在各种生物学和化学试验中已采用了排列在表面或“芯片”上的多种分子探针。 进行这些试验以测定感兴趣的靶分子是否与任何探针相互反应。使探针在所选的条 件下与靶分子接触后，检测装置会确定靶分子是否已与所述探针反应。该系统可用 于各种筛检程序以获得关於探针或靶分子的信息。例如，可用于筛选能与某感兴趣 受体结合的肽或潜在的药物；可筛选其它样品中是否存在基因突变，人群中的等位 基因变异，或其它许多疾病中的具体病原体或病原株；研究基因表达，例如鉴定其 表达与具体生理状态、发展阶段或疾病状态相关的mRNA。
发明描述
本发明提供同时进行多个生物学或化学试验的组合、装置和方法，使得能对多 个样品进行高通量分析，例如，在一诊断试验中筛检多个病人样品或在一药物发现 方法中测试多种潜在药物或治疗药物。提供了一种可用于检测样品中一种或多种靶 分子的组合。此组合包括一含有多个空间上分离区域的表面，这些区域可称为测试 区和可能是一些孔，其中至少二个区域基本上相同。每一表面包含至少二个，优选 至少20个或更多，例如至少约25、50、96、864或1536个等等这种基本上相同的 区域。各测试区具有一可导入含(或可能含)一个或多个靶分子的样品的空间，并包 含一生物学或化学阵列。(“含某靶分子的样品”或“检测样品中的某靶分子”等 术语不意味着排除不含靶分子的样品或不测定(检测尝试)它们。从总体上说，本发 明涉及到检测样品中是否含有某靶分子的阵列，而不论它是否能测到或不能测到。) 此阵列包括多个各与一双功能接头分子连接的“锚”基因，而该接头分子的第一部 分对此锚有特异性，第二部分包含对至少一个靶分子有特异性的探针。将本发明的 组合物与含一个或多个靶分子的样品接触，使靶分子任选地与检测分子反应，然后 接受检测装置的询问，检测靶分子与测试区中探针之间的反应，从而产生试验结果。
本发明提供具体用于高通量生物试验的方法和组合。在具体优选实施例中可采 用本发明进行高通量筛选来发现药物。例如，此高通量试验可一次在多块(如100 块)96孔板上进行。可用一含有大约36对锚和接头的阵列在一块板的每个孔中进 行36种不同的测试。这样，100块板，每块板96个孔，每孔36种测试，就可进 行总共345000个测试；例如每次可测试9600种不同的候选药物的36种不同参数 或试验。高通量试验为各候选药物提供了比一次只能测试一种参数的试验高得多的 信息。例如，可以在一次高通量初步筛选试验中测定某候选药物是否有选择性、特 异性和/或无毒性。非高通量方法需要广泛的后续试验来测试每个感兴趣药物的这 些参数。实施例15-17中描述了几种类型的高通量筛选试验。同时进行各种各样的 试验和一次做非常多的试验是本发明的二个重要优点。
在一实施例中，例如采用聚苯乙烯制的带有供伯氨(如氨基酸或修饰的寡核苷 酸)附着的衍生表面的96孔DNA结合板(Corning Costar)，可将36种不同寡核苷 酸集合物点在每块板的每孔表面作为锚。可将这些锚共价结合于衍生的聚苯乙烯， 同样的36种锚可用于所有的筛选试验。对于一具体试验，可用一组所述接头程序 化各孔表面使其对多达36种不同感兴趣的靶分子或试验类型具有特异性，可将不 同的测试样品加到每块板96孔的每孔中。同一组锚可多次用于重新程序化各孔表 面，用于其它感兴趣的靶分子和试验，或同一组接头可重新多次应用。这种可行性 和可重用性提供了本发明的另一优点。本发明一实施例是一种用于检测样品中一个 或多个靶分子的组合，在加所述样品之前，此组合包含：
a)一含有多个空间上分离区域的表面，这些区域至少有二个基本上相同，每 区包含：
b)至少8种不同的寡核苷酸锚，每个与
c)一双功能接头相连接，此接头的第一部分对该寡核苷酸锚有特异性，其第二 部分含有对所述靶分子特异的探针。
本发明另一实施例是一种用于检测样品中一个或多个靶分子的组合，在加所述 样品之前，此组合包含：
a)一含有多个空间上分离区域的表面，这些区域至少有二个基本上相同，每 区包含：
b)至少8种不同的锚，每个与
c)一双功能接头相连接，此接头的第一部分对该锚有特异性，其第二部分含有 对所述靶分子特异的探针。
本发明的另一实施例是检测至少一种靶分子的方法，此方法包括使可能含有所 述靶分子的样品与对所述靶分子特异并结合所述靶分子的核酸酶保护片段接触。另 一实施例是测定RNA表达模式的方法，此方法包括在有利于RNA靶分子与探针特异 性杂交的条件下，培育含至少两种RNA靶分子的样品与上述组合，其中该组合的至 少一个探针是核酸(如寡核苷酸)，其对于至少一个RNA靶分子有特异性(如选择 性)。另一实施例是一种鉴定能调节RNA表达模式的药物或状况的方法，是确定RNA 表达模式的上述方法，此方法还包括将存在所述药物(或状况)时产生的RNA表达模 式与在不同条件下产生的RNA表达模式相比较。
通过实施例，图1和2说明本发明的组合和用它检测RNA靶分子的方法。图2 显示的本发明表面含有15个相同的测试区；在本发明的一具体实施例中每一个这 些测试区是微滴板中的一个孔。每一测试区含有6种不同的锚，表示为号码1-6。 图1说明了一种这种锚，锚1，在本发明最优选实施例中，它是一种寡核苷酸。附 着锚1的是一接头分子，接头1，它包括两个部分：第一部分对该锚特异，在此说 明中是一种能与该锚特异性杂交的寡核苷酸。第二部分是一种对感兴趣的靶分子 (此地是靶mRNA1)有特异性的探针，在此说明中是一种能与该靶分子杂交的寡核苷 酸。虽然此图没有说明，其余五个锚每一个能通过其锚特异性部分与其自身接头杂 交；每个接头可含有一探针部分，其对例如某RNA特异而不是(或相同于)mRNA1。 所述组合物可同时用于测试多达15个不同样品中是否存在mRNA1(或同时由阵列中 其它五种探针所特异测定的mRNA靶分子)。为进行此试验，将每份样品(此样品可 能是RNA抽提物)，即15种独立细胞系之一，小量加到一个区域或孔中，在有利于 探针和靶分子杂交的条件下培育。为了确定mRNA是否存在于样品中，采用能识别 模式和/或查询各区域中特定部位是否存在信号的检测装置。如果此细胞系在其 mRNA用一标记体内标记条件下培育，以及如果样品中存在mRNA，检测仪将测出位 于锚/探针复合物1所在部位标记mRNA发出的信号。或者，mRNA可在加入区域(孔) 之前或之后体外直接标记。或者，如图1所述，mRNA可在与探针杂交前或后，通 过与标记的“检测”寡核苷酸(靶特异性报告寡核苷酸，它与一序列而不是此探针 所识别的序列互补)一起培育直接标记。在所述实例中，可同时分析15个样品。因 为用本发明可同时分析至少20个或更多个，例如多至1536个或更多的样品，这是 一种非常高通量的试验系统。
如本文所用，“靶分子”是一种需要测定其存在、活性和/或数量并对所述探针 有亲和力的物质。靶分子可以是人造的或天然产生的物质。它们也可以其未变化状 态或作为与其它物质凝聚物形式使用。靶分子可直接或通过一特异性结合底物共价 或非共价结合于其结合伴侣。可用于本发明的靶分子例子包括但不限于：受体(在 运载体、脂质、细胞膜上的受体或各种其它受体)；配体；能结合特异受体的激动 剂或拮抗剂；能与特异性抗原决定簇(如病毒、细胞或其它物质)反应的多克隆抗体、 单克隆抗体和抗血清；药物；核酸或多核苷酸(包括mRNA、tRNA、rRNA、寡核苷酸、 DNA、病毒RNA或DNA、ESTs、cDNA、从RNA或DNA衍生的PCR扩增产物及它们的 突变体、变种或修饰物)；蛋白质(包括酶，如负责切割神经递质的酶、蛋白酶、激 酶等)；酶的底物；肽；辅因子；凝结素；糖；多糖；细胞(可包括细胞表面抗原)； 细胞膜；细胞器等等，以及可能以复合物、共价交联结合形式存在的其它分子或其 它物质。如本文所用，术语核酸、多核苷酸和多聚核酸可互换使用。靶分子也可称 为反探针。
如本文所用，“探针”是一种物质，即一种可被一特定靶分子特异性识别的分 子。可能的探针/靶或靶/探针结合模式包括：DNA/DNA，DNA/RNA，PNA(肽核酸)/ 核酸；酶，其它催化剂，或其它物质与底物、小分子或效应分子；等等。本发明所 考虑到的探针例子包括但不限于：有机或无机物或聚合物，包括金属、塑料、细胞 膜受体的激动剂或拮抗剂，毒素和蛇毒，病毒表位，激素(如类鸦片活性肽、类固 醇等)，激素受体，脂质(包括磷脂)，肽，酶(如蛋白酶、激酶)，酶底物，辅酶， 药物，凝结素，糖，核酸(包括寡核苷酸、DNA、RNA、PNA或修饰的或替代的核酸)， 寡糖，蛋白质，酶，多克隆和单克隆抗体，单链抗体或其片段。探针寡核苷酸可以 是线性或环形探针，可凭借不同活性或不同结合性鉴别磷酸化与非磷酸化蛋白质。 探针例如凝结素可鉴别糖基化蛋白质。如本文所用，术语核酸、多核苷酸、多聚核 酸和寡核苷酸可互换使用。上述任何物质如探针也可作为“靶子”，反之也然。
