细菌中含有多个二硫键的蛋白质的分泌及其用途

1.发明领域

本发明总的涉及蛋白质分泌领域。更具体说，本发明涉及具有多个二硫键的重组 蛋白质通过细菌中的双精氨酸转运通路(Twin-Arginine Translocation pathway) 分泌的方法。

2.相关专业描述

细菌中许多蛋白质的分泌是通过sec通路(Stuart和Neupert，2000)穿越胞质 膜分泌的。蛋白质通过“sec易位子”，一种由三个膜内在蛋白质(SecY，secE和secG) 组成的复合物，穿越胞质膜，该复合物形成一直径狭窄的孔，作为转运蛋白质通过 胞质膜的导管。分泌的多肽大都是非折叠的类似一随机卷曲的线团，可通过此孔有 效穿越，此过程需消耗ATP。注意到，真核生物的蛋白质分泌基本上相似，也涉及非 折叠蛋白通过一狭窄的膜孔穿越，伴有ATP水解(Schatz和Dobberstein，1996)。

蛋白质输出的sec通路(和真核生物中的同类通路)已研究了至少25年。由于 直到现在还不知道其它分泌通路，产生生物技术需要的分泌性蛋白质仍只能依赖于 该sec通路。大量关于可用于蛋白质表达的前导肽的文献和各种改进分泌性蛋白质 输出的策略，都强调了sec通路对于生物技术需求的重要意义。然而蛋白质通过sec 通路的分泌受到几种内在因素的限制。例如，许多异源多肽与通过sec通路转运不 相容，因而不能以分泌形式表达。不相容的多肽进入secYEG孔时会变成梗剌，结果 不能完整通过膜转运。进而，该分泌装置变得拥挤，不能通行天然蛋白质，此现象 导致细胞生长仃止，最终裂解。与异源性分泌蛋白质表达有关的细胞毒性作用很常 见，文献中有详细描述。例如细胞毒性是重组抗体片段在细菌中表达的关键性问题 (Hayhurst和Georgiou 2001；Lou等，2001)。

经sec通路输出的蛋白质的折叠发生在转运通过膜之后。真核和原核生物中，蛋 白质在分泌腔室(革兰阴性菌中为周质间隙，真核细胞中为内质网)中的折叠机制 与在胞质中的机制完全不同(Wulfing和Pluckthun 1994；a Danesse和Silhavy 1998)。注意到，细菌周质间隙缺乏高保真的ATP-依赖伴侣系统，如GroEL/GroES和 Dnak/Dnaj/GrpE网络(Baneyx 1999)。其折叠依赖此类伴侣系统的蛋白质常不能在 分泌到细菌周质中后成为其可溶性生物活性形式，而是积累成为包涵体(Bowden等， 1991)。

许多酶需要胞质中合成的辅因子，如钼、铁硫中心、FMN、FAD等，它们在折叠 过程中掺入蛋白质。如果这种蛋白质通过sec系统分泌，不需要掺入辅因子，因为 输出前蛋白质不折叠(Robinson 2000)。

然而，对sec通路的内在性生物合成限制，限制了重组蛋白质文库的功能多样性 (Lou等，2001；Hayhurst和Georgiou 2001；Arnold 2001)。通常在重组文库筛选 和定向蛋白质进化中，是根据它们通过两个“过滤器”的能力，分离得到显示所需 功能的选择克隆。这两个“过滤器”是：“生物合成过滤器”，它可消除对细胞有毒 性、与表达不相容的蛋白质；和“功能过滤器”，它能选择具有所需功能的蛋白质。 采用展示技术(噬菌体、细菌等)筛选重组文库时，多肽必须从胞质中分泌出来， 然后才能展示在生物粒子，如丝状噬菌体或微生物细胞的表面。然而，许多多肽与 经sec通路输出或与在细菌周质间隙中折叠不相容。因此，表达文库的多肽多样性 受到限制，其中包括受到分泌的限制。绕过这些限制有可能扩展重组文库多肽序列 的多样性，从而可能分离到新的结合蛋白和酶。

本领域目前缺少引导折叠蛋白质从细菌，如大肠杆菌胞质中有效输出的方法。此 外，本领域目前已明确证明，许多异源性蛋白质，特别是人类蛋白质，在细菌中不 能有效输出。缺乏复合蛋白质折叠和输出的方法，限制了用噬菌体展示等方法从重 组文库中筛选分离得到具有所需功能的蛋白质。本发明通过提供从细菌中筛选复合 性多肽，特别是具有多个二硫键的蛋白质通过细菌双精氨酸转运通路分泌的方法， 填补了本领域的这一长期需求。本发明公开了筛选利用双精氨酸转运通路从胞质中 输出的重组多肽的方法。

发明概述

一方面，本发明提供用一种表达盒基因转化的细菌，该表达盒含有一前导肽。 其能引导蛋白质通过双精氨酸转运通路而输出，位于编码异源多肽基因的上游，细 菌细胞产生的此异源多肽至少含有一个二硫键。该细菌可具有氧化性胞质。本发明 某些实施例中，所述异源多肽可含有约1-7个二硫键，和/或可以生物活性形式产生。 本发明某些实施例中，所述前导肽来自蛋白质编码基因，所述蛋白质选自TorA、SufI、 YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、 YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、 YedY、FhuD和YaeI。此前导肽也可得自编码这些序列之一同源物的基因。

本发明一实施例中，所提供的细菌可含有使细菌具有氧化性胞质的一个或多个突 变。该细菌可以是革兰阳性或阴性菌。本发明一实施例中，该细菌是大肠杆菌。所 述异源多肽可由细菌分泌和从细菌周质中分离获得，或为膜内在蛋白。所述异源多 肽也可从细菌培养上清液中分离获得。本发明某些实施例中，该异源多肽是哺乳动 物多肽，例如抗体或其片段。在另一实施例中，此异源多肽选自天然构象多肽、突 变的多肽和截短的多肽。此异源多肽可表达在细菌胞质膜的表面，和/或细菌周质膜 的表面和/或细菌的周质中。

另一方面，本发明提供在细菌中产生至少含有一个二硫键的至少一种异源多肽的 方法，该方法包括以下步骤：a)构建一表达盒，其含有能引导蛋白质通过双精氨酸 转运通路而输出的前导肽，该前导肽位于编码异源多肽基因的上游；b)在含有氧化 性胞质的细菌中表达该表达盒，其中产生的异源多肽含有至少一个二硫键。本发明 一实施例中，所述异源多肽可含有约1-7个二硫键。所述异源多肽可以生物活性形 式产生。两个异源多肽可通过至少一个二硫键连接。此方法中，所述前导肽来自蛋 白质编码基因，所述蛋白质选自TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、YcdB、YaeI、 HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、YnfE、YnfF、 FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD和YaeI。本发明某些实施例中， 采用上述序列同源物的前导肽。

本发明一实施例中，所述异源多肽可由细菌细胞分泌。可从细菌周质中分离获得 此异源多肽和/或可以是膜内在蛋白。异源多肽也可从细菌培养上清液中分离获得。 该异源多肽可以是哺乳动物多肽，可选自天然构象多肽、突变的多肽和截短的多肽。 此异源多肽可表达在细菌胞质膜的表面，可表达在细菌周质膜的表面，可以是抗体 或其片段。

另一方面，本发明提供鉴定能重建分泌腔室中蛋白质氧化的突变多肽的编码核酸 的方法，该方法包括以下步骤：a)获得一含有前导肽的表达盒，该前导肽能引导蛋 白质通过双精氨酸转运通路输出，位于具有氧化活性蛋白质的突变多肽的编码核酸 序列的上游；b)在含有氧化胞质和周质二硫键形成受到损害的细菌中表达该表达 盒，；和c)选择周质二硫键形成活性受损因表达了所述表达盒而得到弥补的至少第 一种细菌，鉴定该菌中能重建分泌腔室蛋白质氧化的突变多肽的编码核酸序列。

在还有一方面内容中，本发明提供筛选重组文库的方法，该方法包括以下步骤：a) 产生感兴趣多肽的文库；b)构建可将双精氨酸转运通路特异性前导肽置于所述多肽 编码基因上游的表达盒；c)在含有氧化性胞质的细菌中表达该表达盒；d)筛选表 达的分泌多肽。此方法中，可通过周质表达、细胞计数筛选或噬菌体展示对表达进 行筛选。多肽可以是哺乳动物多肽，可以是抗体或其片段。本发明某些实施例中， 所述前导肽来自蛋白质编码基因，所述蛋白质选自TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、 WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、 DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD和YaeI。 所述前导肽也可得自这些序列的同源物。

附图简述

如上获得了对本发明的上述特征、优点和目的以及将会明白的事项的说明和详细 了解，附图中简单小结说明了本发明的更具体描述和某些实施方式。这些附图组成 了本说明书的一部分。然而应注意到，附图只是阐述本发明的优选实施方式而不应 认为是限制本发明的范围。

图1A-B：图1A显示不同菌株中表达TorA-PhoA融合物的大肠杆菌周质和胞质组分 的蛋白质印迹分析。图1B显示在菌株DHB4-A(还原性胞质，表示为-)或DR473-B(氧 化性胞质，表示为+)的周质组分和胞质组分中测到的碱性磷酸酶活性。

