豆、柳枝稷、茉莉、甜高粱、甘蔗或其组合的作物。

[2124] 实施方案443是改变植物性质的方法，包括：

[2125] 向植物生长介质中引入实施方案16-141和168-296所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；或

[2126] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 16-141和168-296所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员或包含实施方案338 和342-355中任一项所述的重
组蜡样芽胞杆菌家族成员的制剂；

[2127] 其中目标蛋白或肽包含植物信号传导分子或影响植物组成的酶。

[2128] 实施方案444是改变植物性质的方法，包括：

[2129] 向植物生长介质中引入实施方案147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项所述的重组孢子-形成细菌的制
剂；或

[2130] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案 147-149、151-153和156-268中任一项所述的重组孢子-形成细菌或包含实施方案338和342-355中任一项
所述的重组孢子-形成细菌的制剂；

[2131] 其中目标蛋白或肽包含植物信号传导分子或影响植物组成的酶。

[2132] 实施方案445是实施方案443或444所述的方法，其中目标蛋白或肽物理附着于重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁或重组孢子-形成细菌的孢子包衣。

[2133] 实施方案446是改变植物性质的方法，包括：

[2134] 向植物生长介质中引入实施方案339所述的外孢壁片段或制剂；或

[2135] 向植物、植物种子、或者围绕植物或植物种子的区域施加实施方案339 所述的外孢壁片段或制剂；

[2136] 其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，和包含融合蛋白，并且目标蛋白或肽包含植物信号传导分子或影响植物组成
的酶。

[2137] 实施方案447是实施方案446所述的方法，其中方法还包括使用渗透剂、表面活性剂、洗涤剂、油或其组合来处理植物。

[2138] 实施方案448是实施方案435-447中任一项所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢壁片段在收割之前施加至植物的叶面。

[2139] 实施方案449是实施方案443-450中任一项所述的方法，其中酶包括内切葡聚糖酶、蛋白酶、磷脂酶、氨基羧基-1-丙二醇酶、氨基环丙烷-1- 羧酸脱氨酶、脂肪酶或其组合。

[2140] 实施方案450是实施方案443-448中任一项所述的方法，其中植物信号传导分子包括鞭毛蛋白肽、隐地蛋白、harpins、harpin样蛋白、或降解或修饰细菌、真菌或植物营养源的酶、或其组合。

[2141] 实施方案451是实施方案443-450中任一项所述的方法，其中植物选自葡萄、甘蔗、柳枝稷、甜高粱、谷物、荞麦、油菜籽、油菜籽、大豆、向日葵、大麻或其组合。

[2142] 实施方案452是实施方案443-451中任一项所述的方法，其中待改变的植物性质包括代谢变化。

[2143] 实施方案453是实施方案452所述的方法，其中代谢变化包括通过扩大根系统增加植物组织的大量营养素或微量营养素摄取或含量、增加植物的蛋白含量、增加氮摄入量、改变油含量、改变糖或蔗糖的含量、增强药物化合物含量、增强大麻素含量或其组合。

[2144] 实施方案454是实施方案357-379、390-396、400-414和420-453 中任一项所述的方法，其中植物生长介质补充酶的底物或辅酶。

[2145] 实施方案455是实施方案454所述的方法，其中底物或辅酶包括色氨酸、一磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、吲哚、三偏磷酸盐、铁氧还蛋白、乙偶姻、二乙酰、丙酮酸盐、乙酰乳酸、果胶、纤维素、甲基纤维素、淀粉、几丁质、果胶、蛋白粉、纤维素衍生物、磷酸盐、乙偶姻、脱乙酰壳多糖、吲哚-3-乙酸的非活性衍生物、赤霉酸的非活性衍生物、木聚糖、胆碱、胆碱衍生物、脯氨酸、聚脯氨酸、富含脯氨酸的粉、富含脯氨酸的蛋白、苯丙氨酸、分支酸、阿糖基木聚糖、脂肪、蜡、油、肌醇六磷酸、木质素、腐殖酸、胆碱、胆碱衍生物、脯氨酸、聚脯氨酸、富脯氨酸蛋白、富脯氨酸粉、苯基丙氨酸、分支酸、L-精氨酸、NADH、NADPH、 ATP、GTP、细胞色素C、细胞色素p450或其组合。

[2146] 实施方案456是实施方案455所述的方法，其中三磷酸腺苷包括腺苷-3-三磷酸。

[2147] 实施方案457是实施方案357-379、390-396、400-414和420-456 中任一项所述的方法，包括在种植之前使用重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢壁片
段、或包含重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢壁片段的制剂包覆种
子。

[2148] 实施方案458是实施方案357-379、390-396、400-414和420-457 中任一项所述的方法，包括施加重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子- 形成细菌或外孢壁片段、或包含重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子- 形成细菌或外孢壁片段的制剂至植物的地上部分。

[2149] 实施方案459是实施方案357-379、390-396、400-414和420-458 中任一项所述的方法，其中向植物生长介质中引入重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢壁片段包括向介质施加含有重组蜡样芽胞杆菌家族成员、重组孢子-形成细菌或外孢壁片
段的液体或固体制剂。

[2150] 实施方案460是实施方案459所述的方法，其中方法包括在植物生长介质中种植种子、幼苗、插条、球茎或植物之前、同时或之后将所述制剂施用于所述植物生长介质。

[2151] 实施方案461是实施方案357-379、390-396、400-414和420-460 中任一项所述的方法，进一步包括将至少一种农用化学品引入植物生长介质或将至少一种农用用品施加于
植物或种子。

[2152] 实施方案462是实施方案461所述的方法，其中农用化学品包括肥料、微量营养素肥料材料、杀虫剂、除草剂、杀真菌剂、软体动物杀灭剂、杀藻剂、植物生长修正剂、细菌菌剂、真菌菌剂或其组合。

[2153] 实施方案463是实施方案350所述的制剂、植物种子或接种剂、或实施方案462所述的方法，其中农用化学品包括肥料，并且肥料包括液体肥料；其中农用化学品包括微量营养素肥料材料，并且微量营养素肥料材料包括硼酸、硼酸盐、硼砂、硫酸铜、铜烧结物、铜螯合物、四硼酸钠十水合物、硫酸铁、氧化铁、硫酸铁铵、铁料、铁螯合物、硫酸锰、氧化锰、锰螯合物、氯化锰、锰料、钼酸钠、钼酸、硫酸锌、锌氧化物、碳酸锌、锌料、磷酸锌、锌螯合物或其组合；其中农用化学品包括杀虫剂，并且杀虫剂包括有机磷酸盐、氨基甲酸盐、拟除虫菊酯、杀螨剂、邻苯二甲酸烷基酯、硼酸、硼酸盐、氟化物、硫、卤代芳基取代的脲、烃酯、基于生物的杀虫剂或其组合；其中农用化学品包括除草剂，并且除草剂包括氯苯氧基化合物、硝基酚化合物、硝基酚化合物、二吡啶基化合物、乙酰胺、脂肪酸、苯胺、苯甲酰胺、苯甲酸、苯甲酸衍生物、茴香酸茴香酸衍生物、苯甲腈、苯并噻二嗪酮二氧化物、硫代氨基甲酸酯、氨基甲酸酯、氨基苯甲酸酯、氯吡啶基、环己烯酮衍生物、二硝基氨基苯衍生物、氟二硝基甲苯胺化合物、异恶唑烷酮、烟酸、异丙胺、异丙基胺衍生物、恶二唑啉酮、磷酸酯、邻苯二甲酸酯、吡啶甲酸化合物、三嗪、三唑、尿嘧啶、尿素衍生物、内酯、氯酸钠或其组合；其中农用化学品包括杀真菌剂，并且杀真菌剂包括取代的苯、硫代氨基甲酸酯、亚乙基二硫代氨基甲酸酯、硫代邻苯二甲酰胺、铜化合物、有机汞化合物、有机锡化合物、镉化合物、苯那嗪、苯菌灵、环己酰胺、十二烷胍、氯唑灵、异丙肾上腺素、metlaxyl、 thimeimefon、嗪胺灵或其组合；其中农用化学品包括真菌菌剂，并且真菌菌剂包括家族Glomeraceae的真菌菌剂、家族
Claroidoglomeraceae的真菌菌剂、家族Gigasporaceae的真菌菌剂、家族Acaulosporaceae的真菌菌剂、家族Sacculosporaceae的真菌菌剂、家族 Entrophosporaceae的真菌菌剂、家族Pacidsporaceae的真菌菌剂、家族Diversisporaceae的真菌菌剂、家族Paraglomeraceae的真菌菌剂、家族Archaeosporaceae的真菌菌剂、家族Geosiphonaceae的真菌菌剂、家族
Ambisporaceae的真菌菌剂、家族Scutellosporaceae的真菌菌剂、家族Dentiscultataceae的真菌菌剂、家族Racocetraceae的真菌菌剂、phylum Basidiomycota的真菌菌剂、phylum Ascomycota的真菌菌剂、phylum Zygomycota的真菌菌剂或其组合；或其中农用化学品包括细菌菌剂，并且细菌菌剂包括根瘤菌属的细菌菌剂、慢生根瘤菌属的细菌菌剂、中慢生根瘤菌属的细菌菌剂、genus Azorhizobium的细菌菌剂、genus Allorhizobium的细菌菌剂、
genus Sinorhizobium的细菌菌剂、genus Kluyvera的细菌菌剂、genus Azotobacter的细
菌菌剂、genus Pseudomonas的细菌菌剂、genus Azospirillium的细菌菌剂、genus杆菌的细菌菌剂、genus Streptomyces的细菌菌剂、genus Paenibacillus 的细菌菌剂、genus 
Paracoccus的细菌菌剂、genus Enterobacter的细菌菌剂、genus Alcaligenes的细菌菌
剂、genus Mycobacterium的细菌菌剂、 genus  Trichoderma的细菌菌剂、genus 
Gliocladium的细菌菌剂、genus Glomus的细菌菌剂、genus Klebsiella的细菌菌剂或其组合。

