随着人类基因组测序的完成，分子生物学的下一步重大挑战之一 是了解由DNA编码的多种蛋白靶如何与其他蛋白，小分子药用候选 物，和大量酶和抑制剂相互作用。参见，例如，Pandey & Mann， “Proteomics to study genes and genomes，”Nature，405，p.837- 846，2000；Leigh Anderson等，“Proteomics：applications in basic and applied biology，”Current Opinion in Biotechnology，11，p. 408-412，2000；Patterson，“Proteomics：the industrialization of protein chemistry，”Current Opinion in Biotechnology，11，p.413-418， 2000；MacBeath & Schreiber，“Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination，”Science，289，p. 1760-1763，2000；De Wildt等，“Antibody arrays for high-throughput screening of antibody-antigen interactions，”Nature Biotechnology， 18，p.989-994，2000。为此，能够同时以高灵敏度对多种不同的生 物分子相互作用进行定量的工具可用于药物发现、蛋白组学和诊断。 另外，为了使上述工具能够广泛使用，它们在使用时必须简单，它本 身和操作的成本必须低廉，并且必须可应用于多种分析物，所述分析 物可能包括例如多核苷酸、肽、小蛋白、抗体、甚至是完整的细胞。
业已开发出了用于检测包括寡核苷酸的多种生物分子复合物、抗 体抗原相互作用、激素-受体相互作用以及酶-底物相互作用的生物传 感器。一般，生物传感器由两个元件组成：高度专一性的识别元件， 和能够将分子识别事件转换成可定量信号的转换器。业已通过多种方 法实现了信号转导、包括荧光、干涉量度学(Jenison等， “Interference-based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon，”Nature Biotechnology，19，p.62-65；Lin等，“A porous silicon-based optical interferometric biosensors，”Science， 278，p.840-843，1997)和重量分析法(A.Cunningham，Bioanalytical Sensors，John Wiley & Sons(1998))。
在所述基于光学的转导方法中，直接方法不需要用荧光化合物标 记分析物，它是有价值的，因为测定相对简单，并且能够研究不容易 标记的小分子和蛋白的相互作用。直接光学方法包括表面等离子体共 振(SPR)(Jordan & Corn，“Surface Plasmon Resonance Imaging Measurements of Electrostatic Biopolymer Adsorption onto Chemically Modified Gold Surfaces，”Anal.Chem.，69：1449-1456 (1997))，光栅耦合器(Morhard等，“Immobilization of antibodies in micropatterns for cell detection by optical diffraction，”Sensors and Actuators B，70，p.232-242，2000)，椭圆偏光法(Jin等，“A biosensor concept based on imaging ellipsometry for visualization of biomolecular interactions，”Analytical Biochemistry，232，p.69- 72，1995)，损耗波装置(Huber等，“Direct optical immunosensing (sensitivity and selectivity)，”Sensors and Actuators B，6，p. 122-126，1992)，和反射测量术(Brecht & Gauglitz，“Optical probes and transducers，”Biosensors and Bioelectronics，10，p.923-936， 1995)。理论上推测的这些检测方法的检测极限业已确定，并且用 实验证实了可用于诊断上相关的浓度范围。不过，迄今为止，这些方 法尚未生产出可商业上利用的高通量仪器，所述仪器能够在没有任何 类型的标记的情况下进行高灵敏度测定，这种测定形式能够方便地与 最常用于高通量生物分子相互作用分析的基于微量滴定板的或基于 微阵列的基础结构兼容。因此，本领域需要能够实现这些目的的方 法。
发明概述
在一种实施方案中，本发明提供了包括比色共振反射光学生物传 感器的容器。所述比色共振反射光学生物传感器构成所述容器的内表 面。将一种或多种特殊结合物质固定在包括比色共振反射光学生物传 感器的所述容器的内表面的两个或两个以上的不同位置上。所述容器 可包括微量滴定板孔、试管、培养皿或微流体通道。
本发明的另一种实施方案提供了包括一个或多个微量滴定板孔 的微量滴定板，其中，一个或多个微量滴定板孔的底面包括比色共振 反射光学生物传感器。将一种或多种特殊结合物质固定在每一个微量 滴定板孔的底面上的两个或两个以上不同位置上。
本发明的另一种实施方案提供了检测一种或多种类型的细胞与 一种或多种特殊结合物质结合的方法。所述方法包括将所述一种或多 种类型的细胞应用在容器内表面上，其中，所述容器内表面包括比色 共振反射光学生物传感器，其中，将一种或多种特殊结合物质固定在 包括比色共振反射光学生物传感器的所述容器的内表面的两个或两 个以上的不同位置上。用光线照射所述容器，并且检测每一个不同位 置上的一种或多种峰波长值(PWV)。如果所述一种或多种细胞业 已结合在一种或多种特殊结合物质上，则结合了所述一种或多种细胞 的不同位置上的PWV就会偏移。所述容器可以是微量滴定板孔、微 量滴定板、试管、培养皿或微流体通道。所述一种或多种特殊结合物 质可以排列在包括比色共振反射光学生物传感器的所述容器的内表 面上的一系列不同位置上。所述不同位置可以限定直径为大约50-500 微米的斑点阵列。可以通过选自下列一组的方法将所述一种或多种特 殊结合物质固定在包括比色共振反射光学生物传感器的所述容器的 内表面上：物理吸附、化学结合、电化学结合、静电结合、疏水性结 合和亲水性结合。所述一种或多种特殊结合物质选自下列一组：核 酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、单链或双链DNA溶液、RNA溶液、 RNA-DNA杂交溶液、含有来自组合化学文库的化合物的溶液、抗 原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、F(ab)片段、F (ab′)2片段、Fv片段、小有机分子、细胞、病毒、细菌、聚合物 和生物学样品。
本发明的另一种实施方案提供了检测一种或多种细胞与一种或 多种特殊结合物质的结合的方法。所述方法包括将一种或多种特殊结 合物质固定在容器内表面的两个或两个以上不同位置上，其中，所述 容器内表面包括比色共振反射光学生物传感器。用光线照射所述容 器。检测每一个不同位置上的一种或多种峰波长值(PWVs)。将一 种或多种细胞应用在所述容器内表面上。用光线照射所述容器。检测 每一个不同位置上的一种或多种峰波长值(PWVs)。将在添加细胞 之前获得的PWVs与在添加细胞之后获得的PWVs进行比较。如果 所述一种或多种细胞业已结合了特殊结合物质，则位于结合了细胞的 不同位置上的PWV就会偏移。
附图简述
图1A表示生物传感器的横截面图，其中，所示出的光线照射了 生物传感器的底部；不过，光线能够从顶部或底物照射所述生物传感 器。图1B表示生物传感器的图，其中，所示出的光线照射了生物传 感器的底部；不过，光线能够从顶部或底物照射所述生物传感器；
图2表示比色共振反射生物传感器的实施方案，它包括按照本发 明的方法和组合物制备的一维光栅。
图3A-B表示包括正方形(图3A)或孔(图3B)的矩形栅格的 光栅。
图4表示采用正弦波动光栅形状的生物传感器横截面形状。
图5表示由一组同心环组成的共振反射或透射滤光片结构。
图6表示包括六边形孔栅格(或六边形柱栅格)的共振反射或透 射滤光片结构，它与图5所示的同心圆结构非常接近，而不需要将照 射光束集中在栅格的任何特定位置。
图7表示诸如蛋白单层的吸附材料如何增强包括三维光栅的生 物传感器的反射波长的曲线图。
图8表示三种类型的表面活化化合物(胺、醛和镍)与相应的化 学接头分子，它可用于将各种类型的生物分子受体附着在生物传感器 上。
图9A-C表示可用于扩增结合配偶体物质的方法，如扩增位于生 物传感器表面上的检测的DNA或检测的蛋白。
图10表示生物传感器的共振波长为检测光束的入射角的函数。
图11表示利用两种耦合光纤照射并且收集来自生物传感器的反 射光的例子。
图12表示利用分光器以使得照射光和反射光共有到达生物传感 器的共同的平行光通路的例子。
图13表示检测系统的示意图。
图14表示出现在光纤探头顶端用于体内检测生化物质的生物传 感器的例子。
图15表示峰共振波长对溶解在PBS中的BSA的浓度的依赖性， 然后让所述溶液在生物传感器表面上干燥。
图16A-B。图16A表示用各种浓度的链霉抗生物素蛋白检测业已 用连接在生物素受体分子上的NH2表面化合物激活的生物传感器的 结果。图16B表示与生物传感器结合的分子的示意图。
图17A-B。图17A表示利用山羊抗体受体分子检测抗山羊IgG 的测定。BSA封闭检测表面，产生了明确可测量的背景信号，这是由 于大量BSA整合在生物传感器上。66nM浓度的抗山羊IgG很容易 超过背景信号测量。图17B表示与生物传感器结合的分子的示意 图。
图18A-B。图18A表示利用抗人IgG INF-γ受体分子，和神经 生长因子(NGF)负对照分析干扰素-γ(INF-γ)的非标记ELISA测 定。图18B表示与生物传感器结合的分子的示意图。
图19A-B。图19A表示5-氨基酸肽(MW＝860)的检测，以及随 后用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3切割pNA标记(MW＝130)。 图19B表示与生物传感器结合的分子的示意图。
图20A-B。图20A表示在连续监控三个单独的蛋白层的结合期间 液体中的共振峰。图20B表示与生物传感器结合的分子的示意图。
图21A-B。图21A表示根据图21所示数据精确测定的终点共振 频率。图21B表示与生物传感器结合的分子的示意图。
图22A-B。图22A表示IgG结合的动力学结合测量。图22B表 示与生物传感器结合的分子的示意图。
图23A-B。图23A表示能切割生物传感器表面上的结合蛋白的蛋 白酶的动力学测量。图23B表示与生物传感器结合的分子的示意 图。
图24表示用于试验溶液的峰共振波长值的图。用抗生物素蛋白 溶液作为基线参照物，以与抗生物素蛋白+BSA和抗生物素蛋白+ b-BSA溶液进行比较。将BSA添加到抗生物素蛋白中，仅仅导致了 小的波共振波长增强，因为，预计两种蛋白不会相互作用。不过，由 于生物素和抗生物素蛋白紧密结合(Kd＝10-15M)，所以抗生物素蛋 白+b-BSA溶液将包括较大的结合蛋白复合物。因此与抗生物素蛋白 +BSA溶液相比，抗生物素蛋白+b-BSA蛋白溶液提供了峰共振波长 值的大的偏移。
图25表示相对没有固定化学官能团的传感器的PWV偏移，这 是由于NH2、NH2+(NHS-PEG)和NH2+(NHS-PEG-生物素)分 子附着在传感器表面上而记录到的。误差棒表示在7个微量滴定板孔 上记录的PWV偏移的标准差。数据表明，所述传感器能够区分清洁 表面，和具有固定的NH2的表面，并且能够明确检测NHS-PEG(分 子量大约为2000道尔顿)分子的添加。表面固定的NHS-PEG和 NHS-PEG-生物素(分子量大约为3400道尔顿)之间的差异同样是可 以测量的。
图26A-C表示在接触各种浓度的抗生物素IgG(0-80mg/ml)并 且使其温育20分钟时，生物传感器孔的PWV偏移反应为时间的函 数。NHS-PEG表面(图26B)提供了最弱的反应，而胺活化的表面 (图26A)表明了与高浓度抗生物素IgG的低水平的非专一性相互 作用。NHS-PEG-生物素表面(图26C)明确表明了与抗生物素IgG 的强的专一性相互作用——从而提供了与接触的抗生物素IgG的浓 度成比例的强的PWV偏移。
图27表示在20分钟之后来自图26C的PWV偏移幅度，它是以 图26中的抗生物素IgG浓度的函数形式作图的。观察到了IgG浓度 和测量的PWV偏移之间的大体上线性的相关，并且最低浓度的IgG 溶液(1.25mg/ml，8.33nM)与负对照PBS溶液相比是明确可测量 的。
图28表示利用生长在比色共振反射光学生物传感器上的软骨细 胞进行细胞形态学测定的结果。在所述测定过程中，观察到细胞保持 附着在生物传感器的表面上；在将2mg/ml胰蛋白酶添加到容纳有 软骨细胞的生物传感器孔中后观察到的PWV的降低，表明了软骨细 胞细胞形态学的变化。
图29表示利用肾肿瘤细胞进行细胞粘着测定的结果。将胰蛋白 酶添加到容纳有生长在生物传感器的表面上的肾肿瘤细胞的六个生 物传感器孔中。将两个孔用作三种胰蛋白酶浓度的每一种的重复样 品。在添加胰蛋白酶后，观察到PWV的降低，表明了所述细胞与传 感器表面分离。
图30表示用于生物传感器的角扫描的系统的例子。
图31表示是作微阵列的生物传感器的例子。
图32A-B表示能够整合比色共振反射生物传感器的两种生物传 感器的形式。图32A表示整合在微量滴定板中的生物传感器。图32B 表示微阵列载片形式的生物传感器。