图2A-B：显示在大肠杆菌DHB4-A(还原性胞质)或DR473-B(氧化性胞质)中表达 TorA-vtPA后，全细胞裂解液、完整原生质球(图2A)或周质组分(图2B)中的vtPA 活性分布。

图3A-C：图3A显示TorA-Fab抗体融合的时间顺序；图3B显示蛋白质印迹分析， 表明在含有氧化性(+)或还原性(-)胞质(分别为DR473-A或DHB4-A)的菌株周 质组分或原生质球中Fab抗体蛋白的分布；图3C显示用ELISA监测到的图3B样品 的抗体活性。

图4A-E：显示表达TorA-TrxAAC融合物的细胞：(图4A)DR473-B，(图4B)DR473， (图4C)DR473-B的运动平面；(图4D)含有还原性胞质的MC1000dsbB同基因亲代 DR473-B细胞；(图4E)蛋白质印迹显示不同菌株周质和胞质中硫还氧蛋白的分布。

图5显示不同菌株背景中AP的折叠和输出。Ox和red指特定亚细胞腔室中的氧 化和还原氧还电势。在C:ox(DR473)细胞中，AP能够在胞质中折叠，可作为Tat 通路的底物。在C:ox/P:red菌株DRA(DR473dsbA)中AP的定位未受损。C:ox/P:ox 菌株中缺失tatC(或tatB)阻碍了AP输出。

图6A-D：图6A显示ssFdnG-AP的亚细胞定位。表达ssFdnG-AP细胞的周质(图 6A)和胞质(图6B)的免疫印迹分析。根据细胞总蛋白归一化样品并在12％SDS-PAGE 中分辨。GroEL用抗GroEL血清检测，用作组分标记。图6C：与图A和B中相同的周 质(实心)和胞质(空心)组分的AP活性。图6D：收集自C:ox/P:ox和C:ox/P:red 细胞的周质组分的胰蛋白酶敏感性分析。在4-20％SDS-PAGE凝胶上分离样品，用抗 -AP和抗-OmpA血清检测。

图7显示scFv抗体的Tat输出。用ELISA检测周质和胞质组分中的scFv。将周 质(实心)和胞质(空心)样品作系列稀释，从相同的总蛋白量开始测定，报告的 数据得自4倍稀释液，是二次独立实验的平均值。

图8A-D：图8A显示抗地高辛抗体片段(Fab)的Tat输出。Fab抗体的Tat输出。 图8B：收集自共表达TorA-Fab融合物和ΔssDsbC细胞周质(泳道1-3)和胞质(泳 道4-6)组分的蛋白质印迹分析。所用菌株为：(1，4)C:ox/P:ox；(2，5)C:ox/P:ox/tatC 和(3，6)C:red/P:ox。所有泳道加入同样量的总蛋白，用抗小鼠IgG F(ab’)抗体检 测Fab轻链。用GroEL作为原生质球组分的功能性标记。图8C：收集自(a， b)C:red/P:ox；(c，d)C:ox/P:ox/tatC；和(e，f)C:ox/P:ox细胞的周质(a，c，e) 和胞质(b，d，f)组分的ELISA.。图8D：表达TorA-Fab和ΔssDsbC并用FITC-地高 辛标记的C:red/P:ox(上)和C:ox/P:ox(下)细胞的流式细胞计数分析。

发明详述

为了研究折叠和通过双精氨酸转运(Tat)通路输出能力之间的关系，本发明人分 析了允许或不利于胞质中二硫键蛋白形成的等基因大肠杆菌菌株中的一组假设的8 个Tat前导肽和碱性磷酸酶之间融合物的亚细胞定位。显示只在能氧化胞质中折叠 蛋白质的菌株中才观察到经由Tat易位子的输出。另外，显示只在具有氧化性胞质 的菌株中，含二硫键的其它蛋白质，如单链Fv和异质二聚体Fab抗体片段是有输出 能力的。注意到，功能性异二聚体Fab蛋白可借助融合于其重链的Tat前导肽，从 胞质中输出，表明二硫链双聚体的形成先于输出。这些结果证明体内只有获得天然 构象的蛋白质才能通过Tat转运蛋白输出，表明折叠质量控制机制是该输出过程内 在上具有的。Tat通路输出含二硫链和折叠校正的蛋白质的这种能力有许多用途。

本发明人的这些发现有许多用途。证明具有二硫链结构的蛋白质可经Tat通路输 出。许多产业上重要的分泌蛋白质包括含有适当折叠所需的多个二硫链的酶。这些 蛋白，例如可通过具有氧化性胞质的细菌如C:ox菌株的Tat通路分泌。采用Tat通 路的优点是，它缓解了sec通路输出蛋白质常遇到的在易位子中成为“梗剌”的细 胞毒性问题。第二，在重组文库筛选研究中可利用Tat通路的折叠质量控制特征来 剔除可能折叠不当的突变多肽。

不到5年前才发现Tat通路是蛋白质分泌的一种新机制，首先在光合成微生物的 类囊体中，随后在细菌中(Setties等，1997；Weiner等，1998)取得此发现。此 分泌机制称为“双精氨酸转运”或TAT通路，因为在赋予此输出模式的蛋白质的前 导肽中发现了特征性Arg-Arg基序。依据蛋白组学和生物信息学的估计，表明细菌 如大肠杆菌或芽胞杆菌中5-8％的分泌蛋白质是通过TAT通路转运的(Berks等，2000； Robinson和Bolhuis 2001)。目前对此通路的特征仍然了解很少，将在以下叙述。

第一和首要的，鉴于sec通路和其它分泌机制输出的蛋白质是以非折叠形式穿过 膜的，输出完成后行才获得它们的天然构象；而TAT能路分泌的蛋先在胞质中折叠， 然后以压缩的天然状态转运通过膜。事实上这是因为TAT通路担负需要在胞质中加 入辅因子或装配了不同亚基的蛋白质的输出(Rodrigue等，1999；Robinson 2000； Sanders等，2001)。分泌不是通过secYEG易位子而是通过推测为TatABC所形成的 较大直径孔和蛋白(Saggent等，2001)。已证明高达120kD的大分子蛋白质可通过 TAT通路输出。然而，TAT通路分泌与ATP水解无联系而受跨膜质子的不对称分布或 ΔpH的驱动。

使蛋白质靶向TAT所需的前导肽比sec特异性前导肽长而且疏水性差。TAT特异 前导肽平均长14个氨基酸，有一延伸的氨基末端区和C区多几个碱基残基 (Cristobal等，1999)。然而，TAT特异前导肽的疏水区明显较短，因为甘氨酸和 苏氨酸较多。植物和原核生物二者的TAT特异前导肽的特点，是存在独特和保守的 (S/T)-R-R-x-F-L-K(SEQ ID No.9)序列基序，此基序在sec前导肽中缺乏(Robinson 和Bolhuis，2001)。此信号肽中二精氨酸之一发生突变会明显降低蛋白质的转运作 用(Cristobal等，1999)。

小麦pre-23K和pre-Hcf136的双精氨酸(RR)基序是类囊体TAT通路靶向所必 须的。此基序通常是TAT前导肽的核心特征。细菌双精氨酸信号肽与类囊体TAT信 号相似，可高效引导TAT依赖性靶向植物类囊体。然而，绝大多数的细菌信号肽含 有除该双精氨酸基序外的保守序列元件，提示有特殊功能。双精氨酸基序后面第二 位显著倾向为苯丙氨酸，许多信号肽第4位含赖氨酸。已知的类囊体双精氨酸信号 此位置均不含苯丙氨酸，只有一个(Arabidopsis)在双精氨酸基序后第4残基为赖氨 酸。这些高度保守序列的确切作用尚不知道。苯丙氨酸残基可被亮氨酸但不是丙氨 酸取代而无不良作用，这表明疏水性而不是苯丙氨酸可能起重要作用。类似地，赖 氨酸残基取代不妨碍输出(Robinson和Bolhuis，2001)。

由于TAT输出系统是新发现的，尚未将其用于蛋白质表达或其它生物技术。然而， 本发明证明TAT通路具有克服细菌蛋白质分泌现有技术(即通过sec通路)局限性 的潜力。经由TAT通路输出已在胞质中折叠的蛋白质，这与含有有限折叠辅助因子 的周质相比，提供了帮助形成天然蛋白质结构的更广泛机制。重要的是，TAT通路提 供了输出复合性蛋白质的唯一生理途径，这些蛋白质折叠时必须含有辅因子或必须 伴有多个亚基组成因而不能通过sec通路输出(Robinson 2000)。也许是因为TatABC 转运的复合物直径大，尚不知通过TAT通路输出是否会导致蛋白质变成该通道中的 梗剌或发生细胞毒性作用。鉴于通过sec通路分泌要消耗ATP，而TAT输出只依赖于 ΔpH，因而消耗细胞的能量少(Musser和Theg 2000)。最后，与TAT特异性输出相 关的不同折叠方式和较低毒性提示，利用TAT通路进行蛋白展示可扩展组合文库所 表达多肽的多样性，进而可转为分离功能优异的蛋白质突变体。