[2154] 实施方案464是实施方案350所述的制剂、植物种子或接种剂、或实施方案462所述的方法，其中农用化学品包括杀真菌剂，并且杀真菌剂包括阿霉素、丙丙基、安非他明钾和安曲姆、苯唑嗪、氮杂唑、嘧菌酯、苯菌灵、苯达诺尼、苯菌灵、苯马那丙、苯丙氨酸异丁酯、双丙二酸、苦瓜酸、杀青素-S，boscalid、溴康唑、bupirimate、buthiobate、多硫化钙、 capsimycin、captafol、captan、多菌灵、carvon、quinomethionate、氯哌噻嗪、氯灭唑、氯酮、氯化苦参、百菌清、氯洛他定、clozylacon、cufraneb、 cymoxanil、cyproconazole、cyprodinil、二氯酚、双氯芬酸、双氯芬酸、二氯咪嗪、二氯吗啉、二恶唑烷、二甲唑咪唑、烯酰吗啉、二恶唑酮、二菌唑、二苯唑唑-M、二硝基苯、二苯胺、二硫代硫酮、二氮草酮、二噻吩、十二聚体、乙嘧磺隆、etridiazole、famoxadon、fenapanil、fenarimol、 fenbuconazole、fenfuram、fenitropan、芬太尼、芬太尼、芬太尼、芬太尼、芬太尼、芬太芬、芬太芬、芬太芬、芬太芬、ferimzone、氟啶胺、flumetover、氟啶、氟康唑、氟苯咪唑、氟替唑、氟磺草胺、氟替尼尔、氟替芬、氟噻唑、氟西汀、呋喃草胺、呋喃、福康唑、呋喃康唑、顺式呋喃甲酸、考扎嗪、六氯苯、己康唑、赞姆沙唑、咪达唑仑、亚氨基辛胺、亚氨基辛胺三乙酸酯、碘代卡巴、异丙肾上腺素(IBP)、异丙肾上腺素、伊马替林、异硫辛烷、异戊二酮、春雷霉素、克雷肟甲酯、铜制剂如：氢氧化铜、环烷酸铜、氯氧化铜、硫酸铜、氧铜铜和波尔多混合物、mancopper、代森锰锌、麻布、meferimzone、mepanipyrim、mepronil、甲霜灵、metconazole、methasulfocarb、methfuroxam、metiram、 metomeclam、metsulfovax、温霉素、myclobutanil、myczzolin、二甲基二硫代氨基甲酸镍、硝基硫代异丙基、nararimol、羟肟酸、奥莫卡泊、奥昔康酸、氧卡马西泮、氧氟啶、多效唑、糠酸酯、penconazole、pcurcuron、 phosdiphen、pimaricin、胡椒林、多嗪、多莫尼林、丙烯三唑、丙氯灵、腐霉菌、丙酰胺、丙酸钠、丙环唑、丙炔、丙硫嗪、吡喹啉、吡哆醛、嘧霉胺、焦宁碱、pyroxyfur、quinconazole、quintozene(PCNB)、硫和硫制剂、tebuconazole、tecloftamam、替奈沙芬、tetcyclasis、四康唑、噻菌灵、噻糖、噻吗啉、甲基托布津-甲基、甲苯磺酰胺、三唑酮、三唑醇、三唑并噻唑、三唑盐、三氯丙啶、三环唑、三霉菌、肟菌酯、三氟菌唑、 triricine、uniconazole、有效霉素A、伏立唑啉、伏立康唑、唑胺、嗪宁、齐拉姆以及Dagger G、OK-8705、OK-8801、α-(1,1-二甲基乙基)-(3- (2-苯氧基乙基)-
1H-1,2,4-三唑-1-醇苯酚、α-(2,4-二氯苯基)-[3-3-氟-3- 丙基-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、α-(2,4-二氯苯基)-[3-甲氧基-α-甲基-1H- 三唑-1-乙醇、α-(5-甲基-1,3-二恶烷-5-基)-[3-[[4-(三氟甲基)-苯基]- 甲基]-1H-1,2,(5RS,6RS)-6-羟基-2,2,7,7-四甲基-5-(1H-
1,2,4-三唑-1- 基)-3-辛酮、(E)-α-(甲氧基亚氨基)-N-甲基-2-苯基1-苯基乙酰胺、1- 异丙基{2-甲基-1-[[[1-(4-甲基苯基)-乙基]-氨基]-羰基]-丙基}氨基甲酸叔丁酯、1-(2,4-
二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-乙酮-O-(苯基甲基) -肟、1-(2-甲基-1-萘基)-1H-
吡咯-2,5-二酮、1-(3,5-二氯苯基)-3-(2- 丙烯基)-2,5-吡咯烷二酮、1-[(二碘甲基)磺酰基]-4-甲基苯、1-[[2-4- 二氯苯基)-1,3-二氧戊环-2-基]-甲基]-1H-咪唑、1-[[2-(4-氯
苯基)-3-苯基环氧乙烷基〕甲基〕-1H-1,2，4-三唑、1-[1-[2-[(2,4-二氯苯基)-甲氧基]-苯基]-乙烯基]-1H-咪唑、1-甲基-5-壬基-2-(苯基甲基)3-吡咯烷子基、 2',6'-二溴-2-甲
基-4'-三氟甲氧基-4'-三氟-甲基-1,3-噻唑-甲酰苯胺、2,2-二氯-N-[1-(4-氯苯基)-乙
基]-1-乙基-3-甲基-环丙烷甲酰胺、2,6-二氯-5-(甲硫基)-4-嘧啶基-硫氰酸酯、2,6-二
氯-N-(4-三氟甲基苄基)-苯甲酰胺、 2,6-二氯-N-[[4-(三氟甲基)-苯基]-甲基]-苯甲酰
胺、2-(2,3,3-三碘-2-丙烯基)-2H-四唑、2-[(1-甲基乙基)-膦酰基]-5-(三氯甲基)-1,3,
4-噻二唑、2-[[6-脱氧-4-O-(4-O-甲基-(3-D-吡喃葡萄糖基)-a-D-吡喃葡萄糖基]- 氨
基]-4-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-d]吡啶-5-甲腈、2-氨基丁烷、2-溴-2-(溴甲基)戊二腈、2-氯-N-(2,3-二氢-1,1,3-三甲基-1H-茚-4-基)-3-吡啶甲酰胺、2-氯-N-(2,6-二甲基苯基)-
N-(异硫氰酸基甲基)-乙酰胺、2-苯基苯酚(OPP)、3,4-二氯-1-[4-(二氟甲氧基)-苯基]-吡咯-2,5-二酮、3,5- 二氯-N-[氰基[(1-甲基-2-丙炔基)-氧基]-甲基]-苯甲酰胺、3-(1,1-
二甲基丙基-1-氧代-1H-茚-2-腈、3-[2-氯苯基)-5-乙氧基-3-异恶唑烷基]-吡啶、 4-氯-
2-氰基-N、N-二甲基-5-(4-甲基苯基)-1H-咪唑-1-磺酰胺、4-甲基- 四唑[1,5-a]喹唑啉-5(4H)-酮、8-(1,1-二甲基乙基)-N-乙基-N-丙基-1,4- 二氧杂螺[4,5]癸烷-2-甲胺、8-羟基喹啉硫酸盐、9H-呫吨-2-[(苯基氨基) -羰基]-9-羧酰肼、双-(1-甲基乙基)顺-4-(4-氯苯
基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-环庚醇、顺式-4-[3-[4-(1,1-二甲基丙基)-苯基-2-甲基丙
基]-2,6- 二甲基-吗啉盐酸盐、[(4-氯苯基)-偶氮]-氰基乙酸乙酯、碳酸氢钾、甲基四硫醇钠盐、1-(2,3-二氢-2,2-二甲基-茚-1-基)-1H-咪唑-5-羧酸甲酯、 N-(2,6-二甲基苯基)-N(5-异恶唑基羰基)-DL-丙氨酸甲酯、N-(氯乙酰基)-N-(2,6-二甲基苯基)-DL-丙氨酸甲酯、N-(2,3-二氯-4-羟基苯基) -1-甲基-环己烷甲酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-2-甲氧基-N-
(四氢-2-氧代 -3-呋喃基)-乙酰胺、N-(2,6-二甲基苯乙基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代 -
3-噻吩基)-乙酰胺、N-(2-氯-4-硝基苯基)-4-甲基-3-硝基-苯磺酰胺、 N-(4-环己基苯基)
5,6-四氢-2-嘧啶胺、N-(4-己基苯基)-1,4,5,6-四氢-2- 嘧啶胺、N-(5-氯-2-甲基苯基)-
2-甲氧基-N-(2-氧代-3-恶唑烷基)-乙酰胺、N-(6-甲氧基)-3-吡啶基)-环丙烷甲酰胺、N-
[2,2,2-三氯-1-[(氯乙酰基)-氨基]-乙基]-苯甲酰胺、N-[3-氯-4,5-双(2-丙酰氧基)-苯
基]-N'- 甲氧基-甲亚胺酰胺、N-甲酰基-N-羟基-DL-丙氨酸钠盐、O-二乙基[2-(二丙基氨
基)-2-氧代乙基]-乙基氨基硫代磷酸酯、甲基S-苯基苯基丙基磷酰胺硫代磷酸酯、S-苯甲
基噻二唑-7-硫代硫酸S-甲酯和螺[2H]-1-苯并吡喃 -2,1'(3'H)-异苯并呋喃]-3'-三氯甲
基)硫代-4-环己烷-1,2-二甲酰亚胺、四甲基硫代过氧二碳二酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-
N-(甲氧基乙酰基) -DL-丙氨酸甲酯、4-(2,2-二氟-1,2-二氯-3-苯并间二氧杂环戊烯-4-
基)-1H- 吡咯-3-腈或其组合。

