METHODE DE SELECTION DANS DES CONDITIONS PHYSICO-CHIMIQUES NON STANDARD DE PROTEINES STABLES |
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申请号 | EP06743634.5 | 申请日 | 2006-04-04 | 公开(公告)号 | EP1894014B1 | 公开(公告)日 | 2016-12-21 |
申请人 | Biomethodes; | 发明人 | DELCOURT, Marc; | ||||
摘要 | |||||||
权利要求 | |||||||
说明书全文 | La présente invention relève du domaine de la biologie moléculaire et plus particulièrement de l'évolution dirigée des protéines. Le marché annuel des enzymes industrielles et de spécialité est estimé à plusieurs milliards d'euros. Moins de 30 enzymes comptent pour plus de 90% des enzymes industrielles utilisées. La grande majorité est cependant fragile et peu résistante dans les conditions d'usage industriel, d'où la recherche d'enzymes de substitution plus robustes (température, pH, pression). Les enzymes interviennent en complément ou en substitution de méthodes chimiques classiques plus lourdes de manière à rendre ces procédés plus précis et moins coûteux et afin de limiter les externalités négatives sur l'environnement. Beaucoup de ces procédés n'ont pas lieu à pH neutre, température ambiante et pression atmosphérique. Le procédé suivant l'invention permet de rendre des enzymes compatibles avec une utilisation dans des procédés à haute température (50°C à 110°C). Dans un autre domaine, les protéines et anticorps thérapeutiques constituent une part importante et croissante du marché des médicaments. Un enjeu central, dans l'amélioration d'hormones, enzymes, anticorps ou autres protéines thérapeutiques, est d'augmenter leur stabilité in vivo. En effet, si une protéine thérapeutique est rapidement dégradée dans l'organisme, il est plus délicat de réguler la quantité active à un moment donné et il devient nécessaire d'augmenter la fréquence d'administration, ce qui a un coût et une incidence importante sur le confort d'utilisation pour le patient. Le procédé suivant l'invention, parce qu'il permet de sélectionner des protéines stables dans des conditions physico-chimiques non standard, peut permettre indirectement d'augmenter la stabilité in vivo de protéines thérapeutiques. Le cas des hautes températures et des protéines thermostables constitue un cas important de conditions physico-chimiques non standard. Les protéines et peptides thermostables naturels sont issus de micro-organismes poussant à des températures extrêmes. Les micro-organismes thermophiles comprennent notamment : Bacillus stearothermophilus (qui vit à une température pouvant atteindre Tmax ∼ 60°C), Thermus aquaticus (Tmax ∼ 70°C) et Thermus thermophilus (Tmax ∼ 80°C), et les hyper-thermophiles comme Thermotoga maritime (Tmax ∼ 90°C) et Aquifex pyrophilus (Tmax ∼ 95°C). La capacité de ces organismes à pousser à des températures élevées implique que leurs enzymes et protéines sont stables et actives à ces températures ( L'exemple le plus connu d'utilisation de protéines issues d'organismes extrêmophile est le cas des enzymes ADN polymérases thermostables en biologie moléculaire. Grâce à la polymérase thermostable de Thermus aquaticus (la Taq polymerase), la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), qui a révolutionné la biologie moléculaire, a pu être inventée. Depuis, des polymérases thermostables issues d'autres organismes thermophiles, comme la Pfu polymerase ou la Vent polymerase, ont été produites et commercialisées. En recombinant in vitro les séquences de diverses polymérases thermostables et en utilisant une méthode de sélection spécifique pour ces polymérases, une équipe a pu créer de nouvelles polymérases thermostables, à la thermostabilité élevée, moins sensibles à des inhibiteurs courants ou encore capables d'incorporer des nucléotides non standard ( Un autre exemple d'utilisation d'enzyme important issu d'un extrêmophile est le cas de cellulases tirées d'alkaliphiles utilisées comme agent de dégradation de la cellulose dans les détergents (par exemple, la cellulase 103, vendue par Genencor depuis 1997). Plus généralement, et sans que la liste d' « extremozymes » ci-dessous ne soit exhaustive, les extrêmophiles sont, depuis quelques années, à l'origine de nombreuses nouvelles enzymes ( Utiliser directement des bactéries ou archéobactéries extrêmophiles pour isoler des protéines stables et/ou actives dans des conditions physico-chimiques non standard peut donc être efficace. Une telle approche est toutefois rarement possible dans le cas des enzymes issues d'eucaryotes, champignons, levures, plantes ou mammifères : on recense peu d'extrêmophiles eucaryotes (voir néanmoins http://www.nhm.ac.uk/zoology/extreme.html). Il faut alors partir d'une enzyme standard puis l'améliorer, par évolution dirigée, pour la rendre stable et/ou active dans des conditions physico-chimiques non standard. Cette approche d'évolution dirigée de protéines stables dans des conditions physico-chimiques non standard n'est pas limitée aux protéines issues d'eucaryotes, qui sont généralement mésophiles, mais est également intéressante pour toutes les protéines issues d'organismes procaryotes courants, eux aussi mésophiles. Malgré tous les progrès de la biologie moderne, il demeure en effet difficile de déterminer les relations entre la séquence d'une protéine et sa fonction. Il est notamment peu aisé, en pratique, de prévoir précisément quelles mutations permettront de rendre stable une protéine dans des conditions physico-chimiques non standard. L'approche de choix, dans ce contexte où la conception rationnelle est peu opérante, est l'évolution moléculaire dirigée. S'inspirant de l'évolution naturelle Darwinienne, l'évolution dirigée en reproduit, en laboratoire, les principales étapes : obtention d'une diversité génétique, expression des protéines correspondantes puis tri des produits adaptés à des conditions données. Ainsi, l'évolution dirigée commence par obtenir une diversité de gènes puis les exprime, trie les gènes codant des protéines améliorées par rapport à un critère d'intérêt. Plusieurs types de méthodes génériques sont disponibles pour créer de la diversité en modifiant la séquence d'un gène initial : la mutagenèse aléatoire ( Après l'obtention de diversité au niveau des polynucléotides codant, la deuxième étape de l'évolution dirigée, le tri, a lieu au niveau de leurs produits protéiques et peut se faire suivant deux modalités : le criblage (ou screening, notamment le criblage haut-débit ou « high-throughput screening ») et la sélection. Le criblage consiste à trier, une par une, les protéines et les gènes correspondants sur la base d'un test réalisé typiquement dans des puits de microplaques à 96, 384 ou 1536 puits. Suivant le degré d'automatisation, on peut ainsi trier de l'ordre de 103 à 105 variants par jour. Les méthodes dites de sélection sont plus proches de la sélection naturelle, en ce qu'elles trient « en masse », en parallèle, tous les variants répondant à un critère donné, et les isolent de la majorité des variants, non améliorés. On peut ainsi trier de l'ordre de 106 et jusqu'à 1013 variants simultanément. On voit aisément que, lorsqu'elles sont disponibles, les méthodes de sélection permettent de trier beaucoup plus facilement une diversité beaucoup