[0001] 本发明涉及使用源自M13噬菌体的pIX的工程化杂交噬菌体载体来生成pIX噬菌体展示文库并使用该文库来产生一种或多种非抗体肽或蛋白质的组合物和方法。

[0002] 噬菌体展示是基于亲和力的多肽选择的一种成熟工具。(在典型的噬菌体展示选择中，多肽文库经基因工程融合至丝状噬菌体M13外壳蛋白之一的末端。噬菌体颗粒提供所述文库的每个多肽成员与其编码基因之间的物理关联。接着可针对与所需靶分子结合的文库成员，对噬菌体文库进行亲和选择即淘选。将文库与靶分子混合，洗掉未结合的噬菌体颗粒，洗脱剩下的噬菌体并通过在大肠杆菌细胞中培养而扩增。

[0003] 尽管已经用M13的每种外壳蛋白实现了外源多肽的展示，然而pIII和pVIII仍是目前最常用的融合伙伴。pIII是42kD的次要外壳蛋白，其负责噬菌体感染进入大肠杆菌。每个噬菌体颗粒在其表面含有最多五个拷贝的pIII蛋白，聚集在噬菌体的一端。PVIII是噬菌体的主要外壳蛋白；数千个拷贝到pVIII(分子量为5kD)的拷贝在单链病毒基因组周围以有序的方式排列而构成噬菌体衣壳。除了pIII，M13还有三种其他次要外壳蛋白：pVI(12kD的蛋白)以及pVII和pIX，其中pVII和pIX是涉及装配起始和稳定性维持的短蛋白质(分别具有33和32个氨基酸)。五个拷贝的pVI蛋白位于噬菌体的与pIII相同的一端，而五个拷贝的pVII和pIX的每一者均位于噬菌体的相对两端。

[0004] 虽然已证实在许多情况下可产生与pIII和pVIII融合的噬菌体文库展示融合物，但由噬菌体展示的多肽却受到某些生物学约束。例如，大多数长度为八个或更多个氨基酸的肽不能很好地展示为与pVIII的融合物。此外，与噬菌体蛋白自身相互作用或以其他方式影响pIII或pVIII的表达、结合或活性的多肽将不能在文库中充分表达，因为展示它们的噬菌体生长不良。最后，因为pIII是相当大的蛋白，pIII展示的多肽到某些靶位点的通路(例如，蛋白表面的深而窄的缝隙)或以多聚体形式存在时功能最佳的多肽的正确装配将在空间上受到阻碍。因此，根据利用其他外壳蛋白(其具有不同结构和生物学功能，因此可预计会对所展示的多肽施加不同的约束)的噬菌体文库选择将有助于确保搜寻最大量的序列多样性。在概念验证实验中，已证实pVII和pIX可用于展示抗体片段和肽。这些结果是特别值得注意的，因为早期研究表明将多肽融合至pVII和pIX的N末端使得这些外壳蛋白失去功能。

[0005] 可通过使用噬菌体、噬菌粒或杂交载体实现在噬菌体上展示外源多肽。使用噬菌体载体，通过使用噬菌体载体，所关注的基因可被引入噬菌体基因组中作为与天然外壳蛋白基因的框内融合物。这些载体作为全功能噬菌体独立地繁殖并展示多拷贝的外源多肽。相反，噬菌粒载体是除细菌复制起点之外还含有噬菌体复制起点和包装信号的质粒。噬菌粒带有融合到外壳蛋白基因的重组拷贝中的所关注的基因，并且一旦用辅助噬菌体救援，噬菌粒即被包装进子代病毒中，其中展示的多肽整合在噬菌体外壳中。对辅助噬菌体的需要导致噬菌粒载体比噬菌体载体具有更大的工作强度，并且使定量任何指定样品中所存在噬菌体数量的工作复杂化。此外，由于噬菌体颗粒可同时利用野生型外壳蛋白和融合外壳蛋白进行装配，因此所得噬菌体的某些部分将不展示所关注的多肽序列，从而导致较低的展示效率。杂交载体类似于噬菌体载体，因为噬菌体基因组中携带有融合蛋白并且不需要辅助噬菌体，杂交载体还类似于噬菌粒系统，因为基因组也携带有融合蛋白的野生型拷贝。
关于pIX噬菌体展示的先前报道描述了在噬菌粒载体环境中的融合；关于在来自杂交载体或噬菌体载体的pIX上展示多肽尚未见报道。最近已报道了多肽在来自噬菌体载体的pVII上的展示。

[0006] 需要提供合成的非抗体肽或蛋白质文库，和同时提供人治疗性肽和蛋白质的高亲和力和活性、高产率、良好的溶解性质以及在人中施用时低免疫反应倾向这些关键要素的方法。相对于现行方法，还需要提高从合成文库中分离非抗体肽或蛋白质的效率，以减少发现非抗体肽或蛋白质的资源耗费以及加速提供非抗体肽或蛋白质用于生物学评价。通过将综合设计、装配技术以及噬菌体pIX肽或蛋白质展示加以结合，本发明的文库和方法满足了这些需求。

[0007] 本发明提供可与pVII和pIX噬菌体展示一起使用的工程化pIX噬菌体载体，用于利用M13噬菌体的pIX生成肽或蛋白质文库，如使用诱变或其他多样性产生技术，可选地使用同步成熟法(in line maturation)，从而为肽或蛋白质以及非抗体肽或蛋白质片段的生成及治疗性非抗体肽或蛋白质的选择提供有效快速的平台。根据本发明，提供了杂交噬菌体载体，其已经工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组pIX编码区。