任何相容性表面都可用于本发明。该表面(常为固体)可以是各种有机或无机物 质或它们的组合，只是举例，包括塑料如聚丙烯或聚苯乙烯；陶瓷；硅；(融合的) 二氧化硅。石英或玻璃(它们的厚度显微镜载玻片或盖玻片)；纸，如滤纸；重氮化 纤维素；硝酸纤维素滤膜；尼龙膜；或聚丙烯酰胺或其它类型凝胶垫，如气凝胶制 成的气垫或气珠为多孔固体，包括用各种常规方法干燥湿凝胶制成的膜。当实施试 验的方法涉及到光学检测时，可采用对光线透明的物质。此表面可以是与常规检测 方法相容的任何厚度或不透光。例如，此表面可以是厚底、洁净板或不透明板。一 优选实施例中，此表面是多孔塑料表面，即组织培养皿，例如24-，96-，256-， 384-，或1536-孔板(一种修饰的板，如Coring Costar DNA Bind Plate)。锚可以 直接与表面结合，或与一种表面如玻璃结合，再与微滴板塑料“孔”中的第二表面 结合。此表面的形状不是关键的。它可以是例如平表面，如正方形、长方形、或园 形，曲线形表面/或三维表面如珠、颗粒、线串、沉淀、管状、球形；等等。
此表面含有许多空间上分离的和可寻址或可监定的区域。每个区域含有一组 锚。这些区域如何相分离，它们的物理特征和它们彼此的相对朝向不重要。一实施 例中，诸区域可通过一抵制液体流通的物理屏障隔开。例如，一优选实施例中，诸 区域可以是多孔平皿(组织培养皿)，如24-，96-，256-，284-，864-，或1536- 孔板中的孔。或者，一表面如玻璃表面可被蚀刻成具有例如864或1536个分开的 窄孔。或者，一表面可以含有不分开的区域或孔，例如一平面型塑料、玻璃或纸片， 各区域可通过覆盖一刻划有分开区域的结构(如一塑料或玻璃片)而确定。任选的， 在各区域被刻划出以前，一表面可能已经包含一个或多个锚，或结合了接头的锚的 阵列。在另一实施例中，各区域中的锚阵列可通过表面上的空白区(无锚)彼此分开， 或通过化学边界如蜡或硅胶彼此分开以防止液滴扩散。
另一实施例中，这些区域可以是小管或流体控制通道，如Beattie等，(1995) Clin.Chem.4；700-706，所述设计用于流通试验的小管。小管可以是任何大小，如 毛细管或宽孔小管；可让液体流通；或可部分或完全装满凝胶如琼脂糖或聚丙烯酰 胺，通过这些小管可输送化合物(用泵通过小管流体)，如电泳；或如Albota等 (1998)，Science.281；1653-1656；Cumpston等(1998)， Mat.Res.Soc.Symp.Proc.488；217-225；和/或Cumpston等(1999)，Nature.398； 51-54，所述，采用空间装满基质的通道。在这种充满基质的小管中，流体和/或分 子不仅可沿管壁垂直方向流动而且可侧向扩散。在一优选例中，小管中充满凝胶或 空间填充基质，激活凝胶或空间填充基质以结合锚，使不同的锚依次通过小管，让 锚在凝胶中形成阵列(线性阵列)；使接头、靶分子等继续通过。此阵列可以是线性、 二维或三维阵列。
可在一根小管中进行多个试验。例如在顺序试验中采用相同或不同样品，可重 复使用一根小管中的一种锚阵列或锚与接头结合的阵列(剥下和重利用或重新程序 化)另一实施例中一个试验采用多根小管，在含有不同阵列的多根小管中分析感兴 趣的样品。锚和锚/接头组合可以是本文所述的任何类型。
表面中或上面的区域也可通过修饰表面本身来确定。例如一塑料表面可包含通 过修饰或衍生的塑料制作的部分，它们可作为加入特殊类型聚合物的位点(如PEG 可附着于聚苯乙烯表面，然后用羧基、氨基、双键、醛基等衍生)。或者，一个塑 料表面可包含模式结构，如突出端或隆起，它们可作为加入锚的平台。另一实施例 中，这些区域可以是凝胶垫，如聚丙烯酰胺凝胶垫或气垫，以所需模式在一表面如 玻璃上形成阵列，或夹在两个表面如玻璃和石英板之间。可将锚、接头等固定在垫 的表面，或可埋在垫中。凝胶垫表面上的其它各种安排是本领域技术人员熟习的， 可按常规方法制作。测试区的相对朝向可采纳各种形式，包括但不限于平行阵列、 正方或长方形或其它方形表面阵列、中间园形或其它表面的放射形阵列、线性阵 列等等。
本发明的空间上相分离的区域可以有多个拷贝，即至少二个，优选至少20个， 至少约24、50、96、356、384、864、1536、2025个或更多个基本上相同的空间上 相分离(分开)的区域。增加重复区域的数目可使试验具有更高的通量。如本文所用， 基本上相同的区域指含有相同的或基本上相同的锚、和/或锚/接头复合物的区域。 如本文所用，基本上相同指根据本发明，阵列或区域所起的作用与文中用于分析靶 分子的阵列或区域基本上相同。基本上不影响功能，即检测靶分子能力的差异是沿 线小核苷酸缺陷(删除/插入/替换)或寡核苷酸缺陷(表面结合差)等的差异，其在试 验精确度范围内不会明显影响靶分子测定结果。
当然，本领域技术人员会明白此表面上不是所有区域都需要基本上彼此相同。 例如，如果平行测试二组不同的阵列，将二组阵列包含在一个表面上可能是有益的。 例如，可将二组不同的阵列以交替条纹模式安排以促进二者之间的比较。另一实施 例中，实施者可能希望包括与该表面上其它区域相鉴别方式检测出的区域，从而可 作为“注册区”。例如，注册区可含有显示不同荧光分子模式、能被扫描检测仪识 别为“起始点”的寡核苷酸或肽，以排列对比表面上的区域。
不限制测试区域的大小和物理间隔。典型的区域面积约1-700mm2，优选1-40mm2， 间隔约0.5-5mm，常规选择取决于涉及的面积。一优选实施例中，区域间隔约5mm。 例如，各区域可包括一长方形格栅，例如有8排6行大约园形的锚附着点，这些点 直径约100微米，间隔500微米；这样一个区域覆盖约20平方厘米面积。还包括 较大和较小的区域面积和间隔。
这些区域也可进一步分成小的区域，这样，一区域内的某些或所有的锚可通过 小坑或浅凹与相邻锚物理上分开。例如一个区域的亚区数范围从约10个到约100 个或更多。一实施例中一区域是1536孔平皿中的一孔，可将其进一步分成更小的 孔，例如约4至约900小孔，优选实施例中约16-36小孔，从而形成孔中孔阵列。 见图4。这种浅凹表面降低了物理放置一个(或一组)锚到各设计位置(基因座)的抵 抗力，使含锚的区域大小更均匀，从而有利于与探针结合的靶分子的检测。
如本文所用，术语“锚”指任何实体或物质，如分子，其能与此表面(如固定 于，或共价或非共价结合于)结合，或是此表面的一部分(如塑料表面的衍生部分)， 其可与一接头或本文所述其它物质发生特异性反应或结合。具有接头分子的锚的此 部分可直接与此表面结合，或锚可含有一中间“臂”部分。此臂可以是任何物质， 如各种本领域常规使用的物质之一。在一实施例中，此臂是一种线形碳分子，具有 约5-20个，优选约12个碳原子。另一实施例中，此臂是不与接头分子发生特异性 反应或结合的核酸(本文所述任何类型的核酸)。
如本文所用，术语“锚”还指一组基本上相同的锚。见图7，提供了一含有3 个锚(A，B和C)的测试区，各锚以多个拷贝(一组)存在。各组锚的位置称为“位点”。 如本领域所熟知，一位点中锚的数量只受到物理性如锚大小的限制。例如约25-200 微米直径的一位点可含有数百万锚。
如本文所用，当一锚和一接头通过特定方式的分子连系结合时，产生了“锚/ 接头复合物”。与接头的相互反应可以是不可逆的，例如通过某种共价键；或可逆 的，例如通过核酸杂交。
在一优选实施例中，此锚是一核酸，可以是任何长度(如寡核苷酸)或类型(如 DNA、RNA、PNA、或RNA或DNA分子的PCR产物)。核酸可被修饰或置换(如包含非 天然产生的核苷酸，如肌苷，通过各种已知键连接，如氨基磺酸盐、硫酰胺、磷酸 硫代硫酸酯、膦酸酯、氨基甲酸酯等；或半合成分子如DNA-链霉亲合素交联物等)。 优选单链核酸。
锚核酸可以是任何长短只要与本发明相容。例如锚可以是长约8-15个核苷酸 的寡核苷酸，优选约10、15、20、25或30个核苷酸。另一实施例中，锚可以长约 50-300个核苷酸，或更长或更短，优选约200-250个核苷酸。例如一锚可含有约 150-200个核苷酸的上述“臂”核酸，毗连此臂有一较短的约10、15、20、25或 30个核苷酸的序列，设计其与一接头分子(“接头特异性序列”)相互反应。此臂 可以是任何长度或类型的核酸，可具有在本发明中有功能的碱基组成。一优选实施 例中，某区域一位点各锚或不同位点锚的此种臂基本上相同；因此锚彼此不同主要 在于它们的接头特异性序列。