通过TAT通路输出通常含有二硫键的蛋白质提出了一个问题。TAT通路一般接受 已折叠的蛋白质作为底物，然而由于胞质是高度还原性的，这种天然状态使含有二 硫键的蛋白质不能折叠。因此不能作为TAT通路输出的底物。的确，先前的研究已 证明其折叠需要二硫键的蛋白质不能通过TAT通路输出(Stanley等，2002)。

因此，需要使胞质改变成通过TAT通路分泌所需的氧化状态。通常由于存在还原 性成分如谷胱苷肽和硫还氧蛋白，细菌的胞质维持在还原状态，这非常不利于蛋白 质中二硫键的形成(Ritz和Beckwith，2001)。Bessette等的早期研究中工程改造产 生了具有高度氧化性胞质的细菌菌株，得以有效形成二硫键(Bessette等，1999)。

如Bessette等所示，大肠杆菌的需氧生长依赖于以下两种硫还原系统之一：硫氧 还蛋白和谷胱苷肽-谷氧还蛋白通路。由于硫氧还蛋白还原酶(TrxB)和谷胱苷肽的分 别作用，硫氧还蛋白和谷氧还蛋白维持于还原状态。谷胱苷肽是由gshA和gshB基 因产物合成的。需要gor基因的产物--谷胱苷肽氧化还原酶--来还原氧化的谷胱苷 肽，完成谷胱苷肽-谷氧还蛋白的催化环路。当trxB gor中的突变或trxB gshA双 突变消除了这二种硫还原通路时，细胞生长极其缓慢。然而，可在生长培养基中加 入还原性DTT拯救这些细胞。当trxB gor或trxB gshA菌株在含DTT的培养基中生 长后转移到缺乏DTT的培养基时，其胞质甚至变得比在trxB菌株中还要氧化。甚至 在DTT中生长时，trxB gshA和trxB gor二菌株能高频率产生快速生长的衍生菌。 因为这些菌株中的，trxB gshA和gor等位基因是非可逆性裸突变，生长更快的衍生 菌必然产生自基因外阻抑性突变。

随后确定，这些更快生长的衍生菌在烷基氢过氧化酶(ahpC)基因中累积有阻抑性 突变。产生的ahpC*等位基因能在普通(非还原)培养基中有效生长不会损害胞质中的 二硫键形成。这类trxB gor，ahpC*突变菌株(如大肠杆菌DR473或FA113)显示 了支持胞质二硫键形成的能力，也能象对应的野生型菌株一样在富营养和基本培养 基中生长。本文所述的研究中，大肠杆菌菌株DR473-A也含有使周质氧化酶dsbA失 活的突变。此外，DR473-B是DR473的dsbB衍生菌，DsbB通常为DsbA的氧化剂， 此二酶之一中的突变缺陷损伤了周质间隙中的蛋白质氧化。这类突变可在胞质中而 非周质中形成二硫键。

本文公开了大肠杆菌三甲基胺N-氧还原酶(TorA)的TAT特异性信号序列和编码 多个二硫键的蛋白质基因之间的转录融合物。这些蛋白包括：a)在一级序列中含保 守的两个二硫键的大肠杆菌碱性磷酸酶(PhoA)(PhoA是sec通路分泌及体内二硫键 形成的共同报告分子)；b)含4个分子内和一个分子间二硫键的抗地高辛抗体片段 (Fab)；c)含Kringle 2和蛋白酶结构域共有9个二硫键的截短的人组织血纤蛋白 溶酶原激活剂(vtPA)；d)大肠杆菌硫氧还蛋白(TrxA)的变体。已证明后一蛋白质在 氧化性菌株DR473胞质中表达并通过TAT通路输出时，可作为周质中的通用氧化剂。 此时trxA在胞质中预先被氧化并经TAT通路分泌到周质中，可弥补周质间隙形成二 硫键键正常途径中的dsbB突变缺陷。预先氧化的硫氧还蛋白变体的输出，作用是在 细菌周质中提供氧化剂并恢复因缺乏正常周质细菌氧化剂如dsbA和dsbB酶所致的 缺陷。可通过氧化的硫氧还蛋白恢复的dsbA或dsbB突变缺陷包括细胞运动、在基 本培养基中的生长和受丝状噬菌体感染的能力。

本发明一个方面，提供在细菌细胞中产生含有二硫键的生物活性异源多肽的方 法。该法产生的异源多肽可含有高达17个二硫键，此多肽可从细菌中分泌。另外， 可从细菌细胞的周质、培养上清分离获得此多肽，或是膜内在蛋白质。此方法包括 先构建一表达盒，此盒中能引导蛋白质经由双精氨酸转运通路输出的前导肽被置于 编码异源多肽基因的上游，然后在含有氧化性胞质的细菌如大肠杆菌菌株FA113或 DR473中表达此异源多肽。

可采用本领域技术人员熟知的方构建含有适当的转录和翻译控制信号的表达盒 或载体.见例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第 二版)，Cold Spring Harbor Press，N.Y.所述的技术。本发明的载体包括但不限于： 质粒载体、病毒载体和染色体整合载体。

本文所述分泌方法可用于许多药学和生物加工产业重要的真核蛋白质。目前生产 技术上重要的含4个或多个二硫键的蛋白质生产成本高而复杂，必须依赖能提供二 硫键形成有利环境或从包涵体重折叠的高等真核生物(Hockney，1994；Georgiou和 Valax，1996)。例如，目前是在细菌包涵体中产生组织血纤蛋白溶酶原(tPA)。典型 的生产程序是采用各种离液剂从包涵体中释放此蛋白，然后分离并用还原剂重折叠。 通常重折叠会导致生物活性物质产量降低。

本文所述分泌方法提供了以经济规模生产复杂的具有多个二硫键的真核蛋白质 的有效方法。而且该方法生产的蛋白质折叠完全正确并有生物活性，一旦从宿主细 胞中分离出来无须再活化或后续加工。如本文所用，该方法产生的生物活性分子通 常是具有4个或多个二硫键的分子，虽然也可产生具有17个或更多二硫键的生物活 性分子。特异性取向的这些二硫键能促进天然蛋白质的正确折叠。新形成蛋白质的 不正确取向产生的多个二硫键会导致错误折叠和丧失或缺失生物活性。采用本发明 所述方法含多个二硫键的生物活性多肽可正确折叠形成的二硫键将提供三级结构， 适当时提供四级结构，导致产生具有底物和/或催化性能的天然功能的分子。

本发明方法所解决的一个迫切问题是，现在可向周质输出具有多个二硫键以折叠 和活性构象形式的蛋白质。复杂的含多个二硫键的蛋白质可在能促进新生多肽达到 其天然构象的完全互补的折叠辅助因子的帮助下，在胞质中折叠。然后该折叠蛋白 以功能形式分泌到周质间隙或生长培养基中，这样就解决了包涵体相关问题并简化 了此发现。此外，活性重组蛋白质同时在两个细菌腔室(胞质和周质)中的积累， 或导致全面高产原先不可能在此二腔室同时活性积累的众多复杂蛋白质。

本发明的另一方面，提供鉴定能在分泌腔室中重建蛋白质氧化的突变多肽的方 法。该方法涉及构建可将双精氨酸转运通路的特异性前导肽置于编码具有氧化活性 蛋白质突变多肽基因文库的上游的表达盒。然后使该表达盒在具有氧化胞质和周质 二硫键形成通路受到损伤的细菌中表达。从能表达周质二硫键形成活性的细菌中分 离得到可重建蛋白质氧化的突变多肽。一实施方式中，具有氧化性胞质和周质二硫 键形成通路受一损伤的代表菌是大肠杆菌DR473-A或DR473-B，该突变多肽为突变的 硫氧还蛋白(TrxA)。

然而，本发明的TAT分泌可用于组合文库的筛选。目前文库筛选的蛋白质展示技 术以胞质输出多肽链为转移。迄今为止所有的大肠杆菌展示技术，如噬菌体展示、 细菌展示、周质表达和细胞计数筛选(PECS)均利用sec通路来实现蛋白质分泌。然 而，由于受到sec通路分泌的固有限制，展示文库中只有一部分基因能表达功能形 式的蛋白质。例如，在胞质中sec孔里折叠太快而成为梗剌或需要伴有辅因子或胞 质伴侣蛋白参加的多肽序列，不能恰当表达因而被从文库中消除。可利用Tat通路 消除或至少缓和需要经sec通路输出所产生的生物合成限制。这可能提高文库中表 达序列的多样性，进而有利于分离得到具有所需功能特性的新蛋白质。