[0008] 本发明提供将肽和蛋白质展示为与pIX或pVII噬菌体蛋白的融合物的噬菌体载体，以用于将此类肽或蛋白质表达为肽或蛋白质文库，所述文库用于例如(但不限于)筛选、选择、工程改造、成熟或其他用途，例如提供潜在的治疗性或诊断性肽或蛋白质。因为天然基因IX的调控区和编码区与pVII和pVIII的调控区和编码区重叠，简单融合至该基因的末端可能造成噬菌体失活(Hill和Petersen，J.of Virol.44：32-46，1982)。作为替代，已将M13mp19衍生物改造成含有连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组pIX编码区。该载体(而不是噬菌粒)的使用不需要辅助噬菌体并显著减少在选择和分析期间培养噬菌体所花费的时间和工作量。此外，携带该载体的生长噬菌体的数量比携带噬菌粒的生长噬菌体的数量更容易确定。

[0009] 因此本发明提供了新型载体构建体，其用于以pIX噬菌体展示形式表达肽或蛋白质，以构建多肽阵列。具体地讲，本发明描述了包含编码融合多肽的第二重组pIX编码序列的工程化pIX噬菌体载体，其中所述融合多肽包含融合至丝状噬菌体pVII或pIX蛋白的氨基末端的外源多肽。优选地，所述噬菌体颗粒在其表面包含表达的融合蛋白。

[0010] 在一方面，本发明提供了工程化的重组核酸噬菌体载体，其用于表达结合至所选生物活性配体上的噬菌体展示融合肽或蛋白质，该载体包含(a)重组噬菌体前导编码核酸序列；可操作地连接至：(b)编码重组标签、启动子或选择序列的核酸序列；可操作地连接至：(c)重组pIX或pVII编码核酸序列；可操作地连接至：(d)重组限制性位点；可操作地连接至：(e)编码肽接头的核酸序列；可操作地连接至：(f)选择性地结合到生物活性配体上的第一外源肽或蛋白质编码序列；(g)pVII编码核酸序列；(h)天然pIX编码核酸序列；(i)pIII编码核酸序列；以及(j)pVI编码核酸序列。

[0011] 这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述噬菌体前导编码序列为pelB序列。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列为FLAG标签序列。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列选自SEQ ID NO：3、4、5或6。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述FLAG标签序列包含SEQ ID NO：2。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述启动子为诱导型启动子。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述诱导型启动子为lac启动子。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述肽接头选自SEQ ID NO：7和8。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述第一外源肽或蛋白质是推定的生物活性肽或蛋白质。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述生物活性配体至少介导一种生物体内活性。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述载体编码融合至至少一种噬菌体外壳蛋白上的第二外源肽或蛋白质。

[0012] 本发明还包括包含工程化的核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞。该宿主细胞可表达生物活性融合蛋白。

[0013] 本发明还涉及由根据本发明的细菌宿主细胞表达的生物活性融合蛋白。本发明还涉及源自所述融合蛋白的生物活性外源肽或蛋白质。

[0014] 本发明还涉及包含复数种根据本发明的工程化核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞的噬菌体文库。所述噬菌体文库包括其中所述第一外源肽或蛋白质的变体得以表达。

[0015] 本发明还提供针对具有所需生物活性的外源肽或蛋白质对噬菌体肽或蛋白质文库进行筛选的方法，所述方法包括；(a)由噬菌体文库表达外源肽或蛋白质，以及(b)选择表达具有所述所需生物活性的外源肽或蛋白质的细菌细胞。本发明还提供了根据此方法得到的外源肽或蛋白质编码核酸。

[0016] 在一个实施例中，噬菌体载体还编码第二融合多肽，其中第二融合多肽包含融合至pIX或pVII蛋白的氨基末端的第二外源多肽，并且第一融合多肽中的第一外源多肽融合至pIX或pVII蛋白的氨基末端。在一个实施例中，第一和第二融合多肽可联合形成异型二聚体蛋白质复合物，例如靶标蛋白质、受体、核酸结合蛋白或酶。

[0017] 在另一个实施例中，本发明描述了用于在丝状噬菌体表面表达融合蛋白的载体，所述载体具有用于表达所述融合蛋白的表达盒。该表达盒包含上游和下游可翻译DNA序列，该DNA序列通过适于插入DNA定向连接的核苷酸序列(即多位点接头)可操作地连接，其中上游序列编码原核分泌信号，下游序列编码pVII或pIX丝状噬菌体蛋白。该可翻译DNA序列可操作地连接至一组DNA表达信号上，以将该可翻译DNA序列表达为融合多肽的一些部分。在一个优选的变型中，载体任选地还包含第二表达盒，用于在丝状噬菌体表面上表达第二融合蛋白，其中第二表达盒具有第一表达盒的结构，前提条件是第一融合蛋白表达盒编码pIX或pVII蛋白和/或第二融合蛋白表达盒编码pIX或pVII蛋白。该载体被用作噬菌体基因组来在噬菌体颗粒表面上表达异型二聚体蛋白质复合物，其中该异型二聚体的两种外源多肽通过融合至第一和第二噬菌体蛋白(pVII和/或pIX)而锚定在噬菌体颗粒上。

[0018] 在另一个实施例中，基于所述工程化的pIX噬菌体载体，本发明设想了根据本发明的噬菌体颗粒文库(即组合文库)，其中该文库中的代表性颗粒各自展示不同的融合蛋白。当颗粒展示异型二聚体蛋白复合物时，该文库包含异型二聚体的组合文库，如Fv分子3 4 5 6 7 8 9 10
文库形式的非抗体肽或蛋白质。优选的文库具有至少10、10、10、10、10、10、10、10 、
11 12 13
10 、10 、10 (或其中任何范围或数值)种融合肽或蛋白的组合多样性。

