引物组合物、其用途、构建文库和确定核酸序列的方法 |
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| 申请号 | CN201611037080.3 | 申请日 | 2016-11-22 | 公开(公告)号 | CN106636063A | 公开(公告)日 | 2017-05-10 |
| 申请人 | 广州精科医学检验所有限公司; | 发明人 | 曾晓静; 高晓峘; 韩颖鑫; 张印新; 李胜; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供引物组合物、其用途、构建文库及确定核酸序列的方法，其中该引物组合物包含：第一引物组，第一引物组包含第一正向引物和第一反向引物，第一正向引物包括目标区域特异性正向引物和第一接头；第一反向引物包括目标区域特异性反向引物、反向文库标签和第二接头；第二引物组，第二引物组包含第二正向引物和第二反向引物，第二正向引物包含第一 退火 ，第二反向引物包含第二退火；第一接头与第二正向引物中的第一退火以及第二接头与第二反向引物中的第二退火相互退火互补，第一接头与第二正向引物以及第二接头与第二反向引物经PCR扩增后的产物包含完整的测序接头。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种引物组合物，其特征在于，包含： |
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| 说明书全文 | 引物组合物、其用途、构建文库和确定核酸序列的方法技术领域背景技术[0002] 免疫球蛋白、T细胞受体和HLA等是人类基因组中最活跃的分子，免疫大分子的多样性使得机体能识别并清除无数的外来物质、清除体内产生的部分代谢物甚至凋亡或者衰老的细胞，且保持着机体免疫系统的平衡。免疫系统是机体抵御病原菌入侵与免疫调节的重要系统，对其研究具有很重要的意义。由于免疫大分子巨大的多样性，使得对免疫大分子的研究充满挑战和困难。最近发展起来并持续受欢迎的免疫组库技术被用于研究免疫组库。免疫组库即是指多样性的免疫细胞在一个个体内某一时刻的总和，而这些总和反应了个体遗传因素、抗原接触史、周围环境和个体的免疫调控。目前对免疫组库的研究集中于B细胞受体可变区的序列和T细胞受体可变区的序列，主要通过在V基因骨架区和C区或J区的保守区区域设计引物富集目的序列，采用的方法包括多重PCR、arm-PCR和5’RACE，然后采用生物信息学的方法对目的序列进行序列长度，序列多样性、序列异同性等多维度的分析。 [0003] 目前来说，若要研究这些巨大多样性的区域，必须将这些区域从基因组或者total RNA水平富集并分离出来。多重PCR方法是在上下游保守的位置设计多重引物富集目的片段，使用的循环数常常较高，而该富集过程中无法回避的一个问题就是多重引物在PCR过程由于每对引物扩增效率不一致而带来的偏好性，使得富集的产物部分失真，与真实情况存在一定的差异，并且很难从生物信息学水平来矫正这部分的失真，因此需要采取方法降低多重引物PCR的循环数。 [0004] 目前的PCR扩增富集目标区域一方面需要在正反向引物之间增加一段外源序列来实现退火互补，循环次数多，后续测序时数据量增加，增加了测序成本，另外一方面还需借助高通量芯片等辅助设备进行PCR扩增。此外，现有技术只能在PCR富集时才能将文库标签加入样品中，一旦实验过程中出现样品间相互污染，即无法识别被污染的样品。 发明内容[0005] 本发明的目的在于，通过不断优化引物设计，PCR反应体系和PCR热循环程序等，提出一种与现有引物及方法相比，能有效降低多重引物的偏好性，使得测序数据更精准，无需特定设备辅助即可进行PCR扩增富集目标区域的引物组，及使用所述引物组一步完成构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法。 [0006] 因此，本发明一方面提供一种引物组合物，包含： [0007] 第一引物组，所述第一引物组包含第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物包括目标区域特异性正向引物和第一接头； [0008] 所述第一反向引物包括目标区域特异性反向引物、反向文库标签和第二接头，所述反向文库标签位于目标区域特异性反向引物5’端和第二接头之间； [0009] 第二引物组，所述第二引物组包含第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物包含第一退火，所述第二反向引物包含第二退火； [0010] 所述第一接头与所述第二正向引物中的第一退火相互退火互补，所述第一接头与所述第二正向引物经PCR扩增后的产物包含第一完整测序接头； [0011] 所述第二接头与所述第二反向引物中的第二退火相互退火互补，所述第二接头与所述第二反向引物经PCR扩增后的产物包含第二完整测序接头。 [0012] 本发明另一方面提供上述引物组合物，在免疫组库研究中的用途。 [0013] 本发明另一方面还提供一种构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，包括采用上述引物组，对待测样品包含目标区域的核酸样本进行PCR扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述待测样品目标区域核酸测序文库。 [0014] 本发明另一方面还提供一种确定待测样品目标区域核酸序列的方法，包括以下步骤： [0015] 采用上述构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，构建待测样品的目标区域核酸测序文库； [0016] 对所述待测样品的目标区域核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果； [0017] 以及基于所述测序结果，确定待测样品目标区域核酸的序列。 [0018] 本发明另一方面还提供一种同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列的方法，包括以下步骤： [0019] 针对所述多个待测样品中的每一个，分别独立地采用上述构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，构建待测样品的目标区域核酸测序文库，其中，所述多个待测样品的正/反文库标签互不相同，所述多个为至少2个； [0020] 将所述多个待测样品的目标区域核酸测序文库混合，以获得混合文库； [0021] 对所述混合文库进行测序，以获得测序结果，所述测序结果包括所述多个待测样品的目标区域核酸文库序列和所述正/反文库标签； [0022] 以及基于所述正/反文库标签对所述多个待测样品的目标区域核酸测序文库序列进行区分，并确定所述多个待测样品的每一个的目标区域核酸序列。 [0023] 利用本发明设计的引物组合物无需添加任何外源序列作为PCR结合位置，而是直接使用测序平台的接头的全部或部分作为引物的退火互补区，提高了测序数据的有效率，使得测序结果更加精准，减少了测序成本，降低了数据分析的难度。并且通过第二正/反向引物对产物起到主要富集作用，第二正/反向引物为单一引物，不会引入扩增偏好，能够有效降低多重引物的偏好性。此外本发明的构建文库的方法与现有方法相比，在反转录时即给每个样品加了样品文库标签，避免了后续实验过程中样品间的相互污染。并且无需单管或高通量芯片等特定设备辅助PCR反应，使用普通的PCR设备即可完成产物的富集过程，操作简单，成本低、减低样品损失，效率高，循环次数少，耗时短，减少人为操作误差，测序结果准确、可靠，可重复性好。附图说明 [0024] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中 [0025] 图1是本发明一实施例中第一反向引物对mRNA进行反转录的示意图。 [0026] 图2是本发明一实施例中第一正向引物和第二引物组对cDNA 1st进行PCR的示意图。 [0027] 图3是本发明另一实施例中第一正向引物和第二引物组对cDNA 1st进行PCR的示意图。 [0028] 图4是本发明一实施例中确定待测样品目标区域核酸序列的方法的流程示意图。 [0029] 图5是本发明一实施例中同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列的方法的流程示意图。 具体实施方式[0030] 下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。 [0031] 需要说明的是，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”、“第四”的特征可以明示或者隐含地包括一个或更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。 [0032] 根据本发明的一个方面，本发明提供一种引物组合物，该引物组合物包含： [0033] 第一引物组，所述第一引物组包含第一正向引物和第一反向引物，所述第一正向引物包含目标区域特异性正向引物和第一接头； [0034] 所述第一反向引物包括目标区域特异性反向引物、反向文库标签和第二接头，所述反向文库标签位于目标区域特异性反向引物5’端和第二接头之间； [0035] 第二引物组，所述第二引物组包含第二正向引物和第二反向引物，所述第二正向引物包含第一退火，所述第二反向引物包含第二退火； [0036] 所述第一接头与所述第二正向引物中的第一退火相互退火互补，所述第一接头与所述第二正向引物经PCR扩增后的产物包含第一完整测序接头； [0037] 所述第二接头与所述第二反向引物中的第二退火相互退火互补，所述第二接头与所述第二反向引物经PCR扩增后的产物包含第二完整测序接头。 [0038] 根据本发明的实施例，利用本发明设计的引物组合物无需添加任何外源序列作为PCR结合位置，而是直接使用接头中的全部或部分作为引物的退火互补区，提高了测序数据的有效率，使得测序结果更加精准，减少了测序成本，降低了数据分析的难度。