通过进化和理性设计的组合获得的用于产生1，2-丙二醇的新微生物 |
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| 申请号 | CN200880009616.8 | 申请日 | 2008-03-21 | 公开(公告)号 | CN101641446A | 公开(公告)日 | 2010-02-03 |
| 申请人 | 代谢探索者公司; | 发明人 | 菲利普·索凯尔; 弗朗索瓦·沃尔克; 雷纳·菲格; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及将进化和理性设计组合用于制备可从 碳 源产生1，2-丙二醇的 微 生物 菌株的新方法。所述方法包括：-在适当的生长培养基中，在选择压 力 下培养初始菌株，所述初始细菌菌株包含的tpiA基因表达削弱，并且丙 酮 醛 转 化成 乳酸中涉及的至少一个基因的表达削弱，以促进所述初始菌株中的进化，-然后选择和分离1，2-丙二醇生产速率增加的进化菌株。-然后在进化菌株中重构功能性tpiA基因。本发明还涉及进化菌株，如获得的菌株，其可以另外进行遗传修饰以优化从碳源到1，2-丙二醇的方法，不产生副产物，得到最优的可能得率。 | ||||||
| 权利要求 | 1.用于制备从碳源产生1，2-丙二醇的微生物的进化菌株的方法，所述方 法包括： |
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| 说明书全文 | 本发明涉及将进化和理性设计组合用于制备微生物以产生1，2-丙二醇的 方法，以及获得的微生物及其用于制备1，2-丙二醇的用途。1，2-丙二醇或丙二醇，即C3二醇，是广泛使用的化学品。它是用于飞机 的抗冻和除冰流体、液体洗涤剂、冷却剂、不饱和聚酯树脂的组分。自从 1993-1994年以来，丙二醇越来越多地用作乙烯衍生物的替代物，所述乙烯衍 生物被认为比丙烯衍生物的毒性更强。 目前使用消耗大量水的环氧丙烷水合工艺通过化学手段产生1，2-丙二醇。 环氧丙烷可以由两种方法中的任一种产生，一种使用表氯醇(epichlorhydrin)， 另一种使用氢过氧化物。两条途径都使用高毒性物质。此外，氢过氧化物途 径产生副产物如叔丁醇和1-苯基乙醇。为使丙烯生产成为有利可图的，必须 使用这些副产物。化学途径通常产生消旋的1，2-丙二醇，而两种立体异构体 (R)1，2-丙二醇和(S)1，2-丙二醇中每种对于某些应用是感兴趣的(例如专门的化 学和药物产品的手性起始材料)。 用于产生1，2-丙二醇的化学方法的缺点使生物合成成为具有吸引力的替 代方法。已表征了两种途径用于通过微生物由糖天然产生1，2-丙二醇。 在第一个途径中，将6-脱氧糖(例如L-鼠李糖或L-岩藻糖)裂解成磷酸二 羟基丙酮和(S)-乳醛，其能进一步还原至(S)-1，2-丙二醇(Badia等，1985)。此途 径在大肠杆菌中有功能，但是因为脱氧己糖的高成本，不能得到经济上可行 的工艺。 第二个途径是通过糖酵解途径，然后是丙酮醛途径来代谢普通糖(例如葡 萄糖或木糖)。将磷酸二羟基丙酮转化成丙酮醛，后者可以还原成乳醛或丙酮 醇。然后这两个化合物可以进行第二次还原反应，得到1，2-丙二醇。此途径 由(R)-1，2-丙二醇的天然生产菌使用，如楔形梭菌(Clostridium sphenoides)和热 解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)。已经使用楔形 梭菌产生1，2-丙二醇，在磷酸盐受限条件下效价(titer)为1.58g/l(Tran Din和 Gottschalk，1985)。也已经研究热解糖热厌氧杆菌用于产生1，2-丙二醇 (Cameron和Cooney，1986，Sanchez-Rivera等，1987)。获得的最佳性能是9g/l 的效价和0.2g/g由葡萄糖的得率。然而，用这些生物获得的性能的改进可能 由于缺少可用的遗传工具而受到限制。 Cameron等(1998)研究了大肠杆菌作为平台用于将糖转化为1，2-丙二醇的 代谢工程的用途。他们的理论分析显示实际产物得率的上限(考虑质量平衡和 生长所需能量的产生)取决于培养条件而显著不同。在厌氧条件下，将产生乙 酸(acetate)作为副产物，以循环还原辅因子，而最佳得率限制在1摩尔1，2-丙 二醇每摩尔葡萄糖(0.42g/g)。在需氧条件下，使用氧作为终端电子受体通过 呼吸链确保辅因子的循环，并且可能在没有副产物产生的情况下产生1，2-丙 二醇。在这些条件下，得率能到达最高1.42mol/mol(0.6g/g)。考虑1，2-丙二 醇的最大效价量，Cameron等讨论了其对于产物和副产物毒性的依赖性。1，2- 丙二醇的毒性显著低于1，3-丙二醇，而且大肠杆菌在100g/l 1，2-丙二醇时表 现出0.5h-1的残余生长速率。对生长的抑制更可能是由于副产物乙酸，已知 其高度抑制生长。开发以高效价和得率产生1，2-丙二醇的厌氧工艺将解决乙 酸问题。已经提出了将乙酸转化成丙酮(WO 2005/073364)，丙酮的抑制性较 低，而且容易原位去除。 已经由Cameron小组(Cameron等，1998，Altaras和Cameron，1999，Altaras 和Cameron，2000)和Bennett小组(Huang等，1999，Berrios-Rivera等，2003)进行 了几项大肠杆菌遗传修饰的研究，以获得使用简单碳源的1，2-丙二醇产生菌。 这些研究一方面依赖于从磷酸二羟基丙酮到1，2-丙二醇的途径中一种或几种 酶活性的表达，另一方面依赖于去除宿主菌株中的NADH和碳的消耗途径。 由Cameron小组获得的最佳结果是在厌氧摇瓶培养中产生1.4g/l 1，2-丙二醇， 得率为0.2g/g消耗的葡萄糖。当外推至厌氧补料批式发酵罐时，产生4.5g/l1，2- 丙二醇，由葡萄糖的得率为0.19g/g，与Cameron等的理论估计相差较大。已 经通过在缺乏编码乳酸脱氢酶的基因(ldhA)的菌株中过表达大肠杆菌的丙酮醛 合酶基因(mgs)、大肠杆菌的甘油脱氢酶基因(gldA)和大肠杆菌的1，2-丙二醇氧 化还原酶基因(fucO)而获得了这些性能。在专利US 6,087,140，US 6,303,352 和WO 98/37204中还描述了用同样的方法获得但效价和得率更低的结果。 Bennett小组还使用缺乏ldhA的大肠杆菌宿主菌株过表达来自丙酮丁醇 梭菌的mgs基因和来自大肠杆菌的gldA基因。在厌氧条件下的摇瓶培养得到 1.3g/l的效价和0.12g/g的得率，而微需氧培养得到1.4g/l的效价和0.13g/g 的得率。 获得产生1，2-丙二醇的菌株的另一种方法是将“初始菌株”的进化定向 到下述状态：其中“进化菌株”产生具有更好特性的期望的化合物。这种方 法基于微生物的自然进化，首先通过削弱两个基因来修饰微生物：tpiA和丙 酮醛向乳酸的转化中涉及的一个基因。削弱编码磷酸丙糖异构酶的tpiA基因 的目的是将以通常由此酶相互转化的3-磷酸甘油醛(GA3P)和磷酸二羟基丙酮 (DHAP)开始的两个代谢分支分离。从DHPA到1，2-丙二醇的途径是“还原分 支”，消耗还原辅因子(NADH)，而从GA3P到乙酸的代谢是“氧化分支”，为 细胞的生长而产生NADH和能量。如果没有功能性的tpiA基因，细胞的代谢 被“锁定”，而且菌株的生长、1，2-丙二醇的产生和乙酸的产生紧密偶联。在 适当的生长培养基中在选择压力下，此初始菌株会进化到如下状态，其中所 述菌株的1，2-丙二醇生产得到改进。在专利申请WO 2005/073364中描述了获 得用于产生1，2-丙二醇的微生物的“进化菌株”的方法。这个进化方法和后 面的发酵步骤优选在厌氧条件下进行。这种技术是对现有技术的明显改进。 获得1.8g/l的1，2-丙二醇效价，得率为0.35克每克消耗的葡萄糖，接近 Cameron等的理论结果。 本发明的目的是通过进化和随后对进化菌株的理性遗传工程来改进1，2- 丙二醇生产菌株。特征(special feature)是在进化的tpiA负菌株中重构功能性 tpiA基因。这些修饰使1，2-丙二醇的生产得到改进。 发明描述 本发明涉及将进化和理性设计组合用于制备从碳源产生1，2-丙二醇的微 生物菌株的新方法。所述方法包括： -在适当的生长培养基中在选择压力下培养初始菌株，所述初始细菌菌 株包含tpiA基因表达的削弱，和丙酮醛变为乳酸转化中涉及的至少一个基因 (如gloA、aldA、aldB)表达的削弱，以促进所述初始菌株中的进化， -然后选择和分离1，2-丙二醇生产速率增加的进化菌株(增加至少20％)。 -然后在进化菌株中重构功能性tpiA基因； 在本发明的一个方面，通过缺失编码由丙酮酸(ldhA)、甲酸(pflA，pflB)、 乙醇(adhE)合成乳酸中涉及酶的基因来削弱不需要的副产物的合成。在本发 明的另一个方面，通过缺失edd和/或eda基因来消除Entner-Doudoroff途径。 有利地，为了使更多NADH可用于1，2-丙二醇生物合成途径中的还原步骤， 选自arcA和ndh中的至少一个基因被削弱。 用于制备1，2-丙二醇的微生物选自细菌、酵母和真菌中，但是优选来自 大肠杆菌或丙酮丁醇梭菌菌种。 本发明还涉及进化菌株如获得的菌株，其可以进一步进行遗传修饰以优 化碳源变为1，2-丙二醇的转化，而无副产物且以可能的最优得率进行。在本 发明的一个方面，降低了3-磷酸甘油醛脱氢酶活性，以将可用的3-磷酸甘油 醛的一部分重定向至1，2-丙二醇的合成。