[0019] 一个相关的实施例描述了包含由本发明的工程化pIX噬菌体载体表达的第一和第二多肽的融合蛋白，其中第一多肽是外源蛋白而第二多肽是丝状噬菌体pVII或pIX蛋白，其中外源蛋白融合至丝状噬菌体蛋白的氨基末端上。

[0020] 另外，本发明还设想了多种从本发明的工程化pIX噬菌体载体表达蛋白质或肽的方法，用于产生噬菌体的组合文库，包括将编码外源多肽的基因克隆到本发明的载体中、通过诱变来修饰文库中外源多肽的结构、随机组合第一和第二融合蛋白文库的群体、通过靶向及亲和筛选(“淘选”)来改变文库的多样性等等。

[0021] 设计具有改进的或新颖的功能的蛋白质是一个具有多种医学、工业、环境以及基础研究应用的重要目标。在用工程化pIX噬菌体载体开发非抗体肽或蛋白质组合文库后，强有力的下一步骤是朝着人造非抗体肽或蛋白质构建体以及其他蛋白质基序推进，所述人造抗体构建体以及其他蛋白质基序中二聚物是天然的或可能是功能性的。

[0022] 本发明通过将工程化的pIX噬菌体载体用于构建多肽组合阵列而提供噬菌体展示形式来应对这些挑战，所述多肽组合阵列中pVII和/或pIX用来展示表达单体或二聚体的肽或蛋白质种类的融合蛋白。

[0023] 该技术的范围和能力所固有的是能够展示可参与单体或二聚相互作用的各种蛋白质。这些蛋白质不仅包括非抗体肽或蛋白质，还包括某些酶、激素和激素受体以及DNA结合蛋白。本文所述的展示技术可用于非抗体肽或蛋白质框架区的组合改变，以及改组并微型化非抗体肽或蛋白质结构，或将DNA结合蛋白(例如阻遏蛋白)展示为异型二聚体文库，供选择具有临床和治疗价值的特定DNA序列。

[0024] 因此，本技术提供了肽或蛋白质文库以及其中成员由单体、同型二聚体或异型二聚体阵列组成的组合文库的展示和选择。

[0025] 应当理解，以上一般性的描述和以下详细的描述都仅出于示例性和说明性目的，不应限制受权利要求书保护的本发明。附图说明

[0026] 图1.M13-99载体中的用于表达重组FLAG标签-pIX融合蛋白的合成DNA插入序列。

[0027] 图2.M13-99的图谱，示出了天然噬菌体外壳蛋白基因以及插入的重组pIX基因的位置。

[0028] 图3.示出了抗FLAG标签抗体对展示在M13-99和M13-99L噬菌体上的FLAG-pIX融合蛋白的特异性结合的ELISA。

[0029] 图4.ELISA检测到的展示在pIX上的肽表位。

[0030] 图5.ELISA检测到的展示在pIX上的EGF。通过添加IPTG(0.01mM-1mM)来诱导EGF-pIX从杂交载体表达。[IPTG]浓度＞0.05mM时，与EGFR-MMB的特异性结合明显。

[0031] 图6.展示在pIX上的EGF的FACS分析。噬菌粒：展示在噬菌粒系统中的EGF-pIX；NT：含有pIX-EGF融合的杂交体，生长时无IPTG诱导；0.01mM和1mM:EGF-pIX杂交体，分别由0.01mM和1mM IPTG诱导。

[0032] 本发明提供可与pVII和pIX噬菌体展示一起使用的工程化pIX噬菌体载体，用于利用M13噬菌体的pIX生成肽或蛋白质文库，如使用诱变或其他多样性产生技术，可选地使用同步成熟法，从而为肽或蛋白质及非抗体肽或蛋白质片段的生成以及治疗性非抗体肽或蛋白质的选择提供有效快速的平台。根据本发明，提供了杂交噬菌体载体，其已经工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组pIX编码区。

[0033] 本发明提供将肽和蛋白质展示为与pIX或pVII噬菌体蛋白质的融合物的杂交载体，以用于将此类肽或蛋白质表达为肽或蛋白质文库，所述文库用于例如(但不限于)筛选、选择、工程改造、成熟或其他用途，例如提供潜在的治疗性或诊断性肽或蛋白质。因为天然基因IX的调控区和编码区与pVII和pVIII的调控区和编码区重叠，简单融合至该基因的末端可能造成噬菌体失活(Hill和Petersen，J.of Virol.44：32-46，1982)(8)。作为替代，已将M13mp19的衍生物进行工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组pIX编码区。该载体的使用不同于噬菌粒，其不需辅助噬菌体并显著减少在选择和分析期间培养噬菌体所花费的时间和精力。此外，携带该载体的生长噬菌体的数量比携带噬菌粒的生长噬菌体的数量更容易确定。

[0034] 因此本发明提供了新型载体构建体，其用于以pIX噬菌体展示形式表达肽或蛋白质，以构建多肽阵列。具体地讲，本发明描述了包含编码融合多肽的第二重组pIX编码序列的工程化pIX噬菌体载体，其中所述融合多肽包含融合至丝状噬菌体pVII或pIX蛋白的氨基末端的外源多肽。优选地，噬菌体颗粒包含在其表面上表达的融合蛋白。

