特定生物学分子(生物分子)的检测方法多种多样且本领域技术 人员目前可以采用许多不同方法。特定生物分子的检测具有一系列重 要的实际应用，包括用于诊断目的的基因识别。
一般而言，诸如多核苷酸、DNA、RNA、细胞和抗体的生物样本 (“目标”)的检测可以专门在例如所谓生物阵列(或微阵列)的阵列 上进行，其中相应探针分子附着在该阵列上各种位置。目标-探针的 例子包括DNA/RNA-寡核苷酸、抗体-抗原、细胞-抗体/蛋白质、 激素受体-激素等。当目标结合或杂交到相应探针分子时，目标生物 分子的检测可以通过各种光学、电子、甚至微机械方法来进行。
检测结合在生物阵列上的分子的常用技术为荧光标记目标的光学 检测，其中该荧光标记目标也已知为“标签”或“标记”。一般而言，标 签可以是就其物理分布和/或其发出的信号强度而言是可检测的任何试 剂。荧光剂被广泛使用，但是备选包括磷光剂、电致发光剂、化学发 光剂、生物发光剂等。
一般而言，发光检测的问题涉及将低强度的发光与通常高强度的 照明非发光分离。发光检测的可靠性因此非常依赖于在分离过程中使 用的光谱滤波器的光学特性。光谱滤波器功能可包括两级：第一滤波 器(称为“激发滤波器”)，优选地透射波长与标签的激发光谱交叠的射 线并阻挡波长位于检测窗口光谱内的所有射线。第二滤波器(称为“发 射滤波器”或“检测滤波器”)优选地阻挡所有照明光且仅透射发光射 线。典型滤波器组的衰减(阻挡能力)优于10-6。为此，也可以考虑基 板的光学属性。
US 2005/0048571公开了一种用于从生物阵列减小与光学检测相关 的自动荧光的基板。在公开内容中，基板的多孔层使用着色剂来着色。 然而着色基板的缺点为，这使得基板更为昂贵，并限制了可以使用的 不同类型基板的数目。
本发明的发明人已经意识到用于发光检测的改进手段是有益的， 并因此提出了本发明。

本发明旨在提供一种诸如与进行生物测定相关的处理发光检测的 改进方式，且优选地本发明个别或者任意组合地缓和、减轻或消除了 一个或多个上述及其它缺点。
本发明由独立权利要求限定。从属权利要求限定优选实施例。
根据本发明的第一方面，提供了一种检测样品中目标分子的存在 的方法。
该目标分子可以是与荧光基团共轭的生物分子。
辐射通常是在可见或近可见范围、在红外(IR)或在紫外(UV) 范围的电磁辐射。
在本发明的上下文中，措辞“荧光”和“磷光”应广义地理解为由于 下述过程形成的发射光，即光被分子或原子在特定波长吸收，随后在 该受激发分子/原子的寿命之后在相同或不同波长发射。发射光经常是 但无需限于可见光谱(VIS)、UV光谱和IR光谱。
在一实施例中，通过使用辐射束照射基板且随后检测来自基板的 所得发光束即目标分子的发光来检测该目标分子。被检测的辐射的发 光部分可以是光致发光，特别是荧光或磷光。
用于固定探针分子的基板可以是布置成用于分析生物目标的生物 阵列。通常，该生物阵列可包括多个点位(spots)，其中目标分子固定 在这些点位中。在此上下文中，点位理解为具有特定延展的区域。点 位可具有2D或3D配置。生物阵列可包括硅晶片、玻璃板、诸如尼龙、 硝化纤维的多孔膜等。
用于固定探针分子的基板的光学属性可以使得基板具有非常高的 反射率。散射量特别取决于空气和基板之间的折射率差异。由于高反 射率，入射辐射难以穿透基板，这减小了能够激发已经结合到基板、 特别是位于基板内的荧光基团的入射辐射量。此外，由于高反射率， 大部分反射光在一些配置中会被反射向检测器。
本发明具体地但非专有地优选地用于减小基板的反射率。通过在 清洗步骤期间使用折射率基本匹配的流体，基板的反射率可以大幅减 小。此外，穿透基板的光量将增加，导致入射辐射与发光辐射的比例 的改善。