并且通过第二正/反向引物对产物起到主要富集作用，第二正/反向引物为单一引物，不会引入扩增偏好，能够有效降低多重引物的偏好性。 [0039] 根据本发明的实施例，所述第一正向引物还包括正向文库标签，所述正向文库标签位于目标区域特异性正向引物5’端和第一接头之间。 [0040] 所述文库标签用于区分不同样品文库，能够在进行PCR扩增后，将多个样本的PCR产物进行混合测序，进而基于文库标签的不同，对各序列的样本来源进行区分。例如index/barcode标签，所述文库标签的长度为6～12bp。 [0041] 根据本发明的实施例，所述正/反文库标签可以相同也可以不同。优选的，正/反文库标签相同。 [0042] 根据本发明的实施例，所述第一接头与所述第一退火可以相同也可以不同，优选的，所述第一接头与第一退火相同。 [0043] 根据本发明的实施例，所述第二接头与所述第二退火可以相同也可以不同，优选的，所述第二接头与第二退火相同。 [0044] 根据本发明的实施例，所述第一退火和第二退火的长度均为16-25bp。 [0045] 根据本发明的实施例，所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含第一完整测序接头。优选的，所述第二正向引物即为第一完整的测序接头。 [0046] 根据本发明的实施例，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含第二完整测序接头。优选的，所述第二反向引物即为第二完整的测序接头。 [0047] 根据本发明的一个具体示例，所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P5测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P7测序接头。优选的，所述第一完整测序接头为illumina测序平台的P5测序接头。所述第二完整测序接头为illumina测序平台的P7测序接头。 [0048] 或者所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P7测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P5测序接头。优选的，所述第一完整测序接头为illumina测序平台的P7测序接头，所述第二完整测序接头为illumina测序平台的P5测序接头。 [0049] 根据本发明的一个具体示例，所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含Ion Torrent/Proton测序平台的P1测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含Ion Torrent/Proton测序平台的A测序接头。优选的，所述第一完整测序接头为Ion Torrent/Proton测序平台的P1测序接头，所述第二完整测序接头为Ion Torrent/Proton测序平台的A测序接头。 [0050] 根据本发明的一个具体示例，所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含454测序平台的A测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含454测序平台的B测序接头。优选的，所述第一完整测序接头为454测序平台的A测序接头，所述第二完整测序接头为454测序平台的B测序接头。 [0051] 根据本发明的一个具体示例，当所述第一正向引物不包含正向文库标签时，用于Ion Torrentt/Proton测序平台。 [0052] 根据本发明的一个具体示例，当所述第一正向引物包含正向文库标签时，用于illumina测序平台或454测序平台。 [0053] 根据本发明的实施例，所述目标区域特异性正向引物和所述目标区域特异性反向引物的长度为18-25bp。 [0054] 根据本发明的实施例，所述目标区域特异性正向引物包括B细胞受体或T细胞受体的V基因保守区的特异性引物，所述目标区域特异性反向引物包括B细胞受体或T细胞受体的C基因保守区的特异性引物。 [0055] 根据本发明的一个方面，本发明提供上述引物组合物在免疫组库研究中的用途。 [0056] 根据本发明的另一方面，本发明提供一种构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，包括利用上述引物组，对待测样品包含目标区域的核酸进行PCR扩增，以获得扩增产物，所述扩增产物构成所述待测样品目标区域核酸测序文库。 [0057] 根据本发明的实施例，所述第一正向引物和第二正向引物的摩尔比为1:1～1:10，所述第一正向引物与第二正向引物之和与第二反向引物的摩尔比为1:1。 [0058] 根据本发明的实施例，所述PCR反应体系为： [0059] [0060] [0061] 根据本发明的实施例，所述PCR反应程序为： [0062] [0063] 采用本发明的引物组进行PCR扩增反应，仅需10～25个循环即可完成核酸样本的富集，循环少，反应时间短，效率高。 [0064] 根据本发明的实施例，构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法进一步包括以下步骤： [0065] (1)针对每一个目标区域，均设计适用于扩增所述目标区域核酸扩增的目标区域特异性正/反向引物，第一接头和第二接头、第二正向引物、第二反向引物和正/反文库标签，将目标区域特异性正/反向引物、第一接头和第二接头以及正/反文库标签，进行合成，得到第一正向引物和第一反向引物； [0066] 本发明采用完整测序接头的全部或部分作为第一正向引物和第二正向引物、第一反向引物和第二反向引物的退火互补区，无需引入外源序列，得到测序结果更加精准，减少了测序成本，降低了后续数据分析的难度。 [0067] (2)将待测样品的RNA、第一反向引物和cDNA合成试剂混合进行cDNA 1st合成； [0068] 现有技术需要在PCR时才能将文库标签加入样品中，若实验过程出现样品间相互污染，即无法识别。而本发明在反转录时将样本文库标签通过反转录引入cDNA 1st，同时把第二反向引物的结合位点引入了cDNA 1st中，后续PCR反应中只要使用第二反向引物就可以进行扩增反应。也即本发明在反转录时即将每个样品加了样本文库标签，避免了在后续实验过程样品间的相互污染。 [0069] 优选的，所述混合后在PCR管中进行PCR反应。 [0070] 优选的，所述待测样品RNA为信使RNA(mRNA)。 [0071] 优选的，所述cDNA合成试剂包括脱氧核糖核苷三磷酸混合液(dNTP mi)、5x1链缓冲液(5×1st strand buffer)、二硫苏糖醇(DTT)、RNA酶抑制剂(RNAseOUT)、反转录酶III(SuperScriptTM III)、RNA酶混合物(RNase mix)。 [0072] 优选的，所述合成步骤包括：先将待测基因组RNA、第一反向引物以及dNTP mix混合，进行RNA变性；变性结束后，再加入5×1st strand buffer、DTT、RNAseOUT、SuperScriptTM III，进行PCR反应，反应程序为50℃50min，70℃15min；PCR反应结束后，加入RNase mix，37℃孵育30min，得到cDNA 1st。 [0073] (3)将合成得到的cDNA 1st与第一正向引物、第二引物组以及PCR反应试剂混合进行PCR扩增，所述第一正向引物和第二正向引物的摩尔比为1:1～1:10，所述第一正向引物与第二正向引物之和与第二反向引物的摩尔数为1:1。 [0074] 优选的，所述混合后在PCR管中进行PCR反应。 [0075] 优选的，所述PCR反应程序为： [0076] [0077] (4)PCR反应结束后，回收PCR产物，进行磁珠纯化，按照PCR产物体积的0.8～1倍体积加入磁珠，纯化产物即为核酸文库。 [0078] 优选的，所述磁珠纯化采用AMPure XP DNA纯化试剂盒进行纯化。 [0079] 本发明提供的构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，无需额外的测序接头连接、连接产物纯化的步骤，也无需单管或高通量芯片等特定设备辅助PCR反应，使用普通的PCR设备即可完成产物的富集过程，操作简单，成本低、减低样品损失，效率高，循环次数少，耗时短，减少人为操作误差，测序结果准确、可靠，可重复性好。 [0080] 根据本发明的一些具体示例，本发明的构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法还可以包括以下步骤： [0081] 将合成得到的第一引物组进行预PCR扩增以及凝胶电泳检测，以验证第一引物组是否符合要求，其中以是否能扩增出符合设计大小的单一条带为判定标准。 [0082] 根据本发明的一些具体示例，构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法进一步包括以下步骤： [0083] 将构建好的核酸文库进行文库质量检测，可以使用例如Agilent2100Bioanalyzer或Caliper Bioanalyzer，或ABI StepOnerPlus Real-Time PCR System进行质量浓度、片段大小分布和摩尔浓度的检测。经检测合格后，即可上机测序。 [0084] 根据本发明的另一方面，本发明还提供一种确定待测样品目标区域核酸序列的方法。 [0085] 根据本发明的实施例，参照图4，该方法包括以下步骤： [0086] S101：构建待测样品的目标区域核酸测序文库 [0087] 根据上述构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，构建待测样品的目标区域核酸测序文库。 [0088] S102：对目标区域核酸测序文库进行测序 [0089] 对所述待测样品的目标区域核酸测序文库进行测序，以便获得测序结果。 [0090] 根据本发明的一些实施例，当所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P5测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P7测序接头时，利用Illumina测序平台进行所述测序。 [0091] 或者当所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P7测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P5测序接头时，利用Illumina测序平台进行所述测序。 [0092] 根据本发明的另一些实施例，当所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含Ion Torrent/Proton测序平台的P1测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含Ion Torrent/Proton测序平台的A测序接头时，利用Ion Torrent/Proton测序平台进行所述测序。 [0093] 根据本发明的另一些实施例，当所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含454测序平台的A测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含454测序平台的B测序接头时，利用454测序平台进行所述测序。 [0094] S103：确定待测样品目标区域核酸序列 [0095] 基于所述测序结果，确定待测样品目标区域核酸的序列。 [0096] 根据本发明的再一方面，本发明还提供一种同时确定多个待测样品的目标区域核酸序列的方法。 [0097] 根据本发明的实施例，参照图5，该方法包括以下步骤： [0098] S201：分别独立地构建多个待测样品中的每一个目标区域核酸测序文库 [0099] 针对所述多个待测样品中的每一个，分别独立地根据上述构建待测样品目标区域核酸测序文库的方法，构建待测样品的目标区域核酸测序文库，其中，所述多个待测样品的正/反文库标签相互不同，所述多个为至少2个。 [0100] S202：将多个待测样品的目标区域核酸测序文库混合 [0101] 将多个待测样品的目标区域核酸测序文库混合，以便获得混合文库。 [0102] S203：对混合文库进行测序 [0103] 对所述混合文库进行测序，以便获得测序结果，所述测序结果包括所述多个待测样品的目标区域核酸文库序列和所述正/反文库标签。 [0104] 根据本发明的一些实施例，当所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P5测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P7测序接头时，利用Illumina测序平台进行所述测序。 [0105] 或者当所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P7测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含illumina测序平台的P5测序接头时，利用Illumina测序平台进行所述测序。 [0106] 根据本发明的另一些实施例，当所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含Ion Torrent/Proton测序平台的P 1测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含Ion Torrent/Proton测序平台的A测序接头时，利用Ion Torrent/Proton测序平台进行所述测序。 [0107] 根据本发明的另一些实施例，当所述第一接头与所述第二正向引物PCR扩增后的产物包含454测序平台的A测序接头，所述第二接头与所述第二反向引物PCR扩增后的产物包含454测序平台的B测序接头，利用454测序平台进行所述测序。 [0108] S204：确定多个待测样品中每一个的目标区域核酸序列 [0109] 基于所述正/反文库标签对所述多个待测样品的目标区域核酸测序文库的序列进行区分，并确定所述多个待测样品的每一个的目标区域核酸序列。 [0110] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面示例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列(接头、标签和引物)、软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的。 [0111] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 [0112] 实施例一 [0113] 设计引物 [0114] 以IMGT数据库的参考序列为依据，设计BCR、TCR的特异性引物。第一反向引物在C基因的保守区设计，同时所述第一反向引物在C基因特异引物的5'端连接反向文库标签，反向文库标签的5'端连接第二接头，见图1中第一反向引物。