臂可给于锚好处，改进其性能。例如使锚的接头特异性部分距离此表面更远， 因而与它们靠近此表面相比，物理限制少，空间位障小。例如这有利于具有靶特异 性的多个不同接头(如约2-10个)与所述位点的锚结合。如以下更详细讨论的那样， 一个锚可含有(除臂外)多个串联线性形式排列的接头特异性序列；这使得多个不同 类型的锚得以结合。所述位点的该锚：在一“混合位点”上，二个或多个锚各与一 具有不同靶特异性的不同接头结合。因为含有臂的锚物理上可屈曲，所述位点的锚 可容易地与多个不同接头分子结合而不受毗邻锚的物理约束。使多个接头分子与所 述位点的锚结合的优点是，得以在一具体位点上检出更多数目的靶分子。一实施例 中，结合于所述位点的多个接头具有针对同一感兴趣靶核酸不同部分(如此核酸内 不同的寡核苷酸序列)的特异性探针。与用一个探针相比，这得以扩大靶分子的检 测。另一实施例中，多个接头具有针对不同的无关靶分子的特异性探针，这得以检 测一具体位点内多个不同的靶分子。含有臂的锚的另一优点是，它们可更容易地容 纳与大分子如蛋白质结合，和/或与大的靶分子如蛋白质、膜或细胞结合的接头。
锚的碱基组成无须受限。锚的任何碱基组分都可接受，只要此锚在本发明中有 功能。例如，某区域一位点或不同位点上的单链锚核酸可含有部分或完全随机的序 列(如随机产生的序列，如对A，G，T和C的相对量无限制)，即寡核苷酸具有相同 量的G，C，A和T，但以不同相对顺序排列。即该锚，例如在某区域的不同位点与 公式GnCnAmTm不一致，其中n和m是整数。见实施例1所示锚，它不是随机序列 的同分异构体。本发明的锚中G和C的量无须大约相同，A和T的相对量也如此。 另外G，C，A和T的净相对量无须受限制。例如，某区域中锚的碱基组成可以从 GC较多(G+C大于50％)到G，C，A和T量相等到AT较多(A+T大于50％)。一实施例 中锚以G，C，A和T相对量不受限方式随机产生。
含核酸臂和一个或多个接头特异性部分的锚不可能遵守碱基组成上的特定限 制。例如，若位于某位点的锚具有基本上相同的臂，如基本上相同的25-聚或200- 聚臂，但各锚具有不同的接头特异性部分(如25-聚)，即使其接头特异性部分符合 特定要求(如As和Gs数目大约相同；Ts和Cs数目大约相同；寡核苷酸遵循公式 GnCnAmTm；和/或G+C成分符合特定要求)，这些锚作为整体将不符合那些具体要求。 类似地，即使某区域不同位点锚的接头特异性部分彼此基本上不同(如各接头特异 性部分序列与该区域中各其它接头特异性部分至少约20％或50％，或80％不同)，从 该核酸全长考虑，该锚的净序列相同性可能差别不大。例如各锚含有基本相同的 250-聚臂，和25-聚接头特异性部分(其与该区域中各其它接头特异性部分100％不 同)，这些锚彼此仅10％不同。
锚也可以是肽或蛋白质。例如，它可以是能特异性结合一接头(一种抗原或抗 体)部分的多克隆或单克隆抗体分子或其片段，或单链抗体或其片段；正面讲，锚 可以是肽，与其结合的接头部分可以是抗体等。另一实施例中，锚可以是对特定糖 类特异的凝集素(如伴刀豆球蛋白A或生物体如鲎、花生、绿豆、菜豆、麦芽等的 凝集素)。另一实施例中，锚可以含有机分子，如修饰的或衍生的可塑性聚合物， 其可在寡核苷酸化学合成的特定固相阶段起作用。此时，衍生的塑料中可分布不同 的衍生阵列，在制造过程中整合入组合塑料表面而形成位点。另一实施例中，锚可 利用其特异或优先结合于金属离子如Ni、Zn、Ca、Mg等和特殊蛋白质或螯合剂之 间。例如，锚可以是聚组氨酸，而接头的锚特异性部分可以是镍，其可通过镍螯合 剂与靶特异性探针结合。或者，螯合剂可以是锚，聚组氨酸是探针相关部分。或者， 锚可含无机物质。例如，它可含金属如钙或镁，接头的锚特异性部分可以是优选的 螯合剂，分别是如能与靶特异性探针结合的EDTA或EGTA。本领域技术人员知道广 大范围的其它类型分子也可作为锚，如能与探针和靶结合的那些一般类型。
锚也可是一种杂交体结构，如DNA双链体，或含有DNA和蛋白质(其以本文所 述任何方式特异性相互反应)的双链体。例如，双链体锚的“碱基部分”(直接与表 面接触的部分)可含有任选的修饰单链核酸，优选此碱基部分也含有一臂，如上述 线性碳原子臂。一实施例中，第二单链核酸与此碱基部分结合(杂交)，形成含有至 少部分双链体核酸的锚。例如，该碱基部分可含有一端能结合表面的线性碳原子臂， 另一端能结合约10-100个核苷酸，优选约25个核苷酸的单链DNA寡核苷酸；该双 链体的第二部分可含有与该碱基部分(如与末端约40个核苷酸)至少一部分互补的 序列，后有一任选臂(如约5-15，优选约10个核苷酸)，再后有一接头特异性序列(如 长约8-50个核苷酸，优选约15、20、25、或30个核苷酸，最优选约25个核苷酸)。
锚双链体互补部分和其接头特异性序列的碱基组成可以不同，以适合于采用本 领域常规最适方法的试验的需要。例如，可选择序列，使得接头在双链体锚本身保 持完整的条件下，可从双链体锚中解离下来。此双链体锚的剩余阵列可再使用，若 需要，与相同或不同接头分子杂交。或者，可选择序列，使锚/接头杂交体和双链 体锚的二互补部分在相同条件下均解离，只留下与表面接触的碱基部分。一实施例 中，某区域一特定位点或所有位点中的所有或基本上所有的碱基部分相同，或基本 上相同。只有当双链体锚的互补部分先加回(一种需要知道参与双链体形成的碱基 时的方法)时，解离后碱基部分剩余阵列可再使用(如与接头分子杂交)。不熟悉碱 基部分序列的用户可能或不可能再利用锚操作阵列的能力，提供了利用这种杂交锚 的优点。防止这种再利用也可预防因过度使用发生降解或偶然不稳定问题。
一实施例中，某区域一给定位点的一组锚基本相同(即只针对一种接头的“锚 特异性部分，或一靶分子的特异性))。见图7。另一实施例中，一给定位点可存在 对多个不同接头和/或对多个不同靶分子有特异性的多个不同的锚，此位点称为“混 合位点“，如含约2-100个不同的锚，例如至少约2个、至少约4个，或至少约 10个。混合位点的好处是它们能在一具体位点上检测更多数目的不同靶分子。一 实施例中，各个混合位点含有一个与每个或至少几个位点相同的锚。例如一个以上 位点中相同的锚可用于质量保证和/或控制信号的标准化。
当然，“混合位点“对只有一个信号(无重复)区的表面也有益处。这种单区域 各位点中的锚可与接头，或直接与感兴趣的靶分子相互反应。一测试区中的锚数量 (即一位点有数组锚)可至少为2种，优选约8-900种(或多或少)，更优选约8-300 种，最优选约30-100(如约64种)。某些优选实施例中，一具有96个测试区(如小 孔)的表面有约16、36、45、或100个锚/测试区，或一具有384个测试区(如小孔) 的表面含有约9、16、或25个锚/测试区。在一最优选实施例中，一测试区中的各 锚具有与阵列中各其它锚不同的特异性。然而，两个或多个锚可具有相同的特异性， 所有的锚可以相同。一实施例中，本发明的组合含有大量的测试区(如约864、1536、 或更多)，可一次处理大量的测试样品。可能感兴趣的是只测试这些样品的有限数 目参数(如约2、4、6或9种)。换言之，因为此组合含有非常大数量的区域，每 区域可只含约2-9种锚也许是有益的。
不限制测试区域中或上的锚(即一位点中的数组锚)的物理间隔和相对朝向。通 常锚之间的距离约0.003-5mm或更少，优选约0.03-1mm。包括较大和较小的锚间 隔(或面积)。锚可以彼此和对区域的边界以任何朝向排列，例如，可以二维朝向， 如正方形、长方形、六角形或其它阵列，或园形阵列(锚从中心以放射线或同心园 发射)排列。锚也可以一维线性阵列排列。例如，寡核苷酸可与沿DNA或RNA序列 的具体部位杂交形成一超分子阵列，或在流通凝胶中线性排列，或在流通装置表面 或流通装置内的结构表面排列。或者，锚可以“条码”样形式排列(见图6)。例如， 锚可沿着彼此平行的线排列，各长线的间隔或宽度可有规律的不同以产生一种很象 条码的可识别模式，如第一和第三条线可是其它的二倍粗，也可删去一些线，等等。 也可在最后的区分一测定区域的线后安置一额外的空白线，在后续测定区中可重复 此条码模式。
