酵母展示系统

申请号 CN200980150330.6 申请日 2009-12-14 公开(公告)号 CN102245771B 公开(公告)日 2013-04-10
申请人 诺瓦提斯公司; 发明人 A·洛;
摘要 本 发明 涉及 蛋白质 展示文库和文库筛选领域。在优选的实施方案中,本发明提供了包含细胞表面分子、衔接分子和展示分子的用于展示的三组分系统。
权利要求

1.酵母宿主细胞文库,其中每个宿主细胞包含
(a)连接到细胞表面的细胞表面分子,
(b)包含第一结合位点和第二结合位点的衔接分子,和
(c)包含经修饰多肽的展示分子;
其中,所述第一结合位点特异地与细胞表面分子结合并且不能与展示分子结合,并且所述第二结合位点特异地与展示分子结合并且不能与细胞表面分子结合,其中所述衔接分子不是所述经修饰多肽的组分,并且其中所述每一宿主细胞包含不同的经修饰多肽。
2.权利要求1所述的酵母宿主细胞文库,其包含多个展示分子。
3.权利要求1或权利要求2所述的酵母宿主细胞文库,其中所述宿主细胞表面分子与所述第一结合位点共价连接。
4.权利要求1所述的酵母宿主细胞文库,其中所述宿主细胞表面分子包含为Aga1p的第一凝集素,并且其中所述第一结合位点包含为Aga2p的第二凝集素。
5.权利要求1所述的酵母宿主细胞文库,其中所述宿主细胞表面分子通过磷脂酰肌醇聚糖锚与细胞膜连接。
6.权利要求1所述的酵母宿主细胞文库,其中所述第二结合位点与展示分子共价连接。
7.权利要求1所述的酵母宿主细胞文库,其中所述第二结合位点包含InaD的PDZ结构域。
8.权利要求7的酵母宿主细胞文库,其中所述展示分子包含羧基端NorpA配体。
9.权利要求1所述的酵母宿主细胞文库,其中所述展示分子包含InaD的PDZ结构域。
10.权利要求9的酵母宿主细胞文库,其中所述第二结合位点包含羧基端NorpA配体。
11.权利要求1所述的酵母宿主细胞文库,其中所述经修饰多肽选自支架蛋白、信号转导蛋白质抗体、免疫球蛋白、免疫粘附素、受体、配体、癌蛋白质、转录因子、酶和纤连蛋白多肽。
12.权利要求11所述的酵母宿主细胞文库,其中所述纤连蛋白多肽包含F10多肽。
13.权利要求1所述的酵母宿主细胞文库,其中所述展示分子包含分泌信号肽。
14.权利要求13所述的酵母宿主细胞文库,其中所述分泌信号肽包含MFα/HSA杂合前导肽或MFα前导肽。
15.权利要求1所述的酵母宿主细胞文库,其中所述展示分子的表达在第一诱导型启动子的控制下,所述第一诱导型启动子选自AOX1启动子、Cup 1启动子和Gal 1启动子。
16.权利要求1所述的酵母宿主细胞文库,其中所述衔接分子的表达在第二诱导型启动子的控制下,所述第二诱导型启动子选自AOX1启动子、Cup 1启动子和Gal 1启动子。
17.用于展示经修饰多肽的方法,包括:
(a)提供包含与细胞的表面连接的细胞表面分子和编码包含经修饰多肽的展示多肽的第一核酸的酵母宿主细胞,
(b)在其中第一结合位点与细胞表面分子结合的条件下,将酵母宿主细胞与包含第一结合位点和第二结合位点的衔接分子接触,和
(c)在其中酵母宿主细胞将展示多肽输出到酵母宿主细胞外的条件下,在其中第二结合位点与展示多肽结合的条件下,温育酵母宿主细胞,
其中所述第一结合位点与细胞表面分子特异结合并且不能与展示分子结合,并且所述第二结合位点与展示多肽特异结合并且不能与细胞表面分子结合,并且其中所述衔接分子不是所述经修饰多肽的组分。
18.产生酵母宿主细胞展示文库的方法,包括:
将各自编码包含经修饰多肽的展示多肽的第一核酸的展示文库导入到多个酵母宿主细胞中,其中至少两种导入的第一核酸编码不同的经修饰多肽,其中每一酵母宿主细胞包含编码细胞表面多肽的第二核酸和编码包含第一结合位点和第二结合位点的衔接分子的第三核酸,其中第一结合位点与细胞表面分子结合但是不与展示多肽结合,并且第二结合位点与展示多肽结合但是不与细胞表面分子结合,并且其中衔接分子不是经修饰多肽的组分。

说明书全文

酵母展示系统

[0001] 领域
[0002] 本发明涉及蛋白质展示文库和文库筛选领域。更具体地,本发明涉及产生用于在细胞表面上展示的蛋白质。
[0003] 背景
[0004] 可以从序列数据预测蛋白质结合结构域,然而重新设计具有改进的或者改变的结合亲和的蛋白质常常需要测试许多重新设计的蛋白质的变体。目前,用于获得具有需要的结合亲和力的蛋白质的最好方法是产生并筛选包括此类变体的蛋白质文库,所述变体包括合理地重新设计的蛋白质、随机改变的蛋白质或者它们的组合。已经成功地构建了许多类型的蛋白质,例如免疫球蛋白和支架蛋白和受体或者受体配体的文库,并用于结合亲和力的筛选。
[0005] 筛选文库的方法很多,但最常用的方法之一是噬菌体展示方法,该方法包括将蛋白质文库与丝状噬菌体的外壳蛋白融合(例如,Huse等人,′89;Clackson等人,′91;Marks等人,′92)。最常见的是与称为基因III蛋白质(pIII)的次要外壳蛋白融合,所述次要外壳蛋白在噬菌体的顶端存在3至5个拷贝。然后将融合的文库展示于病毒颗粒的表面上。然后可以筛选针对固定的靶蛋白质的噬菌体展示文库。然而,该方法的一个主要的缺点是不能总是鉴定出与文库非常高亲和力结合的靶蛋白质,因为洗脱结合的噬菌体所需的条件通常会使噬菌体颗粒变性,以致于不能鉴定目标蛋白质。噬菌体展示文库的另一个缺点是需要将靶蛋白质固定于固体表面上,这对确定靶蛋白质与噬菌体展示蛋白质的实际亲和力造成了困难。此外,一些目标蛋白质需要翻译后修饰,例如糖基化、甲基化或者二硫键,而这在噬菌体颗粒中表达时不能实现。
[0006] 用于筛选蛋白质文库的备选方法是在细菌细胞的表面上展示文库。该方法解决了与噬菌体展示相关的许多缺点,但也具有其固有问题。细菌展示的一个问题是,细菌荚膜可能对展示在细菌表面上的蛋白质造成位阻。此外,细菌不含有正确折叠真核蛋白质的机器,因此并不是总可以在细菌内表达目标蛋白质。与在噬菌体中的问题类似,细菌也不能为真核蛋白质提供翻译后修饰,如二硫键。
[0007] Wittrup等人(美国专利号6,699,658和6,696,251)已经研发了用于酵母细胞展示文库的方法。其是一种双组分系统,其中第一个组分涉及表达酵母接合吸附蛋白的一个亚基凝集素,其与酵母细胞壁锚定。第二个组分涉及表达与凝集素蛋白质的第二个亚基融合的蛋白质文库,其与第一个凝集素亚基形成高亲和性二硫键。然后将与凝集素融合的蛋白质文库展示于细胞的表面上。然后可以筛选文库。该方法允许真核蛋白质的正确折叠和翻译后修饰。
[0008] Rakestraw等人(PCT/US2008/003978)已经研发了用于在酵母细胞的表面上展示蛋白质文库的三组分系统。第一个组分涉及表达与生物素结合肽融合的蛋白质文库,第二个组分涉及修饰酵母细胞壁以表达生物素,和第三个组分涉及将抗生物素蛋白与表达在细胞表面上的生物素结合。然后将融合蛋白质文库生物素化并从酵母细胞分泌,并且与酵母细胞表面上的抗生物素蛋白结合,从而,在酵母细胞的表面上展示蛋白质文库。该系统的一个可能的缺点是,抗生物素蛋白非特异性结合所有生物素。另一个可能的缺点是抗生物素蛋白含有4个结合位点,其可能引起空间位阻,因此阻碍生物素化的蛋白质文库与细胞表面结合的抗生物素蛋白结合。类似地,抗生物素蛋白分子可能在结合生物素化的酵母细胞壁之前结合生物素化蛋白质文库,因此阻碍了抗生物素蛋白与酵母细胞壁的结合。此外,该方法还包含不得不在酵母细胞内生物素化蛋白质文库的额外复杂性。该必需的额外步骤需要进一步对酵母细胞进行修饰。已经公认,对生物系统进行了越多的修饰,该系统就越不可能按照所设计来进行运转。此外,由于抗生素蛋白/链霉抗生素蛋白是多价的,所以必需注意不要交联生物素化细胞。最后,生物素/链霉抗生素蛋白和生物素/抗生素蛋白已经用于许多市售的标记试剂盒。此类试剂盒将很难在该生物素/抗生素蛋白展示系统中使用。