plus grande que les méthodes de criblage. Des méthodes de sélection comme le phage display ou le ribosome display, sont disponibles lorsque le critère d'intérêt est l'affinité de la protéine pour un ligand donné, et ont été employées avec succès dans le domaine des anticorps. Ces méthodes ont pu être adaptées à des cas de sélection pour l'activité enzymatique ou la stabilité dans des conditions standard ( La présente invention dans son sens le plus étendu est telle que définie dans les revendications indépendantes. Le procédé selon l'invention est tel que défini dans les revendications et concerne une méthode de sélection de protéines stables dans des conditions physico-chimiques non standard de température, caractérisé par l'expression, dans un micro-organisme extrêmophile, de variants de la protéine d'intérêt sous forme de protéine de fusion avec une protéine rapporteur Π stable dans les conditions non standard considérées jouant le rôle de marqueur de sélection. Ainsi, la présente invention concerne un procédé de sélection de protéines stables, en particulier dans des conditions physico-chimiques non standard, caractérisé en ce qu'une banque de variants d'une protéine d'intérêt est exprimée dans un micro-organisme extrêmophile sous la forme d'une protéine de fusion avec une protéine rapporteur stable dans des conditions physico-chimiques non standard, et en ce que un ou plusieurs variants stables de la protéine d'intérêt sont sélectionnés à partir des micro-organismes dans lesquels la protéine rapporteur est active. Le micro-organisme extrêmophile peut être une bactérie, une archéo-bactérie, ou un eucaryote extrêmophile. Le micro-organisme est un micro-organisme thermophile ou hyper-thermophile. En particulier, le micro-organisme thermophile ou hyper-thermophile peut être sélectionné parmi les micro-organismes thermophiles ou hyper-thermophiles suivant : Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermotoga maritime ou Aquifex pyrophilus. De préférence, la protéine rapporteur stable est une protéine dont l'expression correcte permet la survie du micro-organisme et la sélection du variant stable de la protéine d'intérêt est opérée par survie du micro-organisme. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine rapporteur est une protéine conférant la résistance à un antibiotique. Par exemple, la protéine rapporteur peut être une version thermostable d'une protéine de résistance à un antibiotique. De préférence, la protéine rapporteur est une version thermostable d'une protéine de résistance à la kanamycine ou à la bléomycine. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, la protéine rapporteur est une kanamycine nucleotidyltransférase thermostable. Dans un mode de réalisation alternatif, la protéine rapporteur est un marqueur d'auxotrophie. Dans un autre mode de réalisation, la protéine rapporteur est une protéine dont l'expression correcte conduit directement ou indirectement à la transformation d'un substrat en un produit, le produit et le substrat différant par leurs couleurs, et la sélection du variant stable de la protéine d'intérêt est opérée sur la base de la couleur des micro-organismes. Par exemple, la protéine rapporteur peut être une version stable dans des conditions physico-chimiques non standard de la béta-galactosidase. Dans un mode de réalisation supplémentaire, la protéine rapporteur est fluorescente ou luminescente et la sélection du variant stable de la protéine d'intérêt est opérée par détection de la fluorescence ou luminescence. La protéine rapporteur peut ne pas être fluorescente ou luminescente dans les conditions physico-chimiques non standard où elle est produite mais devenir fluorescente lorsqu'on la place dans des conditions physico-chimiques standard. De préférence, la protéine rapporteur est la GFP (green fluorescent protein) ou un variant de la GFP. Dans un mode de réalisation préféré, la sélection est effectuée en utilisant un FACS ou par simple sélection visuelle de colonies bactériennes. Dans un mode de réalisation préféré, la protéine d'intérêt peut être située en N-terminal de la protéine rapporteur dans la protéine de fusion. Dans un mode de réalisation alternatif, la protéine d'intérêt est située en C-terminal de la protéine rapporteur dans la protéine de fusion. Facultativement, la protéine de fusion comprend un espaceur peptidique. La banque de variants de la protéine d'intérêt peut être générée par une technique de mutagenèse connue de l'homme du métier, de préférence sélectionnée parmi le groupe suivant : la technologie Massive Mutagenesis®, la mutagenèse aléatoire, la mutagenèse dirigée, la mutagenèse à saturation, la mutagenèse par élongation, et la mutagenèse in vivo, une méthode de recombinaison génétique in vivo ou in vitro, ou une combinaison de celles-ci. Dans un mode de réalisation préféré, elle est créée par la technologie Massive Mutagenesis®. Dans un mode de réalisation préféré alternatif, elle est créée par recombinaison in vitro circulaire de plusieurs gènes naturels ou synthétiques codant la protéine d'intérêt. La banque de variants de la protéine d'intérêt peut également être créée par clonage direct d'acides nucléiques tirés d'une source environnementale par utilisation des techniques du metagénome. Dans un mode de réalisation préféré, le micro-organisme est thermophile ou hyper-thermophile, la protéine rapporteur est une protéine thermostable conférant la résistance à un antibiotique, la protéine d'intérêt est située en N-terminal de la protéine rapporteur dans la protéine de fusion, et la banque de variants de la protéine d'intérêt est créée par la technologie Massive Mutagenesis®. De préférence, le micro-organisme est T. Thermophilus, la protéine rapporteur est une kanamycine nucleotidyltransférase thermostable, et la protéine de fusion comprend un espaceur peptidique. Le présent document décrit les protéines ayant une stabilité accrue dans des conditions physico-chimiques non standard sélectionnées selon le procédé de la présente invention. Notamment, sont considérés les enzymes, anticorps, hormones, cytokines ou autres protéines thérapeutiques sélectionnées selon le procédé de la présente invention et qui présentent une stabilité in vivo accrue. La présente invention concerne également une protéine de fusion comprenant une protéine d'intérêt ou un variant de celle-ci et une version thermostable d'une protéine conférant la résistance à un antibiotique. De préférence, la protéine conférant la résistance à un antibiotique est la kanamycine nucleotidyltransférase ou la protéine de résistance à la bléomycine. L'invention concerne en outre un acide nucléique ou vecteur d'expression codant une protéine de fusion selon la présente invention. De préférence, le vecteur comprend les éléments nécessaires à la réplication dans un micro-organisme extrêmophile. Facultativement, le vecteur peut comprendre en outre une origine de réplication pour un autre micro-organisme couramment utilisé en laboratoire, par exemple E. Coli, et/ou un autre gène de résistance à un antibiotique, par exemple un gène de résistance à l'ampicilline. Le procédé selon l'invention permet la sélection, au sein