先兆子痫是一种妊娠特异疾病，其在世界范围内影响全部孕妇的 5-8％，并且是产妇和新生儿发病和死亡的主要原因之一。术语“先兆子痫” 是指怀孕20周后出现的血压升高和尿液中蛋白升高、相关症状和有关疾 患。尽管先兆子痫的原因仍是未知的，但是临床证据明确指出胎盘是病理 生理异常点。普遍的观点是胎盘发育期间有害的细胞侵入和蜕膜螺旋动脉 的不正常发育造成了先兆子痫的出现。尽管进行了大量研究，然而最终导 致先兆子痫的因素还没有完全确定。
目前，医生根据多种常规测试(如血压、血液蛋白浓度等)与其他生 理情况的结合作出最终诊断。然而，假如患先兆子痫的孕妇的症状一旦在 第三个三月期完全出现，则预防性临床筛选就失去了作用。目前，还没有 早期检测先兆子痫的准确方法。
因此，人们希望识别可用于在症状发作之前检测先兆子痫的先兆子痫 生物标志，以对该病情进行合适的治疗。

先兆子痫中差别表达的蛋白目前已经被识别可用作生物标志以对先 兆子痫进行诊断、预后和分级，发作预测以及治疗。这些蛋白的许多种在 功能上涉及或者指向参与先兆子痫病理的若干生物学途径或过程。
因此，本发明的一个方面提供了一种诊断哺乳动物中先兆子痫，或者 检测或预测其出现的方法。所述方法包括以下步骤：
(a)测定取自所述哺乳动物的生物样品中至少一种先兆子痫生物标志 的表达水平或活性，和
(b)将每种先兆子痫生物标志的表达水平或活性与未患先兆子痫的哺 乳动物中该生物标志的水平或活性进行比较，其中该生物标志的差别表达 水平或差别活性表明所述哺乳动物患有先兆子痫或可出现先兆子痫。
本发明的另一方面提供了一种对哺乳动物中先兆子痫进行诊断、监测 或分级的方法，其包括以下步骤：
(a)在取自所述哺乳动物的第一生物样品中测定至少一种先兆子痫生 物标志的表达水平或活性，和
(b)将每种先兆子痫生物标志的表达水平或活性与在先于所述第一样 品取得的第二生物样品中测定的该生物标志的水平或活性进行比较，以监 测所述哺乳动物中的先兆子痫。
另一方面提供了一种用于诊断哺乳动物先兆子痫的微阵列，包括至少 一种能够检测至少两种先兆子痫生物标志的试剂，所述生物标志在患先兆 子痫的哺乳动物中与健康哺乳动物中的所述生物标志水平相比表现差别 表达水平或活性水平。
另一方面提供一种筛选治疗哺乳动物先兆子痫的候选治疗性化合物 的方法。所述方法包括以下步骤：
(a)将表达至少一种先兆子痫生物标志的生物样品与所述候选治疗性 化合物一起孵育，和
(b)测定所述候选治疗性化合物是否调节所述先兆子痫生物标志的表 达或活性，其中对所述先兆子痫生物标志的表达或活性水平的调节表明所 述候选治疗性化合物可为一种治疗或预防先兆子痫的治疗性试剂。
本发明的另一个方面提供了一种监测哺乳动物先兆子痫治疗的方法， 其包括以下步骤：
(a)在治疗过程中的不同时间点测定取自所述哺乳动物的生物样品中 至少一种先兆子痫生物标志的表达水平或活性，和
(b)在每个时间点将每种先兆子痫生物标志的表达水平或活性与健康 哺乳动物中该生物标志的水平或活性进行比较，其中该生物标志在所述哺 乳动物中与健康哺乳动物相比的差别表达水平或差别活性随时间的降低 表明所述治疗有效。
本发明的另一方面提供用于诊断先兆子痫的试剂盒。所述试剂盒包括 至少一种可用于检测一种生物标志的试剂，所述生物标志与健康哺乳动物 中的其表达或活性相比在取自患先兆子痫的哺乳动物的生物样品中表现 出差别表达活性。
本发明的这些和其他方面根据下面的描述、附图和权利要求会更加清 楚。

图1示出了被识别为在超过或不到28周的先兆子痫发现样品组中差 别表达的蛋白的功能分类。

本发明基于对若干可用于哺乳动物中先兆子痫的早期检测、诊断、监 测、分级、预测和预后的生物标志的识别。在取自哺乳动物的样品中，可 用于先兆子痫检测的生物标志与健康哺乳动物中相比表现差别表达或活 性水平并可在取自哺乳动物的生物样本中被识别。
本文所用的术语“先兆子痫生物标志”是指取自哺乳动物的样品中的 一种组分，其与健康哺乳动物中相比表现差别表达或活性水平。本文所用 的术语“健康哺乳动物”是指未患先兆子痫也无出现先兆子痫倾向的孕期 哺乳动物。依照本发明先兆子痫生物标志的实例包括但不限于：脂肪酸结 合蛋白4(FABP4)、烯酰辅酶A水化酶(ECHS1)、Δ3，5-Δ2，4-二烯酰-辅 酶A异构酶(ECH1)、抗氧化剂蛋白Per6、热休克蛋白β-1、胞浆磷蛋白 (stathmin)、脂皮质蛋白(lipocortin)1(LPC1)、前列腺素脱氢酶1、 增殖相关蛋白2G4、胎盘生长激素(绒毛膜生长催乳激素)(CSH1)、雌二 醇17-β脱氢酶(HSD17B1)和巨噬细胞加帽蛋白，以及如本领域技术人员 能理解的，同样与先兆子痫有关的上述蛋白的代谢物和衍生物，包括脂肪 酸、酯和蛋白。
本文所用的术语“哺乳动物”包括人类和非人哺乳动物如家畜和野生 动物。
本文所用的术语“FABP4”是指哺乳动物脂肪酸结合蛋白4，包括人 类FABP4(登录号sp|P15090|FABPA_HUMAN)及其非人等价物。
本文所用的术语“ECHS1”是指哺乳动物烯酰辅酶A水化酶，包括人 类ECHS1(登录号sp|P30084|ECHM_HUMAN)及其非人等价物。
本文所用的术语“ECH1”是指哺乳动物Δ3，5-Δ2，4-二烯酰辅酶A 异构酶，包括人类ECH1(登录号sp|Q13011|ECH1_HUMAN)及其非人等价 物。
本文所用的术语“Per6”是指哺乳动物抗养护剂蛋白Per6，包括人 类Per6(登录号sp|P30041|PRDX6_HUMAN)及其非人等价物。
本文所用的术语“热休克蛋白β-1”是指所述蛋白的哺乳动物形式， 包括人类形式(登录号sp|P04792|HSPB1_HUMAN)及其对应的非人等价物。
本文所用的术语“胞浆磷蛋白”是指哺乳动物胞浆磷蛋白，包括人类 ECHS1(登录号sp|P16949|STMN1_HUMAN)及其对应的非人等价物。
本文所用的术语“前列腺脱氢酶1”是指所述蛋白的哺乳动物形式， 包括人类形式(登录号sp|P15428|PGDH_HUMAN)及其对应的非人等价物。
本文所用的术语“″LPC1”是指哺乳动物脂皮质蛋白，包括人类LPC1 (登录号sp|P04083|ANXA1_HUMAN)及其对应的非人等价物。
本文所用的术语″2G4″是指哺乳动物增殖相关蛋白2G4(登录号 sp|Q9UQ80|PA2G4_HUMAN)及其对应的非人等价物。
本文所用的术语“CSH1”是指人类胎盘生长激素(绒毛膜生长催乳激 素)(登录号sp|P01243|CSH_HUMAN)及其对应的非人等价物。
本文所用的术语″HSD17B1″是指人类雌二醇17-β脱氢酶(登录号 sp|P14061|DHB1_HUMAN)及其对应的非人等价物。
本文所用的术语“巨噬细胞加帽蛋白”是指所述蛋白的哺乳动物形式， 包括人类形式(登录号sp|P04121|HSPB1_HUMAN)及其对应的非人等价物。
依照本发明先兆子痫生物标志可参与某些代谢功能。在一个实施方案 中，先兆子痫生物标志参与脂肪酸代谢，所述脂肪酸例如脂肪酸结合蛋白 4(FABP4)、烯酰辅酶A水化酶(ECHS1)和Δ3，5-Δ2，4-二烯酰-辅酶A异 构酶(ECH1)。在另一个实施方案中，先兆子痫生物标志具有与雌激素前体 (如雌二醇17β脱氢酶和增殖相关蛋白2G4(PA2G4))的代谢有关的功能， 在另一个实施方案中，先兆子痫生物标志与氧化应激(如抗氧化物蛋白 Per6、热休克蛋白β-1(HSP27)和胞浆磷蛋白)有关。脂皮质蛋白(LPC1) 和前列腺素脱氢酶1(PDGH1)先兆子痫生物标志参与炎症反应，增殖相关 蛋白2G4、CSH1、雌二醇17β脱氢酶(HSD17B1)和巨噬细胞加帽蛋白(CAPG) 均参与生长控制和调节。
依照本发明先兆子痫生物标志包括上调的蛋白、编码所述蛋白的多核 苷酸以及它们的代谢物或衍生物，即在患先兆子痫的哺乳动物中的表达或 活性水平比健康哺乳动物中正常的表达或活性水平高。上调先兆子痫生物 标志的实例包括，例如，脂肪酸结合蛋白(FABP4)、抗氧化剂蛋白Per6、 热休克蛋白β-1、前列腺素脱氢酶1和巨噬细胞加帽蛋白。
