一种用于染色体异常检测的文库构建方法及试剂盒 |
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申请号 | CN201710650277.2 | 申请日 | 2017-08-01 | 公开(公告)号 | CN107217310A | 公开(公告)日 | 2017-09-29 |
申请人 | 安诺优达基因科技(北京)有限公司; | 发明人 | 洪燕; 白金蕾; 玄兆伶; 李大为; 梁峻彬; 陈重建; | ||||
摘要 | 本 发明 提供一种用于 染色 体 异常检测 的文库构建方法,通过对反应体系及反应条件的优化,实现了对 羊 水 、脐血等少量样本的文库构建,缩短患者在临床染色体异常检测的等待时间。 | ||||||
权利要求 | 1.一种用于染色体异常检测的文库构建方法,该方法包括: |
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说明书全文 | 一种用于染色体异常检测的文库构建方法及试剂盒技术领域[0001] 本发明属于基因检测领域,具体涉及一种适于少量样本的用于染色体异常检测的测序用文库构建方法及试剂盒。 背景技术[0002] 染色体是细胞核中的遗传物质,人类有23对染色体,其中22对为常染色体,1对为性染色体。染色体异常包括染色体结构异常和数目异常,由染色体异常导致的疾病,临床上表现为染色体病,在自发性流产、死胎、早夭中占50%以上,新生儿中发病率约1%,属于常见的出生缺陷。 [0003] 染色体数目异常指多1条或数条染色体、多1条或数条染色体片段,常见的染色体数目异常为13三体、18三体及21三体。在产前诊断中,染色体异常的主要检测技术包括:核型分析、比较基因组杂交技术(arrayCGH)、荧光原位杂交技术,但是由于羊水或脐带血中胎儿遗传物质较少,需要对遗传物质进行放大。如对于核型分析来说,该方法需经过细胞培养富集胎儿细胞,非常耗时耗力,病人等待报告的周期长。 [0004] 近年来,随着下一代高通量测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术的迅速发展,由于其存在分辨率高,通量大等优势,目前已经被广泛应用于染色体异常的分析。通过传统的建库方法能够检测染色体异常,还可发现新变异,但该方法通常要求较高的DNA样本起始量(100ng以上),当采集样本数量有限并无法获得足量DNA时(如临床采集又不经实验再放大的羊水、脐血等样本),通过现有的建库方法往往不能得到满足后续测序需求的文库产量。若可以实现不经细胞培养,而是直接利用羊水、脐血等少量样本进行建库并检测染色体异常,能够大大节约实验时间和检测成本,将会有很广阔的应用前景。 发明内容[0005] 鉴于上述现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一种能够适用于羊水等少量样本的用于染色体异常检测的测序用文库的构建方法及试剂盒。 [0006] 本发明人为解决上述问题进行了深入研究,结果发现通过优化反应体系及反应条件,实现构建适用于羊水少量样本的、染色体异常检测的测序用文库,从而完成了本发明。 [0007] 即,本发明包括: [0008] 1.一种用于染色体异常检测的文库构建方法,该方法包括: [0009] 步骤A:提取样本gDNA,获得gDNA; [0010] 步骤B:将所述gDNA进行酶切处理,纯化,获得酶切产物; [0011] 步骤C:将所述酶切产物进行末端修复,纯化,得到平末端DNA片段; [0012] 步骤D:将所述平末端DNA片段进行3'端加A,得到3'端加A的DNA片段; [0013] 步骤E:将所述3'端加A的DNA片段进行加接头,纯化,得到加接头的DNA片段; [0014] 步骤F:将所述加接头的DNA片段进行PCR扩增,纯化,得到扩增产物; [0015] 其中,步骤B中所述的酶切处理使用的酶为dsDNA Fragmentase; [0016] 步骤C中所述末端修复使用试剂包括:1μL T4DNA聚合酶,1μL T4多聚核苷酸激酶、5μL 10×多聚核苷酸激酶缓冲液及1μL dNTP; [0017] 步骤D中所述3'端加A使用试剂包括:0.5μL Klenow片段(3'-5'exo-)、2.5μL dATP及2.5μL 10×缓冲液; [0018] 步骤F中所述PCR扩增的扩增引物包括: [0019] Ann引物序列(SEQ ID NO:1): [0020] 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3' [0021] Index引物序列(SEQ ID NO:2): [0022] 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATANNNNNNNGTGACTGGAGTTC-3'; [0023] 其中,N为随机碱基。 [0024] 2.根据项1所述的文库构建方法,其中,所述步骤A中样本为羊水、脐血、全血、组织中任意一种。 [0025] 3.根据项1所述的文库构建方法,其中,所述步骤B中gDNA的量为8~15ng。 [0026] 4.