肿瘤放射治疗毒性基因突变文库的构建方法 |
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| 申请号 | CN201710339037.0 | 申请日 | 2017-05-15 | 公开(公告)号 | CN107119331A | 公开(公告)日 | 2017-09-01 |
| 申请人 | 重庆市肿瘤研究所; | 发明人 | 辇伟奇; 唐万燕; 李丽仙; 王颖; 翁克贵; 张娜; 刘兴明; 何永鹏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种 肿瘤 放射 治疗 毒性基因突变文库的构建方法，其特征在于： 覆盖 人类肿瘤 放射治疗 毒性相关42个基因上总共61种遗传性变异位点。本发明的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要45分钟即可，可以十分有效的解决目前对于临床上患者接受肿瘤放射治疗前预测是否会发生较大毒 副作用 ，而需要对多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉。 | ||||||
| 权利要求 | 1.肿瘤放射治疗毒性基因突变文库的构建方法，其特征在于，覆盖人类基因XRCC1、TNFa、TXNRD2、ERCC2、TGFB1、VEGF、DNMT1、TP53、XRCC3、LIN28B、MTHFR、PON1、GSTP1、ATM、NOS2、APEX1、MLH1、IL8、CD44、LIG4、IL1A、TNF、CYP2C8、IL4、NEIL1、NBN、APC、NFKBIA、DEAD、Tpa、RAD51、NFE2L2、GSTA1、MGMT、TDG、GSK3B、FSHR、MYO3B、TGFBR2、5q31、HSPB1和TXN上的总共61种遗传性变异位点，具体包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 肿瘤放射治疗毒性基因突变文库的构建方法技术领域背景技术[0002] 恶性肿瘤是我国及全球主要的公共健康问题。在我国肿瘤死亡占全部死因的1/4。放射治疗对多种恶性肿瘤均有治疗作用，是常用的治疗方法之一。越来越多的患者通过放射治疗减轻了病痛，延长了生命。大约70％的恶性肿瘤患者，在其病程的某一时期需要不同目的的放射治疗参与，包括根治性放疗、辅助性放疗或姑息性放疗。放疗杀伤肿瘤细胞的机制是通过放射线作用于生物体产生刺激电子引电离损伤DNA分子，或通过射线与生物组织内水分子的作用产生自由基损伤DNA分子，当损伤超出细胞的修复能力是即导致细胞死亡和组织破坏。 [0003] 完美的肿瘤治疗方法最好是对肿瘤组织杀伤有效且无毒副作用。随着科学技术的发展，人们逐渐改善了传统放射治疗技术发展起能够更精准杀伤肿瘤组织的治疗方法，从而减少了正常组织在治疗中所受到的辐射剂量。但是临床实际肿瘤治疗中，放疗在杀伤恶性肿瘤细胞的同时，肿瘤附近的正常组织和器官也不可避免地受到放射性损伤，从而产生放射性治疗毒副作用。心脏毒性是最威胁患者生命的放疗毒副作用之一，放射诱发心脏病，属于晚期并发症,一般在放疗10-20年后出现；表现为心包炎、心肌病、心脏瓣膜病、传导异常和冠状动脉狭窄。在HD长期生存患者中，有2％-5％的患者最终死于心脏损伤性疾病而非原发疾病，心肌梗死则是这些肿瘤治愈后长期生存患者的主要死亡原因。放疗引起的毒副作用给患者带来了不同程度的痛苦，严重者还影响治疗的顺利进行。 [0004] 据预测80％对临床治疗反应的个体差异是有患者相关的个体因素导致的，确定这些因素可以预测患者发展严重毒副反应的风险。因此识别患者个体从放疗获得的副反应的易感性是肿瘤个体化放疗的一个重要先决条件。通过发现与患者放疗毒副作用相关的风险因子，评估患者相关因子的表达从而预测患者的放疗毒副反应易感性，可以对正常组织耐受放疗的患者通过增加肿瘤放射剂量来扩大治疗窗口；另一方面对正常组织毒副反应具有高风险的患者可能更改治疗方案、换成手术或化疗干预改善症状等，从而为患者提供有效且毒副反应小的治疗方案，改善患者的生存情况。 发明内容[0005] 针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种用于高通量测序检测的肿瘤放射治疗毒性基因突变文库的构建方法。 [0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案： [0007] 肿瘤放射治疗毒性基因突变文库的构建方法，覆盖人类基因XRCC1、TNFa、TXNRD2、ERCC2、TGFB1、VEGF、DNMT1、TP53、XRCC3、LIN28B、MTHFR、PON1、GSTP1、ATM、NOS2、APEX1、MLH1、IL8、CD44、LIG4、IL1A、TNF、CYP2C8、IL4、NEIL1、NBN、APC、NFKBIA、DEAD、Tpa、RAD51、NFE2L2、GSTA1、MGMT、TDG、GSK3B、FSHR、MYO3B、TGFBR2、5q31、HSPB1和TXN上的总共61种遗传性变异位点，具体包括如下步骤： [0008] (1)针对目的基因XRCC1、TNFa、TXNRD2、ERCC2、TGFB1、VEGF、DNMT1、TP53、XRCC3、LIN28B、MTHFR、PON1、GSTP1、ATM、NOS2、APEX1、MLH1、IL8、CD44、LIG4、IL1A、TNF、CYP2C8、IL4、NEIL1、NBN、APC、NFKBIA、DEAD、Tpa、RAD51、NFE2L2、GSTA1、MGMT、TDG、GSK3B、FSHR、MYO3B、TGFBR2、5q31、HSPB1和TXN上设计基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃； [0009] (2)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将扩增产物、多对第一不对称连接探针、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR，纯化后获得文库产物； [0010] (3)将文库产物组成所述用于高通量测序的基因变异文库； [0011] 上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。 [0012] 作为本发明的一种优选方案，所述基本扩增引物组包括FL-XRCC1-1-F、FL-XRCC1-1-R、FL-TNFa-1-F、FL-TNFa-1-R、FL-TXNRD2-1-F、FL-TXNRD2-1-R、FL-ERCC2-1-F、FL-ERCC2-1-R、FL-TGFB1-1-F、FL-TGFB1-1-R、FL-VEGF-1-F、FL-VEGF-1-R、FL-DNMT1-1-F、FL-DNMT1-1-R、FL-XRCC1-2-F、FL-XRCC1-2-R、FL-TP53-1-F、FL-TP53-1-R、FL-XRCC3-1-F、FL-XRCC3-1-R、FL-LIN28B-1-F、FL-LIN28B-1-R、FL-XRCC3-2-F、FL-XRCC3-2-R、FL-MTHFR-1-F、FL-MTHFR-1-R、FL-PON1-1-F、FL-PON1-1-R、FL-GSTP1-1-F、FL-GSTP1-1-R、FL-ATM-1-F、FL-ATM-1-R、FL-XRCC1-3-F、FL-XRCC3-1-R、FL-LIN28B-1-F、FL-LIN28B-1-R、FL-XRCC3-2-F、FL-XRCC3-2-R、FL-MTHFR-1-F、FL-MTHFR-1-R、FL-PON1-1-F、FL-PON1-1-R、FL-GSTP1-1-F、FL-GSTP1-1-R、FL-ATM-1-F、FL-ATM-1-R、FL-XRCC1-3-F、FL-XRCC1-3-R、FL-NOS2-1-F、FL-NOS2-1-R、FL-TGFB1-2-F、FL-TGFB1-2-R、FL-APEX1-1-F、FL-APEX1-1-R、FL-VEGF-2-F、FL-VEGF-2-R、FL-XRCC1-4-F、FL-XRCC1-4-R、FL-MLH1-1-F、FL-MLH1-1-R、FL-IL8-1-F、FL-IL8- 1-R、FL-CD44-1-F、FL-CD44-1-R、FL-LIG4-1-F、FL-LIG4-1-R、FL-IL1A-1-F、FL-IL1A-1-R、FL-TNF-1-F、FL-TNF-1-R、FL-CYP2C8-1-F、FL-CYP2C8-1-R、FL-IL1A-2-F、FL-IL1A-2-R、FL-IL4-1-F、FL-IL4-1-R、FL-IL4-2-F、FL-IL4-2-R、FL-NEIL1-1-F、FL-NEIL1-1-R、FL-NBN-1-F、FL-NBN-1-R、FL-APC-1-F、FL-APC-1-R、FL-NFKBIA-1-F、FL-NFKBIA-1-R、FL-DEAD-1-F、FL-DEAD-1-R、FL-ATM-2-F、FL-ATM-2-R、FL-IL8-2-F、FL-IL8-2-R、FL-ATM-3-F、FL-ATM-3-R、FL-tPA-1-F、FL-tPA-1-R、FL-TGFB1-3-F、FL-TGFB1-3-R、FL-RAD51-1-F、FL-RAD51-1-R、FL-NFE2L2-1-F、FL-NFE2L2-1-R、FL-GSTA1-1-F、FL-GSTA1-1-R、FL-MGMT-1-F、FL-MGMT-1-R、FL-ATM-4-F、FL-ATM-4-R、FL-TDG-1-F、FL-TDG-1-R、FL-TDG-2-F、FL-TDG-2-R、FL-GSK3B- 1-F、FL-GSK3B-1-R、FL-NOS2-2-F、FL-NOS2-2-R、FL-XRCC1-5-F、FL-XRCC1-5-R、FL-FSHR-1-F、FL-FSHR-1-R、FL-MYO3B-1-F、FL-MYO3B-1-R、FL-TGFBR2-1-F、FL-TGFBR2-1-R、FL-TGFBR2-2-F、FL-TGFBR2-2-R、FL-5q31-1-F、FL-5q31-1-R、FL-LIN28B-2-F、FL-LIN28B-2-R、FL-HSPB1-1-F、FL-HSPB1-1-R、FL-NBN-2-F、FL-NBN-2-R、FL-TXN-1-F和FL-TXN-1-R。 [0013] 作为本发明的另一种优选方案：XRCC1基因引物名称：FL-XRCC1-1-F，序列信息TTTTCTGCTGCAGGACACGACA；FL-XRCC1-1-R，序列信息TTTTCGCGCTTGCGCACTTTA； [0014] TNFa基因引物名称：FL-TNFa-1-F，序列信息TTTTCCCTCCCAGTTCTAGTTCTAT；FL-TNFa-1-R，序列信息TTTTCTTCTGGGCCACTGACTGATT； [0015] TXNRD2基因引物名称：FL-TXNRD2-1-F，序列信息TTTTCACATTGTCGTAGTCCATCAGA；FL-TXNRD2-1-R，序列信息TTTTGCAAAGGGTGATGGCATAGG； [0016] ERCC2基因引物名称：FL-ERCC2-1-F，序列信息TTTTAAGACTCAGGAGTCACCAGGA；FL-ERCC2-1-R，序列信息TTTTTCTGTTCTCTGCAGGAGGATC； [0017] TGFB1基因引物名称：FL-TGFB1-1-F，序列信息TTTTGTCAGGCTGGGAAACAAGGTA；FL-TGFB1-1-R，序列信息TTTTGGTGCTCAGTAAAGGAGAGCAA； [0018] VEGF基因引物名称：FL-VEGF-1-F，序列信息TTTTCCCAAATCACTGTGGATTTTG；FL-VEGF-1-R，序列信息TTTTCCCAAAAGCAGGTCACTCACT； [0019] DNMT1基因引物名称：FL-DNMT1-1-F，序列信息TTTTCCCAAACATAATCCCGGACTAT；FL-DNMT1-1-R，序列信息TTTTTAAGCATGTGCTTTGTTTCCTGT； [0020] XRCC1基因引物名称：FL-XRCC1-2-F，序列信息TTTTCTGGGACCACCTGTGTTCT；FL-XRCC1-2-R，序列信息TTTTCCGCATCGTGCGTAAGGA； [0021] TP53基因引物名称：FL-TP53-1-F，序列信息TTTTGGTTTTCTGGGAAGGGACAGA；FL-TP53-1-R，序列信息TTTTCGGACGATATTGAACAATGGTTC； [0022] XRCC3基因引物名称：FL-XRCC3-1-F，序列信息TTTTCGCATCCTGGCTAAAAATACGA；FL-XRCC3-1-R，序列信息TTTTATTCCGCTGTGAATTTGACAG； [0023] L I N 2 8 B 基 因 引 物 名 称 ：F L - L I N 2 8 B - 1 - F ，序 列 信 息TTTTTGAATTAAAACATGTAGCTGCTGAAG；FL-LIN28B-1-R，序列信息TTTTAAGAAACCTCTTTAACTAGGCATCA； [0024] L I N 2 8 B 基 因 引 物 名 称 ：F L - L I N 2 8 B - 1 - F ，序 列 信 息TTTTTGAATTAAAACATGTAGCTGCTGAAG；FL-LIN28B-1-R，序列信息TTTTAAGAAACCTCTTTAACTAGGCATCA； [0025] XRCC3基因引物名称：FL-XRCC3-2-F，序列信息TTTTAGTGTCCACTGACGGATAACAGA；FL-XRCC3-2-R，序列信息TTTTCCTAATCAGCTGTCAAGGGTGAT； [0026] MTHFR基因引物名称：FL-MTHFR-1-F，序列信息TTTTCACTCCAGCATCACTCACTTTG；FL-MTHFR-1-R，序列信息TTTTGGGAGCTGAAGGACTACTACCT； [0027] PON1基因引物名称：FL-PON1-1-F，序列信息TTTTATACTTGCCATCGGGTGAAATGT；FL-PON1-1-R，序列信息TTTTGCACTTTTATGGCACAAATGATCAC； [0028] GSTP1基因引物名称：FL-GSTP1-1-F，序列信息TTTTAGTGACTGTGTGTTGATCAGGC；FL-GSTP1-1-R，序列信息TTTTAGATGCTCACATAGTTGGTGTAGATG； [0029] ATM基因引物名称：FL-ATM-1-F，序列信息TTTTACTCATTTTTACTCAAACTATTGGG；FL-ATM-1-R，序列信息TTTTCGAAGACAGCTGGTGAAAAATCC； [0030] XRCC1基因引物名称：FL-XRCC1-3-F，序列信息TTTTCTACCACACCCTGAAGGATCTTC；FL-XRCC1-3-R，序列信息TTTTCTAATCTACTCTTTGTCTTCTCCAGT； [0031] NOS2基因引物名称：FL-NOS2-1-F，序列信息TTTTGGCTAGGAGTAGGACAACGGAA；FL-NOS2-1-R，序列信息TTTTTGGCCAGGTTTCCAGAAGAAAG； [0032] TGFB1基因引物名称：FL-TGFB1-2-F，序列信息TTTTGTAACCATCATGGGCCTTGTC；FL-TGFB1-2-R，序列信息TTTTTGTTCTGAGGACATGGGCAAA； [0033] APEX1基因引物名称：FL-APEX1-1-F，序列信息TTTTCTATTGATGCCTAATGCCTGAACT；FL-APEX1-1-R，序列信息TTTTCGAGTCAAATTCAGCCACAATCAC； [0034] APEX1基因引物名称：FL-APEX1-1-F，序列信息TTTTCTATTGATGCCTAATGCCTGAACT；FL-APEX1-1-R，序列信息TTTTCGAGTCAAATTCAGCCACAATCAC； [0035] VEGF基因引物名称：FL-VEGF-2-F，序列信息TTTTCACACCATCACCATCGACAGAA；FL-VEGF-2-R，序列信息TTTTGCAAGAAAAATAAAATGGCGAATC； [0036] XRCC1基因引物名称：FL-XRCC1-4-F，序列信息TTTTCGAGTCTAGGTCTCAACCCTAC；FL-XRCC1-4-R，序列信息TTTTCGGGACCTTAGAAGGTGACAGT； [0037] MLH1基因引物名称：FL-MLH1-1-F，序列信息TTTTCAACCCACAGAGTTGAGAAATTTG；FL-MLH1-1-R，序列信息TTTTAAGAGCCAAGGAAACGTCTAGATG； [0038] IL8基因引物名称：FL-IL8-1-F，序列信息TTTTTGTTCTAACACCTGCCACTCTAGT；FL-IL8-1-R，序列信息TTTTCGGAGTATGACGAAAGTTTTCTTTGA； [0039] CD44基因引物名称：FL-CD44-1-F，序列信息TTTTGGTCCCTGGGAGGAAATTTGAA；FL-CD44-1-R，序列信息TTTTGTGTCTCCCAGAAGCATCTGAAAA； [0040] L I G 4 基 因 引 物 名 称 ：F L - L I G 4 - 1 - F ，序 列 信 息TTTTAAGAATCTAAAAATTCCCTGAAGTGTCT；FL-LIG4-1-R，序列信息 TTTTTGCTTTACTAGTTAAACGAGAAGATTCAT； [0041] IL1A基因引物名称：FL-IL1A-1-F，序列信息TTTTCAGCCGTGAGGTACTGATCATT；FL-IL1A-1-R，序列信息TTTTCATTAATCTGCACTTGTGATCATGGTT； [0042] TNF基因引物名称：FL-TNF-1-F，序列信息TTTTGATGTGACCACAGCAATGGGTA；FL-TNF-1-R，序列信息TTTTCCCAGTGTGTGGCCATATCTTC； [0043] C Y P 2 C 8 基 因 引 物 名 称 ：F L - C Y P 2 C 8 - 1 - F ，序 列 信 息TTTTTCAATTGGGAACAACAGAGTTAACTCC；FL-CYP2C8-1-R，序列信息TTTTTGGAATTAGTTGGAATTTACATG； [0044] IL1A基因引物名称：FL-IL1A-2-F，序列信息TTTTAGAAGCCAGTGGCTAAGTTTGG；FL-IL1A-2-R，序列信息TTTTTTCATTTGCTAAGAGTCTGGTGTTCT； [0045] IL4基因引物名称：FL-IL4-1-F，序列信息TTTTCCCAAGTGACTGACAATCTGGT；FL-IL4-1-R，序列信息TTTTCCCATTAATAGGTGTCGATTTGCAGT；FL-IL4-2-F，序列信息 TTTTCCCAAACTAGGCCTCACCTGATA；FL-IL4-2-R，序列信息TTTTGTACAGGTGGCATCTTGGAAACT； [0046] NEIL1基因引物名称：FL-NEIL1-1-F，序列信息TTTTGGCTTCTCAACTCATGGTCTCT；FL-NEIL1-1-R，序列信息TTTTGATGGCTTCCCAGGTATTTGGT； [0047] NBN基因引物名称：FL-NBN-1-F，序列信息TTTTATCCTGAAACAAGCATTAAAGAGGGA；FL-NBN-1-R，序列信息TTTTCGTCCAATTGTAAAGCCAGAATATTTT； [0048] APC基因引物名称：FL-APC-1-F，序列信息TTTTGCGATGGATATATACGCAGGTAATTTT；FL-APC-1-R，序列信息TTTTCTTTCTTTGGCTATTTTTGATATGCCT； [0049] APC基因引物名称：FL-APC-1-F，序列信息TTTTGCGATGGATATATACGCAGGTAATTTT；FL-APC-1-R，序列信息TTTTCTTTCTTTGGCTATTTTTGATATGCCT； [0050] N