依照本发明先兆子痫生物标志也包括下调的蛋白、编码所述蛋白的多 核苷酸以及它们的代谢物或衍生物，即在患先兆子痫的哺乳动物中的表达 或活性水平比健康哺乳动物中正常的表达或活性水平低。下调先兆子痫生 物标志的实例包括增殖相关蛋白2G4(PA2G4)、烯酰辅酶A水化酶(ECHS1)、 Δ3，5-Δ2，4-二烯酰-辅酶A异构酶(ECH1)、胞浆磷蛋白、脂皮质蛋白 (LPC1)、增殖相关蛋白2G4、胎盘生长激素或绒毛膜生长催乳激素(CSH1) 和雌二醇17-β脱氢酶(HSD17B1)。
本发明诊断哺乳动物中先兆子痫的方法检测哺乳动物生物样品中的 至少一种先兆子痫生物标志的表达或活性水平。本文所用的术语“生物样 品”是指任何可从哺乳动物获得的含先兆子痫生物标志的样品。在一个实 施方案中，优选地所述样品可非侵入地获得，包括例如唾液、痰、尿液、 汗液、宫颈分泌物和阴道或宫颈粘液。在另一个实施方案中，当所述先兆 子痫生物标志是蛋白时，所述生物样品可为含核酸的样品以适于检测编码 所述先兆子痫生物标志的核酸，所述样品包括例如唾液、尿液和其他身体 分泌物以及头发、上皮细胞等。尽管本方法优选使用这些非侵入地获得的 生物样品，然而本领域技术人员理解本发明方法也可使用侵入式获得的含 蛋白和核酸生物样品，所述侵入式获得的样品包括例如血液(包括白细胞、 血清、血浆)、羊水、胎盘组织和标准化的胎盘绒毛、骨髓、腹膜液、胸 膜液、脑脊液(CSF)和淋巴结样品。本领域技术人员知晓侵入式地获得这 些样品的技术。
所述方法包括检测受试哺乳动物的生物样品中至少一种先兆子痫生 物标志的表达或活性水平并将该水平与对应健康哺乳动物水平的对照进 行比较。本文所用的术语“活性”是指所述生物标志的“生物学活性”、 “生物活性”或“生物功能”。活性的实例包括通过与另一个生物分子结 合或催化另一个生物分子的活性来抑制或激活生物活性。可通过直接影响 所述生物标志来调节生物活性。或者可通过调节所述多肽的水平来改变生 物活性，如通过调节所对应基因的表达。
先兆子痫生物标志的表达水平可通过测量所表达蛋白的水平来测定。 这可通过使用特异性检测所述蛋白的试剂(如抗体)的免疫沉淀法、ELISA 或免疫组化法来完成。其他技术包括蛋白质印迹分析。免疫测定常用于定 量生物样品中的蛋白水平，本领域还有许多其他已知的免疫技术。本发明 不限于特定免疫方法，并因此意图包括同源和异源方法。根据本发明可进 行的免疫测定的实例包括荧光偏振免疫测定(FPIA)、荧光免疫测定(FIA)、 酶免疫测定(EIA)、浊度抑制免疫测定(NIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA) 和放射免疫测定(RIA)。
为用于免疫测定，可将指示基团或标记基团附着在所述抗体上并进行 选择以满足所述方法的多种使用需要，所述需要经常是由测定装置及相容 的免疫测定方法的可用性决定的。标记的实例包括但不限于当融合到先兆 子痫分子时产生可检测的分子信号的标记，包括例如绿色荧光蛋白(GFP)、 加强绿色荧光蛋白(EGFP)、海肾(Renilla reniformis)绿色荧光蛋白、 GFP2mut 2、GFPuv4、加强黄色荧光蛋白(EYFP)、加强青色荧光蛋白(ECFP)、 加强蓝色荧光蛋白(EBFP)、菇类的柠檬色和红色荧光蛋白(dsRED)。在另 一个实施方案中，先兆子痫生物标志多肽与荧光或生色标记缀合。多种荧 光标记可从Handbook of Fluorescent Probes and Research Products 8th Ed.(2001)中找到和/或在其中得到详细地描述，并可从Molecular Probes，Eugene，OR.以及许多其他厂商购得。在其他实施方案中，先兆 子痫生物标志融合到一个因存在或活性而易于检测的分子上，所述分子包 括但不限于荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、分泌的胎盘 碱性磷酸酶、β-内酰胺酶、人类生长激素和其他分泌的酶受体。
也可评估生物标志的活性以识别生物样品中所述生物标志的存在。在 此情况下，可使用测量被所述生物标志活性调节或倚赖所述生物标志活性 的反应途径的测定法，所述反应途径例如产生易于测量的反应产物。
先兆子痫生物标志的表达水平也可通过测量编码所述生物标志的基 因的存在来测定。用于此目的的合适方法包括，例如，反转录聚合酶链式 反应(RT-PCR)、其中寡核苷酸探针用于捕获和检测多种核酸目标的“三明 治”杂交技术(如英国专利申请GB 2156074A，Oct.2，1985中所述)、 斑点印迹分析、反向斑点印迹分析、RNA印迹分析和原位杂交。也可使用 基因表达(SAGE)技术的序列分析(如Velculescu et al.(1995)Science 270，484-487中所述)，此方法的优点包括可检测给定细胞类型中表达的 全部基因、可获得定量基因表达信息以及可获得用于识别所检测基因的序 列信息。用于产生和探测核酸的技术在，例如，Sambrook et al.， Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)中有进一步的描述。也可通过例如使用AQUA TM自动化病理学系统测定AQUATM分数而测定先兆子痫生物标志的表达水 平。AQUATM(用于自动化定量分析)是一种分析原位蛋白质表达的绝对测 量值的方法。
在其中先兆子痫生物标志为脂肪酸的实施方案中，结合色谱方法(如 气相色谱或HPLC或薄层色谱)的质谱可用于检测生物样品中所述先兆子 痫生物标志的水平。
当从包括细胞或组织的生物样品分析时，防止在将所述组织或细胞从 所述哺乳动物中取出后基因表达的任何进一步变化是非常重要的。已知表 达水平在受到扰动(如用脂多糖或其他试剂热休克或激活)后变化很快。 此外，所述组织和细胞中的RNA和蛋白可迅速降解。因此，在一个优选的 实施方案中，从哺乳动物中获得的样品被尽快地速冻。
以在健康哺乳动物中测定的对照表达水平或活性为对照检测一种或 多种先兆子痫生物标志的差别表达或活性水平可指示先兆子痫或先兆子 痫的特定阶段。本文所用的关于先兆子痫生物标志的短语“差别表达或活 性水平”是指相对在健康哺乳动物中测定的对照水平，所述生物标志的表 达或活性的变化或偏差。所述先兆子痫生物标志的表达或活性的偏差量不 局限于它们作为先兆子痫生物标志的作用。先兆子痫的程度或严重程度可 基于哺乳动物中所述先兆子痫生物标志的表达水平或活性相对于对照的 偏差程度来确定。例如，哺乳动物中先兆子痫生物标志的活性或表达水平 与对照相比偏差较大可指示所述哺乳动物患有先兆子痫、易患先兆子痫或 患有较严重的先兆子痫。另一方面，所述先兆子痫生物标志的表达水平或 活性相对于对照的较小偏差可指示非常早期的先兆子痫或指示先兆子痫 病情正在改善。
上述方法可包括将测定的一种或多种先兆子痫生物标志的表达水平 与所述生物标志在健康哺乳动物中的对照表达水平比较，或与所述先兆子 痫生物标志的表达或活性水平的参照组比较以确定是否存在不正常或确 定不正常的程度，例如先兆子痫的程度或阶段。优选地将与参照组或谱的 比较用于上述方法的实施中，例如，它们可以用在对哺乳动物中先兆子痫 的发病进行诊断、预后、检测、分级和预测的方法中。因此，一种诊断、 监测、预后或分级、或者预测先兆子痫的发病的方法可包括：(a)测定一 种或多种先兆子痫生物标志的表达水平，和b)将所述先兆子痫生物标志 的表达水平与先兆子痫生物标志的表达水平的参照组(例如与先兆子痫的 多个阶段相关的先兆子痫表达水平和/或非先兆子痫样品例如健康哺乳动 物中的所述生物标志的正常水平)比较。
还提供了一种预后、监测或分级哺乳动物中先兆子痫的方法，其中监 测一种或多种先兆子痫生物标志的表达或活性水平随时间的变化从而监 测所述先兆子痫。因此，可将取自所述哺乳动物的生物样品中至少一种先 兆子痫生物标志的表达水平或活性的测定值可与以前获得的生物样品中 的表达或活性水平比较以监测哺乳动物中先兆子痫。一种或多种生物标志 的表达/活性水平的增加或降低可指示倚赖所述生物标志的疾病的改善或 恶化，如上调生物标志表达的增加或下调生物标志表达的降低指示疾病恶 化，而下调生物标志表达的增加或上调生物标志表达的降低指示疾病改 善。
