一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法专利检索- 组合化学;化合物库如化学库虚拟库专利检索查询-专利查询网

一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法
申请号	CN201710288214.7	申请日	2017-04-27	公开(公告)号	CN106868597A	公开(公告)日	2017-06-20
申请人	河南牧业经济学院;			发明人	李文刚; 吴凤笋; 刘玲玲; 吕玉金; 赵迪; 樊淑华; 刘胜利; 陈志港; 郭敏; 李明亮;
摘要	本发明公开了一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法，包括以下步骤：(1)设计特异性引物和探针：以副猪嗜血杆菌的infB基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，副猪嗜血杆菌上游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，副猪嗜血杆菌下游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述的探针基因序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；(2)合成上述特异性引物和探针；(3)基因芯片的制备：用TE Buffer溶解合成探针，在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将基因芯片干燥。本发明操作简便易行，省去了已点样基因芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需2h，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，可用于大规模检测。
权利要求	1.一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)设计特异性引物和探针：以副猪嗜血杆菌的infB基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，副猪嗜血杆菌上游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，副猪嗜血杆菌下游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述的探针基因序列如序列表中SEQ ID NO：3所示； (2)对上述特异性引物和探针进行合成，制得合成探针； (3)基因芯片的制备：用TE Buffer溶解合成探针，在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将基因芯片干燥。 2.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的特异性引物浓度为10μM/L。 3.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的探针浓度为5μM/L-20μM/L。 4.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，其特征在于，步骤(3)中接触式点样的环境参数为相对湿度55％-65％，温度15℃-30℃。 5.根据权利要求1所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，干燥过程是静置于80℃烘箱干燥2小时。 6.一种如权利要求1-5任一所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)提取待测副猪嗜血杆菌细菌的基因组DNA； (2)杂交用PCR产物的制备：采用不对称PCR，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成分，然后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增。所述的反应体系为：5μl 5×Buffer，1μl上游引物，2μl下游引物，2.0μl dNTP，1.0μl模板DNA，0.3μl Prime STAR， 13.7μl ddH2O，总体积为25μl；PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃延伸5min； (3)杂交用PCR产物与用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片杂交：将杂交用PCR产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出冰浴5min，取杂交用PCR产物40μl和杂交缓冲液160μl加入离心管中，混匀后取该混合液加到基因芯片的点样区，将基因芯片放入杂交盒内，置于 49℃水浴锅中避光杂交2h； (4)杂交后基因芯片的洗涤与干燥：将杂交后基因芯片放置在玻片架上，立即用洗液洗涤三次，每次2min，离心干燥； (5)洗涤后基因芯片的结果分析：将洗涤后基因芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值。 7.根据权利要求6所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的使用方法，其特征在于，dNTP的浓度为10mmol/μl。 8.根据权利要求6所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的使用方法，其特征在于，所述的基因芯片三次洗涤所用洗液依次分别为1×SSC/0.2％SDS，0.1×SSC/0.2％SDS，0.1×SSC。 9.根据权利要求6所述的用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的使用方法，其特征在于，所述的基因芯片杂交结果判定的依据如下： (1)模板DNA的PCR扩增效果良好； (2)信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰； (3)检测基因芯片的杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，且SNR≥1.5。
