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一种沟叶结缕草全长cDNA文库构建的方法
申请号	CN201611144264.X	申请日	2016-12-13	公开(公告)号	CN106754876A	公开(公告)日	2017-05-31
申请人	江苏省中国科学院植物研究所;			发明人	宗俊勤; 陈煜; 刘建秀; 陈静波; 李丹丹; 张兵;
摘要	本发明属于分子生物学领域，它涉及一种沟叶结缕草全长cDNA文库构建的方法。方法如下：提取盐胁迫处理下的沟叶结缕草总RNA，mRNA纯化，反转录成第一链cDNA，经过乙醇沉淀、RNA消化、乙醇沉淀获得高质量的第一链cDNA；富集带5’帽子结构的第一链cDNA及连接5’接头；cDNA第二链合成、分级分离与收集；BP重组到pDONR/Zeo入门载体；电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞中，构建了pDONR/Zeo‑cDNA文库。本发明为后续表达文库构建及优异基因开发提供基础，同时为其它植物文库构建提供技术参考。
权利要求	1.一种沟叶结缕草全长cDNA文库构建的方法，其特征在于沟叶结缕草cDNA文库的构建方法是按照以下步骤进行的：一、采用Trizol 法提取沟叶结缕草的总RNA，然后采用mRNA纯化试剂盒获得高质量mRNA；二、将步骤一的mRNA反转录成第一链cDNA，RNA消化并纯化获得高纯度cDNA；三、将步骤二得到的cDNA经过5’帽子抗体富集获得高质量全长cDNA；四、将步骤三得到的cDNA加上接头后合成cDNA第二链，经过分级分离并收集，形成高质量双链cDNA；五、将步骤四得到的双链cDNA与入门载体pDONR/Zeo进行BP重组；六、将步骤五得到的产物通过电转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，构建了pDONR/Zeo-cDNA在大肠杆菌DH10B中的文库，即完成沟叶结缕草全长未剪切cDNA文库的构建。 2.根据权利要求1所述的一种沟叶结缕草全长未剪切cDNA文库构建的方法，其特征在于步骤二中所述的反转录体系为：① mRNA 22.5μl，DEPC处理水 3μl，Biotin-attB2-Oligo(dT) Primer 2μl，反应条件为70℃处理7min，然后在15min内缓慢降至45℃；② 向①的产物中依次加入5×First Strand Buffer 10μl，0.1 M DTT 5μl，10 mM dNTPs 2.5μl，SuperScript III RT (200 U/μL) 5μl，混匀，反应条件依次为45℃ 20min，50℃ 20min，55℃ 20min。 3.根据权利要求1所述的一种沟叶结缕草全长cDNA文库构建的方法，其特征在于步骤三中所述的5’帽子抗体富集获得高质量全长cDNA的体系为：① 取300μl的TEN buffer和20μg 酵母tRNA重悬cap-antibody磁珠，置于室温孵育10min；② 取300ul TEN buffer重悬步骤二中的高纯度cDNA，然后加入到①的混合磁珠中，室温孵育60min，每隔20min混匀一次，静置弃上清；③ 将②的磁珠依次加入300ul TEN buffer、300μl的TENG buffer重悬、静置、弃上清；④ 取100μl的50 mM NaOH加入到③的磁珠中，重悬，37℃孵育10min，静置，取上清（100μl），加入到预先准备的100μl的1M Tris-HCl，中和NaOH，重复两次，共400μl，采用DNA柱纯化获取22μl全长cDNA第一链溶液。 4.根据权利要求1所述的一种沟叶结缕草全长未剪切cDNA文库构建的方法，其特征在于步骤五中的BP重组反应体系为：双链cDNA 14μl，pDONRZEO (150ng/uL) 2μl，BP Clonase® II enzyme mix 4μl，反应条件为25℃，20h。