本方法也可用于监测受治疗的哺乳动物，并从而确定所述治疗是否有 效。因此，在治疗之前和治疗过程中测定先兆子痫生物标志的表达可指示 所述治疗是否有效。所述先兆子痫和健康哺乳动物之间生物标志的差别表 达或活性的降低指示所述治疗是有效的。也可利用本方法来确定特定治疗 是否可有效治疗特定哺乳动物中的先兆子痫，具体可通过用选定的治疗剂 孵育所述哺乳动物生物样品以确定所述试剂是否影响一种或多种本发明 先兆子痫生物标志的表达水平或活性。所述试剂确实以治疗方式影响生物 标志表达或活性——即下调一种上调生物标志或上调一种下调生物标志 ——的确定，证明所述治疗剂对所述哺乳动物有效。所述方法也可用于确 定对特定哺乳动物的最佳治疗，具体可通过比较选定数量的候选治疗剂的 效果，并选择对增加或抑制一种或多种先兆子痫生物标志的表达或活性的 结果最好的治疗。
一种或多种先兆子痫生物标志的表达或活性水平与对照或参照组的 比较可手动进行或通过自动方法包括例如计算机系统进行。在这种情况 下，可在获得生物标志表达水平后将其输入计算机系统以与从计算机内的 数据库获得的参照水平比较。可通过用户界面向计算机提供指导，提示比 较所输入数据与计算机中的参照数据以确定所输入数据与数据库内数据 的相似程度。这些参照数据可包括正常对照数据或先兆子痫生物标志水平 的数据或两者都包括。然后以适当形式通过计算机输出显示比较结果，包 括文本输出或可见输出(如图形或其他形式)。
所述哺乳动物先兆子痫生物标志的表达水平或活性可与对照水平定 量或定性地比较。例如，可通过测定受试者中所述先兆子痫生物标志的水 平或活性是否高于、低于对或与对照大致相等来进行定性(或无单位)比 较。任选地，定量比较可用于测量或评估受试者中所述先兆子痫生物标志 的水平或活性与对照差别的倍数，如2倍变化、50％变化等。例如，可通 过测量受试哺乳动物样品中先兆子痫生物标志的量并与对照样品中的量 比较来进行定量比较，其中所述量附有单位(例如蛋白的mg、凝胶上点/ 带的体积、磷光显像仪或放射自显影图上的点密度、色谱板上的点直径 等)。
在另一个实施方案中，哺乳动物样品中的先兆子痫生物标志的表达水 平或活性可用于计算所述哺乳动物中所述先兆子痫生物标志的生理浓度。 然后可比较所述哺乳动物中所述先兆子痫生物标志的生理浓度与被测定 为正常的水平或范围，例如取自未患先兆子痫的健康哺乳动物的对照样品 中的测定水平。
在某些实施方案中，可定期(或固定间隔)筛查哺乳动物中先兆子痫 生物标志的表达水平或活性以诊断先兆子痫、对先兆子痫分级或者作为预 后或监测先兆子痫治疗的工具监测先兆子痫的阶段或出现。术语“预后” 是指对哺乳动物中关于先兆子痫的可能结果的确定，即先兆子痫诊断的可 能性、先兆子痫的严重程度或从中恢复的可能性。
术语“分级”是指确定哺乳动物中疾病发展到达的程度。
在一个实施方案中，对怀孕哺乳动物中先兆子痫生物标志的水平或活 性的筛查可约每三个月、每个月、每3周、每2周、每10天、每周、或 每约144、120、96、72、48、24或12小时进行一次。在另一个实施方案 中，可在整个妊娠中或者在妊娠的一个或多个阶段定期筛查怀孕哺乳动 物，例如，在妊娠的第一、第二和/或第三个三月期中定期筛查。在另一 个实施方案中，可在分娩或一次怀孕终止后筛查哺乳动物中先兆子痫生物 标志的表达水平或活性以确定或监测与之前怀孕有关的疾病或疾患。
优选地，除了监测哺乳动物中先兆子痫生物标志的表达水平或活性以 外，还监测先兆子痫的症状。例如，在患有或怀疑患有先兆子痫的哺乳动 物中，优选地监测所述哺乳动物中的血压和/或尿液中总蛋白。在示例性 实施方案中，优选地定期(如每小时、每天、每周、每月等)测定哺乳动 物的血压。可使用本领域已知的任何技术监测血压，例如使用 Finometer(TNO Biomedical Instruments，Amsterdam，The Netherlands) 或血压计。可使用本领域已知的任何方法测量尿蛋白排泄，例如通过使用 二辛可宁酸试剂(Pierce，Rockford，IL)进行的分光光度法。
阵列
在另一个实施方案中，一种检测先兆子痫生物标志表达水平的方法可 包括使用阵列，包括微阵列和宏阵列。所述阵列包括一个表面或固体载体， 上面结合有一系列对生物样品中的生物标志靶标特异的特异性试剂。生物 标志靶标包括编码所述生物标志的核酸以及所述生物标志自身。因此，所 述试剂可包括与生物标志编码核酸(如cDNA、mRNA、寡核苷酸)的一个 区域对应或者能够以其他方式与编码生物标志的基因结合的核酸或核酸 类似物。或者，所述试剂可为适于与所述生物标志本身结合的非核酸探针。
固定在所述阵列上的试剂通常为多核苷酸探针。这些DNA可通过，例 如聚合酶链式反应(PCR)扩增基因组DNA、cDNA(如通过RT-PCR)或克隆 序列的基因片段而获得。基于所述基因或cDNA的已知序列选择所述探针， 使其与独特片段(例如，与所述微阵列上的任何其他片段没有超过10个 连续相同碱基序列的片段)结合以保持所述阵列的特异性。所述探针也可 由基因、cDNA(如表达系列标签)或由其得到的插入片段的质粒或噬菌体 克隆制备。
所述探针用本领域已知的方法附着在所述阵列的固体载体上，例如如 Schena et al.，1995，Science 270：467-470；DeRisi et al.，1996， Nature Genetics 14：457-460；和Shalon et al.，1996，Genome Res. 6：639-645中所述，所述文献的相关内容以引用的方式纳入本文中。另一 种制备微阵列的方法是通过制备高密度寡核苷酸阵列，如U.S.Pat.Nos. 5,578,832；5,556,752；和5,510,270中所述，所述专利的相关内容以 引用的方式纳入本文中。也可使用制备微阵列的其他方法，如掩膜法 (Maskos and Southern，1992，Nuc.Acids Res.20：1679-1684)。原 则上，可使用本领域技术人员公认的任何类型的阵列，例如，尼龙杂交膜 上的斑点印迹(参见Sambrook et al.，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd Ed.)，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。
要与所述微阵列接触并结合的来自生物样品的成分，如核酸、蛋白或 其他成分通常带有可检测标记如荧光标记，从而在结合于所述阵列时可使 用合适的检测技术进行实时监测。此标记可在样品与所述阵列接触之前或 之后加到所述样品上。选择杂交或结合以及洗涤条件以使所述样品中全部 被标记成分特异性地与附着在基质上的合适位点杂交/结合。可采用方法 以使被标记成分与所述阵列的非特异性结合最小化。例如，可通过用大量 非特异DNA处理所述阵列(称为“封闭”步骤)使核酸的非特异性结合降 低。
本领域技术人员会理解，所述阵列可为组织阵列。例如，可制备石蜡 包埋的经福尔马林固定的样品，然后挖取来自所述样品的不同区域的“活 组织检查”核心。将每个核心都排列在一个单独的受体模块中，切片和处 理如前人所述，例如Konenen，J.et al.，Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens，(1987)Nat. Med.4：844-7和Chung，G.G.et al.，Clin.Cancer Res.(印刷中)。 在另一个实施方案中，所述阵列可为一个细胞培养物沉淀微阵列。
筛查先兆子痫生物标志