[2155] 实施方案465是实施方案350所述的制剂、植物种子或接种剂、或实施方案462所述的方法，其中农用化学品包括芽孢杆菌属的细菌菌剂，并且芽孢杆菌属的细菌菌剂包括芽
孢杆菌属芽孢杆菌、阿扎维亚芽孢杆菌、白僵菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、内切芽孢杆菌、杆状芽孢杆菌(Bacillus endorhythmos)、Bacillus kurstaki、杆菌 kurstaki、乳酸芽孢杆菌、乳病杆菌、乳杆菌、侧孢芽孢杆菌、缓死芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、Bacillus medusa、Bacillus metiens、纳豆芽孢杆菌、Bacillus 
nigrificans、Bacillus popillae、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、Bacillus sphearicus、杆菌属、枯草芽胞杆菌、苏云金芽孢杆菌、Bacillus unifagelatu或其组合。

[2156] 实施方案466是实施方案350所述的制剂、植物种子或接种剂、或实施方案462所述的方法，其中农用化学品包括除草剂，并且除草剂包括2,4-D、2,4-DB、乙草胺、三氟醚、甲草胺、莠灭宁、莠去津、氨基吡哆醛、益生菌、苄嘧磺隆、bensulide、苯扎沙坦、溴西泮、溴嘧啶、丁酸盐、carfentrazone、氯嘧磺隆、氯磺隆、克罗地芬、氯麦芽糖、氯吡啶、克洛司他姆、环酯、DCPA、desmedipham、麦草畏、二氯替苯尼、双氯芬酸、双氯灭氨酸、diflufenzopyr、二甲苯胺、diquat、敌草隆、EPTC、乙氟乐灵、ethofumesate、fenoxaprop、fluazifop-P、
flucarbazone、flufenacet、flumetsulam、flumiclorac、flumioxazin、fluometuron、 fluroxypyr、fomesafen、甲磺嘧磺隆、草铵膦、草甘膦、halosulfuron、 hexazinone、
imazamethabenz、imazamox、imazapic、imazaquin、 imazethapyr、异黄酮、孕激素、木犀草素、MCPA、MCPB、甲基磺草酮、异丙甲草胺、metribuzin、甲磺隆、茉莉酸、MSMA、萘普生、naptalam、烟嘧磺隆、诺氟拉津、奥立唑林、恶二酮、氟氟芬、百草枯、壬酸、二甲戊乐灵、phenmedipham、picloram、primisulfuron、prodiamine、prometryn、 pronamide、propanil、prosulfuron、吡嗪、吡噻硫、喹草酸、喹禾灵、环草隆、西马那啶、磺扎酮、磺胺甲龙、磺嘧磺隆、噻替隆、terbaci、噻唑啉、噻吩磺隆、噻苯甲腈、tralkoxydim、triallate、
triasulfuron、tribenuron、 triclopyr、trifluralin、triflusulfuron或其组合。

[2157] 实施方案467是实施方案350所述的制剂、植物种子或接种剂、或实施方案463所述的方法，其中制剂或接种剂包含除草剂和能够降解除草剂的细菌菌株。

[2158] 实施方案468是实施方案467所述的制剂、植物种子或接种剂或方法，其中能够降解除草剂的细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349 (NRRL No.B-50928)、蜡样芽胞杆
菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)或蕈状
芽孢杆菌 EE-B00363(NRRL B-67121)或其组合。

[2159] 实施方案469是实施方案463-468中任一项所述的制剂、植物种子、接种剂或方法，其中除草剂包括磺酰脲、芳基三嗪、麦草畏、苯氧基除草剂、2,4-D、除虫菊酯、拟除虫菊酯或其组合。

[2160] 实施方案470是实施方案469所述的制剂、植物种子、接种剂或方法，其中磺酰脲包括磺胺腙。

[2161] 实施方案471是实施方案350和463-470中任一项所述的制剂、植物种子或接种剂、或实施方案461-470中任一项所述的方法，其中肥料包括硫酸铵、硝酸铵、硝酸铵盐、氯化铵、硫酸氢铵、多硫化铵、硫代硫酸铵、氨水、无水氨、多磷酸铵、硫酸铝、硝酸钙、硝酸钙铵、硫酸钙、煅烧菱镁矿、钙石灰石、氧化钙、硝酸钙、白云石、石灰石、熟石灰、碳酸钙、磷酸二铵、磷酸二氢铵、硝酸镁、硫酸镁、硝酸钾、氯化钾、硫酸镁钾、硫酸钾、硝酸钠、镁石灰石、氧化镁、尿素、尿素-甲醛、尿素硝酸铵、硫化尿素、聚合物包被的尿素、异亚丁基二脲、K2SO4-
2MgSO4、冰晶石、硅藻土、硫酸镁石、Epsom盐、元素硫、油饼、鱼粪、血粉、磷酸磷酸盐、超级磷酸盐、矿渣、骨粉、木灰、粪便、蝙蝠泥炭苔、堆肥、绿砂、棉籽粉、羽毛粉、螃蟹粉、鱼乳、腐殖酸或其组合。

[2162] 实施方案472是递送有益细菌至动物的方法，包括向动物喂养这样的植物，该植物被修改为包含这样水平的内生和益生菌细菌菌株，该水平大于在未经修改的相同植物中在
相同条件下生长的内生和益生菌细菌菌株的水平。

[2163] 实施方案473是实施方案472所述的方法，其中向动物喂养的植物包括：在含有内生和益生菌细菌菌株或包含内生和益生菌细菌菌株的制剂的植物生长介质中生长的植物、
施加内生和益生菌细菌菌株的植物、从施加内生和益生菌细菌菌株的植物种子生长的植
物、在施加内生和益生菌细菌菌株的区域中生长的植物、或在施加内生和益生菌细菌菌株
的区域中生长的种子。