[0035] 利用本文所述的这种工程化pIX噬菌体载体生成的人肽或蛋白质从头文库与现有的非抗体肽或蛋白质文库技术现状不同之处在于它通过M13噬菌体的pIX基因来展示。

[0036] 丝状噬菌体

[0037] 本发明设想将本文所述的工程化pIX噬菌体载体与编码至少一种重组融合肽或蛋白质的pIX或pVII噬菌体一起使用。该融合蛋白包含融合至丝状噬菌体pVII或pIX蛋白的氨基末端上的外源多肽部分。

[0038] 所谓“外源”意指融合至噬菌体蛋白的多肽通常不与丝状噬菌体的野生型种类中的噬菌体pVII或pIX蛋白相缔合，而是对于正常噬菌体蛋白来说是外来的。

[0039] 在一个优选实施例中，丝状噬菌体封装有编码第一和/或第二融合蛋白的基因组，其中第一融合蛋白包含融合至pVII或pIX的第一外源多肽，第二融合蛋白包含融合至pIX或pIX的第二外源多肽。

[0040] 如本文所述，丝状噬菌体还包含展示于噬菌体颗粒表面上的一种或多种融合蛋白。因此，如果存在至少第一和第二融合蛋白，则噬菌体可以功能性方式展示这些蛋白质，使得第一和第二外源多肽可相互作用成为异型二聚体，从而在噬菌体表面上形成功能性双链蛋白质复合物。

[0041] 在存在于本发明噬菌体上的融合蛋白中，外源多肽与丝状噬菌体pVII或pIX蛋白之间的“融合”可包含典型的酰胺键，或可如实例中所述包含连接多肽(即“接头”)。可使用多种接头中的任何一种，所述接头通常为一段长度为5至50个氨基酸的序列。尤其优选的接头可在连接点处给融合蛋白提供高度的活动性。

[0042] 文库设计：以前的合成文库并入了以下内容的一部分，但没有一个全面地包含以下全部内容。

[0043] 序列多样性的位置和性质。序列多样性是如何内源提供具有高亲和力、选择性结合实体的人蛋白质的标志。这种序列多样性的产生和积累不是随机的。基因组序列的核苷酸突变位点和类型因DNA序列和机理而具有偏向性，但是只有提供结合和功能优势的突变才被选择和存储，并且通常还伴有中性置换。虽然不易从机理预测，但已知的人肽或蛋白质序列和结构功能分析的数据库能鉴定在大多数情况下与所需靶标或抗原的识别(包括蛋白质、肽和小分子抗原之间的区分)相关的位置和氨基置换。本发明的文库通过利用设计的简并寡核苷酸来在推定的结合区及功能区整合进置换，从而提供这种天然的人多样性。

[0044] 表达、生物化学和生物物理特性。优选的人类非抗体肽或蛋白质不仅具有所需生物活性和结合活性，而且可由多种宿主有效生产，并且具有稳定性和良好的溶解特性。高频率种系基因用法(1d)也表明其在哺乳动物系统中具有良好的表达。此外，通过选择或筛选的细菌噬菌体展示方法来从文库回收的非抗体肽或蛋白质应在细菌宿主中良好表达。本发明的文库是基于人种系衍生的模板，所述模板是从标准的重组哺乳动物宿主(如HEK293和CHO细胞)以及细菌宿主良好表达和纯化的，并且具有高稳定性和良好的溶解特性。

[0045] 文库组装技术。一些优选的从头非抗体肽或蛋白质文库均具有高的多样性(＞10
10 )，易于改变，容易组装，并且不需要的序列的背景低。这些背景序列包括亲代模板和低靶向多样性。结合以下方法可加速文库组装并产生低的背景：(a)基于Kunkle的单链诱变；
(b)具有限制性位点的回文环；(c)大引物。

[0046] pIX肽或蛋白质噬菌体展示。所有以前的丝状噬菌体从头人非抗体肽或蛋白质文库均利用pIII或pVIII噬菌体外壳蛋白来进行展示。pIX与所选的肽或蛋白质模板的组合是用于回收非抗体肽或蛋白质的更有效的选择系统，所回收的非抗体肽或蛋白质在转化为单克隆抗体及其他相关分子时保留它们的选定特性。

[0047] 肽或蛋白质展示。肽或蛋白质是人非抗体肽或蛋白质的天然片段，当它们通过基因工程引入至完全非抗体肽或蛋白质中时可更好地重演它们的活性。肽或蛋白质的有效丝状噬菌体展示除了要求在细菌宿主中良好表达这个性质之外还要去其他特性。本发明的文库中所用的肽序列被选择用于通过pIX在丝状噬菌体上有效展示。

[0048] 噬菌粒展示。相对于噬菌体pIX外壳蛋白而言肽或蛋白质分子可能较大，因此如果连接至在细菌细胞中产生的所有pIX蛋白的话，则可能干扰重组噬菌体颗粒的装配。规避此干扰的一种方法为利用pIX噬菌粒系统，凭此野生型pIX蛋白和肽或蛋白质连接的pIX蛋白都可整合进重组噬菌体颗粒中。在一个优选应用中，本发明的文库是通过pIX在噬菌粒系统中展示。

[0049] 用于展示的噬菌体外壳蛋白pIX。类似于pIII，pIX以较低的拷贝数存在于噬菌体上，并适合于对所展示的肽或蛋白质进行亲和选择。然而，pIII蛋白参与侵染过程并起着关键作用，展示在该pIII蛋白上的蛋白质可能会干扰侵染效率。此外，重链Fd片段或轻链片段均可与pIX融合以进行展示。预计展示在pIX蛋白上的本发明文库可被有效复制并递呈，以进行选择和/或筛选。