在优选实施例中，冲洗液的折射率在基板折射率的+/-10％范围 内。原则上，获得尽可能好的折射率匹配是优选的，不过至少在给定 探针和/或目标分子和/或基板需要特定类型冲洗液的情形中，折衷可能 是有利的。冲洗液折射率相对于基板折射率的匹配可以优于+/-8％， +/-6％，  +/-4％，  +/-2％。
在优选实施例中，冲洗液为糖(蔗糖)在水中的水溶液，其中糖 的重量百分比为50％至80％。蔗糖的水溶液可能是优选的，因为许多 荧光基团共轭物容易溶解在这种流体中。
本发明的实施例优选地可以使用多孔基板来应用，因为来自基板 的高反射对于多孔基板而言由于孔的散射而更成问题。
在本发明的方法的实施例中，目标分子为与荧光基团共轭的生物 分子。
在本发明的方法的实施例中，基板为使用探针分子准备的生物阵 列，目标分子化学结合到存在于基板中的探针分子。在各种优选实施 例中，可以在从辐射源到检测器的光束路径中引入辐射滤波器、镜以 及可能的其它光学部件。
例如，通过使用辐射束照射基板且随后检测来自基板的所得光束 来检测目标分子。
所得光束可以透射穿过基板，或者从基板反射。
在一实施例中，第一辐射滤波器(2)引入在辐射源(36)和基板 (3，30-32)之间的光束路径中。
在一实施例中，第二辐射滤波器(4)引入在基板(3，30-32)和 检测器(35)之间的光束路径中。
在一实施例中，该光束路径还包括二向色镜(5)。
本发明的方法优选地例如可以通过在依据本发明其它方面的设备 或检测系统中实施该方法而至少部分地自动化。
在第二方面，本发明涉及用于准备测定的设备。
在第三方面，本发明涉及在测定中用于检测目标分子的光学检测 系统。
本发明的第二和第三方面可以提供用于检测样品中一种或多种生 物目标即目标分子的存在以及可选的数量的设备和检测系统。该系统 可检测包括但不限于多核苷酸、DNA、RNA、细胞和抗体的目标。生 物检测系统经常十分复杂，且本发明在提供收集数据的可靠性高的系 统方面是有益的。
在第四方面，本发明涉及依据第一方面的方法制作的基板。
在第五方面，本发明涉及用于进行测定的工具包。
一般而言，本发明的各个方面可以在本发明范围内按照任何可能 方式来组合和结合。本发明的这些和其它方面、特征和/或优点将从下 述实施例变得显而易见并得以阐述。
附图说明
本发明的实施例将参考附图仅示例性地予以描述，其中：
图1示意性示出光学设置的两个总体实施例；
图2示出图1B的设置的光谱特性以及Cy5染料的光谱；
图3示出检测样品中目标分子的存在的方法的实施例；
图4示出蔗糖水溶液的折射率n和重量百分比p的函数的曲线图。

在生物研究和医疗诊断中，许多生物标记借助于所附着的荧光标 签而被检测。通常使用的设备为荧光扫描器或显微镜，但是对于特定 应用，基于相同检测原理制作专用设备。
在本发明总体实施例中，使用一光学设置，其中应用了至少两个 光谱滤波器。图1示意性示出两个总体实施例。图1A示出透射模式下 的荧光检测装置的示意图，其中所得光束透射穿过基板，而图1B示出 反射模式下的荧光检测装置的示意图，其中所得光束从基板反射。在 图1A和1B中，光束1A、1B发射向基板3。应用光谱滤波器，从而将 所得荧光光束与照明非荧光分离。
光谱滤波器功能由两级组成：第一辐射滤波器2(称为“激发滤波 器”)被引入在辐射(光)源和基板之间的光束路径中。激发滤波器优 选地透射波长与标签的激发光谱交叠的射线并阻挡波长位于检测窗口 光谱内的所有射线。第二辐射滤波器4(称为“发射滤波器”或“检测滤 波器”)被引入在光束路径中，该发射滤波器优选地阻挡或者至少基本 抑制照明光且仅透射荧光射线。典型滤波器组的衰减(阻挡能力)优 于10-6。