图33表示使用生物传感器平台以较高的密度和通量进行测定的 一系列阵列概念。
图34A-B。图34A表示由于附着链霉抗生物素蛋白受体层导致的 共振波长偏移，和随后的生物素化的IgG的检测。图34B表示与生 物传感器结合的分子的示意图。
图35A-B。图35A表示位于比色共振反射生物传感器微阵列上的 兔、鸡、山羊和人IgG的点样。图35B表示让抗人-IgG在所述传感 器表面上流过的结果，表明了人-IgG和抗人-IgG之间的较强的结 合。
图36A-B。采用固定在所述传感器表面上的Poly-T，图36A表 明了固定化的寡核苷酸与Poly-T、Poly-A和T7-启动子之间的不同程 度的杂交亲和力。图36-B表示终点数据与误差棒。
图37表示蛋白-DNA相互作用专一性的例子，在这种场合下，可 以检测T7-启动子DNA和T7RNA聚合酶之间的相互作用专一性。
图38表示细胞蛋白相互作用测定的示意图。
图39表示来自细胞蛋白相互作用测定的结果。
发明详述
比色共振反射光学生物传感器能够在不使用荧光标记、比色标记 或任何其他类型的标记或标志的前提下在生物传感器表面上测量生 物化学相互作用。生物传感器表面包括光学结构，在用平行白光照射 时，所述结构被设计成只能反射窄的波长带。窄的波长带被定义为波 长“峰”。当诸如生物学材料的材料沉积在生物传感器表面上或从生 物传感器表面上除掉时，“峰波长值”(PWV)发生改变。将读出 装置用于通过平行白光照射生物传感器表面的不同位置，并且收集平 行反射光。将收集到的光线聚拢到波长分光计上，用于测定PWV。
通过将所述结构(生物传感器一侧向上)结合在无底微量滴定板 盒的底部，可以将生物传感器结构整合成标准一次性实验室用品，如 微量滴定板。将生物传感器整合进普通实验室形式的盒子中，是与现 有的微量滴定板处理设备兼容所需要的，所述设备如混合器、培养箱 和液体分配装置。
在本公开内容中定义的每一种测定方法的功能性优点来自比色 共振反射生物传感器的特性。首先，在不使用标记的前提下测量生物 化学相互作用。其次，可以同时监控很多相互作用。第三，将生物传 感器整合进标准微量滴定板中，用于平行测定的隔离和液体封闭。
对于目前用于基因组学、蛋白组学、药用化合物筛选和临床诊断 用途的大部分测定来说，荧光或比色化学标记通常附着在要研究的分 子上，以便能够方便地显示它们。由于标记的附着显著提高了测定复 杂性，并且可能通过构象修饰或表位封闭改变分子功能，所以业已出 现了各种无标记的生物传感器技术。无标记检测现象学包括在用对检 测分子具有高亲和力的受体分子活化的表面上测定质量、微波传递线 路特征、微型悬臂偏转或光密度的改变。无标记生物传感器技术的广 泛的商业可接受性，业已受到了它们在生产和包装上廉价的形式中提 供高检测灵敏度和高检测并行性的能力的制约。例如，如果生物传感 器面积大到足以包括大量平行测定，则在批量光刻法、蚀刻和沉积方 法中在半导体或玻璃晶片上生产的生物传感器的生产和包装成本是 昂贵的。类似的，在阵列中生产与单个生物传感器的电连接的要求， 造成了在包装成本和与生物传感器接触流体的兼容性方面的困难的 挑战。
定义
比色共振反射光学生物传感器：
“比色共振反射光学生物传感器”，或者在本文中被称作生物传 感器，在这里被定义为子波长结构表面(SWS)生物传感器和表面浮 雕衍射体(SRVD)生物传感器。参见，例如，美国申请10/059,060， 其名称为“Resonant Reflection Microarray”和美国申请序号 10/180,374，和美国申请序号10/180,647。
完整的特殊结合物质：
在本文中，“完整的特殊结合物质”，表示大体上完整的目标分 子，例如，将完整的特殊结合物质大体上从比色共振反射光学生物传 感器上切割下来，得到了大体上完整的、天然的特殊结合物质。
微量滴定板：
在本文中，“微量滴定板”被定义为具有2、6、8、24、48、96、 384、1536或3456个孔的形式的，或任何其他数目孔的微量滴定板 或多孔平板。
试验试剂：
在本文中，“试验试剂”被定义为任何酶或化合物和它们的溶液。 酶的非限定性例子有蛋白酶、脂酶、核酸酶、裂解酶、肽酶、水解酶、 连接酶、激酶和磷酸酶。除了酶、化合物及其溶液之外，“试验试剂” 还表示它们的缓冲液空白物。缓冲液空白物表示与添加到其他所述试 验试剂中的组成相同的试剂或溶液，其中去掉了酶成分。
半渗透性内部套管：
“半渗透性内部套管”在这里还可以被称作“插入物”或“套管”， 它被定义为能够支持细胞生长的多孔材料。半渗透性内部套管对于从 生长在套管表面上的细胞中分泌、流出或以其他方式排出的蛋白或其 他分子可以渗透的，但对于完整的细胞不能渗透。半渗透性内部套管 通常保持距离在它上面结合有特殊结合物质的生物传感器表面或生 物传感器表面上的生长培养基或缓冲液较短的距离，以便所述分泌 的、流出的或以其他方式排出的部分能够自由地通过所述套管扩散。 半渗透性内部套管可以放置在如上文所定义的任何类型的比色共振 反射光学生物传感器上，位于微量滴定板孔中或没有所述孔。
保持与生物传感器表面或位于生物传感器表面上的生长培养基 或缓冲液表面接触的半渗透性内部套管在本文中被定义为(1)是这 样定位的，以便所述套管是紧密相邻的，但是与生物传感器的表面没 有直接的物理接触；(2)是这样的定位的，以使得所述套管与放置 在生物传感器表面上的缓冲液或生长培养基的表面物理接触；或(3) 是以任何方式定位或连接的，以便有利于从细胞中分泌、流出或以其 他方式排出的分子能够扩散通过半渗透性内部套管，并且优选不受阻 碍。“保持接触”还表示“靠近生物传感器表面”的布置或安装。
用作半渗透性内部套管的材料的类型可以是，例如，聚对苯二甲 酸乙二酯(PET)或聚四氟乙烯(PTFE)，如在商业化可获得的细 胞培养插入物中使用的材料(BD Falcon，Millipore)。
抑制活性：
“抑制活性”在这里被定义为一种分子或化合物延缓或阻止另一 种分子执行催化活性的能力。例如，具有蛋白酶抑制活性的化合物能 抑制蛋白酶切割蛋白。所述抑制活性是“针对”所述催化分子执行的。 “抑制活性”还表示一种分子或化合物大体上抑制或部分抑制结合配 偶体与特殊结合物质结合的能力。
核酸：
“核酸”在这里被定义为通过3′，5′磷酸二酯键连接的天然或 非天然核苷酸或其衍生物的单链或双链聚合物。
寡核苷酸：
“寡核苷酸”在这里被定义为通过磷酸二酯键结合的天然或非天 然核苷酸或其衍生物的单链或双链聚合物序列。“寡核苷酸”一般表 示长度大约为20个碱基或更少的短的多核苷酸，如果超过这一长 度，它们优选被称作多核苷酸。
蛋白：
“蛋白”在这里被定义为通过特殊序列上的肽键结合的天然或非 天然氨基酸或其衍生物的线性聚合物。
肽：
“肽”在这里被定义为能够水解成氨基酸并且构成蛋白的基础结 构单元的任何类型的分子。一般表示短的多肽或蛋白片段。
组合化学文库：
“组合化学文库”在这里被定义为通过将它们的组成结构单元材 料以多种方式组合产生的多种类型的分子。
细胞膜：
“细胞膜”在这里被定义为细胞外部的、限制性脂双层膜。
组织：
“组织”在这里被定义为一组细胞，通常是混合类型的细胞，并 且通常通过细胞外基质结合在一起，它们起着特殊的作用。另外，在 更广泛的意义上，“组织”可以表示来自共同因素的一种细胞类型的 生物学分类；例如，结缔组织，它们的共同特征是它们的功能，或上 皮组织，它们的共同因素是组构模式。
受体：
“受体”在这里被定义为膜结合或膜封闭的分子，它们以高的专 一性结合，或对某些移动性更高的分子(配体)作出反应。
配体：
“配体”在这里被定义为彼此结合的分子；在正常使用时，为可 溶性分子，如激素或神经递质，其能结合受体。其还与本发明的“结 合物质”类似。
细胞因子：
“细胞因子”在这里被定义为由细胞释放的蛋白，它能影响其他 细胞的行为。与“激素”类似，不过该术语倾向于被用作白细胞介素、 淋巴因子和诸如TNF和干扰素的其他相关信号传导分子的通用名 词。
趋化因子：
“趋化因子”在这里被定义为能刺激白细胞的趋化性的小的分泌 蛋白。
细胞外基质材料：
“细胞外基质材料”在这里被定义为由细胞产生的并且分泌到周 围介质中的任何材料，不过，通常用于动物组织的非细胞部分。
抗原：
“抗原”在这里被定义为能诱导免疫反应的物质。抗原决定簇组 被称作表位，并且载体分子上的表位(它可任选地是相同分子的一部 分，例如，肉毒杆菌神经毒素A，单个分子具有三种不同的表位。参 见Mullaney等，Infect Immun 2001 Oct；69(10)：6511-4)使得 所述载体分子起着抗原的作用。常见的抗原对其可以产生免疫反应的 动物来说是外源的。
多克隆抗体：
“多克隆抗体”在这里被定义为通过若干种克隆的B-淋巴细胞产 生的抗体，完整动物就是这种情况。其通常表示在免疫动物体内产生 的抗体。
单克隆抗体：
“单克隆抗体”在这里被定义为细胞系，无论是在体内还是在培 养物中的，它具有单克隆起源。单克隆抗体是通过杂交瘤细胞的单克 隆产生的，且因此，是单一种类的抗体分子。
单链抗体(Scfv)：
“单链抗体(Scfv)”在这里被定义为重组融合蛋白，其中， 轻链和重链(Vh和Vl)的两个抗原结合区通过连接肽连接，这使得 轻链和重链能够在异源生物中等量表达，并且使所述蛋白稳定。
F(Ab)片段：
“F(Ab)片段”在这里被定义为通过木瓜蛋白酶处理制备的免 疫球蛋白的片段。Fab片段由通过二硫键结合在重链的一部分上的轻 链组成，并且包括一个抗原结合部位。它们可以被视为单价抗体。
F(Ab′)2片段：
“F(Ab′)2片段”在这里被定义为通过用胃蛋白酶水解免疫球 蛋白分子N-末端至胃蛋白酶攻击位点获得的大约90kDa的蛋白片 段。其包括通过二硫键在Fc片段的短的部分连接在一起的Fab片段。
Fv片段：
“Fv片段”在这里被定义为免疫球蛋白分子的Fab片段的N-末 端部分，其由一个轻链和一个重链的可变部分组成。
小有机分子：
“小有机分子”在这里被定义为任何小的含碳分子，它们不另外 地被归类为上述有机分子之一，例如，多肽。
子波长结构表面(SWS)生物传感器
在本发明的一种实施方案中，子波长结构表面(SWS)被用于产 生特定波长的强烈的光学共振反射，可将它用于以高灵敏度跟踪生物 学材料的相互作用，如特殊结合物质或结合配偶体或这两者。比色共 振反射衍射光栅表面起着特殊结合物质的表面结合平台的作用。
子波长结构表面是非常规类型的衍射光学元件，它能模拟薄膜涂 层的作用(Peng & Morris，“Resonant scattering from two- dimensional gratings，”J.Opt.Soc.Am.A，Vol.13，No.5，p.993， May 1996；Magnusson，& Wang，“New principle for optical filters，” Appl.Phys.Lett.，61，No.9，p.1022，August，1992；Peng & Morris， “Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings，”Optics Letters，Vol.21，No.8， p.549，April，1996)。SWS结构包括一维、二维或三维光栅，其中， 与入射光的波长相比，光栅周期较小，以便不允许除了反射和透射零 级以外的衍射级波长传播。SWS表面窄带滤光片可以包括在基片层 和覆盖层之间所夹的光栅，所述光栅填充光栅刻线槽。可任选地不使 用覆盖层。当光栅区的有效折射率大于所述基片或覆盖层时，就会产 生波导。当适当设计滤光片时，入射光进入波导区，并且以衰减模传 播。光栅结构选择性地以窄带的波长将光线耦合到所述波导中。光线 只能传播非常短的距离(在10-100微米数量级上)，发生散射，并 且与向前和向后传播的零级光耦合。这种高度敏感的耦合条件，可能 在反射的辐射光谱上产生共振光栅效应，导致反射或透射波长的窄 带。所述光栅的厚度和周期小于共振光栅效应的波长。
这种结构的反射或透射颜色可以通过将诸如特殊结合物质或结 合配偶体或这两者添加在覆盖层或光栅表面的上表面上而进行调 节。所添加的分子增加了通过该结构的入射辐射的光程长度，并因此 改变了发生最大反射或透射的波长。
在一种实施方案中，在用白光照射生物传感器时，将它设计成只 能反射单一波长或窄带波长。当特殊结合物质附着在生物传感器的表 面上时，反射波长由于耦合在光栅上的灯光的光程改变而偏移。通过 将特殊结合物质连接在生物传感器表面上，可以在不使用任何类型的 荧光探针、颗粒标记或任何其他类型标记的情况下检测互补性结合配 偶体分子。所述检测技术能够分辨，例如，大约0.1nm厚的蛋白结 合变化，并且能够用浸泡在流体中的或干燥的生物传感器表面进行。
例如，检测系统由例如光源和分光计组成，所述光源以正入射方 式通过例如光纤探头照射生物传感器的小斑点，所述分光计通过，例 如，同样是正入射的第二个光纤探头收集反射光。由于在激发/检测 系统和生物传感器表面之间没有物理接触，所以不需要特殊的耦合棱 镜，并且所述生物传感器可以容易地应用在任何常用测定平台上，包 括，例如微量滴定板和微阵列载片。可以在几毫秒时间内进行一次分 光计读数，因此，它能够快速测量在生物传感器表面上同时发生的大 量的分子相互作用，并且实时监控反应动力学。
这种技术可应用于同时测量的大量的生物分子相互作用，特别是 当分子标记能改变或抑制研究中的分子的功能时。用蛋白靶高通量筛 选药用化合物，以及用于蛋白组学的蛋白-蛋白相互作用的微阵列筛 选是需要由本发明的组合物和方法提供的灵敏度和通量的应用的例 子。
图1A和1B是比色共振反射衍射光栅生物传感器的一种例子的 图。在图1中，n基片表示基片材料。n2表示光栅的折射率。n1表示 任选的覆盖层。nbio表示一种或多种特殊结合物质的折射率。t1表示 在一维、二维或三维光栅结构上的任选的覆盖层的厚度。t2表示光 栅的厚度。tbio表示一种或多种特殊结合物质层的厚度。在一种实施 方案中，n2＜n1(参见图1A)。对层厚度(即覆盖层，一种或多种特 殊结合物质，或光栅)进行选择，以便获得对顶面上的其他分子的共 振波长灵敏度。选择光栅周期，以便获得理想波长的共振。