[0009] 现有技术缺少简单、有效的能特异结合分泌蛋白质文库的系统,所述系统使用衔接分子通过不同的结合部分结合蛋白质文库和真核细胞的表面。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明通过提供本说明书所公开的方法和组合物满足了该需求。一个方面包括具有与细胞表面连接的细胞表面分子的宿主细胞、包含第一结合位点和第二结合位点的衔接分子和包含经修饰多肽的展示分子,其中第一结合位点特异地与细胞表面分子结合并且不与展示分子结合,第二结合位点特异地与展示分子结合且不与细胞表面分子结合,并且衔接分子不是经修饰多肽的组分。在某些实施方案中,宿主细胞具有多个展示分子。在其他可以与前述实施方案组合的实施方案中,宿主细胞表面分子可以与第一结合位点共价地连接。在其他可以与前述实施方案组合的实施方案中,宿主细胞表面分子可以通过二硫键与第一结合位点共价地连接。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,宿主细胞表面分子可以包括可以是Aga1p的第一凝集素。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,宿主细胞表面分子可以通过GPI锚与细胞膜连接。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,其中第一结合位点包含可以是Aga2p的第二凝集素。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,第二结合位点可以与展示分子共价地连接。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,第二结合位点可以通过二硫键与展示分子共价地连接。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,第二结合位点包括PDZ结构域,其可以是具有基酸序列SEQ ID NO:8的InaD的PDZ结构域。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,展示分子包括在羧基端具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的NorpA配体。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,除其中的第二结合位点包括PDZ结构域或者其中展示分子包括NorpA配体外,展示分子包括PDZ结构域,其可以是具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的InaD的PDZ结构域。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,除其中第二结合位点包括PDZ结构域或者其中的展示分子包括NorpA配体外,第二结合位点还包括在羧基端具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的NorpA配体。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,其中经修饰多肽可以是支架蛋白、信号转导蛋白质、抗体、免疫球蛋白、免疫粘附素、受体、配体、癌蛋白质、转录因子或酶。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,展示分子可以是包括F10多肽的纤连蛋白多肽。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,展示分子包括可以是MFα的分泌信号序列、葡糖淀粉酶、Aga2分泌信号序列、Flo 1p分泌信号序列、转化酶分泌信号序列或者酸性磷酸酶分泌信号序列的分泌信号肽。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,分泌信号肽可以是MFα/HSA杂合前导肽。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,展示分子的表达在可以是AOX1启动子、Cup1启动子或者Gal启动子的第一诱导型启动子的控制下。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,衔接分子的表达在可以是AOX1启动子、Cup1启动子或者Gal启动子的第二诱导型启动子的控制下。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,宿主细胞可以是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或者酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母细胞。
[0012] 根据前述方面和其任一和所有实施方案,另外的方面包括包含至少两种宿主细胞的宿主细胞的文库,其中每一宿主细胞包括不同的经修饰多肽。
[0013] 再一方面包括用于展示修饰的多肽的方法,包括(a)提供包含与细胞的表面连接的细胞表面分子的宿主细胞和编码包含经修饰多肽的展示多肽的第一核酸,(b)在第一结合位点与细胞表面分子结合的情况下,将宿主细胞与包含第一结合位点和第二结合位点的衔接分子接触,并然后(c)在宿主细胞将展示多肽输出到宿主细胞之外的条件下,在第二结合位点与展示多肽结合的条件下,温育宿主细胞,其中第一结合位点特异地与细胞表面分子结合并且不能与展示分子结合,第二结合位点特异地与展示多肽结合并且不能与细胞表面分子结合,并且衔接分子不是经修饰多肽的组分。在其他实施方案中,宿主细胞可以展示至少102、至少103、至少104或者至少105的经修饰多肽。在其他可以与前述实施方案组合的实施方案中,宿主细胞表面分子可以与第一结合位点共价地连接。在其他可以与前述实施方案组合的实施方案中,宿主细胞表面分子可以通过二硫键与第一结合位点共价地连接。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,宿主细胞表面分子可以包括可以是Aga1p的第一凝集素。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,宿主细胞表面分子可以通过GPI锚与细胞膜连接。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,其中第一结合位点包含可以是Aga2p的第二凝集素。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,第二结合位点可以与展示分子共价地连接。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,第二结合位点可以通过二硫键与展示分子共价地连接。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,第二结合位点包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的InaD的PDZ结构域的PDZ结构域。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,展示分子包括在羧基端具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的NorpA配体。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,除其中第二结合位点包含PDZ结构域或者其中的展示分子包含NorpA配体外,展示分子包含PDZ结构域,其可以是具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的InaD的PDZ结构域。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,除其中的第二结合位点包括PDZ结构域或者其中的展示分子包括NorpA配体外,第二结合位点还包括在羧基端具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的NorpA配体。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,其中经修饰多肽可以是支架蛋白、信号转导蛋白质、抗体、免疫球蛋白、免疫粘附素、受体、配体、癌蛋白质、转录因子或酶。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,展示分子可以是包括F10多肽的纤连蛋白多肽。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,展示分子包括可以是MFα分泌信号序列、葡糖淀粉酶、Aga2分泌信号序列、Flo 1p分泌信号序列、转化酶分泌信号序列或者酸性磷酸酶分泌信号序列的分泌信号肽。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,分泌信号肽可以是MFα/HSA杂合前导肽。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,展示分子的表达在可以是AOX1启动子、Cup1启动子或者Gal启动子的第一诱导型启动子的控制下。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,衔接分子的表达在可以是AOX1启动子、Cup1启动子或者Gal启动子的第二诱导型启动子的控制下。在其他可以与任一前述实施方案组合的实施方案中,宿主细胞可以是巴斯德毕赤酵母或者酿酒酵母的酵母细胞。