在图1B中还应用了分束器5，该分束器例如可以在基板不透明的 情形下被应用。在备选实施例中，可以应用二向色镜来代替分束器， 二向色镜反射低于特定波长的激发光并透射大于该波长的光。二向色 镜因此也可以用作发射滤波器4，分离的发射滤波器仍可以使用以提高 性能，但不是必须的。
在一实施例中，基板可以被许多高功率LED(诸如2至10个红色 LED)照射，暗场设置可以应用。得到的光由CCD相机(未示出)检 测，其中发射滤波器安装在相机前面。作为荧光基团的示例，可以使 用染料Cy5。
基板3可以通过任意合适的基板(诸如在生物测定中使用的生物 阵列基板)准备方式来准备。一种典型的阵列测定方法涉及将探针分 子固定在基板上的离散位置。包括与所附着探针结合的目标分子的溶 液在下述条件下置为接触结合探针，即这些条件足以促进溶液中的目 标结合到基板上的互补探针以形成结合到基板表面的结合复合物。该 生物阵列可具有微米量级或甚至毫米量级的尺寸。生物阵列上具有相 异杂交特性的不同点位的数目在当前阵列上可以从约1每平方毫米变 化到1000每平方毫米甚至更高，例如高达106点位每平方毫米。通常 相同的探针分子固定在阵列上的点位内。
图2示出图1B设置的可能涉及的光谱特性的实施例以及Cy5染料 的光谱。图2是利用可从Omega Optical网站(www.omegafilters.com) 获得的Curv-o-matic在线应用而产生的。图2示出对于Omega滤波器 组XF110-2，所涉及光谱的单位为百分比的透射率T与单位为纳米的 波长λ的函数。
图2示出激发峰值在649nm的Cy5激发光谱20以及发射峰值在 670nm的相应发射光谱21。每个光子的照射波长和荧光波长之间的差 异称为“斯托克斯频移”。Cy5的斯托克斯频移为21nm。
激发滤波器为Omega 630AF50激发滤波器，其呈现用22表示的 光谱(带宽50nm，中心在630nm)。发射滤波器为Omega 695AF55发 射滤波器，其呈现用23表示的光谱(带宽55nm，中心在695nm)。二 向色镜选择为使得用24表示的二向色镜光谱是反射激发辐射波长的入 射光，而透射所得到的经斯托克斯频移的光的光谱。特定滤波器组和 二向色镜作为示例提供，但不一定应用于所有实施例中。例如，如结 合图1B所述，可以在使用二向色镜时配备发射滤波器。
表1示出实验结果，其中多孔尼龙基板(Nytran N和Nytran SPC) 3的光学属性被测量。使用650nm入射波长照射基板且随后检测来自 基板的所得光束来进行该实验。进行了两种类型的实验，一种使用干 基板，一种使用在清洗步骤中暴露于水的基板。
表1
  Nytran N    湿       干       透射率       31.1％   4.2％   反射率       68.7％ 95.3％ 吸收率       0.1％   0.5％    Nytran SPC                     透射率       33.8％ 5.3％   反射率       65.4％ 94.4％ 吸收率       0.8％   0.4％  
从表1可以看出，基板具有非常高的反射率，特别是干基板。这 种高反射率的原因是由于基板高多孔性引起的散射。散射量取决于空 气和基板之间折射率差异。与空气相比，水的折射率更为接近基板的 折射率。这是湿基板反射低于干基板的原因。
依据本发明，在测定的清洗步骤期间应用折射率基本匹配的流体， 且基板的反射率因此可以大幅减小直至5％的典型值。