[2164] 实施方案474是实施方案472或473所述的方法，其中内生和益生菌细菌菌株包括杆菌或Lysinibacillus种。

[2165] 实施方案475是实施方案474所述的方法，其中杆菌种包括枯草芽胞杆菌、杆菌firmus、解淀粉芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、杆菌toyocerin、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌或其组合。

[2166] 实施方案476是实施方案472-475中任一项所述的方法，其中内生和益生菌细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No. B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439
(NRRL B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)、蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-
50977)、巨大芽孢杆菌EE385(NRRL B-50980)、杆菌sp.EE387(NRRL B-50981)、环状芽孢杆菌EE388(NRRL B-50982)、枯草芽胞杆菌EE405  (NRRL B-50978)、Lysinibacillus 
fusiformis EE442(NRRL B-50975)、或 Lysinibacillus sphaericus EE443(NRRL B-
50976)、短小芽孢杆菌 EE-B00143(NRRL B-67123)或其组合。

[2167] 实施方案477是向动物递送蛋白或肽的方法，包括向动物喂养表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外
孢壁的目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段、或向动物喂养衍生自表
达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁片段，融合蛋白包含使融合蛋白靶向重
组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白
片段。

[2168] 实施方案478是实施方案477所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括实施方案16-29、48-63、125-141和186-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员、或其中外孢壁片段包括衍生自实施方案 100-124中任一项所述的蜡样芽胞杆菌家族成员的外
孢壁片段。

[2169] 实施方案479是实施方案477或478所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含内生细菌菌株。

[2170] 实施方案480是实施方案479所述的方法，其中内生细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No.B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRL B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)、蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-50977)、苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL B-50983)、苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-
B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366 (NRRL B-67120)；或蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)。

[2171] 实施方案481是实施方案480所述的方法，其中内生细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRL B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417 (NRRL B-50979)、蜡样芽胞杆菌
EE444(NRRL B-50977)、或苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL B-50983)、苏云金芽孢杆菌EE-
B00184(NRRL B-67122)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)；或蕈状芽孢杆菌 EE-B00363(NRRL B-67121)。

[2172] 实施方案482是实施方案477-479中任一项所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括益生菌细菌菌株。

[2173] 实施方案483是实施方案482所述的方法，其中益生菌细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No.B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE439(NRRL B-50979)、苏云金芽孢杆菌EE417(NRRL B-50979)、蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-50977)、苏云金芽孢杆菌 
BT013A(NRRL No.B-50924)或其组合。

[2174] 实施方案484是实施方案479-481中任一项所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包含在喂养给动物的植物内。

[2175] 实施方案485是实施方案477或478所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族包括能够定植植物的叶面的细菌菌株。

[2176] 实施方案486是实施方案485所述的方法，其中能够定植植物的叶面的细菌菌株包括蕈状芽孢杆菌BT155(NRRL No.B-50921)、蕈状芽孢杆菌EE118(NRRL No.B-50918)、蕈状
芽孢杆菌EE141(NRRL NO. B-50916)、蕈状芽孢杆菌BT46-3(NRRL No.B-50922)、蜡样芽胞
杆菌家族成员EE218(NRRL No.B-50926)、苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRL No.B-50924)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-
67120)、或蕈状芽孢杆菌EE-B00363 (NRRL B-67121)。

[2177] 实施方案487是实施方案485或486中任一项所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员存在于喂养给动物的植物叶面上。

[2178] 实施方案488是疫苗，包含药学上可接受的载体和表达实施方案12 所述的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[2179] 实施方案489是疫苗，包含药学上可接受的载体和外孢壁片段，其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，并且包含融合蛋白，并且融合蛋白包含抗原。

[2180] 实施方案490是疫苗，包含药学上可接受的载体和实施方案17-27 中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中融合蛋白包含抗原。

[2181] 实施方案491是实施方案488-490中任一项所述的疫苗，其中疫苗适用于静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、局部、口服、鼻内、皮内、经上皮内施用或通过吸入。

[2182] 实施方案492是实施方案488-490中任一项所述的疫苗，其中疫苗适用于口服或经上皮内施用。

[2183] 实施方案493是在受试者中产生免疫原性应答的方法，方法包括向受试者施用实施方案488-492中任一项所述的疫苗。

[2184] 实施方案494是在环境中减少污染物的方法，包括将污染的环境暴露于表达实施方案13所述的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子。

[2185] 实施方案495是在环境中减少污染物的方法，包括将污染的环境暴露于外孢壁片段，其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，并且包含融合蛋白，并且其中融合蛋白包括修复酶。

[2186] 实施方案496是在环境中减少污染物的方法，包括将污染的环境暴露于实施方案17-27中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，其中融合蛋白包含修复酶。

[2187] 实施方案497是实施方案494-496中任一项所述的方法，其中污染的环境包括气体、液体、半液体、凝胶、薄膜、半固体或固体。

[2188] 实施方案498是实施方案497所述的方法，其中固体包括表面土壤、地下土壤、堆肥、作物残渣、叶子、覆盖物、切割树木、生物膜、泥土层、霉菌、污泥、沙子、矿渣、沉积物、污水、废石、核废料、军火、医院废物、汽车零件、金属切割、绝缘废物、食品废物、石棉、电池、工业废料、垃圾填埋废物、木材废料、纺织废物、玻璃废物、皮革废料、橡胶废料、塑料废料、电子元件废物、农业废弃物、摄影废物、陶瓷废物、医药废物、蜡、废催化剂或其组合。

[2189] 实施方案499是实施方案497所述的方法，其中液体包括饮用水、地下水、地表水、盐水、储罐、泻湖、水生系统、工业废水、酸性矿井排水、废自流体、废电镀浴、脱脂溶液、干洗液、机器冷却剂、钻井液废液、切削液废料、水力压裂流体废物、润滑剂废料、油漆、灰水、油性废水、纸浆水处理系统、化粪系统、下水道系统、降水泻湖、保存池塘、湖泊、河流或其组合。

[2190] 实施方案500是实施方案497所述的方法，其中气体包括空气，例如烟电、发电厂、废物焚化炉、火葬场或炼油厂的排放物、工艺废气流、填埋气体、天然气、丙烷气体或其组合。

[2191] 实施方案501是实施方案494-500中任一项所述的方法，其中污染物包括：化学战剂，包括沙林(GB；o-异丙基甲基膦酰氟)；索曼(GD；邻频那基甲基甲基膦酰氟)；环磷酰胺(GF；邻环己基甲基膦酰氟)；VX(O-乙基 S-[2-(二异丙基氨基)乙基]甲基膦酰硫酸酯)；
tabun(GA；N,N-二甲基乙基磷酰胺脒基)；DFP(二异丙基膦酰氟化物)或芥子剂。

[2192] 实施方案502是实施方案494-500中任一项所述的方法，其中污染物包括无机化合物，包括砷、锑、钡、铍、镉、铬、铜、铁、铅、锰、汞、镍、硒、银、锡、铊、铀、锌或其组合。

[2193] 实施方案503是实施方案494-500中任一项所述的方法，其中污染物包括有机化合物，包括多环芳烃(PAH)、氯化芳香族化合物、氯化脂肪族化合物、硝基芳香族化合物(NAC)、酚类化合物、氰基化合物、二恶英或其组合。

[2194] 实施方案504是实施方案494-500中任一项所述的方法，其中污染物包括原油、成品油、燃料油、柴油、汽油、液压油、煤油、或挥发性成分。

[2195] 实施方案505是实施方案494-500中任一项所述的方法，其中污染物包括爆炸物、化肥、杀虫剂、杀虫剂或除草剂。

[2196] 实施方案506是实施方案494-500中任一项所述的方法，其中酶包括磷酸酯结合蛋白、蛋白酶、碳水化合物水解酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、营养结合蛋白、纤维素酶、氧化还原酶、单加氧酶、二氧加氧酶、漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、过氧化物酶、脱卤素酶、过氧化氢酶、淀粉酶、还原酶、氧化酶、酰胺酶、木质素酶、木聚糖酶、果胶酶、木糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、生物膜抑制肽、除草剂降解酶、杀虫剂降解酶或其组合。