[0014] 仍在另一方面包括用于产生宿主细胞展示文库的方法,其包括将分别编码包含经修饰多肽的展示多肽的第一核酸的展示文库导入到多个宿主细胞中,其中至少两种导入的第一核酸编码不同的经修饰多肽,其中每一宿主细胞包含编码细胞表面多肽的第二核酸和编码包含第一结合位点和第二结合位点的衔接分子的第三核酸,其中第一结合位点与细胞表面分子而不与展示多肽结合,第二结合位点与展示多肽而不与细胞表面分子结合,并且衔接分子不是经修饰多肽的组分。该方面可以与前述方面的任一实施方案组合。
[0015] 以上所述的是本发明的非限制性实施例。其他方面和实施方案可见于本说明书中。
[0016] 附图简述
[0017] 图1显示三组分系统的示意图,该系统包括细胞表面分子、包括第一和第二结合位点的衔接分子,以及具有针对第二结合位点的结合配偶体(在该实施方案中是结合多肽)和作为待展示分子的经修饰多肽的展示分子。在该实施方案中,宿主细胞是酵母细胞。
[0018] 图2显示用于酵母表达作为细胞表面分子的Aga1p的pPIC3.5AGA1载体。
[0019] 图3显示用于酵母表达作为衔接分子的Aga2p-InaD融合多肽的pPIC6AAGA2-InaD载体。
[0020] 图4显示用于酵母表达作为展示分子的MFα1Hsa-Fn10-NorpA融合多肽的pPICHOLI-1MFα1Hsa-Fn10-NorpA载体,其中NorpA是衔接分子(即,InaD)的第二结合位点的结合配偶体并且纤连蛋白F10结构域是经修饰多肽。
[0021] 图5显示用于酵母表达作为展示分子的MFα1Hsa-Fn10-NorpA融合多肽的pPICHOLI-C MFα1Hsa-Fn10-NorpA载体,其中NorpA是衔接分子(即,InaD)的第二结合位点的结合配偶体并且纤连蛋白F10结构域是经修饰多肽。
[0022] 图6显示用于酵母表达作为衔接分子的Aga2p-InaD融合多肽的pYDNBC1Aga2-InaD载体。
[0023] 图7显示用于酵母表达作为展示分子的MFα1HSA-Fn10-NorpA融合多肽的pYS HSA MFα1Fn10-NorpA载体,其中NorpA是衔接分子(即,InaD)的第二结合位点的结合配偶体并且纤连蛋白F10结构域是经修饰多肽。
[0024] 图8显示用于酵母表达作为展示分子的MFα1HSA--NorpA融合多肽的pYSMFα1HSA NorpA载体,其中NorpA是衔接分子(即,InaD)的第二结合位点的结合配偶体且HSA是展示多肽。
[0025] 图9A是显示表达纤连蛋白(pYS6/CT HSA MFα1Fn10NorpA)或者HSA(pYS6/CT MFα1-HSA-NorpA)的酵母细胞的蛋白质表面表达的FACS分析图,其中将酵母细胞用抗myc抗体和APC标记的二级抗小鼠抗体染色。图9A是未染色的酵母细胞对照;图9B是未诱导的表达纤连蛋白的酵母细胞;图9C是诱导的表达纤连蛋白的酵母细胞,显示出在曲线中的偏移;图9D是未诱导的表达HSA的酵母细胞;和图9E是诱导的表达HSA的酵母细胞,显示出在曲线中的偏移。
[0026] 图10A-E是表达纤连蛋白(pYS6/CT HSA MFα1Fn10NorpA)或者HSA(pYS6/CT HSA-NorpA)的FMAT分析的图像,其中将酵母细胞用抗myc小鼠单克隆抗体和APC标记的二级抗小鼠抗体染色并进行FMAT共焦荧光分析。图10A是用未染色酵母细胞的对照;图10B是未诱导的表达纤连蛋白的酵母细胞;图10C是显示为白色斑点的诱导的表达纤连蛋白的酵母细胞;图10D是未诱导的表达HSA的酵母细胞;和图10E是显示为白色斑点的诱导的表达HSA的酵母细胞。
[0027] 图11显示用于酵母表达作为展示分子的MFα1scFv溶菌酶NorpA融合多肽的pYS MFα1scFv溶菌酶NorpA载体,其中NorpA是衔接分子(即,InaD)的第二结合位点的结合配偶体且溶菌酶是经修饰多肽。
[0028] 图12显示其中将pYD NBC1Aga2-NorpA载体用于酵母表达NBC1Aga2-NorpA的反向系统。
[0029] 图13显示其中将pYS6/CT*MFα1-InaD-Fn10载体用于酵母表达MFα1-InaD-Fn10的反向系统。
[0030] 发明详述
[0031] 定义
[0032] 如本文中所用,术语“宿主细胞”指经修饰以表达细胞表面分子、衔接分子和展示分子的真核细胞。此外,应当理解,宿主细胞在展示分子与宿主细胞表面上的衔接分子结合前分泌或者排出展示分子。
[0033] 如本文中所用,术语“细胞表面分子”指指向宿主细胞的胞外表面的肽、多肽、结合结构域、配体、脂类或者糖类。细胞表面分子可以通过共价结合或非共价结合锚定于细胞表面。细胞表面分子可包括磷脂、糖类或者蛋白质,通过其可以与宿主细胞的表面连接。细胞表面分子可以是与细胞表面的磷脂、糖类或者多肽结合或者缀合的多肽。例如,多肽,例如a-凝集素、α-凝集素和絮片蛋白可以使用磷脂酰肌醇聚糖(GPI)与宿主细胞的表面锚定或者连接。细胞表面分子也可以是具有定位于宿主细胞的表面的、可以与衔接分子的第一结合位点结合的结合结构域的跨膜蛋白质。
[0034] 如本文中所用,术语“衔接分子”指具有两个不同的结合位点的肽、多肽、结合结构域、配体、脂类或糖类或者前述的组合。衔接分子具有特异结合细胞表面分子的结合位点和特异结合展示分子的第二个不同的结合位点。并不限制本发明,多肽的两个结合位点可以是分别对融合在一起的不同分子具有其自己的结合亲和性的多肽结构域。例如,多肽可以是与PDZ结构域融合的a-凝集素亚基如Aga2p,或者其可以是与PDZ结构域融合的絮片蛋白如Flo1。
[0035] 如本文中所用,术语“第一结合位点”指特异地识别并结合至少一部分细胞表面分子的衔接分子的区域。例如,第一结合位点可以包含与细胞表面分子特异结合的肽、多肽、结合结构域、配体、脂类或糖类或者它们的组合,所述细胞表面分子可以包括但不限于,肽、结合结构域、配体、蛋白质、脂蛋白、脂类或糖类。更具体地,但并不限制本发明,第一结合位点可以指通过二硫键与a-凝集素的Aga1p亚基特异结合的a-凝集素的Aga2p亚基。总而言之,可以将任意的两个分子结合配偶体用于第一结合位点和细胞表面分子的对应的部2+
分。实例包括Ni 离子和多组氨酸标签、糖残基和伴刀豆球蛋白A、对氨基苯基-β-D–硫代半乳糖苷和β-半乳糖苷酶(Germino等人,roc.Natl.Acad.Sci.USA 80:6848(1983),谷胱甘肽和谷胱甘肽-S转移酶(Smith,D.B和Johnson,K.S.Gene 67:31(1988));葡萄球菌A蛋白和IgG(Uhlen,M.等人Gene 23:369(1983))、调蛋白镍结合蛋白(CNBP)和钙调蛋白琼脂糖(Stofko-Hahn,R.E.等人FEBS Lett.302(3):274-278);链霉抗生素蛋白或抗生物素蛋白和生物素(Takashige,S.和Dale,G.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85:
1647-1651(1988);来自大肠杆菌malE基因的淀粉酶和麦芽糖结合蛋白结构域(Bach,H.等人,J.Mol.Biol.312:79-93(2001))、任意表位和其对应的抗体(参见,Kolodziej,P.A.和Young,R.A.,Methods Enzymol.194:508-519(1991),例如,FLAG(TM)八肽或者抗洋地黄毒苷抗体和洋地黄毒苷)。
[0036] 如本文中所用,术语“第二结合位点”指特异识别并结合展示分子的衔接分子的区域。例如,第二结合位点可以包含与包含展示分子的肽、配体、蛋白质、脂蛋白、脂类或糖类特异结合的肽、多肽、结合结构域、配体、脂类或糖类。更具体地,但并非限制,第二结合位点可以指与NorpA配体特异结合的PMZ结构域。也可以将适合于第一结合位点的任一结合对用于第二结合位点,只要它们不识别相同的配偶体。
[0037] 如本文中所用,术语“展示分子”指可以通过结合宿主细胞表面的衔接分子定位于宿主细胞表面的分子。展示分子一般包含待展示的分子(或分子文库)和与衔接分子的第二结合位点特异结合的结合配偶体。在某些实例中,待展示的分子和结合配偶体可以是相同的分子。通过示例的方式,展示分子可以包含肽、多肽、结合结构域、配体、脂类或糖类或者它们的组合。应当理解,展示分子在宿主细胞内表达或者以其他方式产生,并分泌或者排出于细胞之外以展示在所述细胞的表面上。展示分子可以包含不同分子的文库,其可以筛选与靶的结合或者用于改进或改变的活性。在某些实施方案中,文库可以包含经修饰多肽。展示分子也可以包含可以标记的标签或多肽以检测展示分子与细胞表面的结合,或者分选展示所述分子的宿主细胞。
[0038] 如本文中所用,术语“经修饰多肽”指任一目标多肽,其融合到与包含衔接分子的第二结合位点的肽、配体、蛋白质、脂蛋白、脂类或糖类特异结合的肽、多肽、结合结构域、配体、脂类或糖类,并在宿主细胞的表面上展示(并因此是展示分子的组分)。经修饰多肽的非限制性示例是支架蛋白、信号转导蛋白质、抗体、免疫球蛋白、免疫粘附素、受体、配体、癌蛋白质、转录因子和酶。