采用经Tat通路的输出可与二种蛋白质文库筛选方法：噬菌体展示和PECS(周质 表达和细胞计数筛选)相结合。前者代表了目前蛋白质文库筛选应用最广泛的方式。 另一方面，周质表达和细胞计数筛选是蛋白质在细菌周质中以可溶形式表达的唯一 文库筛选方法，不限于生物学表面(Chen等，2001)。周质表达和细胞计数筛选是从 多样性文库分离获得配体结合蛋白质的强有力和快速技术。简言之，将可表达分泌 到周质间隙中蛋白质文库的大肠杆菌，与靶配体的荧光偶联物一起培育。在适当的 培育条件下，12KD大小的配体在周质间隙中平衡，没有蛋白质漏出或细胞活力损伤。 这样，细菌细胞的包膜起着渗透袋的作用，能选择性保留蛋白质-荧光配体复合物， 而不保留游离配体。然后用流式细胞计数仪分离显示荧光增强的细胞(Chen等， 2001)。

由于周质表达和细胞计数筛选的唯一要求是，位于周质中的蛋白质肯定利用Tat 通路而非sec通路。另一方面，改变分泌通路结合在噬菌体上展示蛋白质将更为复 杂。在丝状噬菌体上展示的蛋白质是与噬菌体蛋白p3融合的。通常利用职权sec特 异性前导序列从胞质分泌与p3融合的蛋白(Hoogenboom等，1998)。分泌后，p3融 合蛋白位于胞质膜(周质侧)中(Endeman和Model 1995)，然后掺入到新生噬菌体 颗粒中最终通过外膜的孔从细胞排出(Russell 1998)。含正确折叠所需4个二硫键 的P3蛋白通常在分泌到周质中时才形成(Kremser和Rashed 1994).。然而Tat通路 输出的蛋白已在胞质中获得天然的紧密构象。因此为了转换噬菌体展示所用的分泌 通路，必须不只是在P3融合物N末加上Tat特异性前导肽，而且还要采用具有氧化 性胞质的菌株。如上所述，TrxB gor ahpC突变菌株如FA113中的氧化折叠是Tat特 异性输出含二硫键蛋白质所需要的

因此，本发明还有一方面是提供筛选包括构建表达盒组合文库的一种方法，该 表达盒包含位于感兴趣多肽文库上游的双精氨酸通路的特异性前导肽。通过表达和 筛选穿过TAT通路的多肽来筛选此文库。一般在细菌如大肠杆菌菌株FA113或DR473 中表达该文库，并采用周质表达和细胞计数筛选或本领域普通技术人员熟知的其它 筛选方法筛选此文库。

“多肽”或“感兴趣的多肽”本文一般用于指具有10个以上氨基酸的肽和蛋白 质。多肽的“异源性”意为它们对所用宿主细胞是外来的，如CHO细胞产生的人蛋 白质，哺乳动物细胞产生的酵母菌多肽，或人细胞系产生的并非天然来源的人多肽。 感兴趣多肽的例子包括但不限于以下分子，如肾素、生长激素(包括人生长激素)、 牛生长激素、生长激素释放因子、甲状旁腺素、甲状腺剌激激素、载脂蛋白、α1- 抗胰蛋白酶、胰岛素A链、胰岛素β-链、前胰岛素、血小板生成素、卵泡剌激素、 降钙素、黄体生成素、胰高血糖素、凝血因子(如因子VIIIC、因子IX、组织因子 和von Willebrands因子)、抗凝血因子(如蛋白C、必钠素、肺表面活性剂)、血 纤蛋白原激活剂(如入tPA或尿激酶)、哺乳动物胰蛋酶抑制剂、脑衍生神经营养 生长因子、激肽释放酶、CTNF、gp120、抗-HER-2、人绒毛膜促性腺激素、哺乳动 物胰腺胰蛋白酶抑制剂、抗体、抗休片段、蛋白酶抑制剂、治疗用酶、淋巴因子、 细胞因子、生长因子、神经营养因子、胰岛素链或前胰岛素、免疫毒素、铃蟾肽、 凝血酶、肿瘤坏死因子-α或-β、脑啡肽酶、血清白蛋白(如人血清白蛋白)、穆 勒氏抑制物、松弛素A-链、松弛素B-链、前松弛素、小鼠促性腺素相关肽、微生物 蛋白(如β-内酰胺酶)、DNA酶、抑制素、活化素、血管皮生长因子(VEGF)、激 素或生长因子的受体、整合素、蛋白A或D、类风湿因子、神经营养因子(如神经营 养因-3、-4、-5或-6)、或神经生长因子(如NGF-β)、心营养因子(心过度生长因 子，如心营养因子-1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(如αFGF 和βFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF，如TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、 TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5)、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、 des-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白、CD蛋白(如CD-3、CD-4、CD-8 和CD-19)、红细胞生成素、骨诱导因子、骨形态发生蛋白(BMPs)、干扰素(如干扰 素-α、干扰素-β、和干扰素-γ)、集落剌激因子(CSFs，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF)、 白介素(ILs，如IL-1至IL-10)、过氧化物岐化酶、T细胞受体、表面膜蛋白、衰 变加速因子、病毒抗原如AIDS包膜的一部分、转运蛋白、归巢受体、寻址蛋白、调 节蛋白、抗原如gp120(IIIb)或上列任一肽的衍生物或活性片段。多肽可以是天然 的或突变的多肽，哺乳动物多肽的优选来源包括人、牛、马、猪、狼和鼠来源，人 蛋白质是特别优选的。以下给出实施例目的是阐明本发明的各种实施方式，不意味 以任何方式限制本发明。

实施例1

质粒和文库构建

如下构建大肠杆菌硫氧还蛋白(TrxA)的表达质粒。用PCR分别扩增pFA3和pFA6 的野生型硫氧还蛋白1和带有dsbA活性位点(trx--AdsbA，-CPHC-)的硫氧还蛋白1 (Mossner等.，1999)，引物为Sal1-TrxA-F (5’-ctctcgtcgacatgagcgataaaattattcac-3’，SEQ ID NO：1)和R-TrxA-Hind3 (5’-ctctcaagcttacgccaggttagcgtcgag-3’，SEQ ID NO：2)。这些引物分别将SalI 和HindIII限制性位点导入TrxA基因的5’和3’端。将PCR扩增片段克隆入 pBAD33-TorA质粒中[三甲基胺N-氧还原酶(TorA)的信号序列(前150个碱基对) 克隆入pBAD33(Guzman等，1995)的SalI/HindIII位点]，获得pBAD33-TorA::TrxA 和pBAD33-TorA::TrxAdsbA。采用这二种质粒作模板以PCR扩增TorA::TrxA和 TorA::TrxAdsbA插入物，所用引物将BspHI(Ncol相容性))和Hind1II限制位点分别导 入5’和3’端。将这些PCR扩增片段克隆入pTrc99a(Amersham Pharmacia)的 NolI/HindIII位点，获得pTrc99a-TorA::TrxA和pTrc99a-TorA::TrxAdsbA。

如下构建TrxA-CXXC-文库。采用随机寡核苷酸引物的重叠PCR策略构建34和35 位(-CXXC-基序)为随机化氨基酸的TrxA文库。用pBAD33-TorA::TrxA作模板扩增 TrxA的N末部分，引物为Sal1-trxA-F (5’-ctctcgtcgacatgagcgataaaattattcac-3’(SEQ  ID  NO：3)和N-ovlpTrxA-R (5’-ctctgcccagaaatcgacga-3’(SEQ ID NO：4))，而C末端部分可用诱变引物 TrxA-CXXC-F(5’-tcgtcgatttctgggcagagtggtgcNNNNaNNtgcaaaatgatcgccccgat-3’， SEQ ID NO：5)和R-TrxA-Hindi(5’-ctctcaagcttacgccaggttagcgtcgag-3’，SEQ ID NO：6)。用二种PCR扩增片段作模板，以Sal1-trxA-F和R-TrxA-Hind3引物进行重 叠PCR。在取得编码野生型TrxA区段后，将此重叠PCR产物克隆入 pTrc99a-TorA::TrxA的SalI/HindIII位点，而得到pTrc99a-TorA::TrxACXXC质粒文 库。将pTrc99a-TorA::TrxACXXC质粒文库电穿孔输入DR473dsbB中，接种在含100g/ml 氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基平板上。

实施例2

运动试验

先在37℃含相应抗菌素的M9酪蛋白培养基(1XM9基础含盐(Sigma，M6030)， 0.4％(w/v)甘油，0.1％(w/v)酪蛋白酶水解产物(Sigma，C0626)，2mM MgSO4，0.05mg/ml 硫胺素)中振摇培养单个克隆过夜。根据OD600稀释过夜培养物，在M9酪蛋白运动平 板(M9酪蛋白培养基，含0.3％(w/v)琼脂加充足抗菌素)上接种大约100个细胞。 然后37℃培养细胞40小时。

为筛选TrxA-CXXC文库中能恢复运动力的克隆，合并大约2000个氨苄青霉素抗 性克隆，37℃振摇培养在M9酪蛋白培养基中过夜。稀释过夜培养物(2x10-6)接种 在含100μg/ml氨苄青霉素的M9酪蛋白培养基中。37℃培养36小时后，获得大约 3600个氨苄抗性克隆。根据运动性“晕圈”的存在和大小选择单个克隆。