d'un ensemble de variants d'une protéine d'intérêt, de variants présentant une stabilité accrue dans des conditions physico-chimiques non standard. Ces conditions physico-chimiques non standard ou « extrêmes » sont ici définies par une température élevée (50°C à 110°C). Cette stabilité dans des milieux plus ou moins extrêmes peut être intéressante et recherchée en soi. Dans de nombreux cas, la sélection pour une stabilité accrue dans des conditions physico-chimiques non standard pourra en outre conduire indirectement à améliorer les caractéristiques de la protéine dans d'autres conditions non standard, ou dans des conditions standard. Ainsi, il a été montré qu'un variant ayant acquis de la thermostabilité peut aussi avoir acquis de la résistance aux solvants (Liu et al, 2006 ; Hao et al, 2004), aux détergents (Liao, 1993), à la protéolyse (Mukherjee et al, 2005 ; Amin et al, 2004). La thermostabilité est également associée à l'accroissement de la demi-vie en conditions douces (Hao et al, 2004 ; Wintrode et al, 2001). Le procédé selon l'invention permet donc l'amélioration de la stabilité, au sens large, de protéines. Plus précisément, partant d'un gène G0 codant la protéine d'intérêt P0 que l'on souhaite améliorer, le procédé selon l'invention comprend les trois étapes suivantes :
Dans un premier mode de réalisation, la préparation de la banque de variants de l'étape a) comprend les étapes suivantes : on prépare une construction ou un vecteur comprenant le gène G0 codant la protéine d'intérêt P0 et la séquence codant une protéine rapporteur Π sous forme d'une protéine de fusion Po-Π, puis la banque de variants Gi (où i=1, 2... N avec N compris entre 2 ou 10 et 1010, et de préférence compris entre 103 et 108) est généré à partir de cette construction ou de ce vecteur. Dans un mode de réalisation alternatif, la préparation de la banque de variants de l'étape a) comprend les étapes suivantes : construction d'une banque de variants Gi (où i=1, 2... N avec N compris entre 2 ou 10 et 1010, et de préférence compris entre 103 et 108), puis les gènes Gi codant les variants protéiques Pi (i=1, 2... N) sont clonés dans un vecteur de telle sorte que des protéines Pi soient exprimées avec une protéine rapporteur Π, stable dans des conditions physico-chimiques non standard, sous la forme de protéines de fusion Pi-Π. Dans un mode de réalisation particulier, le critère d'amélioration retenu est la thermostabilité, l'extrêmophile est un thermophile et, partant d'un gène G0 codant la protéine P0 qu'on souhaite améliorer, le procédé selon l'invention est caractérisé par la succession des trois étapes suivantes :
Une approche relativement similaire est décrite dans la littérature dans le cas de l'amélioration de la solubilité des protéines insolubles : dans ces exemples, des banques de mutants sont fusionnés en phase avec la GFP, et les mutants ayant acquis une certaine solubilité sont sélectionnés sur le critère de leur fluorescence plus importante (brevets américains 6,867,042 et 6,448,087 ; demandes de brevets américains 20030138843 et 20040078148). La présente invention diffère de façon importante en ce que l'on ne recherche pas ici une amélioration de la solubilité des protéines, mais une amélioration de la stabilité dans des conditions extrêmes. A ce titre, les hôtes de sélection utilisés sont des organismes extrêmophiles qui ne sont pas mentionnés dans les documents cités précédemment. En outre, la méthode nécessite la conception de vecteurs navettes adaptés aux organismes extrêmophiles, mais de préférence également adaptés à un organisme standard comme E. Coli. Le gène de fusion doit correspondre aux conditions non standard choisies. Ainsi, le gène rapporteur Π doit être stable dans les conditions physico-chimiques non standard considérés. En effet, le procédé selon l'invention s'applique à l'amélioration de la thermostabilité. Si optimiser une protéine pour qu'elle soit stable et/ou active dans ces conditions peut conduire à améliorer sa solubilité, l'inverse n'est en général pas vrai. Ainsi, de nombreuses protéines sont exprimées très facilement de manière hétérologue chez E. Coli et sont donc très solubles sans pour autant être stables dans des conditions physico-chimiques non standard, notamment sans être thermostables. Par ailleurs, les effets sur la séquence d'une amélioration de l'activité à basse température et à haute température sont évidemment différents. On peut encore illustrer cette différence en considérant le cas de protéines qui sont très thermostables, mais peu solubles (voir par exemple: Le détail des mécanismes assurant le couplage entre la stabilité des deux partenaires d'une protéine de fusion n'est pas bien élucidé. Néanmoins, il a été observé que lorsqu'on fusionne une protéine d'intérêt à une protéine rapporteur, la conformation de l'une et de l'autre sont liées, avec généralement un ordre : une conformation correcte de la protéine située du côté COOH est dépendante d'une conformation également correcte de la protéine localisée à l'extrémité NH2. Ces effets de conformation lors de la synthèse sont parfois décrits sous le terme de « nucléation ». Dans des cas plus rares, cependant, c'est l'inverse qui est observé si bien qu'une approche empirique consistant à tester les deux orientations est nécessaire pour déterminer le sens de la causalité. Les protéines Pi stables dans des conditions physico-chimiques non standard sélectionnées peuvent, en même temps qu'elles ont augmenté leur stabilité avoir diminué leur activité (au sens d'activité enzymatique, ou d'affinité, dans le cas des anticorps, par exemple). Parfois, on souhaite obtenir des protéines qui sont non seulement stables mais également actives dans des conditions physico-chimiques non standard. Dans ce cas, en aval de la méthode générique de sélection pour la stabilité offerte par le procédé selon l'invention, un criblage (ou une sélection) secondaire des clones améliorés sur le critère de leur activité est nécessaire. Ce criblage secondaire peut être effectué directement sur la protéine Pi fusionnée au gène rapporteur. Alternativement, il peut être nécessaire à ce stade de transposer les mutations identifiées sur les protéines Pi stables dans un autre vecteur, éventuellement adapté à l'expression dans un autre hôte (cellules mammifères, levures, ou autres bactéries par exemple), par sous-clonage ou par mutagenèse dirigée. Cette transposition est en particulier souhaitable lorsque la fusion à un gène rapporteur affecte l'activité de la protéine d'intérêt. Lorsque, dans des conditions physico-chimiques non standard données, une protéine Pi n'est pas stable, la protéine de fusion Pi-Π ne sera pas stable. En sélectionnant au sein de la banque celles des protéines de fusion Pi-Π qui correspondent à une protéine Π stable, (ou, suivant les cas, actives) le procédé selon l'invention permet de sélectionner les protéines Pi stables dans ces conditions physico-chimiques non standard données. La première contrainte évidente pour la protéine Π est qu'elle doit être stable dans les conditions de sélection. Par exemple, si on veut sélectionner une protéine Pi stable à 80 °C, il faut que la protéine Π