一种污水处理系统中水/泥样品DNA扩增子测序文库快速构建的引物及快速构建方法 |
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| 申请号 | CN201611071680.1 | 申请日 | 2016-11-29 | 公开(公告)号 | CN106554958A | 公开(公告)日 | 2017-04-05 |
| 申请人 | 南京大学宜兴环保研究院; 南京大学; | 发明人 | 张徐祥; 汤俊英; 任洪强; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种污 水 处理 系统中水/泥样品DNA 扩增子 测序文库快速构建的引物及快速构建方法，属于高通量测序领域。本发明的步骤为：一、样品DNA的提取；二、目的 片段 的扩增；三、扩增产物的纯化；四、扩增产物的 质量 鉴定；五、扩增产物的混合；六、混合文库的质量鉴定；七、混合文库的准备及测序。本发明公开了一种引物，包括接头序列、索引序列、异质性间隔序列、目的片段扩增序列，使得利用该引物经一步扩增能够快速完成文库的构建，降低了测序成本、大量节省文库 构建时 间。本发明克服了复杂污水/泥样品中高多样性菌群结构解析难题，满足了基于高通量DNA测序技术应用于 污水处理 系统中水/泥样品菌群深度解析的技术需求。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种污水处理系统中水/泥样品DNA扩增子测序文库快速构建的引物，包括上游引物和下游引物，其特征在于：所述的上游引物和下游引物按照从5’端至3’端的顺序均包括接头序列、索引序列、异质性间隔序列、目的片段扩增序列；所述的接头序列中包含测序引物序列；所述的索引序列由12个碱基组成；所述的异质性间隔序由0-4bp的碱基组成；所述的目的片段扩增序列为16S rDNA高可变区处：341F和806R。 |
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| 说明书全文 | 一种污水处理系统中水/泥样品DNA扩增子测序文库快速构建的引物及快速构建方法 技术领域背景技术[0002] 目前市场上比较主流的二代测序平台是由Illumina公司和Life Technologies公司生产的，这些测序平台都能够产生较长的读长。相比较于Life Technologies公司生产的Ion Torrent个人化基因组测序仪，基于Illumina平台生产的Hiseq 2500、Hiseq 4000及Miseq测序仪运行每个循环能够产生更多的数据量，而其中Miseq测序仪优势在于试验周期短，能够快速分析细菌微生物群落结构和多样性。 [0003] 在细菌基因组中，编码16S rRNA的rDNA基因具有良好的进化保守性、适宜分析的长度(约为1540bp)及与进化距离相匹配的良好变异性，所以成为细菌分子鉴定的标准标识序列。16S rDNA的序列包含9个高可变区和11个恒定区。保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域能体现物种间的差异。采用Miseq测序仪对16S rDNA高可变区进行测序，可以对微生物的种群结构和多样性进行全面地鉴定。 [0004] 为完成微生物16S rDNA的测序，首先需要基于Illumina测序仪进行相应的文库构建，目前基于Illumina测序平台的建库方法主要有两种，包括两步扩增建库方法以及一步扩增建库方法。两步扩增建库，即使用两对引物进行两轮PCR进行文库的构建，步骤较为繁琐，且经过两次扩增引入的污染较多，使得后续信息分析准确度降低。第二种方法为一步扩增方法，该方法目前使用比较广泛，即通过一步扩增完成建库过程，但是该方法需要自定义目的片段的测序引物以及每个样品索引序列的测序引物。 [0005] 污水处理系统中的水/泥样品含有大量理化性质复杂的有机和无机物质，这些物质会影响对DNA进行分子操作(如：限制性内切酶酶切、PCR扩增等)的物质，如重金属离子等杂质以及一些胞外游离的DNA。因此，仍需要对现有的建库方法进行优化改进，以便提供一种快捷、污染较少的适用于污水处理系统中水/泥样品DNA扩增子测序文库的快速构建方法。 发明内容[0006] 1.要解决的问题 [0007] 针对目前污水处理系统中水/泥样品建库质量低、需要自定义目的片段的测序引物、操作繁琐、成本高等问题，本发明设计一种扩增子测序文库快速构建的引物，包含接头序列、索引序列、异质性间隔序列、目的片段扩增序列，目的在于克服污水处理系统中水/泥样品建库质量低、操作繁琐、容易污染、成本高等不足，采用一步扩增法，无需自定义目的片段的测序引物，直接使用Illumina Miseq配套试剂盒进行测序，优化扩增子测序文库构建方法，提供了一种适用于污水处理系统中水/泥样品扩增子测序文库的快速构建方法。 [0008] 2.技术方案 [0009] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下： [0010] 一种污水处理系统中水/泥样品DNA扩增子测序文库快速构建的引物，包括上游引物和下游引物，所述的上游引物和下游引物按照从5’端至3’端的顺序均包括接头序列、索引序列、异质性间隔序列、目的片段扩增序列；所述的接头序列中包含测序引物序列；所述的索引序列由12个碱基组成；所述的异质性间隔序由0-4bp的碱基组成；所述的目的片段扩增序列为16S rDNA高可变区处：341F和806R。 [0011] 更进一步地，所述的接头序列包含能够和Illumina Miseq测序试剂盒中的flow cell结合的序列，以及测序引物序列，能够使扩增子文库和Illumina Miseq配套试剂盒中的flow cell结合，而且能够直接使用Illumina Miseq配套试剂盒进行测序，接头序列中包含测序引物序列，因此无需自定义测序引物。 [0012] 更进一步地，上游引物和下游引物中都包括索引序列，采用双索引的方法。 [0013] 更进一步地，所述的上游引物序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15中的任意一种；所述的下游引物序列为SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.30中的任意一种。 [0014] 更进一步地，序列SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.18中的异质性间隔序列由0个碱基组成；SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.21中的异质性间隔序列由1个碱基组成；SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.22～SEQ ID NO.24中的异质性间隔序列由2个碱基组成；SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.25～SEQ ID NO.27中的异质性间隔序列由3个碱基组成；SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.30中的异质性间隔序列由4个碱基组成。 [0015] 一种DNA扩增子测序文库的快速构建方法，包括以下步骤： [0016] (1)样品DNA的提取； [0017] (2)目的片段的扩增：采用PCR进行目的片段的扩增，引物为上述的引物； [0019] (4)扩增产物的质量鉴定：采用吸光度的方法测定扩增产物的浓度、纯度，采用凝胶电泳的方法鉴定片段长度； [0020] (5)扩增产物的混合：不同样品DNA等质量进行混合； [0021] (6)混合文库的质量鉴定：采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)对混合文库进行定量检测； [0022] (7)混合文库的准备及测序：先对混合文库进行变性，然后采用Illumina Miseq配套试剂盒对混合文库进行稀释和上机测序。 [0023] 更进一步地，所述的样品来自于污水处理系统中的水/泥样品。 [0024] 更进一步地，步骤(1)中采用硅吸附DNA原理进行提取；如果样品是水样，需要用0.22um的微孔滤膜富集微生物，如果样品是泥样，需要离心沉淀以富集微生物。 [0025] 更进一步地，提取后的DNA纯度要求为260nm处吸光度/280nm处吸光度＝1.8～2.0。 [0026] 更进一步地，步骤(2)中进行PCR扩增的引物由SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15中的任意一条与NO.16～SEQ ID NO.30中的任意一条随机组合而成。 [0027] 更进一步地，步骤(4)中采用NaOH对混合文库进行变性。 [0028] 3.有益效果 [0029] 相比于现有技术，本发明的有益效果为： [0030] (1)本发明通过将接头序列、索引序列、异质性间隔序列、目的片段扩增序列整合在上、下游扩增的一对引物上，使得利用该引物能够通过一步扩增法完成文库构建，不仅提高测序文库质量及建库效率，而且降低了建库成本； [0031] (2)本发明设计的引物中，接头序列包含能够和Illumina Miseq测序试剂盒中的flow cell结合的序列，以及测序引物序列，能够使扩增子文库和Illumina Miseq配套试剂盒中的flow cell结合，而且能够直接使用Illumina Miseq配套试剂盒进行测序，接头序列中包含测序引物序列，因此无需自定义测序引物，操作更加简便； [0032] (3)本发明与常规建库方法相比，克服污水处理系统中水/泥样品建库质量低、操作繁琐、成本高的缺点，该方法能够准确区分不同样品并保证不同样品测序条数比较平均，在污水处理系统中水/泥样品扩增子测序领域中具有广泛应用前景。