锚模式不需要严格注册分离的测试孔(测定区)或分离测试滴的位置。术语“测 定位置”用于指测定样品加入测试表面的位置。(例如，这些位置可由测试样品的 分离液滴位置或多孔板上孔的位置或确定各测试孔的分隔来确定。)锚模式本身(如 “条码”-样寡核苷酸锚模式)可通过模式识别精确定位各分离的锚，即通过其与其 它线的相对位置识别条码的每条线。因此第一锚不必位于各测试位置的一边或一 角。靠模式识别而非相对于该位置的位置找到该第一锚。只要各试验位置(例如液 滴的面积或孔的面积)所用面积足够大，明确含有至少一整个锚重复模式单元，当 此模式位于测定位置区域时，各测试点将测定对此(条码)模式特异的所有靶分子测 定位置的样品。
每测定区域内锚不需要按严格的甚至固定的模式排列。例如，各锚可与一测定 区域中随机位置的颗粒、珠等结合。各锚的位置可采用，例如一可检测标记来确定。 例如，可用不同的荧光、发光标记物标记各种锚的特异性接头分子，含有特定的接 头/锚对的颗粒的位置，可通过该接头发出信号的性质，例如激发或发射光谱来鉴 定。本领域技术人员能制备携带有各种结合标记，各具有一可鉴别光谱的一系列接 头。或者，可直接标记锚。例如，各种锚可用具有与其它类型锚不同的荧光标记来 标记。或者，颗粒、珠等在大小或形状上可彼此不同。可采用本文所述的标记和方 法。例如，可通过CCD摄影系统用扫描荧光显微镜或荧光激活细胞分拣仪测定荧光。
锚可与接头分子的一部分—锚特异性部分反应或特异性结合。术语“相互反应” 或“结合”，指两种物质或化合物(如锚和接头的锚特异性部分，探针和其靶分子， 或靶分子和靶特异性报道剂)彼此充分结合(如附着、结合、杂交、连接、退火、共 价连接或其它结合)，从而可进行所述试验。术语“特异性”或“特异地”指两种 成分(如锚和接头的锚特异性部分，探针和其靶分子，或靶分子和靶特异性报道剂) 彼此选择性结合，在缺乏保护技术时，一般不结合能结合目标成分的不想要成分。 实现特异性相互反应所需参数可用本领域常规方法确定。
对于核酸，例如本领域技术人员可凭经验确定在选择的严谨条件下，使核酸(如 寡核苷酸锚)能与另一核酸(如接头的锚特异性部分)杂交，同时最大程度降低与其 它物质或分子(如其它接头寡核苷酸)非特异性杂交。通常，DNA或锚的其它核酸序 列、接头部分或检测寡核苷酸将与其结合伙伴充分互补，使其能在所选的严谨杂交 条件下杂交，Tm将高于室温约10-20℃(如约37℃)。通常，寡核苷酸锚可长约8- 50个核苷酸，优选约15、20、25或30个核苷酸。如本文所用，“高严谨杂交条件” 指核酸之间核苷酸互补(相同性)杂交达到至少95％，优选约97-100％的条件。然而， 根据所需目的，可选择互补性要求较低，如约90％、85％、75％、50％等的杂交条件。 杂交反应参数中可以不同的有：盐浓度、缓冲液、PH、温度、培养时间、变性剂如 甲酰胺的量和类型等。(见Sambrook等(1989)，分子克隆实验手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)第二版，1-3卷；Cold Spring Harbor出版社，纽 约；Hames等(1985)，IL出版社；Davis等(1986)，分子生物学的基础方法(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevir科学出版公司，纽约)。例如，可将核 酸(如接头寡核苷酸)加入一测定区(如多孔板的一孔，一优选实例中用96或384 孔板或更多孔板)，其体积为约0.1-100微升或更多(一实施例中约1-50微升，最 优选约40微升)，浓度约0.01-约5微摩(一优选实施例中约0.1微摩)，缓冲液 为例如，6XSSPE-T(0.9M NaCl，60mM NaH2P04，6mM EDTA，0.05％ Triton X-100)， 与结合伙伴(如表面上的寡核苷酸锚)杂交约10分钟至至少3小时(一优选实施例中 至少15分钟)，温度约4-37℃(一优选实施例中在大约室温中)。可选择能进行高 通量的条件。在本发明的一实施例中，此反应条件可接近生理条件。
可设计其它类型的物质或分子(如多肽、凝集素等)作为锚或接头部分，确定实 现与其结合伙伴特异性相互反应所需的反应条件是本领域的常规工作(如 Niemeyer等(1994)，Nucl.Acids Res.22；5530-5539；Fodor等(1996)，美国专 利号5,510,270；Pirrung等(1992)，美国专利号5,143,854)。培养参数有：、 缓冲液、盐浓度、PH、温度、培养时间、是否存在载体和/或试剂、降低非特异性 相互反应的条件等。例如，在一测定区(如多孔板的一孔中，一优选实施例中，采 用96或384孔或更多孔板)中可含有抗体作为锚，可在其中加入抗抗体(即抗原或 抗体特异性第二抗体)，其体积为约0.1-100微升或更多(一优选实施例中约1-50 微升，最优选约40微升)，浓度约10皮摩至-约10纳摩(一优选实施例中约10纳 摩)，缓冲液为例如，6XSSPE-T、PBS、或生理盐水，与表面上的锚培育约10分钟 至至少3小时(一优选实施例中至少15分钟)，温度约4-45℃(一优选实施例中约4 ℃)。对于肽锚优选长约5-20个氨基酸。
本发明某些实施例中，在选择的反应条件下，阵列中的各锚以与阵列中其它 锚基本上相同的程度，与接头的锚特异性部分反应。这可保证这些锚特异于基本上 均一的接头和探针阵列。
测定区中的锚(各位点的锚组)可以是“通用的”，组中的各锚可与各接头反应， 各接头具有针对此类锚的特异性部分，但有不同的“探针”部分；这样，一个通用 锚的阵列可用于程序化或确定不同组探针。锚通用阵列的灵活性可参见图1和2 的说明。图2描述一含15个测定区的表面，各区含有6种不同的锚(此例中为寡核 苷酸)组成的阵列。图1说明这些锚(寡核苷酸)之一，锚1，与接头1接触，接头1 含有针对锚1的特异性部分，和针对靶mRNA1的特异性第二部分。或者，象接头1， 接头2含有针对锚1的特异性部分和针对靶mRNA2而非靶mRNA1的特异性第二部分。 这样，锚1可用于对二个或多个不同靶mRNA之一的特异性探测。产生和附着高分 辨率寡核苷酸或肽的模型(阵列)，可能是花费多、费时和/或费力的。能用预先形 成的锚阵列来程序化各种各样的探针阵列是本发明的一个优点。
虽然图2所述通用锚确定了寡核苷酸探针的模式，但此相同的锚阵列也可用于 程序化其它探针阵列，如受体蛋白质(见图3)。对于锚/接头的类型，已知可能有 许多排列，如甚至更复杂的“夹心”或“积木“式探针层。例如，一实施例中，一 组通用锚可与一组接头结合(共价或非共价)形成一修饰的“交联”锚阵列，详述见 以下。如此，含锚的表面本身就赋予了新的优点。
本发明的一实施例中，锚可反过来与接头反应，这样一组通用的锚重新用于程 序化不同组探针。例如，一寡核苷酸锚可通过加热使两种寡核苷酸解离，而与一接 头的寡核苷酸部分分离，然后可再与第二个接头分子结合。重新利用制备花费高、 费时费力的锚阵列的能力，是本发明的另一优点。
锚不一定需要与接头相互反应。例如，可将锚偶联于(直接或间接)一检测分子， 如荧光色素，因而可为测试表面和检测之间的登记起着在座标方格内定位一个点的 作用。或者，可用已知量的检测分子标记锚，可作为校准目的的内部定量标准。
术语“接头”如本文所用指一种双功能物质，其含有对所选锚或锚亚组有特异 性(“锚-特异性”)的第一部分，和含有感兴趣的靶分子的特异性探针(“靶特异性”) 的第二部分。接头的此二部分可通过共价或非共价键连接，或直接或通过一中间物 (如臂)相连。
当然，接头的锚特异性部分的化学性质功能是与锚相互反应。例如，如果锚是 寡核苷酸，与其反应的接头部分可以是，例如一种能与该寡核苷酸特异结合的肽， 或能在所选的严谨杂交条件下与其有效和特异性杂交的核酸。此核酸可以是寡核苷 酸、DNA、RNA、PNA、PCR产物，或取代的或修饰的核酸(如含有非天然产生的核苷 酸如肌苷；通过各种已知的键连接，如氨基磺酸盐、硫酰胺、磷酸硫代硫酸酯、磷 酸甲酯、氨基甲酸酯等；或半合成分子如DNA-链霉亲合素交联物等)。优选单链核 酸。接头的寡核苷酸锚特异性部分长约8-50个，优选约15、20、25或30个核苷 酸。如果锚是抗体，与其反应的接头部分可以是抗抗体或抗原，或这些分子的能与 锚特异性反应的较小片段。本领域熟知能与上述其它类型锚特异性反应可作为接头 的锚特异性部分的物质或分子，并可用常规方法设计(见上)。