soit elle-même stable à une température de 80 °C ou plus. Pour que la protéine thermostable Π puisse jouer son rôle de marqueur de sélection, il est en outre nécessaire qu'on puisse de manière simple isoler des clones exprimant correctement cette protéine au sein de clones qui ne l'expriment pas. La solution la plus simple est une sélection par survie : lorsque la protéine Π est active, l'organisme extrêmophile dans lequel a lieu la sélection survit, dans le cas contraire, il meurt. Si la protéine Pi est stable dans les conditions physico-chimiques non standard choisies, alors la protéine de fusion Pi- Π s'exprime correctement à l'étape b), ce qui permet à Π d'être active et aux cellules de survivre. De sorte qu'à l'étape c), la sélection consiste simplement à récupérer les cellules ayant poussé. Une méthode simple dans ce contexte est d'utiliser une protéine de résistance à un antibiotique. Lors de l'étape c), la sélection s'effectue en faisant pousser, en milieu liquide ou en milieu solide, les cellules du micro-organisme extrêmophile utilisé en présence de l'antibiotique correspondant. Seules les cellules exprimant correctement, dans les conditions physico-chimiques non standard choisies, le gène de résistance à cet antibiotique pousseront. Par exemple, si la propriété recherchée est la thermostabilité, un antibiotique pour lequel l'existence de variants thermostables de l'enzyme de résistance a été rapportée est la kanamycine. La kanamycine est un antibiotique peu coûteux et couramment utilisé dans les laboratoires de recherche. Il s'agit d'un bactéricide puissant, agissant indépendamment de la densité bactérienne, et ayant un effet à la fois très intense et très rapide in vitro. La kanamycine nucleotidyltransférase (KNTase) est une enzyme permettant aux bactéries de résister à l'antibiotique. Cette enzyme a été isolée à partir de Staphylococcus aureus. Elle catalyse le transfert d'un nucléoside monophosphate d'un nucléotide vers le groupement hydroxyle en 4' de la kanamycine. Ceci a pour effet de neutraliser l'effet de l'antibiotique. Il existe différents mutants de l'enzyme permettant la résistance qui sont stables et actives à des températures allant jusqu'à plus de 70 °C ( Il est aujourd'hui possible de fabriquer d'autres protéines conférant la résistance à un antibiotique à des micro-organismes (bactéries ou archéobactéries) extrêmophiles, et en particulier thermophiles. Par exemple, en faisant évoluer la protéine équivalente chez la bactérie mésophile Streptoalloteichus hindustanus, un groupe vient récemment d'obtenir une protéine conférant la résistance à la bléomycine à la bactérie thermophile Thermus thermophilus HB27 ( Par des méthodes de sélection évidentes pour l'homme du métier, il est plus généralement possible de fabriquer des protéines conférant la résistance à un antibiotique à des organismes extrêmophiles variés. On clone par exemple une banque de mutants du gène de résistance qu'on veut adapter aux conditions de vie extrêmes de l'organisme d'intérêt, on transforme le micro-organisme extrêmophile avec cette banque et les cellules de ce micro-organisme qui pousseront en présence de l'antibiotique seront porteuses de variants stables et actifs dans les conditions de vie de cet organisme. Par exemple, l'article de Brouns et collaborateurs (Brouns et al. supra) illustre une méthode simple permettant d'obtenir, par évolution dirigée, un gène conférant la résistance à haute température à un antibiotique. Il est ainsi possible d'obtenir de manière simple une gamme de protéines Π grâce à laquelle le procédé suivant l'invention permettra de sélectionner des protéines stables dans des conditions physico-chimiques non standard variées. Dans un mode de réalisation particulier, alternativement à l'utilisation d'antibiotiques, la sélection par survie est réalisée en utilisant des souches auxotrophes. Ces souches ont été modifiées par délétion d'un gène, la délétion étant létale dans des conditions de pousse sur milieu minimum. En complémentant ces souches avec un vecteur porteur du marqueur d'auxotrophie, les souches qui expriment correctement ce gène survivent. Le marqueur d'auxotrophie permet de complémenter le gène supprimé et de permettre à la cellule de survivre en milieu minimum. Dans un mode de réalisation particulier, le procédé suivant l'invention utilise ce principe et un vecteur exprimant en fusion le marqueur d'auxotrophie et la banque de variants de gènes codant la protéine d'intérêt que l'on souhaite améliorer sera utilisé. Ainsi, si la protéine de fusion est correctement exprimée, elle complémente le gène supprimé et permet à la cellule de survivre lorsque celle-ci est cultivée sur un milieu non complémentant. Dans le cas contraire, la cellule est incapable de survivre. La sélection peut être effectuée en utilisant un critère autre que la survie. Tout système de protéine rapporteur stable dans des conditions physico-chimiques non standard connu de l'homme du métier peut être utilisé. Dans un mode de réalisation, la protéine Π est un mutant stable dans des conditions physico-chimiques non standard d'une protéine qui est fluorescente ou luminescente, par exemple la GFP (green fluorescent protein). Plusieurs mutants supportant des températures un peu plus élevées que la GFP sauvage sont aujourd'hui disponibles, et possèdent des caractéristiques spectrales variées (voir par exemple : Dans un mode de réalisation particulier, la protéine rapporteur est stable et éventuellement fluorescente dans les conditions physico-chimiques non standard choisies et elle est fluorescente ou luminescente dans des conditions standard. Notamment, la protéine rapporteur utilisée peut ne pas être fluorescente ou luminescente dans les conditions physico-chimiques non standard où elle est produite mais elle devient fluorescente lorsqu'on la place dans des conditions physico-chimiques standard. Par exemple, elle peut être produite à haute température, subir une dénaturation réversible et retrouver une conformation la rendant fluorescente ou luminescente lorsqu'elle est placée à température ambiante. Les cellules contenant des protéines Pi stables dans des conditions physico-chimiques non-standard expriment correctement la protéine de fusion Pi- Π et ces cellules fluorescent lorsqu'elles sont excitées à une longueur d'onde adaptée. Ces cellules peuvent ensuite être triées de manière simple et rapide, dans des conditions standard (notamment : à température ambiante) en utilisant un FACS (« fluorescence activated cell sorter »). Il est à noter que, dans ce mode de réalisation, il n'est absolument pas nécessaire, pour que la sélection ait lieu correctement, que la protéine fluoresce dans les conditions physico-chimiques non standard dans lesquelles pousse l'organisme extrêmophile choisi et dans lesquelles la protéine de fusion Pi- Π est exprimée. Il suffit, en effet, que la protéine rapporteur soit stable, ou au pire subisse une dénaturation réversible, dans les conditions physico-chimiques non standard choisies, puisque c'est son activité dans des conditions standard (notamment : à température ambiante) qui permettra ensuite la sélection. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules de micro-organismes extrêmophiles exprimant les protéines de fusion Pi- Π sont cultivées sur milieu solide et la sélection se fait simplement en prélevant les colonies fluorescentes ou luminescentes. Dans un autre mode de réalisation particulier, la protéine Π est une protéine qui, directement ou indirectement, conduit à la transformation d'un substrat en un produit coloré. La sélection a alors lieu de préférence sur milieu solide en prélevant les colonies de la couleur du produit coloré. La protéine rapporteur est de préférence un variant stable de la béta-galactosidase. Une autre protéine rapporteur thermostable utilisable dans la présente invention est l'esterase thermostable de A. acidocaldarius ( Il est probable que de nombreuses autres protéines pouvant être utilisées comme marqueur de sélection chez des organismes extrêmophiles vont être fabriquées dans les années qui viennent. Le procédé suivant l'invention n'est pas dépendant d'une protéine Π particulière. Quelle que soit la nature de la protéine Π, lorsqu'on construit le gène codant la protéine de fusion Pi-Π, un certain nombre de règles classiques sont à respecter. Ainsi, la liaison entre le gène d'intérêt et celui codant pour la protéine rapporteur doit se faire sans interrompre la phase de lecture. Il est également nécessaire de prendre soin aux contraintes stériques de l'une et l'autre protéine. En effet, il est possible que la fusion de la protéine d'intérêt et de la protéine rapporteur empêche l'une ou l'autre d'adopter sa conformation naturelle. Sa structure en serait modifiée, et son activité annulée. Afin d'éviter ce possible écueil, il est généralement souhaitable d'introduire une séquence codant un peptide de liaison (« linker ») entre le gène codant pour la protéine d'intérêt et celui codant pour la protéine rapporteur. Ce peptide de liaison a en général une structure la plus neutre possible (ie : généralement sans aucun motif de structure secondaire), et ne présente pas en lui-même d'activité particulière. Il est typiquement composé de 8 ou 9 acides aminés neutres qui ne doivent pas influer sur la structure des protéines et ne doivent pas être la cible des protéases. Il est préférable qu'il soit flexible et hydrophile ( Dans un aspect particulier, la présente invention concerne une protéine de fusion comprenant une protéine d'intérêt ou un variant de celle-ci et une protéine rapporteur stable dans des conditions physicochimiques non standard, ainsi qu'un acide nucléique ou un vecteur codant cette protéine de fusion. Les conditions physicochimiques non standard considérées sont la haute température. Ainsi, la protéine rapporteur est thermostable. La protéine rapporteur est une protéine de résistance à un antibiotique stable dans des conditions physicochimiques non standard, et en particulier une protéine de résistance à un antibiotique thermostable. Dans un mode de réalisation tout particulièrement préféré, la protéine rapporteur thermostable est la kanamycine nucleotidyltransférase ou la protéine de résistance à la bléomycine. Le vecteur portant la séquence codant la protéine de fusion selon la présente invention comprend tous les éléments nécessaires à son expression dans le micro-organisme hôte extrêmophile choisi. Il peut également comprendre des éléments permettant une expression dans des organimes standard. Il comprend bien entendu les éléments nécessaires à la reproduction du vecteur (par ex., origine de réplication). Le vecteur est de préférence un plasmide. Le choix de l'organisme extrêmophile utilisé pour l'expression à l'étape b) et la sélection à l'étape c) dépend de la condition physico-chimique non standard choisie, de la facilité avec laquelle on peut transformer et faire pousser les cellules de ce micro-organisme et de la capacité de la machinerie cellulaire de ce micro-organisme à exprimer correctement la protéine Π et les fusions Pi-Π. Peuvent notamment être utilisés avec profit : des thermophiles (qui vivent à une température comprise entre 60°C et 80°C), des hyper-thermophiles (qui vivent à une température supérieure à 80°C), des psychrophiles (qui vivent à une température inférieure à 15°C), des halophiles (qui vivent avec des concentrations élevées en sel, par exemple 4M NaCl ou 3M KCl), des alkaliphiles (qui vivent à des pH supérieurs à 9), des acidophiles (qui vivent à des pH inférieurs à 3), des piezophiles (qui vivent à des pressions allant jusqu'à environ 110MPa), des metallophiles (qui vivent en présence de concentrations élevées de métaux), des radiophiles (qui vivent en présence de niveaux élevés de radiation), des microaerophiles (qui vivent malgré de très faibles teneurs en oxygène). Par exemple, et sans que cette liste ne soit exhaustive, l'organisme extrêmophile peut être sélectionné parmi la liste suivante :
Dans un mode de réalisation préféré, le micro-organisme est thermophile et de préférence est Thermus thermophilus ou Thermus aquaticus. Comme on vient de le voir, ces mêmes organismes peuvent également être une source intéressante de protéines Π. Un problème important peut se poser, en fonction de la séquence de la protéine P0 de départ : celui du biais de codon. En effet, les organismes extrêmophiles ont un profil d'utilisation des codons très différent de celui des cellules non extrêmophiles, d'où est généralement issue la protéine P0. En fonction de données concernant l'expression hétérologue de P0 dans l'organisme extrêmophile choisi, il est possible que cette différence dans les profils d'utilisation des codons empêche la bonne expression des fusions Pi- Π à l'étape b). Il est alors nécessaire de modifier la séquence du gène codant P0 à l'intérieur du vecteur d'expression avant l'étape a) de manière à modifier l'utilisation des codons pour la rendre compatible avec l'expression dans l'organisme extrêmophile choisi aux étapes b) et c). A l'issue de la sélection, il peut être à nouveau nécessaire de modifier la séquence du gène codant la protéine Pi améliorée (rendue stable) de manière à permettre son expression dans l'organisme mésophile choisi in fine pour la production. Par exemple, si la protéine d'origine est tirée d'un mammifère et si l'organisme utilisé pour la sélection est une bactérie thermophile, on peut modifier d'abord les codons du gène correspondant pour permettre une sélection dans un thermophile puis modifier à nouveau la séquence du « hit » obtenu à l'issue de l'évolution moléculaire pour permettre la production de la protéine améliorée dans un hôte de production classique, Pischia pastoris par exemple. Dans un mode de réalisation préféré, on ne modifie qu'une fois, au départ, la séquence de P0 de manière à ce qu'elle puisse être exprimée convenablement à la fois dans l'organisme extrêmophile utilisé pour la sélection et dans l'organisme utilisé ensuite pour la production des variants améliorés. On utilise alors un ensemble d'isocodons (codons synonymes, c'est-à-dire codant pour le même acide aminé) « consensus » qui évite de faire appel à des codons très peu utilisés dans les organismes choisis. Le problème des différences de profil d'utilisation des codons est bien connu aujourd'hui