SWS生物传感器包括光栅，它由高折射率材料、能支持光栅的 基片层和固定在与基片层相反的光栅表面上的一种或多种特殊结合 物质组成。可任选地用覆盖层覆盖光栅表面。用高折射率介电薄膜对 按照本发明生产的光栅进行涂覆，所述薄膜可能由这样的材料组成， 所述材料包括，例如，硫化锌、二氧化钛、氧化钽和四氮化三硅。具 有光学部件的光栅的横截面轮廓可以包括任何周期性的重复功能，例 如，“方波”。光栅还可以包括选自下列一组的重复形式的形状： 线、正方形、圆形、椭圆形、三角形、梯形、正弦波、卵形、长方形 和六边形。本发明的生物传感器还可以包括光栅，其由例如，用高折 射率材料涂覆的塑料或环氧树脂组成。
传感器特征
线性光栅(即，一维光栅)具有共振特征，其中，照射光偏振化 的方向是垂直于光栅周期的。在图2A中示出了具有光学覆盖层的线 性光栅结构的一种实施方案的示意图。例如，比色共振反射生物传感 器还可以包括例如二维光栅，例如，六边形阵列的孔(参见图3B) 或正方形(参见图3A)。还可以使用其他形状。线性光栅可以具有 相同的节距(即高和低折射率区之间的距离)、周期、层厚度和材料 特性，如六边形阵列光栅。不过，光线必须偏振化成垂直于光栅线， 以便与所述光学结构共振耦合。因此，它的偏振光轴垂直于它的线性 光栅的偏振滤光片必须插在照射源和生物传感器表面之间。由于只有 一小部分照射光源是正确偏振化的，所以与六边形光栅相比，需要较 长的积分时间收集等量的共振反射光。
光栅还可以包括，例如，“阶梯”形状，其中，将一个固定高度 的高折射率区包埋在较低折射率的覆盖层中。高和低折射率的交替的 区域提供了平行于生物传感器顶面的光导管。
还可能生产共振生物传感器，其中，所述高折射率材料不是阶梯 形的，相反，它随侧向位置而改变。图4表示一种轮廓，其中二维光 栅的高折射率材料，n2在高度上是正弦波动的。为了产生特定波长的 共振反射，正弦曲线的周期与相同的阶梯形结构的周期相同。业已利 用GSOLVER(Grating Solver Development Company，Allen，Tex.， 美国)计算机模型验证了正弦波动结构的共振工作，以及它作为生物 传感器的功能。
本发明的生物传感器还可以包括位于光栅上的与基片层相反的 表面上的覆盖层。当存在覆盖层时，所述一种或多种特殊结合物质固 定在与光栅相反的覆盖层的表面上。优选的是，覆盖层包括具有比构 成光栅的材料低的折射率的材料。覆盖层可以由，例如，玻璃(包括 旋涂玻璃(spin-on glass)(SOG))、环氧树脂或塑料组成。
例如，可以将满足生物传感器的折射率要求的各种聚合物用作覆 盖层。SOG由于它的有利的折射率、便于操作以及便于使用大量的 玻璃表面活化技术用特殊结合物质激活而可以使用。当生物传感器表 面的平整度对于特定系统装置而言不是问题时，SiN/玻璃的光栅结构 可直接用作感测表面，所述表面的激活可以使用与在玻璃表面上相同 的方式进行。
共振反射还可以在不用平面覆盖层覆盖光栅的条件下获得。例 如，生物传感器可能只包括用高折射率材料的有结构的薄膜层涂覆的 基片。在不使用平面覆盖层的情况下，周围的介质(如空气或水)填 充所述光栅。因此，特殊结合物质固定在生物传感器上位于接触所述 特殊结合物质的光栅的所有表面上而不是仅覆盖上表面。
一般，本发明的生物传感器是用白光照射，白光包括具有每一种 偏振角的光线。偏振角相对生物传感器光栅上的重复部件的取向将决 定共振波长。例如，“线性光栅”(即，一维光栅)生物传感器由一 组重复的线和间距组成，它具有两种光学偏振化，其能够产生单独的 共振反射。被偏振化成垂直于所述线的光线被称作“s-偏振化”，而 被偏振化成平行于所述线的光线被称作“p-偏振化”。入射光的s 和p成分同时存在于未滤光的照射光束中，并且各自产生单独的共振 信号。生物传感器通常被设计成能最优化仅仅一种偏振化(s-偏振 化)的特性，并且通过偏振滤光片可容易地将非最优化的偏振化除 掉。
为了去除偏振化依赖性，以便每一个偏振角产生相同的共振反射 光谱，可以使用替代性的生物传感器结构，该结构由一系列同心环组 成。在该结构中，每一个同心环的内径和外径的差等于光栅周期的大 约1/2。每一个后续环的内径比前一个环的内径大大约一个光栅周 期。所述同心环模式延伸到覆盖一个传感器位置-如一系列斑点或微 量滴定板孔。每一个单独的微阵列斑点或微量滴定板孔具有位于它中 央的单独的同心环模式。参见，例如，图5。所述结构的所有偏振化 方向具有相同的横截面轮廓。所述同心环结构必须在中央被精确地照 射，以便保持偏振化独立性。同心环结构的光栅周期小于共振反射光 的波长。光栅周期为大约0.01微米-大约1微米。光栅厚度为大约0.01- 大约1微米。
在另一种实施方案中，将一系列孔或柱排列成非常接近上述同心 圆结构，而不需要集中在栅格的任何特定部位的照射光束。参见，例 如，图6。这种阵列模式是由从三个方向以相同的角照射在表面上的 三个激光光束的光学干涉自动产生的。在这种模式中，孔(或柱)集 中在一系列紧密堆积的六边形的角落，如图6所示。所述孔或柱还出 现在每一个六边形的中央。所述孔或柱的六边形栅格具有三个偏振化 方向，它们“看上去”具有相同的横截面轮廓。因此，所述六边形栅 格结构利用任何偏振角的光线提供了相当的共振反射光谱。因此，不 需要偏振滤光片来消除不希望的反射信号成分。所述孔或柱的周期可 以为大约0.01微米-大约1微米，并且厚度或高度可以为大约0.01 微米-大约1微米。
可以用本发明的方法生产的另一种光栅是体积表面浮雕衍射体 光栅(SRVD光栅)，又被称作三维光栅。SRVD光栅的表面在用 宽带光波长照射时，主要反射特定的窄带光波长。当特殊结合物质和 /或结合配偶体固定在SRVD光栅上，从而产生SRVD生物传感器 时，反射的窄带光波长发生偏移。一维表面，如薄膜干扰滤光片和布 拉格反射器可以从宽带发射源中选择窄范围的反射或透射波长，不 过，诸如特殊结合物质和/或结合配偶体的其他材料沉积在它们的上 表面上，只会导致共振线宽的改变，而不是共振波长的改变。相反， SRVD生物传感器具有通过将诸如特殊结合物质和/或结合配偶体添 加在它表面上来改变反射波长的能力。浮雕衍射体结构的厚度和周期 小于从生物传感器上反射的光线的共振波长。
三维表面浮雕衍射体光栅可以是，例如，三维相位量化阶梯形表 面浮雕模式，它的沟槽图案类似于阶梯形棱椎。当这样的光栅被宽带 辐射光束照射时，光线能够以特定波长从相等间隔的台阶上一致地反 射，所述波长通过将二倍的阶梯间距乘以周围介质的折射率给出。特 定波长的光线从间隔半波长的阶梯上共振衍射或反射，其带宽与阶梯 的数目成反比。
三维相位量化阶梯形表面浮雕模式的一种例子是类似于阶梯形 棱椎的模式。每一个倒置的棱椎的直径为大约1微米，优选，每一 个倒置的棱椎的直径可以为大约0.5-大约5微米，包括，例如，大 约1微米。所述棱椎结构可以是紧密堆积的，以便直径大约150-200 微米的一般的微阵列斑点可以整合数百个阶梯形棱椎结构。所述浮雕 衍射体结构的周期为大约0.1-大约1微米，厚度为大约0.1-大约1微 米。图7示出了个体微阵列位置(整合了数百个棱椎的一个完整的微 阵列斑点现在通过一个微阵列斑点的一个棱椎表示)如何进行光学查 询，以便确定特殊结合物质或结合配偶体是否吸附在所述表面上。在 用白光照射所述生物传感器时，没有明显结合材料的棱椎结构能够反 射由棱椎结构的阶梯高度决定的波长。当较高折射率的材料，如结合 配偶体或特殊结合物质整合在反射金属表面上时，反射波长被修饰成 向更长的波长偏移。从阶梯形阶梯结构上反射的颜色理论上是以阶梯 高度的2倍乘以涂覆在SRVD生物传感器的片状材料的第一表面上 的反射材料的折射率得出的。反射材料可以是例如银、铝或金。
将上述一种或多种特殊结合物质固定在SRVD生物传感器的反 射材料上。一种或多种特殊结合物质可以排列在所述反射材料的上述 一系列一个或多个不同位置上。
由于来自SRVD生物传感器的光线的反射波长被局限在窄的带 宽，所以所述表面的光学特征的非常小的变化自身在反射波长光谱的 易于观察的改变中显示。与平表面的反射光谱测定法相比，窄反射带 宽提供了表面吸附灵敏性优点。
在用宽带光波长照射时，SRVD生物传感器主要反射第一种单一 光学波长的光线，并且在将一种或多种特殊结合物质固定在反射表面 上时，反射第二种单一光学波长的光线。对第二种光学波长的反射来 自光学干涉。当所述一种或多种特殊结合物质结合在它们各自的结合 配偶体上时，由于光学干涉，SRVD生物传感器还能反射第三种单一 光学波长的光线。
反射颜色的读出可以通过将显微镜物镜聚焦在单个微阵列斑点 上并且读出反射光谱连续进行，或者平行进行，例如，通过将微阵列 的反射图像投射在高分辨彩色CCD照相机上。
在本发明的一种实施方案中，提供了光学装置。光学装置包括类 似于本发明的生物传感器的结构；不过，光学装置不包括固定在光栅 上的一种或多种结合物质。光学装置可以用作，例如，窄带滤光片。
特殊结合物质和结合配偶体
通过例如，物理吸附或通过化学结合，将一种或多种特殊结合物 质固定在一维或二维或三维光栅或覆盖层(如果有的话)上。特殊结 合物质可以是，例如核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、单链或双链DNA 溶液、RNA溶液、RNA-DNA杂交溶液、含有来自组合化学文库的 化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、 F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有机分子、细胞、病毒、 细菌、聚合物或生物学样品。生物学样品可以是例如血液、血浆、血 清、胃肠分泌物、组织或肿瘤的匀浆物、滑液、粪便、唾液、痰、囊 肿液、羊水、脑脊液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、眼泪或前 列腺液。所述聚合物选自下列一组：每个分子上具有多个活性位点的 长链分子，它由水凝胶、葡聚糖、聚氨基酸及其衍生物组成，所述衍 生物包括聚-赖氨酸(包括聚-l-赖氨酸和聚-d-赖氨酸)、聚-phe-赖氨 酸和聚-glu-赖氨酸。
优选的是，将一种或多种特殊结合物质排列在生物传感器上的一 系列一个或多个不同位置上。一系列特殊结合物质包括位于本发明的 生物传感器表面上的一种或多种特殊结合物质，以便表面包括很多不 同位置，每一个位置具有不同的特殊结合物质或具有不同量的特殊结 合物质。例如，一个系列可以包括1、10、100、1,000，10,000或100,000 个不同位置。这样的生物传感器表面被称作阵列，因为一种或多种特 殊结合物质通常是沿x-y坐标以规则的栅格模式排布的。不过，本发 明的阵列可以包括以任何类型的规则或不规则的模式排布的一种或 多种特殊结合物质。例如，不同位置可以限定一种或多种特殊结合物 质的一系列斑点。一系列斑点的直径可以为大约50-大约500微米。 一系列斑点的直径还可以为大约150-大约200微米。可以将一种或 多种特殊结合物质结合在它们的特殊结合配偶体上。
本发明的生物传感器上的阵列可以通过将一种或多种特殊结合 物质的微滴放置在，例如，光栅或覆盖层表面的x-y栅格位置上产 生。在所述生物传感器接触包括一种或多种结合配偶体的测试样品 时，所述结合配偶体优选被吸引到微阵列上包括对所述结合配偶体具 有高亲和力的特殊结合物质的不同位置上。某些不同位置能够将结合 配偶体聚集在它们的表面上，而其他位置则不能。
特殊结合物质能够专一性地结合添加在本发明的生物传感器表 面上的结合配偶体。特殊结合物质能够专一性地结合它的结合配偶 体，而基本上不能结合添加在生物传感器表面上的其他结合配偶体。 例如，当所述特殊结合物质是抗体，并且它的结合配偶体是特殊抗原 时，所述抗体能专一性地结合所述特殊抗原，而基本上不能结合其他 抗原。结合配偶体可以是例如核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、单链或 双链DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA杂交溶液、含有来自组合 化学文库的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗 体(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)2片段、Fv片段、小有机分子、 细胞、病毒、细菌、聚合物或生物学样品。生物学样品可以是例如血 液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤的匀浆物、滑液、粪便、 唾液、痰、囊肿液、羊水、脑脊液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴 液、眼泪和前列腺液。
本发明的阵列的一种例子是核酸阵列，其中，所述阵列中的每一 个不同位置包括不同的核酸分子。在本实施方案中，在所述核酸微阵 列中的斑点能检测与测试样品中核酸的相对链的互补性化学结合。
尽管微量滴定板是用于生物化学测定的最常见的形式，但微阵列 越来越被认为是使可以同时测量的生物化学相互作用的数目最大 化，同时使珍贵试剂的体积最小化的方法。通过将特殊结合物质与微 阵列点样器(spotter)应用在本发明的生物传感器上，可以获得的特 殊结合物质的密度为10,000特殊结合物质/英寸2。通过聚焦照射光 束来检查单个微阵列位置，可以将生物传感器用作无标记微阵列读出 系统。
另外，可以组合微阵列和微量滴定板实施方案，以便将一种或多 种特殊结合物质排列在传感器表面上的一系列一个或多个不同位置 上，所述表面位于微量滴定板的一个或多个孔内，并且包括微量滴定 板的一个或多个表面，优选底面。所述特殊结合物质的阵列包括位于 微量滴定板孔内传感器表面上的一种或多种特殊结合物质，以便表面 包括一个或多个不同位置，每一个位置具有不同的特殊结合物质，或 具有不同量的特殊结合物质。例如，阵列可以包括1、10、100、1,000， 10,000或100,000个不同位置。因此，微量滴定板实施方案的每一个 孔可以在它里面具有一系列与微量滴定板实施方案的其他孔分离的 一个或多个不同位置，这允许在本发明的微量滴定板上对多种不同样 品进行处理，一种或多种样品用于每一个分离的孔。在任何一个孔内 的一个或多个阵列可以与出现在相同微量滴定板上的任何其他微量 滴定板孔中的一个或多个阵列相同或不同。