[0050] 肽或蛋白质-pIX表达。筛选从噬菌体文库中回收的肽或蛋白质的一种方法是去除连接至用来展示的肽或蛋白质分子上的噬菌体外壳蛋白。pIX蛋白的小尺寸提供了不需此步骤而直接筛选肽或蛋白质的生产选择。

[0051] 噬菌体构造。合适的M13或相似类型的噬菌体载体可用作根据本发明的工程化载体。可根据已知技术对具有合适调节、选择、限性制酶切以及其他所需位点和序列(如启动子、信号序列、前导序列(如pelB)、核糖体结合位点(如Shine-Delgano)、标签(如FLAG标签)、转录终止子(如trpA)、选择序列(如LACZ)、限制性位点(如HindIII、EcoRI)、肽接头等等)的编码pIX或pVII融合蛋白的这种载体进行修饰，使其还包含连接至上游信号肽编码序列和诱导型启动子(如LacZa)的第二pIX和/或pVII编码序列。这消除了对辅助噬菌体的需要，并且还显著减少了在选择和/或分析步骤期间培养噬菌体所需的时间和精力。另外，与使用其他载体相比，可更容易地确定需要培养的噬菌体数量。

[0052] 举个非限制性的例子，源自M13mp19的M13KE是已知的可通过插入重组pIX基因来提供本发明的工程化pIX噬菌体载体的噬菌体载体。可将重组区插入(例如)M13mp19的lacZα区，位于噬菌体基因组的基因间区域中，因此lac启动子可驱动重组基因IX融合的转录。插入序列(图1)可包含Shine-Delgarno序列(核糖体结合位点)、来自果胶裂解酶B的信号序列(pelB)、用于后续克隆的双BbsI限制性酶识别位点、pIX编码区以及trpA转录终止子。FLAG标签肽DYKDDDDK以及五氨基酸接头(M13-99：GGTKT)或九氨基酸接头(M13-99L：SGGSGGTKT)包含在pelB与IX基因之间。

[0053] 可用九氨基酸接头将具有各种长度和电荷的另外的肽(例如，但不限于表1中的那些)展示于pIX的氨基末端，以确定最适合表达特定多肽的接头。此外，将一种或多种外源融合肽展示于pIX或pVII上。

[0054] 可针对肽标签的展示分析最终噬菌体载体是否含有重组pIX基因，如在ELISA实验中进行分析。可用抗M13/或靶标缀合物或任何其他表达外源肽的检测方法来检测结合至固定化的靶标肽或蛋白质上的噬菌体。

[0055] 优点。用于在pIX上展示肽的杂交系统相对于此前开发的pIX噬菌粒系统来说具有速度和方便性方面的优点。可将噬菌体感染进宿主细胞中并扩增一个下午，基本上在一个步骤中进行。相反，噬菌粒的扩增需要进行噬菌粒感染和长出、用辅助噬菌体以确定的培养物浓度进行超感染以及对所救援的噬菌体进行扩增。因此该过程必需要额外的步骤和操作者输入，并且(至少)要过夜培养。相对于典型选择实验中涉及的重复选择循环和多轮筛选过程，杂交系统的时间节省十分明显。此外，噬菌粒扩增可生成含有噬菌粒或辅助噬菌体基因组的噬菌体混合物。因此精确定量含有噬菌粒基因组的病毒颗粒的数量更为困难。杂交系统不需辅助噬菌体感染，因而仅存在一种类型的噬菌体基因组可包装进噬菌体颗粒中。这样便生成了均一的噬菌体群体，从而可精确测量包含融合基因组的病毒颗粒。

[0056] 虽然已概括地描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例中进一步公开，所述实例不应理解为限制权利要求的范围。

[0057] 实例1：示例性的工程化噬菌体载体的构建

[0058] 噬菌体的构建。M13-99和M13-99L含有插入噬菌体基因组M13KE(M13mp19的衍生物)的重组pIX基因。该重组区被插入M13mp19的lacZα区，位于噬菌体基因组的基因间区域，因此lac启动子可驱动重组基因IX融合的转录。插入序列(图1)包含Shine-Delgarno序列(核糖体结合位点)、果胶裂解酶B的信号序列(pelB)、用于后续克隆的双BbsI限制性酶识别位点、pIX编码区以及trpA转录终止子。FLAG标签肽DYKDDDDK(SEQ ID NO：2)和五氨基酸接头(M13-99：GGTKT(SEQ IDNO：7))或九氨基酸接头(M13-99L：SGGSGGTKT(SEQ ID NO：8))包含于pelB和基因IX之间。

[0059] 具有各种长度和电荷的四种另外的肽(表1)通过九氨基酸接头展示于pIX的氨基末端。此外，将表皮生长因子(EGF)(5.6kDa)展示于pIX上，以评估通过多个二硫键展示的球蛋白的可行性。