F K B I A 基 因 引 物 名 称 ：F L - N F K B I A - 1 - F ，序 列 信 息TTTTAGTGTGCAGTGTGGATATAAGTACAC；FL-NFKBIA-1-R，序列信息TTTTTTTCAGCTGCCCTATGATGACTG； [0051] DEAD基因引物名称：FL-DEAD-1-F，序列信息TTTTTCCTTGCTTCCAGTTTTTCCACT；FL-DEAD-1-R，序列信息TTTTGGACTTTATCCACTGAAATGTGATA； [0052] ATM基因引物名称：FL-ATM-2-F，序列信息TTTTTGCGTGGCTAACGGAGAAAA；FL-ATM-2-R，序列信息TTTTGGGTCGCACACGACTGAATT； [0053] IL8基因引物名称：FL-IL8-2-F，序列信息TTTTGCCTACTATAAATAACACTGTGGTA；FL-IL8-2-R，序列信息TTTTCCCTTGACCTCAGTTAGTTCTTTGTT； [0054] ATM基因引物名称：FL-ATM-3-F，序列信息TTTTAGGGAAATCATAAAGTACGTGAGTCT；FL-ATM-3-R，序列信息TTTTATGCTTTCTATTTCTCAGCAAAAACA； [0055] tPA基因引物名称：FL-tPA-1-F，序列信息TTTTTAACACTGACAATAACCAAAACCAAG；FL-tPA-1-R，序列信息TTTTCCCAGGTCTGAGTGATCTCATTG； [0056] TGFB1基因引物名称：FL-TGFB1-3-F，序列信息TTTTGTAGCCACAGCAGCGGTAGC；FL-TGFB1-3-R，序列信息TTTTTTCCCTCGAGGCCCTCCTAC； [0057] RAD51基因引物名称：FL-RAD51-1-F，序列信息TTTTGCAACTCATCTGGGTTGTGC；FL-RAD51-1-R，序列信息TTTTCTCACACACTCACCTCGGTC； [0058] NFE2L2基因引物名称：FL-NFE2L2-1-F，序列信息TTTTGGGCTAAAGATTTGGACCCAG；FL-NFE2L2-1-R，序列信息TTTTGAATGGAGACACGTGGGAGTT； [0059] G S T A 1 基 因 引 物 名 称 ：F L - G S T A 1 - 1 - F ，序 列 信 息TTTTATAAGATCAGTACTTACTTTGTTAAA；FL-GSTA1-1-R，序列信息TTTTGAGTGGCTTTTCCCTAACTTGACT； [0060] MGMT基因引物名称：FL-MGMT-1-F，序列信息TTTTCCCATAGTTCAGTTCTCTGTGTAGG；FL-MGMT-1-R，序列信息TTTTCTAGCACGAGGTGGGCAGAGT； [0061] ATM基因引物名称：FL-ATM-4-F，序列信息TTTTTCTGTAATCTATAGCAGAGTAAAGCG；FL-ATM-4-R，序列信息TTTTAAAAACAAAAAGAGCTGACTACCCA； [0062] TDG基因引物名称：FL-TDG-1-F，序列信息TTTTCCCACATTGTTTCCTTTGAACAGA；FL-TDG-1-R，序列信息TTTTAGTCTATGGCATTCTGAAACAGCAA；FL-TDG-2-F，序列信息TTTTGTCTGAAGACACTTTTGATGATCAAG；FL-TDG-2-R，序列信息 TTTTCTCAGGACGTAAAGCAGTTTCTCA； [0063] G S K 3 B 基 因 引 物 名 称 ：F L - G S K 3 B - 1 - F ，序 列 信 息TTTTGTTTGCACAACTTCGTGAATCTACTC；FL-GSK3B-1-R，序列信息TTTTTGACCTTAAGTGCATGGACATTGG； [0064] NOS2基因引物名称：FL-NOS2-2-F，序列信息TTTTCGCCTCTGACAGATACACTCAG；FL-NOS2-2-R，序列信息TTTTCAATCTGCAATAACGCAATAGTGCAA； [0065] XRCC1基因引物名称：FL-XRCC1-5-F，序列信息TTTTCCAGGTCACTTTTGGATTCTGGT；FL-XRCC1-5-R，序列信息TTTTCCTCATGGTGTGTGTATCAGCA； [0066] FSHR基因引物名称：FL-FSHR-1-F，序列信息TTTTCCGAGAAATCCAGAAATCTAGACTTA；FL-FSHR-1-R，序列信息TTTTTCTACCCAGTGTATCATTCTGCTTACT； [0067] M