第一正向引物包括V基因保守区的特异性引物和第一接头，见图2中第一正向引物，或者包括V基因保守区的特异性引物、正向文库标签和第一接头，见图3中第一正向引物。正/反文库标签均用于区分不同的样本。第二正向引物包含第一退火，见图2所示，第二反向引物包含第二退火，见图3所示。 [0115] 在进行PCR反应时，主要起作用的是上下游两端的接头，也就是第二正向引物和第二反向引物。本发明并没有引入外源的一段序列作为PCR结合位置，而是使用了测序接头的部分序列，即完整测序接头的3'端16-25bp作为第一正向引物和第二正向引物、第一反向引物和第二反向引物退火互补区，正是由于这个特殊的设计使得本方法不需要进行末端修复，加‘A’和加接头等过程，直接进行目的产物富集同时完成文库构建。举例如下，设计2个样本引物组序列。 [0116] 表1 2组引物组序列 [0117] [0118] [0119] [0120] 样本文库制备 [0122] 使用含抗凝剂的无菌采血管进行采血(抗凝剂一般有乙二胺四乙酸EDTA)，利用淋巴细胞分离液，比如Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液或Percoll淋巴细胞分离液进行密度梯度分离PBMC。 [0123] 2、RNA提取 [0124] 采用Trizol regeant方法或者提取试剂盒等提取总RNA。 [0125] 3、DNA消化 [0126] 使用DNA消化酶将残留在RNA样本中的DNA去除。 [0127] 4、cDNA 1st合成 [0128] 使用反转录酶和反转录引物对RNA进行反转录，得到cDNA 1链，并加入RNA消化酶，消化RNA。如图1所示，第一反向引物对mRNA进行反转录。 [0129] 4.1在0.2ml PCR管内按以下体系配制(1个样品)。 [0131] 4.2将混合物置于65℃5分钟以使RNA变性，变性结束，放置冰上1min，瞬时离心后，将以下混合溶液加至4.1中0.2ml PCR管。 [0132]组分 体积μL 5x1链缓冲液(5×1st strand buffer) 4 100mM M二硫苏糖醇(DTT) 1 RNA酶抑制剂(RNAseOUT)(40U/μL) 1 反转录酶III(SuperScriptTM III)(200U/μL) 1 [0133] 其中，PCR管的总体积为20μL。轻微震荡混匀。 [0134] 4.3在PCR仪上反应 [0135] 50℃50min。 [0136] 70℃15min [0137] 4.4加入1μLRNase mix，轻微震荡并彻底混匀，37℃孵育30min。 [0138] 4.5按照说明书，使用AMpure XP纯化cDNA1链样品，以18ul无核酸酶水回收cDNA1链样品。 [0139] 此步骤结束之后，可以将反应混合物储存于-20℃。 [0140] 5、特殊设计的PCR条件富集目标区域并完成文库构建 [0141] PCR使用的引物包括第一正向引物(V区正向引物)及第二引物组，其中第一正向引物和第二正向引物的摩尔比为1:1～1:10，所述第一正向引物与第二正向引物之和与第二反向引物的摩尔比为1:1。此步PCR结束后，目的片段两端含有完整的测序接头，文库构建结束。见图2和图3，第一正向引物和第二引物组对cDNA 1st进行PCR。 [0142] 5.1将合成得到的cDNA 1st作为模板PCR富集。将以下混合溶液在 [0143] 200μL的PCR管中配制PCR反应体系。 [0144] [0145] PCR反应条件为： [0146] [0147] 6、测序文库纯化 [0148] 构建的测序文库可用三种方法进行纯化，分别为磁珠纯化、纯化柱纯化和琼脂糖胶电泳回收纯化。 [0149] PCR反应结束后，将PCR产物转移至1个1.5mL离心管中,用AMPure XP DNA纯化试剂盒(SPRI beads)纯化扩增后的样品。 [0150] 7、文库检测 [0151] Agilent 2100Bioanalyzer analysis system检测文库插入片段大小及含量；Q-PCR精确定量文库的浓度。 [0152] 高通量测序 [0153] 将构建的测序文库在高通量测序平台上进行测序，高通量测序平台包括Illumina Hiseq及Miseq测序平台，Roche 454测序平台及Life Technologies的Ion Torrent测序平台等。 [0154] 测序数据分析 [0155] 将测序得到的数据进行质量过滤和长度过滤去除污染及接头序列；统计结果包括：测定的序列(Reads)长度、数据产量。然后将得到的序列进行比对分析，按照IMGT上V、(D、)J基因的定义将V、(D、)J基因找出并确定位置，并统计V、(D、)J基因的多样性。 [0156] 根据IMGT上的定义找出CDR3，并统计CDR3的长度和多样性。 [0157] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 |
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