固定或一种或多种特殊结合物质
将一种或多种结合物质固定在生物传感器上，以便特殊结合物质 不会被清洗程序洗掉，因此它与测试样品中结合配偶体的结合不受生 物传感器表面的妨碍。业已实施了若干种不同类型的表面化学策略， 以便将特殊结合物质共价附着在，例如，玻璃上，以便用于各种类型 的微阵列和生物传感器。相同的方法可容易地适用于本发明的生物传 感器。对生物传感器进行表面制备，以便它包括合适的官能团，用于 结合一种或多种特殊结合物质，它是生物传感器生产工艺的主要部 分。
可以通过物理吸附(即，不使用化学接头)或通过化学结合(即， 使用化学接头)以及电化学结合、静电结合、疏水性结合和亲水性结 合，将一种或多种特殊结合物质附着在生物传感器表面上。化学结合 能在生物传感器表面上产生更强的特殊结合物质的附着，并且提供表 面结合分子的特定的方向和构象。
在下面的实施例2中提供了特殊结合物质与本发明的生物传感 器化学结合的若干例子。其他类型的化学结合包括，例如，通过以下 官能团的结合：胺基、醛基、镍基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、 醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、腈基、糖基、 硫醇基、有机磷酸酯基、脂基、磷脂基或类固醇基。所述表面可用于 将若干种不同类型的化学接头附着在生物传感器表面上，如图8所 示。例如，可以将胺表面用于附着若干种类型的接头分子，同时将醛 表面用于直接结合蛋白，而不需要额外的接头。可以将镍表面用于结 合具有整合的组氨酸(“his”)标记的分子。利用镍-激活的表面进 行的“his-标记的”分子的检测为本领域所熟知(Whitesides，Anal. Chem.68，490，(1996))。
将特殊结合物质固定在塑料、环氧树脂或高折射率材料上，基本 上可以按照固定在玻璃上的方法进行。不过，可以取消酸洗涤步骤， 其中，这种处理会破坏固定所述特殊结合物质的材料。
为了检测浓度低于大约0.1ng/ml的结合配偶体，优选扩增并且 将结合在生物传感器上的结合配偶体转换成生物传感器表面上的额 外的层。作为增加了的光程长度的结果，可以容易地检测增加了的沉 积在生物传感器上的质量。通过将更大的质量整合在生物传感器表面 上，还可以增加所述表面上结合配偶体的光密度，因此能够在不添加 物质的情况下产生更大的共振波长偏移。添加物质可以通过例如，酶 促方法，通过“夹心”测定，或者通过将物质以具有各种大小和组成 的适当缀合的珠或聚合物形式直接应用在生物传感器表面上而实 现。这种原则业已应用在其他类型的光学生物传感器上，以用于证实 灵敏度相对不进行质量放大的灵敏度极限而言提高了超过1500x。参 见，例如，Jenison等，“Interference-based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon”，Nature Biotechnology，19： 62-65，2001。
作为例子，图9A示出了NH2-活化的生物传感器表面可能具有特 殊结合物质，包括固定在该表面上的单链DNA捕获探针。所述捕获 探针选择性地与它的互补性靶结合配偶体相互作用。反过来，可以将 所述结合配偶体设计成包括能够结合“检测”分子的序列或标记。如 图9A所示，检测分子可以包括，例如，连接在辣根过氧化物酶(HRP) 上的接头，当所述接头接触正确的酶时，会选择性地仅将额外材料沉 积在生物传感器上存在检测分子的部位。所述方法能够在几分钟内 将，例如，300_的可检测生物材料添加在生物传感器上。
还可将“夹心”方法用于增强检测灵敏度。在该方法中，可以将 大分子量分子用于放大低分子量分子的存在。例如，分子量为，例如， 大约0.1kDa-大约20kDa的结合配偶体可以进行标记，例如，用琥 珀酰亚胺基-6-[a-甲基-a-(2-吡啶基-二硫代)甲苯甲酰胺]己酸酯 (SMPT)或庚二亚胺酸二甲酯(dimethylpimelimidate)(DMP)、 组氨酸或生物素分子进行标记，如图9B所示。当所述标记是生物素 时，生物素分子能强有力地与链霉抗生物素蛋白结合，它的分子量为 60kDa。由于生物素/链霉抗生物素蛋白相互作用是高度专一性的， 所以所述链霉抗生物素蛋白能够将只能由的小的结合配偶体产生的 信号放大60倍。
通过使用化学衍生化的小颗粒能够将检测灵敏度进一步提高。用 胶态金、各种塑料，或直径大约为3-300nm的玻璃制备的“纳米颗 粒(nanoparticle)”可以用能够使它们选择性地与结合配偶体共价 结合的分子种类涂覆。例如，如图9C所示，能够用链霉抗生物素蛋 白共价涂覆的纳米颗粒来增强生物素-标记的结合配偶体在生物传感 器表面上的可见度。尽管链霉抗生物素蛋白分子本身的分子量为60 kDa，但衍生化的珠的分子量可以为任何大小，包括，例如，60KDa。 大型珠的结合，会导致生物传感器表面上光密度的大的改变，并且导 致可容易检测的信号。该方法可能导致灵敏度分辨率增加大约 1000x。
装有液体的容器
本发明的光栅可以包括内表面，例如，装有液体的容器的底面， 装有液体的容器可以是，例如，微量滴定板孔、试管、培养皿或微流 体通道。本发明的一种实施方案是整合在任何类型微量滴定板中的生 物传感器。例如，通过将反应容器壁组装在共振反射表面上，可将生 物传感器整合在微量滴定板的底面中，如图32A和32B所述，以便 每一个反应“斑点”能够接触不同的检测样品。因此，每一个单独的 微量滴定板孔可以起着单独的反应容器的作用。因此，单独的化学反 应可以在相邻的孔中进行，而没有混杂的反应流体，并且可以将化学 上不同的试验溶液应用到单独的孔中。
可以用若干种方法将本发明的生物传感器或光栅附着在无底微 量滴定板的底面上，所述方法包括例如，粘合剂附着、超声波焊接和 激光焊接。
用于药物高通量筛选实验室、分子生物学研究实验室和诊断测定 实验室的最常见的测定形式是微量滴定板。所述板是标准尺寸的塑料 盒，它可能包括排列成栅格的大约2、6、8、24、48、96、384、1536 或3456个单独的反应容器。由于所述平板的标准机械结构，所以将 液体分配、自动化平板操纵和检测系统设计成能够用这种常见形式工 作。本发明的生物传感器可以整合在标准微量滴定板的底面中。参 见，例如，图32A。由于生物传感器表面能够以大的面积生产，并且 由于所述读出系统不会与生物传感器表面物理接触，所以可以确定任 意数目的单独的生物传感器区域，这些区域只会受到照射光学元件和 x-y台的聚焦分辨率的制约，所述台扫描横过所述生物传感器表面的 所述照射/检测探头。
使用生物传感器的方法
本发明的生物传感器可用于并行地研究一种或多种特殊结合物 质/结合配偶体相互作用。一种或多种特殊结合物质与它们各自的结 合配偶体的结合，可以在不使用标记的情况下检测，其中通过将一种 或多种结合配偶体应用在在它们的表面上固定有一种或多种特殊结 合物质的生物传感器上。用光线照射生物传感器，并且检测来自生物 传感器的最大反射波长，或最小透射光波长。如果一种或多种特殊结 合物质业已结合在它们各自的结合配偶体上，那么与一种或多种特殊 结合物质没有结合在它们各自的结合配偶体上的情况相比光线的反 射波长会发生偏移。在用包括所述一种或多种特殊结合物质的一系列 一个或多个不同位置涂覆生物传感器时，检测来自所述生物传感器的 每一个不同位置的最大反射波长或最小透射光波长。
在本发明的一种实施方案中，可以将多种特殊结合物质，例如， 抗体以阵列形式固定在本发明的生物传感器上。参见，例如，图31。 然后让所述生物传感器与包括结合配偶体，如蛋白的目标测试样品接 触。只有能专一性地结合固定在生物传感器上的抗体的蛋白保持结合 在所述生物传感器上。这种方法基本上是酶联免疫吸附测定的大规模 形式；不过，不需要使用酶或荧光标记。对于高通量应用来说，生物 传感器可以排列成一系列阵列，其中，构成特殊结合物质阵列的若干 生物传感器以阵列排列。参见，例如，图33。所述一系列阵列可以 是，例如，浸没在微量滴定板中的，以便同时进行多种测定。在另一 种实施方案中，生物传感器可以出现在光纤探头的顶端，以便对生物 化学物质进行体内检测。参见图14。
可以通过将一种或多种酶应用在业已固定了一种或多种特殊结 合物质的生物传感器上来检测酶活性。洗涤所述生物传感器，并且用 光线照射。检测来自所述生物传感器的光线反射波长。当所述一种或 多种酶通过酶促活性通过，例如，将所有或部分特殊结合物质从所述 生物传感器表面上切割下来而改变了所述生物传感器的所述一种或 多种特殊结合物质时，所述光线的反射波长发生了偏移。本发明的另 一种实施方案是检测一种或多种完整的特殊结合物质从比色共振反 射光学生物传感器的表面上切割的方法。该方法包括将一种或多种结 合物质固定在比色共振反射光学生物传感器的表面上的不同位置，从 而检测所述不同位置的PWV，应用一种或多种切割分子，检测不同 位置的PWV，并且比较起始PWV与随后的PWV。检测一种或多种 完整的特殊结合物质的切割，并且峰波长值(PWV)是结合在生物 传感器上的所述特殊结合物质的相对量度。切割分子是能够切割其他 分子的分子，例如，切割分子可以是酶，如蛋白酶、脂酶、核酸酶、 裂解酶、肽酶、水解酶、连接酶、激酶和磷酸酶。
比色共振反射光学生物传感器可以构成微量滴定板孔、微量滴定 板、试管、培养皿或微流体通道的内表面。所述特殊结合物质的固定 可以通过与，例如，以下官能团结合而受到影响：镍基、胺基、醛基、 酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、 氨基酸基、硝基、腈基、糖基、硫醇基、有机磷酸酯基、脂基、磷脂 基或类固醇基。另外，通过物理吸附、化学结合、电化学结合、静电 结合、疏水性结合或亲水性结合，将所述特殊结合物质固定在比色共 振反射光学生物传感器的表面上。
可以将一种或多种特殊结合物质排列在生物传感器的表面上的 一系列一个或多个不同位置上。所述一个或多个不同位置可以限定直 径大约为50-500微米，或大约150-200微米的微阵列斑点。
所述检测一种或多种完整的特殊结合物质从比色共振反射光学 生物传感器表面上切割的上述方法还可以包括其他步骤。可以将一种 或多种特殊结合物质固定在在微量滴定板的孔中限定阵列的一个或 多个不同位置上。限定微阵列的所述一个或多个不同位置可以位于比 色共振反射光学生物传感器的表面上，反过来，所述表面又可以包括 所述孔的内表面。测定所述孔内一个或多个不同位置的PWV。将一 种或多种切割分子应用在所述孔上。检测所述孔内一个或多个不同位 置的PWV。比较起始PWV和随后的PWV。检测所述孔内一个或多 个不同位置上的一种或多种完整的特殊结合物质的切割。峰波长值 (PWV)是结合在所述生物传感器上的所述特殊结合物质的相对量 度。
本发明的另一种实施方案提供了检测一种分子如何有效抑制酶 或结合配偶体的活性，即，检测所述分子的“抑制活性”的方法。在 一种实施方案中，将怀疑具有抑制活性的一种或多种分子添加到附着 了一种或多种特殊结合物质的生物传感器上，然后添加已知能对所述 特殊结合物质产生作用的一种或多种酶。例如，蛋白酶、脂酶、核酸 酶、裂解酶、肽酶、水解酶、连接酶、激酶、磷酸酶或能够产生特殊 结合物质的可检测变化的任何其他类型的酶。所述酶能够影响特殊的 结合配偶体，例如，通过从生物传感器上切割大体上完整的一种结合 物质或结合物质的一部分。还可以将已知能结合固定在所述生物传感 器上的一种或多种特殊结合物质的一种或多种结合配偶体添加在所 述生物传感器上。
没有抑制活性的分子使得酶活性不会减弱；具有大体上完全抑制 活性的分子能够大体上完全停止反应；而具有部分抑制作用的分子能 够部分停止所述反应。另外，没有抑制活性的分子允许结合配偶体结 合在它的特殊结合物质上。具有部分抑制作用的分子允许结合配偶体 部分或较弱地结合在它的特殊结合物质配偶体上。具有抑制活性的分 子，能够抑制结合配偶体与它的特殊结合配偶体的结合。因此，所述 方法提供了检测一种或多种分子对酶或结合配偶体的抑制活性的技 术。
检测一个或多个不同位置的PWV之后，将怀疑具有抑制活性的 一种或多种分子应用在一个或多个不同位置上，并且将一种或多种酶 或结合配偶体应用在不同位置上。检测一个或多个不同位置的 PWV，并且与起始PWV进行比较。另外，所述怀疑具有抑制活性的 一种或多种分子可以与一种或多种酶或结合配偶体混合，可将它们一 起应用在所述一个或多个不同位置上。上述起始PWV相对于上述随 后的PWV的减少或增加，是(1)被所述酶改变的结合物质的比例 或来自所述生物传感器表面的结合在生物传感器上的结合配偶体的 量的相对量度或(2)怀疑具有抑制活性的一种或多种分子的相对效 力的量度。
上述检测一种或多种分子对酶或结合配偶体的抑制活性的方法 还可以包括其他步骤。例如，可以将一种或多种特殊结合物质固定在 在微量滴定板或其他液体容纳装置的孔中限定阵列的一个或多个不 同位置上。限定阵列的所述一个或多个不同位置位于比色共振反射光 学生物传感器的表面上，其包括所述孔的内表面。检测所述孔中所述 一个或多个不同位置的PWV，然后将怀疑具有抑制活性的一种或多 种分子应用到所述孔中。将一种或多种酶或结合配偶体应用到所述孔 中，并且检测所述孔中所述一个或多个不同位置的PWV。将起始 PWV与随后的PWV进行比较，并且发现一种或多种分子对所述孔 内的每一个不同位置上的酶或结合配偶体的抑制活性。另外，所述怀 疑具有抑制活性的一种或多种分子能够与一种或多种酶或结合配偶 体混合，将它们同时应用到所述孔中。