在本发明的另一个方面，通过使用 不依赖糖输入的(sugar import independent)磷酸烯醇丙酮酸(PEP)(像由galP编 码的)，或者通过向糖-磷酸转移酶系统提供更多的PEP，来增加糖输入的效率。 这通过消除消耗PEP类丙酮酸激酶(由pykA和pykE基因编码)的途径，和/或 通过促进PEP的合成，例如通过过表达编码PEP合酶的ppsA基因来获得。 此外，对于将丙酮酸转化成乙酰-CoA的酶有价值的是对在厌氧条件下存在的 高浓度NADH有抗性。这可通过在lpd基因中的特定突变来获得。有利地， 通过削弱ackA、pta、poxB基因中的一个或几个来防止副产物乙酸的合成。 本发明还涉及以最优得率，在需氧、微需氧或厌氧条件下产生1，2-丙二 醇的方法，其中使用所述在包含简单碳源的适当生长培养基中生长的、进化 的且可选地经遗传修饰的大肠杆菌菌株。此外，本发明涉及以最优得率，在 厌氧条件下产生1，2-丙二醇的方法，其中使用在包含简单或复杂碳源的适当 生长培养基中生长的、所述进化的且可选地经遗传修饰的丙酮丁醇梭菌菌株。 随后回收根据这个方法产生的1，2-丙二醇和可选地纯化。 附图简述 并入本说明书并构成本说明书的一部分的附图例示了本发明，并与描述 部分一起，用来解释本发明的原理。 图1描绘由糖产生1，2-丙二醇的系统的开发中的中央代谢的遗传工程。 发明详述 如本文所使用的，下述术语可以用于解释权利要求和说明书。 术语“菌株”表示菌种的遗传变体。因而术语“微生物的菌株”表示特定 微生物菌种的遗传变体。任何菌株的给定特性也适用于相应微生物，反之亦然。 根据本发明，术语“培养”、“生长”和“发酵”可互换使用，表示细菌 在包含简单碳源的适当生长培养基中的生长。 根据本发明，术语“碳源”表示碳的任何来源，其可以由本领域技术人 员用来支持微生物的正常生长，并且其可以是己糖、戊糖、单糖、二糖、寡 糖、淀粉或其衍生物、半纤维素、甘油，和它们的组合。 根据本发明，术语“适当的生长培养基”表示分子组成已知的培养基， 其适合微生物生长并且以促进期望的进化的方式设计。 根据本发明，进化方法是用于制备进化微生物的方法，所述微生物提供 改进的生产特性，该方法包括下述步骤： a)修饰微生物，以获得具有“锁定”代谢的初始菌株，其中当初始菌株 的细胞在适当的培养基中生长时，进化只能为期望的方向， b)将如上获得的初始菌株在所述适当的培养基中培养以使其进化，其中 初始菌株在需氧、微需氧或厌氧条件下生长， c)选择能在这些特定条件下生长的“进化菌株”，其提供对期望化合物 的改进的生产特性。 这个进化方法已经由相同的申请人在2004年2月17日提交的专利申请 WO 2004/076659和2005年1月12日提出的WO 2005/073364中详尽描述。 根据本发明，术语“选择”表示这样的方法，其中保留在培养基中的仅 有的微生物菌株是在选择压力条件下提供更好适应性的菌株。通常，最适合 的菌株会超过其竞争者，然后被选择。在群落中选择微生物的特定的进化菌 株的简单方式包括使群落在连续培养中生长，其中生长缓慢的菌株最终从培 养物中洗脱。这不是选择的排他性实例，可以应用本领域专家已知的其他选 择方法。 术语“分离”表示这样的方法，其中从提供不同遗传特性的菌株群落中 分离出提供特定遗传修饰的个体菌株。这可以通过在进化期后对生物质取样， 并将其涂布在培养皿(Petri dish)上以分离单菌落。 术语“1，2-丙二醇产生速率”指以g/l/h表示的产生速率，如下计算： 培养基中产生的1，2-丙二醇的浓度(g/l)/此生产所需的时间(小时) 此外，以g/g/h表示比生产速率，其考虑了生物质的量，可以如下计算： 培养基中产生的1，2-丙二醇的浓度(g/l)/培养基中产生的生物质的浓度(g/l) /此生产所需的时间(h) 可以通过用分光光度计例如600nm处的读数来测量发酵培养液的吸光 度，或通过将一定体积发酵培养液干燥后测定细胞干重来确定生物质的浓度。 通过高效液相色谱(HPLC)，根据技术规程的状态用适合的柱测量产生的 1，2-丙二醇的量。 在本发明中，选择进化菌株的下述特性：葡萄糖摄入速率增加和1，2-丙 二醇产生速率改进。然后分离出显示这些特性的菌株，并有利地互相比较， 从而鉴定最佳的生产菌。 以g/l/h表示的葡萄糖摄入速率如下计算： 由培养消耗的葡萄糖的浓度(g/l)/此消耗所需的时间(h) 如前所述，通过考虑培养基中生物质的浓度，可以计算比葡萄糖摄入速率。 葡萄糖摄入速率和1，2-丙二醇产生速率密切相关。如果葡萄糖的消耗增 加，则由葡萄糖代谢产生的产物以同样的比例增加。 在选择和分离后，最佳进化菌株提供比初始菌株高约20％，优选高约30％ 或更多，更优选高50％的葡萄糖摄入。 增加的1，2-丙二醇产生速率比初始菌株的产生速率高约20％，优选高约 30％或更多，更优选高约50％。 tpiA基因编码酶“磷酸丙糖异构酶”，其催化DHAP和GA3P的相互转 化(参见图1)。削弱这个基因的目的是以一定方式工程改造细胞的代谢，使得 向1，2-丙二醇最有效产生的进化成为可能。 根据本发明，术语“基因表达的削弱”表示基因表达的部分或全部抑制， 即所述的“削弱”。这种表达的抑制可以是抑制基因的表达，抑制基因的激活机 制，缺失基因表达所需的全部或部分启动子区域，或者缺失基因的编码区域。 优选地，基因的削弱基本上是基因的完全缺失，所述基因可以用促进本发明菌 株的鉴定、分离和纯化的选择标记基因取代。优选通过Datsenko，K.A.和Wanner， B.L.(2000)“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6640-6645所述的同源重组技 术使基因失活。其他方法在下面描述。 术语“表达”指基因序列的转录和翻译，其可以产生相应的蛋白质，即 基因产物。 术语“在进化菌株中重构功能性tpiA基因”表示在进化方法后，通过导 入功能性tpiA基因来修饰所选择的进化菌株，这可以通过用野生型功能性拷 贝经同源重组替代削弱的基因拷贝，从而使磷酸丙糖异构酶活性恢复到类似 于初始菌株中测定的活性，或者通过在不同染色体基因座上导入功能性tpiA 基因或者通过在质粒上导入功能性tpiA基因而完成。这种恢复通过将GA3P 部分循环成为DHAP以通过磷酸丙糖异构酶的作用而产生1，2-丙二醇，能使 由葡萄糖产生1，2-丙二醇的得率大于1摩尔/摩尔。 削弱丙酮醛(2-氧代丙醛)变成乳酸的转化中涉及的至少一个基因的表达 的目的是抑制丙酮醛转化成乳酸，使存在的丙酮醛被基本上用于合成1，2-丙 二醇的细胞机制使用。 丙酮醛变成乳酸的转化中涉及的基因具体为： -编码乙二醛酶的基因，例如编码乙二醛酶I的gloA基因，其催化从丙 酮醛合成乳酰谷胱甘肽； -编码乳醛脱氢酶的aldA和aldB基因(其催化从(S)乳醛合成(S)乳酸)。 在初始菌株中，有利地削弱了这些基因中一个或多个的表达(或完全缺失 所述基因)。优选缺失gloA基因。 对初始菌株有利地进行其他修饰，包括抑制天然葡萄糖发酵途径，所述 途径消耗还原当量NADH，并且因此与1，2-丙二醇生物合成途径竞争。 具体地，有利的是削弱编码乳酸脱氢酶的基因ldhA的表达，其催化由丙 酮酸合成乳酸，并且削弱编码醇-醛脱氢酶的基因adhE的表达，其催化由乙 酰-CoA合成乙醇。 相似地，可能迫使微生物使用丙酮酸脱氢酶复合物以从丙酮酸产生乙酰 -CoA和NADH。这可以通过削弱编码丙酮酸甲酸裂合酶的基因pflA和pflB 的表达而实现。 编码Entner-Doudoroff途径中涉及的酶的基因edd和eda中的至少一个的 削弱，也可用于防止葡萄糖直接代谢为能绕过1，2-丙二醇合成途径的3-磷酸 甘油醛和丙酮酸。 在厌氧或微需氧条件下，用于将前体还原成1，2-丙二醇的NADH的可用 性得到有利地增加。这可以通过减轻全局调控子ArcA(由arcA基因编码)介 导的对三羧酸循环的抑制而获得。细胞中NADH的浓度也可以通过失活由基 因ndh编码的NADH脱氢酶II而增加。因此，优选地，选自arcA和ndh中 的至少一个基因的表达被削弱。 优选地，初始菌株选自下组：细菌，酵母和真菌。 更优选地，初始菌株选自下组：肠杆菌科、芽孢杆菌科、梭菌科、链霉 菌科和棒杆菌科。 在本发明的优选实施方案中，初始菌株是大肠杆菌或丙酮丁醇梭菌。 易于获得的进化菌株，和如通过前述方法获得的进化菌株，也是本发明 的目的。 在此进化菌株中，有利的是修饰特定基因的表达，即增加或削弱基因表达。 这些修饰可以改进1，2-丙二醇的生产性能。 为了获得目的基因的过表达，本领域的技术人员了解不同的方法，例如： -用更强的启动子替换内源启动子。 -向微生物导入携带所述目的基因的表达载体。 -向染色体中导入目的基因的额外拷贝。 本领域的技术人员了解几种用于将DNA导入细菌菌株的技术。优选的技 术是电穿孔，其为本领域的技术人员所熟知。 为了获得基因表达的削弱，本领域的技术人员了解不同的方法，如下所述。 在本发明的特定实施方案中，通过削弱3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活 性而修饰进化菌株，以减少糖酵解下部的流量，并使其重新定向至DHAP和 最终1，2-丙二醇的合成(参见图1)。这种减小的活性具体可以通过削弱gapA 基因的表达而获得。 术语“酶活性的削弱”指与进行任何修饰之前在进化菌株中观察到的活 性相比，目的酶的活性降低。