[2197] 实施方案507是实施方案506所述的方法，其中杀虫剂-降解酶包括除虫菊酯酶。

[2198] 实施方案508是实施方案506所述的方法，其中酶包括除草剂-降解酶或杀虫剂-降解酶，并且重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株。

[2199] 实施方案509是实施方案508所述的方法，其中能降解除草剂或杀虫剂的细菌菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No. B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377
(NRRL B-67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)或蕈状芽孢杆菌EE-B00363 
(NRRL B-67121)。

[2200] 实施方案510是实施方案494-509中任一项所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子或外孢壁片段通过将孢子或外孢壁片段并入含有污染物的物流接触污染环境、
将含有污染物的物流与含有孢子或将外孢壁片段、将孢子或外孢壁片段合并成颗粒以与受
污染的环境混合、将孢子或外孢壁片段喷洒到污染环境、将孢子或外孢壁片段注入污染的
环境、或用孢子或外孢壁片段浸润受污染的环境。

[2201] 实施方案511是污染土壤植物补救的方法，该方法包括：

[2202] 将重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子引入受污染的土壤中；或

[2203] 将重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子施加于种植在污染土壤中的植物、或种植在污染土壤中的植物种子、或植物或植物种子周围的污染土壤；

[2204] 其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子表达融合蛋白，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁孢子的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外
孢壁蛋白片段，其中融合蛋白包括实施方案13所述的融合蛋白，并且其中重组蜡样芽胞杆
菌家族成员包括内生细菌菌株或根部定殖细菌菌株。

[2205] 实施方案512是污染土壤植物补救的方法，该方法包括：

[2206] 在蜡样芽胞杆菌家族成员孢子中表达修复酶，其中在重组蜡样芽孢杆菌家族成员孢子中修复酶的表达相对于修复酶在野生型蜡样芽胞杆菌家族成员中孢子中的表达增强。

[2207] 实施方案513是污染土壤植物补救的方法，该方法包括：

[2208] 将重组孢子-形成细菌引入受污染的土壤；或

[2209] 将重组孢子-形成细菌施用于种植在污染土壤中的植物、或种植在污染土壤中的植物种子、或者围绕植物或植物种子的污染土壤区域，其中重组孢子-形成细菌表达融合蛋白，包含使融合蛋白靶向细菌的孢子表面的至少一种目标蛋白或肽和孢子外壳蛋白，其中
孢子外壳蛋白包括CotB蛋白、 CotC蛋白、CgeA蛋白、CotB/H蛋白、Cot G蛋白、孢子外壳蛋白X蛋白或CotY蛋白；重组孢子-形成细菌包括内生细菌菌株或根部定殖细菌菌株；并且目标
蛋白或肽包括修复酶。

[2210] 实施方案514是实施方案513所述的方法，其中重组孢子-形成细菌包括细菌的内生菌株。

[2211] 实施方案515是污染土壤植物补救的方法，该方法包括：将外孢壁片段引入受污染的土壤或将外孢壁片段施用于种植在污染土壤中的植物、或种植在污染土壤中的植物种
子、或者围绕植物或植物种子的污染土壤区域，其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的孢子，并且包含融合蛋白，其中融合蛋白包括
修复酶。

[2212] 实施方案516是污染土壤植物补救的方法，该方法包括：将实施方案17-27中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子引入受污染的土壤或将实施方案17-27中任一项
所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子施用于种植在污染土壤中的植物、或种植在污染土
壤中的植物种子、或者围绕植物或植物种子的污染土壤区域，其中融合蛋白包括修复酶。

[2213] 实施方案517是实施方案511-516中任一项所述的方法，其中孢子或外孢壁片段施加至植物或植物种子，并且从植物种子生长的植物或植物对待污染土壤的目标污染物是耐
受的。

[2214] 实施方案518是实施方案494-517中任一项所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子包含内生细菌菌株。

[2215] 实施方案519是实施方案518所述的方法，其中内生菌株包括蜡样芽胞杆菌家族成员EE349(NRRL No.B-50928),蜡样芽胞杆菌家族成员 EE439(NRRL B-50979),苏云金芽孢
杆菌EE417(NRRL B-50979),蜡样芽胞杆菌EE444(NRRL B-50977),或苏云金芽孢杆菌EE319
(NRRL B-50983),苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122),蜡样芽胞杆菌家族成员EE-
B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366 (NRRL B-67120)；或蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)。

[2216] 实施方案520是降低环境中污染物的方法，包括将受污染的环境暴露于能降解除草剂或杀虫剂的蜡样芽胞杆菌家族成员菌株的孢子；其中环境中的污染物包括除草剂、杀
虫剂或其组合；并且其中能降解除草剂或杀虫剂的蜡样芽胞杆菌家族成员菌株包括蜡样芽
胞杆菌家族成员EE349 (NRRL No.B-50928)、蜡样芽胞杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-
67119)、假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120)、蕈状芽孢杆菌 EE-B00363(NRRL B-
67121)或其组合。

[2217] 实施方案521是实施方案520所述的方法，其中能降解除草剂或杀虫剂的蜡样芽胞杆菌家族成员菌株包括表达融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，融合蛋白包含使融合
蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标蛋白或肽和靶向序列、外孢
壁蛋白或外孢壁蛋白片段。

[2218] 实施方案522是实施方案521所述的方法，其中目标蛋白或肽包括除草剂-降解酶、杀虫剂-降解酶或其组合。

[2219] 实施方案523是在流体内处理水力压裂流体以破裂乳液或胶体的方法，该方法包括增加重组蜡样芽胞杆菌家族成员孢子至水力压裂流体，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员
表达融合蛋白，包含使融合蛋白靶向重组蜡样芽胞杆菌家族成员的外孢壁的至少一种目标
蛋白或肽和靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段，并且目标蛋白或肽包括适于破裂乳
液或胶体的酶。

[2220] 实施方案524是实施方案523所述的方法，其中重组蜡样芽胞杆菌家族成员包括实施方案16-29、48-63、125-141和168-296中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[2221] 实施方案525是在流体内处理水力压裂流体以破裂乳液或胶体的方法，方法包括增加外孢壁片段至水力压裂流体，其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述
的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，并且包含融合蛋白，并且其中融合蛋白包括适于破裂乳液
或胶体的酶。

[2222] 实施方案526是实施方案523-525中任一项所述的方法，其中融合蛋白包括实施方案14所述的融合蛋白。

[2223] 实施方案527是实施方案523-526中任一项所述的方法，其中酶包括半纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、碳水化合物水解酶、纤维素酶、琼脂糖酶、多聚半乳糖醛酸酶、内切葡聚糖酶或其组合。

[2224] 实施方案528是实施方案523-527中任一项所述的方法，其中乳液或胶体包括聚合物、阿拉伯糖胶、琼脂、黄原胶、纤维素、羧基甲基纤维素、羧基甲基羟基乙基纤维素、羟基乙基甲基纤维素、瓜尔胶、瓜尔胶衍生物或其组合。

[2225] 实施方案529是实施方案523-528中任一项所述的方法，其中孢子注入与地下含烃地层例如砂岩储层或碳酸盐储层接触的井中。

[2226] 实施方案530是消毒表面的方法，方法包括将表面暴露于表达实施方案15所述的融合蛋白的重组蜡样芽胞杆菌家族成员。

[2227] 实施方案531是消毒表面的方法，方法包括将表面暴露于外孢壁片段，其中外孢壁片段衍生自实施方案100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，并且包含融合
蛋白，并且其中融合蛋白包括抗菌性蛋白或肽。

[2228] 实施方案532是消毒表面的方法，方法包括将表面暴露于实施方案17-27中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，其中融合蛋白包括抗菌性蛋白或肽。

[2229] 实施方案533是实施方案530-532中任一项所述的方法，其中抗菌性蛋白或肽最小化或防止病毒剂、细菌、变形虫、害虫或霉菌在表面上形成或结合。

[2230] 实施方案534是实施方案530-533中任一项所述的方法，其中抗菌性蛋白或肽包括蛋白酶、核酸酶、抗菌肽、LysM、LfcinB、溶葡萄球菌素、白蛋白、防御素、细菌素、脂肽、先天免疫系统肽、溶菌酶、裂解酶或其组合。