[0039] 如本文中所用,术语“多个展示分子”指在宿主细胞的表面上展示的展示分子的至少两个拷贝。在某些实例中,每一独特的展示分子通过不同的宿主细胞展示。
[0040] 如本文中所用,术语“经修饰多肽的组分”指修饰肽的任意片段的任一天然存在的结合配偶体。非限制性实例包括与免疫球蛋白重链结合的免疫球蛋白轻链、结合生物素分子的抗生物素蛋白、二聚化α-血红蛋白的两个亚基、与肌球蛋白轻链结合的肌球蛋白重链、二聚化的血型糖蛋白A的两个单体或者相互结合的任一天然存在的二聚体蛋白质的两个单体。
[0041] 如本文中所用,术语“宿主细胞的文库”指多个宿主细胞,其中每一宿主细胞包含在细胞的表面上展示的不同的经修饰多肽。
[0042] 如本文中所用,术语“不同的经修饰多肽”指至少两种经修饰多肽的氨基酸序列,其中每一氨基酸序列包含氨基酸替换、插入或者缺失,其将在宿主细胞表面上展示的一种经修饰多肽与在第二宿主细胞的表面上展示的另一种经修饰多肽相区别。
[0043] 如本文中所用,术语“Fn10”指人类纤连蛋白的第10型III结构域。
[0044] 展示分子
[0045] 展示分子可以用于展示在宿主细胞中表达或者以其他方式产生的任一分子。此类分子的非限制性示例如下。
[0046] 抗体支架
[0047] 展示分子可以是免疫球蛋白。最初研发了产生免疫球蛋白文库的方法以通过噬菌体展示免疫球蛋白,但是后来已经研发了其他展示方法。对于这些备选的展示方法,可以采用所有产生文库的方法以允许使用本文中公开的方法展示。产生抗体文库的示例方法可以见于Ladner等人的美国专利号5,223,409;5,403,484和5,571,698;Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717;McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197和Griffiths等人的美国专利号5,885,793;6,521,404;6,544,731;6,555,313;6,582,915和6,593,081。
[0048] 非抗体支架
[0049] 使用本文中公开的方法可以展示的公知的非免疫球蛋白构架或支架包括但不限于,纤连蛋白(Compound Therapeutics公司,Waltham,MA)、锚蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,瑞士)、结构域抗体(Domantis有限公司(Cambridge,MA)和Ablynx nv(Zwijnaarde,比利时))、脂笼蛋白(Anticalin)(Pieris Proteolab AG,Freising,德国)、小型模免疫药物(small modular immuno-pharmaceuticals)(Trubion Pharmaceuticals公司,Seattle,WA)、maxybody(Avidia公司(Mountain View,CA))、A蛋白(Affibody AG,瑞典)和affilin(γ晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,德国)、蛋白质表位模拟物(protein epitope mimetics)(Polyphor有限公司,Allschwil,瑞士)。
[0050] (i)纤连蛋白
[0051] adnectin支架基于纤连蛋白III型结构域(例如,纤连蛋白III型的第10个模块(10Fn3结构域))。纤连蛋白III型结构域具有分布在两个β折叠之间的7或者8条β链,它们相对于彼此包装以形成蛋白质的核心,并进一步含有将β链相互连接的环(类似于CDR)并且是溶剂暴露的。在β折叠夹层的每一边缘存在至少3个此类环,其中该边缘是垂直于β链的方向的蛋白质的边界。
[0052] 这些基于纤连蛋白的支架并不是免疫球蛋白,尽管整体折叠与最小的功能性抗体片段重链的可变区密切相关,所述重链的可变区包含在骆驼和骆IgG中的整个抗原识别单位。由于这种结构,非免疫球蛋白纤连蛋白分子模拟抗原结合特性,它们的性质和亲和力与抗体的相似。这些支架可以用于体外环随机化和改组策略,其与抗体在体内的亲和成熟过程类似。这些基于纤连蛋白的分子可以用作为支架,其中分子的环区域可以使用标准的克隆技术用本公开的CDR取代。
[0053] (ii)锚蛋白–分子配偶体
[0054] 该技术基于使用具有锚蛋白衍生的重复模块作为支架的蛋白质,用于产生可以用于与不同靶结合的可变区。锚蛋白重复模块是由两个反平行的α螺旋和β转组成的33个氨基酸多肽。通过使用核糖体展示最优化了可变区的结合。
[0055] (iii)Maxybodies/Avimers-Avidia
[0056] Avimer来源于天然含有A结构域的蛋白质例如LRP-1。这些结构域天然地用于蛋白质-蛋白质相互作用,并且在人类中超过250种蛋白质结构上基于A结构域。Avimer由许多不同的“A结构域”单体(2-10)通过氨基酸连接体连接组成。使用描述于,例如20040175756;20050053973;20050048512和20060008844中的方法可以产生能与靶抗原结合的Avimer。
[0057] (vi)A蛋白-Affibody
[0058] Affibody 亲和配体是由基于A蛋白的一个IgG结合结构域的支架的3螺旋束组成的小的、简单的蛋白质。A蛋白是来自细菌金黄色葡萄球菌的表面蛋白质。该支架结构域由58个氨基酸组成,其中13个氨基酸随机化以产生具有大量配体变体的Affibody 文库(参见例如,US 5,831,012)。Affibody 分子模拟抗体,与分子量为150kDa的抗体比较,它们具有6kDa的分子量。尽管其小尺寸,但是Afffibody 分子的结合位点与抗体的结合位点类似。
[0059] (v)Anticalins–Pieris
[0060] Anticalins 是由Pieris ProteoLab AG公司研发的产品。它们来源于脂笼蛋白,一组广泛分布的小而且结实的蛋白质,它们通常涉及化学敏感或不溶性化合物的生理转运或贮藏。几种天然的脂笼蛋白存在于人组织或体液中。
[0061] 蛋白质结构表明为免疫球蛋白,在刚性构架的顶部具有高变环。然而,与抗体或它们的重组片段相比,脂笼蛋白由具有160至180个氨基酸残基的单一多肽链组成,仅比单一的免疫球蛋白结构域稍大。
[0062] 组成结合袋的4个环的集合显示出明显的结构可塑性并容忍多种侧链。因此,可以以合适的方法重新塑造结合位点,以高亲和性和特异性识别指定的不同形状的靶分子。
[0063] 通过诱变4个环的集合,已经将脂笼蛋白家族的一种蛋白质,大菜粉蝶(Pieris Brassicae)的后胆色素结合蛋白质(BBP)用于研发anticalins。描述“anticalins”的专利申请的一个实例是PCT WO 199916873。
[0064] (vi)Affilin–Scil Proteins
[0065] AffilinTM分子是设计用于对蛋白质和小分子具有特异亲和性的小的非免疫球蛋TM白蛋白质。新的Affilin 分子可以非常快的选自两个文库,每一所述文库都基于不同的人类来源的支架蛋白。
[0066] AffilinTM分子与免疫球蛋白蛋白质不显示出任何的结构同源性。Scil ProteinsTM使用两种Affilin 支架,其中一个是γ晶体蛋白——一种人类结构性眼晶状体蛋白质,另一个是“泛素”超家族蛋白质。两种人类支架都非常小,显示出高温稳定性并几乎抗pH变化和变性剂。这种高稳定性主要是由于该蛋白质扩展的β折叠结构。γ晶体蛋白衍生的蛋白质的实例描述于WO200104144中,并且“泛素样”蛋白质的实例描述于WO2004106368中。
[0067] (vii)蛋白质表位模拟物(PEM)
[0068] PEM是模拟蛋白质的β发夹二级结构的中等大小的、环状、肽样分子(MW1-2kDa),主要的二级结构涉及蛋白质-蛋白质相互作用。
[0069] 非支架
[0070] 除用于重新产生具有特定亲和性的分子的支架外,在本文中公开的方法可以用于展示任一其他的可以在宿主细胞中表达或以其他方式产生的生物分子。可以将此类生物分子,特别是可以由多核苷酸编码的便于宿主细胞表达的多肽的文库,用于筛选改进的目标特性例如受体和配体之间改进的结合性,其中受体或配体是展示分子的一部分,或者改进的酶活性,其中酶是展示分子的一部分。
[0071] 表达系统