当然，接头的靶特异性部分的化学性质功能是与要探测的靶分子相互反应。例 如，如果靶是一具体mRNA，接头的靶特异性部分可以是，例如一种能在所选杂交 条件下与该靶而非干扰性DNA或RNA特异性结合的寡核苷酸。本领域技术人员可采 用已知方法，靠经验确定将优先与该靶分子杂交，而与非特异性干扰性DNA或 RNA(见上)最少杂交的寡核苷酸的特征。通常，用于鉴别靶mRNA与背景中大量过剩 的非靶RNA的寡核苷酸长度是约8-50个，优选18、20、22或25个核苷酸。用于 无高背景竟争性靶分子生化试验的寡核苷酸探针可较短。用已知方法(如计算机程 序BLAST)，可选择此寡核苷酸的序列，使它们相互无关并与已知的基因数据库中 的潜在干扰序列不相似。可按常规用已知的方法(见上)确定使寡核苷酸探针与RNA 特异性杂交的杂交条件的选择。例如，可将从组织或容器中，如多孔微滴板(如96 或384孔或更多孔)的孔中培养细胞提取的靶RNA(即总RNA或mRNA)加入含有寡核 苷酸探针阵列(见上)的测定区中，缓冲液用例如6XSSPE-T或其它，任选地含有能 降低非特异性结合的试剂(如约0.5mg/ml降解的鲱或鲑精DNA，或酵母菌RNA)，并 在经验确定的温度下培养19分钟到至少18小时(一优选实施例中约3小时)，杂交 的严谨性可能与此锚和接头的锚特异性部分结合所用严谨性相同或较低。其它类型 探针的设计和应用也如上述是本领域的常规。
一实施例中，某给定位点中所有或基本上所有的与锚结合的接头都含有相同 (或基本上相同)的针对某一个特定感兴趣的靶分子的特异性探针。另一实施例中， 某给定位点中与锚结合的一个或多个接头含有多个不同的探针，它们是针对多个不 同靶分子的。这些探针可位于接头中分支结构部分，或优选可以线性关系排列，它 们可以是同样的物质(如都是核酸或都是肽序列)，或各种物质的组合。事实上，每 个接头含多个探针增加了一特定位点可检测的靶分子数。一实施例中，给定接头上 的多个探针均对感兴趣的特定靶分子有特异性(如对一感兴趣mRNA的不同部分有 特异性，或对相应于该mRNA不同部分的核酸酶保护片段有特异性)，这得以提高靶 分子试验(如样品中存在少量靶分子)的灵敏度。接头上探针的数目可为约2-50， 优选约2、4或10个。
当然，含有多个不同探针的接头也有利于只含一个(非重复)测定区的表面的应 用。
接头的锚特异性和靶特异性部分可通过各种共价或非共价键连接，连接键的性 质对本发明不重要。此二部分可直接或通过一中间分子连接。一实施例中，接头的 二部分是寡核苷酸，它们可通过共价键如磷酸二酯键连接，形成一共线核酸。另一 实施例中，锚特异部分是寡核苷酸，而靶特异部分是一受体，例如一受体蛋白质， 此二部分可通过生物素链霉亲和素分子的相互反应连接，例子见图3所述。已知这 种连接的许多变化(见Niemeyer等(1994)，NAR.22；5530-5539)。或此二部分可直 接连接，例如寡核苷酸可酰胺化再通过酰胺键直接连接(如交联)于肽或蛋白质，或 通过酰胺键或脂键连接于一膜成分。形成这种共价或非共价键的方法是本领域的常 规并且不难优化。接头的锚特异性和靶特异性部分也可存在空间臂序列(如核酸)。
两物质结合后(通过培育两种核酸、两种蛋白质、一蛋白加一核酸，或其它)形 成一复合物(如锚/接头复合物)，可任选项地处理(如洗涤)产生的复合物去掉未结 合物(如接头)，所用条件要能保留特异性相互反应完全，而去掉非特异性结合物质。 例如，在达到复合(如锚/接头复合)所用条件相同或稍微更严谨的条件下，洗涤反 应混合物约1-10次或更多。
本领域技术人员将明白可产生各种类型的锚和接头夹心物。例如，可使第一组 接头，每个接头具有锚特异性第一部分和针对第二组接头之一的特异性第二部分， 结合于一锚阵列(如该锚具有基本上相同的序列)，如此等等。事实上，夹心的这第 二层使得第一组锚(如相同的寡核苷酸)转变成具有不同“偶联”锚特异性的不同阵 列。如需要，不同组的接头和锚可相互共价或非共价接合。
可用常规技术制造本发明的组合。
可用于本发明的某些表面不难从供货商处购得。一优选实施例中，此表面是 96-、384-或1536-孔微滴板，如Corning Costar销售的修饰板。或者，含孔表面 可进一步含有浅凹或“凹痕”，可通过显微加工铝或钢等物质制备一个模子，然后 将塑料或类似物质显微注入此模子中，形成图4所述结构来形成这种浅凹或“凹 痕”。或者，图4所示含玻璃、塑料、陶瓷等的结构可从图5所述的三段材料组装： 第一段称为孔分隔(图5a)，其将形成样品孔之间的分隔；第二段称为亚区(图5b)， 其形成各测定孔内的亚区或浅凹；第三段称为底(图5c)将形成此板的底部，测定 孔的下表面。孔分隔可以是，例如一片材料如硅酮，间隔着一些洞，当此三段材料 组装时各洞将形成测定孔的壁。亚小区可以是一片材料如硅酮，形状塑造成筛子或 网状结构。底可以是一平片材料如玻璃，是用于生化试验的典型微板下部的形状。 如图5所示，底的上表面可以是平的，或可以形成浅凹，按亚区形状排列以在各样 品孔中提供完全的亚区或孔。可用标准方法，如组装硅晶片所用的方法组装这三段 材料。
可用常规技术，如商品化寡核苷酸合成仪，和/或将合成的亚片段连接在一起 来合成锚、接头或检测寡核苷酸。太长而不易用此类方法合成的核酸可通过扩增方 法，如PCR，用常规程序产生。本发明一实施例中，可用各种常规技术，包括光蚀 刻、丝网印刷化学结合、喷墨技术沉积、毛细管、筛网或液体通道芯片、采用电极 阵列的电化学成模、与钉或刺接触、或烘烤或UV照射滤器后变性，在测定区的表 面内或表面上设置锚核酸，如寡核苷酸锚(见Rava等(1996)，美国专利号 5,545,531；Fodor等(1996)，美国专利号5,510,270；Zanzuchi等(1997)，美国 专利号5,643,738；Brennan(1995)，美国专利号5,474,796；PCT WO 92/10092：PCT WO 90/15070)。锚可置于测定区的表面顶部，或当采用聚丙烯酰胺凝胶垫时，可包 埋在表面内，其方式应使某些锚突出於表面而能与接头相互反应。一优选实施例中， 在寡核苷酸锚的5’端产生一游离氨基，将其以经验确定的常规浓度(如约1微摩) 溶于PH8.5，50mM磷酸缓冲液和1mM EDTA中，并用Pixus nanojet分散器 (Cartesian Technologies)以约10.4纳升液滴加在测定孔表面特定部位上，此表 面是新的乾燥DNA结合板(Corning Costar)。。取决于寡核苷酸结合和蒸发量的相 对速度，必须控制制备时孔的湿度。另一实施例中，可用常规方法，如光激活脱保 护生长的寡核苷酸链(如与利用位点指导“遮蔽罩”结合)，或用nanojet分散器 模式化分散无活性化合物的纳升液滴，在表面上直接合成寡核苷酸锚。可使所有生 长中的序列脱保护以接受一个核苷酸，将该核苷酸加入此表面。另一实施例中，用 常规技术使寡核苷酸锚通过其3’端结合于此表面。
也可常规产生肽、蛋白质、凝集素、螯合体、塑料和其它类型的锚或接头分子， 可用适合的现有技术将锚安置在表面内或表面上(见Fodor等(1996)，美国专利 号5,510,270；Pirrung等(1992)，美国专利号5,143,854；Zanzuchi等(1997)， 美国专利号5,643,38；Lowe等，1985美国专利号4,562,157；Niemeyer等(1994)， NAR.22；5530-5539)。
本发明某些实施例中，以上公开的组合可用于各种筛选程序，和/或获得关於 探针或靶分子的水平、活性或结构的信息。这些试验称为多阵列平板筛选(MAPS) 法或试验，用于此试验的含锚或锚加探针阵列的表面，称为MAPS阵列或MAPS板。
可以任何顺序组装反应混合物的成分、试验、或筛选程序。例如，可依次组装 锚、接头和靶分子；或在有或没有报道剂时可在溶液中组装靶和接头分子，然后与 锚接触。
本发明一实施例涉及检测至少一种靶分子的方法，此方法包括：
a)使可能含有所述靶分子的样品与一双功能接头接触，该接头含有特异性针对 一寡核苷酸锚的第一部分，和含有针对所述靶分子的特异性探针的第二部分，接触 是在能有效获得所述靶分子和所述接头之间第一杂交产物的条件下进行
b)在能有效获得所述第一杂交产物和组合之间第二杂交产物的条件下，使所述 第一产物与所述组合接触，其中，所述组合在加入所述第一产物前含有：
1)含多个空间上相分离区域的表面，其中至少二个区域基本相同，各区域含 有
2)至少8个不同的寡核苷酸锚
c)使所述第一杂交产物或所述第二杂交产物与标记的检测探针接触，和
d)检测所述检测探针。