另外，可以将测试样品，例如，含有结合配偶体的细胞裂解物应 用在本发明的生物传感器上，然后洗涤，以便除去未结合的材料。结 合在生物传感器上的结合配偶体可以从生物传感器上洗脱，并且被鉴 定，例如，通过质谱分析法鉴定。可任选地将噬菌体DNA展示文库 应用在本发明的生物传感器上，然后洗涤，以便除去未结合的材料。 可以分离结合在生物传感器上的单个噬菌体颗粒，并且随后对所述噬 菌体颗粒中的插入片段进行测序，以便确定所述结合配偶体的特征。
本发明的另一种实施方案提供了检测细胞迁移和趋化性的方 法。具体地讲，细胞能够在比色共振反射光学生物传感器的一端生 长，在孔中或者以阵列形式生长。包括所述细胞的生物传感器的末端 可任选地被通过使用半透膜，从放置趋化剂的相反一端分离。然后可 以使用由图象分光计，或另外由能够移动以便从生物传感器的多个位 置上读取数据的光纤探头组成的检测系统检测所述细胞的位置，并且 反过来允许计算细胞迁移速度。
本发明的另一种实施方案提供了检测细胞生长模式变化的方 法。简单地讲，细胞能够在比色共振反射光学生物传感器上生长；检 测PWV；将试剂应用在所述细胞上；检测PWV；并且比较起始PWV 和随后的PWV，其中，起始PWV相对随后的PWV的差异表明了细 胞生长模式的变化。PWV的差异与细胞生长模式的变化相关。
细胞生长模式的变化可选自下列一组：细胞形态学、细胞粘着、 细胞迁移、细胞增殖和细胞死亡。一种类型的原核或真核细胞或两种 或两种以上类型的真核或原核细胞可以在所述生物传感器上生长。所 述生物传感器可以构成选自下列一组的容器内表面：微量滴定板孔、 微量滴定板、试管、培养皿和微流体通道。
本发明的另一种实施方案提供了检测在保持与比色共振反射光 学生物传感器接触的半渗透性内部套管中生长的细胞中释放的分子 的方法。所述半渗透性内部套管可以是，例如，可拆卸的多孔或不可 拆卸的多孔插入部件，它保持与所述生物传感器表面接触或紧靠该表 面，其中，所述套管是从在它表面上培养的细胞中分泌的分子可透过 的，并且，其中，所述套管是完整的细胞不可透过的。可以将套管安 装在微量滴定板或其他容器的孔中，其中，本发明的生物传感器构成 所述孔或其他容器的内表面。
该方法可以包括以下步骤：将一种或多种特殊结合物质固定在比 色共振反射光学生物传感器的表面上的一个或多个不同位置；检测所 述一个或多个不同位置的PWV；使细胞在保持与比色共振反射光学 生物传感器接触的半渗透性内部套管的所述一个或多个不同位置上 生长；检测所述一个或多个不同位置的PWV；并且比较起始PWV 和随后的PWV。检测从生长在保持与比色共振反射光学生物传感器 接触的半渗透性内部套管中的细胞释放的分子与所述一种或多种特 殊结合物质的结合。另外，起始PWV是与生物传感器结合的所述特 殊结合物质的相对量度，而起始PWV相对随后的PWV的差异是从 生长在半渗透性内部套管中的细胞释放的与所述特殊结合物质结合 的分子的相对量度。所述半渗透性内部套管是可拆卸的或不可拆卸的 多孔插入部件。
检测从生长在保持与比色共振反射光学生物传感器接触的半渗 透性内部套管中的细胞释放的分子的上述方法还可以包括其他步 骤。例如，可以将一种或多种结合物质固定在在微量滴定板的孔中限 定阵列的一个或多个不同位置上，其中，所述比色共振反射光学生物 传感器构成所述孔的内表面。检测在所述孔中限定阵列的所述一个或 多个不同位置的PWV，然后在保持与所述孔接触的半渗透性内部套 管中生长细胞。最后的步骤是检测所述孔中所述一个或多个不同位置 的PWV，并且比较起始PWV和随后的PWV。起始PWV相对随后 的PWV的差异，表明了从生长在孔内的所述半渗透性内部套管上的 细胞分泌的一种或多种分子与固定在比色共振反射光学生物传感器 的表面上的孔中的一个或多个不同位置上的所述一种或多种特殊结 合物质的相对结合。
检测结合配偶体与特殊结合物质结合的能力，任选地后随检测从 所述生物传感器的一个或多个不同位置大体上完全或部分除掉结合 的特殊结合物质的能力，是本发明的重要方面。本发明的生物传感器 还能够检测并且定量来自样品的结合配偶体的量，所述样品结合在限 定阵列的一个或多个不同位置上，其通过测量光线反射波长的偏移实 现。例如，在一个或多个不同位置上的波长偏移可以与其他不同位置 上的正和负对照进行比较，以便测定所结合的特殊结合物质的量。重 要的是，可以将多个这样的一个或多个不同位置排列在生物传感器表 面上，并且所述生物传感器可以构成容器内表面，如大约2、6、8、 24、48、96、384、1536或3456个孔的微量滴定板。例如，在将96 个生物传感器附着在固定装置上，并且每一个生物传感器包括大约 100个不同位置时，可以同时进行大约9600种生物化学测定。
因此，与用于表面等离子体共振、共振镜子和波导生物传感器的 测定方法不同，所述方法使得能够在共振光学生物传感器表面上同时 进行数千种单独的结合反应。很显然，这种技术可用于并行测量大量 生物分子相互作用的应用中，特别是当分子标记能改变或抑制被研究 的分子的功能时。用蛋白靶对药用化合物文库进行高通量筛选，和蛋 白组学的蛋白-蛋白相互作用的微阵列筛选是需要由本发明方法提供 的灵敏度和通量的应用的例子。
检测系统
检测系统可以包括生物传感器，将光线导向生物传感器上的光 源，和检测从生物传感器上反射的光线的探测器。在一种实施方案 中，通过采用滤光片可以简化读出装置，以便只有超过确定阈值的正 结果会启动检测。
光源能够从生物传感器的顶面照射，即，固定一种或多种特殊结 合物质的表面，或者从它的底面照射。通过测量本发明的生物传感器 的每一个不同位置上的共振波长的偏移，可能确定在它上面结合了结 合配偶体的不同位置。可以将偏移程度用于确定测试样品中结合配偶 体的量，以及一种或多种特殊结合物质与测试样品的结合配偶体的化 学亲和力。
生物传感器可以被照射两次。第一次测量确定了在生物传感器上 固定了一种或多种特殊结合物质的生物传感器阵列的一个或多个不 同位置的反射光谱。第二次测量确定了在将一种或多种结合配偶体应 用在生物传感器上之后的反射光谱。两次测量之间的峰波长差是业已 专一性地结合在生物传感器上或结合在生物传感器的一个或多个不 同位置上的结合配偶体的量的量度。这种照射方法能够控制生物传感 器表面上的小的不均匀性，这种不均匀性可能导致峰共振波长中具有 小的波动的区域。这种方法还能够控制固定在生物传感器上的特殊结 合物质的不同的浓度或分子量。
可以利用计算机模拟来确定峰共振波长和入射照射角之间的预 期的依赖性。图1所示的生物传感器可用于说明的目的。所选择的基 片是玻璃(n基片＝1.50)。光栅是四氮化三硅正方形的光带图形(t2＝180 nm，n2＝2.01(n＝折射率)，k2＝0.001(k＝吸收系数))，其周期为 510nm，填充系数为56.2％(即，56.2％的表面被四氮化三硅正方形 所覆盖，而其余部分是位于正方形之间的面积)。位于四氮化三硅正 方形之间的面积用较低折射率的材料填充。还用相同的材料覆盖所述 正方形，以便提供均匀的扁平顶面。对于这种模拟来说，选择玻璃层 (n1＝1.40)，其以t2＝100nm覆盖四氮化三硅正方形。
利用GSOLVER软件构建作为波长函数的反射强度的模型，它 利用了完整的三维矢量代码，其中使用杂合严格的耦合波分析 (Rigorous Coupled Wave Analysis)和模式分析(Modal analysis)。 GSOLVER计算来自任意复杂的光栅结构的平面波照射的衍射场和 衍射效率。所述照射可以来自任何入射光和任何偏振化。
图10图示峰共振波长对入射照射角的依赖性。所述模拟表明， 在入射光角和测量的峰波长之间存在显著相关。这一结果表明，照射 光束的瞄准，以及照射光束和反射光束之间的排列，会直接影响测量 的共振峰谱线宽度。如果照射光束的瞄准较差，将会有不同的照射角 入射在生物传感器表面上，并且要测量比纯粹的平行光入射更宽的共 振峰。
由于生物传感器的较低的灵敏度限制与测定峰最大值的能力相 关，所以重要的是测量窄的共振峰。因此，在所述生物传感器上使用 瞄准照射系统，提供了最大可能的灵敏度。
用于照射生物传感器表面和用于收集反射光的一种类型的检测 系统是探头，它包括，例如，六个连接在光源上的照射光纤，和一个 连接在分光计上的收集光纤。光纤的数目并不重要，任何数目的照射 或收集光纤都是可行的。所述光纤是成束排列的，以便所述收集光纤 位于束的中央，并且由六个照射光纤环绕。光纤束的顶端与准直透镜 连接，所述透镜将照射聚焦在生物传感器的表面上。
在这种探头结构中，照射和收集光纤是并排排列的。因此，当准 直透镜正确调整到将光线聚焦在生物传感器表面上时，人们可以看到 六个明确确定的照射的圆环区和一个中央黑暗区。由于所述生物传感 器不能散射光线，而是反射平行光束，所以没有光线会入射在收集光 纤，并且不会出现共振信号。只有通过对准直透镜进行散焦，直到六 个照射区重叠成一个中央区，才可以将任何光线都反射到收集光纤 中。由于只有进行散焦的、略微非平行的光线才可能产生信号，所以 所述生物传感器不会被单一入射角所照射，而是由多种入射角照射。 入射角的范围导致了混合的共振波长，这是由于图10所示的依赖 性。因此，测量的共振峰比其他方式可能出现的共振峰更宽。
因此，需要照射并且收集光纤探头，以便在空间上拥有相同的光 程。可以用若干种方法共同定位照射和收集光程。例如，一个照射光 纤，它的第一末端与光源连接，所述光源将光线导向生物传感器上， 和一个收集光纤，它的第一末端与探测器连接，所述检测器检测从生 物传感器上反射的光线，它们彼此由第二个末端连接在第三个光纤探 头上，该探头可以同时起着照射器和收集器的作用。第三个光纤探头 以对生物传感器直角入射角定向，并且支持反向照射和反射光学信 号。在图11中示出了这样一种检测系统的例子。
检测的另一种方法涉及使用分光器，它能够使与光源连接的一个 照射光纤的方向与和探测器连接的收集光纤成90度角。引导光线通 过照射光纤探头进入分光器，由它将光线导向生物传感器。反射光向 后返回进入分光器，由它将光线导向收集光纤探头。在图12中示出 了这种检测装置的例子。分光器允许照射光线和反射光线在分光器和 生物传感器之间拥有共同的光程，因此可以完美地使用平行光而不进 行散焦。
角度扫描
本发明的检测系统是基于生物传感器表面的平行白光照射，和反 射光束共振峰的光谱学测量的。生物传感器表面上的分子结合是通过 峰波长值的偏移表现的，而波长的增加相当于分子吸收的增加。
正如在理论模拟和实验数据中所表明的，共振峰波长在很大程度 上取决于检测光束的入射角。图10表示模拟本发明的生物传感器的 这种依赖性。由于共振峰波长的角度依赖性，所以入射白光需要很好 地瞄准。光束的角分散加宽了共振峰，并且降低了生物传感器的检测 灵敏度。另外，来自光谱学测量的信号质量取决于光源的能量和检测 器的灵敏度。为了获得高信噪比，可能需要每一个检测位置的超长的 积分时间，因此，延长了读出生物传感器平板的总时间。可调谐激光 光源可用于检测光栅共振，不过价格昂贵。
在本发明的一种实施方案中，通过将激光光束用于照射生物传感 器，并且将光检测器用于测量反射光束能量解决了上述缺陷。可以将 扫描镜装置用于改变激光光束的入射角，并且将光学系统用于保持入 射激光光束的瞄准。参见，例如，“Optical Scanning”(Gerald F. Marchall ed.，Marcel Dekker(1991)。任何类型的激光扫描都可以 使用。例如，在本发明中可以使用以每秒钟大约2线-大约1,000线 的速度产生扫描线的扫描装置。在本发明的一种实施方案中，扫描装 置每秒钟可以扫描大约50线-大约300线。
在一种实施方案中，所述反射光束通过激光扫描光学系统的一部 分，并且通过一个光检测器测量。所述激光光源可以是二极管激光 器，其波长为，例如，780nm、785nm、810nm或830nm。这种类 型的激光器二极管在最高达到150mW的能量水平容易得到，并且它 们的波长与高灵敏度的Si光电二极管相当。因此，所述检测器可以 是基于光电二极管生物传感器的。在图13中示出了这种检测系统的 一种例子。光源(300)向扫描装置(400)提供光线，由它将光线导 入光学系统(500)。光学系统(500)将光线导入生物传感器(600)。 光线从生物传感器(600)上反射到光学系统(500)中，后者将光线 导入光学信号探测器(700)。在图30中示出了检测系统的一种实施 方案，该附图表明，在扫描镜改变其角位置时，在所述表面上的激光 光束的入射角名义上改变了镜面角位移的两倍。所述扫描镜装置可以 是线性检流计，在大约2Hz至最高大约120Hz的频率下工作，并且 机械扫描角为大约10度-大约20度。在该例子中，一次扫描可以在 大约10毫秒内完成。还可以使用共振检流计或多边形扫描仪。图30 中所示出的例子包括用于角扫描的简单的光学系统。它由一对透镜组 成，在它们之间具有共同的焦点。可以设计所述光学系统，以便获得 激光瞄准和反射光束收集的最佳性能。
角分辨率取决于检流计规格和反射光采样频率。假设检流计分辨 率为30arcsec mechanical，则相应的生物传感器的角扫描分辨率为 60arcsec，即0.017度。另外，假设采样速度为100ksamples/sec，则 在10毫秒内具有20度的扫描。结果，量子化步骤对于1000个样品 为20度，即每个样品0.02度。在本例子中，共振峰宽度为0.2度， 正如由Peng和Morris所显示的(Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings， Optics Lett.，21：549(1996))，它能由10个数据点覆盖，每一个 数据点相当于该检测系统的分辨率。
该检测系统的优点包括：通过激光光束获得的良好的入射光瞄 准，由于激光器二极管的高的光束能量产生的高信噪比，由于用一个 元件光检测器替代了分光计而导致的低成本，以及由于角扫描产生的 共振峰的高分辨率。
光纤探头生物传感器
本发明的生物传感器可以出现在多种模式光纤探头的顶端。这种 光纤探头可用于疾病和状况的生物标记的体内检测，所述疾病和状况 例如，心脏动脉疾病、癌症、炎症和脓毒病。可以将一个生物传感器 元件(包括，例如，数百个光栅周期)生产成光纤探头顶端，或用玻 璃基片制成，并且附着在光纤探头顶端。参见图14。将单一光纤用 于提供照射和测量共振反射信号。