[0072] 表达载体可以用于在宿主细胞中表达一种或多种细胞表面分子、衔接分子和展示分子。用于真核宿主细胞的表达载体一般包括(i)控制转录起始的真核DNA元件,例如启动子,(ii)控制转录物加工的真核DNA元件,例如转录终止/聚腺苷酸化信号序列,和(iii)任选地,如果该载体是独立复制的(例如,非整合载体),在真核宿主细胞中控制复制的真核DNA元件。为了便于构建此类表达载体,载体可以任选地包括(iv)编码细菌复制起点和抗生素抗性标记物的真核DNA元件,以在细菌宿主细胞中操作载体时提供表达载体的生长和选择。用于真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的真核表达载体是本领域已知的,并描述于,例如,Powels等人(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)中。
[0073] 具体的目标酵母宿主细胞包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。这些载体包括基于Yip的载体例如Yip5、YRp载体例如YRp17、YEp载体例如YEp13和YCp载体例如YCp19。存在许多用于在酵母中表达重组蛋白质的载体。YEp载体的其他实例包括YEp24、YEp51和YEp52,其是用于将基因构建体导入到酿酒酵母中的克隆和表达载体(参见,例如Broach等人(1983)在Experimental Manipulation of Gene Expression,M.Inouye编辑Academic Press,第83页中)。这些载体也是穿梭载体,因为由于pBR322起点的存在,它们可以在大肠杆菌中复制,并且由于酵母2微米质粒的复制决定子,它们可以在酿酒酵母中复制。
[0074] 在酵母中发挥功能的合适的启动子包括金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人,J.Biol.Chem.255,2073(1980)或者其他糖酵解酶(Hess等人,J.Adv.Enzyme Req.7,149(1968);和Holland等人Biochemistry 17,4900(1978)),例如烯醇酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸-葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。在酵母表达中使用的合适的载体和启动子进一步描述于R.Hitzeman等人,EP073,657中。其他在酵母中表达的合适的启动子包括来自GAL1(半乳糖)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、ADH(醇脱氢酶)、AOX1(醇化酶)、HIS4(组氨醇脱氢酶)等的启动子。许多酵母克隆载体是容易得到的并且可以按上述讨论进行修饰。其他具有通过生长条件控制转录的额外优点的启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶,和前述金属硫蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶,以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。最后,仅在两种单倍体接合型之一中起作用的启动子可能适合于某些情况。在这些单倍体特异的启动子中,信息素启动子MFa1和MFα1是特别重要的。
[0075] 可以通过使用酵母蛋白质的任一可用的分泌信号序列来增加包括衔接分子(如果在宿主细胞中产生)和展示分子的组分从酵母宿主细胞中分泌。一个实例是酵母接合信息素的前体α因子的前导序列,其也用于指导酵母中异源蛋白质的分泌(参见,例如,Valenzuela,P.编辑,第269-280页,Butterworths,London;Brake,A.J.(1990)Meth.Enzymol.185,408-441)。除17个残基的氨基端信号肽外,α因子前导序列还包括含有72个残基的亲性前区,并具有3个N-连接的糖基化位点。前区在ER和Golgi中是广泛糖基化的,并且在晚高尔基区室中被Kex2内肽酶剪切。认为氨基端前区的存在允许一些异源蛋白质通过ER中的质量控制并到达周质。
[0076] 另一实例是来自酵母转化酶的前导序列(MLLQAFLFLLAGFAAKISADAHKS)(SEQ ID NO:1)。已经表明,当进入内质网时,该前导序列将从新生的异源肽中剪切。负责剪切前序列的酶Kex2定位于高尔基外侧区中。另外的实例是酵母酸性磷酸酶的信号序列,其可以用于指导在本文中公开的组分的分泌。
[0077] 用外源DNA转化酿酒酵母细胞并从其产生重组多肽的方法由,例如,Kawasaki,美国专利号4,599,311、Kawasaki等人,美国专利号4,931,373、Brake,美国专利号4,870,008、Welch等人,美国专利号5,037,743和Murray等人,美国专利号4,845,075公开。通过选择标记,通常是药物抗性或者在不存在特定营养物(例如,亮氨酸)中生长的能力确定的表型来选择转化的细胞。在酿酒酵母中使用的优选的载体系统是由Kawasaki等人(美国专利号4,931,373)公开的POT1载体系统,其允许通过在含葡萄糖的培养基中生长来选择转化的细胞。
[0078] 用于其他酵母的转化系统是本领域已知的,所述酵母包括多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillermondii)和麦牙糖假丝酵母(Candida maltosa)。参见,例如Gleeson等人,J.Gen.Microbiol.132:3459(1986)和Cregg,美国专利号4,882,279。根据McKnight等人,美国专利号4,935,349的方法可以使用曲霉属(Aspergillus)细胞。转化产黄顶孢霉(Acremonium chrysogenum)的方法由Sumino等人,美国专利号5,162,228公开。转化脉孢菌属(Neurospora)的方法由Laambowitz,美国专利号4,486,533公开。
[0079] 例如,甲醇毕赤酵母作为用于产生重组蛋白质的宿主的用途由Raymond,美国专利号5,716,808、Raymond,美国专利号5,736,383、Raymond等人,Yeast 14:11-23(1998)和在国际公开号WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536和WO 98/02565中公开。通常将在转化甲醇毕赤酵母中使用的DNA分子制备为双链、环状质粒,其优选地在转化前线性化。对于在甲醇毕赤酵母中的多肽产生,优选地,质粒中的启动子和终止子是甲醇毕赤酵母基因,例如甲醇毕赤酵母醇利用基因(AUG1或者AUG2)的启动子和终止子。其他有用的启动子包括二羟丙酮合酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)和过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。为了便于DNA整合到宿主染色体中,优选地是质粒的整个表达区段的两端侧翼都具有宿主DNA序列。对于希望最小化甲醇使用的大规模、工业化方法,优选地使用将两个甲醇利用基因(AUG1和AUG2)都缺失了的宿主细胞。对于产生分泌蛋白质,优选地是缺失了液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)的宿主细胞。使用电穿孔法以便于将含有编码目标多肽的DNA的质粒导入到甲醇毕赤酵母细胞中。可以通过使用指数衰减的、具有2.5至4.5kV/cm,优选地约
3.75kV/cm场强的脉动电场和1至40毫秒,最优选地约20毫秒时间常数(t)的电穿孔法转化甲醇毕赤酵母细胞。
[0080] 对于哺乳动物宿主细胞的用途,哺乳动物表达载体也是本领域熟知的并也可以使用。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包括非洲绿猴肾细胞(Vero;ATCC CRL 1587)、人胚肾细胞(293-HEK;ATCC CRL 1573)、幼仓鼠肾细胞(BHK-21,BHK-570;ATCC CRL 8544,ATCC CRL 10314)、犬肾细胞(MDCK;ATCC CCL 34)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1;ATCC CCL61;CHO DG44(Chasin等人,Som.Cell.Molec.Genet.12:555,1986))、大鼠垂体细胞(GH1;ATCC CCL82)、HeLa S3细胞(ATCCCCL2.2)、大鼠肝癌细胞(H4-II-E;ATCC CRL 1548)、SV40转化的猴肾细胞(COS-1;ATCC CRL 1650)和鼠胚胎细胞(NIH-3T3;ATCC CRL1658)。实施例