[2231] 实施方案535是实施方案13或15中任一项所述的包含酶作为目标蛋白或肽的融合蛋白或者实施方案13或15中任一项所述的表达包含酶作为目标蛋白或肽的融合蛋白的重
组蜡样芽胞杆菌家族成员的用途：油脂、油脂或脂肪处理或脱胶；皮料加工；生物燃料、生物柴油或生物乙醇形成；糖加工或转化；淀粉处理；纸或亚麻加工；动物或真菌副产品处理或氨基酸回收；有针对性地消化设施废物；饲料或食品添加剂；膳食补充剂；动物营养；工业清洗；粮食加工；化妆品制造；气味对照、食品或饮料加工；酿造增强剂或添加剂；洗涤剂添加剂；或纺织或纱线加工。

[2232] 实施方案536是外孢壁片段的用途：油脂、油脂或脂肪处理或脱胶；皮料加工；生物燃料、生物柴油或生物乙醇形成；糖加工或转化；淀粉处理；纸或亚麻加工；动物或真菌副产品处理或氨基酸回收；有针对性地消化设施废物；饲料或食品添加剂；膳食补充剂；动物营养；工业清洗；粮食加工；化妆品制造；气味对照、食品或饮料加工；酿造增强剂或添加剂；洗涤剂添加剂；或纺织或纱线加工；其中外孢壁片段衍生自实施方案 100-124中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员，并且包含融合蛋白，并且其中融合蛋白包括酶。

[2233] 实施方案537是实施方案17-27中任一项所述的重组蜡样芽胞杆菌家族成员的用途：油脂、油脂或脂肪处理或脱胶；皮料加工；生物燃料、生物柴油或生物乙醇形成；糖加工或转化；淀粉处理；纸或亚麻加工；动物或真菌副产品处理或氨基酸回收；有针对性地消化设施废物；饲料或食品添加剂；膳食补充剂；动物营养；工业清洗；粮食加工；化妆品制造；气味对照、食品或饮料加工；酿造增强剂或添加剂；洗涤剂添加剂；或纺织或纱线加工；其中融合蛋白包含酶。

[2234] 实施方案538是实施方案535-537中任一项所述的用途，其中酶包括β-内酰胺酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、果胶酶、木质素酶、淀粉酶、多聚半乳糖醛酸酶、葡萄糖苷酶、半乳糖苷酶、碳水化合物水解酶、细胞壁水解酶、核酸酶、半纤维素酶、木聚糖酶、甘露酶、漆酶、乳糖酶、酯酶、肌醇六磷酸酶、磷酸酶、转化酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、溶解酶、乙酰乳酸脱羧酶或脲酶。

[2235] 实施方案539是实施方案538的用途，其中淀粉酶包括α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶；或者其中酯酶包括果胶甲基酯酶。