例如，类似于图11的光纤探头结构可用于将照射光纤和检测光 纤耦合成单一反向光纤，其中将生物传感器嵌入或附着在它的顶端。 将光纤探头插入哺乳动物体内，例如人体。可以在将所述探头插入体 内时照射并且检测反射信号。
提供以下实施例只是用于说明目的，而不希望限定上面以广义形 式描述的本发明的范围。在本公开内容中所引用的所有参考文献都被 收作本文参考。
实施例1
固定化蛋白检测
为了证实生物传感器对它表面上的生物分子进行定量的能力，将 以各种浓度溶解在H2O中的BSA的小滴应用在图1所示生物传感器 上。让3μl小滴风干，留下分布在大约2mm直径范围内的少量BSA。 在小滴沉积之前和之后测量每一个生物传感器位置的峰共振波长，并 且记录峰波长偏移。参见图34。
实施例2
一种或多种特殊结合物质的固定
将以下方案用在比色共振反射生物传感器上，以便用胺官能团激 活所述表面。可以将胺基用作若干类型接头分子的随后的共价结合的 通用表面。
通过在过氧硫酸蚀刻剂(piranha etch)(70/30％(v/v)浓硫酸 //30％过氧化氢)中浸泡12小时来清洗本发明的玻璃基片生物传感 器。用水充分洗涤所述生物传感器。将所述生物传感器浸泡在溶于无 水丙酮的3％3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中1分钟，然后用无水丙酮 漂洗，并且风干。另外，将生物传感器浸泡在溶于乙醇(Aldrich) 的10％3-氨丙基三乙氧基硅烷(Pierce)溶液中1分钟，然后用乙醇 简短地漂洗。然后在70℃下干燥激活的传感器10分钟。然后用水洗 涤所述生物传感器。
利用半定量方法验证氨基在所述生物传感器表面上的存在。将来 自每一批氨基官能化生物传感器的一个生物传感器用5mL的50 mM碳酸氢钠，pH8.5简短地洗涤。然后将所述生物传感器浸泡在5 mL的50mM碳酸氢钠，pH8.5中，该溶液含有0.1mM硫代-琥珀 酰亚胺基-4-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-丁酸酯(s-SDTB，Pierce， Rockford，IL.)，并且剧烈振荡30分钟。通过将3.0mg的s-SDTB 溶解在1mL的DMF中来制备s-SDTB溶液，并且用50mM碳酸氢 钠，pH8.5稀释到50mL。在温育30分钟之后，用20mL的ddH2O洗涤所述生物传感器三次，随后用5mL 30％高氯酸处理。橙色溶 液的形成，表明了生物传感器业已被胺成功的衍生化；未处理过的玻 璃生物传感器上没有出现颜色变化。
在上述方法之后，通过高氯酸处理之后的溶液在495nm的吸收 可以用作所述表面上胺基定量的指标。在一种类型的实验中，Sigma 载片、Cel-Associate载片和内部生物传感器载片的吸收分别为 0.627、0.647和0.728。这表明，生物传感器表面的NH2活化水平与 通过商业渠道获得的微阵列玻璃载片的活化水平相当。
在用胺活化所述生物传感器的上述方案之后，可以将接头分子附 着在所述生物传感器上。在选择交联剂时，应当考虑诸如活性基团选 择性、间隔臂长度、溶解度和可切割性的问题。反过来，所述接头分 子能结合被用于专一性识别结合配偶体的所述特殊结合物质。作为一 种例子，业已将下面所述方案用于将生物素接头分子结合在胺活化的 生物传感器上。
用生物素活化胺涂覆的生物传感器的方案
用PBS(pH8.0)洗涤胺涂覆的生物传感器三次。在PBS缓冲 液(pH8)中以0.5mg/ml的浓度制备硫代-琥珀酰亚胺基-6-(生物 素酰胺)己酸酯(硫代-NHS-LC-生物素，Pierce，Rockford，Illinois) 溶液。将2ml的硫代-NHS-LC-生物素溶液添加到每一个胺涂覆的生 物传感器上，并且在室温下温育30分钟。用PBS(pH8.0)洗涤生 物传感器三次。所述硫代-NHS-LC-生物素接头的分子量为556.58， 长度为22.4_。所得到的生物传感器可用于捕获抗生物素蛋白或链霉 抗生物素蛋白分子。
用醛活化胺涂覆的生物传感器的方案
在0.1M磷酸钠、0.05％叠氮化钠、0.1％氰基硼氢钠，pH7.0 中，制备2.5％戊二醛溶液。将2ml的硫代-NHS-LC-生物素溶液添 加到每一个胺涂覆的生物传感器上，并且在室温下温育30分钟。用 PBS(pH7.0)洗涤生物传感器三次。戊二醛接头的分子量为100.11。 可以将得到的生物传感器用于结合蛋白和其他含胺的分子。反应通过 形成席夫碱进行，随后进行还原性胺化，得到了稳定的二级胺键。在 一种实验中，将通过本发明制备的涂覆的醛载片与通过商业渠道获得 的醛载片(Cel-Associate)进行比较时，发现在通过本发明人制备的 载片上链霉抗生物素蛋白和抗兔IgG的结合增强了10倍。
用NHS活化胺涂覆的生物传感器的方案
在碳酸钠缓冲液(pH8.5)中制备25mM N，N′-二琥珀酰亚胺基 碳酸酯(DSC，Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri)。 将2ml的DSC溶液添加到每一个胺涂覆的生物传感器上，并且在室 温下温育2小时。用PBS(pH8.5)洗涤生物传感器三次。DSC接头 的分子量为256.17。将所得到的生物传感器用于含有羟基或胺的分 子。该接头是现有最小的同双功能NHS酯交联剂之一。除了上述方 案之外，业已报道了很多其他表面活化和分子接头技术，这些技术能 最优化不同类型的生物分子的测定性能。其中最常见的是胺表面、醛 表面和镍表面。反过来，所述活化的表面可用于将若干不同类型的化 学接头附着在生物传感器表面上，如表1所示。尽管将胺表面用于附 着若干类型的接头分子，但可以将醛表面用于直接结合蛋白，而不需 要额外接头。镍表面被专门用于结合具有整合的组氨酸(“his”) 标记的分子。用镍活化的表面检测“his-标记的”分子是众所周知的 (Sigal等，Anal.Chem.68，490(1996))。表1证实了用于制备 和使用生物传感器的步骤的顺序的例子，以及可用于表面活化化学、 化学接头分子、特殊结合物质和结合配偶体分子的多种选项。还存在 通过用诸如HRP或链霉抗生物素蛋白的较大的分子进行放大和使用 诸如葡聚糖或TSPS的聚合材料增加可用于分子结合的表面积来增强 检测信号的可能性。   裸露的    传感器    表面活化      接头分子      受体分子      检测的材料      标记分子    (任选的)    玻璃      任选地增    强灵敏度    2-5x的聚    合物    葡聚糖      TSPS      胺        醛        Ni          SMPT    NHS-生物素      DMP      NNDC      His-标记      其他    小分子    肽      Med蛋白      Lrg蛋白    ·IgG        cDNA    肽    Med蛋白      Lrg蛋白    ·IgG      噬菌体      细胞    cDNA    增强灵敏度    1000x    HRP          链霉抗生    物素蛋白     
                          表1
实施例3
IgG测定
作为检测生物化学结合的初步证明，进行了测定，其中，通过用 在实施例2中所描述的氨基表面化学激活制备生物传感器，然后附着 生物素接头分子。将所述生物素接头用于与链霉抗生物素蛋白受体分 子专一性地相互作用和有效地将其连接在所述表面上，这通过在室温 下接触溶于PBS中的50μg/ml浓度的链霉抗生物素蛋白溶液2-4小 时来实现。所述链霉抗生物素蛋白受体能够将任何生物素化的蛋白结 合在所述生物传感器表面上。对本实施例来说，将溶于磷酸缓冲液 (PBS)中的3μl的生物素化的抗人IgG小滴沉积在生物传感器表 面上的4个不同位置上，其浓度为200μg/ml。让所述溶液在生物传 感器上温育30分钟，然后用PBS充分漂洗。在生物素活化之后、链 霉抗生物素蛋白受体应用之后以及在ah-IgG结合之后，测量所述4 个位置的峰共振波长。图34表示添加链霉抗生物素蛋白和ah-IgG都 能导致共振波长的显著的可测量的增强。
实施例4
生物素/链霉抗生物素蛋白测定
进行一系列测定，以便检测生物素受体层对链霉抗生物素蛋白的 结合。首先用胺化学活化生物传感器，然后按上文所述方法附着NHS- 生物素接头层，然后，将溶于PBS中的3μl的链霉抗生物素蛋白小 滴以不同的浓度应用在生物传感器上。让所述小滴在生物传感器表面 上温育30分钟，然后用PBS充分洗涤，用DI水漂洗。在链霉抗生 物素蛋白结合之前和之后测量峰共振波长，并且峰共振波长偏移如图 16所示。观察到了峰波长和链霉抗生物素蛋白浓度之间的线性关系， 且在这种场合下，测量的最低链霉抗生物素蛋白浓度为0.2μg/ml。 这种浓度相当于摩尔浓度为3.3nM。
实施例5
蛋白-蛋白结合测定
进行一种测定，以便证实蛋白-蛋白相互作用的检测。正如以前 所描述的，用胺化学和NHS-生物素接头层活化生物传感器。通过让 生物传感器在室温下接触溶于PBS中的浓度为50μg/ml的溶液60分 钟，将山羊抗生物素抗体受体层附着在生物素接头上，然后用PBS 洗涤，并且用DI水漂洗。为了抑制非专一性蛋白与生物传感器表面 上的未结合的生物素的相互作用，让所述生物传感器表面接触溶于 PBS中的1％牛血清清蛋白(BSA)溶液30分钟。该步骤的意图是“阻 断”不希望的蛋白与所述生物传感器相互作用。如图17所示，将大 量BSA整合到受体层中，正如通过增强诱导的峰波长所显示的。在 阻断之后，将3μl各种浓度的抗山羊IgG小滴应用到生物传感器表 面上的不同位置上。让所述小滴温育30分钟，然后用DI水充分漂洗。 在对每一个斑点进行阻断之前、阻断之后、受体层结合之后以及抗山 羊IgG检测之后测量生物传感器峰共振波长。图17表示10μg/ml的 抗山羊IgG浓度产生了易于测量的波长偏移。
实施例6
未标记的ELISA测定
生物传感器阵列平台的另一种应用是它在不需要酶标记，以及随 后的酶专一性底物相互作用以产生有色染料的前提下进行酶联免疫 吸附测定(ELISA)。图18表示实验结果，其中，制备生物传感器， 以便用IFN-γ抗体受体分子检测干扰素-γ(IFN-γ)。用SMPT接头 分子(Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois)将受体分子 共价附着在NH2-活化的生物传感器表面上。如图18所示，测量生物 传感器表面上两个相邻位置的使用NH2、SMPT和抗人IFN-γ受体 分子的峰共振波长偏移。让以上两个位置接触溶于PBS中的浓度为 100μg/ml的两种不同的蛋白溶液。第一个位置接触IFN-γ，预计它能 与受体分子结合，而第二个位置接触神经生长因子(NGF)，预计它 不能结合所述受体。在温育30分钟之后，通过从底部照射测量所述 生物传感器，同时顶面保持浸泡在液体中。接触IFN-γ的位置记录到 了0.29nm的波长偏移，而接触NGF的位置记录到了仅为0.14nm的 波长偏移。因此，在不使用任何类型的酶标记或颜色产生性酶反应的 前提下，所述生物传感器能够分辨含有不同类型蛋白的溶液。
实施例7
蛋白酶抑制剂测定(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3)
进行天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3蛋白酶抑制剂测定，以便 验证生物传感器在与药用化合物筛选相关的实验中测量小分子存在 和切割的能力。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(需要半胱氨酸的天冬氨酸蛋白 酶)是一种蛋白酶家族，它能介导细胞死亡，并且在细胞凋亡中起着 重要作用。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3，即一种效应子天冬氨 酸特异性半胱氨酸蛋白酶，是研究的最充分的哺乳动物天冬氨酸特异 性半胱氨酸蛋白酶，因为它能够专一性地切割大部分已知的天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶-相关底物。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 3测定就是基于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3对4-氨基酸肽底 物NHS-Gly-Asp-Glu-Val-Asp对硝基苯胺(NHS-GDEVD-pNA)的 水解的，从而导致了pNA部分的释放。
(NHS-GDEVD-pNA) 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(NHS-GDEVD)+pNA
附着在GDEVD的N-末端的NHS分子提供了活性末端基团，以 使得NHS-GDEVD-pNA复合物能够共价结合在生物传感器上，其中 使得该复合物的pNA部分的朝向远离所述表面。通过以这种方式附 着，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3具有它的底物切割位点的最佳 入口。
通过在3∶1的H2SO4∶H2O2溶液中清洗(室温，1小时)制备 生物传感器，然后进行硅烷化(溶解在无水丙酮中的2％的硅烷，30 秒)并且附着聚-phe-赖氨酸(PPL)层(溶解在pH6.0的PBS中的 100μg/ml PPL，含有0.5M NaCl，10小时)。通过让生物传感器接 触溶于PBS中的10mM溶液(pH8.0，室温，1小时)来附着 NHS-GDEVD-pNA复合物。将微孔腔室密封在所述生物传感器表面 上，并且通过添加溶于1x酶缓冲液中的100μl的天冬氨酸特异性半 胱氨酸蛋白酶-3(100ng/ml，室温，90分钟)来切割pNA。在接触 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3溶液之后，用PBS洗涤所述生物 传感器。将使用分光光度计的单独组的实验用于证实所述复合物与生 物传感器的表面的附着，以及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3从表 面结合的复合物中除掉pNA分子的功能活性。