[0081] 以下提供了本中所公开的系统、组合物和方法的非限制性实施例。可以通过使用酵母InaD蛋白质的PDZ结构域和酵母NorpA蛋白质的羧基端5个氨基酸在酵母细胞的表面上展示蛋白质。该三组分蛋白质展示系统由以下组成:表达具有在其氨基端融合了分泌信号并在羧基端融合了NorpA配体的待展示蛋白质的载体;表达能与酵母细胞壁蛋白质特异结合并与InaD的PDZ结构域融合的、与NorpA配体特异结合的衔接蛋白质的第二载体;和表达与衔接蛋白质特异结合的酵母细胞壁蛋白质的第三载体。该系统适合于在酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母中使用。
[0082] 实施例1:在巴斯德毕赤酵母中使用InaD/NorpA相互作用的酵母展示
[0083] 通过在Fn10的氨基端融合杂合的分泌序列(MFα/HSA)或者酵母前导序列(MFα1)并在其羧基端融合NorpA配体,研发了展示纤连蛋白III型结构域(Fn10)的巴斯德毕赤酵母的蛋白质展示系统。一旦表达,Fn10从细胞中分泌,并且NorpA配体通过二硫键与InaD的PDZ结构域特异结合。将InaD与Agap2蛋白质的羧基端融合。Aga2p-InaD融合蛋白质用作为衔接蛋白质,并且将氨基端Aga2p与固定于细胞表面上的Aga1p结合。Aga2p通过二硫键与Aga1p特异地结合。
[0084] 将由Fn10-NorpA融合蛋白质、Aga2p-InaD融合蛋白质和Aga1p细胞表面蛋白质组成的三组分系统克隆到pPIC表达载体中,处于诱导型启动子控制下。使用的诱导型启动子是由甲醇诱导的AOX1启动子。因此,当将甲醇添加到转化了载体的酵母细胞时,这3种蛋白质将得到表达。Aga1p表达在细胞的表面上。Aga2p-InaD定位于细胞表面,其中Aga2p-InaD的氨基端区与Aga1p结合。Fn10-NorpA定位于分泌途径,从细胞中分泌,并通过羧基端NorpA配体结合InaD(图1)。也可以变换该系统,使得将InaD与Aga1融合并将NorpA与Aga2p融合(参见图12和13)。
[0085] 将c-myc表位标记融合在NorpA配体和Fn10的羧基端之间。通过使用c-myc抗体,c-myc表位允许检测展示的纤连蛋白。通过荧光激活细胞分选术(FACS)检测与细胞表面上c-myc表位结合的荧光标记的c-myc抗体。
[0086] 菌株和培养基
[0087] 将大肠杆菌Top10菌株(Invitrogen Carlsbad,CA)用作为用于重组DNA操作的宿主菌株。将巴斯德毕赤酵母GS115菌株(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA)用于融合蛋白质AGA2-InaD和HSA/MFα1-Fn10-NorpA的产生。将大肠杆菌培养于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%氯化钠)中。将巴斯德毕赤酵母培养于BMGY培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、100mM磷酸缓冲液(pH6.0)、1.34%酵母-5氮基、4×10 %生物素和1%甘油)和BMMY培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、100mM磷酸-5
钾缓冲液(pH 6.0)、1.34%酵母氮碱基、4×10 %生物素和0.5-2.0%甲醇)中。
[0088] 表达质粒的构建
[0089] 通过Geneart合成对应于AGA1的基因,并亚克隆到pPIC3.5(Invitrogen)中。得到的载体命名为pPIC3.5-AGA1(图2)。通过Geneart(德国)合成AGA2-InaD锚定基因,并使用BstI和EcoRI限制位点亚克隆到表达载体pPIC6a(Invitrogen)中。得到的载体命名为pPIC6-AGA2-InaD(图4)。纤连蛋白构建体由MFα1/HSA杂合前导区,接着是在羧基端与NorpA配体序列融合的纤连蛋白组成。通过Geneart(德国)合成全基因并亚克隆到pPICHOLI-1(Mobitec)中。得到的载体命名为pPICHOLI-1MFα1Hsa-Fn10-NorpA(图6)。
[0090] 酵母转化
[0091] 根据由供应商指定的方案制备电感受态巴斯德毕赤酵母GS115(Invitrogen)菌株并用SalI消化的pPIC3.5-AGA1、pPIC6-AGA2-InaD和pPICHOLI-1MFα1Hsa-Fn10-NorpA共转化。
[0092] 培养条件
[0093] 在30℃将酵母转化体预培养于含有100μg/ml Zeocin和200μg/ml杀稻瘟素的BMGY培养基中16小时,并用于接种在1L挡板瓶中的200ml的BMGY培养基(含有100μg/ml Zeocin和200μg/ml杀稻瘟素)以产生0.1的初始OD600值。培养24小时后,将培养物在1000g离心10分钟,并重悬于含有0.5%、1.0%或2.0%甲醇的BMMY培养基(+100μg/ml Zeocin和200μg/ml杀稻瘟素)中。为了维持融合蛋白质的诱导,每24小时添加一次100%甲醇到培养物中以达到上述终浓度。使用FACS和抗myc抗体进行酵母表面上展示的纤连蛋白的分析。
[0094] 实施例2:在巴斯德毕赤酵母的表面上分泌或者展示纤连蛋白的开关系统[0095] 上述展示系统的一种变体使得可以在分泌还是展示来自巴斯德毕赤酵母的蛋白质之间选择。为了实现这一点,将由MFα1/HSA杂合前导区接着在羧基端与NorpA配体序列融合的纤连蛋白组成的纤连蛋白构建体克隆到pPICHOLI-C而不是pPICHOLI-1中。得到的载体命名为pPICHOLI-CMfα1Hsa-Fn10-NorpA(图8)。两种载体之间关键的不同是启动子,pPICHOLI-1中的启动子是由甲醇诱导的AOX1启动子,并且在pPICHOLI-C中的启动子是由诱导的Cup1启动子。为了在巴斯德毕赤酵母的表面上展示纤连蛋白,用甲醇诱导AGA1和AGA2-InaD,而用铜诱导pPICHOLI-C。这允许捕获通过紧密的InaD/NorpA相互作用介导的在酵母的表面上的分泌纤连蛋白。对于没有在酵母的表面上展示蛋白质的纤连蛋白,用铜诱导就足够了。在没有诱导AGA1和AGA2-InaD(由甲醇驱动)的情况下,针对NorpA的结合配偶体(AGA1/AGA2-InaD)将不会在酵母的表面上存在,并因此纤连蛋白被分泌。
[0096] 实施例3:在酿酒酵母中使用InaD/NorpA相互作用的酵母展示
[0097] 该实施例描述了用其他酵母菌株例如酿酒酵母使用InaD/NorpA系统。
[0098] 菌株和培养基
[0099] 将大肠杆菌Top10菌株(Invitrogen,Carlsbad,CA)用作为用于重组DNA操作的宿主菌株。将酿酒酵母菌株EBY100(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA)用于产生融合蛋白质AGA2-InaD和MSα1/HSA-Fn10-NorpA或者pYS6CT*MFα1-HSA-NorpA。将大肠杆菌培养于含有100μg/mL氨苄青霉素或100μg/mL杀稻瘟素的LB培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%氯化钠)中培养。将EBY100培养于CM培养基-URA中。
[0100] 表达质粒的构建
[0101] 通过Geneart(德国)合成InaD锚定基因,并使用HindIII和EcoRI限制位点与AGA2锚定蛋白质符合读框地亚克隆到表达载体pYD NBC1(pYD1的衍生物,Invitrogen)中。得到的载体命名为pYD_NBC1AGA2-InaD(图10)。纤连蛋白构建体由MFα1/HSA杂合前导区接着是在羧基端与NorpA配体融合的纤连蛋白组成。通过Geneart(德国)合成全基因并亚克隆到pYS6CT(Invitrogen)中,其中将复制起点用CEN6/ARS4区取代。得到的载体命名为pYS6CT_HSA_MFα1_Fn10_NorpA(图12)。
[0102] 质粒分离自大肠杆菌并确认序列。然后将纯化的质粒共转化到EBY100中并接种在含有CM-TRP、+200ug/ml杀稻瘟素的选择性培养基中。转化菌落在2天内出现,并使用抗myc抗体(ccccc)通过FACS分析测试纤连蛋白的展示。
[0103] 实施例4:在巴斯德毕赤酵母中使用Flo1-InaD/NorpA的酵母展示
[0104] 该实施例描述了在毕赤酵母中使用InaD/NorpA的备选表达系统Flo1的用途。
[0105] 菌株和培养基