par l'homme du métier et on y est confronté, avec un degré de gravité plus ou moins important, dans pratiquement tous les cas d'expression hétérologue. Dans un mode de réalisation particulier, les problèmes liés aux différences de profil d'utilisation des codons peuvent être résolus en réécrivant, par mutagenèse dirigée, avant l'étape a), un petit nombre (typiquement : 1-20) de codons particulièrement pénalisants pour l'expression de P0 (et des banques créées à partir de P0) dans l'organisme extrêmophile choisi pour la sélection. Dans un autre mode de réalisation, ces problèmes sont résolus en resynthétisant entièrement le gène codant la protéine P0 en concatémérisant des oligonucléotides. Le calcul de grandeurs comme le CAI (Codon Adaptation Index ; De fait, pour certaines protéines P0, et suivant la protéine Π utilisée, l'expression de la banque Pi-Π dans un micro-organisme extrêmophile aura naturellement lieu à un niveau suffisant pour la sélection de sorte qu'aucune réédition de codons ne sera nécessaire. La banque de variants de la protéine d'intérêt peut être préparée soit avant la fusion avec la protéine rapporteur soit après cette fusion. Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, la méthode comprend dans un premier temps la préparation du vecteur portant la séquence codant la protéine de fusion comprenant la protéine d'intérêt et la protéine rapporteur, puis la génération de la banque de variants de la protéine d'intérêt. La banque de variants de la protéine d'intérêt peut être générée par une technique de mutagenèse. Dans un mode de réalisation préféré, la banque de variants de la protéine d'intérêt est créée par la technologie Massive Mutagenesis®. Elle peut également être créée par une autre technologie de mutagenèse et notamment : la mutagenèse aléatoire, la mutagenèse dirigée, la mutagenèse à saturation, la mutagenèse par élongation, la mutagenèse in vivo. Dans un mode de réalisation alternatif, elle peut être générée par une méthode de recombinaison génétique in vivo ou in vitro. De préférence, elle est créée à partir de la recombinaison in vitro circulaire (Demande de brevet Dans un autre mode de réalisation alternatif, la banque de variants de la protéine d'intérêt est créée par clonage direct d'acides nucléiques tirés d'une source environnementale par utilisation des techniques du metagénome. L'approche metagénomique utilisée peut être de type fonctionnelle, ou de type séquence-dépendant, ou de type SIGEX. Dans un premier mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par l'utilisation de la mutagenèse, de la sélection par survie (
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence du gène codant la protéine d'intérêt P0 est modifiée avant l'étape a), en substituant des isocodons adaptés. Dans un mode de réalisation particulier, d'autres substitutions d'isocodons sont également introduites après l'étape e) à l'issue de l'évolution moléculaire pour s'adapter à l'utilisation des codons dans l'organisme choisi pour la production ultérieure de la protéine améliorée. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode de mutagenèse utilisée est la technologie Massive Mutagenesis®. Dans un autre mode de réalisation, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la méthode de mutagenèse utilisée n'est pas Massive Mutagenesis® mais la mutagenèse aléatoire, la mutagenèse dirigée ou la mutagenèse par élongation ( Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la mutagenèse est effectuée in vivo, par utilisation de souches mutatrices. Dans un mode de réalisation particulier, la banque de variants est créée à l'étape b) non pas chez E. Coli, mais directement dans un organisme thermophile. Dans un mode de réalisation préféré, l'antibiotique utilisé pour la sélection dans l'organisme thermophile est la kanamycine, et le gène de résistance utilisé code la kanamycine nucleotidyltransférase thermostable. Dans un mode de réalisation particulier, le gène codant une protéine active à haute température conférant la résistance à un antibiotique ne code pas pour la kanamycine nucleotidyltransférase, mais une autre protéine active à haute température Π conférant la résistance à un autre antibiotique (lui-même thermostable). Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la sélection par survie à haute température est effectuée non pas en utilisant un antibiotique, mais en faisant appel à une souche auxotrophe, en particulier une souche thermophile auxotrophe, le gène rapporteur rétablissant alors la capacité de la souche à pousser sur milieu minimum. Dans un second mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par l'utilisation de la recombinaison, de la sélection par survie (
Dans un mode de réalisation particulier, la séquence des gènes codant la protéine Pi est modifiée après l'étape a) et avant l'étape b), par des mutations synonymes appropriées introduites par mutagenèse dirigée ou par resynthèse du gène pour s'adapter à l'utilisation des codons dans le micro-organisme thermophile choisi. Dans un mode de réalisation particulier, d'autres mutations synonymes appropriées sont également introduites à l'issue de l'évolution moléculaire pour s'adapter à l'utilisation des codons dans l'organisme choisi pour la production ultérieure de la protéine améliorée. Dans un mode de réalisation particulier, la recombinaison est effectuée en utilisant le procédé de recombinaison in vitro circulaire (Demande de brevet Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la méthode de recombinaison utilisée n'est pas la recombinaison circulaire in vitro mais le DNA Shuffling® ( Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la recombinaison est effectuée in vivo. Dans un mode de réalisation préféré, l'antibiotique utilisé pour la sélection dans l'organisme thermophile est la kanamycine, et le gène de résistance utilisé code la kanamycine nucleotidyltransférase thermostable. Dans un mode de réalisation particulier, le gène codant une protéine active à haute température conférant la résistance à un antibiotique code pour une autre protéine Π active à haute température conférant la résistance à un autre antibiotique (lui-même thermo stable). Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la sélection par survie est effectuée non pas en utilisant un antibiotique, mais en faisant appel à une souche auxotrophe, en particulier une souche thermophile auxotrophe, le gène rapporteur rétablissant alors la capacité de la souche à pousser sur milieu minimum.. Dans un troisième mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par l'utilisation de techniques dite du metagenome et par la succession des étapes suivantes :