实施例3

碱性磷酸酶(PHOA)的TAT特异性输出

用表达载体pBAD33-TorA将大肠杆菌碱性磷酸酶(PhoA)基因融合于TAT前导肽。 所得的TorA-PhoA融合蛋白当在含有氧化性胞质的菌株(菌株DR473-A，图1A，泳 道2)中产生时被输出至周质。相反在含还原性胞质的等基因亲代菌株(菌株DHB4-A) 的周质腔隙中没有测到PhoA蛋白(图1A，泳道1)。重要的是，在DHB4-A和DR473-A 细胞的胞质中有大量PhoA蛋白合成和积累。然而DHB4-A的还原性胞质防碍了PhoA 的正确折叠，正据是其在胞质和周质腔隙中完全缺乏活性(图1B)。在DHB4-A胞质 中不正确折叠的PhoA看来有二种不同结局：i)如在免疫印迹上有许多低分子量条带 证实的那样，错误折叠的PgoA蛋白在胞质中有明显降解(图1A，泳道3)；和ii) 在胞质中缺乏氧化性折叠使PhoA与TAT依赖的分泌不相容，因而在DHB4周质组分 中没发现可测到的PhoA蛋白(图1A)或碱性磷酸酶活性(图1B)。

上述研究中，DHB4-A和DR473-A突变体由于周质氧化剂dsbA中的突变完全不能 氧化周质蛋白。因此赋予DR473-A细胞PhoA活性的二硫键形成，可能只发生在胞质 中。进而在通过TAT能路输出过程中这些二硫键保持完整。

图1A中，A箭头所指为具有完整TorA信号肽的前体蛋白，B为具信号肽酶去除 了TorA信号肽的成熟蛋白质，和C为低分子量降解产生。GroEL和DsbC分别用作胞 质和周质组分标记。观察到GroEL在胞质组分中占优势，DsbC在周质组分中占优势， 表明已成功进行了亚细胞水平的分级。

实施例4

人组织血纤蛋白溶酶原激活剂(VTPA)截短物的TAT-特异性输出

对与TorA前导肽融合表达的人组织血纤蛋白溶酶原激活剂(vtPA)截短变体进行 了如上所述PhoA的类似研究。将编码tPA截短变体(Bessette等，2001)的基因编 码pBAD33-TorA中TorA前导肽的序列融合。如图2所示，当TorA-vtPA融合蛋白在 含还原性胞质的细胞(DHB4-A)中表达时，观察到在全细胞裂解液中组织血纤蛋白 溶酶原活性水平非常低。此活绝大部分位于周质腔隙中，提示即使在DHB4-A的还原 性胞质中，也有少量vtPA正确折叠因而可通过TAT通路输出。当同样的TorA-vtPA 构建物在DR473细胞的氧化性胞质中产生时，在全细胞裂解液中明确观察到极高水 平的tPA活性(图2A)。亚细胞分级时，tPA酶活性的绝大部分位于周质中。值得注 意的是，DR473细胞周质组分中的tPA活性极大地高于DHB4-A细胞所见的活性(图 2B)。

实施例5

抗地高辛抗体片段的TAT输出

将地高辛特异性抗体的重链(Levis等，2001)与含有阿拉伯糖可诱导启动子的 pBAD33-TorA表达载体中的TorA前导肽杠内融合。融合方案见图3A。注意，该抗体 的抗原结合片段(Fab)含有总共5个二硫键：4个分子内链和一个分子间二硫键，将 该重链的可变区和恒定区共价连接于此Fab的轻链可变区和恒定区。此结构的一个 独特特点是TAT输出信号只附着于重链的可变区。因此，活性Fab在周质中的积累 需要在输出前通过TorA重链融合来征募轻链。以此种形式，只有当先在胞质中形成 链内二硫键后，TorA-重链才能“肩扛”携带着轻链进入周质。

如同PhoA和vtPA，观察到含还原性胞质的细胞(DHB4-A)中表达TorA-Fab融 合蛋白，结果是实际上在周质或胞质中都检测不到Fab(图3B，泳道1和3)。相反， 在含氧化性胞质的细胞(DR473-A)中表达同一构建物，结果是周质和胞质中都有Fab 积累(图3B，泳道2和4)。注意，免疫印迹分析测到的绝大部分Fab蛋白位于周质 腔隙中。重要的是，用能识别小鼠轻链序列的原代抗体探测到此Fab抗体的存在。 因此，图3B所见条带证实轻声链已适当地被重链所征募，输送到周质间隙中。图3 也显示了胞质标志蛋白GroEL和周质标志蛋白DsbC的位置。这二种标志蛋白质在胞 质和周质中的分别定位证明亚细胞分级已获成功。

图3C所示ELISA数据清楚地表明，只在DR473-A细胞中而不是在同基因亲代菌 株DHB4-A中检测到Fab活性。因此，大部分Fab活性与周质组分相关，从而证实该 抗体片段的TAT特异性输出。

实施例6

变体硫氧还蛋白(VTRXA)的TAT输出

以下例子显示如何利用TAT分泌通路使氧化等价物(二硫键)从氧化性胞质转运 成周质蛋白。在周质中形成二硫键能力受损的突变细胞(即在dsbA或dsbB突变体) 中细菌的鞭毛装配受到破坏。这是因为鞭毛P-环状蛋白(FIgI)装配成鞭毛结构并 具有相应功能需要一个二硫键(Dailey和Berg，1993)。当细胞在运动平板上培养 时不难明白此现象。如图4B所示，DR473细胞在运动平板上显示有大的运动性“晕 圈”，而缺乏dsbB的DR473-B细胞不能运动(图4A)。

野生型硫氧还蛋白1(TrxA)通过融合TorA信号序列，以TAT依赖方式输出到 周质中，当在同时含氧化性胞质和受损的周质二硫键形成通路的菌株(DR473dsbB) 中表达时，不能恢复细菌的运动力(资料未显示)。更加氧化的变体TrxA(vTrxAPH) 的TAT特异性输出也不能恢复运动力(资料未显示)。通过在硫氧还蛋白活性位点的 -Cys-Gly-Pro-Cys基序中导入二肽序列Ala-His构建了硫氧还蛋白1的更加氧化的 变体(vTrxAPH)。Ala-His替代Gly-Pro提高了硫氧还蛋白的氧还电势(Martin，1995)。

如上所述构建了在该蛋白质活性位点(-CXXC-)含有融合于TorA信号序列的随 机氨基酸的TrxA文库。分离得到一个含有活性位点序列Cys-Ala-Cya-Cya(SEQ ID NO：7)的突变体硫氧还蛋白。此trxA突变体(vTrxAAC)当在含氧化性胞质的菌株(图 4C中的DR473-B，与图4A中的对照菌株DR473-B相比)中产生时能部分恢复运动力。 推测以适合胞质最佳氧化的氧还电势平衡，一旦进入周质其二硫键转移到蛋白上。 值得注意，当TorA信号序列与vTrxAPH融合后在含还原性胞质的等基因菌株 (MC1000dsbB)中表达，不能恢复运动力(图4D)。这些结果表明氧化性胞质是经 TAT通路输送氧还蛋白(二硫键)至周质所必须的。图4E)证实变体TrxA(vTrxAAC) 从氧化性胞质输出到周质间隙中。泳道3较下条带对应于染色体拷贝表达的野生型 TrxA蛋白。等基因trxA突变体DR473缺乏此较低条带(泳道2和4)。

实施例7

TAT分泌在组合性文库筛选中的应用

为探索TAT分泌通路在组合性文库筛选中的用途，用Tat特异性前导肽表达了全 体突变的基因。具体说，从免疫动物构建的或原初免疫文库代表的抗体组合文库卡 分离获得scFv抗体。利用PCR将IgG的重链和轻链装配到scFvs中(Hoogenboom等， 1998)并插入适合周质表达和细胞计数筛选(PECS)、或噬菌体展示，或在微生物中 表达所需的其它组合文库筛选的载体中。筛选完成后测定能结合此二抗原之一并由 表达含Tat的筛选文库所产生的克隆的序列，以鉴定配体结合克隆的氨基酸序列。

因此，本发明在一实施例中，涉及在细菌中生产至少含一个二硫键的至少一种生 物活性异源多肽的方法，该方法包括以下步骤：构建能引导蛋白质从双精氨酸转运通 路输出的前导肽位于编码异源多肽基因上游的表达盒；使该表达盒在细菌中表达， 其中以生物活性形式产生该异源肽。此方法产生的异源多肽通常含有2-17个二硫键。 该方法可用于生产至少由一个二硫键连接的二种异源多肽。在某些实施例中所述前 导肽来自蛋白质编码基因，所述蛋白质选自TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、WcaM、 YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、DmsA、 YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD和YaeI。或者， 所述前导肽来自蛋白质编码基因，所述蛋白质选自TorA、SufI、YacK、YdhX、YdcG、 WcaM、YcdB、YaeI、HyaA、HybO、HybA、NapG、NrfC、YagT、YdhX、BisZ、NapA、 DmsA、YnfE、YnfF、FdnG、FdoG、YahJ、AmiA、AmiC、YcdB、YedY、FhuD和YaeI的 同源物。在该方法一实施例中，所述细菌含有氧化性胞质。可用于此方法的代表性 细菌包括：大肠杆菌trxB突变株、大肠杆菌gor突变株和大肠杆菌trxB gor双突变 株。通常从细菌细胞的周质中分离获得细菌分泌的，或是整合性膜蛋白的异源多肽。 任选地，可从细菌细胞培养上清液中分离获得此异源多肽。此方法生产的异源多肽 通常是哺乳动物多肽。例如，该哺乳动物多肽可以是组织血纤溶蛋白酶原激活剂或 抗体片段。该异源多肽可以是天然构象多肽、突变的多肽和截短的多肽。