本领域的技术人员了解多种手段以获得此结果， 例如： -向基因中导入突变，降低该基因的表达水平，或者降低编码蛋白质的 活性水平。 -用低强度的启动子取代基因的天然启动子，得到更低的表达。 -使用使相应信使RNA或蛋白质不稳定的元件。 -如果期望完全不表达则缺失基因。 在进化菌株中，有利地增加糖输入的效率。gapA基因表达的有力削弱使 GAPDH反应中碳流量降低超过50％，这将导致每摩尔输入的葡萄糖合成小 于1摩尔的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。确保向细胞中输入简单糖的糖-磷酸转移 酶系统(PTS)通常与给出6-磷酸葡萄糖的磷酸化反应偶联。通过将PEP转化成 丙酮酸而提供这个反应所需的磷酸。因此通过减少经过3-磷酸甘油醛的流量 来减少所产生的PEP的量，可以减少糖输入。 在本发明的特定实施方案中，可以通过不依赖于磷酸烯醇丙酮酸可用性 的糖输入系统将糖输入微生物。可以利用由galP基因编码的半乳糖-质子共运 输体(symporter)，其不涉及磷酸化。在这种情况下，输入的葡萄糖必须被由 glk基因编码的葡萄糖激酶磷酸化。为了促进此途径，增加选自galP和glk 中的至少一个基因的表达。结果，PTS变得不必要(dispensable)，而且可以通 过削弱选自ptsH、ptsI或crr中的至少一个基因的表达而消除。 在本发明的另一个特定的实施方案中，通过增加代谢物PEP的可用性而 增加PTS的效率。由于gapA活性的削弱和向丙酮酸的碳流量较低，所以本 发明的修饰菌株中PEP的量受到限制，导致转运至细胞中的葡萄糖量较低。 存在可用于增加微生物菌株中PEP可用性的多种手段。具体地，一种手 段是削弱反应PEP→丙酮酸。优选地，将选自pykA和pykF中编码丙酮酸激 酶的至少一个基因的表达在所述菌株中削弱以获得此结果。另一种方式是增 加PEP的可用性，有利于反应丙酮酸→PEP，所述反应由磷酸烯醇丙酮酸合 酶催化，可以通过增加酶的活性而实现。此酶由ppsA基因编码。因此，优选 地在微生物中增加ppsA基因的表达。两种修饰可以同时存在于微生物中。 特别是在厌氧或微需氧条件下，有利的是，将丙酮酸转化成乙酰-CoA的 丙酮酸脱氢酶对于NADH的抑制具有低的敏感性。术语“低的敏感性”相对 于未修饰酶的敏感性而定义，如已经在WO 2005/073364中证明的。具体地， 这些特性可以通过如下方式获得：向lpd基因(编码PDC的硫辛酰胺脱氢酶亚 基)中导入特定突变，使酶的蛋白质序列中的丙氨酸55被缬氨酸代替。 在本发明的另一个特定的实施方案中，防止副产物乙酸的合成。在完全需 氧的条件下，优先经由呼吸链，以氧作为终端电子受体，将还原辅因子NADH 氧化成为NAD+。因此，共产物(例如乙酸)的合成不是强制性的。优选避免这 样的乙酸合成，以优化1，2-丙二醇的产生。 为了防止产生乙酸，有利地削弱了乙酸合成中涉及的至少一个酶的活性。 优选地，选自ackA、pta和poxB中的至少一个基因的表达被削弱，所有这些 基因都编码涉及不同的乙酸生物合成途径的酶(参见图1)。 本发明的另一个目的是用于制备1，2-丙二醇的方法，其中进化菌株如前 述的菌株在包含碳源的适当的生长培养基中生长，然后回收产生的1，2-丙二 醇。在需氧、微需氧或厌氧条件下进行1，2-丙二醇的产生。 根据本发明的微生物的培养条件(发酵)可以由本领域的技术人员容易地 确定。具体地，细菌在20℃-55℃，优选在25℃-40℃的温度发酵，并且对于 丙酮丁醇梭菌优选在约35℃，对于大肠杆菌在约37℃的温度发酵。 这个方法可以以分批方法，补料分批方法或连续方法进行。 可以使用进化菌株在需氧、微需氧或厌氧条件下产生1，2-丙二醇。 “在需氧条件下”表示通过将气体溶于液相而向培养物供氧。这可以通 过下述方式获得：(1)将含氧气体(例如空气)鼓泡入液相，或(2)震荡包含培养 基的容器，以将液上空间包含的氧传递入液相。在需氧条件而不是厌氧条件 下发酵的优势是氧作为电子受体的存在改进了菌株以ATP形式为细胞过程产 生更多能量的能力。因此菌株的普通代谢得到了改进。 微需氧条件定义为这样的培养条件：其中低百分比的氧(例如使用包含 0.1-10％氧的气体混合物，用氮补至100％)溶于液相中。 厌氧条件定义为不向培养基供氧的培养条件。可以通过向培养基中鼓泡 惰性气体如氮气，去除痕量的其他气体而获得严格厌氧条件。可以使用氮气 作为电子受体以改进菌株的ATP生产，并改进其代谢。 在用于1，2-丙二醇生产的发酵方法和进化方法中，用适于所用细菌的设 定组成已知的培养基在发酵罐中进行菌株的培养，所述培养基包含至少一种 碳源。具体地，因此用于大肠杆菌的基本生长培养基可以与M9培养基 (Anderson，1946，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32：120-128)、M63培养基(Miller， 1992；A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，New York)或如Schaefer等(1999，Anal.Biochem.270：88-96) 所定义的培养基有相同或相似的组成，并且具体地，命名为MPG的基本培养 基如下所述： K2HPO4 1.4g/l 氮川三乙酸 0.2g/l 痕量元素溶液＊ 10ml/l (NH4)2SO4 1g/l NaCl 0.2g/l NaHCO3 0.2g/l MgSO4 0.2g/l 葡萄糖 20至100g/l NaNO3 0.424g/l 硫胺素 10mg/l FeSO4，7H2O 50mg/l 酵母提取物 4g/l 用氢氧化钠将培养基的pH调至7.4。 *痕量元素溶液：柠檬酸4.37g/L，MnSO4 3g/L，CaCl2 1g/L，CoCl2，2H2O 0.1g/L，ZnSO4，7H2O 0.10g/L，CuSO4，5H2O 10mg/L，H3BO3 10mg/L， Na2MoO4 8.31mg/L。 在本发明的具体实施方案中，用大肠杆菌的进化菌株，在包含简单碳源 的生长培养基中进行所述方法，其中简单碳源可为阿拉伯糖、果糖、半乳糖、 葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或木糖。特别优选的简单碳源是葡萄糖。 在本发明的另一个特定的实施方案中，用丙酮丁醇梭菌的进化菌株，在 包含简单碳源或复杂碳源的生长培养基中进行所述方法。 因此丙酮丁醇梭菌的生长培养基可以与梭菌属生长培养基(CGM， Wiesenborn等，Appl.Environm.Microbiol.，54：2717-2722)或由Monot等(Appl. Environm.Microbiol.，44：1318-1324)或Vasconcelos等(J.Bacteriol.，176： 1443-1450)给出的无机生长培养基具有相同或相似的组成。 用于丙酮丁醇梭菌培养的碳源是简单或复杂碳。简单碳源可以是阿拉伯 糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或木糖。特别优选的简单碳 源是葡萄糖。复杂碳源可以是淀粉或半纤维素。特别优选的复杂碳源是淀粉。 优选地(preferentially)，进一步纯化回收的1，2-丙二醇。本领域的技术人 员了解用于回收和纯化所产生的1，2-丙二醇的方法。这些方法是常用方法。 本发明在上文、下文和实施例中针对大肠杆菌描述。因此对于本发明的 初始和进化菌株可以削弱、缺失或过表达的基因主要使用来自大肠杆菌的基 因的名称(denomination)来定义。然而，这种指定根据本发明具有更一般的意 义，并覆盖了其他微生物中相应的基因。使用来自大肠杆菌的基因的GenBank 参考符号(reference)，本领域的那些技术人员能确定大肠杆菌之外的其他生物 体中的等同基因。 鉴定同源序列和它们的百分比同源性的方法是本领域的技术人员公知 的，并且具体包括可以在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上以网站上 指示的默认参数使用的BLAST程序。获得的序列可以使用例如程序 CLUSTALW(http://ww.ebi.ac.uk/clustalw/)以这些网站上指示的默认参数进 行研究(比对)。 PFAM数据库(比对和隐藏的Markov模型的蛋白质家族数据库， http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是蛋白质序列比对的大集合。每个 PFAM能够显示多重比对，查看蛋白质域，评价生物体之间的分布，访问其 他数据库并显示已知的蛋白质结构。 通过比较源自代表了44个主要的系统发生系的66个完全测序基因组的 蛋白质序列而获得COG(蛋白质直向同源组的簇，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ COG/)。每个COG由至少三个系定义，从而能够鉴定古老的保守的域。 参考文献(按在本文中引用的顺序) 1.Badia J，Ros J，Aguilar J(1985)，J.Bacteriol.161：435-437. 