与水作为冲洗液相比，激发强度的改善至少为3倍，不过与干基 板相比可以高达20倍。
与水相比，激发辐射与荧光辐射的比例的改善至少为14倍，与干 基板相比可高达19倍。
图3示出依据本发明检测样品中目标分子的存在的方法的实施例， 其中生物阵列使用清洗步骤来准备。图3A至3C说明至少部分涉及的 步骤。
在图3A步骤之前的步骤中，使用与荧光基团共轭的目标生物分子 准备样品流体。在图3A的步骤37中，通过使样品流体流过基板30而 使样品6接触基板30，致使具有荧光基团的目标生物分子附着到基板 上的特定结合位置。应理解，目标分子例如可以通过应用来自脉动喷 射的液滴淀积或者通过其它合适手段以备选的方式接触到基板。
在准备步骤期间，不是所有荧光基团均预期结合到探针分子。这 意味着除了已经结合到基板30的荧光基团之外，还存在未附着到基板 而仍存在的非结合的荧光基团。应用清洗步骤38以除去或者至少稀释 任何非结合的荧光基团共轭物，仅在基板上留下结合的荧光基团共轭 物，如图3B所示。在该步骤期间，清洗液7被挤压通过基板31。在本 发明中，清洗液7选择为使得该冲洗液的折射率基本匹配基板31的折 射率。
图3C示出目的是检测基板上所得的结合复合物存在的检测步骤 39，该检测步骤已经结合图1予以描述。由于在清洗步骤中使用折射 率基本匹配的流体(图3B)，基板32的反射率已经显著减小，改善了 检测步骤的灵敏度。该检测通常紧接着清洗步骤，使得基板仍是湿的。
在本发明不同实施例中，可以使用不同的折射率匹配流体。在一 个实施例中，可使用油，作为合适的油的示例，可以使用在23℃时 n＝1.518的Zeiss Immersol 518F。在其它实施例中，可以应用致密材料 的水溶液。在特定实施例中，使用糖的水溶液。优选使用60％至70％ 糖(蔗糖等)的溶液，由此获得1.45的折射率(见图4，其示出蔗糖 水溶液的折射率n与重量百分比p的函数)。蔗糖水溶液可以是优选折 射率匹配流体，因为荧光基团共轭物容易溶解在这种流体中，使得该 流体对于清洗步骤和检测步骤均是合适的。
应理解，在备选实施例中，可以应用附加的清洗步骤。这些附加 清洗步骤可以应用以不同或相同的冲洗液，对于不同清洗步骤使用不 同冲洗液的情形，至少最后清洗步骤使用与基板折射率基本匹配的冲 洗液来执行。
图3的步骤以及可能的附加步骤可以在用于准备测定的设备和/或 光学检测系统中以自动或半自动的方式来进行。这些设备和系统可包 括用于容纳基板的处理单元33以及用于对基板执行清洗步骤的清洗单 元4。处理单元和清洗单元可以实施于同一单元内，或者样品可以在单 元之间移动。光学检测系统的实施例还包括诸如一个或多个激光二极 管的辐射源36以及诸如CCD的辐射检测器35。
还提供了用于目标检测测定的工具包。该工具包至少包括与基板 折射率基本匹配的冲洗液以及用于使用该冲洗液的指令。该工具包还 可包括在实施目标检测测定时使用的一个或多个附加部件，诸如一个 或多个基板、样品准备试剂、缓冲液、标签等。供使用的指令可以以 纸格式来提供，可以记录在合适记录介质上，可以以如何经由远程源 例如英特网访问该指令的指示形式来提供，等等。
尽管已经结合具体实施例描述了本发明，本发明并不旨在限于此 处所述具体形式。相反，本发明的范围仅由所附权利要求限定。在权 利要求书中，措辞“包括”不排除其它要素或步骤的存在。此外，尽管 在不同权利要求中包括单独的特征，这些特征可以有利地组合，且包 括在不同权利要求中并不意味着特征的组合不可行和/或不优选。此外， 单数引用并不排除存在多个。因此，对“一”、“一个”、“第一”、“第二” 等的引用并不排除多个。此外，权利要求书中的参考符号不应理解为 限制范围。