[2236] 实施方案540是实施方案447-487、493、495-510、515-519、 521-529和531-534中任一项所述的方法、实施方案489-492中任一项所述的疫苗、或实施方案536-539中任一项所述的用途，其中靶向序列、外孢壁蛋白或外孢壁蛋白片段包括:(1)靶向序列包含与SEQ 
ID NO:1的氨基酸20-35具有至少约43％同一性的氨基酸序列，其中与氨基酸25-35 的同一
性至少约54％；(2)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-35；(3) 靶向序列包含SEQ ID 
NO:1的氨基酸20-35；(4)靶向序列包含SEQ ID NO:1；(5)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的氨基酸序列；(6)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸2-35；(7)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸5-35；(8)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸8-35；(9)靶向
序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸10-35；(10)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸15-35；
(11)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸1-27；(12)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸
12-27；(13)靶向序列包含SEQ ID NO:3；(14)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:4具有至少85％同一性的氨基酸序列；(15)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸 2-27；(16)靶向序列包含
SEQ ID NO:3的氨基酸5-27；(17)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸8-27；(18)靶向序列
包含SEQ ID NO:3的氨基酸10-27；(19)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸1-38；(20)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸23-38；(21)靶向序列包含SEQ ID NO:5； (22)外孢壁蛋白
包含与SEQ ID NO:6具有至少85％同一性的氨基酸序列； (23)靶向序列包含SEQ ID NO:5
的氨基酸2-38；(24)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸5-38；(25)靶向序列包含SEQ ID 
NO:5的氨基酸8-38； (26)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸10-38；(27)靶向序列包含 
SEQ ID NO:5的氨基酸15-38；(28)靶向序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸 20-38；(29)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸1-28；(30)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸13-28；(31)靶向序列包含SEQ ID NO:7；(32) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的氨
基酸序列；(33) 靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸2-28；(34)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-28；(35)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸8-28；(36) 靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸10-28；(37)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸1-24；(38)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸9-24； (39)靶向序列包含SEQ ID NO:9；(40)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO: 10具有至少85％同一性的氨基酸序列；(41)靶向序列包含SEQ ID NO:9 的氨基酸2-
24；(42)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸5-24；(43)靶向序列包含SEQ ID NO:9的氨基
酸8-24；(44)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸1-33；(45)靶向序列包含SEQ ID NO:11
的氨基酸18-33； (46)靶向序列包含SEQ ID NO:11；(47)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 12具有至少85％同一性的氨基酸序列；(48)靶向序列包含SEQ ID NO:11 的氨基酸2-33；(49)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸5-33；(50)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸8-
33；(51)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸10-33；(52)靶向序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸15-33； (53)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸1-33；(54)靶向序列包含 SEQ ID 
NO:13的氨基酸18-33；(55)靶向序列包含SEQ ID NO:13；(56) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO:14具有至少85％同一性的氨基酸序列；(57)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸2-33；
(58)靶向序列包含 SEQ ID NO:13的氨基酸5-33；(59)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基
酸8-33；(60)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸10-33；(61)靶向序列包含SEQ ID NO:13的氨基酸15-33；(62)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸1-43；(63)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸28-43； (64)靶向序列包含SEQ ID NO:15；(65)外孢壁蛋白包含与SEQ ID 
NO: 16具有至少85％同一性的氨基酸序列；(66)靶向序列包含SEQ ID NO: 15的氨基酸2-
43；(67)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸5-43；(68) 靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸8-43；(69)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸10-43；(70)靶向序列包含SEQ ID NO:
15的氨基酸15-43； (71)靶向序列包含SEQ ID NO:15的氨基酸20-43；(72)靶向序列包含 
SEQ ID NO:15的氨基酸25-43；(73)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸1-27；(74)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸12-27；(75)靶向序列包含SEQ ID NO:17；(76)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:18具有至少85％同一性的氨基酸序列；(77)靶向序列包含SEQ ID NO:17的
氨基酸 2-27；(78)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸5-27；(79)靶向序列包含SEQ ID 
NO:17的氨基酸8-27；(80)靶向序列包含SEQ ID NO:17的氨基酸10-27；(81)靶向序列包含
SEQ ID NO:19的氨基酸1-33；(82)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸18-33；(83)靶向序列包含SEQ ID NO:19；(84)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:20具有至少85％同一性的氨基酸
序列；(85)靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸2-33；(86)靶向序列包含SEQ ID NO:19的
氨基酸5-33；(87)靶向序列包含SEQ ID NO:19 的氨基酸8-33；(88)靶向序列包含SEQ ID 
NO:19的氨基酸10-33；(89) 靶向序列包含SEQ ID NO:19的氨基酸15-33；(90)靶向序列包
含SEQ ID NO:21的氨基酸1-33；(91)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸18-33； (92)靶
向序列包含SEQ ID NO:21；(93)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 22具有至少85％同一性的
氨基酸序列；(94)靶向序列包含SEQ ID NO: 21的氨基酸2-33；(95)靶向序列包含SEQ ID 
NO:21的氨基酸5-33；(96) 靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸8-33；(97)靶向序列包含
SEQ ID NO:21的氨基酸10-33；(98)靶向序列包含SEQ ID NO:21的氨基酸 15-33；(99)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸1-24；(100)靶向序列 SEQ ID NO:23的氨基酸9-24；(101)靶向序列包含SEQ ID NO:23；(102) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:24具有至少85％同一性
的氨基酸序列； (103)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸2-24；(104)靶向序列包含 SEQ ID NO:23的氨基酸5-24；(105)靶向序列包含SEQ ID NO:23的氨基酸8-24；(106)靶向序列
包含SEQ ID NO:25的氨基酸1-24；(107)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸9-24；(108)
靶向序列包含SEQ ID NO:25；(109)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:26具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(110)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸2-24；(111)靶向序列包含SEQ 
ID NO:25的氨基酸5-24；(112)靶向序列包含SEQ ID NO:25的氨基酸8-24；(113)靶向序列
包含SEQ ID NO:27的氨基酸1-30； (114)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸15-30；
(115)靶向序列包含 SEQ ID NO:27；(116)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:28具有至少85％
同一性的氨基酸序列；(117)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸2-30； (118)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸5-30；(119)靶向序列包含 SEQ ID NO:27的氨基酸8-30；(120)靶向序列包含SEQ ID NO:27的氨基酸10-30；(121)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-
33；(122)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸18-33；(123)靶向序列包含SEQ ID NO:29；
(124)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:30具有至少85％同一性的氨基酸序列；(125)靶向序列
包含SEQ ID NO:29的氨基酸2-33；(126)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸5-33；(127)
靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸8-33；(128)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸 
10-33；(129)靶向序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸15-33；(130)靶向序列包含SEQ ID NO:
31的氨基酸1-24；(131)靶向序列包含SEQ ID NO: 31的氨基酸9-24；(132)靶向序列包含
SEQ ID NO:31；(133)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:32具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(134)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸2-24；(135)靶向序列包含SEQ ID NO: 31的氨
基酸5-24；(136)靶向序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸8-24； (137)靶向序列包含SEQ ID 
NO:33的氨基酸1-15；(138)靶向序列包含 SEQ ID NO:33；(139)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:34具有至少85％同一性的氨基酸序列；(140)靶向序列包含SEQ ID NO:35的氨基酸1-
16； (141)靶向序列包含SEQ ID NO:35；(142)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:36具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(143)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸1-29；(144)靶向序
列包含SEQ ID NO:43的氨基酸 14-29；(145)靶向序列包含SEQ ID NO:43；(146)外孢壁蛋
白包含与 SEQ ID NO:44具有至少85％同一性的氨基酸序列；(147)靶向序列包含 SEQ ID 
NO:43的氨基酸2-29；(148)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸5-29；(149)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸8-29；(150)靶向序列包含SEQ ID NO:43的氨基酸10-29；(151)靶向序列包含SEQ IDNO:45的氨基酸1-35；(152)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸 20-35；
(153)靶向序列包含SEQ ID NO:45；(154)外孢壁蛋白包含与 SEQ ID NO:46具有至少85％
同一性的氨基酸序列；(155)靶向序列包含 SEQ ID NO:45的氨基酸2-35；(156)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸5-35；(157)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸8-35；(158)靶
向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸10-35；(159)靶向序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸15-
35；(160)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸 1-43；(161)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸28-43；(162)靶向序列包含SEQ ID NO:47；(163)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:48具有至少85％同一性的氨基酸序列；(164)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸2-43；(165)
靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸5-43；(166)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸8-
43；(167)靶向序列包含SEQ ID NO: 47的氨基酸10-43；(168)靶向序列包含SEQ ID NO:47
的氨基酸15-43； (169)靶向序列包含SEQ ID NO:47的氨基酸20-43；(170)靶向序列包含 
SEQ ID NO:47的氨基酸25-43；(171)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸1-32；(172)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸17-32；(173) 靶向序列包含SEQ ID NO:49；(174)外孢壁
蛋白包含与SEQ ID NO:50 具有至少85％同一性的氨基酸序列；(175)靶向序列包含SEQ ID NO:49 的氨基酸2-32；(176)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸5-32；(177) 靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸8-32；(178)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸10-32；(179)靶向序列包含SEQ ID NO:49的氨基酸 15-32；(180)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸1-
33；(181)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸18-33；(182)靶向序列包含SEQ ID NO: 51；
(183)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:52具有至少85％同一性的氨基酸序列；(184)靶向序列
包含SEQ ID NO:51的氨基酸2-33；(185)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸5-33；(186)
靶向序列包含SEQ ID NO: 51的氨基酸8-33；(187)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸
10-33； (188)靶向序列包含SEQ ID NO:51的氨基酸15-33；(189)靶向序列包含 SEQ ID 
NO:53的氨基酸1-33；(190)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸18-33；(191)靶向序列包
含SEQ ID NO:53；(192)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:54具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(193)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸2-33；(194)靶向序列包含SEQ ID NO:53 的氨基酸5-33；(195)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸8-33；(196) 靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸10-33；(197)靶向序列包含SEQ ID NO:53的氨基酸15-33；(198)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸 1-30；(199)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸15-30；(200)
靶向序列包含SEQ ID NO:55；(201)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:56具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(202)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸2-30；(203)靶向序列包含SEQ 
ID NO:55的氨基酸5-30；(204)靶向序列包含SEQ ID NO:55的氨基酸8-30；(205)靶向序列
包含SEQ ID NO: 55的氨基酸10-30；(206)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸1-130； 
(207)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸115-130；(208)靶向序列包含SEQ ID NO:57；
(209)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少85％同一性的氨基酸序列；(210)靶向序列
包含SEQ ID NO:57的氨基酸 2-130；(211)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸5-130；
(212)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸10-130；(213)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨
基酸20-130；(214)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸 30-130；(215)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸40-130；(216)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸50-130；(217)靶向
序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸60-130；(218)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸70-
130；(219)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸80-130；(220) 靶向序列包含SEQ ID NO:
57的氨基酸90-130；(221)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸100-130；(222)靶向序列包含SEQ ID NO:57的氨基酸110-130；(223)外孢壁蛋白片段包含与SEQ ID NO:95具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(224)靶向序列包含SEQ ID NO:96；(225)靶向序列包含SEQ ID NO:97；(226)靶向序列包含SEQ ID NO:98；(227)靶向序列包含SEQ ID NO:99；(228)靶向序列包含SEQ ID NO:100；(229) 靶向序列包含SEQ ID NO:101；(230)靶向序列包含SEQ ID 
NO:102； (231)靶向序列包含SEQ ID NO:103；(232)靶向序列包含SEQ ID NO: 104；(233)靶向序列包含SEQ ID NO:105；(234)靶向序列包含SEQ ID NO:106；(235)外孢壁蛋白包含
与SEQ ID NO:108具有至少85％同一性的氨基酸序列；(236)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
109具有至少85％同一性的氨基酸序列；(237)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:110具有至少 
85％同一性的氨基酸序列；(238)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:111具有至少85％同一性的
氨基酸序列；(239)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:112 具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(240)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO: 113具有至少85％同一性的氨基酸序列；(241)外孢壁
蛋白包含与SEQ IDNO:114具有至少85％同一性的氨基酸序列；(242)外孢壁蛋白包含与 
SEQ ID NO:115具有至少85％同一性的氨基酸序列；(243)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:
116具有至少85％同一性的氨基酸序列；(244)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:117具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(245) 外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:118具有至少85％同一性
的氨基酸序列； (246)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:119具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(247)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:120具有至少85％同一性的氨基酸序列；(248)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:121具有至少85％同一性的氨基酸序列；(249)靶向序列包含氨基
酸SEQ ID NO:1的氨基酸 22-31；(250)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸22-33；(251)靶向序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸20-31；(252)靶向序列包含SEQ ID NO:3 的氨基酸14-