[0106] 将大肠杆菌Top10菌株(Invitrogen Carlsbad,CA)用作为用于重组DNA操作的宿主菌株。将巴斯德毕赤酵母GS115菌株(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA)用于融合蛋白质Flo1-InaD和HSA/MFα1-Fn10-NorpA的产生。将大肠杆菌培养于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5%氯化钠)中。将巴斯德毕赤酵母培养于BMGY培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)、1.34%酵母-5氮碱基、4×10 %生物素和1%甘油)和BMMY培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、100mM磷酸-5
钾缓冲液(pH 6.0)、1.34%酵母氮碱基、4×10 %生物素和0.5-2.0%甲醇)中。
[0107] 表达质粒的构建
[0108] 通过Geneart(德国)合成在羧基端与InaD的PDZ结构域融合的Flo1基因,并使用5’EcoR1位点和3’Not1位点亚克隆到pPIC3.5(Invitrogen)中。得到的载体命名为pPIC3.5-Flo1-InaD。融合蛋白质的表达通过甲醇诱导的启动子AOX1驱动。纤连蛋白构建体由MFα1/HSA杂合前导区,接着在羧基端与NorpA配体序列融合的纤连蛋白组成。通过Geneart(德国)合成全基因并亚克隆到pPICHOLI-1(Mobitec)中。得到的载体命名为pPICHOLI-1MFα1Hsa-Fn10-NorpA(图6)。纤连蛋白构建体的表达通过甲醇诱导的启动子AOX1驱动。
[0109] 酵母转化
[0110] 根据由供应商指定的方案制备电感受态巴斯德毕赤酵母GS115(Invitrogen)菌株并用SalI消化的pPIC3.5-Flo 1-InaD和pPICHOLI-1MFα1Hsa-Fn10-NorpA共转化。
[0111] 培养条件
[0112] 在30℃将酵母转化体预培养于含有100μg/ml Zeocin和200μg/ml杀稻瘟素的BMGY培养基中16小时,并用于接种在1L挡板瓶中的200ml的BMGY培养基(含有100μg/ml Zeocin和200μg/ml杀稻瘟素)以产生0.1的初始OD600值。培养24小时后,将培养物在1000g离心10分钟,并重悬于含有0.5%、1.0%或2.0%甲醇的BMMY培养基(+100μg/ml Zeocin和200μg/ml杀稻瘟素)中。为了维持融合蛋白质的诱导,每24小时添加一次100%甲醇到培养物中以达到上述终浓度。使用FACS和抗myc抗体进行酵母表面上展示的纤连蛋白的分析。
[0113] 实施例5:筛选纤连蛋白文库
[0114] 纤连蛋白文库展示
[0115] 通过本领域熟知的方法,包括在美国专利号6,673,901中公开的方法产生纤连蛋白文库。其他方法,例如使用易错聚合酶链式反应、使用随机引发技术或者使用计算机技术都是本领域熟知的,并且也可以使用。设计的纤连蛋白文库具有合适的限制酶切割位点,以将文库克隆到酵母表达载体中。
[0116] 如实施例1中所述,将纤连蛋白文库展示在多个巴斯德毕赤酵母细胞上。修饰纤连蛋白文库以含有与氨基端融合的MFα/HSA杂合前导序列和与羧基端融合的NorpA配体序列。然后,将修饰的纤连蛋白文库克隆到pPICHOLI-1载体中。与上面的实施例一样,纤连蛋白文库的表达在AOX1启动子的控制下。将巴斯德毕赤酵母用表达纤连蛋白文库的pPICHOLI-1载体和表达Aga1p和Aga2p-InaD的载体转化。通过添加甲醇到细胞中诱导组分的表达,并将纤连蛋白文库展示于多个巴斯德毕赤酵母细胞上。
[0117] 筛选展示文库
[0118] 使用本领域已知的许多方法之一,针对目标靶蛋白质筛选酵母展示纤连蛋白文库。例如,将靶蛋白质在允许靶蛋白质与文库的任一成员特异结合的条件下与酵母展示纤连蛋白文库接触。此时,所有结合的靶蛋白质都固定在酵母细胞的表面。将所有未结合的靶蛋白质洗掉。通过本领域熟知的方法,例如特异针对靶蛋白质的荧光标记抗体荧光标记结合的靶蛋白质。此时,标记的靶蛋白质固定在酵母细胞的表面,然后使用流式细胞术,即FACS检测。结合标记的靶蛋白质的酵母细胞将发荧光,并且可以从那些不结合靶蛋白质的酵母细胞中分选出来。将已经结合靶蛋白质的分选的酵母细胞克隆扩增,并确定结合靶蛋白质的克隆细胞系或者含有纤连蛋白文库成员的细胞系。
[0119] 实施例6:筛选蛋白质文库
[0120] 蛋白质文库展示
[0121] 通过本领域熟知的方法,例如使用易错聚合酶链式反应、使用随机引物技术或者使用计算机技术产生蛋白质文库。设计的蛋白质文库具有合适的限制酶切割位点,以将文库克隆到酵母表达载体中。
[0122] 如上面的实施例1所述,将克隆的蛋白质文库展示在多个巴斯德毕赤酵母细胞上。修饰蛋白质文库以含有与氨基端融合的MFα/HSA杂合前导序列和与羧基端融合的NorpA配体序列。然后,将修饰的蛋白质文库克隆到pPICHOLI-1载体中。与上面的实施例,蛋白质文库的表达在AOX1启动子的控制下。将巴斯德毕赤酵母用表达蛋白质文库的pPICHOLI-1载体和表达Aga1p和Aga2p-InaD的载体转化。通过添加甲醇到细胞中诱导组分的表达,并将蛋白质文库展示于多个巴斯德毕赤酵母细胞上。
[0123] 筛选展示文库
[0124] 使用本领域已知的许多方法之一,针对目标靶蛋白质筛选酵母展示蛋白质文库。例如,将靶蛋白质在允许靶蛋白质与文库的任一成员特异结合的条件下与酵母展示蛋白质文库接触。此时,所有结合的靶蛋白质都固定在酵母细胞的表面。将所有未结合的靶蛋白质洗掉。通过本领域熟知的方法,例如特异针对靶蛋白质的荧光标记抗体荧光标记结合的靶蛋白质。此时,标记的靶蛋白质固定在酵母细胞的表面上,然后使用流式细胞术,即FACS检测。结合标记的靶蛋白质的酵母细胞会发荧光,并且可以从那些不结合靶蛋白质的酵母细胞中分选出来。将分选的已经结合靶蛋白质的酵母细胞克隆扩增,并确定结合靶蛋白质的克隆细胞系或者含有蛋白质文库的成员的细胞系。
[0125] 实施例7:筛选纤连蛋白或者HSA文库
[0126] 纤连蛋白或者HSA文库展示
[0127] 通过本领域熟知的方法,例如使用易错聚合酶链式反应、使用随机引物技术或者使用计算机技术产生纤连蛋白或HSA文库。设计的文库具有合适的限制酶切割位点,以将文库克隆到酵母表达载体中(参见图8和SEQ ID NO:10)。
[0128] 如上面的实施例1所述,将克隆的纤连蛋白文库或HSA文库展示在多个巴斯德毕赤酵母细胞上。修饰纤连蛋白文库以含有与氨基端融合的MFα/HSA杂合前导序列和与羧基端融合的NorpA配体序列(pYS HSA_MFα1 Fn10 NorpA)。修饰HSA文库以含有MFαCT(羧基端)。其是用于构建的初始Invitrogen载体的剩余物。如果查找载体图(例如图13),你会发现羧基端v5和插入片段的羧基端的6×组氨酸序列。我们已经在其前面放置了终止子,并且其不会在最终的展示蛋白质前导序列(pYS6/CT HSA-NorpA)中翻译。然后,将修饰的纤连蛋白文库或HSA文库克隆到pYS载体中。纤连蛋白文库或HSA文库的表达在T7启动子的控制下。将巴斯德毕赤酵母细胞用表达纤连蛋白文库或HSA文库的pYS载体和表达Aga1p和Aga2p-InaD的载体转化。通过添加甲醇到细胞中诱导组分的表达,并将纤连蛋白文库或HSA文库展示于多个巴斯德毕赤酵母细胞上。
[0129] (a)蛋白质表面表达的FACS分析
[0130] 将表达纤连蛋白(pYS HSA_MFα1 Fn10 NorpA)或者HSA(pYS6/CTHSA-NorpA)的酵母细胞用抗myc抗体,然后用APC标记的二级抗小鼠抗体染色,并然后进行FACS分析。分析的结果显示于图9A-E中。具体地,图9A是显示出未染色酵母细胞的对照样品;图9B是表达纤连蛋白的未诱导的酵母细胞的样品;图9C是表达纤连蛋白的诱导的酵母细胞的样品,与未诱导的细胞比较,显示出细胞的偏移;图9D是表达HSA的未诱导酵母细胞的样品;和图9E是表达HSA的诱导的酵母细胞的样品,与未诱导的细胞比较,再次显示出细胞的偏移。结果清楚地表明,酵母展示系统能表达纤连蛋白分子和蛋白质,例如HSA。
[0131] (b)荧光微体积测定技术(FMAT、Perkin Elmer)分析表达纤连蛋白或HSA的酵母[0132] 也通过FMAT通过用抗myc抗体和APC标记的二级抗小鼠抗体分析表达纤连蛋白(质粒)或HSA(质粒)的酵母细胞。然后,将样品进行FMAT共焦荧光显微镜分析,并显示于图10A-E中。那些表达纤连蛋白或HSA的菌落相对于黑色背景呈现出白点。具体地,图10A是显示未染色的酵母细胞的对照样品,并呈现出完全的黑色;图10B是表达纤连蛋白的未诱导样品。未诱导酵母细胞不产生纤连蛋白并且不会被检测到(图像呈现黑色);图10C是表达纤连蛋白的诱导的酵母细胞的样品。在该实例中,诱导导致具有myc标记的纤连蛋白表达并可以使用抗myc抗体检测。随后用APC二级抗小鼠抗体和FMAT共焦荧光显微镜检测,产生了检测到的可见白色菌落。图10D是表达HSA的未诱导酵母细胞的样品,如前所述,未诱导的酵母细胞不产生纤连蛋白并且图像呈现黑色;和图10E是表达HSA的诱导的酵母细胞的样品,与未诱导细胞比较,再次显示出小的白色菌落。这些结果进一步证实,酵母展示系统能表达纤连蛋白分子和蛋白质,例如HSA。