本发明还涉及鉴定能重建分泌腔室蛋白质氧化作用的突变多肽的方法，该方法包 括以下步骤：产生一个编码具有氧化活性蛋白质的突变多肽文库；构建可将双精氨酸 转运通路的特异性前导肽置于突变多肽上游的表达盒；使该表达盒在含有氧化性胞 质和损伤的周质二硫键形成通路的细菌中表达；测定该细菌中周质二硫键形成所致 的细菌活性；和收集能表达周质二硫键形成所致活性的细菌细胞，其中收集细菌中 表达的突变多肽能重建分泌腔室中的蛋白质氧化作用。

本发明还涉及筛选重组文库的方法，该方法包括以下步骤：产生感兴趣多肽的文 库；构建可将双精氨酸转运通路的特异性前导肽置于该多肽上游的表达盒；在细菌 中表达该表达盒；和筛选表达的分泌多肽。虽然本领域普通技术人员能够采用任何 有用的技术筛选和表达分泌的多肽，代表性的技术包括周质表达和细胞计数筛选或 噬菌体展示。该方法有用的多肽通常是哺乳动物多肽，如含有2-17个二硫键的抗体 片段。此技术所用的前导肽见上述。

本发明还涉及筛选重组文库的方法，该方法包括以下步骤：产生感兴趣多肽的文 库；构建将双精氨酸转运通路的特异性前导肽置于该多肽上游的表达盒；在含有氧 化性胞质的细菌中表达该表达盒；和筛检细菌中该多肽的表达。该多肽通常是哺乳 动物多肽。此方法所用细菌可在trxB基因中含有一个突变。此方法所用的多肽可含 有2-17个二硫键。

实施例8

细菌菌株、培养和诱导条件

表1说明了所用的细菌菌株和质粒。为监测AP的输出，将在LB培养基上生长的 细菌亚培养于100倍稀释的添加有0.2％葡萄糖，1μg/ml维生素B1，1mM MgSO4， 50μg/ml 18氨基酸(包括甲硫氨酸和半胱氨酸)的M9盐水中，然后30℃培养。为 表达scFv和Fab抗体片段，将培养过夜的细胞亚培养于新鲜LB培养基(5％v/v) 中，然后30℃培养。当细胞达到OD600约0.5时，加入IPTG至最终浓度0.1mM诱导蛋 白质白质合成。适当时间，用0.2％阿拉伯糖诱导pBAD-ΔssDsbC共表达DsbC。用以 下浓度的抗菌素选择维持质粒上的所有标志：氨苄100μg/ml；氯霉素25μg/ml；卡 那霉素50μg/ml和链霉素100μg/ml。

表1

所用的细菌菌株和质粒

  大肠杆菌菌株   或质粒   相关表型或特征   来源   DHB4   MC1000phoRΔ(phoA)PvuIIΔ(malF)3   F’[LaclqZYA pro]   实验贮存   DR473   DHB4ΔtrxB gor552..Tn10Tet   ahpC*..Tn10Cm(araC Para-trxB)   礼物   FA113   DHB4 trx●●552...Tn10tetT ahpC*   礼物   DHBA，DRA   DHB4 dsbA::kan，DR473 dsbA::kan   本研究   DRB   DR473 tatB::kan   本研究   DRC   DR473 tatC::spec   本研究   PTrc99A   trc启动子，ColE1 ori，ampr   Amersham-Pharmac   ia

 pAID135  Δ2-22)AP   (Dermam等，   1993)  pTorA_AP  在pTrc99A中克隆的ssTorA-Δ1-22   本研究  pKK-AP  作为pTorA-AP和R11K；R12K在ssTorA中的  突变   本研究  pFdnG-AP  pTrc99A中的ssFndG-Δ1-22)-AP   本研究  pTrc99-Fab   (Levy等，2001)  pssTorA-Fa  Trc99中的dicistronic操纵子ssTorA-VH-CH1  和V1-C1   本研究  pKK-Fab  如上ssTorA(R11K；R12K)   本研究  pBAD-ΔssdsbC   (Levy等，2001)

实施例9

酶活性试验

诱导三小时后，收获表达AP的细胞，如上所述用100mM碘乙酰胺处理，离心沉 淀，经冷等渗冲击方法分级(Sargent等，1998)。用BSA作标准，以Bio-Rad蛋白试 验定量可溶性蛋白质。按文献所述进行AP活性和B-半乳糖苷酶活性试验(Derman 等，1993)。分级研究的唯一数据报告是胞质组分中β-半乳糖苷酶活性≥95％。如前 所述评估了AP的胰蛋白酶抗性(Sone，等，1997)，除了先用碘乙酰胺处理的样品 外。

按照Levy等(2001)所述进行ELIS A，按Chen等(2001)先前所述进行免疫印迹。

实施例10

只有在含氧化性胞质的菌株中碱性磷酸酶可通过TAT输出

细菌中，硫氧还蛋白和谷氧还蛋白通路维持胞质于高度还原状态，这很不利于 蛋白质巯基的氧化(Ritz和Beckwith，2001)。为此，需要二硫键的蛋白质必须分 泌到更氧化的环境中。碱性磷酸(AP)正常通过sec特异性前导肽分泌到周质间隙中， 在那儿快速被DsbA氧化形成对其稳定性和催化活性关键的两个二硫键(Sone，等， 1997)。更早的研究证明AP与Tat特异性前导肽的融合物不经过Tat通路输出(Berks， 1996；Kebir和Kendall，2002；Reinatz等，1998；Sambasivarao等，1990；Stanley 等，2002)。本发明人据此认为AP融合物不能通过Tat通路输出，是因为这类在胞 质中不能正常折叠的蛋白质维持在强还原状态而妨碍了二硫键形成。为查明这一点 和研究折叠与Tat输出能力之间的关系，本发明人探索了允许在胞质中形成二硫键 的，或相反不能在周质中氧化蛋白质的突变大肠杆菌的可利用性。

Beckwith及其同事(bessette等，1999)已证明，当AP在氧化性突变菌株如大 肠杆菌DR473(trxB gor ahpC)中表达而不含其信号序列时，可容易地形成二硫键。 为方便起见，将此菌株命名为C:ox/P:ox，因为其胞质和周质均为氧化性(图5)。 在dsbA衍生菌中，周质中蛋白质氧化受损(belin和Boquet，1993)。因此，将DR473 的dsbA衍生菌命名为C:ox/P:red。DR473dsbA细胞中，AP二硫键的形成可发生在 胞质中。

将显示能引导经过Tat通路输出的一组8个前导肽与AP融合，并在DHB4， DR473，DR473dsbA中，最后在DR473tatB::kan和DR473tatC::spec中表达。后 二菌株的背景中，预计tatB或tatC的突变灭活损伤了经Tat通路的输出。在基础 培养基上培养细胞，测定AP的亚细胞分布。收获细胞后用100mM碘乙酰胺处理防止 在等渗冲击分级中形成二硫键，然后测定包质和周质组分中的AP酶活性。如β-半 乳糖苷酶活性和GroEL(用免疫印迹法测定)亚细胞分布测定的那样，分级时胞质成分 的渗漏程度不到5％。

根据AP活性的形成是否严格依赖于氧化性胞质，将融合蛋白分成二类(表1)。 第一类Tat前导肽(类I；ssFdnG，ssFdoG，ssHyaA，ssTorA)以C:ox依赖和Tat 依赖方式将AP输出到周质中。换言之，周质中AP活性的积累只发生在具有氧化性 胞质和完整Tat装置的菌株中。具体说，当I类前导肽在具有还原性胞质的亲代菌 株DHB4(即其是C:red/P:ox)中表达时，只观察到本底AP活性。然而在C:ox菌株 中，发现周质中有明显组分的AP活性(总数的25-50％)。重要的是，周质的AP活性 不依赖于DsbA，并且事实上在C:ox/P:ox细胞与C:ox/P:red细胞(即DR473dsbA) 中是相同的。此发现表明AP氧化只在输出前发生在胞质中。当该前导肽中的标签RR 基序改变成KK序列时(一种已知能完全阻断输出的取代)，周质中活性蛋白质的积 累消失了。同样，C:ox/P:red菌株中tatB或tatC的失活导致周质中几乎完全丧失 AP酶活性，而胞质的酶活性维持基本不变。对于4种I类Tat前导肽之一(ssHyaA)， 输出只部分被阻断。