本发明的另一个方面提供了一种识别先兆子痫生物标志的方法。对某 些生物标志的识别为其他生物标志的识别提供了基础，所述其他生物标志 包括例如已知生物标志的天然衍生物或代谢物，以及涉及与已知生物标志 相同的代谢功能的生物分子。因此，从先兆子痫哺乳动物的生物样品中筛 查生物分子的方法包括识别与其在健康哺乳动物中的表达或活性相比表 现出差别表达和/或活性的生物分子。例如，本发明的先兆子痫生物标志 参与脂肪酸代谢。因此，可筛查脂肪酸代谢物或脂肪酸自身在先兆子痫生 物样品中的差别表达/活性。本领域技术人员应理解，脂肪酸以酸的形式 存在、以脂肪醇的还原形式存在或以缀结形式(如与甘油(如三油酸甘油 酯)或磷酸甘油(如甘油磷脂)缀合的形式)存在，或者与其他糖缀合生 成鞘氨基醇和二氢鞘氨醇。对这些脂肪酸形式的每一种都可筛查其差别表 达/活性。在另一个实例中，筛查参与氧化应激调节的蛋白可能会发现可 用作先兆子痫生物标志的其他蛋白。在另一个实例中，烯酰辅酶A水化酶 和Δ3，5，Δ2，4-二烯酰辅酶A异构酶的阻断或下调造成不饱和脂肪酸的 积聚。因此，筛查上调不饱和脂肪酸及相关生物分子也可发现先兆子痫生 物标志。不饱和脂肪酸的实例包括丁酸(丁烷酸)、己酸(己烷酸)、辛酸 (辛烷酸)、癸酸(癸烷酸)、月桂酸(十二烷酸)、肉豆蔻酸(十四烷酸)、 棕榈酸(十六烷酸)、硬脂酸(十八烷酸)、花生酸(二十烷酸)、山嵛酸 (二十二烷酸)、木焦油酸(二十四烷酸)、蜡脂酸(二十六烷酸)，以及 高水平的降植烷酸、植烷酸、二羟基胆甾烷酸(DHCA)和三羟基胆甾烷酸 (THCA)，其中每种都代表可作为先兆子痫生物标志的候选生物标志。
本领域技术人员知晓的任何可评估候选生物标志是否为先兆子痫生 物标志的技术都可用于发现其他生物标志，包括本文所述的方法。除了本 文所述的蛋白质组学技术以及对先兆子痫和正常生物样品中的潜在生物 标志的高分辨率、强力、基于质谱的分析方法以外，还可使用表达挖掘法 (expression mining method)识别先兆子痫生物标志，包括基因表达的 序列分析(SAGE)、包括先兆子痫组织和正常组织对比的微阵列分析、对先 兆子痫微阵列数据的大规模荟萃分析、挖掘EST数据库和大量平行信号测 序(MPSS)。
治疗剂筛选
本发明的另一方面提供一种筛选用于治疗先兆子痫的候选治疗性化 合物的方法。所述候选化合物可为核酸例如反义核酸、siRNA或核酸类似 物，小分子，多肽，蛋白或模拟肽。所述方法包括将表达至少一种先兆子 痫生物标志的生物样品与候选治疗性化合物在适于所述生物标志表达的 条件下一起孵育。将所述孵育进行一段合适的时间——如本领域技术人员 能理解的——以使得所述候选化合物对所述生物标志的表达或活性起作 用，即调节其表达或活性，如果所述候选化合物能够或可能能够调节所述 生物标志的表达或活性的话。然后使用例如之前描述过的技术测定所述生 物标志的表达或活性，以确定所述候选治疗性化合物是否调节或者是否可 能调节或改变所述先兆子痫生物标志的表达或活性。优选地，调节所述生 物标志的表达或活性使其表达或活性正常化，或接近健康哺乳动物中所述 生物标志的表达或活性。如前所述，可通过检测所述生物标志核酸或蛋白 水平的表达、所述生物标志的活性、或者所述候选化合物与所述生物标志 或编码所述生物标志的核酸的结合来测定或推测调节。预期可用于本发明 的检测方法的实例包括但不限于竞争性结合检测、直接结合检测、双杂交 检测、细胞增殖检测、激酶检测、磷酸酶检测、核激素转位子检测、荧光 激活细胞筛选(FACS)检测、聚落形成/嗜菌斑检测和聚合酶链式反应检测。 这些检测为本领域技术人员所熟知，并可作为常规实验方法用于本发明的 方法。
所有上述筛选方法都可用多种检测形式来完成。根据本公开内容，本 文未特别描述的技术也可为本领域技术人员知晓和理解。所述检测可识别 这样的药物，即所述药物可作为如先兆子痫生物标志的表达或活性或者先 兆子痫生物标志的蛋白质-蛋白质或蛋白质-底物相互作用的激动剂和拮 抗剂。接近蛋白复合物或蛋白核酸复合物、酶活性和甚至特异信号通路形 成条件的检测形式可以多种不同的形式获得，包括但不限于基于无细胞系 统(如纯化的蛋白、血浆或尿样)或细胞裂解物的检测，以及利用完整细 胞的细胞基的检测。
对所述候选化合物调节所述先兆子痫生物标志的表达或活性水平的 确定指示所述候选化合物可为一种治疗或预防先兆子痫的治疗剂。
试剂盒
本发明提供实行本发明方法的试剂盒。在一个实施方案中提供用于诊 断哺乳动物先兆子痫的试剂盒，包括至少一种可用于检测一种生物标志的 试剂，所述生物标志在取自患先兆子痫的哺乳动物的生物样品中与健康哺 乳动物中的其表达或活性相比表现出差别表达或活性。本领域技术人员理 解，这种试剂盒也可用于先兆子痫的诊断或分级；然而，对生物标志与以 前诊断或参照数据组相比的差别表达或活性的变化的检测足以提供先兆 子痫的诊断或分级的指征。
依照一种实施方案的试剂盒可包括一种或多种抗先兆子痫生物标志 的抗体。在其他实施方案中，试剂盒可包括测定待测哺乳动物生物样品中 蛋白活性水平的合适试剂。
在另一个实施方案中，试剂盒可包括一个微阵列，所述微阵列包括用 于先兆子痫生物标志编码核酸或生物标志结合成分或两者混合物的探针。 试剂盒可包括一种或多种检测先兆子痫生物标志表达水平的探针、引物或 其他成分，和/或这些探针或结合成分所附着的可用于检测先兆子痫生物 标志的固体载体。试剂盒还包括对照、缓冲液和使用说明。
试剂盒也可包括与先兆子痫的多个阶段以及健康状态相关的先兆子 痫生物标志基因表达水平的文库，即参照组。所述试剂盒可用于识别有患 先兆子痫倾向的哺乳动物，以及用于识别和确认先兆子痫的治疗剂。在一 个实施方案中，所述试剂盒包括一个计算机可读介质，上面储存有一个或 多个参照组或至少代表参照组的值。所述试剂盒可包括能装载到计算机系 统内存中的表达谱分析软件。
试剂盒组分可被包装起来以用于手工或者部分或全部自动地实行前 述方法。在其他包括试剂盒的实施方案中，本发明设计了一个包括本发明 组分的试剂盒，以及任选地包括使用说明。这些试剂盒可具有多种用途， 包括例如成像、诊断、预后、分级、治疗和其他应用。
实施例
本发明通过以下实施例被进一步阐明，所述实施例不应以任何方式被 看做限制。在本申请全文中引用的所有引用参考文献(包括参考文献、授 权专利、公开或非公开的专利申请)的内容都以引用的方式清楚地纳入本 文中。除非另外指出，本发明的实施可采用本领域技术范围内的细胞生物 学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫 学的传统技术。这些技术在所述文献中被充分解释(参见，例如Molecular Cloning A Laboratory Manua 1，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning， Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Patent No： 4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J. Higgins eds.1984)；(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)； Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；，VoIs.154and 155(Wu et al.eds.)， Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C. Blackwell，eds.，1986)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986))。
发现先兆子痫生物标志的实验设计
样品收集
基于以下选择标准在伦敦St Josephs医院建立了275名临床先兆子 痫和对照胎盘样品的组织库。对于被包括在所述先兆子痫组织库采样中的 妊娠，母亲血压的收缩压必须超过160mm Hg或舒张压超过110mm Hg， 并显示若干次要选择标准中的至少一种。如果满足任何排除标志，则本研 究不采用该可能的先兆子痫胎盘样品。对于此研究，如果妊娠时间大于 22周并且妊娠时间匹配的胎盘既不满足选择标准也不满足排除标准，则 加入组织库中作为对照。

以以下方式采集对照或满足所述选择标准的先兆子痫胎盘。分娩后立 即从胎盘上切下12个1厘米乘1厘米的立方体。用于确定12个采集位点 的采样网格确保了每个胎盘的平均和典型采样。
因此每个样品都具有基板蜕膜(BPD)和切下的只保留绒膜绒毛(CV)的 绒膜板。将从每个胎盘上取下的12个CV样品立即置于液氮中速冻，然后 汇集到包括一个样品的样品采集袋中。取得并汇集12片中每片的三分之 一用于蛋白质组学分析，而保留剩余的三分之二用于微阵列的RNA分析和 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。此外，从每个对照和先兆子痫胎盘上取 得三个样品用于组织学检查。将满足上述采样标准的先兆子痫和对照胎盘 加入到所述胎盘组织库中。