在NHS-GDEVD-pNA复合物附着之前、所述复合物(MW＝860 Da)附着之后以及在用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3切割pNA (MW＝136)之后测量生物传感器的峰共振频率。如图19所示，所 述肽分子的附着是明确可测量的，正如随后除掉pNA一样。Δλ＝0.016 nm的pNA去除信号为0.003nm的最小可检测峰波长偏移的5.3x。 所添加的分子量和扣除的分子量的比例(860Da/136Da＝6.32)与所 观察到的添加的和扣除的材料的峰波长偏移的比例(0.082nm/0.016 nm＝5.14)非常吻合。
本实验的结果证实，生物传感器能够在没有标记的情况下测量小 肽(在这种情况下，为5-聚体肽)，甚至检测通过酶活性去除分子的 130Da的部分。
实施例8
蛋白-蛋白结合测定的反应动力学
由于本发明的生物传感器在浸泡在液体中时能够作为时间的函 数被连续地查询，所以生物传感器可用于进行终点检测实验，并且用 于获得有关生物化学反应的动力学信息。作为一种例子，图20示出 了通过向所述表面上连续添加各种结合配偶体连续测量一个生物传 感器位置的实验的结果。在所述实验过程中，检测探头通过生物传感 器基片的背面照射所述生物传感器，同时在所述装置的顶面进行生物 化学反应。将橡胶垫圈密封在测量的生物传感器位置周围，以便限制 所述添加的试剂，并且所有测量都是在生物传感器的顶面浸泡在缓冲 液中的情况下进行的。在初步清洗之后，用NH2和NHS-生物素接头 分子活化所述生物传感器。如图20所示，将几种不同浓度(1、10、 100、1000μg/ml)的山羊α-生物素抗体连续添加到所述生物传感器 上，并且温育30分钟，同时监控峰共振波长。在应用最高浓度的α- 生物素IgG之后，通过添加各种浓度(0.1、1、10和100μg/ml)的 α-山羊IgG将第二层蛋白结合在生物传感器表面上。同样，在让每一 种溶液在生物传感器上温育30分钟时，连续监控共振峰。图20表示 在每一个温育阶段结束时共振峰如何偏向更大的波长。
图21表示来自图20的最终共振峰过渡的动力学结合曲线，其 中，将100μg/ml的α-山羊IgG添加到所述生物传感器上。该曲线表 现了在动力学结合实验中通常观察到的曲线类型，其中，首先观察到 了基准频率的快速增加，随后是反应的逐渐饱和。这种类型的反应曲 线出现在实验中测量的所有的过渡中。图22表示IgG结合的动力学 结合测量。
通过酶的活性从生物传感器表面上除去材料同样是容易观察到 的。当来自上述实验的生物传感器(具有山羊抗生物素IgG和抗山 羊IgG的两种蛋白涂层)接触浓度为1mg/ml的胃蛋白酶时，这种 酶能够解离IgG分子，并且将它们从生物传感器表面上除掉。如图 23所示，从所述表面上除掉结合的分子可以作为时间的函数而观察 到。
实施例9
蛋白组学用途
本发明的生物传感器可用于蛋白组学用途。生物传感器阵列能够 接触包括结合配偶体混合物的测度样品，该测试样品包括，例如，蛋 白或噬菌体展示文库，然后漂洗生物传感器表面，以便除掉所有未结 合的材料。对生物传感器进行光学探测，以便确定在生物传感器表面 上的不同位置上业已经历了最大程度的结合，并且提供结合材料的定 量量度。然后，将所述生物传感器放入“流动室(flow cell)”中， 其允许(例如，＜50微升)固定体积的流体与生物传感器表面接触。 激活一个电极，以便只从选择的生物传感器阵列不同位置上洗脱结合 材料。结合材料在流动室液体中被稀释。将流动室液体从生物传感器 表面上用泵抽走，并且储存在微量滴定板或某些其他容器中。用新的 溶液取代所述流动室液体，并且激活新的生物传感器电极，以便洗脱 它的结合的结合配偶体。重复以上过程，直到生物传感器的所有不同 目标位置液体洗脱，并且集中在单独容器中。如果所述测试样品液体 包括蛋白混合物的话，则可以用诸如电喷雾串联质谱分析法的技术分 析单独容器中的蛋白含量。如果所述样品液体包含噬菌体展示文库， 则可以通过与宿主菌株温育，浓缩扩增，以及分析相关的文库DNA 序列来鉴定单独容器中的噬菌体克隆。
实施例10
均匀的测定证明
SWS生物传感器能检测与它表面接触的均匀流体的光密度，并 且能够区分折射率相差小到Δn＝4×10-5的流体。由于溶液包括两种折 射率与含有两种结合的相互作用蛋白的溶液不同的游离的非相互作 用蛋白，所以在没有任何类型的颗粒标记或化学标记的前提下，SWS 生物传感器能够测量蛋白-蛋白相互作用何时在溶液中发生。
制备三种测试溶液用于进行比较：
1.溶解在磷酸缓冲溶液(PBS)中的抗生物素蛋白，(10μg/ml)
2.溶解在PBS中的抗生物素蛋白(10μg/ml)+牛血清清蛋白 (BSA)(10μg/ml)
3.溶解在PBS中的抗生物素蛋白(10μg/ml)+生物素化的BSA (b-BSA)(10μg/ml)
将一个SWS生物传感器用于所有测量，以便消除任何可能的生 物传感器之间的偏差。将每一种测试溶液的200μl的样品应用到生 物传感器上，并且平衡10分钟时间，然后测量SWS生物传感器峰共 振波长值。在样品之间，用PBS充分洗涤生物传感器。
在图24中对测试溶液的峰共振波长值进行作图。取抗生物素蛋 白溶液作为基线参照物，以用于与抗生物素蛋白+BSA和抗生物素蛋 白+b-BSA溶液进行比较。将BSA添加到抗生物素蛋白中，仅仅导 致了小的共振波长增加，因为这两种蛋白预计不会相互作用。不过， 由于生物素和抗生物素蛋白强有力结合(Kd＝10-15M)，抗生物素蛋 白+b-BSA溶液会包括更大的结合的蛋白复合物。因此，与抗生物素 蛋白+BSA相比，抗生物素蛋白+b-BSA溶液的峰共振波长值提供了 较大的偏移。
BSA(MW＝66KDa)和b-BSA(MW＝68KDa)之间的分子量差 异是非常小的。因此，含有非相互作用蛋白(抗生物素蛋白+BSA) 和相互作用蛋白(抗生物素蛋白+b-BSA)的溶液之间测量的差异仅 仅是由于这两种分子之间结合相互作用的差异造成的。所述结合的分 子复合物导致了所述溶液具有与不含结合复合物的溶液不同的光学 折射率。所述光学折射率变化是通过SWS生物传感器测量的。
实施例11
微量滴定板测定
作为构成微量滴定板内表面的比色共振反射光学生物传感器上 的生物化学结合检测的证明，进行了以下测定。选择用于本研究的蛋 白-蛋白系统是利用固定在生物传感器表面上的生物素作为特殊结合 物质对抗生物素IgG抗体的检测。因此，开发了将生物素固定在生物 传感器表面上的方案，该方案利用双功能聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚 胺(NHS-PEG)接头分子(Shearwater Polymers，Inc.)在胺表面基 团和生物素之间起着中间物的作用。NHS-PEG分子是专门设计的， 以便NHS能够优先结合胺活化的表面，从而使得该分子的PEG部分 的朝向远离该表面。NHS-PEG接头分子起着使生物素分子与生物传 感器表面分离一小段距离的作用，以便它可以保持它的构象，并因此 保持它对其他分子的亲和力。PEG还可起着抑制蛋白与生物传感器 的非专一性结合的作用。
在胺活化的生物传感器片附着到微量滴定板底部之后，用三种不 同的表面官能团制备单独的微量滴定板孔，以便提供足够的实验对 照，以用于检测抗生物素IgG。首先，在不进行额外改性的前提下研 究胺活化的表面。胺活化的表面预计能非专一性地结合蛋白，但是没 有高的亲和力。其次，制备了具有NHS-PEG双功能接头分子的微量 滴定板孔。预计NHS-PEG分子能够提供不会结合蛋白的表面。第三， 制备了具有NHS-PEG-生物素接头分子的微量滴定板孔。预计NHS- PEG-生物素分子能够与抗生物素IgG强有力结合。
为了用生物素激活胺涂覆的生物传感器，将溶解在TPBS(0.01％ TWEENTM 20的参考缓冲液，溶解在磷酸缓冲液中，pH8)中的浓度 为1.0mg/ml的2ml的NHS-PEG-生物素(Shearwater)溶液添加 到所述生物传感器表面上，并且在37℃下温育1小时。用相同的方 法附着没有生物素的NHS-PEG(Shearwater)分子。所有购买的试 剂都是以包装形式使用的。
进行蛋白-抗体亲和力测定，以便证实生物传感器的工作。制备 三种单独的生物传感器表面状态(NH2、NHS-PEG、NHS-PEG-生物 素)的基质，并且接触7种浓度的山羊抗生物素IgG(Sigma)。在 单独的微量滴定板孔中测量每一个基质位置，同时测量总共21个 孔。由于预期NHS-PEG孔不能结合蛋白，它们提供了用于取消共同 的模式效应的参考，如测试样品的折射率影响和在测定过程中环境温 度波动。
图25对PWV偏移进行作图-与没有固定的化学官能团的生物传 感器进行参考，是由于NH2、NH2+(NHS-PEG)和NH2+(NHS- PEG-生物素)分子与生物传感器表面的附着而记录的。误差棒表示 在7个微量滴定板孔上记录的PWV偏移的标准差。数据表明，所述 生物传感器能够区分清洁表面，和固定有NH2的表面，并且明确检 测NHS-PEG(MW＝2000Da)分子的添加。表面固定化NHS-PEG 和NHS-PEG-生物素(MW＝3400Da)之间的差异同样是可以测量的。
图26A-C表示在接触各种浓度的抗生物素IgG(0-80mg/ml)并 且温育20分钟时生物传感器孔作为时间函数的PWV偏移反应。 NHS-PEG表面(图26B)提供了最低的反应，而胺活化的表面(图 26A)表现了与高浓度抗生物素IgG的低水平的非专一性相互作用。 NHS-PEG-生物素表面(图26C)明确表现出与抗生物素IgG的强的 专一性相互作用，从而提供了与预期的抗生物素IgG浓度成比例的 强的PWV偏移。
20分钟之后，将PWV相对图26C的偏移幅度在图25中作为抗 生物素IgG浓度的函数作图。观察到了IgG浓度和测量的PWV偏 移之间的大致上的线性相关，并且，最低浓度IgG溶液(1.25μg/ml， 8.33nM)相对负对照PSB溶液是明显可测量的。
在图27中示出了通过酶的活性从生物传感器表面上除掉材料。 当所述生物传感器接触浓度为1mg/ml(体积＝100μl)的胃蛋白酶 时，所述酶解离山羊-抗生物素IgG和抗山羊IgG，并且将它们从生 物传感器表面上除掉。可以观察到作为时间函数的所述表面的结合分 子的去除。
实施例12
在比色共振反射光学生物传感器(96孔微量滴定板)上生长细 胞
在接种培养物之前，对构成微量滴定板的内表面的比色共振反射 光学生物传感器进行灭菌。灭菌是通过将生物传感器放入Biosafety 通风橱中，并且让微量滴定板和防护盒接触紫外线12-48小时，更优 选大约16-36小时，更优选18-30小时，且最优选大约24小时而实现 的。从生长在软骨细胞生长培养基(Cell Applications，Inc.)中的软 骨细胞和生长在RPMI(Sigma)中的HEK人肾肿瘤细胞(ATCC) 的活的培养物中收获细胞。将1×105-1×106个细胞添加到96个孔的 每一个孔中，并且将微量滴定板放入防护盒，并且在CO2培养箱中， 在37℃下温育24-48小时。
可以通过比色共振反射光学生物传感器表面的峰波长值检测在 生物传感器位置上的细胞生长，或更通常的是使用显微镜、数码相 机、常规照相机或其他观察装置监控，其中进行放大或不放大，所述 装置采用了基于透镜的光学元件或基于电子的电荷耦合装置(CCD) 技术。
实施例13
在比色共振反射光学生物传感器上检测细胞形态学变化
利用构成微量滴定板的内表面的比色共振反射光学生物传感器 检测细胞形态学变化。按照实施例12的方法让软骨细胞生长到10- 90％汇合的单层。用盐平衡缓冲液，如Hank氏培养基(Sigma)洗 涤细胞单层，并且检验单层的稳定性，用诸如Hank氏培养基的盐平 衡的培养基洗涤或温育所述细胞10分钟。可以通过在洗涤或温育步 骤之前、期间或之后检测任何位置的峰波长值来评估任何生物传感器 位置的单层稳定性。
将溶于Tris-EDTA中的0.25％胰蛋白酶加温到室温，并且添加 到生物传感器孔中，同时检测峰波长值。还采用没有生长细胞的空白 对照。参见图28，跟踪反应进程12分钟。贯穿所述测定，发现所述 细胞保持附着在生物传感器的表面上；在向容纳有软骨细胞的生物传 感器孔中添加2mg/ml胰蛋白酶后观察到的PWV的减弱，表明了软 骨细胞细胞形态学的变化。对于添加胰蛋白酶，对照(无软骨细胞) 孔表现出不明显的反应。
图29表示使用肾肿瘤细胞的细胞粘着测定结果。将胰蛋白酶添 加到容纳有生长在生物传感器的表面上的肾肿瘤细胞的六个生物传 感器孔中。将两个孔用作三种胰蛋白酶浓度的每一种的重复样品。在 添加胰蛋白酶后，观察到的PWV的减弱，表明了所述细胞与生物传 感器的表面的脱附。
业已观察到原代和肿瘤细胞系在所述微量滴定板孔中的比色共 振反射光学生物传感器表面上生长良好，并且业已观察到真核细胞产 生了非常稳定的PWVs。
实施例14
检测从生长在保持与比色共振反射光学生物传感器接触的半渗 透性内部套管中的细胞中释放的分子
可以使用构成微量滴定板孔的内表面的比色共振反射光学生物 传感器检测从细胞中分泌、流出或以其他方式排出的分子。将抗白细 胞介素-1的抗体固定在微量滴定板孔内的比色共振反射光学生物传 感器的表面上。将半渗透性内部套管插入所述孔，然后放入小鼠巨噬 细胞(ATCC CRL-2019)和RPMI 1640生长培养基(Sigma)。按 照实施例12所述方法生长细胞，同时在生物传感器表面上的若干位 置检测比色共振反射光学PWV。在将脂多糖(Sigma)用于刺激白细 胞介素-1产生时，发现了PWVs随时间推移而增强，因为从巨噬细 胞中分泌的白细胞介素-1通过半渗透性内部套管扩散，并且与固定在 生物传感器表面上的白细胞介素-1抗体结合。
实施例15
在比色共振反射光学生物传感器上的蛋白微阵列证明