附图说明 [0033] 图1为本发明所用引物结构示意图； [0034] 图2为采用本发明文库构建方法具体实施中水样和泥样通过一步扩增并纯化后所得到的扩增子测序文库经电泳检测的结果。 具体实施方式[0035] 下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。 [0036] 实施例1 [0037] (1)污水处理系统中水样DNA的提取 [0038] ①采集某污水处理厂进水500mL、出水以及不同处理单元三个出水样品约2L，用0.22um的微孔滤膜过滤水样，水样中的微生物富集在微孔滤膜上，用于DNA的提取，依次编号为水样1、水样2、水样3、水样4、水样5； [0041] ④将破碎后的样品裂解管放入离心机，14000×g条件下离心15分钟，将上清液转移到2mL离心管中，加250μL PPS缓冲液，手摇10次混匀液体； [0042] ⑤将混合液在14000×g条件下离心5分钟，取1mL上清液转移到15mL离心管中，并向15mL离心管中加入1mL混匀的Binding Matrix，手摇混合液5分钟，使其混合均匀，随后静置3分钟； [0043] ⑥混匀离心管中剩余液体，转移700μL混合液到SPINTM Filter中，14000×g条件下离心1分钟，倒弃废液，重复2次； [0044] ⑦向SPINTM Filter中加500μL的SEWS-M溶液，用枪头吹吸混匀，在14000×g条件下离心1分钟，倒弃废液； [0045] ⑧再次将SPINTM Filter在14000×g条件下离心2分钟。将DNA纯化柱置于洁净的1.5mL离心管中，室温干燥3分钟后，于纯化柱管内柱面中央加入70μL双蒸水，慢慢混匀后， 55℃条件下热激5分钟； [0046] ⑨在14000×g下离心1分钟，所得即为提取的样品总DNA； [0047] ⑩使用显微分光光度计检测提取的DNA样品的浓度和纯度。 [0048] (2)目的片段扩增 [0049] 本发明中的引物结构示意图如图1所示，本实施例中选择五个引物配对：水样1使用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.16；水样2使用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.17；水样3使用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.18；水样4使用SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.16；水样5使用SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.17。其中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，第1-58位碱基是接头序列，第59-70位碱基是索引序列，0个异质性间隔序列，第71-87位碱基是目的片段扩增序列；SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18，第1-58位碱基是接头序列，第59-70位碱基是索引序列，0个异质性间隔序列，第71-90位碱基是目的片段扩增序列。 [0050] 扩增条件为：95℃2min；30个循环(95℃20s；51℃30s；72℃60s)；72℃5min。扩增体系为30μL：15μL的北京全式金公司生产的2×TransTaq High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix I、3μL的上游引物(引物浓度为1μM)、3μL下游引物(引物浓度为1μM)、5μL的DNA模板(模板浓度稀释到25ng/μL)；每组样品做三个平行，而且均设空白对照，空白对照即用双蒸水代替样品DNA模板，其它条件均不变。 [0051] (3)扩增产物的纯化； [0052] ①采用德国QIAGEN公司生产的的QIAquick PCR纯化试剂盒； [0054] ③分别取三管平行样品中的pcr产物25μL，一共是75μL加入新的1.5mL的离心管； [0055] ④在1.5mL的离心管中加入500μL的Buffer PB，涡旋混匀、低速离心； [0056] ⑤把上述液体加入试剂盒提供的QIAquick spin column中，17900×g常温离心1分钟，弃废液； [0057] ⑥在QIAquick spin column中加入750mL Buffer PE，17900×g离心1分钟，弃废液； [0058] ⑦然后17900×g室温再离心90s，去除残留的Buffer PE； [0059] ⑧把QIAquick column放在新的干净的1.5mL离心管中，加入25μL Buffer EB，静置1分钟，17900×g离心1分钟，所得就是纯化后的DNA。 [0060] (4)扩增产物的质量鉴定 [0061] (4a)采用赛默飞世尔公司的 dsDNA BR Assay Kit试剂用 2.0荧光计测定； [0062] ①配制工作液：按A试剂：B试剂＝199：1的比例配制工作液(注：A试剂为ds DNA BR Buffer，B试剂为ds DNA BR Reagent*200×)； [0063] ②取两个型号与荧光计配套使用的qubit试验管，先分别向两个管中各加入前面配制的工作液190μL，分别加入10μL的标准样品1试剂及10μL标准样品2试剂( dsDNA BR Assay Kit自带试剂)，室温条件下，涡旋震荡混匀后，低速离心； [0064] ③取qubit试验管，向管中加入配制的工作液198μL，再加入2μL目的片段样品，室温条件下，涡旋震荡混匀后，低速离心； [0065] ④根据加入扩增产物的体积，测定扩增产物的浓度。 [0066] 扩增产物的浓度为：水样1为70ng/ul、水样2为98ng/ul、水样3为103ng/ul、水样4为90ng/ul、水样5为88ng/ul。 [0067] (4b)采用凝胶电泳鉴定扩增产物片段大小； [0068] ①取1克琼脂糖粉末至100mL 1×TAE缓冲液中，加热至完全溶化沸腾，冷却至60℃左右，向溶液内加入溴化乙锭(商业购得)，至浓度为0.5ug/mL，将胶液倒入胶槽，冷却半小时，插好梳子制成均匀水平胶面； [0070] ③取纯化后的扩增产物4μL加上1μL loading buffer(全式金公司购得)混匀加入上样孔，以DL2000DNA marker为标准物(全式金公司购得)，设定电压120V，电流400mA，跑胶时间为20分钟。 [0071] ④使用紫外凝胶成像仪观察PCR实验结果。 [0072] 图2中，从左至右6个胶孔分别表示：第一个胶孔为DL 2000DNA marker，指示DNA分子大小的条带，从上往下依次为：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp，第二到第六个胶孔分别是水样1、水样2、水样3、水样4、水样5扩增产物纯化后的结果。正常16S rDNA V3-V4区的大小为450bp左右，上下游引物总长约140bp的，因此，扩增得到的总长应为590bp左右，图2所示PCR产物大小约590bp左右，可见，利用本发明的上述引物扩增得到的16S rDNA V3-V4区的扩增子测序文库的大小是符合预期的。 [0073] 实施例2 [0074] (1)污水处理系统中泥样DNA的提取 [0075] 采集某污水处理厂不同处理单元的4个泥样约50ml，10000rpm离心10分钟收集大约500mg的污泥进行DNA的提取；DNA的提取采用美国MP Biomedicals公司生产的FastDNA Soil Kit，编号为泥样1、泥样2、泥样3、泥样4。 [0076] (2)目的片段的扩增 [0077] 选择四个引物配对：泥样1使用SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.19；泥样2使用SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.20；泥样3使用SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.19；泥样4使用SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.20。扩增条件和扩增体系和实施例1相同。其中SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5，第1-58位碱基是接头序列，第59-70位碱基是索引序列，第71位是异质性间隔序列，第72-88位碱基是目的片段扩增序列；SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20，第1-58位碱基是接头序列，第59-70位碱基是索引序列，第71位是异质性间隔序列，第72-91位碱基是目的片段扩增序列。 [0078] (3)扩增产物的纯化 [0079] 采用德国QIAGEN公司生产的的QIAquick PCR纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。 [0080] (4)扩增产物的质量鉴定： [0081] 采用赛默飞世尔公司的 dsDNA BR Assay Kit试剂用 2.0荧光计测定，泥样1浓度为150ng/ul、泥样2浓度为145ng/ul、泥样3浓度为161ng/ul、泥样4浓度为 157ng/ul； [0082] 图2中，第七个胶孔开始从左至右依次表示：第一个胶孔为DL 2000DNA marker，第八到第十一个胶孔分别是泥样1、泥样2、泥样3、泥样4扩增纯化后的结果，可见，利用本发明的上述引物扩增得到的16S rDNA V3-V4区的扩增子测序文库的大小是符合预期的。 [0083] 实施例3 [0084] (1)样品前处理： [0085] 收集污水处理系统中450个水样和泥样的DNA(包括实施例1、例2中的样品)，用由SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.15中的任意一条与NO.16～SEQ ID NO.30中的任意一条随机组合而成的225对引物进行目的片段的扩增、纯化、质量鉴定(见实施例1)，每对引物用两次，所有样品扩增子测序文库的大小符合预期。 [0086] (2)扩增产物的混合： [0087] 根据测定的浓度，把使用不同引物扩增得到的样品按照相同的质量进行混合，得到混合文库A和混合文库B，每个文库都包含225个样品，并且每个文库没有使用重复的引物配对。 [0088] (3)混合文库的质量鉴定： [0089] (3a)采用赛默飞世尔公司的 dsDNA BR Assay Kit试剂用 2.0荧光计对混合文库进行初步的测定(实施例1)； [0090] (3b)采用瑞士罗氏公司生产的KAPA Library Quantification Kit对混合文库的浓度进行精确定量： [0091] ①准备步骤：把试剂盒中10X Primer Premix(1mL)加入2X KAPA FAST qPCR Master Mix(5mL)中，涡旋混匀，配成工作液Mix； [0092] ②配置文库稀释液：配置pH＝8.0的10mM Tris-HCl，加入 20(索莱宝公司购买)，使得其最终浓度为0.05％； [0093] ③准备样品：根据(3a)测得的浓度，用文库稀释液分别把文库A、B稀释100倍、1000倍、10000倍分别得到文库A1、文库A2、文库A3、文库B1、文库B2、文库B3； [0094] ④在ABI 7500qPCR仪器上进行qPCR扩增，扩增体系为20μL：12μL的工作液Mix，3.6μL双蒸水，0.4μL ROX Low(试剂盒自带)，4μL DNA(DNA分别为：标准品1-6为试剂盒自带、文库A1、文库A2、文库A3、文库B1、文库B2、文库B3)；扩增条件为：95℃5min，35个循环(95℃30s；60℃45s)；每组样品做三个平行，而且均设空白对照，空白对照即用双蒸水代替样品DNA模板，其它条件均不变。 [0095] ⑤根据标准品的质量浓度，得出最终文库的摩尔质量浓度：文库A的摩尔质量浓度为92.9nM、文库B的摩尔质量浓度为126.7nM。 [0096] (4)混合文库的准备及测序 [0097] ①根据(3)中测得的混合文库的摩尔质量浓度，把文库A、文库B的浓度稀释到3nM； [0098] ②配制0.2M NaOH和0.2M Tris-HCl(索莱宝公司购买)； [0099] ③分别在两个反应管中加10μL 3nM的文库DNA和10μL 0.2M NaOH涡旋震荡，短暂离心，静置5min； [0100] ④在上述反应管中加10μL 0.2M Tris-HCl，使得最终质量浓度为1nM； [0101] ⑤用Illumina Miseq Reagent Kit v3(600cycle)自带的试剂HT1，稀释上述文库DNA，使得最终质量浓度为12pM； [0102] ⑥上机测序：采用Illumina的Miseq仪器分别对文库A、文库B进行测序，测序策略是300PE(两端测序，各测300bp的碱基)。下机序列用PANDAseq软件进行拼接，拼接得率分别为92.99％、93.74％，其中测序数据结果见表1；而且每个样品的序列条数相对比较平均，都在40000-50000条；去掉引物信息后序列的平均长度为：429±7bp，符合实际目的片段长度。 [0103] 表1本发明文库构建方法具体实施中扩增子测序文库的序列信息结果 [0104] [0105] 注：高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值，这个质量值是衡量测序准确度的，Q30表明错误识别的概率是0.1％，即正确率是99.9％。 |
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