23；(253)靶向序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸14-25；(254) 靶向序列包含SEQ ID NO:3的
氨基酸12-23；(255)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸1-30；(256)靶向序列包含SEQ ID NO:59；(257)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:60具有至少85％同一性的氨基酸序列；(258) 
靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸2-30；(259)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸4-
30；(260)靶向序列包含SEQ ID NO:59的氨基酸6-30； (261)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸1-33；(262)靶向序列包含 SEQ ID NO:61的氨基酸18-33；(263)靶向序列包含SEQ 
ID NO:61； (264)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:62具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(265)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸2-33；(266)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基
酸5-33；(267)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸10-33；(268)靶向序列包含SEQ ID NO:
61的氨基酸15-33；(269) 靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸1-35；(270)靶向序列包含
SEQ IDNO:63；(271)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:64具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(272)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸2-35；(273)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基
酸5-35；(274)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸8-35；(275)靶向序列包含SEQ ID NO:
63的氨基酸 10-35；(276)靶向序列包含SEQ ID NO:63的氨基酸15-35；(277)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸1-24；(278)靶向序列包含SEQ ID NO: 65的氨基酸9-24；(279)靶向序列包含SEQ ID NO:65；(280)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:66具有至少85％同一性的氨
基酸序列；(281)靶向序列包含SEQ ID NO:107；(282)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸 
2-24；(283)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸5-24；(284)靶向序列包含SEQ ID NO:67
的氨基酸1-27；(285)靶向序列包含SEQ ID NO:67 的氨基酸12-27；(286)靶向序列包含SEQ ID NO:67；(287)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:68具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(288)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸2-27；(289)靶向序列包含SEQ ID NO: 67的氨
基酸5-27；(290)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸10-27； (291)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸1-38；(292)靶向序列包含 SEQ ID NO:69的氨基酸23-38；(293)靶向序列包含SEQ ID NO:69； (294)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:70具有至少85％同一性的氨基酸序
列；(295)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸2-38；(296)靶向序列包含SEQ ID NO:69的
氨基酸5-38；(297)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸10-38；(298)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸15-38；(299) 外孢壁蛋白包含SEQ ID NO:72；(300)靶向序列包含SEQ ID 
NO:73； (301)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:74具有至少95％同一性的氨基酸序列；(302)
靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸1-42；(303)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-
42；(304)靶向序列包含SEQ ID NO:75； (305)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:76具有至少
85％同一性的氨基酸序列；(306)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸2-42；(307)靶向序
列包含SEQ ID NO:75的氨基酸5-42；(308)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸10-42；
(309)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸15-42；(310) 靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨
基酸20-42；(311)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸25-42；(312)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 1-24；(313)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸9-24；(314)靶向序列包含
SEQ ID NO:77；(315)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:78具有至少 85％同一性的氨基酸序
列；(316)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸 2-24；(317)靶向序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸5-24；(318)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:80具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(319)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸1-38；(320)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨
基酸23-38；(321)靶向序列包含SEQ ID NO:81；(322)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:82具有至少85％同一性的氨基酸序列；(323)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸2-38；(324)靶
向序列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸5-38；(325)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸10-
38； (326)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸15-38；(327)靶向序列包含 SEQ ID NO:81的氨基酸20-38；(328)靶向序列包含SEQ ID NO:83的氨基酸1-34；(329)靶向序列包含SEQ ID NO:83；(330)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:84具有至少85％同一性的氨基酸序列；
(331)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:86具有至少85％同一性的氨基酸序列；(332)靶向序列
包含SEQ ID NO:87的氨基酸1-28；(333)靶向序列包含SEQ ID NO: 87的氨基酸13-28；
(334)靶向序列包含SEQ ID NO:87；(335)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:88具有至少85％同
一性的氨基酸序列；(336)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸2-28；(337)靶向序列包含
SEQ ID NO: 87的氨基酸5-28；(338)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸10-28； (339)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸1-28；(340)靶向序列包含 SEQ ID NO:89；(341)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:90具有至少85％同一性的氨基酸序列；(342)靶向序列包含SEQ ID 
NO:89的氨基酸2-28； (343)靶向序列包含SEQ ID NO:89的氨基酸5-28；(344)靶向序列包
含 SEQ ID NO:89的氨基酸10-28；(345)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸1-93；(346)
靶向序列包含SEQ ID NO:91；(347)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:92具有至少85％同一性
的氨基酸序列；(348)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸2-93；(349)靶向序列包含SEQ 
ID NO:91的氨基酸10-93；(350)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸20-93；(351) 靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸30-93；(352)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸40-93；
(353)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨基酸 50-93；(354)靶向序列包含SEQ ID NO:91的氨
基酸60-93；(355)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸1-130；(356)靶向序列包含SEQ ID NO: 93；(357)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:94具有至少85％同一性的氨基酸序列；(358)
靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸2-130；(359)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸
10-130；(360)靶向序列包含SEQ ID NO:93的氨基酸20-130；(361)靶向序列包含SEQ ID 
NO:93的氨基酸 30-130；(362)外孢壁蛋白包含与SEQ ID NO:122具有至少85％同一性的氨
基酸序列；(363)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸20-33； (364)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸21-33；(365)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:1的氨基酸
23-31；(366)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:96的氨基酸1-15；(367)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:96的氨基酸1-13；(368)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸12-25；
(369)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸13-25； (370)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:3的氨基酸15-23；(371)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:97的氨基酸1-15；(372)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-13；(373)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸23-36；(374)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸23-34；(375)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸24-36； (376)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:5的氨基酸26-34；(377)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸13-26；(378)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸13-24；(379)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸
14-26；(380)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:7的氨基酸16-24；(381)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-22； (382)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸9-20；
(383)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸10-22；(384)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:9的氨基酸12-20；(385)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:105的氨基酸1-15；(386)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:105的氨基酸1-13；(387)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸18-31； (388)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸18-29；(389)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:11的氨基酸19-31；(390)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
98的氨基酸1-15；(391)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:98的氨基酸1-13；(392)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-31；(393)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸18-29； (394)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸19-31；(395)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:13的氨基酸21-29；(396)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:99的氨基酸1-15；(397)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:99的氨基酸1-13；(398)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸28-41；(399)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸28-
39； (400)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:15的氨基酸29-41；(401)靶向序列由下列组
成：SEQ ID NO:15的氨基酸31-39；(402)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:17的氨基酸12-
25；(403)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:17的氨基酸13-25；(404)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:100 的氨基酸1-15；(405)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸 18-
31；(406)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸18-29；(407) 靶向序列由下列组
成：SEQ ID NO:19的氨基酸19-31；(408)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:19的氨基酸21-
29；(409)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:21的氨基酸18-31；(410)靶向序列由下列组
成：SEQ ID NO: 21的氨基酸18-29；(411)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸19-
31；(412)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:21的氨基酸21-29； (413)靶向序列由下列组
成：SEQ ID NO:101的氨基酸1-15；(414)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:101的氨基酸1-
13；(415)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸9-22；(416)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:23的氨基酸9-20；(417)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸10-22；
(418)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:23的氨基酸12-20； (419)靶向序列由下列组成：
SEQ ID NO:102的氨基酸1-15；(420)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:102的氨基酸1-13；
(421)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸9-22；(422)靶向序列由下列组成：SEQ IDNO:25的氨基酸9-20；(423)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸10-22；(424)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:25的氨基酸12-20； (425)靶向序列由下列组成：SEQ ID 
NO:103的氨基酸1-15；(426)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:103的氨基酸1-13；(427)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸15-28；(428)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
27的氨基酸15-26；(429)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27 的氨基酸16-28；(430)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:27的氨基酸 18-26；(431)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:
104的氨基酸1-15；(432) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:104的氨基酸1-13；(433)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:33的氨基酸1-13；(434)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:33的氨基酸1-11；(435)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 33的氨基酸3-11；(436)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸 1-14；(437)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸1-12；(438) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:35的氨基酸2-14；(439)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:43的氨基酸14-27；(440)靶向序列由下列组成： SEQ ID NO:43的氨基酸14-25；(441)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO: 43的氨基酸15-27；(442)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸20-33；(443)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸
20-31； (444)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:45的氨基酸21-33；(445)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:106的氨基酸1-15；(446)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:106的氨基酸
1-13；(447)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:47的氨基酸28-41；(448)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:47 的氨基酸28-39；(449)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸 
18-31；(450)靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸18-29；(451) 靶向序列由下列组成：SEQ ID NO:53的氨基酸19-31；(452)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨基酸18-31；
(453)靶向序列包含SEQ ID NO:61 的氨基酸18-29；(454)靶向序列包含SEQ ID NO:61的氨
基酸19-31； (455)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸9-22；(456)靶向序列包含 SEQ ID NO:65的氨基酸9-20；(457)靶向序列包含SEQ ID NO:65的氨基酸10-22；(458)靶向序列包
含SEQ ID NO:107的氨基酸1-15；(459) 靶向序列包含SEQ ID NO:107的氨基酸1-13；(460)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸12-25；(461)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸 
12-23；(462)靶向序列包含SEQ ID NO:67的氨基酸13-25；(463)靶向序列包含SEQ ID NO:
67的氨基酸15-23；(464)靶向序列包含SEQ ID NO: 69的氨基酸23-36；(465)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸23-34； (466)靶向序列包含SEQ ID NO:69的氨基酸24-36；(467)靶向序列包含 SEQ ID NO:69的氨基酸26-34；(468)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-
40；(469)靶向序列包含SEQ ID NO:75的氨基酸27-38；(470) 靶向序列包含SEQ ID NO:77
的氨基酸9-22；(471)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸9-20；(472)靶向序列包含SEQ 
ID NO:77的氨基酸 10-22；(473)靶向序列包含SEQ ID NO:77的氨基酸12-20；(474)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸23-36；(475)靶向序列包含SEQ ID NO: 81的氨基酸23-34；
(476)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨基酸24-36； (477)靶向序列包含SEQ ID NO:81的氨
基酸26-34；(478)靶向序列包含 SEQ ID NO:87的氨基酸13-26；(479)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸13-24；或(480)靶向序列包含SEQ ID NO:87的氨基酸14-26。