[0060] 方法。合成编码两侧有HindIII和EcoRI酶识别位点的FLAG盒(图1)的DNA(Blue Heron)，通过限制性酶消化使之从其穿梭载体中释放出来，然后连接进已经用HindIII和EcoRI消化过的M13KE(New England Biolabs)。最终的噬菌体载体M13-99(SEQ ID NO：1)在图2中示出。对于其他肽，使互补的寡核苷酸退火到一起而生成合适的DNA序列。退火的寡核苷酸含有与BbsI消化的13-99L载体对应的相容悬突，使得肽标签DNA和载体能连接。对EGF进行PCR扩增，用BbsI限制性内切酶消化，然后连接到BbsI消化的M13-99L中。接种重组噬菌体以用于在XL-1蓝宿主大肠杆菌细胞(Stratagene)的菌苔上分离出单个菌斑。将噬菌斑重新悬浮于介质中，并让其在琼脂上扩散。将噬菌体感染进XL-1蓝大肠杆菌细胞并在37℃下培养4.5小时。1mM IPTG是诱导pIX融合蛋白表达的标准手段，但对于某些实验，可使用多种量(1.0至0.01mM)的IPTG来诱导EGF表达。在噬菌体生长和诱导之后，通过离心移除细菌，用4％PEG-8000、0.5M NaCl将噬菌体从培养上清液中沉淀出来，并在4℃下孵育过夜。通过离心回收噬菌体颗粒，并将噬菌体粒料重新悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中。

[0061] pIX展示的肽的分析。在ELISA实验中针对肽标签的展示对含有重组pIX基因的噬菌体进行测试。用抗M13/HRP缀合物来检测结合在固定化的单克隆非抗体肽或蛋白质上的噬菌体。除了M13-99和M13-99L，还包括了M13KE亲代载体作为阴性对照。在完全相同的抗FLAG包被的小孔中，将过量的合成FLAG肽包括在噬菌体结合反应物中作为竞争物。相对于抗多聚组氨酸抗体，M13-99和M13-99L看起来都特异性地结合至抗FLAG抗体，并且此结合被过量的FLAG肽所抑制，表明FLAG标签在重组pIX上成功展示(图3)。M13-99L产生较低的背景信号，因此被用于其他肽的展示。

[0062] 其他肽的ELISA数据示于图4中。抗his、抗myc、抗V5以及抗HA非抗体肽或蛋白质被用于合适的噬菌体。在每个实验中包括Fc以作为阴性对照。这些结果表明这些肽也在重组pIX上成功展示。

[0063] 方法。将Maxisorp ELISA板(NUNC)的小孔用250ng单克隆非抗体肽或蛋白质(PBS中4μg/mL)包被，在4℃下过夜。用含有0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水(TBS-T)冲洗小孔两次，然后用Starting Block(Pierce)在室温下封闭1小时。再次冲洗小孔。将9
稀释于Starting Block中的PEG沉淀的噬菌体(约10pfu)加入小孔中并且在室温下振荡孵育1.5小时。对于M13-99和M13-99L，加入FLAG肽至终浓度为0.1mg/mL以作为竞争剂并继续孵育15分钟。用TBS-T冲洗小孔三次，将抗M13/辣根过氧化物酶缀合物(GE Healthcare)(在Starting Block中以1∶5000稀释)加入小孔中，并在室温下振荡孵育
1小时。用TBS-T冲洗小孔三次，然后加入POD化学发光底物(Roche)并且在Tecan读板器上进行检测。

[0064] pIX展示的EGF的分析。在ELISA实验中测试了pIX展示的EGF与EGFR-MMB的结合，并在FACS实验中测试了与在A431细胞上表达的EGFR的结合。(注意，EGFR-MMB融合蛋白已在另一个最近的发明公开中有所描述。)用抗m13:HRP单克隆抗体检测通过ELISA发现结合至EGFR-MMB的噬菌体颗粒(图5)，而那些通过FACS发现结合至A431细胞上的EGFR的噬菌体颗粒则用抗M13:FITC单克隆抗体进行检测(图6)。ELISA数据证实EGF成功展示于pIX杂交系统中。在FACS实验中，将亲代载体M13KE和未诱经导的EGF-pIX杂交噬菌体包括在内作为阴性对照。方法。对于ELISA实验，用5μg/mL的抗Fc单克隆抗体包被Maxisorp板，4℃下过夜。用TBS-T冲洗板三次，然后将500ng EGFR-MMB加至一半被包被小孔中。用TBS-T处理剩余的小孔。洗涤该板，并以每孔300μL的Chemiblocker(Chemicon)在室温下封闭1小时。用TBS-T冲洗小孔，将噬菌体的系列稀释液加入小孔中，使其结合1小时。用TBS-T洗小孔3次后，如上所述检测所结合的噬菌体。对于FACS分析，用0.25％的6
tyrpsin-EDTA收获A431细胞，用含10％FBS和1％NEAA的完全DMEM洗涤两次，以2.5×10
5
个细胞/毫升重新悬浮于含有叠氮化钠的FACS缓冲液中。将细胞(2.5×10)与滴定当量的噬菌体或小鼠抗M13:FITC(RDI，Fitzgerald Industries)于4℃在含有叠氮化钠的FACS缓冲液中一起孵育一小时。将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次以移除任何未结合的噬菌体，并将其与小鼠抗M13:FITC抗体于4℃下在FACS缓冲液中孵育一小时。洗涤细胞以移除未结合的抗体，并用流式细胞仪分析噬菌体结合。

[0065] 图1.克隆至pIX杂交表达载体中的肽序列。

[0066]肽标签 氨基酸序列
FLAG DYKDDDDK(SEQ ID NO：2)
HA YPYDVPDYA(SEQ ID NO：3)
His HHHHHH(SEQ ID NO：4)
MYC MEQKLISEEDLNS(SEQ ID NO：5)
V5 GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO：6)