图6A-C显示不同菌株背景中一种I类前导肽融合物ssFdnG-AP的亚细胞分布。 C:ox菌株背景中tatC的灭活导致低水平的胞质融合蛋白。与此相似，在C:red细胞 的胞质中只发现少量的ssFdnG-AP融合物。相应于该ssFdnG-AP前体的较高分子量 物质可通过4-20％聚丙烯酰胺凝胶分辨(图8D)。由于该前导肽中存在胰蛋白酶敏感 位点(Kebir和Kendall，2002)，通过与胰蛋白酶一起培育，此HMW物质形成的条 带电泳移动率与天然蛋白质相同。在导致全长OmpA消失的条件下，该成熟蛋白质完 全抵抗胰蛋白酶的作用(图6D)。另外，这些研究中没测到AP酶活性的丧失，此与 Sone等(1997)观察到的只有天然的完全氧化形式的AP才对胰酶有抗性相一致。

在野生型菌株DHB4(C:red/P:ox)中8个Tat前导肽有4个(II类；ssDmsA， ssSufI，ssYacK和ssYcbK)显示了AP高活性。进一步分析表明II类前导肽可经过 Tat和Sec二条通路输出。具本说，经过sec通路证据有：i)在与dsbA+细胞相关的 dsbA突变株(比较DHB4(C:red/P:ox)与DHB4dsbA(C:red/P:red)，还有DR473(C:ox/ P:ox)与DR473dsbA(C:ox/P:red))中周质AP活性显著降低。对于所有4个II类前 导肽，dsbA突变菌株细胞中的周质AP活性水平是等到基因大肠杆菌获得的大约60％。 ii)tatB和tatC突变株中出现了显著的周质AP活性。iii)secA条件性突变株(菌 株MM52secA51(ts)，C:red/P:ox)当温度升高到野生型细胞也可升到的42℃非允许 温度后，该菌株的AP活性丧失(Tullmam，DeLisa，Kawarasaki和Georgiou制备 手稿)。DR473dsbA(C:ox/P:red)细胞周质组分中存高AP活性表明II类前导肽也能 经过Tat通路输出。

实施例11

抗体片段的TAT输出

除AP外，I类前导肽能介导含分子内或分子间二硫键的其它蛋白质从C:ox菌 株的胞质中输出。单链抗体含有两个分子间二硫键，一个在VH链中，一个在V1链中。 将26-10抗地高辛scFv抗体(Levy等，2001)与I类Tat前导肽ssTorA融合，用ELISA 监测C:ox/P:ox细胞周质间隙中抗原结合蛋白质的积累(图7)。近45％的地高辛结 合活性位于周质间隙中。积累在周质中的抗高辛活性scFv抗体在DR473dsbA (C:ox/P:red)中不受影响，但在tatC突变株中降低至本底水平。

FAB抗体是异质二聚体蛋白质，其中重链(VH-CH1)和轻链(V1-C1)通过一分子间 二硫键相连。此外，FAB蛋白含有4个分子内二硫键，重链和轻链各两个。构建了由 编码ssTorA-VH-CH1融合物后接轻链(V1-C1)的基因组成的Dicistronic操纵子(图 8A，Levy等，2001)。此构建中，轻链不含前导肽，因此本身不能从胞质输出。发现 诱导DR473dsbA(即C:ox/P:red)蛋白质合成可导致渗透休克组分中轻链多肽小量 但明显的积累。用FAB轻链特异性抗小鼠IgG F(ab’)2抗体作免疫印迹分析，表明在 渗透休克组分中V1-C1条带的强度是胞质中的大约15-20％(数据未显示)。在tatC突 变株或DHB4dsbA(C:red/P:ox)细胞的渗透休克组分中测不到轻链或FAB蛋白。

有理由认为，如果重轻链事先连接是经由Tat通路分泌所需，那么能提高正确 折叠FAB产量的条件可提高该输出的效率。trxB gor ahpC突变株(此研究采用C:ox 菌株EFA113而能从ara启动子共表达DsbC)胞质中表达的抗地高辛FAB量，在共表达 无信号序列的周质二硫化物异构酶DsbC(ΔssDsbC)后显著增加(Levy等，2001)。与 此假设相一致，共表达ΔssDsbC的细胞中，渗透休克组分中轻链条带的强度是胞质 中的70％(与上述无ΔssDsbC时的15-20％相比)。ELISA检测到FAB地高辛结合活性的 类似分割(图8C)。在FA113tatC::spec菌株中，周质组分中测不到FAB，还观察到 胞质中留存的该蛋白质量显著减少。本发明人和其它人观察到tat基因的缺失常导 致胞质中Tat底物蛋白的灭活或降解(Angelini等，2001；Santini等，2001)。与 此类似，在大肠杆菌DHB4(图8D和8C)中或当ssTorA中的RR二肽被KK取代时， 检测不到轻链蛋白或FAB结合活性。

如最后的测定所显示，能结合半抗原地高辛的功能性FAB蛋白可在体内形成。 将大肠杆菌培养在高渗溶液(5x PBS)中提高了外膜的渗透性，从而可使周质中的 荧光配体平衡，同时周质蛋白质不会漏出细胞外(Chen等，2001)。因而可用流式细 胞计数法检测能结合荧光配体的细胞。将表达ssTorA-VH-CH1和V1-C1的C:ox/P:ox细 胞与地高辛-荧光素复合物一起培育，显示细胞荧光比对照细胞(C:red/P:ox，图8D) 明显增强。在完整细胞原位测到地高辛结合活性进一步排除了细胞组分时发生FAB蛋 白中形成二硫键的可能性。

实施例12

讨论

使Tat通路与蛋白质通过脂质双层膜转运的所有其它方式相区别的特点，是其 能输出已装配成稳定的二级结构，或许甚至三级结构的多肽。通过基因工程选择性 促进胞质中或周质间隙中氧化性蛋白质折叠的能力，使本发明人能检验蛋白质输出 能力是否需要：i)不能含有哺因子和ii)显示已知的折叠动力学。

通过比较能在胞质中形成二硫键的野生型大肠杆菌突变菌株及其dsbA衍生株 周质组分中的AP积累(表2)，揭示胞质中所有8个前导肽的氧化性折叠是Tat输出 的预先要求的。Sone等证明部分氧化的AP缺少Cys-168-Cys-178二硫键对蛋白水解 不稳定，易受体内DegP的快速降解(Sone等，1997)。因此，我们研究中(degP+ 菌株背景)AP融合物在周质中的稳定积累以及渗透休克组分中ssFdnG-AP的AP结构 域对胰蛋白酶的稳定性(图6A-D)，表明AP融合物的输出形式必须是完全氧化的。 根据这些考虑，结论是Tat孔洞能转运完全氧化的含天然二硫键的AP。不可能确定 输出的蛋白是否为双体，或氧化折叠的单体结合是否发生在转运入周质间隙之后， 虽然由于在体外，二聚体化代表了AP折叠中的缓慢的一步(Walker和Gilbert， 1994)，后一机制看来更为似乎有理。

表2

表达Tat前导肽-AP融合物的细胞中周质碱性磷酸酶的活性

  FdnG   MDVSRRQFFKICAGGMAGTTVAALGFAPKQALAQ(SEQ ID NO：8)   FdnG   MQVSRRQFFKICAGGMAGTTAAALGFAPSVALAE(SEQ ID NO：9)   HyaA   MNNEETFYQAMRRQGVTRRSFLKYCSLAATSLGLGAGMAPKIAWAL(SEQ ID NO：10)   TorA   MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATAA(SEQ ID NO：11)   DmsA   MKTKIPDAVLAAEVSRRGLVKTTAIGGLAMASSALTLPFSRIAHAV(SEQ ID NO：12)   SufI   MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASAA(SEQ ID NO：13)   YacK   MQRRDFLKYSVALGVASALPLWSRAVFAA(SEQ ID NO：14)   YcbK   MDKFDANRRKLLALGGVALGAAILPTPAFAT(SEQ ID NO：15)

将所有信号序列框内融合于大肠杆菌AP(Δ1-22)并将该融合物插入载体 Trc99A(见实验程序)。

收获细胞后立即用100mM碘乙酰胺处理以防止在后续取样过程中形成二硫键。 AP活性计算为25℃和pH8时每分钟p-磷酸硝基苯酚水解的量(以微摩尔计)。AP活 性的报告值是2个独立研究(n＝6)3次分别测定值的平均值。所有报告数据的标准 误差不到10％。括号中的值表示周质组分中总酶活性的百分比。

aAP与2-20在天然前导肽中：b前导肽携带c-区阳电荷；nd-未检测。

对于4/8前导肽(I类：ssFdnG，ssFdoG，ssHyaA和ssTorA)，输出只通过Tat 通路，证据有：i)渗透休克组分中的AP酶活性不受DsbA存在与否的影响；ii)tatC 突变体和tatB突变体中该前导肽中的恒定RR被KK取代后输出完全消除，ssHyaA例 外。TatB在氢化酶输出中的作用一直是某些争论的主题(Walker和Gilbert，1994)。 TatB在非生理性底物大肠杆菌素的输出中是非必须有(Ize等，2002)，也有报告说 TatB的植物同源物，Hcf106，是叶氧释放复合物(oxygen evolving complex)的叶 绿体16-和23kD亚基分泌所非必须的(Roy和Barkan，1998)。