2.Tran Din K和Gottschalk G(1985)，Arch.Microbiol.142：87-92 3.Cameron DC和Cooney CL(1986)，Bio/Technology，4：651-654 4.Sanchez-Rivera F，Cameron DC，Cooney CL(1987)，Biotechnol.Lett.9： 449-454 5.Altaras NE和Cameron DC(1999)，Appl.Environ.Microbiol.65： 1180-1185 6.Cameron DC，Altaras NE，Hoffman ML，Shaw AJ(1998)，Biotechnol. Prog.14：116-125 7.Altaras NE和Cameron DC(2000)，Biotechnol.Prog.16：940-946 8.Huang K，Rudolph FB，Bennett GN(1999)，Appl.Environ.Microbiol.65： 3244-3247 9.Berrios-Rivera SJ，San KY，Bennett GN(2003)，J.Ind.Microbiol. Biotechnol.30：34-40 10.Datsenko KA和Wanner BL(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97： 6640-6645 11.Anderson EH(1946)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 32：120-128 12.Miller(1992)，A Short Course in Bacterial Genetics：A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York 13.Schaefer U，Boos W，Takors R，Weuster-Botz D(1999)，Anal.Biochem. 270：88-96 14.Wiesenborn DP，Rudolph RB，Papoutsakis ET(1987)，Appl.Environ. Microbiol.，54：2717-2722 15.Monot F，Martin JR，Petitdemange H，Gay R(1982)，Appl.Environ. Microbiol.44：1318-1324 16.Vasconcelos I，Girbal L，Soucaille P(1994)，J.Bacteriol.176：1443-1450 实施例 下述实施例表示： 1.大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA， ΔaldB，Δedd，ΔarcA，Δndh的修饰菌株的构建 2.所述初始菌株的进化 3.所选进化菌株中tpiA基因的重构 4.gapA基因的削弱，基因pykA和pykF的缺失，ppsA基因的过表达 5.基因ackA-pta、poxB的缺失 6.在需氧条件下，几种获得的用于1，2-丙二醇生产的菌株的比较 7.用最佳的菌株在补料分批培养中产生1，2-丙二醇 实施例1：构建能向改进的1，2-丙二醇的生产进化的大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔarcA，Δndh的 修饰菌株： a)构建大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ldhA::Km，ΔgloA， ΔaldA，ΔaldB，Δedd的修饰菌株 根据操作规程1在菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE， ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd::cm(参见WO2005073364)中消除氯霉素 抗性盒。 操作规程1：抗性盒的消除 根据下述技术消除氯霉素和/或卡那霉素抗性盒。通过电穿孔将携带在氯 霉素和/或卡那霉素抗性盒的FRT位点发挥作用的FLP重组酶的质粒pCP20 导入菌株。在42℃系列培养后，用表1中给出的寡核苷酸通过PCR分析，检 验抗生素抗性盒是否丢失。 使用表1给出的寡核苷酸检验菌株中先前建立的修饰是否存在。 将获得的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE， ldhA::km，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd。 表1.用于检查抗性盒的插入或抗性盒的丢失的寡核苷酸 区域名称 寡聚物的名称 SEQ ID 与染色体区域同源的部分 tpiA基因 (缺失) cdh YIIQ No1 No2 参见WO2005073364 pflAB基因 pflABF pflABR No3 No4 参见WO2005073364 adhE基因 ychGf adhECr No5 No6 参见WO2005073364 ldhA基因 (盒插入) hsIJC ldhAC2 No7 No8 参见WO2005073364 gloA基因 NemACd Rnt Cr No9 No10 参见WO2005073364 aldA基因 Ydc FCf gapCCr No11 No12 参见WO2005073364 aldB基因 aldBCf YiaYCr No13 No14 参见WO2005073364 edd基因 Eda d Zwfr No15 No16 参见WO2005073364 ldhA基因 (缺失) ldhAF ldhAR No17 No18 1439724至1439743 1441029至1441007 arcA基因 arcAF arcAR No19 No20 4638292至4638273 4636854至4636874 ndh基因 ndhF ndhR No21 No22 1164722至1164742 1167197至1167177 tpiA基因 (重构) YIIQ tpiA R No2 No23 4109599至4109580 4108953至4108973 gapA启动子 (Ptrc 16-gapA) yeaAF gapAR No24 No25 1860259-1860287 1861068-1861040 pykA基因 pykAF pykAR No26 No27 1935338至1935360 1937425至1937401 pykF基因 pykFF No28 1753371至1753392 pykFR No29 1755518至1755495 ackA-pta基因 B2295 YfcCR No30 No31 2410900至2410919 2415164至2415145 poxB基因 poxBF poxBR No32 No33 908475至908495 910375至910352 b)构建大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA， ΔaldA，ΔaldB，Δedd的修饰菌株 为了消除卡那霉素抗性盒和失活ldhA基因，根据操作规程2，将氯霉素 抗性盒插入缺失相关基因的大部分的ldhA基因中。 操作规程2：导入用于重组的PCR产物和选择重组体 使用表2中选择和给出的用于替代基因或基因间区域的寡核苷酸，从质 粒pKD3扩增氯霉素抗性盒或从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko， K.A.和Wanner，B.L.(2000))。然后通过电穿孔将获得的PCR产物导入携带质 粒pKD46的受体菌株，所述质粒中表达的系统λRed(γ，β，exo)对同源重组极 为有利。然后选择对抗生素有抗性的转化体，并用表1中给出的适当的寡核 苷酸通过PCR分析，检查抗性盒的插入。 用表1中给出的寡核苷酸检查菌株的其他修饰。 将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔldhA::cm，ΔtpiA，ΔpflAB， ΔadhE，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd。 表2.用于通过用PCR产物重组而在大肠杆菌MG1655中替代染色体区域 的寡核苷酸 区域名称 寡聚物的名称 SEQ ID 与染色体区域同源的部分 ldhA基因 DldhAF DldhAR No34 No35 1440865-1440786 1439878-1439958 arcA基因 DarcAF DarcAR No36 No37 4637868-4637791 4637167-4637245 ndh基因 DndhF DndhR No38 No39 1165071-1165149 1166607-1166528 tpiA基因 (重构) tpiA::kmF tpiA::kmR No40 No41 4109264-4109195 4109109-4109193 gapA启动子 (Ptrc16-gapA) Ptrc-gapAF Ptrc-gapAR No42 No43 1860478-1860536 1860762-1860800 pykA基因 DpykAF DpykAR No44 No45 1935756-1935836 1937055-1937135 pykF基因 DpykFF DpykFR No46 No47 1753689-1753766 1755129-1755051 ackA-pta基因 DackAF DptaR No48 No49 2411494-2411573 2414906-2414830 poxB基因 DpoxBF DpoxBR No50 No51 908557-908635 910262-910180 c)构建修饰的菌株大肠杆菌MG1655ΔarcA::km 使用操作规程2中所述技术，用表2中给出的寡核苷酸通过插入卡那霉 素抗生素抗性盒并缺失相关基因的大部分而使菌株大肠杆菌MG1655中的 arcA基因失活。