[0067] 参考文献

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[0076] 序列表

[0077] SEQ ID NO：1

[0078] aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgccccaaatgaaaat 60[0079] atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaactaaatctact 120[0080] cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagacaccgtacttta 180[0081] gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag caccagattc agcaattaagctctaagcca 240[0082] tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaatcctgacctg 300[0083] ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcgatatttgaag 360[0084] tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctgactataatagt 420[0085] cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaactgtttaaagca 480[0086] tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgctatccagtct 540[0087] aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctctcgctatttt 600[0088] ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttactatgcctcgt 660[0089] aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaaatctcaactg 720[0090] atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaacgtagatttt 780[0091] tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcataaggtaattca 840[0092] caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgttctggtgttt 900[0093] ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgatttgggtaatg 960[0094] aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctatgcgcctggtc 1020[0095] tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttcccttatgattgacc 1080[0096] gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcgacacaatttat 1140[0097] caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataatcgctgggggt 1200[0098] caaagatgag tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttggtgccttcgta 1260[0099] gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagtctttagtcct 1320[0100] caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctgctgagggtga 1380[0101] cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaatatatcggtta 1440[0102] tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagctgtttaagaa 1500[0103] attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctccttttggagcctttt 1560[0104] ttttggagat tttcaacgtg aaaaaattat tattcgcaat tcctttagtggtacctttct 1620[0105] attctcactc ggccgaaact gttgaaagtt gtttagcaaa atcccatacagaaaattcat 1680[0106] ttactaacgt ctggaaagac gacaaaactt tagatcgtta cgctaactatgagggttgtc 1740[0107] tgtggaatgc tacaggcgtt gtagtttgta ctggtgacga aactcagtgttacggtacat 1800[0108] gggttcctat tgggcttgct atccctgaaa atgagggtgg tggctctgagggtggcggtt 1860[0109] ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggta ctaaacctcc tgagtacggtgatacaccta 1920[0110] ttccgggcta tacttatatc aaccctctcg acggcactta tccgcctggtactgagcaaa 1980[0111] accccgctaa tcctaatcct tctcttgagg agtctcagcc tcttaatactttcatgtttc 2040[0112] agaataatag gttccgaaat aggcaggggg cattaactgt ttatacgggcactgttactc 2100[0113] aaggcactga ccccgttaaa acttattacc agtacactcc tgtatcatcaaaagccatgt 2160[0114] atgacgctta ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggctttaatgaag 2220[0115] atccattcgt ttgtgaatat caaggccaat cgtctgacct gcctcaacctcctgtcaatg 2280[0116] ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggtggctctgagggtg 2340[0117] gcggttctga gggtggcggc tctgagggag gcggttccgg tggtggctctggttccggtg 2400[0118] attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaaaatgccgatg 2460[0119] aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctactgattacggtg 2520[0120] ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaatggtgctactg 2580[0121] gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgataattcacctt 2640[0122] taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ccctccctca atcggttgaatgtcgccctt 2700[0123] ttgtctttag cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaaataaacttat 2760[0124] tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgtattttctacgt 2820[0125] ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aatcatgcca gttcttttgggtattccgtt 2880[0126] attattgcgt ttcctcggtt tccttctggt aactttgttc ggctatctgcttacttttct 2940[0127] taaaaagggc ttcggtaaga tagctattgc tatttcattg tttcttgctcttattattgg 3000[0128] gcttaactca attcttgtgg gttatctctc tgatattagc gctcaattaccctctgactt 3060[0129] tgttcagggt gttcagttaa ttctcccgtc taatgcgctt ccctgtttttatgttattct 3120[0130] ctctgtaaag gctgctattt tcatttttga cgttaaacaa aaaatcgtttcttatttgga 3180[0131] ttgggataaa taatatggct gtttattttg taactggcaa attaggctctggaaagacgc 3240[0132] tcgttagcgt tggtaagatt caggataaaa ttgtagctgg gtgcaaaatagcaactaatc 3300[0133] ttgatttaag gcttcaaaac ctcccgcaag tcgggaggtt cgctaaaacgcctcgcgttc 3360[0134] ttagaatacc ggataagcct tctatatctg atttgcttgc tattgggcgcggtaatgatt 3420[0135] cctacgatga aaataaaaac ggcttgcttg ttctcgatga gtgcggtacttggtttaata 3480[0136] cccgttcttg gaatgataag gaaagacagc cgattattga ttggtttctacatgctcgta 3540[0137] aattaggatg ggatattatt tttcttgttc aggacttatc tattgttgataaacaggcgc 3600[0138] gttctgcatt agctgaacat gttgtttatt gtcgtcgtct ggacagaattactttacctt 3660[0139] ttgtcggtac tttatattct cttattactg gctcgaaaat gcctctgcctaaattacatg 3720[0140] ttggcgttgt taaatatggc gattctcaat