说明书全文	一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法技术领域 [0001] 本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法。背景技术 [0002] 副猪嗜血杆菌(Haemophlius parasuis，HPS)是一种NAD依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德菌科(Pastteurellacea)嗜血杆菌属(Haemophilus)，有15种血清型，还有20％的菌株血清型无法确定。该菌能够引起猪的多发性浆膜炎、关节炎以及脑膜炎，由该菌引起的副猪嗜血杆菌病又称为猪革拉斯氏病( disease)。HPS可以影响2周龄～4月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，常见于5～8周龄，发病率可达40％，严重时死亡率可达50％。随着我国规模化养猪场的发展，HPS感染有明显增加趋势，已成为猪场保育仔猪发病率和死亡率增加的重要原因之一，每年给我国养猪业造成巨大经济损失。因此，建立一种副猪嗜血杆菌的检测技术，对于监控该菌的繁殖、疾病发生和流行以及疾病的及时防治都具有重要的意义。 [0003] 现有的副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)检测方法有病原学检测技术、血清学鉴定及分子生物学检测技术(如：PCR检测)等。微生物学检测方法是根据细菌的形态、培养特性和生化特性等进行鉴定。副猪嗜血杆菌在显微镜下呈长丝状或球杆状，大小为1.5μm×(0.3～0.4)μm，是革兰氏染色阴性小杆菌，且革兰氏染色常常呈现两极着色。该菌无鞭毛，不运动，无芽孢，通常有荚膜。Hps是需氧或兼性厌氧菌，在适宜的培养基上生长的菌落只有针尖大小，呈圆形、湿润、稍隆起的灰白色半透明状且表面光滑，边缘整齐。血清学的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接血凝试验(IH)、琼脂扩散试验、补体结合试验等。其中ELISA与间接血凝试验的应用最为广泛。PCR检测方法有很强的特异性和高度的敏感性。 [0004] 基因芯片作为检测手段，有高灵敏性、高度精确性、高信息量等优点，被应用于多种微生物的检测中，已建立有针对猪病致病菌的基因芯片的检测方法，但需要对已点样的基因芯片进行水化和预杂交处理，且所需杂交探针的浓度较高，检测成本高。发明内容 [0005] 本发明的目的是提供提供一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备及使用方法，可有效解决现有检测设备及方法耗时长，投入大的问题。 [0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： [0007] 一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的制备方法，包括以下步骤：(1)设计特异性引物和探针：以副猪嗜血杆菌的infB基因序列为靶序列，设计特异性引物和探针，副猪嗜血杆菌上游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，副猪嗜血杆菌下游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述的探针基因序列如序列表中SEQ ID NO：3所示； [0008] (2)对上述特异性引物和探针进行合成，制得合成探针； [0009] (3)基因芯片的制备：用TE Buffer溶解合成探针，在醛基化基片上接触式点样，点样完毕后将基因芯片干燥。 [0010] 作为本发明进一步的方案：步骤(2)中所述的特异性引物浓度为10μM/L。 [0011] 作为本发明进一步的方案：步骤(3)中所述的探针浓度为5μM/L-20μM/L。 [0012] 作为本发明进一步的方案：步骤(3)中接触式点样的环境参数为相对湿度55％-65％，温度15℃-30℃。 [0013] 作为本发明进一步的方案：步骤(3)中，干燥过程是静置于80℃烘箱干燥2小时。 [0014] 一种用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片的使用方法，包括以下步骤： [0015] (1)提取待测副猪嗜血杆菌细菌的基因组DNA； [0016] (2)杂交用PCR产物的制备：采用不对称PCR，先预混合反应体系中除下游引物以外的所有成分，然后在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增。所述的反应体系为：5μl 5×Buffer，1μl上游引物，2μl下游引物，2.0μl dNTP，1.0μl模板DNA，0.3μl Prime STAR，13.7μl ddH2O，总体积为25μl；PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s， 56℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃延伸5min； [0017] (3)杂交用PCR产物与用于检测副猪嗜血杆菌的基因芯片杂交：将杂交用PCR产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出冰浴5min，取杂交用PCR产物40μl和杂交缓冲液160μl加入离心管中，混匀后取该混合液加到基因芯片的点样区，将基因芯片放入杂交盒内，置于49℃水浴锅中避光杂交2h； [0018] (4)杂交后基因芯片的洗涤与干燥：将杂交后基因芯片放置在玻片架上，立即用洗液洗涤三次，每次2min，离心干燥； [0019] (5)洗涤后基因芯片的结果分析：将洗涤后基因芯片置于激光共聚焦扫描仪上扫描，分析Cy3荧光信号的强度和比值。 [0020] 作为本发明进一步的方案：dNTP的浓度为10mmol/μl。 [0021] 作为本发明进一步的方案：基因芯片三次洗涤所用洗液依次分别为1×SSC/0.2％SDS，0.1×SSC/0.2％SDS，0.1×SSC。 [0022] 作为本发明进一步的方案：基因芯片杂交结果判定的依据如下： [0023] (1)模板DNA的PCR扩增效果良好； [0024] (2)信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰； [0025] (3)检测基因芯片的杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，且SNR≥1.5。 [0026] 本发明与现有技术相比有如下有益效果： [0027] 本发明操作简便易行，省去了已点样基因芯片的水化处理和预杂交步骤，杂交只需2h，大大节省了时间，达到了快速检测的目的，采用5μm/L的探针浓度就可以达到较高的信号强度，降低了检测成本，可用于大规模检测。附图说明 [0028] 图1为本发明的副猪嗜血杆菌基因芯片点样示意图。具体实施方式 [0029] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0030] 实施例1 [0031] 1材料与方法 [0032] 1.1材料 [0033] 1.1.1标准菌株来源 [0034] 副猪嗜血杆菌由河南牧业经济学院惠赠。 [0035] 1.1.2芯片材料 [0036] 基因芯片基片采用醛基化基片，购自博奥经典生物技术有限公司。 [0037] 1.1.3试验仪器 [0038] 基因芯片点样仪美国Bio-Dot公司[0039] MILIPORE-21JO纯水机美国MILIPORE公司[0040] YEAR2000PCR仪英国Whatman Biometra公司[0041] DBT-07凝胶成像系统英国UVITEC公司[0042] MLTRA PR080型超高速冷冻离心机德国HermLer公司[0043] TGL-16C台式高速低温离心机德国Eppendorf公司[0044] 基因芯片扫描仪法国Innopsys公司[0045] -80℃超低温冰柜 Thermo公司 [0046] Tanon 2500全自动数码凝胶成像分析系统上海天能科技有限公司[0047] YJ-875 净化工作台苏州净化设备公司[0048] SHA-C水浴恒温振荡器江苏恒丰仪器厂[0049] DYY-31A型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂[0050] DBT-07凝胶成像系统英国UVITEC公司[0051] PCR扩增仪 Biometra公司 [0052] 1.1.4主要试剂和溶液 [0053] TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 大连宝生物工程有限公司[0054] ExTaqTM酶、DNA Marker DL500 大连宝生物工程有限公司[0055] 细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型) 北京索莱宝科技有限公司[0056] Proteinase K,Tritirachium album CALBIOCHEM [0057] BIOWEST AGAROSE SPECIFICATIONS[0058] 杂交缓冲液上海百傲生物科技有限公司[0059] 5×电泳储存液(5×TBE)、1.5％琼脂糖凝胶、20×SSC、10％SDS、基因芯片点样缓冲液、洗脱液均由本实验室配制。 [0060] 1.2方法 [0061] 1.2.1细菌的培养 [0062] 用接种环在无菌条件下取保存的细菌菌株，划线接种于巧克力平板上，置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h。当初步确定为Hps后，挑取单个菌落在5ml已加入5％胎牛血清的LB液体培养基(已高压灭菌)中接种，37℃，180rmp，培养24h。 [0063] 1.2.2细菌基因组DNA(即模板DNA)的提取及注意事项 [0064] 1.2.2.1提取细菌基因组DNA的步骤 [0065] 对上述培养的细菌采用北京索莱宝科技有限公司的细菌基因组DNA提取(离心柱型)试剂盒提取，具体步骤按照试剂盒说明书进行： [0066] (1)取细菌培养液1.5ml，12000rmp离心1min，尽量吸尽上清。 [0067] (2)向菌体沉淀中加入200μl溶液A，振荡至菌体充分悬浮，或用加样枪缓慢反复吹打数次，加入20μl终浓度为20mg/ml的溶菌酶，加入20μl 10mg/ml的RnaseA,37℃放置15min。 [0068] (3)向管中加入20μl 10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，65℃消化30-60min，期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。消化完全的标志是：液体清亮及粘稠。 [0069] (4)向管中加入200μl溶液B,充分混匀。如出现白色沉淀，可放65℃15-30min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致上柱后堵柱子。 [0070] (5)向管中加入200μl无水乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现絮状沉淀)，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，静置2min。 [0071] (6)12000rmp离心2min，弃掉废液，将吸附柱放入收集管中。 [0072] (7)向吸附柱中加入700μl漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇！)，12000rmp离心1min，弃掉废液,将吸附柱放入收集管中。 [0073] (8)向吸附柱中加入500μl漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇！)，12000rmp离心1min，弃掉废液,将吸附柱重新放入收集管中。 [0074] (9)12000rmp离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。 [0075] (10)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200μl经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rmp离心2min。 [0076] (11)将离心所得洗脱液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rmp离心2min， [0077] 即可得到高质量的细菌基因组DNA。 [0078] 1.2.2.2提取过程中的注意事项 [0079] (1)细菌培养液应避免反复冻融，最好用新培养的，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。 [0080] (2)若溶液A或溶液B中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，不影响实验结果。 [0081] (3)如果菌体沉淀消化不彻底，后imd离心步骤中可能会出现堵柱子的现象，可适当延长离心时间。 [0082] (4)洗脱缓冲液的体积最好不少于50μl，体积过小会影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率；回收的DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。 [0083] 1.2.3特异性引物的设计与合成 [0084] 以副猪嗜血杆菌的infB基因序列为靶序列，利用Primer Primer 5.0引物设计软件设计特异性引物和探针。副猪嗜血杆菌上游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，副猪嗜血杆菌下游引物基因序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述的探针基因序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。特异性引物和探针均在大连宝生物工程有限公司合成。特异性引物用TE Buffer稀释成10μM/L的浓度，置于-20℃冻存备用。 [0085] 1.2.4基因芯片的制备 [0086] 使用TE Buffer将合成的Hps的冻干探针(使用前要进行离心)稀释成100μM/L的母液，依次稀释成5μM/L(5μL探针+45μL灭菌水+50μL点样缓冲液)、10μM/L(10μL探针+40μL灭菌水+50μL点样缓冲液)、15μM/L(15μL探针+35μL灭菌水+50μL点样缓冲液)、20μM/L(20μL探针+30μL灭菌水+50μL点样缓冲液)。在96孔U形板的A1孔加入100μl点样缓冲液作阴性对照，A4孔加入100μl含荧光的PCR产物作阳性对照，A2、A3、A5、A6孔分别加入100μl 5μM/L、10μM/L、l5μM/L、20μM/L的探针。使用基因芯片点样仪(美国Bio-Dot-AD1500)预定程序对醛基基片进行喷点式点样。点样环境：相对湿度60％，温度25℃，各探针点间距为1.5mm；点样阵列根据实验要求设定为六矩阵，每个矩阵内点样为5×3，点样完毕的基因芯片置于盛有探针固定增效剂的湿盒内，置于80℃烘箱固定2h备用。 [0087] 1.2.5杂交用PCR产物的制备与鉴定 [0088] 对反应条件和参数逐个进行优化，确立最佳浓度和扩增反应条件，杂交用产物需采用不对称PCR。反应总体积为25μl，其组成如下： [0089] [0090] [0091] 试验时先预混合上述反应体系中除下游引物以外的所有成分，在暗室中加入下游引物，混匀后置于PCR仪进行扩增。 [0092] PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃延伸5min。 [0093] 取PCR扩增产物5μl与1μl 6×Lording Buffer，用10μl移液器混合均匀后，将枪头小心深入到加样孔中，注意不要伸到孔底部，以免穿透加样孔而导致样品外溢，缓慢推出使样品垂直落入加样孔中。 [0094] 加样结束后，盖上电泳槽盖，调节电压为5v/cm(80v)，关闭电泳室灯光，避光电泳20min。待电泳结束后，小心取出凝胶放置于UVI凝胶成像系统中，观察结果并拍照保存。 [0095] 1.2.6基因芯片的杂交 [0096] 将杂交用PCR产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即取出冰浴5min，取杂交用PCR产物40μl和杂交缓冲液160μl加于离心管中，混匀后取该混合液加到基因芯片的点样区，尽量避免产生气泡，将基因芯片放入杂交盒内，置于49℃水浴锅中避光杂交2h。 [0097] 1.2.7基因芯片的洗涤和干燥 [0098] 将杂交后基因芯片放置在玻片架上，立即用立即用洗液洗涤三次，每次2min，离心干燥，三次洗涤所用洗液分别为1×SSC与0.2％SDS混合物、0.1×SSC和与0.2％SDS混合物、0.1×SSC，洗涤在暗室中完成。 [0099] 1.2.8基因芯片的扫描及扫描结果分析 [0100] 将基因芯片置于InnoScan 700A高性能激光共聚焦扫描仪上扫描，如果背景较高可用洗液3(1×SSC)再洗涤一次，以TIF格式保存图像，然后再另存为为JPG格式图片。用MAPIX软件分析Cy3荧光信号的强度和比值，用以下三个条件作为基因芯片杂交结果判定的依据： [0101] (1)模板DNA的PCR扩增效果良好； [0102] (2)信号强度中位值≥1000，结合杂交扫描图像，杂交斑点清晰(清晰程度和杂交条件有很大关系)； [0103] (3)检测基因芯片杂交结果判断时引入样点信号阈值概念SNR，且SNR≥1.5。 [0104] 本发明工艺简单，能对副猪嗜血杆菌进行快速、灵敏的检测，经试验取得了满意的效果，有关试验结果如下： [0105] 1、PCR扩增结果 [0106] 以副猪嗜血杆菌基因组DNA为模板，与其特异性引物进行不对称PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析扩增片段大小约为169bp，与预计目的片段相同，特异性较好。 [0107] 2、基因芯片杂交结果 [0108] 将杂交用PCR产物置于PCR仪上98℃变性10min后，立即冰浴5min，取该产物40μl和杂交缓冲液160μl加于离心管中充分混合均匀，将该混合液全部加到基因芯片点样区，将基因芯片放入杂交盒内，置于49℃水浴锅避光杂交2h。杂交结果经扫描仪扫描，各杂交斑点的SNR值均大于1.5。 [0109] 结果表明，采用5μm/L的探针浓度就可以达到较高的信号强度，从而降低了检测成本，可用于大规模检测。 [0110] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。 [0111] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

意见反馈