从所述组织库中，选择24个胎盘的初始样品组用于2D SDS-PAGE分 析。由于此数据组用于对所述对照和先兆子痫样品组之间差别表达的蛋白 的初始确定，因此其被称为“发现样品组”。从所述组织库中选择另一样 品组以验证通过所述“发现样品组”的2D凝胶分析获得的蛋白质组学差 异。此样品组被称为“验证样品组”。
患者人口统计
对可变来源的复杂组织实施蛋白质组学分析需要特别注意样品的选 择。在此研究中，仔细检查每个妊娠的细节以在每个试验组中确认最接近 的可能妊娠时间和妊娠情况。
项目实验设计
所述“发现样品组”由24个选自所述胎盘组织库的样品组成。这些 样品分为两个独立的组，其中第一个包括12个全部在28周以下的胎盘样 品。所述胎盘样品的6个选自先兆子痫妊娠，其他6个选自妊娠时间匹配 的对照。第二组也由12个胎盘样品组成(6个先兆子痫和6个对照)，但 这些是从28周后的分娩获得的。两个样品组之间的28周分界是在临床环 境中设置的时间点。
此研究的目标是检查和比较28周以下和28周以上分界的先兆子痫 CV和时间匹配的对照CV的蛋白质组学。因此，28周以下和28周以上的 样品被分别分析。选择另一组胎盘以确认在所述“发现样品组”的2D凝 胶分析中看出的蛋白质组学差异。此“验证样品组”也包括两组。第一组 中的样品都在妊娠28周以下，由9个对照和10个先兆子痫样品组成。第 二组由10个对照和10个先兆子痫样品组成，所有样品都在妊娠28周以 上。在所述发现样品组中识别差别调节的蛋白后，通过对对照和先兆子痫 样品的独立组的蛋白质印迹确认所述表达水平。
普通提取方法包括从每组中的胎盘中提取蛋白、通过透析脱盐、然后 测定每个样品中的蛋白含量，最后通过每个样品一式两份的2D SDS-PAGE 分析合适量的蛋白。对全部所述凝胶成像并用软件分析差别表达蛋白的存 在。将被确定差别表达的蛋白从凝胶上切下、用胰蛋白酶消化、通过质谱 分析，并通过数据库搜索识别。通过蛋白质印迹进一步确认被确定差别调 节的蛋白。
尽管将28周以下和以上的胎盘样品组作为完全独立的实验处理，然 而也在28周以上的样品中研究在28周以下的样品中被识别的差别调节的 蛋白，反之亦然。通过比较所述两个胎盘时间组之间的差别表达的蛋白， 评估每组中的目标蛋白相对于它们的胎盘时间的特异性。这是为了确定妊 娠28周以下或以上的胎盘组中对特定蛋白的调节的增加或降低是否相 同，或所述蛋白的表达水平是否受到所检查胎盘组的妊娠时间的限制。
如上所述，所述“发现样品组”中的对照和先兆子痫CV样品被分为 三种用途。每个CV样品的三分之一进行2D SDS-PAGE分析，三分之一进 行微阵列分析，剩余的保留以用于未来的试验。对此研究所用的全部CV 样品的操作和处理是根据以下方法进行的。
材料和方法
绒膜绒毛(CV)的样品收集
先兆子痫和对照胎盘CV样品都是在分娩后立即以及时的方法收集 的。新鲜分娩的完整胎盘以胎儿面部朝下的方式放置，然后将标准样品收 集网格叠加在所述胎盘上面。从每个收集网格矩阵的中心切下单个1cm x 1cm的组织样品，每个胎盘得到12个样品。通过手术将基板蜕膜和绒膜 板与CV分开，然后将每个样品在液氮中速冻。汇集从每个胎盘取下的全 部12个样品并储存在-80℃下用于进一步分析。
从绒膜绒毛提取蛋白
在对每个胎盘进行的蛋白提取中，从所述12个样品中的每一个的原 始1cm x 1cm样品中挖取100μg部分，然后汇集得到约1g的样品(1.00 g-1.29g)。所汇集的CV样品在用研钵和杵研磨时一直都置于液氮中保持 冷冻。当所述CV被研磨至均匀的滑石粉状后，从此匀浆中取出200μg 等分试样用于蛋白提取；剩余部分储存在-80℃下。在每200μg CV样品 中加入435μL的2X PE提取缓冲液[4％CHAPS(Sigma，St Louis，MO)、 50mM碳酸氢铵(Sigma)、20mM DTT(Sigma)、20μL/mL Ettan蛋白酶 抑制剂混料(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.Piscataway.NJ)、5mM EDTA(Fisher Biotech，NJ)]。蛋白提取允许在冰上进行，使用对基因 组DNA具有极大剪切力的30.5号针头。为进一步提取所述蛋白，将380mg 尿素(Sigma)和139mg硫脲(Sigma)的等分试样加入所述匀浆中使终浓度 为7M尿素、2M硫脲。然后在将样品在Slide-A-Lyzers(Pierce，Rockford， IL)中用1mM EDTA透析48小时。用改进的Micro-Bradford检测法 (Bio-Rad，Hercules，CA)测定所透析样品的蛋白浓度。将提取的蛋白储 存在-80℃用于进一步分析。
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳
第一维等电聚焦(IEF)进行如下。将足量的再水化缓冲液[6M尿素、 2M硫脲、4％CHAPS、0.4％DTT、0.5％两性电解质(GE Healthcare)、10uL/mL Et tan蛋白酶抑制剂混料、10mM EDTA、1mM PMSF(Sigma)]加入200μ g蛋白中使总体积为450μL。此溶液通过槽均匀地分散在再泡胀托盘 中，然后放入pH 3-10NL的IPG固定化电解质干胶条(GE Healthcare) 并用矿物油覆盖以防止16小时再水化过程中的挥发。用Ettan IPGphor II 等电聚焦装置将所述再水化胶条在Ettan IPGphor manifold中聚焦。IEF 通过使用以下电压梯度进行：恒定500V 1小时，1小时梯度变化至1000 V，再2小时梯度变化至5500V，最终恒定5500V 8小时，整个IEF 共计99000Vh。
对于第二维，聚焦蛋白在SDS平衡缓冲液[2％SDS(Sigma)、6M尿 素、30％甘油(FisherBiotech)，50mM Tris-Cl pH 8.0(Bioshop， Burlington，ON)]中平衡、还原和烷基化40分钟，然后使用。所述IGP 胶条在室温下在含有1％w/v DTT的10mL SDS平衡缓冲液中还原20分钟。 然后通过与2.5％w/v的碘乙酰胺(Sigma)在10mLSDS平衡缓冲液中再反 应20分钟，将所述蛋白的半胱氨酸的游离巯基基团S-羧基氨基甲基化。 将聚乙烯酰胺平板凝胶(25.5cm X 20.5cm X 0.15cm，12％丙烯酰胺) 在Plus Multi-casting chamber(Bio-Rad，Hercules，CA) 中成型。用琼脂糖密封溶液(0.5％琼脂糖、0.002％w/v溴酚蓝、0.1％SDS) 将带有还原和烷基化蛋白的IPG胶条密封在合适的位置。一次将12个所 述凝胶装入Plus DodecaTM电泳室(Bio-Rad)中并在恒定100V 下浓缩1小时。此电压最终调整为250V持续6-7小时，直至所述染料迁 移至距胶边缘的0.5cm内。在第二维中，所述SDS电泳缓冲液(25mM Tris、 192mM甘氨酸、0.1％(w/v)SDS，pH 8.3)在整个电泳过程中都恒定保 持在15℃。
2D GE凝胶成像、图像分析和机器采点
在50％甲醇、7％乙酸溶液中固定过夜后，用荧光染色剂Sypro Ruby (Molecular Probes，Eugene，OR)将聚丙烯酰胺凝胶染色48小时。为使 背景染色最小化，在获得凝胶图像之前在10％甲醇、7％乙酸溶液中脱色30 分钟再在milliQ双蒸水中洗涤3次。用固体黑色底盘和绿色丙烯酰胺片 得到平面，用顶部照明使所述Sypro Ruby染色凝胶在ProXPRESS蛋白质 组成像系统(Perkin-Elmer，Boston，MA)上成像。在480nm的激发波长 和620nm的发射波长下获得图像。用Phoretix 2D Expressions凝胶记 录软件(Non-Linear Dynamics，Newcastle UK)分析被扫描的凝胶。基于 以下标准选取差别调节点：1)实验和对照凝胶之间的蛋白表达必须超过 +/-2倍调节才会被认为差别调节；2)目标点必须在所有实验和对照凝胶 中存在；和3)选取的点必须通过ANOVA测定在统计意义上明显(p＜0.005)。 通过机器点切除将满足这些标准的点从所述凝胶上切下置于96孔板 (Ettan spot picker，GE Healthcare)中。