[0133] 实施例8:筛选单链Fv文库
[0134] 单链Fv文库展示
[0135] 通过本领域熟知的方法,例如使用易错聚合酶链式反应、使用随机引物技术或者使用计算机技术产生单链Fv文库。设计的文库具有合适的限制酶切割位点,以将文库克隆到酵母表达载体中(参见图11和SEQ ID NO:11)。
[0136] 如上面的实施例1所述,将克隆的scFv溶菌酶文库展示在多个巴斯德毕赤酵母细胞上。修饰scFv文库以含有与氨基端融合的MFα前导序列和与羧基端融合的NorpA配体序列(pYS6/CT*MFα1-scFv溶菌酶-NorpA)。然后,将修饰的scFv溶菌酶文库克隆到pYS载体中。scFv溶菌酶的表达在T7启动子的控制下。将巴斯德毕赤酵母用表达scFv溶菌酶文库的pYS载体和表达Aga1p和Aga2p-InaD的载体转化。通过添加甲醇到细胞中诱导组分的表达,并将纤连蛋白文库或HSA文库展示在多个巴斯德毕赤酵母细胞上。
[0137] (a)蛋白质表面表达的FACS分析
[0138] 用抗myc抗体然后APC标记的二级抗小鼠抗体染色表达scFv溶菌酶的酵母细胞,并然后进行FACS分析。
[0139] (b)FMAT分析表达纤连蛋白或HSA的酵母
[0140] 通过FMAT通过用抗myc抗体和APC标记的二级抗小鼠抗体染色分析表达scFv溶菌酶的酵母细胞。然后,将样品进行FMAT共焦荧光显微镜分析。
[0141] 实施例9:筛选具有反向系统的蛋白质文库
[0142] 蛋白质文库展示
[0143] 在该实施例中,将本文中所述的酵母展示系统反向,以使NorpA与Aga2融合并使InaD与Aga1融合。通过本领域熟知的方法,例如使用易错聚合酶链式反应、使用随机引物技术或者使用计算机技术产生蛋白质文库。设计的文库具有合适的限制酶切割位点,以将文库克隆到酵母表达载体中(参见图12和13以及SEQ ID NO:12和13)。
[0144] 通过在InaD的氨基端融合前导序列(MFα1)并在其羧基端融合Fn10,研发了展示纤连蛋白III型结构域(Fn10)的巴斯德毕赤酵母的蛋白质展示系统。一旦表达,Fn10从细胞中分泌并且InaD的PDZ结构域通过二硫键与NorpA配体结合。将NorpA与Agap2蛋白质的羧基端融合。Aga2p-NorpA融合蛋白质用作为衔接蛋白质,并且氨基端Aga2p与固定于细胞表面上的Aga1p结合。Aga2p通过二硫键与Aga1p特异地结合。
[0145] 将由Aga2p-NorpA融合蛋白质、Aga1-InaD融合蛋白质和Aga1p细胞表面蛋白质组成的三组分系统分别克隆到pPD和pYS表达载体中,处于Gal诱导型启动子控制下。
[0146] 使用的诱导型启动子是由半乳糖诱导的Gal1启动子。因此,当将半乳糖添加到用载体转化了的酵母细胞中时,这3种蛋白质将得到表达。Aga1p表达在细胞的表面上。Aga2p-Norp定位于细胞表面,其中Aga2p-Norp的氨基端区与Aga1p结合。从Fn10-InaD定位于分泌途径,从细胞中分泌,并通过羧基端InaD配体结合NorpA。
[0147] 序列
[0148] pPIC3.5AGA1(956bp-3136bp,直接的)242aa
[0149]
[0150] pPIC6 A AGA2-InaD(941bp-1648bp,直接的)78aa
[0151]
[0152] pPICHOLI-1_MFα1Hsa-Fn10-NorpA(884bp-1441bp,直接的)62aa
[0153]
[0154] pPICHOLI-C Mfα1Hsa-Fn10-NorpA(691bp-1248bp,直接的)62aa
[0155]
[0156] pYD_NBC1_Aga2-InaD(534bp-1235bp,直接的)78aa
[0157]
[0158] pYS6/CT_HSA_MFα1_Fn10_NorpA(513bp-1080bp,直接的)63aa
[0159]
[0160] InaD PDZ结构域氨基酸序列(InaD aa 11-107)
[0161]
[0162] 包括EFCA基序的NorpA羧基端11个氨基酸
[0163] YKTQGKTEFC A(SEQ ID NO:9)
[0164] pYS6/CT*MFαHSA-NorpA
[0165] MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNST
[0166] NNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAASDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAF
[0167] AQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE
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[0171] ICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEA
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[0176] CKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGSENLYFQGSGGGGEQKLISEEDLHHHHHHHH
[0177] PSTPPTPSPSTPPTPSPSYKTQGKTEFCA(SEQ ID NO:10).
[0178] pYS6/CT*MFα1-scFv溶菌酶-NorpA
[0179] MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNS
[0180] TNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAASQVKLQQSGAELVKPGASVKLSCTASG
[0181] FNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSS
[0182] LTSEDTAVYYCARWDWYFDVWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPSSMYT
[0183] SLGERVTITCKASQDINSYLRWFQQKPGKSPKTLIYYATSLADGVPSRFSGSGSGQDYS
[0184] LTISSLESDDTTTYYCLQHGESPYTFGGGTKLEIKRAAAEQKLISEEDLNGSENLYFQG
[0185] SGGGGEQKLISEEDLHHHHHHHHPSTPPTPSPSTPPTPSPSYKTQGKTEFCA(SEQ ID NO:11)[0186] pYD_NBC1_Aga2-NorpA
[0187] MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSLSTTTILANGKAMQGVFEYY
[0188] KSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVFKLLQASGGGGSGGGGSYKTQGKTEFCA
[0189] (SEQ ID NO:12)
[0190] pYS6/CT*MFα1-InaD-Fn10(507bp-1487bp,直接的)109aa
[0191] MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNST
[0192] NNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAASAGELIHMVTLDKTGKKSFGICIVRGEV
[0193] KDSPNTKTTGIFIKGIVPDSPAHLCGRLKVGDRILSLNGKDVRNSTEQAVIDLIKEADF
[0194] KIELEIQTFDKSGGGGEQKLISEEDLHHHHHHPSTPPTPSPSTPPTPSPENLYFQGVSD
[0195] VPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGL
[0196] KPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT(SEQ ID NO:13)
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