可以高通量方式进行以下各种试验或程序，其中可在每块板或表面上快速和同 时检测大量样品(如多达约864、1036、1536、2025或更多样品，取决于此组合中 测试区的数量)。还有，可一次测定多块板或表面。例如，在寻找药物的方法中， 可将大量的样品(各含一候选药物，如一组成性化学物文库的成员，如各种小分子、 肽、寡核苷酸或其它物质)加入到上述组合的分离的区域中，或可加入到生物或生 化样品中，再将它们加入到所述组合的分离区域中，与区域中的探针阵列一起培育， 对各份样品进行测试。随着高密度微型板、产生和从密度更高的微型板收集数据的 DNA点样的技术和方法如激光技术、机器人技术、改进的分散器、高级检测系统和 数据处理软件最近的进展和不断发展，本发明的方法可用于每天筛选和分析数千或 数万种化合物。
例如，一实施例中，探针是寡核苷酸，此试验可能是诊断大量样品中是否存在 基因变异或缺陷(如与疾病膀胱纤维病变有关的多态性或特定突变，见Iitia等 (1992)，分子和细胞探针(Molecular and Cellular Probes)。6；505-512)；病原 性微生物(如细菌、病毒、原虫、它们的宿主是动物，包括人，或植物)、或mRNA 转录模式(用于诊断特定生理状态或疾病)的诊断性核酸或多核苷酸筛检试验(如结 合或其它试验)。可利用含EST(包括全长拷贝)部分的核酸探针阵列来评价EST衍 生(或其它)细胞产生的转录模式。核酸探针也可以检测肽、蛋白质或蛋白质中能与 特定核酸序列特异性结合的结构域。
类似地，一实施例中，此探针是抗原结合分子(如抗体)，此试验可以筛检变体 蛋白，或蛋白质表达模式以诊断特定生理状态或疾病。参见图40和41，说明了可 检测的分子类型。
另一实施例中，本发明的组合可用于监测生化反应，如蛋白质、核酸、小分子 等的相互反应，例如，抗原和抗体、受体(如纯化的受体或与细胞膜结合的受体) 和其配体、激动剂和拮抗剂、酶(如蛋白酶或激酶)和其底物之间的相互反应，底物 转变成产物的量增加或减小，及其它等等。这类生化试验可用于特征分析探针或靶 分子的性质，或作为筛选试验的基础。例如，为筛检样品中是否存在特定蛋白酶(如 参与血液凝结的蛋白酶，如蛋白酶Xa和VIIa)，可在含有各感兴趣蛋白酶的特异 性荧光底物的探针的此组合上测试这些样品。如某核酸蛋白酶能结合和切割某底 物，而该底物会发荧光，通常由于两个能量转移对之间的切断和分离，可测到信号。 在另一实施例中，为筛检样品中是否存在特定的激酶(如Sre，酪氨酸激酶，或 ZAP70)，可在含有能被感兴趣激酶之一选择性磷酸化的肽的探针组合上测试这些样 品。采用本领域已知的常规测定条件，可将样品与底物阵列在适当的缓冲液和必须 的协同因子中培育一段经验确定的时间。(在某些试验中，如研究感兴趣激酶活性 调节因子的生化试验中，可调整各激酶的浓度，使各底物磷酸化的速率相似)。在 经验确定的条件下处理各反应物去掉激酶和不要的反应成分(任选)后，将其与可检 测试剂，如荧光素标记的抗磷酰酪氨酸或抗磷酰丝氨酸抗体(如浓度约10nM左右) 一起培育，通过检测产生的信号来检测磷酸化底物。另一实施例中进行结合试验。 例如，可在相应的磷酸化肽的探针阵列上检测SH2结构域如GRB2 SH2或ZAP70 SH2； 或在特定受体的探针阵列上筛检血清中的免疫缺陷。另外，可在这类阵列模式中进 行酶联试验。本发明的组合也可用于检测活性比野生型酶高或低的突变酶，或筛选 各种药物包括除草剂或杀虫剂。
当然，MAPS试验可用于定量测定样品中活性靶分子的量，只要探针不完全被靶 分子占据，即不超过约90％的探针位点被靶分子占据(或反应或杂交)。在这些情况 下可定量靶分子，因为靶分子越多与探针结合越多。另一方面，在90％以上的探针 位点被结合时，更多的靶分子基本上不会提高结合于探针的靶分子量。上述任何类 型的靶分子都可用此方式定量测定。例如，实施例6描述了靶寡核苷酸的定量测定。 此外，已显示，即使存在过量的靶分子(如其量大到使MAPS探针阵列中的探针饱 和)，可通过在该结合混合物中加入已知量的未标记靶分子，可转移此反应的灵敏 度而得以定量检测如此大量的靶分子。
另一个实施例中，可用本发明的组合物筛选靶与所述探针相互反应的制剂。 一制剂可直接或间接与探针，靶分子或靶加探针形成的复合物反应，而调节靶/探 针相互反应。此种调节可采取各种方式，包括但不限于提高或降低靶对探针的亲和 力，提高或降低靶和探针结合的速度，竟争或非竞争性抑制探针与靶的结合，提高 或降低探针或靶分子的活性，此活性在某些情况上可增强或减弱探针/靶的相互反 应。这些制剂可以是人造的或天然生成的物质。另外，可采用这些制剂的未改变状 态或与其它物质的凝聚物；它们可直接或通过一特异性物质共价或非共价结合于一 结合成员。例如，为了鉴定潜在的“血缓冲剂”，或能与蛋白酶级联反应之一的酶 反应引起血凝的制剂，可测试感兴趣蛋白酶的混合物与多种候选制剂的反应，然后 测定上述活性。可用于本发明的制剂的其它例子非常多种多样，包括除草剂和杀虫 剂。实例16和17描述了选择性抑制特定激酶的制剂，或选择性抑制SH2结构域和 磷酸化肽之间相互反应的抑制剂的高通量试验。
另一个实施例中，可用本发明的组合来筛选能调节基因表达模式的制剂。例如， 可采用寡核酸阵列来鉴定mRNA种类，一组与特定生理状态或发育阶段相关，或与 疾病相关的基因(相关基因、RNA、或表达模式)表达此种模式的mRNA。术语”相关” 或”相关性”指RNA的表达模式与细胞的生理状况相关，，但不一定所述RNA的表达 负责或引起该特定生理状况。例如，可监定到一个小亚组的mRNA被表达，上调或 下调.在细胞起着具体疾病状态的模型作用时，与未显示病理表型的的正常细胞相 比，表达模式的这种改变可作为患病的指征(“指示”基因，RNA，或表达模式)。术 语”相关性”和”指示物”可或互换使用。例如，用肿瘤促进剂如十四烷佛波醇处理的 细胞可能显示模拟肿瘤生长早期阶段的基因表达模式。输在另一种癌症模型中，当 用腺病毒感染小鼠胰岛瘤细胞(如细胞系TGP61)时，其显示c-Jun和MIP-2表达提 高，而管家基因如GAPDH和L32基本保持不受影响。
在与患病模型的细胞直接或间接，体内或体外(如组织培养)接触后，能调节指 示物表达模式的制剂可作为患此病生物(如人或患病动物或植物)的治疗制剂或药 物。这些制剂也可通过直接，如在体外(试管)表达系统接触此核酸来调节表达模式。 如本文所用，”调节”指引起参与检测反应的分子量和/或活性提高或降低。可用本 发明的组合来筛选这些制剂。例如，可使一系列细胞(患病模型的)与一系列制剂接 触(如约10分钟至48小时或更多)。采用常规的本领域已知的方法(如商品化试剂 盒)，可制备总RNA或mRNA提取物。如果需要扩增RNA的量，可采用标准方法如 RT-PCR扩增(见Innis等编(1996)，PCR：扩增方法向导(PCR Protocols：A Guide to Methods in Amplification)。学院出版社，纽约)。可使此提取物(或它们的扩增 产物)接触(或与其共培育)多个基本上相同的含有针对相应检测RNA的探针的阵 列，可鉴定那些与该检测物表达模式变化有关的制剂。实施例15描述的高通量试 验可筛选能改变疾病相关基因表达的化合物。
类似的，可鉴定能调节与特定生理状态或发育阶段相关表达模式的制剂，这种 制剂可以是人造的或天然产生的物质，包括环境因子如参与胚胎发育或调节生理反 应的物质，或农业工商业中重要的物质如除草剂或杀虫剂。另外，可采用这类制剂 的改变状态或其与其它物质的凝聚物，可使它们直接或通过一特异性结合物共价或 非共价结合于一结合成员。
本发明另一实施例是用于检测样品中至少一种靶分子的试剂盒，该试剂盒包含 有：
1)含多个空间上相分离区域的表面，其中至少二个区域基本相同，各区域含 至少8个不同的寡核苷酸锚，或本文所述其它类型之一，和
2)一容器，该容器含有至少一个双功能分子，此分子具有针对至少一个所述锚 的特异性第一部分，和含有针对至少一个所述靶分子的探针的第二部分。
在一实施例中，提供上述1)的表面和使双功能接头分子结合至少一个所述锚， 此双功能接头分子具有针对至少一个所述锚的特异性第一部分，和含有针对至少一 个所述靶分子的探针的第二部分。此说明书可包括，例如(但不限于)此表面上各锚 的描述，表明有多少种锚，它们位于表面何处，和使接头与锚附着(连接，结合等) 的方法。例如，如果锚是寡核苷酸，此说明书可包括各种锚的序列，根据此序列， 试验者可设计出与这些锚特异性反应(杂交)的接头的互补性锚特异性部分。如果锚 是肽，此说明书可提供关於能与这些肽特异性反应的抗体信息。此说明书还可包括 使锚和接头结合的方法，如杂交(或其它结合类型)的条件，试剂，温度，培育时间， 去掉未结合分子(如洗涤)的条件和试剂等。另外，该说明书可包括本文所述各类控 制接头的结构和用法，和定量，标准化，”微调”，或校准所述组合进行试验的方法。 此说明书可包括本申请书所述的任何参数，条件或实施例，对于这些本领域技术人 员都可按常规方法进行。