比色共振反射光学生物传感器能够以阵列形式进行测定，本实施 例说明了检测不同类型的IgG之间的不同的结合亲和力的能力。
在本实施例中，将生物传感器片切割成1英寸×2英寸的矩形区 域。该传感器由疏水性TaO表面组成，在它上面使用Affymetrix GMS 针和环点样仪用400微米点样环点样了1mg/ml的兔-IgG、鸡-IgG、 山羊-IgG和人-IgG(所有IgG均购自Sigma)。一共形成了4排各7 个斑点(参见图35-A)，其中，兔-IgG构成了第一排；鸡-IgG构成 了第二排；山羊-IgG构成了第三排；而人IgG构成了第四排。在点 样之后，在室温下温育IgG 30分钟。然后将由Jobin Yvon高分辨率 成像分光计组成的SRU微阵列扫描仪用于扫描所得到的数据，如图 35-A所示。
在点样之后，让1mg/ml的明胶(Sigma)流动到所述表面上， 以作为阻断剂来阻止结合剂(抗人-IgG)与非点样区域的非专一性结 合。然后在PBS中漂洗整个微阵列载片三次，每次10秒钟，然后用 H2O漂洗三次，同样每次10秒钟。然后使用SRU微阵列扫描仪扫 描所得到的微阵列，最后，将100μg/ml的抗人-IgG流动到整个表面 上，并且在室温下温育30分钟，然后使用与上述相同的PBS漂洗方 法漂洗。再次用SRU微阵列扫描仪扫描所得到的包括所述结合相互 作用的微阵列。该最后扫描和在阻断之后进行的扫描之间的差别表明 了结合在微阵列上每一个斑点上的材料的量(参见图35-B)。具体 地讲，人-IgG和抗人-IgG之间的高度亲和力是与图35-B中最下面 一排相应的强反应的证据。另外，在图35-B中0.04nm/强度计数的 强度等级上，通过所述微阵列系统观察到了0.8-nm-1.0-nm波长偏移 的结合结果，该结果与用基于孔的测定获得的观察结果吻合。
实施例16
在比色共振反射光学生物传感器上证明DNA-DNA结合相互作 用
为了在比色共振反射光学生物传感器上证明杂交事件的检测，用 与固定的胸腺嘧啶的18个碱基的寡核苷酸序列(poly-T)杂交的腺 嘌呤的18个碱基的寡核苷酸序列(poly-A)进行实验，其中使用与 生物传感器片结合的无底96-孔平板。所述poly-A序列具有附着在它 的3′-末端的Cy-5标记，以便允许利用荧光验证结合。
具体地讲，首先用聚-苯丙氨酸-赖氨酸(PPL)(Sigma)对具有 疏水性TaO顶层的生物传感器进行涂覆；然后将所述生物传感器结 合在无底聚苯乙烯96-孔微量滴定板(Greiner)上。制备由3×SSC 缓冲液(Sigma)和0.1％SDS(Sigma)组成的杂交缓冲溶液。然后， 将9个孔(分成三组，每组三个孔)用于检查三种不同的分析物，每 一个重复三次。具体地讲，在第一和第二组孔中，添加溶解在水中的 10mM的poly-T(Oligos Etc.，Inc.)。在第三组孔中，固定来自T7 启动子区(New England BioLabs)的DNA。在固定之后，首先用杂 交缓冲液漂洗所有孔，然后，将杂交缓冲液添加到第一组孔中，从而 提供基线反应曲线。在第二组孔中，添加poly-A(具有Cy-5标记)， 以便诱导固定化的poly-T和poly-A之间的杂交。在第三组孔中，将 poly-A(具有Cy-5)添加到固定化的T7DNA上，以便产生非专一性 结合。
图36归纳了上述实验的结果。在图36A中，示出了来自poly-T、 poly-A和T7-启动子的结合量的曲线图。在图36B中，将相同的数据 作为终点与误差棒一起作图。从上述曲线中很容易看出，所述生物传 感器可以测量poly-T和poly-A之间的专一性杂交，以及区分上述强 的相互作用与较弱的非专一性相互作用。
实施例17
在比色共振反射光学生物传感器上证明蛋白-DNA相互作用
在另一种实施方案中，证实了利用比色共振反射光学生物传感器 检测蛋白和DNA之间的相互作用的能力。在这种场合下，T7启动 子DNA和T7RNA聚合酶之间的相互作用被用作例子。
使用与无底96-孔聚苯乙烯微量滴定板(Greiner)的底部结合的 TaO-涂覆的生物传感器，首先将聚-苯丙氨酸-赖氨酸(PPL)(Sigma) 用于对所述传感器表面进行涂覆。具体地讲，用PPL对12个孔进行 涂覆，将三个孔用于要分析的四种分析物中的每一种。
在第一组孔中，添加pH＝7.4的PBS缓冲液(Sigma)。在第二 组孔中，添加T7 RNA聚合酶(New England BioLabs)的反应缓冲 液。在第三组孔中，首先固定T7-启动子DNA(New England BioLabs)，然后添加溶解在反应缓冲液(New England BioLabs)中 的T7 RNA聚合酶。在第四组孔中，固定T7-启动子DNA，然后添 加反应缓冲液。原则上讲，T7反应缓冲液只应当提供非专一性反 应，除非同时存在T7 DNA和T7 RNA聚合酶。如图37所示，图中 就示出了这种情形。具体地讲，注意到在第175个时间步骤上，进行 漂洗处理，以便除去缓冲液影响；在该漂洗步骤之后，可以看出蛋白 -DNA相互作用仅发生在同时容纳有T7启动子DNA和T7 RNA聚合 酶的孔中。
实施例18
现有用于研究细胞-蛋白相互作用和其他细胞相互作用的技术是 耗时的和劳动密集型的，因为它们可能涉及很多步骤，包括放射性同 位素或荧光标记、洗涤、封闭和检测。参见，例如，表2。用于研究 细胞-蛋白相互作用和其他细胞相互作用的现有技术还会使用大量的 昂贵试剂。本发明提供了用于测定细胞相互作用的组合物和方法，本 发明的方法比常规方法更快，并且与常规方法相比需要使用更少的试 剂。
本发明的方法和组合物提供了无标记的、简单的、高通量测定， 以用于鉴定对特殊结合物质(包括蛋白)的细胞专一性、细胞迁移、 细胞趋化性、特殊结合物质-细胞相互作用、细胞-细胞外基质相互作 用和细胞-细胞相互作用。
在本发明的一种实施方案中，所述方法和组合物能够显著减少细 胞测定中试剂的使用。与微量滴定板完整细胞测定相比，试剂使用可 以减少至少100倍。更重要的是，本发明的简单的图像细胞测定可以 取代现有的耗时和劳动密集型细胞迁移测定，和细胞趋化性测定，具 有更高的精确度和可再现性。
由于生物分子和生物学细胞与生物传感器表面相互作用，所以比 色共振反射光学生物传感器技术对光学特性变化非常敏感。这一特征 提供了所述生物传感器在生物学应用中的重大优点，如研究生物分子 之间的相互作用，包括结合在细胞表面，如细胞表面受体或细胞表面 标记上的生物分子和生物分子之间的相互作用。由于比色共振反射光 学生物传感器技术直接检测生物相互作用，所以所述荧光标记、放射 性同位素标记或诸如酶和生物学基序的生物学标记是不需要的。比色 共振反射光学生物传感器细胞附着测定提供了直接检测分子和位于 细胞表面上的它的对应体之间的相互作用的新方法。比色共振反射光 学生物传感器细胞附着测定的原理是固定化的靶分子以及它在细胞 表面上的对应体之间的亲和力结合会导致细胞与所述生物传感器表 面相互作用，其中，可以检测这种相互作用。
本发明的一种实施方案提供了包含比色共振反射光学生物传感 器的容器，其中，所述比色共振反射光学生物传感器构成所述容器的 内表面。例如，所述比色共振反射光学生物传感器可以构成所述容器 的底面。将一种或多种特殊结合物质，如两种或两种以上特殊结合物 质固定在包括比色共振反射光学生物传感器的所述容器的内表面的 两个或两个以上不同位置上。在两个或两个以上不同位置上可能具有 不同量的一种特殊结合物质。例如，容器可以包括微量滴定板孔、试 管、培养皿或微流体通道。本发明的一种实施方案提供了包括一个或 多个微量滴定板孔的微量滴定板，其中，一个或多个微量滴定板孔的 底面包括比色共振反射光学生物传感器。可以将一种或多种特殊结合 物质固定在所述每一个微量滴定板孔的底面上的两个或两个以上不 同位置上。
本发明提供了检测一种或多种类型的细胞与一种或多种特殊结 合物质结合的方法。在本发明的一种实施方案中，将一种或多种类型 的细胞应用在容器内表面上。可以使用任何类型的细胞，例如，包括 原核细胞、真核细胞、人工细胞、细胞膜或人工细胞膜。例如，所述 细胞可以作为贴壁细胞在培养物中生长，或作为悬浮细胞在培养物中 生长。所述容器内表面包括比色共振反射光学生物传感器，其中，两 种或两种以上特殊结合物质固定在包括比色共振反射光学生物传感 器的所述容器的内表面的两个或两个以上的不同位置上。用光线照射 所述容器，并且检测每一个不同位置上的一种或多种峰波长值 (PWVs)。峰波长值(PWV)是与生物传感器结合的结合物质和/ 或细胞的相对量度。如果所述一种或多种细胞业已结合了特殊结合物 质的话，那么在结合所述一种或多种细胞的不同位置上会发生PWV 偏移。例如，与没有结合特殊结合物质的生物传感器部分或与仅结合 了特殊结合物质的生物传感器部分，或与特定基线PWV相比，所述 PWV偏移了。
例如，所述一种或多种特殊结合物质可以排列在包括比色共振反 射光学生物传感器的所述容器的内表面上的一系列不同位置上。所述 不同位置可以限定直径大约为50-500微米的一系列斑点。所述一种 或多种特殊结合物质可以在所述容器内表面上随机地排列。例如，可 以通过诸如物理吸附、化学结合、电化学结合、静电结合、疏水性结 合和亲水性结合的方法，将所述一种或多种特殊结合物质固定在包括 比色共振反射光学生物传感器的所述容器的内表面上。
本发明的另一种实施方案提供了检测一种或多种细胞与特殊结 合物质结合的方法。所述方法包括将一种或多种特殊结合物质，如两 种或两种以上特殊结合物质固定在容器内表面的两个或两个以上不 同位置上，其中，所述容器内表面包括比色共振反射光学生物传感 器，并且用光线照射所述容器。测定不同位置的一种或多种峰波长 值。将一种或多种细胞应用在所述容器内表面上。用光线照射所述容 器，并且检测每一个不同位置的一种或多种峰波长值。比较所述峰波 长。如果所述一种或多种细胞业已结合了特殊结合物质，那么在结合 了特殊结合物质的不同位置上的PWV会发生偏移。
在工作实施例中，包括线性光栅比色共振反射光学生物传感器作 为内表面的微量滴定板孔具有固定在生物传感器表面上的1μl的抗 人CD3和1μl的抗小鼠CD3单克隆抗体。参见图38和图39。对 所述微量滴定板孔进行扫描，并且分析抗体涂层。参见图39。在Jurkat 细胞(1×105)与生物传感器表面温育20分钟之后，扫描所述微量滴 定板孔，并且观察细胞附着模式，如图39所示。
该测定明确证实了Jurkat细胞能与业已用ahCD3对来自96孔 微量平板生物传感器孔的内侧涂覆的不同位置相互作用，并且没有观 察到来自使用抗小鼠CD3单克隆抗体的不同位置的可检测信号。例 如，所述细胞附着测定可用于鉴定参与细胞粘着、迁移、趋化性和入 侵的分子。该测定还可用于鉴定细胞表面分子，所述分子可调节例 如，细胞粘着、迁移、趋化性和细胞入侵。另外，所述测定可以提供 研究细胞-细胞相互作用、细胞-基质相互作用和细胞-分子相互作用的 新型工具。竞争细胞附着测定，可以提供药物筛选的新工具，以用于 鉴定专一性靶定参与细胞相互作用的分子的化合物。
表2   比色   荧光  放射性  同位素   本发明的   生物传感器   贴壁细胞   悬浮细胞   平板制备   涂覆平板   90分钟   90分钟  90分钟   30分钟   60分钟   封闭   30分钟   30分钟  30分钟   -   -   收获细胞   30分钟   30分钟  30分钟   30分钟   30分钟   标记细胞   荧光标记   -   45分钟   -   -   1uCi3[H]   -   -  12-16小时   -   -   洗涤   -   30分钟  30分钟   -   -   细胞粘着   温育   120分钟   120分钟  120分钟   120分钟   120分钟   洗涤   5XPBS   5XPBS  5XPBS   -   -   检测   10分钟：   用96％乙醇   固定细胞   -  -   -   -   30分钟：   染色0.1％   结晶紫   -  -   -   -   10分钟：   洗涤   -  -   -   -   10分钟：   裂解细胞   0.2％triton   10分钟：10％   FCS  3％SDS  裂解   -   -   读出   OD＝570nm   在荧光计平   板读出器中   读出  闪烁   直接实时   监控细胞   与传感器   表面的相   互作用   直接实时   监控细胞   与涂覆的   传感器的   相互作用   总测定   时间   (小时)   5.5小时   6小时  16-20小时   3小时   3.5小时
优先权
本申请是2002年9月9日提交的美国申请序号10/237,641的部 分继续申请，后者又是2002年8月26日提交的名称为“Amine Chemical Surface Activation Process And Test Method For A Plastic Colorimetric Resonant Biosensor”的美国申请序号10/227,908，和 2002年6月26日提交的名称为“Colorimetric Resonant Biosensor Microarray Readout Instrument”的美国申请序号10/180,374和2002 年6月26日提交的名称为“Colorimetric Resonant Biosensor Microtiter Plate Readout Instrument”的美国申请序号10/180,647的 部分继续申请，后者是2002年1月28日提交的美国申请序号 10/059,060，和2002年1月28日提交的美国申请序号10/058,626的 部分继续申请，后者是2001年8月15日提交的美国申请序号 09/930,352的部分继续申请，该申请要求以下申请的利益：2000年10 月30日提交的美国临时申请60/244,312；2001年4月12日提交的美 国临时申请60/283,314；和2001年7月3日提交的美国临时申请 60/303,028，以上所有申请都以它们的全文形式收作本文参考。