Dans un mode de réalisation particulier, des mutations synonymes appropriées sont introduites à l'issue de l'évolution moléculaire pour s'adapter à l'utilisation des codons dans l'organisme choisi pour la production ultérieure de la protéine améliorée. Dans un mode de réalisation préféré, l'antibiotique utilisé pour la sélection dans l'organisme thermophile est la kanamycine, et le gène de résistance utilisé code la kanamycine nucleotidyltransférase thermostable. Dans un mode de réalisation particulier, le gène codant une protéine active à haute température conférant la résistance à un antibiotique code pour une autre protéine Π active à haute température conférant la résistance à un autre antibiotique (lui-même thermo stable). Dans un mode de réalisation particulier, et avec des adaptations évidentes pour l'homme du métier, la sélection par survie est effectuée non pas en utilisant un antibiotique, mais en faisant appel à une souche auxotrophe, en particulier une souche thermophile auxotrophe, le gène rapporteur rétablissant alors la capacité de la souche à pousser sur milieu minimum. Dans un quatrième mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par l'utilisation d'une protéine Π fluorescente qui est stable dans des conditions physico-chimiques non standard. La protéine peut être directement active dans ces conditions physico-chimiques non standard ; alternativement, elle peut être produite dans ces conditions physico-chimiques non standard sans être active, puis devenir active lorsqu'on la replace dans des conditions standard. Le tri a lieu en utilisant la cytométrie de flux et un FACS (fluorescence activated cell sorter ; Dans ce quatrième mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé par la succession des étapes suivantes :
Dans un mode de réalisation particulier, on réalise, par mutagenèse dirigée ou par synthèse de gènes, les substitutions d'isocodons nécessaires à une bonne expression hétérologue. Dans un mode de réalisation particulier, la sélection n'a pas lieu par FACS, mais par lecture de la fluorescence de colonies cultivées sur support solide puis prélèvement et repiquage des colonies présentant une fluorescence élevée ( Un plasmide pouvant être utilisé dans le procédé selon l'invention comporte, dans un ordre approprié, et de façon à ce qu'une phase de lecture unique soit respectée, les éléments suivants :
Augmenter la thermostabilité de phytases bactériennes permet de répondre à un enjeu économique et environnemental majeur dans le domaine de l'alimentation animale. La phytase d'Escherichia coli (myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase, EC 3.1.3.8), catalyse le clivage de l'acide phytique, la forme majeure de stockage du phosphore dans les graines de plantes, avec libération d'un phosphomonoester. Le phosphore présent dans l'acide phytique n'est pratiquement pas utilisable par les animaux monogastriques comme les porcs et la volaille. Aussi, supplémenter l'alimentation de ces animaux avec une phytase augmente la valeur nutritionnelle de l'alimentation fournie. En réduisant le besoin de suppléments en phosphate inorganique dans l'alimentation animale, les phytases aident aussi à préserver l'environnement. Les procédés impliqués dans la fabrication des granulés ou autres aliments pour animaux font très généralement intervenir des étapes à haute température (typiquement : une phase courte de 1 seconde à trois minutes, à 80°C ou plus). Il est donc nécessaire de disposer d'une phytase qui est stable à ces hautes températures, tout en étant active à la température du corps si on veut pouvoir l'incorporer dans l'alimentation animale.
Dans un mode de réalisation particulier, l'activité phytase est mesurée directement dans le surnageant de culture. Pour cela, 20µL de surnageant de culture sont incubés avec 200µL d'une solution de phytate de sodium (10g/L dans du tampon acétate de sodium 250mM - CaCl2 1mM - pH5,5) à 37°C pendant des temps variables (de 15min à 18h). A t=0 et à la fin de la réaction, 50µL de la réaction sont prélevés et mélangés à 50µL de TCA 20% pour arrêter la réaction. L'activité phytase est estimée par le dosage des phosphates libérés dans le milieu réactionnel. Ce dosage s'effectue par ajout de 100µL d'un mélange 4:1 de molybdate d'ammonium 12mM et de sulfate de fer 380mM. Après 30min d'incubation à 20°C (température ambiante), la DO est mesurée à 620nm. Le facteur d'augmentation du signal est calculé par le rapport (DO finale) / (DO initiale). Les cellulases peuvent être utilisées dans la conversion de biomasse mais aussi dans divers procédés industriels, dont l'agroalimentaire, le textile, la lessive, le papier. En vue de l'utiliser dans plusieurs de ces procédés, on souhaiterait disposer d'une cellulase possédant une activité spécifique élevée à des pH neutres ou alcalins (pH 6 à pH 11). Des auteurs ont récemment décrit l'obtention, par évolution dirigée, d'un variant d'une cellulase, l'endoglucanase III (EG III) issu de Trichoderma reesei (
En utilisant un mutant thermostable de la kanamycine nucleotidyltransférase (KNTase) comme marqueur de sélection ( Un vecteur navette E. Coli/ T. Thermophilus a d'abord été généré. Le gène de l'IFNγ humain a été cloné dans ce vecteur en phase avec le marqueur de sélection. Une banque de mutants a été réalisée en utilisant la technologie Massive Mutagenesis®. Des mutants ont été identifiés sur le critère de la résistance à haute concentration de kanamycine. Les mutations ont été identifiées par séquençage. Les mutations ont ensuite été introduites dans un vecteur d'expression mammifère permettant la production d'IFNγ, et l'amélioration de thermostabilité a été validée dans un modèle de culture cellulaire. Le vecteur qui a été utilisé, appelé pNCK, comportait les origines de réplication de E. coli et de T. Thermophilus, un gène de résistance à l'ampicilline qui permet la sélection de transformants dans E. Coli ainsi qu'un gène codant la KNTase thermostable sous contrôle d'un promoteur actif à la fois chez E. Coli et T. Thermophilus (le promoteur ps1pA) ( Deux mutants thermostables décrits dans la bibliographie ont été également construits et utilisés à titre de contrôles positifs. Ils codent pour :
Ces différentes constructions ont ensuite été transformées chez T. Thermophilus. Ont également été transformés en parallèle :
La souche de T. Thermophilus a été transformée à 70°C (par compétence naturelle) avec des quantités égales de chaque plasmide. Après une période d'incubation de 4 heures, 10 μl d'une dilution 10-3 du mélange de transformation ont été «spottés» sur boites contenant différentes concentrations de kanamycine et incubés à 60°C et 70°C. Les résultats, présentés sur la