如本申请书所述，实施者可使含所述锚阵列的本发明表面结合各种类型的接 头，从而使各种各样的探针阵列程序化。而且，实施者可从本发明的表面去除某组 接头，并在此表面加上另一组接头(与第一组相同或不同)，使此表面可重复利用多 次。这种灵活性和重复就用能力构成了本发明的另一优点。
另一实施例中，用本发明的组合绘制EST(表达序列标记)图，即MAP试验可用 于确定一种或一组EST是否产生于同一基因的不同部分，和是否是唯一的。图18， 19，20和21说明了这些试验。在此实施例中，说明一种测定16种EST之一是否” 连接”于一共同基因。此试验(见图18)第一步是组装待绘制图谱的各EST的阵列， 含有对应其的至少一个寡核苷酸探针，绘制数目等于(或多于)EST的许多阵列并分 布于一表面的分离区域(如孔)中。在所述实施例中，组合的此表面含有16孔，各 孔含16种不同EST特异性寡核苷酸的阵列，编号1-16。“对应于”一EST的寡核苷 酸(EST特异性)是与该EST充分互补的，在所选择的条件下，该寡核苷酸将与此EST 特异性杂交，但不与其它无关EST杂交。此种类型的EST相应寡核苷酸(在优选条 件下)可特异性结合从原先产生此EST的基因合成的cDNA的编码或非编码链。优化 设计寡核苷酸要考虑的因素和杂交参数以实现特异性杂交在本文中有所讨论.。为 组装此阵列，制备接头分子，其各含有针对通用阵列锚之一的特异性部分，和含有 对应于待绘制图谱EST之一的寡核苷酸探针部分；并使这些接头结合于本文所述的 锚分。.在后续步骤中，将含有核酸混合物(如mRNA或单链或变性cDNA)(其可能性 含有与这些寡核苷酸探针之一或多个互补的序列)加入含一探针阵列的各区(孔)。， 然后在经验确定的常规优选条件下培育该混合物，使核酸结合于互补探针。如果有 几个EST特异性探针与一核酸的不同部分互补，该核酸将结合于阵列中这些探针所 处部位每一位点。
在后续步骤中，将不同的检测寡核苷酸(说明性实施例子中为检测寡核苷酸 #1-16)加入各区域(孔)中(见图19)。为待绘制图谱的各EST设计了检测寡核苷酸， 各EST特异性检测寡核苷酸对应于EST而非探针寡核苷酸的不同(至少部分不重叠) 部分，这样探针和检测寡核苷酸相互不会干扰。考虑到，例如图21所示的EST对 应于图18-20的EST1，2和6。图21表明EST#1和#2二者获自基因X(它们是”连接” 的)，而EST#6获自一不同的无关基因。如果将一等分含有mRNA混合物，包括基因 X产生的mRNA的样品与图18-20所示探针阵列一起培育，在优化条件下，基因X 的mRNA将与探针1和2的位点杂交但不与探针6的杂交。(当然各mRNA必须以超 过其可能杂交的探针之和的摩尔量加入)。如果将检测寡核苷酸1加入区域(孔)1， 它将与已结合在该探针阵列位点1和2的XmRNA杂交，但不与位点6杂交。类似的， 如果检测寡核苷酸2加入到另一孔，比如孔#2，它也结合于位点1和2而非位点6。 以这种方式可高通量确定那个EST连接该同一基因各部分的密码，那个EST是独特 的。对于图20推测的实施例，同一基因的前3个编码部分，另一基因的后5个EST 编码部分和其它的EST看来不相连接。本申请书中讨论了关于其它MAPS试验的杂 交条件，任选的洗涤步骤，检测方法等。为了验证MAPS试验获得的连接资料，可 用EST特异性寡核苷酸对作为有义和反义引物进行PCR反应，每对连接的EST应产 生一PCR产物。注意到进行这种配对PCR试验可直接测定连接链无须采用连接酶 MAPS试验；然而可能需要许多反应物，必须合成各EST引物作为有义和反义链。 此实施例说明需要180种反应物。
一方面，本发明涉及检测多个EST中那个与某给定核酸互补的方法，此方法包 括：
a)培育一固定的寡核苷酸探针阵列与测试样品，此阵列中至少一个探针对 应于一个所述EST，而测试样品可能含有所述给定的核酸，以获得所述寡核苷酸和 所述核酸的杂交产物
b)培育所述杂交产物与一检测寡核苷酸，该检测寡核苷酸对应于所述寡核 苷酸探针之一所对应的EST，但针对该EST的不同部分而非所述寡核苷酸探针，和
c)检测所述阵列中那个寡核苷酸探针被所述检测寡核苷酸所标记
其中所述寡核苷酸探针阵列固定于一组合的某区域上，所述组合含有：
1)含多个基本上相同的空间上相分离区域的表面，区域数目等于待测EST的 区域，各区域含：
2)数目等于待测EST的许多不同的锚，各锚与
3)一双功能接头结合，此双功能接头具有针对此锚的特异性第一部分，和含 有对应于至少一个所述EST的寡核苷酸探针的第二部分。
另一方面，本发明涉及的上述方法，其中所述EST可与所述核酸互补，各所 述EST含有两个不同的寡核苷酸序列，第一个序列确定了对应于所述EST的寡核苷 酸探针，第二个序列确定了对应于所述EST的检测寡核苷酸，此方法包括：
a)使含有所述核酸分子的样品与一组合中至少一个区域接触，其中所述区 域含一寡核苷酸探针阵列，至少一个探针对于一个EST
b)培育所述样品与所述区域，从而使所述核酸分子结合于所述EST对应的 寡核苷酸探针，该探针与所述核酸某部分互补
c)将含有结合于一个或多个所述EST对应寡核苷酸探针的所述核酸分子， 与对应于一EST的检测寡核苷酸一起培育，所述阵列寡核苷酸探针之一也对应于此 EST，从而使检测寡核苷酸与已结合于所述给定寡核苷酸探针的核酸分子，或与所 述核酸互补的其它寡核苷酸探针结合
d)检测所述检测寡核苷酸的存在，从而鉴定所述阵列中那个EST对应寡核 苷酸探针与此核酸的结合于所述给定寡核苷酸EST对应探针的部分互补，从而鉴定 那个EST与所述给定核酸互补，其中所述寡核苷酸探针阵列固定在一组合的一区域 上，所述组合含有：
1)包含多个空间上相分离区域的表面，基本上相同的区域等于待测EST，各区 域含有
2)数目等于待测EST的许多不同的锚，各锚与
3)一双功能接头结合，此双功能接头具有针对此锚的特异性第一部分，和含有 对应于至少一个所述EST的寡核苷酸探针的第二部分。
EST绘图试验中的组分可以任何顺序组装。例如，可依次组装锚，接头和EST； 或在存在或缺乏报道剂时可在溶液中装配接头和EST，然后加入到锚中。
另一方面，本发明涉及检测多个EST中那个与某给定核酸互补的方法，所述方 法包括：
a)将一批双功能寡核苷酸接头分子与测试样品一起培育，该接头分子 各含有一作为探针的对应于至少一个所述EST的第一部分，和针对一寡核苷酸锚的 特异性第二部分，而此样品可能含有所述给定的核酸，以获得所述寡核苷酸探针和 所述核酸之间的第一杂交产物
b)培育所述第一杂交产物与一固定的寡核苷酸锚阵列，此阵列中各寡 核苷酸锚对应于至少一个所述接头分子的锚特异性部分，从而形成含所述锚，所述 寡核苷酸探针和所述核酸的第二杂交产物，和
c)将所述第一或第二杂交产物与检测寡核苷酸一起培育，该寡核苷酸 对应于所述寡核苷酸探针对应的EST，但特异性针对此EST的不同部分而不是所述 寡核苷酸探针，和
d)检测所述阵列中那个寡核苷酸探针被所述检测寡核苷酸所标记
其中所述寡核苷酸锚阵列固定在一组合的一区域上，所述组合含有：
1)包含多个空间上相分离区域的表面，基本上相同的区域等于待测EST，各区 域含有
2)数目与待测EST相等的不同的锚
当然，上述绘制EST图的方法可用于绘制对任何感兴趣的核酸的测定序列(如 多核苷酸)，例如，可确定对同一基因DNA的二个或多个克隆的DNA片段或cDNA 图。这种方法有助于阐明复杂的长基因的结构。以类似方法，可确定对同一基因 DNA的一个或多个剪接序列或编号序列。这种确定可用于鉴别正常与以不同剪接模 式为特征的疾病的诊断试验。绘图法的其它许多用途是本领域技术人员所知道。
另一方面，本发明涉及检测多个多核苷酸中那一个与某给定核酸互补。
其中一个或多个所述多核苷酸可能与所述核酸互补和各所述多核苷酸含二个 不同寡核苷酸序列，此方法第一步确定对应于所述多核苷酸的寡核苷酸探针，第二 步确定对应于所述多核苷酸的检测寡核苷酸，这二步包括：
a)使含所述核酸的分子与所述组合的至少一个区域接触，其中所述区域含寡核 苷酸探针阵列，至少一种探针对应于各所述多核苷酸。