Y O 3 B 基 因 引 物 名 称 ：F L - M Y O 3 B - 1 - F ，序 列 信 息TTTTCATGATCCTTTATACTGCCACCAGAA；FL-MYO3B-1-R，序列信息TTTTTGGCAAGTTAATGTCCAAGATGGAATT； [0068] TGFBR2基因引物名称：FL-TGFBR2-1-F，序列信息TTTTTCTGAATGCCCAGAAGACCTCT；FL-TGFBR2-1-R，序列信息TTTTGGGAAGCATGGAATATGACAAGAGTC；FL-TGFBR2-2-F，序列信息TTTTCCACATCCATTTGGTGCTTTTAATTGA；FL-TGFBR2-2-R，序列信息 TTTTCCAGTCGATAACTAAGAAGAAGCTACA； [0069] 5q31基因引物名称：FL-5q31-1-F，序列信息TTTTTTGATAACAGCAGAAGATAGAAGAGTT；FL-5q31-1-R，序列信息TTTTCTGTATTCCCAAGACAAAGCCTCA； [0070] LIN28B基因引物名称：FL-LIN28B-2-F，序列信息TTTTCAATTGTGTGAAGCCAGAGCAT；FL-LIN28B-2-R，序列信息TTTTACATTCCTACGACATGGAGACAAATG； [0071] HSPB1基因引物名称：FL-HSPB1-1-F，序列信息TTTTGCAATGCATGACTGTTACCATCATT；FL-HSPB1-1-R，序列信息TTTTGCAATCTAGTAATCTGGTGTGGTTGTTAG； [0072] NBN基因引物名称：FL-NBN-2-F，序列信息TTTTATTATTTCAGCCAGATGGCAGACT；FL-NBN-2-R，序列信息TTTTTCTGTAAAATAAGAATAGCAAAGGCAGT； [0073] TXN基因引物名称：FL-TXN-1-F，序列信息TTTTACATACCCAAGCTTCTTAAATGGAAACT；FL-TXN-1-R，序列信息TTTTCCTTATTTGAAATCCCAGCCTCAGAATT。 [0074] 作为本发明的又一种优选方案，在步骤(2)中，多重富集PCR的反应体系为： [0075] 1×PCR缓冲液 [0076] [0078] 一DNA富集反应组件，由第一扩增引物组组成； [0079] 一RingCap-Taq酶，由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成； [0080] 一管阳性质控品； [0081] 和一管阴性质控品。 [0082] 与现有技术相比，本发明具有如下优点： [0083] 1、本发明的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要45分钟即可，结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上预测患者接受肿瘤放射治疗是否发生较毒性，而需要对多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉。 [0084] 2、本发明的构建方法所制备的文库序列可被目前高通量测序系统识别并进行检测，从而实现文库构建进行核酸序列的检测的应用，该核酸检测可应用于目前多种高通量测序平台、基因芯片平台、杂交检测平台，见图1。 [0086] 图1为本发明的实施例构建的核酸文库进行高通量测序总数据图； [0087] 图2为本发明的实施例检测肿瘤放射治疗毒性基因突变的检测均一性结果图； [0088] 图3为本发明的实施例检测肿瘤放射治疗毒性基因突变的检测突变结果。 具体实施方式[0089] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。 [0090] 肿瘤治疗心脏毒性基因突变文库的构建方法，覆盖人类基因XRCC1、TNFa、TXNRD2、ERCC2、TGFB1、VEGF、DNMT1、TP53、XRCC3、LIN28B、MTHFR、PON1、GSTP1、ATM、NOS2、APEX1、MLH1、IL8、CD44、LIG4、IL1A、TNF、CYP2C8、IL4、NEIL1、NBN、APC、NFKBIA、DEAD、Tpa、RAD51、NFE2L2、GSTA1、MGMT、TDG、GSK3B、FSHR、MYO3B、TGFBR2、5q31、HSPB1和TXN上的总共61种遗传性变异位点。 [0091] 具体包括如下步骤： [0092] (1)针对目的基因XRCC1、TNFa、TXNRD2、ERCC2、TGFB1、VEGF、DNMT1、TP53、XRCC3、LIN28B、MTHFR、PON1、GSTP1、ATM、NOS2、APEX1、MLH1、IL8、CD44、LIG4、IL1A、TNF、CYP2C8、IL4、NEIL1、NBN、APC、NFKBIA、DEAD、Tpa、RAD51、NFE2L2、GSTA1、MGMT、TDG、GSK3B、FSHR、MYO3B、TGFBR2、5q31、HSPB1和TXN设计基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；所述扩增引物组包括FL-XRCC1-1-F、FL-XRCC1-1-R、FL-TNFa-1-F、FL-TNFa-1-R、FL-TXNRD2-1-F、FL-TXNRD2-1-R、FL-ERCC2-1-F、FL-ERCC2-1-R、FL-TGFB1-1-F、FL-TGFB1-1-R、FL-VEGF-1-F、FL-VEGF-1-R、FL-DNMT1-1-F、FL-DNMT1-1-R、FL-XRCC1-2-F、FL-XRCC1-2-R、FL-TP53-1-F、FL-TP53-1-R、FL-XRCC3-1-F、FL-XRCC3-1-R、FL-LIN28B-1-F、FL-LIN28B-1-R、FL-XRCC3-2-F、FL-XRCC3-2-R、FL-MTHFR-1-F、FL-MTHFR-1-R、FL-PON1-1-F、FL-PON1-1-R、FL-GSTP1-1-F、FL-GSTP1-1-R、FL-ATM-1-F、FL-ATM-1-R、FL-XRCC1-3-F、FL-XRCC3-1-R、FL-LIN28B-1-F、FL-LIN28B-1-R、FL-XRCC3-2-F、FL-XRCC3-2-R、FL-MTHFR-1-F、FL-MTHFR-1-R、FL-PON1-1-F、FL-PON1-1-R、FL-GSTP1-1-F、FL-GSTP1-1-R、FL-ATM-1-F、FL-ATM-1-R、FL-XRCC1-3-F、FL-XRCC1-3-R、FL-NOS2-1-F、FL-NOS2-1-R、FL-TGFB1-2-F、FL-TGFB1-2-R、FL-APEX1-1-F、FL-APEX1-1-R、FL-VEGF-2-F、FL-VEGF-2-R、FL-XRCC1-4-F、FL-XRCC1-4-R、FL-MLH1-1-F、FL-MLH1-1-R、FL-IL8-1-F、FL-IL8- 1-R、FL-CD44-1-F、FL-CD44-1-R、FL-LIG4-1-F、FL-LIG4-1-R、FL-IL1A-1-F、FL-IL1A-1-R、FL-TNF-1-F、FL-TNF-1-R、FL-CYP2C8-1-F、FL-CYP2C8-1-R、FL-IL1A-2-F、FL-IL1A-2-R、FL-IL4-1-F、FL-IL4-1-R、FL-IL4-2-F、FL-IL4-2-R、FL-NEIL1-1-F、FL-NEIL1-1-R、FL-NBN-1-F、FL-NBN-1-R、FL-APC-1-F、FL-APC-1-R、FL-NFKBIA-1-F、FL-NFKBIA-1-R、FL-DEAD-1-F、FL-DEAD-1-R、FL-ATM-2-F、FL-ATM-2-R、FL-IL8-2-F、FL-IL8-2-R、FL-ATM-3-F、FL-ATM-3-R、FL-tPA-1-F、FL-tPA-1-R、FL-TGFB1-3-F、FL-TGFB1-3-R、FL-RAD51-1-F、FL-RAD51-1-R、FL-NFE2L2-1-F、FL-NFE2L2-1-R、FL-GSTA1-1-F、FL-GSTA1-1-R、FL-MGMT-1-F、FL-MGMT-1-R、FL-ATM-4-F、FL-ATM-4-R、FL-TDG-1-F、FL-TDG-1-R、FL-TDG-2-F、FL-TDG-2-R、FL-GSK3B- 1-F、FL-GSK3B-1-R、FL-NOS2-2-F、FL-NOS2-2-R、FL-XRCC1-5-F、FL-XRCC1-5-R、FL-FSHR-1-F、FL-FSHR-1-R、FL-MYO3B-1-F、FL-MYO3B-1-R、FL-TGFBR2-1-F、FL-TGFBR2-1-R、FL-TGFBR2-2-F、FL-TGFBR2-2-R、FL-5q31-1-F、FL-5q31-1-R、FL-LIN28B-2-F、FL-LIN28B-2-R、FL-HSPB1-1-F、FL-HSPB1-1-R、FL-NBN-2-F、FL-NBN-2-R、FL-TXN-1-F和FL-TXN-1-R，其序列依次如SEQ ID 01～SEQ ID 122所示； [0093] (2)将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将扩增产物、多对第一不对称连接探针、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR，纯化后获得文库产物； [0094] (3)将文库产物组成所述用于高通量测序的肿瘤放射治疗毒性基因突变文库； [0096] 上述模板所来自的样品适用范围包括外周血标本。 [0097] 外周血样品，使用Qiagen公司外周血DNA提取试剂盒提取基因组DNA，具体步骤按试剂盒操作说明。每次提取外周血不少于1000μl。所提DNA溶于Tris-HCl(10mmol/L,pH8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，并确定浓度，用Tris-HCl溶液(10mmol/L,pH 8.0)调整DNA浓度到2ng/μl作为PCR扩增的模板。 [0098] 基于上述构建方法的试剂盒包括： [0099] 一DNA富集反应组件，由扩增引物组组成，每人份的DNA富集反应组件的配方如下表所示： [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] 一RingCap-Taq酶，由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成，比例为0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2，优选比例1:1:1； [0105] 一阴性质控品，具体为无核酸水； [0106] 和一阳性质控品，具体由10个阳性突变质粒序列野生型基因组DNA混合而成，浓度为2ng/μL。 [0107] 将上述试剂盒用前述的构建方法进行实验，来分析本发明的检测肿瘤放射治疗毒性基因突变的方法。分别用20份临床乳腺癌放射治疗过程无严重毒性的全血样品、20份临床乳腺癌放射治疗过程存在严重毒性的全血样本： [0108] 所述PCR反应体系的模板量(待测样品、阳性质控品和阴性质控品)为5uL，其余组分如下表所示： [0109] [0110] PCR扩增程序设置如下表： [0111] [0112] 上述PCR反应体系所得的扩增产物的纯化具体如下： [0114] 第一轮纯化步骤 [0115] (1)向每个样品反应管25μL产物中分别加入12.5μL(0.5x样本体积)的Agencourt AMPure XP试剂，上下吸取吹打5次，完全混匀重悬DNA； [0116] (2)室温孵育5分钟； [0117] (3)放置在磁力架上面，孵育5分钟，一直到溶液澄清； [0118] (4)小心地吸取上清液置于新的离心管，不要扰动磁珠；注意：上清液中含有扩增产物不要丢弃。 [0119] 第二轮纯化步骤 [0120] (1)向上述吸取的上清液25μL中加入30μL(1.2x样本体积)的Agencourt AMPure XP试剂，上下吸取吹打5次，完全混匀重悬DNA； [0121] (2)室温孵育5分钟； [0122] (3)放置在磁力架上面，孵育3分钟，一直到溶液澄清，小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠；注意：磁珠上含有扩增文库不要丢弃。 [0123] (4)加入150μl新鲜配制的70％乙醇，没过磁珠样品即可，离心管正反方向移动5次，然后磁力架上孵育2分钟，去除上清液； [0124] (5)重复上述步骤4，进行第二次洗涤； [0125] (6)确保乙醇液滴已全部从孔中吸走，将板放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥。 [0126] (7)将样品管从磁力架上拿开，在每孔中加入25μL TE(PH8.0)缓冲液充分浸润磁珠。充分振荡混匀，快速离心将液体收集到管底。(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)；注意：上清液含有扩增文库不要丢弃。 [0127] 将样品管置于磁力架上2分钟。上清液中含有扩增产物。取出20μL上清。 [0128] 上述纯化所得的扩增产物制备文库产物的PCR反应的模板量为5uL，其余组分如下表所示： [0129] [0130] PCR扩增程序设置如下表： [0131] [0132] [0133] PCR产物分别按纯化扩增产物方法进行纯化，制得文库产物。 [0134] 上述文库产物的检测具体如下： [0136] 前述40份全血样品以及阳性质粒经本发明的体系检测，只有阳性质粒和临床接受肿瘤放射治疗具有严重毒性的有检测到突变序列，而临床接受肿瘤放射治疗无严重毒性样品无突变序列，进一步证明了该方法的特异性，具体结果如图1至图3所示。 [0137] 重复性试验：每个反应分别加入突变细胞系DNA10ng、1ng和100pg，重复10次进行高通量测序检测，10次结果一致，符合率100％。 [0138] 以上可知本发明肿瘤放射治疗毒性基因文库构建反应就可以同时检测肿瘤放射治疗毒性基因61个遗传性变异位点，文库构建时间仅需3小时，因此本发明省时省力，准确性高，可满足突变的快速诊断。 |
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