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔarcA::km。 d)构建大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔplfAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA， ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔarcA的修饰菌株 通过用噬菌体P1转导的技术，用卡那霉素抗性盒进行基因置换而缺失菌 株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA， ΔaldB，Δedd中的基因arcA。 操作规程3：用噬菌体P1转导而缺失基因 通过用噬菌体P1转导的技术，用抗性盒(卡那霉素或氯霉素)进行基因置 换而缺失受体大肠杆菌菌株中的所选基因。操作规程为两个步骤：(i)用单一 基因缺失的菌株MG1655制备噬菌体裂解物和(ii)由这一噬菌体裂解物转导受 体菌株。 噬菌体裂解物的制备 -用单一基因缺失的菌株MG1655的100μl过夜培养物接种10ml LB+ Cm 30μg/ml+葡萄糖0.2％+CaCl2 5mM。 -在37℃震荡温育30分钟。 -加入由野生型菌株MG1655制备的100μl噬菌体裂解物P1(约1x109 个噬菌体/ml)。 -在37℃震荡3小时直至细胞裂解。 -加入200μl氯仿，并漩涡震荡。 -在4500g离心10分钟以去除细胞碎片。 -将上清液转移至无菌管中，并加入200μl氯仿。 -在4℃保存裂解物。 转导 -将LB培养基中大肠杆菌受体菌株的5ml过夜培养物在1500g离心10 分钟。 -将细胞沉淀(pellet)悬浮于2.5ml MgSO4 10mM，CaCl2 5mM中。 -对照管：100μl细胞 具有单一基因缺失的菌株MG1655的100μl噬菌体P1 -测试管(tube test)：100μl细胞+具有单一基因缺失的菌株MG1655的 100μl噬菌体P1 -在30℃无震荡温育30分钟。 -在每个管中加入100μl1M柠檬酸钠，并漩涡震荡。 -加入1ml LB。 -在37℃震荡温育1小时。 -在7000rpm将管离心3分钟后涂布于LB+Cm 30μg/ml平板上。 -37℃过夜温育。 然后选择抗生素抗性转化体，并用表1中给出的适当的寡核苷酸通过 PCR分析检查缺失的插入。 将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE， ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔarcA::km。 然后根据操作规程1消除氯霉素和卡那霉素抗性盒。将获得的菌株命名 为大肠杆菌MG 1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB， Δedd，ΔarcA。 e)构建大肠杆菌MG1655Δndh::km的修饰菌株 用表2中给出的寡核苷酸通过使用操作规程2中所述技术，通过插入卡 那霉素抗性盒并缺失相关基因的大部分而使ndh基因失活。将得到的菌株命 名为大肠杆菌MG1655Δndh::km。 f)构建菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，.ΔplfAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA， ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔarcA，Δndh 通过操作规程3描述的使用噬菌体P1的转导技术，如前所述由卡那霉素 抗性盒进行基因置换而缺失菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，.ΔplfAB，ΔadhE， ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔarcA中的基因ndh。 将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，.ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA， ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔarcA，Δndh::km。 然后根据操作规程1消除卡那霉素抗性盒。将获得的菌株命名为大肠杆 菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd， ΔarcA，Δndh。 在每个步骤，使用表1中给出的寡核苷酸，检查菌株中先前构建的修饰 是否存在。 实施例2：修饰菌株大肠杆菌MG1655 lpd*ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE， ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd在微需氧条件下在恒化培养中的进化和 进化的生理表征： 为了向改进的1，2-丙二醇生产的方向进化，一方面在厌氧条件下另一方 面在微需氧条件(1％氧)下在连续培养中在如前所述的具有过量葡萄糖(起初 20g/l，如果葡萄糖耗尽则补加)的培养基MPG中培养菌株大肠杆菌MG1655 lpd*ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd。将温度设置 在37℃，通过加碱将pH调至6.5。菌株在恒化中进化后，生物质浓度增加， 与产物1，2-丙二醇和副产物乙酸的浓度增加偶联，历时几周(4周多至6周)。 这表示菌株性能的改进。当培养物到达稳态，在这些条件下浓度不再增加时， 即完成了进化。 评价了进化前和进化后菌株的特性。在培养皿上分离代表个体克隆的单 菌落。使用初始菌株作为对照，在锥形瓶实验中评价这些克隆，使用的培养 基与恒化培养中使用的MPG培养基相同。在这些克隆中，将提供较好1，2- 丙二醇比生产速率的几个克隆与对照比较。选择这些克隆用于后面的步骤。 对于每种进化条件下对于最佳克隆获得的结果示于下面的表4和5中。 表4.在厌氧条件下进化后获得的最佳进化克隆与初始菌株的比较 菌株大肠杆菌MG1655lpd*ΔtpiA ΔpflAB ΔadhEΔldhA::cmΔgloAΔald，ΔaldBΔedd 进化前的初始菌株(培 养2天后测量的性能) 最佳进化克隆(培养 2天后测量的性能) 萄萄糖比消耗速率 (g葡萄糖/g生物质/h) 0.12 0.21(+75％) 1，2-丙二醇比生产速率 (g 1，2-丙二醇/g生物质/h) 0.02 0.07(+250％) 1，2-丙二醇+羟基丙酮比生产速率 (g 1，2-丙二醇+羟基丙酮/g生物质/h) 0.04 0.08(+100％) 表5.在微需氧条件下进化后获得的最佳进化克隆与初始菌株的比较 菌株大肠杆菌MG1655lpd＊ΔtpiAΔpflAB ΔadhEΔldhA::cm ΔgloAΔald，ΔaldB Δedd 进化前的初始菌株(培 养2天后测定性能) 最佳进化克隆(培养 2天后测定性能) 葡萄糖比消耗速率 (g葡萄糖/g生物质/h) 0.10 0.22(+120％) 1，2-丙二醇比生产速率 (g 1，2-丙二醇/g生物质/h) 0.01 0.08(+700％) 1，2-丙二醇+羟基丙酮比生产速率 (g 1，2-丙二醇+羟基丙酮/g生物质/h) 0.04 0.08(+100％) 因为这些克隆已经在含酵母提取物的培养基上培养了一段延长的时间， 所以需要适应在基本培养基中的生长。通过在基本培养基上系列培养，使表 4和5中给出其性能的两个最佳克隆适应，以增加在这些条件下它们的生长 速率，并且当它们的生长速率稳定时，停止适应。从最终培养物分离克隆并 检查其是否代表了已适应的群落。 实施例3：大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，ΔpflAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA， ΔaldA，ΔaldB，Δedd选择的进化菌株中tpiA基因的重构 a)构建修饰菌株大肠杆菌MG1655 tpiA::km 根据操作规程2中描述的技术，用表2中给出的寡核苷酸，将卡那霉素 抗生素抗性盒插入基因tpiA的上游。将得到的菌株命名为大肠杆菌MG1655 tpiA::km。 然后用操作规程3中描述的噬菌体P1，使用转导技术进行基因tpiA在进 化菌株大肠杆菌MG1655 lpd*，ΔtpiA，.