用于质谱的蛋白样品的胰蛋白酶消化
将之前切下的2D SDS-PAGE目标点转移到1.5mL微量离心管中并用 50％(v/v)甲醇/5％(v/v)乙酸和20％(v/v)乙腈/1M碳酸氢铵交替脱色。 然后将脱色凝胶片在100％乙腈中脱水，在旋转Speed Vac浓缩器(Savant， Hicksville，NY)中干燥，并通过在30μL 10mM DTT/100mM碳酸氢铵 中重水化还原1小时。在通过抽吸除去所述DTT溶液后，通过加入30μ L含100mM碘乙酰胺的100mM碳酸氢铵并孵育1小时来使所述半胱氨酸 的游离的巯基基团烷基化。然后通过Speed Vac干燥所述凝胶片，然后用 30μL含0.6μg测序级修饰的胰蛋白酶(Promega，Madison，WI)的50 mM碳酸氢铵溶液再水化。在冰上再水化10分钟后，通过抽吸除去过量 的胰蛋白酶溶液并且加入5μL的50mM碳酸氢铵溶液。在37℃下进行 胰蛋白酶消化18小时。通过用30μL的50mM碳酸氢铵溶液洗涤，然后 用30μL的10％(v/v)甲酸洗涤2次，最后用50μL的100％乙腈洗涤将 所述胰蛋白酶消化的肽从所述凝胶片中提取出来。将所述洗液汇集在500 μL微量离心管中，然后在旋转Speed Vac浓缩器中干燥。样品储存在-80 ℃直至分析。
质谱
在样品注射前，将用MS分析的样品加入5％乙腈/1％的甲酸中。在 Micromass Q-ToF Ultima Global(Waters，Milford，MA)上以正离子ESI 模式进行全部MS分析。将样品以“μl选取模式”注射到由使用5mm x 300 μm 100A PepMap C18μ-前柱(LC Packings，San Francisco，CA)和 15cm x 75μm 100A PepMap C18柱(LC Packings)的Micromass Modular Cap LC(Waters)构成的纳米液相色谱系统中。将肽在0.1％的甲酸中上样 到柱中，然后通过60分钟以上的5-70％乙腈/0.1％甲酸梯度洗脱到MS中。 所采用的数据倚赖的采集方法按照以下程序进行。在m/z 400-1800之间 运行MS勘测扫描2.4s，并为MS/MS选择超过每秒25次的强度阈的离子。 使用带电状态识别进行MS以将门控离子上的碰撞能量指定10s或直到 TIC升高至超过10000。在转换回勘测扫描后，使用实时排除200s使之 前的门控离子不被再门控。用相同的实验参数连续运行所有样品。
数据搜索
对切下的蛋白点的蛋白识别是用三种独立的软件包完成：Protein Lynx Global Server II(Waters)、Mascot(Matrix Science Inc，Boston， MA)和PEAKS(Bioinformatics Solutions，Waterloo，ON)。目标点的阳 性识别基于以下标准：全部三种软件包都必须得到相同的蛋白识别，所述 凝胶上的点必须匹配假定的蛋白识别的pi和MW，和所述蛋白的MS/MS序 列覆盖必须达到或超过10％。如果全部这些标准都满足，则认为所述蛋白 识别是阳性的。
用于确认差别表达蛋白的其他先兆子痫和对照胎盘样品的制备
以下列方式处理用于确认差别表达蛋白的其他样品。从所述每胎盘 12个1cm x 1cm的CV样品的每个样品上取约50mg的组织并收集到一起。 所汇集的从胎盘组织库获得的CV组织样品为240-710mg。每提取500mg 的CV组织，向每个样品中加入1ml提取缓冲液(2％SDS，50mM Tris pH 6.8)。用PowerGen 700组织匀浆器(Fisher Scientific)以“第六档” 将所述CV匀浆。所述样品完全匀浆后，通过将所述样品置于沸水浴中10 分钟来进行蛋白提取。通过用30.5号针头反复抽吸对在核酸细胞裂解过 程中释放的核酸进行剪切。在提取蛋白和剪切核酸之后，在15℃下将所 述样品以15,000xg离心15分钟以使所述样品澄清。将所述蛋白提取物 从沉淀中吸出，分成等分试样并且储存在-80℃下备用。从每种蛋白提取 物中取出10μL等分试样用于通过改进的Micro-Bradford试验 (Bio-Rad)测定蛋白浓度。
通过免疫印迹确认差别表达蛋白
为确认各个CV样品中的差别表达蛋白(FABP4和Per6)，通过12％一 维SDS-PAGE分辨10μg上述每种胎盘蛋白提取物并在聚偏氟乙稀膜 (PVDF)(Bio-Rad Laboratories)上电转染。用Tris/Gly转移缓冲液(25 mM Tris、192mM甘氨酸、20％甲醇)在Trans-Blot SD半干装置(Bio-Rad Laboratories)中以25V进行电转染40分钟。可在含有5％脱脂奶粉的 TBST(10mM Tris pH 7.6、150mM NaCl、0.1％Tween 20)中在室温下 封闭所述PVDF膜过夜。所用的一级抗体为稀释度1∶200的兔抗 FABP4(Cayman，Ann Arbor，MI)和稀释度1∶2000的兔抗过氧化物酶 6(Per6)(Abcam，Cambridge，MA)。对于FABP4和Per6，用稀释度1∶10000 的HRPO缀合的山羊抗兔IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA) 作为次级抗体。所有抗体都在含有5％脱脂奶粉的TBST中稀释。加入 SuperSignal Dura化学发光底物(Pierce Chemical Company)后，进行免 疫印迹2分钟，在ProXPRESS蛋白质组成像系统(Perkin-Elmer)上成像。 用Phoretix 2D Expressions凝胶记录软件(Non-Linear Dynamics)对所 述三种免疫印迹的每个的免疫反应蛋白带进行定量。通过对肌动蛋白的定 量来对每个样品的上样对照进行监测。初级小鼠抗肌动蛋白抗体 Ab-5(Lab Vision，Freemont，CA)的使用浓度为1∶400，HRPO缀合的山 羊抗鼠IgG(Jackson Immunoresearch)以1∶10000的稀释度作为次级抗体 使用。
实验结果
检验差别分析软件的精确度
对本研究所用的样品的成功差别显示分析倚赖于对高质量2D凝胶的 基于软件的精确和可重复的分析。由于每个CV样品都是从不同患者收集 的，因此可以预期患者-患者差异的因素。尽管2D凝胶分析软件的运行中 并不预期这种差异，然而可测定相同标准样品之间的样品-样品差异。这 些实验包括分析三种蛋白标准品，所述标准品以50-1000ng的点浓度一 式四份地进行电泳。
除了用Phoretix 2D ExpressionsTM软件检验2D凝胶分析过程中的 重复差异以外，还就人工“差别调节”点的定量分析评估了该软件的线性 和重复性。用于测定样品重复之间差异的相同的三种蛋白标准品也用于此 评估；将在所述样品重复评估中获得的值平均以给出所测每种浓度的点体 积的值。对于BSA和肌红蛋白标准品，使用50ng、100ng和250ng浓 度来表示1、2和5倍的人工差异调节。对于碳酸酐酶标准品，使用100ng、 250ng、500ng和1μg浓度来表示1、2.5、5和10倍的人工差异调节。 对于BSA和肌红蛋白，使用50ng平均点体积作为与2和5倍浓度平均值 比较的1∶1比例对照。对于碳酸酐酶，使用100ng平均点体积作为与2.5、 5和10倍浓度平均值比较的1∶1比例对照。所测定的此组标准品的重复 再现性和比例的相互关系与以发表的数据相关[68]。
实验样品的图像分析
作为一般规律，使用Phoretix 2D ExpressionsTM软件的2D凝胶分 析遵循以下分析功能途径。在所述凝胶中检测到点、除去噪点、从每点中 减去背景、将图像与主要对照凝胶对齐、使全部凝胶之间的点匹配、将各 个凝胶标准化以及对差异表达蛋白进行比较。偶尔需要其他手动操作。