taagccctac tgttgagcgttggctttata 3780[0141] ctggtaagaa tttgtataac gcatatgata ctaaacaggc tttttctagtaattatgatt 3840[0142] ccggtgttta ttcttattta acgccttatt tatcacacgg tcggtatttcaaaccattaa 3900[0143] atttaggtca gaagatgaaa ttaactaaaa tatatttgaa aaagttttctcgcgttcttt 3960[0144] gtcttgcgat tggatttgca tcagcattta catatagtta tataacccaacctaagccgg 4020[0145] aggttaaaaa ggtagtctct cagacctatg attttgataa attcactattgactcttctc 4080[0146] agcgtcttaa tctaagctat cgctatgttt tcaaggattc taagggaaaattaattaata 4140[0147] gcgacgattt acagaagcaa ggttattcac tcacatatat tgatttatgtactgtttcca 4200[0148] ttaaaaaagg taattcaaat gaaattgtta aatgtaatta attttgttttcttgatgttt 4260[0149] gtttcatcat cttcttttgc tcaggtaatt gaaatgaata attcgcctctgcgcgatttt 4320[0150] gtaacttggt attcaaagca atcaggcgaa tccgttattg tttctcccgatgtaaaaggt 4380[0151] actgttactg tatattcatc tgacgttaaa cctgaaaatc tacgcaatttctttatttct 4440[0152] gttttacgtg ctaataattt tgatatggtt ggttcaattc cttccataattcagaagtat 4500[0153] aatccaaaca atcaggatta tattgatgaa ttgccatcat ctgataatcaggaatatgat 4560[0154] gataattccg ctccttctgg tggtttcttt gttccgcaaa atgataatgttactcaaact 4620[0155] tttaaaatta ataacgttcg ggcaaaggat ttaatacgag ttgtcgaattgtttgtaaag 4680[0156] tctaatactt ctaaatcctc aaatgtatta tctattgacg gctctaatctattagttgtt 4740[0157] agtgcaccta aagatatttt agataacctt cctcaattcc tttctactgttgatttgcca 4800[0158] actgaccaga tattgattga gggtttgata tttgaggttc agcaaggtgatgctttagat 4860[0159] ttttcatttg ctgctggctc tcagcgtggc actgttgcag gcggtgttaatactgaccgc 4920[0160] ctcacctctg ttttatcttc tgctggtggt tcgttcggta tttttaatggcgatgtttta 4980[0161] gggctatcag ttcgcgcatt aaagactaat agccattcaa aaatattgtctgtgccacgt 5040[0162] attcttacgc tttcaggtca gaagggttct atctctgttg gccagaatgtcccttttatt 5100[0163] actggtcgtg tgactggtga atctgccaat gtaaataatc catttcagacgattgagcgt 5160[0164] caaaatgtag gtatttccat gagcgttttt cctgttgcaa tggctggcggtaatattgtt 5220[0165] ctggatatta ccagcaaggc cgatagtttg agttcttcta ctcaggcaagtgatgttatt 5280[0166] actaatcaaa gaagtattgc tacaacggtt aatttgcgtg atggacagactcttttactc 5340[0167] ggtggcctca ctgattataa aaacacttct caagattctg gcgtaccgttcctgtctaaa 5400[0168] atccctttaa tcggcctcct gtttagctcc cgctctgatt ccaacgaggaaagcacgtta 5460[0169] tacgtgctcg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaagcgcggcggg 5520[0170] tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgcccgctccttt 5580[0171] cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaagctctaaatcg 5640[0172] ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgaccccaaaaaacttga 5700[0173] tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttcgccctttgac 5760[0174] gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaacactcaaccc 5820[0175] tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggaaccaccatcaaa 5880[0176] caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaactctctcagggc 5940[0177] caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcgctgg tgaaaagaaaaaccaccctg 6000[0178] gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaatgcagctggca 6060[0179] cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatgtgagttagct 6120[0180] cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgttgtgtggaat 6180[0181] tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacgccaagcttag 6240[0182] gaggacagct atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttattactcgcggc 6300[0183] ccagccggcc atggccgtct tcgactataa ggatgatgac gacaaaggcggtacgaagac 6360[0184] gatgagtgtt ttagtgtatt ctttcgcctc tttcgtttta ggttggtgccttcgtagtgg 6420[0185] cattacgtat tttacccgtt taatggaaac ttcctcataa tgaactcagatacccagccc 6480[0186] gcctaatgag cgggcttttt tttgaattca ctggccgtcg ttttacaacgtcgtgactgg 6540[0187] gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atccccctttcgccagctgg 6600[0188] cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcagcctgaatggc 6660[0189] gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc cggaaagctggctggagtgc 6720[0190] gatcttcctg aggccgatac ggtcgtcgtc ccctcaaact ggcagatgcacggttacgat 6780[0191] gcgcccatct acaccaacgt aacctatccc attacggtca atccgccgtttgttcccacg 6840[0192] gagaatccga cgggttgtta ctcgctcaca tttaatgttg atgaaagctggctacaggaa 6900[0193] ggccagacgc gaattatttt tgatggcgtt cctattggtt aaaaaatgagctgatttaac 6960[0194] aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aatttaaatatttgcttata 7020[0195] caatcttcct gtttttgggg cttttctgat tatcaaccgg ggtacatatgattgacatgc 7080[0196] tagttttacg attaccgttc atcgattctc ttgtttgctc cagactctcaggcaatgacc 7140[0197] tgatagcctt tgtagatctc tcaaaaatag ctaccctctc cggcattaatttatcagcta 7200[0198] gaacggttga atatcatatt gatggtgatt tgactgtctc cggcctttctcacccttttg 7260[0199] aatctttacc tacacattac tcaggcattg catttaaaat atatgagggttctaaaaatt 7320[0200] tttatccttg cgttgaaata aaggcttctc ccgcaaaagt attacagggtcataatgttt 7380[0201] ttggtacaac cgatttagct ttatgctctg aggctttatt gcttaattttgctaattctt 7440[0202] tgccttgcct gtatgattta ttggatgtt 7469

[0203] DYKDDDDK(SEQ ID NO：2)

[0204] YPYDVPDYA(SEQ ID NO：3)

[0205] HHHHHH(SEQ ID NO：4)

[0206] MEQKLISEEDLNS(SEQ ID NO：5)

[0207] GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO：6)

[0208] GGTKT(SEQ ID NO：7)

[0209] SGGSGGTKT(SEQ ID NO：8)