在表达AP与I类前导肽融合物的细胞中，发现细胞裂解液中总酶活性的约26％ (对于ssTorA)至约60％(对于ssHyaA)存于周质组分中。所见的AP输出效率是天 然Tat物质和Tat与异源性蛋白质融合物的典型效率(Thomas等，2001；Stanley 等，2002；和elinl等，2001；Delisa等，2002；Yahr和Wickner，2001)。如需要， 如上所述Tat转运蛋白优先输出氧化的单体AP，然后留在胞质中的此酶活性蛋白可 能成为与输出不相容的二聚体蛋白。此外，发现胞质中有不同量的无活性的输出无 能AP的积累。C:ox细胞中无活性胞质AP对胰蛋白酶敏感，在较高培养温度下由于 高拷贝数质粒所致融合物的表达其含量升高，也依赖于所用的前导肽(数据未显示)。 相反，对于所测试的任何构建物没有发现周质中有无活性AP融合物的证据。某些情 况下(如图6D中的ssFdnG-AP)，周质中AP融合物的一部分电泳迁移为较高分子量 条带，具有其前体蛋白的预计电泳迁移率。此HMW物质经胰蛋白酶加工成为成熟条 带，推测是由于Tat前导肽中存在敏感位点(Kebir和Kendall，2002)。

II类Tat前导肽(ssPmsA，ssSufI，ssYacK和ssYcbK)提供了含还原性胞质 细胞的某些AP输出。在C；red tatB或tatC突变株中没有废除此AP活性，表明该 蛋白质输出到周质中不涉及Tat机制，当II类前导肽融合物在C；ox/P:ox细胞中 表达时，击质中活性AP的量升高42％(对于ssSufI)至100％以上(对于ssDmsA)。 然而，C；ox菌株DR473中的dsbA失活导致周质AP的显著下降。这些结果的二种 可能解释是，或者错误折叠或未折叠AP的转运可能通过Tat装置，或II类前导肽 可通过Sec和Tat二者转运。发现C；red细胞中AP活性的输出在secA51(ts)突变 株培养在非允许温度(大肠杆菌MM52在42℃)下时消失，技持后一假设。II类前 导肽经Sec和Tat分泌装置转运的能力与Sander等(2001)的最近研究相一致，他们 发现融合于HyaA前导肽的异源细胞色素C的输出在缺乏血红素辅因子时可经由sec 通路；而当胞质血红素经酶促连接(此前导肽)时，Tat成为优势输出途径。较早的 研究表明，Tat前导肽的C端存在一阳电荷，可作为“Sec-avoidance”信号(Cristobal 等，1999；Bogsch等，1997)。虽然ssDmsA、ssSufI和ssYacK的此区域，都含有带 电荷氨基酸，但看来只有C区阳电不能充分防止经sec通路的混杂输出，至少当这 些前导肽融合于AP时。

早期几项研究致力于通过Tat通路输出AP未能成功(Berks，1996；Reinartz 等，1998；Sambasivarao等，1990；Stanley等，2002)。某些情形可在同质间隙中 检测到AP活性，但其输出不依赖于Tat通路(Stanley etsl.，2002)。本文提供的 分析现在解释这些先前的观察如下：虽然经Tat的AP输出依赖于胞质中的氧化折叠， 但某些前导肽能经由Sec和Tat通路输出。这二通路的输出流推测依赖于多肽的折 叠动力学，折叠分子的输出通过Tat系统，而尚未达到折叠关键状态的蛋白质可通 过sec通路。

除AP外，本发明人发现与其它含有多个二硫键的蛋白质，如scFv和Fab抗体 片段，当在其胞质能促进氧化性蛋白折叠的菌株中表达时，能通过Tat通路输出。 周质中Fab抗体的积累只能在C:ox菌株中见到，并依赖于完整的Tat装置和重链上 存在功能性前导肽。这些发现的最简单解释是，Fab先在胞质中装配，二条链由分子 间二硫键连接，然后折叠的蛋白质由Tat输出。通过ssDsbC的共表达提高了胞质中 Fab的折叠效率，从而极大提高了Fab的输出效率。完全折叠的Fab分子输入周质即 使二条链只有一条含前导肽，这是无前导序列的多肽通过与能利用此分泌装置的另 一条多肽相连而“免费搭车”输出方式的代表。

上述结果提供的结论性证据是：i)胞质中缺乏折叠的蛋白质不能通过Tat通路 输出；和ii)至少约43kD(单体AP的大小)的折叠蛋白，及必须在胞质中装配亚 基的蛋白质以折叠构象经细菌体内Tat通路输出。不能输出缺乏二硫键的AP、scFv 和Fab蛋白表明，存在着作为Tat转运机制整体一部分的一种质量控制机制。由于 转运只要求Tat蛋白，该折叠质量控制机制必定是膜中TatABCE蛋白质所固有的。 例如，Tat成分的胞质结构域可能通过与未折叠蛋白质中间物的暴露的疏水区域结 合，起着伴侣作用。或者，通过与折叠失常蛋白质的相互反应可抑制Tat转运孔的 装配，或一旦该孔形成姨其进行门控。分离出能在C:red菌株中输出与I类前导肽 融合的未折叠AP的Tat突变体，将有助于区别这二种机制，目前正在进行。

***

借助本文公开内容无须过多实验即可制备上述和本文权利要求所述的所有组 合物和实施所述方法。虽然本发明的组合物和方法已通过优选实施例作了描述，但 本领域技术人员懂得，可对所述组合物和方法，及所述方法的步骤或步骤的顺序进 行改变而不背离本发明的概念、思路和范围。更具体说，懂得可用化学和生理上相 关的某些试剂替代本文所述的试剂而能获得相同或相似的结果。本领域技术人员懂 得的所有这些相似替代物和修饰均应认为属于本申请权利要求所限定的本发明的思 路、范围和概念中。

参考文献

下列参考文献纳入本文作为参考，它们补充、解释、提供了本文所用方法学、 技术和/或组合物的背景或说明。

Angelini等，FEBS Lett.，506：8159-8164，2001.

Belin和Boquet，C.R.Acad.Sci.III，316：469-473，1993.

Berks，Mol.Microbiol.，22：393-404，1996.

Bessette等，Proc.Natl.，Acad.Sci.USA，96：13703-13708，1999.

Bogsch等，Embo J.，16：3851-3859，1997.

CHEN等，Nat.Biotechnol.，19：537-542，2001.

Clark和Theg，Mol.Biol.Cell，8：923-934，1997.

Cristobal等，Embo J.，18：2982-2990，1999.

Dalbey和Robinson，Trends Biochem.Sci.，24：17-22，1999.

DeLisa等，J.Biol.Chem.，277：29825-29831，2002.

Derman等，Science，262：1744-1747，1993.

Guzman等，J.Bacteriol.，177：4121-4130(1995).

Halbig等，Eur.J.Biochem.，263：543-55l，1999.

Halbig等，FEBS Lett.，447：95-98，1999.

Hynds等，J.Biol.Chem.，273：34868-34874，1998.

Ize等，J.Mol.Biol.，317：327-335，2002.

Kebir和Kendall，Biochemistry，41：5573-5580，2002.

Keegstra和Cline，Plant Cell，11(4)：557-570，1999.

Levy等，Protein Expr.Purif.，23：338-347，2001.

Mori和Cline，J.Biol.Chem.，273：11405-11408，1998.

Mossner等，J.Biol.Chem.，274：25254-25259(1999).

Pugsley，Microbiol.Rev.，57：50-108，1993.

Reinartz等，Arch.Microbiol.，170：59-68，1998.

Ritz和Beckwith，Annu.Rev.Microbiol.，55：21-48(2001).

Ritz和Beckwith，Annu.Rev.Microiol.，55：5573-5580，2002.

Robinson和Bolhuis，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，2：350-356，2001.

Rodrigue等，J.Biol.Chem.，274：13223-13228，1999.

Roy和Barkan，J.Cell Biol.，141：385-395，1998.

Sambasivarao等，J.Bacteriol.，172：5938-5948，1990.

Sanders等，Mol.Microbiol.，41：241-246，2001.

Santini等，J.Biol.Chem.，276：8159-8164，2001.

Sargent等，Embo J.，17：3640-3650，1998.

Schatz和Dobberstein，Science，271：1519-26(1996).

Schnell和Blobel，J.Cell Biol.，120：103-115，1993.

Settles和Martienssen，Trends Cell Biol.，8：494-501，1998.

Settles等，Science，278：1467-70(1997).

Sone等，J.Biol.Chem.，272：6174-6178，1997.

Stanley等，Mol，Microiol.，43：1005-1021，2002.

Stuart和Neupert，Nature，406：575-577，2000.

Thomas等，Mol.，Microbiol.，39：47-53，2001.

Walker和Gilbert，J.Biol.Chem，269：28487-28493，1994.

Weiner等，Cell，93：93-101，1998.

Wexler等，FEBS Lett.，431：339-342，1998.

Yahr和Wickner，Embo J.，20：2472-2479，2001.

发明背景