综上，在“28周以上”实验的初始测量中检测到的蛋白比在“28周 以下”实验中要少。此点可能的原因是“28周以下”胎盘样品相对更成 熟的“28周以上”胎盘样品的快速生长和代谢。28周以下的样品中蛋白 的快速周转和可变表达导致在此实验组中统计上差异调节的蛋白增加。
为描述一种简单的情况，这里考虑用28周以下的对照组描述28周以 下对照平均凝胶的制备。选择属于28周以下的对照样品重复的单一凝胶 作为此组的凝胶平均水平的“基准凝胶”。在检测和匹配此组中的所有点 之后，将点加到基于预定平均参数的基于计算机的平均凝胶上。在这种情 况下，点必须存在于所述样品重复的至少一半中以被包括在所述平均凝胶 中。当所述对照和先兆子痫平均凝胶被编译后，所述软件用这些点的类别 在所述对照和先兆子痫点数据组之间匹配蛋白。只在所述对照平均中存在 而不在所述先兆子痫平均中存在的蛋白(反之亦然)不包括在匹配蛋白中 并被独立检测。这导致所述凝胶之间匹配的点的数量少于所检测的点的总 数。在更进一步地检查所述对照和先兆子痫平均之间不匹配的点之后，确 定它们因为重复性很差且变化显著而不是在统计意义上显著的。
基于对所述对照和先兆子痫平均之间的匹配数据的进一步检查，得到 差异调节的点的列表并用于进一步分析。手动检查每个疑为差异调节的点 在所有本实验中的凝胶中的存在，以确认是否已经有成功的点匹配。排除 未正确匹配的、对于差异表达在统计意义上不显著的(ANOVA p＞0.05)或者 太复杂而无法获得精确点值的点之后，得到一个基本上更小但更加显著的 数据组。从此筛选得到的最终数目产生在28周以下实验的先兆子痫数据 组中的2个上调和7个下调蛋白，和28周以下实验的先兆子痫中的3个 上调和0个下调蛋白。
实验差别调节分析结果
确认所述凝胶分析软件的重复性和精确度之后，对28周以下和28 周以上的CV实验组都进行分析。用Phoretix软件使用前述参数分析小于 28周的CV样品。将在所述对照和先兆子痫CV样品中均重复观察到的差 别调节的点切下并进行MS分析。
在广泛的2D凝胶分析后，重复识别出在所述对照和先兆子痫CV样品 之间差别调节的9个蛋白。将这些蛋白中的每一种均切下并通过LC-MS/MS 成功地识别。表I总结了所识别的差别表达的蛋白、每种被识别蛋白的平 均标准化点体积、所述点差别的统计显著性和28周以下的对照和先兆子 痫样品之间的总体调节差别。
表I：5个对照和5个先兆子痫妊娠的28周以下分析中的蛋白识别。
  识别的蛋   白   对照妊娠平均   点体积*   (n＝5)   先兆子痫妊娠平   均点体积*   (n＝5)   ePE相   对对照   的倍数   差   ANOVA   P值   脂肪酸结   合蛋白4   0.057(0.049)   0.213(0.074)   3.7   ＜0.0001   过氧化物   酶6   0.093(0.028)   0.250(0.057)   2.7   ＜0.0001   烯酰辅酶A   水化酶   0.116(0.038)   0.060(0.025)   -2   ＜0.005   雌二醇17-   β-脱氢酶   0.197(0.050)   0.096(0.031)   -2   ＜0.0001   胞浆磷蛋   白   0.080(0.018)   0.038(0.021)   -2.1   ＜0.0001   人类胎盘   催乳激素   0.239(0.057)   0.097(0.043)   -2.5   ＜0.0001   脂皮质蛋   白   0.063(0.020)   0.026(0.009)   -2.4   ＜0.0001   增殖相关   蛋白2G4   0.052(0.017)   0.019(0.007)   -2.7   ＜0.001   Δ3，5-Δ   0.132(0.085)   0.038(0.014)   -3.4   ＜0.005
  2，4-二烯   酰-辅酶A   异构酶
点体积的值是5个不同CV样品的两次平行电泳(共10个凝胶)的平均值。 对所述对照样品的10个值取平均，对所述先兆子痫样品的10个值也取平 均。计算的每个平均值的标准偏差示于括号中。倍数差是所述先兆子痫平 均值除以所述对照平均值。
*值显示为：标准化点体积(标准偏差)
对每种在28周以下样品中识别的蛋白汇总其等电点、分子量、MS/MS 最小肽分界以及前述MS识别标准的总蛋白覆盖。所测样品中的每种目标 蛋白的MS/MS细节和所观察到的频率均汇总于表II。每种目标蛋白都具 有可接受的MS/MS覆盖，具有足够数量的作为蛋白识别基础的所观察到的 肽。此外，在每个所测CV样品中都可观察到每种差别调节的目标蛋白。
表II：用于28周以下分析的蛋白识别数据
  蛋白识别   观察到的   肽的数量   Mascot   分数   总蛋白   覆盖   含有目标蛋白   的凝胶数目   脂肪酸结合蛋白4   6   374   48％   10/10   过氧化物酶6   9   416   52％   10/10   烯酰辅酶A水化酶   7   345   35％   10/10   雌二醇17-β-脱   氢酶   14   818   53％   10/10   胞浆磷蛋白   4   169   28％   10/10   人类胎盘催乳激素   5   316   29％   10/10   脂皮质蛋白   6   437   21％   10/10   增殖相关蛋白2G4   5   186   12％   10/10   Δ3，5-Δ2，4-二烯   酰-辅酶A异构酶   12   564   39％   10/10
每种识别蛋白都存在于所测所有凝胶中。LC-MS/MS产生足够数量的肽和 充分的覆盖，从而使所分析的每种蛋白的识别具有高可信度。
用与对28周以下样品同样的程序分析28周以上的对照和先兆子痫 CV样品。表III总结了三种在28周以上的样品中被重复和统计学地测定 为差别调节的蛋白。对于28周以下的样品，都总结了每种识别蛋白的平 均标准化点体积、所述点差别的统计学显著性以及对照和先兆子痫样品之 间的总体调节差别。
表III：5个对照和6个先兆子痫妊娠的28周以上分析的蛋白识别。
  蛋白识   别   对照妊娠平均点   体积*   (n＝6)   先兆子痫妊娠平   均点体积*   (n＝5)   PE相对   对照的   倍数差   ANOVA   P值   巨噬细   胞加帽   蛋白   0.020(0.013)   0.044(0.014)   2.2   ＜0.0005   热激活   蛋白β   -1   0.064(0.021)   0.129(0.060)   2   ＜0.005   前列腺   素脱氢   酶   0.053(0.029)   0.110(0.035)   2   ＜0.0005
点体积的值是5个不同CV样品的两次平行实验的平均值。所述对照样品 的10个值取平均，所述先兆子痫样品的10个值也取平均。计算的每个平 均值的标准偏差示于括号中。倍数差是所述先兆子痫平均值除以所述对照 平均值。*值显示为：标准化点体积(标准偏差)
所述28周以上样品中的所有三种目标蛋白均依照与所述28周以下样 品相同的基于MS的识别标准。所述28周以上的MS/MS结果示于表IV并 突出了观察到的肽的数量、总MS/MS蛋白覆盖以及所述28周以上实验的 不同样品之间的每种蛋白的观察频率。通常，在28周以上样品组中观察 到的差别调节的蛋白比28周以下的样品组中少得多。
表IV：用于28周以上分析的蛋白识别数据
  蛋白识别   观察到的肽   的数量   Mascot分   数   总蛋白   覆盖   含有目标蛋白的   凝胶数目   巨噬细胞加   帽蛋白   5   242   18％   11/11   热激活蛋白   β-1   6   172   35％   11/11   前列腺素脱   氢酶   6   535   42％   11/11
每种识别蛋白都存在于所测的所有凝胶中。LC-MS/MS分析产生足够数量 的肽和充分的覆盖，从而使所分析的每种蛋白具有的高可信度识别。