根据项1所述的文库构建方法,其中,所述步骤B的酶切处理的条件为37℃50分钟。 [0027] 5.根据项1所述的文库构建方法,其中,所述步骤C的末端修复的条件为20℃30分钟。 [0028] 6.根据项1所述的文库构建方法,其中,所述步骤D的3'端加A的反应条件为37℃30分钟。 [0029] 7.根据项1所述的文库构建方法,其中,所述步骤F的PCR扩增条件为94℃预变性2分钟、(94℃变性15秒、62℃退火30秒、72℃延伸30秒)17个循环、72℃延伸10分钟、4℃保存。 [0030] 8.一种用于染色体异常检测的文库构建试剂盒,其用于实施项1~7中任一项所述的文库构建方法,其包括: [0031] 用于所述酶切处理的试剂; [0032] 用于所述末端修复的试剂; [0033] 用于所述3'端加A的试剂; [0034] 用于所述加接头的试剂; [0035] 用于所述PCR扩增的试剂; [0036] 用于所述纯化的试剂。 [0037] 发明效果 [0038] 通过本发明提供的文库构建方法和试剂盒,成功对临床采集的少量羊水、脐带血样本进行文库构建,实现了对少量羊水、脐带血样本的直接检测,既避免了细胞培养的实验耗时,极大的节约了染色体异常检测的时间和检测成本,提高了染色体异常检测结果的准确性。 [0039] 发明的具体实施方式 [0041] 首先,本发明提供一种用于染色体异常检测的文库构建方法,其包括: [0042] 步骤A:提取样本gDNA,获得gDNA; [0043] 步骤B:将所述gDNA进行酶切处理,纯化,获得酶切产物; [0044] 步骤C:将所述酶切产物进行末端修复,纯化,得到平末端DNA片段; [0045] 步骤D:将所述平末端DNA片段进行3'端加A,得到3'端加A的DNA片段; [0046] 步骤E:将所述3'端加A的DNA片段进行加接头,纯化,得到加接头的DNA片段; [0047] 步骤F:将所述加接头的DNA片段进行PCR扩增,纯化,得到扩增产物; [0048] 其中,步骤B中所述的酶切处理使用的酶为dsDNA Fragmentase; [0049] 步骤C中所述末端修复使用试剂包括:1μL T4DNA聚合酶,1μL T4多聚核苷酸激酶、5μL 10×多聚核苷酸激酶缓冲液及1μL dNTP; [0050] 步骤D中所述3'端加A使用试剂包括:0.5μL Klenow片段(3'-5'exo-)、2.5μL dATP及2.5μL 10×缓冲液; [0051] 步骤F中所述PCR扩增的扩增引物包括: [0052] Ann引物序列(SEQ ID NO:1): [0053] 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3' [0054] Index引物序列(SEQ ID NO:2): [0055] 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATANNNNNNNGTGACTGGAGTTC-3'; [0056] 其中,N为随机碱基,NNNNNNN为标签序列。在这里,标签序列可作为不同样本文库的标记,不同样本使用的标签序列不同,测序后将测序数据按照标签序列将样本数据进行区分。 [0057] 优选地,所述步骤A中样本为羊水、脐血、全血、组织中任意一种。 [0058] 在本发明中,所述低起始量是指DNA量在8~15ng。 [0059] 优选地,所述步骤A的羊水样本为未经培养的样本,gDNA的量为10ng。 [0060] 优选地,所述步骤B的酶切处理的条件为37℃50分钟。 [0061] 优选地,所述步骤C的末端修复条件为20℃30分钟。 [0062] 优选地,所述步骤D的3'端加A的反应条件为37℃30分钟。 [0063] 优选地,步骤F的PCR扩增条件为94℃2分钟、(94℃15秒、62℃30秒、72℃30秒)17个循环、72℃10分钟、4℃保存。 [0064] 优选地,本发明的文库构建方法中,步骤B与步骤C之间、步骤C与步骤D之间、步骤E和步骤F之间、步骤F之后还包括产物纯化步骤。本发明发明人发现,在步骤D和步骤E之间不进行纯化,可提高最后文库产量。对于本发明的纯化步骤,本发明技术领域人员可以采用传统建库中用于纯化的方法、试剂或装置来进行。 [0065] 在另一方面,本发明提供一种用于染色体异常检测的文库构建试剂盒(本发明的试剂盒),其可用于实施本发明的文库构建方法。该试剂盒包括: [0066] 用于所述酶切处理的试剂,例如dsDNA Fragmentase及相应的酶切反应缓冲液等; [0067] 用于所述末端修复的试剂,例如T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、dNTP、10×多聚核苷酸激酶缓冲液等; [0068] 用于所述3'端加A的试剂,例如缺失外切酶活性的Klenow片段及相应的反应缓冲液等; [0069] 用于所述加接头的试剂,例如接头、T4DNA连接酶及相应的连接反应缓冲液; [0070] 用于所述PCR扩增的试剂,例如KAPA HiFi HotStart ReadMix、Ann公共引物、Index引物等; [0072] 以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解,此处所描述的实施例是用于解释本发明,而非用于限定本发明。 [0073] 实施例1 [0074] 1.基因组(gDNA)提取 [0075] 取两份羊水样本,分别命名为样本1、样本2,各取2mL使用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(TIANGEN)进行基因组DNA提取,获得样本1gDNA、样本2gDNA。 [0076] 2.酶切处理 [0077] 样本1和样本2分别取10ng进行酶切处理,单个反应体系如下表1, [0078] 表1 [0079] [0080] 反应条件为37℃,50分钟;反应结束后,加入5μL,0.5M EDTA终止反应2分钟;加入2.5μL 10%SDS混匀后,取49.5μL纯化磁珠悬浮液(annoroad公司),70%乙醇洗两次,43μL ddH2O洗脱DNA,获得样本1/样本2酶切产物。 [0081] 3.末端修复 [0082] 对步骤2获得的酶切产物进行末端修复,反应体系如下表2, [0083] 表2 [0084] [0085] 反应条件为20℃,30分钟,取75μL纯化磁珠悬浮液,70%乙醇洗两次,20μL ddH2O洗脱DNA,获得样本1/样本2平末端DNA片段。 [0086] 4.3'端加A反应 [0087] 取步骤3中获得的平末端DNA片段按表3进行3'端加A反应,反应体系如下: [0088] 表3 [0089] [0090] 反应条件为37℃,30分钟,获得样本1/样本2 3'端加A的DNA片段。5.加接头反应[0091] 取步骤4中获得的3'端加A的DNA片段进行加接头反应,反应体系如下表4,[0092] 表4 [0093] [0094] 反应条件为20℃,15分钟,取78μL纯化磁珠悬浮液,70%乙醇洗两次,18μLddH2O洗脱DNA,得到样本1/样本2加接头DNA片段。 [0095] 6.PCR反应 [0096] 取步骤5中获得的加接头DNA片段,使用表5中的反应体系进行PCR,反应体系如下表,样本1使用Index1引物,样本2使用Index2引物, [0097] Index1引物序列(SEQ ID NO:3): [0098] 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCAATGGTGACTGGAGTTC-3' [0099] Index2引物序列(SEQ ID NO:4): [0100] 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAATCCGAAGTGACTGGAGTTC-3' [0101] 表5 [0102] [0103] 反应条件为: [0104] [0105] [0106] 取45μL纯化磁珠悬浮液,70%乙醇洗两次,81μLddH2O洗脱DNA,获得样本1/样本2PCR扩增产物(文库),完成文库构建。 [0107] 7.文库浓度测定 [0108] 使用Caliper和QPCR方法检测文库的峰图和浓度。 [0109] 分析结果如下表6,样本1文库产量为470nmol/L,样本2文库产量为695nmol/L,说明该方法成功建库,符合测序要求。 [0110] 表6 [0111] [0112] 实施例2 [0113] 使用550AR测序仪对步骤7中获得的文库进行测序,测序策略为SE50。通过对数据进行对比分析,得到测序数据如下表7,分析测序数据发现(如下表8)样本1中存在21三体,样本2羊水中存在18三体。 [0114] 为了进一步证明本发明的结果,使用核型分析的方法对样本1和样本2进行分析,分析发现样本1存在21三体,样本2存在18三体,结果与本发明方法获得文库的测序结果一致。 [0115] 表7 [0116] [0117] 表8 [0118] [0119] 还需要说明的是,在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下,在本说明书中作为某一技术方案的构成部分所描述的任一技术特征或技术特征的组合同样也可以适用于其它技术方案;并且,在可实施且不明显违背本发明的主旨的前提下,作为不同技术方案的构成部分所描述的技术特征之间也可以以任意方式进行组合,来构成其它技术方案。本发明也包含在上述情况下通过组合而得到的技术方案,并且这些技术方案相当于记载在本说明书中。 [0120] 上述说明示出并描述了本发明的优选实施例,如前所述,应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述发明构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域技术人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围,则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。 [0121] 工业实用性 [0122] 根据本发明,能够适用于羊水样本等少量样本的、染色体异常检测的文库构建方法及试剂盒。 |