Il est donc possible de discriminer des variants plus ou moins thermostables de l'IFNγ, grâce à la fusion de celle-ci avec la KNTase thermostable et la transformation dans T. Thermophilus. De plus, la gamme de résistance qui a pu être déterminée permet de dégager des conditions pour sélectionner des variants plus stables contenus dans une banque de variants de pNCK-IFNγ (20 à 40 μg/ml à 70°C). Une banque de variants de l'IFNγ cloné dans le vecteur pNCK a été générée en utilisant la technologie Massive Mutagenesis®. Une diversité totale a été introduite sur toutes les positions situées entre 21 et 166. La banque de mutants contient potentiellement tous les 2800 mutants simples, une partie significative des 4 millions de mutants doubles, ainsi que des mutants ayant trois mutations ou plus. La banque a ensuite été transformée par compétence naturelle à haute température (70°C) dans T. Thermophilus et sélectionnée à 20 ou 40 μg/ml de kanamycine. Les différents mutants isolés par le moyen de cette sélection primaire ont ensuite été retransformés dans T. Thermophilus et leur niveau de résistance a été comparé à celui de la construction sauvage. 20 mutants, conférant à la souche une résistance plus ou moins importante mais toujours supérieure au sauvage ont ainsi été confirmés. Pour ces 20 mutants, un facteur de thermostabilité (TF) a été calculé en divisant le nombre de clones obtenus en conditions sélectives (20 ou 40 μg/ml de kanamycine et 70°C) par le nombre de clones obtenus en conditions non sélectives (20μg/ml et 60°C), ceci pour s'affranchir d'éventuels biais dus à l'efficacité de transformation de chaque clone. On a observé que les mutants ayant été sélectionnés à faible stringeance sont associés à un facteur de thermostabilité moins important que les mutants sélectionnés à forte stringeance. 35 mutations ont été identifiées par séquençage des 20 clones: C21G, C21W, Y22D, Y22S, Y22T, Q24A, D25V, P26D, V28C, T50Y, W59F, S63R, Y76D, E98K, M100N, K109C, T119P, T119Y, Y121T, S122H, S122P, K131I, M140P, A147E, A147F, L158W, F159C, R162D, R162E, R162Q, R163G, R163T, R163L, A164E, S165V, La séquence des mutants est répertoriée dans la Certaines des 35 mutations simples précédemment identifiées ont été introduites indépendamment dans le vecteur pORF/IFNγ (Invivogen), permettant d'exprimer transitoirement l'IFNγ en cellules mammifères grâce à un promoteur hybride (EF-1α-HLTV) et un signal de polyadénylation fort du SV40. La transfection des cellules COS7 a été réalisée en plaque 24 puits avec un ensemencement de 30 000 à 60 000 cellules par puits lorsque les cellules atteignent 70-80% confluence. La transfection a été réalisée avec environ 50ng d'ADN et du Jet PEI (Polyplus transfection) en utilisant un ratio Jet PEI/ADN de 5 en laissant 30 minutes à température ambiante. Après 24h de transfection, le milieu (500μL IMDM + SVF + antibiotiques) a été changé. Les surnageants contenant l'IFNγ (avec un niveau d'expression de l'ordre de 0,5 à 1μg/ml) ont été récupérés 24 heures après la transfection. Ils ont été aliquotés et conservés à -20°C avant le dosage de l'activité de l'IFNγ. Il a été déjà été décrit que l'IFNγ active spécifiquement les récepteurs à l'IFNγ présents sur les cellules HeLa. La stimulation de la voie des Jak/Stat1 des cellules HeLa par l'IFNγ s'effectue en ayant, en particulier, pour conséquence l'activation de la transcription des gènes sous le contrôle de promoteur possédant des séquences GAS pour « Gamma Activated Site ». Il est alors possible de mesurer et de comparer les activités des variants de l'IFNγ en transfectant dans les cellules HeLa un système de gène rapporteur dans lequel la luciférase (firefly luciferase) est en aval d'un promoteur possédant plusieurs sites GAS (plasmide pGAS/Luciférase de Stratagene). Les transfections de cellules HeLa à 50-80 % de confluence ont été réalisées en plaque 96 puits selon le protocole du fournisseur : 20 000 cellules par puits ont été transfectées avec environ 150ng d'ADN pGAS/Luciférase et du jet PEI dans un rapport Jet PEI/ADN de 5. Le tout a été vortexé 30s et laissé à température ambiante 30 min. Puis, 20μL du mélange ADN/Jet PEI ont été répartis dans chaque puits de la plaque et les cellules ainsi transfectées sont cultivées pendant 24 heures à 37°C et en 5% CO2. Tous les réactifs de culture cellulaire ont été fournis par Invitrogen. Les cellules HeLa et les cellules COS-7 ont été cultivées dans des conditions standard (37°C en atmosphère humide contenant 5% CO2) en utilisant respectivement les milieux Dulbecco's Modified Eagle's Medium (D-MEM) et Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM). Tous ces milieux de culture contiennent un analogue de la L-glutamine (le glutamax) et sont supplémentés en sérum de veau foetal décomplémenté (10% final) et en antibiotiques à raison de 100 unités/ml de pénicilline et 0.1 mg/ml de streptomycine. Le vecteur pSV-betagal ™ (Promega), qui exprime la béta galactosidase sous le contrôle du promoteur précoce SV40, a été utilisé pour normaliser les efficacités de toutes les transfections réalisées. On a ensuite fait agir les surnageants de cellules COS7 transfectées par les mutants de l'IFNγ sur des cellules HeLa transfectées : Les surnageants de cellules COS7 contenant l'IFNγ ont été dilués au 1/100ème. 10μL de ces dilutions de surnageants de cellules COS7 contenant l'IFNγ ont été ajoutés sur les cellules HeLa transfectées par du pGAS/Luciférase. Après 16 heures à 37°C 5% CO2 pendant lesquelles l'expression cytoplasmique de la firefly luciférase s'est effectuée, les culots de cellules ont été récupérés et congelés. 50μL de Glo lysis buffer™ (Promega), ont été ajoutés pour lyser les cellules. La lyse s'est effectuée pendant 10 min sous agitation à température ambiante de façon à libérer la luciférase produite en réponse à la stimulation spécifique de l'IFNγ. Le test de l'activité luciférase à proprement dit a été initialisé par l'ajout du réactif Bright Glo™ (Promega) et la quantité de luciférase accumulée a ensuite été comptée avec un luminomètre (FLX 800, Bio-Tek Instrument). Le calcul de l'activité totale (par rapport à la protéine sauvage) de chaque variant est une moyenne réalisée sur la base de résultats obtenus sur 5 manipulations différentes (duplicates au minimum) et sur des surnageants de culture provenant, au minimum, de deux transfections indépendantes. Les barres d'erreur présentées sont calculées par la formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m). L'une des façons de présenter les résultats d'activité totale est de rapporter l'activité de base de chaque variant en pourcentage de l'activité de base de l'IFNγ non muté exprimé dans les mêmes conditions pour chaque transfection ( Les surnageants de culture de cellules COS7 ont été soumis à une dénaturation thermique (10 minutes à 59°C). On a ensuite comparé l'activité induite par la protéine non dénaturée à l'activité induite par cette même protéine dénaturée et on en a déduit l'activité résiduelle après dénaturation thermique pour la protéine étudiée (Activité résiduelle = Activité dénaturée/ Activité non dénaturée * 100). Ces valeurs représentent une moyenne de 5 manipulations différentes (chacune en duplicata au minimum). Les barres d'erreur présentées sont calculées sur la formule de l'erreur standard sur la moyenne (s.e.m). Les résultats de thermostabilité et d'activité relative à L'IFNγ non muté sont présentés en En conclusion : la sélection de mutants de l'IFNγ plus thermostables a été rapidement obtenue à partir d'une banque de mutants aléatoires sans qu'il soit besoin de procéder à aucune activité de criblage à haut-débit. Dans toutes les figures, la séquence codant la protéine de fusion Pi-Π est représentée de telle sorte que Pi est en amont. Ceci correspond à la configuration préférée. Dans un mode de réalisation particulier, l'orientation contraire est utilisée, avec Π en amont. Eventuellement, une séquence codant un espaceur peptidique d'une dizaine d'acides aminés est insérée entre la séquence codant Pi et la séquence codant Pi ; pour simplifier cette séquence n'est pas représentée.
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