ΔplfAB，ΔadhE，ΔldhA::cm，ΔgloA，ΔaldA， ΔaldB，Δedd，ΔarcA，Δndh中的重构。 将得到的菌株命名为进化菌株大肠杆菌MG1655lpd*，tpiArc::km，.ΔplfAB， ΔadhE，ΔldhA ::cm，ΔgloA，ΔaldA，ΔaldB，Δedd，ΔarcA，Δndh。 然后根据操作规程2消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。将获得的菌株命名 为“进化大肠杆菌tpiArc”。 使用表1中给出的寡核苷酸检查菌株中先前构建的修饰是否存在。 实施例4：“进化大肠杆菌tpiArc”的修饰：gapA基因的削弱；基因pykA 和pykF的缺失；用载体pJB137-PgapA-ppsA进行ppsA基因的过表达 a)用合成的短Ptrc16启动子替代天然的gapA启动子 通过用FRT-CmR-FRT和工程改造的启动子替代225bp的上游gapA序 列，用合成的短Ptrc16启动子(SEQ ID NO 52：gagctgttgacgattaatcatccggctcg aataatgtgtggaa)替代菌株“进化大肠杆菌tpiArc”中的天然gapA启动子。 使用的技术如操作规程2所述，使用表2中给出的寡核苷酸。将得到的 菌株命名为“进化大肠杆菌tpiArc”Ptrc16-gapA::cm。 然后根据操作规程1消除氯霉素抗性盒。将获得的菌株命名为“进化大 肠杆菌tpiArc”Ptrc 16-gapA。 b)pykA基因的缺失 使用操作规程2中所述技术，用表2给出的寡核苷酸，通过插入卡那霉 素抗生素抗性盒和缺失相关基因的大部分而使pykA基因失活。将得到的菌株 命名为“进化大肠杆菌tpiArc”Ptrc16-gapA ΔpykA::km。 然后根据操作规程1消除卡那霉素抗性盒。将获得的菌株命名为“进化 大肠杆菌tpiArc”Ptrc 16-gapA ΔpykA。 c)pykF基因的缺失 使用操作规程2中所述技术，用表2给出的寡核苷酸，通过插入卡那霉 素抗生素抗性盒和缺失相关基因的大部分而使pykF基因失活。将得到的菌株 命名为“进化大肠杆菌tpiArc”Ptrc16-gapA ΔpykA ΔpykF::km。 如前，然后根据操作规程1消除卡那霉素抗性盒。将获得的菌株命名为 “进化大肠杆菌tpiArc”Ptrc16-gapA ΔpykA ΔpykF。 d)将表达载体pJB137-PgapA-ppsA导入菌株 为了增加磷酸烯醇丙酮酸的产生，使用gapA启动子从质粒pJB137表达 ppsA基因。对于质粒pJB137-PgapA-ppsA的构建，使用下述寡核苷酸，从大 肠杆菌MG1655的基因组DNAPCR扩增ppsA基因： 1.由65个碱基组成的gapA-ppsAF(SEQ ID NO：53) ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCT GGTGC 具有： -与基因ppsA(1785136至1782758)的序列(1785106-1785136)同源的区域 (大写字母)，网站http://genolist.pasteur.fr/Colibri/上的参照序列，和 -与gapA启动子(1860794-1860761)同源的序列(小写字母)。 2.ppsAR，由43个碱基组成(SEQ ID NO：54) aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC 具有： -与基因ppsA的区域(1785136至1782758)序列(1782758-1782780)同源的 区域(大写字母) -限制性位点HindIII(下划线字母) 同时使用下述寡核苷酸扩增大肠杆菌基因gapA的gapA启动子区域： 1.gapA-ppsAR，由65个碱基组成(SEQ ID NO：55) GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtg aataaaagg 具有： -与基因ppsA(1785136至1782758)序列(1785106-1785136)同源的区域 (大写字母)，和 -与gapA启动子(1860794-1860761)同源的序列(小写字母)。 2.gapAF，由33个碱基组成(SEQ ID NO：56) A CGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc 具有： -与gapA启动子(1860639-1860661)同源的序列(小写字母)。 -限制性位点SmaI(下划线字母) 随后使用寡核苷酸ppsAR和gapAF将两个片段融合(Horton等，1989Gene 77：61-68)。用限制性酶HindIII和SmaI剪切PCR扩增的片段，并克隆进载体 pJB137(EMBL登录号：U75326)的HindIII/SmaI位点，得到载体 pJB137-PgapA-ppsA。通过DNA测序验证重组质粒。 将质粒pJB137-PgapA-ppsA导入菌株“进化大肠杆菌tpiArc”Ptrc16-gapA， ΔpykA，ΔpykF。 将获得的菌株命名为“进化大肠杆菌tpiArc”Ptrc16-gapA，ΔpykA，ΔpykF， (pJB137-PgapA-ppsA)。 在每个步骤，使用表1中给出的寡核苷酸检查菌株中先前构建的修饰是 否存在。 实施例5：构建能产生1，2-丙二醇而不产生乙酸作为副产物的菌株“进化 大肠杆菌tpiArc”Ptrc16-gapA，ΔpykA，ΔpykF，ΔackA-pta，ΔpoxB (pJB137-PgapA-ppsA)。 a)构建修饰菌株大肠杆菌MG1655ΔackA-pta::cm 使用操作规程2中所述技术，用表2给出的寡核苷酸，通过插入氯霉素 抗生素抗性盒和缺失相关基因的大部分而使基因ackA和pta失活。将得到的 菌株命名为大肠杆菌MG1655ΔackA-pta::cm。 b)构建菌株“进化大肠杆菌tpiArc”Ptrc16-gapA，ΔpykA，ΔpykF，ΔackA-pta 如操作规程3中所述，用噬菌体P1使用转导技术，在菌株“进化大肠杆 菌tpiArc”Ptrc16-gapA，ΔpykA，ΔpykF中进行基因ackA和pta的缺失。 将得到的菌株命名为“进化大肠杆菌tpiArc”Ptrc16-gapA，ΔpykA，ΔpykF， ΔackA-pta::cm。 如前，然后根据操作规程1消除氯霉素抗性盒。将获得的菌株命名为“进 化大肠杆菌tpiArc”Ptrc16-gapA，ΔpykA，ΔpykF，ΔackA-pta。 c)构建修饰菌株“进化大肠杆菌tpiArc”Ptrc16-gapA，ΔpykA，ΔpykF， ΔackA-pta，ΔpoxB(pJB137-PgapA-ppsA) 使用操作规程2中所述技术，用表2给出的寡核苷酸，通过插入氯霉素 抗生素抗性盒和缺失相关基因的大部分而使基因poxB失活。 将得到的菌株命名为进化大肠杆菌tpiArc Ptrc16-gapA，ΔpykA，ΔpykF， ΔackA-pta，ΔpoxB::cm。 如前，然后根据操作规程1消除氯霉素抗性盒。将获得的菌株命名为进 化大肠杆菌tpiArc Ptrc16-gapA，ΔpykA，ΔpykF，ΔackA-pta，ΔpoxB。 将质粒pJB137-PgapA-ppsA导入菌株进化大肠杆菌tpiArc Ptrc16-gapA， ΔpykA，ΔpykF，ΔackA-pta，ΔpoxB。将获得的菌株命名为进化大肠杆菌tpiArc Ptrc16-gapA，ΔpykA，ΔpykF，ΔackA-pta，ΔpoxB(pJB137-PgapA-ppsA)。 在每个步骤，使用表1中给出的寡核苷酸检查菌株中先前构建的修饰是 否存在。 实施例6：不同进化菌株在需氧条件下的1，2-丙二醇生产的比较 在需氧条件下，在锥形瓶实验中，在补加酵母提取物和补加葡萄糖作为碳 源的基本培养基中培养如实施例4中所述获得的菌株和对照菌株(在厌氧条件 下进化的对照1：MG1655 lpd*ΔtpiA ΔpflABΔadhEΔldhA::Cm ΔgloAΔald， ΔaldB Δedd和在微需氧条件下进化的对照2：MG1655 lpd*ΔtpiAΔpflABΔadhE ΔldhA::Cm ΔgloA Δald，ΔaldB Δedd)。在34℃进行培养，并通过用MOPS缓冲 培养基而保持pH。在培养结束时，通过HPLC分析发酵培养液中的1，2-丙二 醇、丙酮醇和残余的葡萄糖，并计算1，2-丙二醇对葡萄糖的得率和1，2-丙二醇+ 丙酮醇对葡萄糖的得率。然后选择最佳菌株用于发酵罐补料分批培养。 菌株 1，2-丙二醇 效价 (g/l) 丙酮醇 效价 (g/l) 1，2-丙二醇 得率 (g/g葡萄糖) 1，2-丙二醇+ 丙酮醇得率 (g/g葡萄糖) 对照1 1.88 2.1 0.16 0.34 对照2 0.7 3.56 0.06 0.37 “进化大肠杆菌tpiArc”， Ptrc16-gapA， (pJB137-PgapA-ppsA) (由对照1构建) 0.5 2.77 0.06 0.42 “进化大肠杆菌tpiArc”， Ptrc16-gapA， (pJB137-PgapA-ppsA) (由对照2构建) 3.71 3.85 0.20 0.41 实施例7：用最佳菌株在补料分批培养中产生1，2-丙二醇 使用补料分批操作规程在21发酵罐中培养前面实验中选择的最佳菌株。 