选择和识别被确定为差别调节的蛋白可得到有关参与先兆子痫基础 过程的蛋白的宝贵信息。然而，需要进一步确认这些结果。仔细检查在本 研究中被确定为差别调节的蛋白之后，识别若干功能组。使用基因本体(G0) 数据库和GoMinerTM确定功能分组，GoMinerTM是一种复杂的分析蛋白功 能的工具，如Zeeberg et al.(Genome Biol，2003.4(4)：p.R28)中所 述，所述文献的内容以引用的方式纳入本文中。在对28周以下和以上的 数据组进行GoMinerTM分析之后，将差别表达的蛋白功能性地分类到图1 所示的组中。
通过蛋白质印迹(Western Blotting)确认差别调节点
由于有大量被确定为差别表达的蛋白，只选择了几个蛋白用于进一步 确认差别表达。尽管有许多确认这些蛋白表达水平的方法，然而本研究使 用蛋白质印迹来确认表达。
如前所述，本研究使用的有两个数据组。第一个数据组——称为发现 ——用于对所述对照和先兆子痫CV样品的初始2D分析。采用这些样品以 识别任何存在的差别调节的蛋白。第二个数据组不进行2D凝胶分析，而 是用作确认组以确认在所述发现数据组中识别的差别表达水平。此第二数 据组称为“验证数据组”。
由于下述原因，只对两种表现差别调节的蛋白的发现和验证数据组进 行蛋白质印迹分析。其中一种蛋白通过蛋白质印迹检测的蛋白参与脂肪酸 代谢，而另一种参与氧化应激的调节。被确认的与脂肪酸代谢有关的蛋白 是脂肪酸结合蛋白4(FABP4)，参与氧化应激调节的蛋白是过氧化物酶 6(Per6)。开始在所述发现数据组中验证这两种蛋白的表达水平以确认和 支持在所述2D凝胶分析中发现的调节差异。
清楚地，FABP4表达在28周以下的对照和先兆子痫CV样品中存在很 大的差别。此差别不存在于28周以上的样品中，这指向了限于早期先兆 子痫妊娠的蛋白质组差别。考虑到肌动蛋白上样对照并且用Phoretix软 件将表达值标准化和定量后，发现FABP4表达在28周以下的先兆子痫样 品中增加8.49倍(ANOVA p＝＜0.0001)，在28周以上的先兆子痫样品中 增加1.06倍(ANOVA p＝＞0.83)。
尽管Per6蛋白表达的差别不如FABP4明显，然而在所述对照与先兆 子痫CV样品之间仍然存在统计差别。与FABP4相似，所述Per6表达水平 只在28周以下样品中有差别而在28周以上样品中没有。所述样品对肌动 蛋白上样对照标准化之后，发现Per6表达在28周以下的先兆子痫样品中 增加8.49倍(ANOVA p＝＜0.01)，而在28周以上的先兆子痫样品中少量 地减少0.69倍(ANOVA p＝＞0.1)。
所述发现数据组由10个28周以下的CV样品和12个28周以上的CV 样品组成。尽管两个数据组在对照和先兆子痫条件之间都是均分的，然而 所识别的差别表达蛋白的显著性需要用一个新的样品组进行进一步验证。 所述验证数据组选自所述胎盘组织库中与所述发现数据组的样品不同的 患者样品。此数据组由18个妊娠28周以下的CV样品和20个妊娠28周 以上的CV样品组成。如同所述发现数据组一样，每个组都是在对照和先 兆子痫实验条件之间均分的。
所述验证数据组的蛋白质印迹结果与所述发现数据组非常相似，这确 认了在所述2D凝胶分析中观察到的表达值。对于所述发现数据组验证蛋 白质印迹，肌动蛋白用作所述验证数据组的上样对照。当使用所述上样对 照标准化FABP4表达水平后，发现FABO4表达在28周以下的先兆子痫样 品中增加4.59倍(ANOVA p＝＜0.001)，而在28周以上的先兆子痫样品 中增加1.13倍(ANOVA p＝＞0.35)。对于Per6表达水平，在用所述激动 蛋白上样对照标准化之后，发现在28周以下的先兆子痫样品中表达增加 2.05倍(ANOVA p＝＜0.001)，而在28周以上的先兆子痫样品中表达降低 0.88倍(ANOVA p＝＞0.39)。
早期先兆子痫样品中的FABP4的上调在两个发现和验证数据组之间 都非常相似。由于本研究分析的样品数量有限以及胎盘组织样品的内在患 者-患者之间差异，每个表达水平的标准偏差反映了这种水平的预期偏差。 因为许多涉及妊娠的蛋白以妊娠时间相关的方式被调节，每组中的不同样 品之间观察到的偏差可归因于28周以下和28周以上样品组中都存在的多 种不同的妊娠时间。我们在样品选择中尽最大努力将胎盘的妊娠时间保持 在可能的最接近的范围内。尽管在所述样品组的选择和分析中尽了很大努 力，对所述样品组中被识别为差别表达的蛋白的调节仍然存在显著的偏 差。尽管结果存在显著的标准偏差，但应注意到表V和VI中总结的ANOVA 分数显示在28周以下的样品中，FABP4和Per6的调节在所述对照和先兆 子痫样品之间都是在统计学上显著的事件。对于28周以上的FABP4和 Per6表达水平，通过表V和VI所示的非常高的ANOVA p值可看出不存在 统计学上显著的差别。
表V：所述脂肪酸结合蛋白(FABP4)的发现和验证数据组的总调节统计数 据

所示值为每组的标准化点体积平均值以及相关的标准偏差。差别调节值为 所述先兆子痫数据组中的平均倍数差别+/-标准偏差。显示的是单尾 ANOVA值以突出统计学相关的差别。
表VI：过氧化物酶6(Per6)的发现和验证数据组的总调节统计数据。

所示值为每组的标准化点体积平均值以及相关的标准偏差。差别调节值为 所述先兆子痫数据组中的平均倍数差别+/-标准偏差。显示的是单尾 ANOVA值以突出统计相关的差别。
讨论
根据它们的差别调节的统计学显著性而将数种蛋白识别为先兆子痫 的生物标志。这些蛋白可被分为5个功能组，包括脂肪酸代谢相关蛋白、 氧化应激相关蛋白、涉及生长调节和控制的蛋白以及参与炎症反应的蛋 白。大部分被识别的生物标志候选与脂肪酸代谢或氧化应激的细胞调节子 有关。
若干在本研究中被识别的差别调节蛋白直接参与脂肪酸代谢：脂肪酸 结合蛋白4(FABP4)、烯酰辅酶A水化酶(ECHS1)和Δ3，5-Δ2，4-二烯酰- 辅酶A异构酶(ECH1)。如上所示，通过蛋白质印迹验证了FABP4在先兆子 痫妊娠中是差别表达的。如2D SDS-PAGE测定的，此蛋白在所述先兆子痫 CV样品中有3.7倍上调。蛋白ECHS1和ECH1则被测定为在先兆子痫中分 别有2.0和3.4倍的下调。这两种蛋白都是脂肪酸β-氧化所需的关键酶。
在此研究中，识别了涉及氧化应激的差别调节的蛋白。在这些蛋白中， 参与氧化应激调节的抗氧化剂蛋白Per6和热休克蛋白β-1(HSP27)在所 述先兆子痫样品中分别有2.7和2倍的上调。另一种微管失稳蛋白胞浆磷 蛋白在先兆子痫中有2.1倍的下调，并在其他研究中已被发现在氧化破坏 应激中是下调的。
在所述先兆子痫CV样品中被发现差别调节的参与所述炎症反应的蛋 白为脂皮质蛋白(LPC1)和前列腺素脱氢酶(PGDH1)。在此研究中，PGDH1 被测定在所述先兆子痫样品中上调2倍。与PGDH1的上调相反，LPC1被 测定在所述先兆子痫样品中下调2.4倍。
其他在先兆子痫中差别表达的蛋白为增殖相关蛋白2G4(PA2G4)和雌 二醇17-β脱氢酶(HSD17B1)。这两种蛋白都行使与雌激素前体代谢有关 的功能。还已知PA2G4作为生长调节分子的发挥功能。在此研究中，发现 PA2G4在所述先兆子痫样品中下调2.7倍，这可指示在先兆子痫妊娠中雌 激素前体转录的可能下调。在此研究中，还发现负责雌激素前体向雌二醇 转化的蛋白HSD17B1在所述先兆子痫样品中下调2.0倍。
人类胎盘生长激素或绒毛膜生长催乳激素(CSH1)和巨噬细胞加帽蛋 白(CAPG)也被识别为在先兆子痫中受调节的蛋白。在此研究中CSH1被识 别为有2.5倍的下调。CAPG被识别为在先兆子痫中有2.2倍的上调。
图1图示了在此研究中所识别的蛋白按功能分类的分组。对属于相似 代谢过程的蛋白的识别为发现其他先兆子痫生物标志提供了基础。
对在28周以下样品中先兆子痫差别调节蛋白的识别有利地提供了一 种先兆子痫早期检测的方法。
在此研究中，在所述28周以下数据组和28周以上数据组中都识别了 差别蛋白。被测定为差别调节的蛋白的识别在这两个数据组之间没有重 叠，这指示所述蛋白生物标志是年龄依赖的并且涉及在特异妊娠时间窗口 中发生的特异生物过程。