说明书全文	一种沟叶结缕草全长cDNA文库构建的方法技术领域 [0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种沟叶结缕草全长cDNA文库构建的方法。背景技术 [0002] cDNA文库是以某种生物在特定时期、特定组织或特定处理下所表达的全部mRNA为模板，经反转录形成的混合cDNA与适当的载体进行连接或重组后，转化受体菌获得包括所有mRNA信息的cDNA克隆集合；近些年，cDNA文库成为基因挖掘或分子生物学研究的重要基础，如通过cDNA文库获取大量的EST序列，采用cDNA表达文库筛选获得优异的抗逆基因，利用cDNA 酵母双杂文库筛选获得互作蛋白。 [0003] 沟叶结缕草（Zoysia matrella）属禾本科（Gramineae）画眉草亚科（Chloridoideae）结缕草属植物，是优异的多年生暖季型草坪草，在世界范围内广泛应用，具有较高的经济价值和生态效应；同时，沟叶结缕草为盐生植物，是盐碱地宝贵的生物基因资源，其盐胁迫下cDNA文库构建的研究未见报道。发明内容 [0004] 本发明提供了一种沟叶结缕草全长cDNA文库的构建方法，本发明的技术问题可通过如下技术方案解决：1.采用Trizol 法提取总RNA，通过mRNA纯化试剂盒获得高质量mRNA； 2.将步骤1的mRNA反转录成cDNA，RNA消化，纯化获得高质量第一链cDNA； 3.采用cap-antibody磁珠富集步骤2中带5’帽子结构的第一链cDNA； 4.给步骤3中的cDNA加上5’接头后纯化，合成cDNA第二链，形成双链cDNA； 5.对步骤4中的双链cDNA进行分级分离及收集，获得高纯度的双链cDNA； 6.步骤5获得的双链cDNA与文库载体pDONR/Zeocin进行BP重组，电转大肠杆菌DH10B，即完成沟叶结缕草全长未剪切cDNA文库的构建。 [0005] 有益效果：1．本发明提供的沟叶结缕草全长cDNA表达文库，可直接用于测序、功能基因组学研究，用于优异基因的规模化筛选； 2．本发明提供的文库构建的方法，可为其他植物文库构建提供参考。附图说明 [0006] 图1 为具体实施方式1中提取的沟叶结缕草植株（包括根茎叶）的总RNA（a）及mRNA纯化（b）检测的电泳图及浓度检测图；图2 为具体实施方式7中的文库浓度检测及PCR检测，a：取电转化菌液10µL按照1:100稀释取50µL涂布平板后，长出的克隆；b：随机挑选32个克隆，PCR检测其插入片段大小。具体实施方式 [0007] 1. RNA提取与mRNA纯化。 [0008] 采用水培法进行盐处理，取300 mM NaCl的Hoagland 营养液处理10 d后的沟叶结缕草植株，采用Trizol RNA试剂盒（Invitrogen）提取根、茎、叶的总RNA，采用1%凝胶电泳检测RNA条带清晰，Thermo nanodrop 核酸分析仪定量结果表明（图1a），RNA浓度为884.6ng/µL，A260/A280为1.93，总体积600µL，RNA总量达到520µg。采用Dynabeads® mRNA Purification Kit（Invitrogen）分离纯化mRNA，检测结果表明（图1b），mRNA在1-5kb呈现弥散条带，mRNA浓度达到12.8 ng/µL，A260/A280为2.17，总体积400µL，mRNA总量达到5.12µg。这些结果均达到文库构建的要求。 [0009] 2. 第一链cDNA合成及RNA消化。 [0010] 取实施方式1中得到的mRNA，经乙醇沉淀，溶于22.5 µL DEPC水中，按下表在0.2ml RNase free tube中配置引物反应体系：70℃处理7min，然后在15min内缓慢降至45℃；按下表依次加入：混匀后并运行以下程序：45℃ 20min，50℃ 20min，55℃ 20min。然后经乙醇沉淀，溶于 179µL DEPC水中。按下列体系进行RNA消化处理： 37℃孵育30min；然后经酚抽提和乙醇沉淀，最后用300µL TEN buffer重悬cDNA沉淀，获得高质量cDNA第一链。 [0011] 3. 富集带5’帽子结构的一链cDNA。 [0012] ① 取充分混匀的cap-antibody（Invitrogen）磁珠300µl，于磁架上静置2min、去上清，用300µL的TEN buffer（10 mM Tris-HCl，pH 7.5；0.1 mM EDTA；25 mM NaCl）重悬洗涤2次，去上清后，加入300µL的TEN buffer和20µg的酵母tRNA重悬磁珠，置于室温孵育10min。 [0013] ② 重悬①的磁珠，加入实施方式2中获得的300µL高质量cDNA第一链，室温孵育60min，每隔20min混匀一次；然后于磁架上静置2min、去上清；用300µl的TEN buffer重悬洗涤2次，去上清后，加入300µL的TENG buffer（10 mM Tris-HCl，pH 7.5；0.1 mM EDTA；25 mM NaCl；1 mM GDP）重悬cap-antibody磁珠并转入新的1.5ml离心管中，静置，去上清。 [0014] ③ 加入100µL的50 mM NaOH重悬②的磁珠，于37℃孵育10min，静置、取上清置于新的离心管中，即为洗脱的cDNA；然后加入100µL的1M Tris-Hcl（pH7.0）中和cDNA中的NaOH。重复两次，最后收集的洗脱液管中溶液总体积为400µL。 [0015] ④ 采用DNA柱纯化试剂盒，纯化400µL洗脱液，用22µL的DEPC水过柱洗涤获得全长筛选富集的cDNA第一链溶液。 [0016] 4. 加5’接头及双链cDNA合成。 [0017] 加入以下产物置于PCR仪上，95℃ 10分钟，立即从PCR仪上取出，置于室温，放置30分钟，合成attB1 adapter接头；将具体实施方式3中获得的22µL的cDNA第一链溶液中依次加入以下试剂用枪混匀后置于16℃孵育24小时，然后采用DNA柱纯化试剂盒纯化，用80µL的DEPC水过柱洗涤获得带接头的cDNA第一链溶液；按照以下体系合成cDNA第二链，形成双链cDNA溶液 68℃ 20 min，72℃ 20 min，置于冰上待用。 [0018] 5. cDNA分级分离及收集。 [0019] 向具体实施方式3中获得的100µl的双链cDNA中加入50µL的TEN buffer，混匀后加入分级柱（Invitrogen）中，收集全部滤过液到1号收集管；然后向分级柱中加入250µL的TEN buffer，收集全部滤过液到2号收集管；向分级柱中加入50µL的TEN buffer，收集全部滤过液到3号收集管；向分级柱中加入100µL的TEN buffer，收集全部滤过液到4号收集管；向分级柱中加入100µL的TEN buffer，收集全部滤过液到5号收集管；取2号收集管的产物，经乙醇沉淀，用14µL溶解cDNA双链，用于下一步反应。 [0020] 6．BP重组及电转化。 [0021] 按下表加入各成分：混匀后置于25℃，20小时。然后加入2µL的ProreinaseK，37℃，15min；75℃，10min。再经乙醇沉淀，用8µL的TE Buffer溶解cDNA；将纯化的2uL重组产物和50µL电转感受态细胞DH10B混合加入预冷电转杯，冰上置45min；于TX ECM 630电转化仪上电击转化，其条件设置为：电击后迅速向电转杯中加入SOC培养基1mL，将电转物取入到新的15mL离心管，置于37℃，225-250rpm摇床培养1小时；培养结束后，此即为全长未剪切cDNA文库菌液。 [0022] 7．文库质量检测。 [0023] 取菌液10µL按照1:100稀释取50µL涂布平板用于库容量鉴定、插入片段大小评价及测序检测；经检测（图2a），转化平板的菌液浓度为：CFU/ml= 500/50µL ×100 × 1000µL6 6 =1×10cfu/mL，共电转3次，共获得3mL菌液，总克隆数CFU达到3×10 个；随机挑选32个克隆进行PCR扩增检测，其检测体系为：其PCR扩增条件为：其检测结果如图2b，重组率达到100%，平均插入片段大小为1.59kb。另外，也通过测序，BLASTX分析表明，16个克隆序列（SEQ ID NO. 6-21）中均包括了预测的起始密码子序列，全长率达到100%。 [0024] 综上所述，本发明成功构建了高质量的沟叶结缕草全长cDNA文库，不仅为开展沟叶结缕草功能基因组学研究奠定了新思路，同时也为其它植物文库构建提供了新方法。

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