将培养的温度在37℃保持恒定，使用NH4OH溶液将pH持久地调至6.5-8 的数值。在分批培养期，将搅拌速率保持在200-300rpm，并在补料分批期结 束时增加到多至1000rpm。通过使用气体控制器，将溶氧的浓度保持在 30-40％饱和度的数值。当光密度达到3-5的数值时，以0.3-0.5ml/h的初始流 速开始补料分批培养，并逐渐增加至2.5-3.5ml/h的流速值。此时使流速保持 恒定24至48小时。补料的培养基基于包含浓度为300-500g/l的葡萄糖的基 本培养基。 <110>代谢探索者公司(METABOLIC EXPLORER) <120>通过进化和理性设计的组合获得的用于产生1，2-丙二醇的新微生物 <130>D24916 <150>PCT/IB2007/001680 <151>2007-03-23 <160>56 <170>PatentIn version 3.3 <210>1 <211>20 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>1 ggtgatgata gttatcgccg 20 <210>2 <211>20 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>2 cgtgccatcg acagcagtcc 20 <210>3 <211>30 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>3 agacattaaa aatatacgtg cagctacccg 30 <210>4 <211>30 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>4 gtgaaagctg acaacccttt tgatctttta 30 <210>5 <211>22 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>5 ggctcattgc accaccatcc ag 22 <210>6 <211>24 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>6 gaaaagacgc gctgacaata cgcc 24 <210>7 <211>20 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>7 gccatcagca ggcttagccg 20 <210>8 <211>23 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>8 gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23 <210>9 <211>31 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>9 gaagtggtcg atgccgggat tgaagaatgg g 31 <210>10 <211>31 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>10 gggttacgtt tcagtgaggc gcgttctgcg g 31 <210>11 <211>31 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>11 tgcagcggcg cacgatggcg acgttccgcc g 31 <210>12 <211>31 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>12 cacgatgacg accattcatg cctatactgg c 31 <210>13 <211>40 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>13 catatttccc tcaaagaata taaaaaagaa caattaacgc 40 <210>14 <211>31 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>14 tatgttcatg cgatggcgca ccagctgggc g 31 <210>15 <211>24 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>15 ccccggaatc agaggaatag tccc 24 <210>16 <211>29 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>16 gggtagactc cattactgag gcgtgggcg 29 <210>17 <211>20 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>17 gccatcagca ggcttagcgc 20 <210>18 <211>23 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>18 gggtattgtg gcatgtttaa ccg 23 <210>19 <211>20 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>19 cgacaattgg attcaccacg 20 <210>20 <211>21 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>20 gcggtattga aaggttggtg c 21 <210>21 <211>21 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>21 ccgtgagaag aatcgcgatc g 21 <210>22 <211>21 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>22 gcgtagtcgt gtaagtatcg c 21 <210>23 <211>21 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>23 catttccggt ggtgcgattg c 21 <210>24 <211>29 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>24 gccacagccg gaatcatact tggtttggg 29 <210>25 <211>29 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>25 cgtcaacacc aacttcgtcc catttcagg 29 <210>26 <211>23 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>26 ggcaattacc ctcgacgtac cgg 23 <210>27 <211>25 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>27 ccgatggatg atctgttaga ggcgg 25 <210>28 <211>22 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>28 gcgtaacctt ttccctggaa cg 22 <210>29 <211>24 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>29 gcgttgctgg agcaacctgc cagc 24 <210>30 <211>20 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>30 gcatgggtaa acttaaggcg 20 <210>31 <211>20 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>31 taatcaccaa cgtatcgggc 20 <210>32 <211>21 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>32 cgcggcttgg tcgggtaacg g 21 <210>33 <211>24 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>33 tcgggctatt taaccgttag tgcc 24 <210>34 <211>100 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>34 gaaactcgcc gtttatagca caaaacagta cgacaagaag tacctgcaac aggtgaacga 60 gtcctttggc tttgagctgg tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210>35 <211>101 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>35 ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt tttgcagcgt 60 agtctgagaa atactggtca gcatatgaat atcctcctta g 101 <210>36 <211>98 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>36 ccccgcacat tcttatcgtt gaagacgagt tggtaacacg caacacgttg aaaagtattt 60 tcgaagcgga aggctatgtg taggctggag ctgcttcg 98 <210>37 <211>99 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>37 ccagatcacc gcagaagcga taaccttcac cgtgaatggt ggcgatgatt tccggcgtat 60 ccggcgtaga ttcgaaatgc atatgaatat cctccttag 99 <210>38 <211>99 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>38 ctctcacaaa ttcgctcaaa taataaacaa taaactctgt tttttgatct cacccggtaa 60 agtcgcctat cttttcagct gtaggctgga gctgcttcg 99 <210>39 <211>100 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>39 gcaacttcaa acgcggacgg ataacgcggt taatactccc caccagcatc attaatccgg 60 ttttaaagta accatgcagc catatgaata tcctccttag 100 <210>40 <211>124 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>40 ggggctgacc ttcgctgttg aaccgattaa gctggcgcta tctgaatcgc ttgaaggttt 60 gaataaatga tcacactggc tcaccttcgg gtgggccttt ctgccatatg aatatcctcc 120 ttag 124 <210>41 <211>106 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>41 gcgaataaag gaagatggcc gccccgcagg gcagcaggtc tgtgaaacag tatagagatt 60 catcggcaca aaggctttgc tttttgtgta ggctggagct gcttcg 106 <210>42 <211>100 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>42 agtcatatat tccaccagct atttgttagt gaataaaagc cacacattat tcgagccgga 60 tgattaatag tcaacagctc tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210>43 <211>79 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>43 gctcacatta cgtgactgat tctaacaaaa cattaacacc aactggcaaa attttgtccc 60 atatgaatat cctccttag 79 <210>44 <211>101 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>44 cgcggcgggt gccaacgttg tacgtatgaa cttttctcac ggctcgcctg aagatcacaa 60 aatgcgcgcg gataaagttc gtgtaggctg gagctgcttc g 101 <210>45 <211>101 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>45 cgccgcatcc ggcaacgtac ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc 60 acggtactca tcacgtcgcc ccatatgaat atcctcctta g 101 <210>46 <211>98 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>46 cccatccttc tcaacttaaa gactaagact gtcatgaaaa agaccaaaat tgtttgcacc 60 atcggaccga aaaccgaatg taggctggag ctgcttcg 98 <210>47 <211>99 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>47 ggacgtgaac agatgcggtg ttagtagtgc cgctcggtac cagtgcacca gaaaccataa 60 ctacaacgtc acctttgtgc atatgaatat cctccttag 99 <210>48 <211>100 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>48 cgagtaagtt agtactggtt ctgaactgcg gtagttcttc actgaaattt gccatcatcg 60 atgcagtaaa tggtgaagag tgtaggctgg agctgcttcg 100 <210>49 <211>97 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>49 gctgctgtgc agactgaatc gcagtcagcg cgatggtgta gacgatatcg tcaaccagtg 60 cgccacggga caggtcgcat atgaatatcc tccttag 97 <210>50 <211>99 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>50 ccttagccag tttgttttcg ccagttcgat cacttcatca ccgcgtccgc tgatgattgc 60 gcgcagcata tacaggctgc atatgaatat cctccttag 99 <210>51 <211>102 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>51 cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggcagg ggtgaaacgc atctggggag 60 tcacaggcga ctctctgaac ggtgtaggct ggagctgctt cg 102 <210>52 <211>41 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>合成的启动子 <400>52 gagctgttga cgattaatca tccggctcga ataatgtgtg g 41 <210>53 <211>65 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>53 ccttttattc actaacaaat agctggtgga atatatgtcc aacaatggct cgtcaccgct 60 ggtgc 65 <210>54 <211>43 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>54 aatcgcaagc ttgaatccgg ttatttcttc agttcagcca ggc 43 <210>55 <211>65 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>55 gcaccagcgg tgacgagcca ttgttggaca tatattccac cagctatttg ttagtgaata 60 aaagg 65 <210>56 <211>33 <212>DNA <213>人工的 <220> <223>寡核苷酸 <400>56 acgtcccggg caagcccaaa ggaagagtga ggc 33 |
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