b)培育所述样品与所述区域，使所述核酸分子与所述多核苷酸对应的寡核苷酸 探针结合，该探针与所述核酸的一部分互补。
c)培育含有与一个或多个所述多核苷酸对应的寡核苷酸探针结合的所述核酸 分子的区域与一检测寡核苷酸，该检测寡核苷酸对应于一多核苷酸，而所示阵列的 一个寡核苷酸探针对应于此多核苷酸，因而使检测寡核苷酸与已结合于所述给定的 寡核苷酸探针或与所述核酸互补的其它寡核苷酸探针的核酸分子结合。
d)检测是否存在所述检测寡核苷酸，从而鉴定所述阵列中那些多核苷酸相应的 寡核苷酸探针与某核酸多部分互补，该核酸结合于所述给定的多多核苷酸相应的寡 核苷酸探针，从而鉴定出那些多核苷酸与所述给定核酸互补。
其中，所述寡核苷酸探针阵列固定在一组合的一区域中，所述组合含有：
1)一表面，该表面含有空间上相分离的、基本上相同的数目与待测多核苷酸数 目相等的区域，各区域含有。
2)与待测多核苷酸数目相等的许多不同的锚，各锚与。
3)一双功能接头结合，该接头的第一部分特异性对此锚，第二部分含有对应于 至少一个所述多核苷酸的寡核苷酸探针。
本发明另一方面，上述绘制EST或其它多核苷酸图的方法包括在一步或多步骤 之间除去样品中的未结合部分。
本发明另一实施例中，通过逆转录将感兴趣的一个或多个靶RNA(如mRNA或其 它类型RNA)转变成cDNA，然后使这些cDNA与一探针阵列杂交。图8说明了这种试 验。如本文所述制备细胞或组织的RNA提取物(或纯化的mRNA)，然后在RNA样品 中加入逆转录酶和感兴趣RNA的特异性寡核苷酸引物，采用本领域已知的可用常规 确定和优化的条件和程序，产生cDNA的第一链。术语“特异性”引物，指与感兴 趣mRNA充分互补能在选定的严谨杂交条件下与其结合并被逆转录酶识别，但不结 合不需要的核酸的引物(见上述实现特异性杂交的适当反应条件的讨论)。
可用各种核糖核酸酶之一或化学方法如碱处理去除残余RNA-RNA提取物中该特 异性引物不识别的mRNA，和/或其它类型的污染RNA如tRNA或rRNA，留下单链cDNA， 然后使其与MAPS探针阵列接触。此方法中采用逆转录酶大大减少了对广泛处理RNA 的需要，RNA对核酸酶降解敏感而难以留存。另外，特异性逆转录酶引物所到的额 外特异性给此试验添加了一层特异性。
任选的可在与探针阵列杂交前扩增上述cDNA以提高信号强度。上述逆转录酶 寡核苷酸引物5’端可含有针对RNA聚合酶(如，T7，T3或SP2聚合酶等)引发位点 的特异性序列(可长约22-27个核苷酸)。在图8所示实施例中，将T7启动子序列 加入逆转录酶引物中。任选地，可用PCR和适当的引物进一步扩增这样产生的mRNA， 或可扩增cDNA本身。转录和PCR的方法是常规和本领域熟知的。
PCR的灵活性使得可在本发明的方法中作许多改进变化。在一实施例中，用于 扩增靶分子的一个或二个PCR引物可含有使产生的PCR产物特异性或非特异性结合 固相载体的化学修饰。这类化学修饰包括例如5’酰胺化，从而可结合于Costar的 DNA结合板表面(如经N-氧琥珀酰亚胺脂修饰的表面，或马来酸酐包被的板如 Pierce的Reaci-Bind板，Rockford.IL)。产生含这类化学修饰寡核苷酸的方法是 本领域的常规方法。含这类修饰引物的PCR产物可结合于任何需要的载体，包括固 相载体如微滴孔的内壁、珠(如磁性或非磁性珠)或上述类型的表面。当然，开始 PCR反应之前PCR引物也可结合于载体，可用过量的结合引物不洗涤重复几轮PCR， 使产生的PCR产物保持与载体的结合。扩增的靶序列结合于载体有利于靶分子与含 有锚和/或接头的表面接触(杂交)之前或其接触之后洗涤(或纯化)靶分子，然后从 此表面释放下来。
另一实施例中，用于扩增靶分子的一个或二个PCR引物可含有一个或多个限制 性酯切位点，将此限制位点导入两端之一的毗邻部位或侧接感兴趣的靶序列。可在 PCR扩增的靶分子接触(杂交)含锚和/或接头的表面前后在其中加入限制性位点。 以此方式导入的限制性位点通过提供侧接靶序列的克隆位点而有利于扩增靶分子 的克隆。限制性位点也有利于扩增序列的纯化。例如，在PCR引物中在靶特异性序 列和使其结合于载体的化学修饰之间可安置一个或多个限制性位点。当靶分子经 PCR扩增后，利用该修饰的PCR引物通过此化学修饰结合于载体，可洗涤，然后在 毗邻靶序列的限制性位点切断，从而释放出洗脱的靶分子。见图23。
当然，上述方法也可利用切割位点而不是限制性酶位点，如可用特异性受体或 检测接头的特异性序列(其不必存在于靶分子中)。
当然，上述引物修饰都可用于任何需要的组合中，可在试验的任何一阶段将其 加入扩增产物。图21和22显示上述几种引物修饰加入拉增靶分子的方法。
可用在MAPS板上进行试验前用逆转录酶和/可PCR扩增将mRNA靶分子转变成 cDNA的上述方法代替标准的MAPS试验程序来进行上述RNA为基础的任何试验。
本发明方法中手所用的核酸，如靶分子检测或核酸酶保护片段(本文有描述)的 寡核苷酸，可用常规的各种酶促方法之一，包括PCR和连接酶反应来扩增。一种扩 增方法是转录介导的扩增(见Abe等(1993)，J Clin.Microbiol，31：3274)，也见 图32，36-39和42。
本发明另一实施例中，使感兴趣的一个或多个靶核酸与特异性多核苷酸保护片 段杂交，并进行核酸酶保护程序，并在MAPS板上测定与感兴趣靶核酸杂交的那些 保护片段。当然，此类“MAPS板”可含有不与接头结合的锚(如直接与感兴趣的靶 分子或核酸酶保护片段结合)。用于与任何一方类型探针阵列结合的核酸酶保护的 优点，本领域技术从中央到地方将会从本说明书和其原始专利申请所需求的权利中 得以理解，如果感兴趣的靶分子是RNA，保护片段是DNA，核酸酶保护/MAPS试验 (NPA-MAPS)可减少对广泛RNA的需要。(RNA对污染的核酸酶的降解敏感而难以保 存)。用核酸酶可信程序处理新品也得以降低样品的粘稠度。样品的核酸酶保护可 使试验的灵敏度和重现性更高。见图30说明用核酸酶保护程序处理样品的试验的 灵敏度和重现性。本发明的一个优点是当靶扩增(如PCR)不需要检测信号时这些试 验的灵敏度足够高。在NPA-MAPS试验中，探针阵列中的探针是与感兴趣靶核酸标 准相同的寡核苷酸，而不是像标准MAPS试验中与其互补，NPA-MAPS试验的一个例 是见图9。
在一NPA-MAPS试验中，感兴趣的靶分子可以是核酸，如基因组DNA，cDNA，病 毒DNA或RNA、rRNA、tRNA、mRNA、寡核苷酸、核酸片段、修饰的核酸、合成的 核酸等。本发明一优选实施例中，采用此方法测定组织或细胞RNA提取物中一种或 多种靶的RNA。在所选项严谨条件(见实现特异性杂交的相应反应条件讨论)下使含 有感兴趣的靶分子的样品先与过量的一种或多种特异性保护片段杂交。保护片段是 针对感兴趣靶核酸某部分的特异性多核苷酸，可以是RNA、DNA(包括PCR产物)、 PNA或修饰的或替代的核酸。“特异性”保护片段指与结合伙伴充分互补能在选定 的严谨条件下与其结合但不与其它的核酸结合的多核苷酸。保护片段至少长10个 核苷酸，宜长50-100个或为全长cDNA。在一优选实施例中，此保护片段是单链DNA 寡核苷酸。可在一杂交反应中包括多达100个或更多个靶分子的特异性保护片段。 杂交后，用含一种或多种核酸酶的混合物处理样品以破坏核酸而不破坏已与感兴趣 的核酸杂交的保护片段，和任选地在核酸酶保护程序中(在双链体杂交物中)，靶核 酸的已杂交部分将受到保护不被核酸酶消化。例如，样品中含有细胞提取物，不需 要的核酸如基因组DNA，tRNA，rRNA和不感兴趣的mRNA可在此步骤中基本上受到 破坏.可制备各种核酸酶的任何一种，如胰腺RNA酶，绿豆核酸酶，S1核酸酶，RNA 酶A，核糖核酸酶T1，外切核酸酶III，外切核酸酶VII，RNA酶CLB，RNA酶PhyM， RNA酶U2等，取决于杂交复合和样品中不要的核酸的性质.RNA酶H可部分用于消 化已结合于DNA保护片段的剩余RNA.这些酶的反应条件是本领域所熟知的可凭经 验优化.另外也可用碱水解RNA。如需要可起家一步用本领域熟知的方法处理样品 去掉未杂交物质，和/或灭活或除去残存酶(如酚抽提，沉淀，柱渗滤等)。杂交后 进行核酸酶消化和(任选的)化学降解称为核酸酶保护程序.已报道了各种核酸酶保 护程序(见Lee等(1987)，Meth Enzymol.152，633-648；Zinn等(1983)，Cell.34， 865-879)。受核酸酶保护处理的样品(任选地)灭活核酸酶后，使样品与MAPS探针 阵列接触，进行MAPS试验各步骤。可通过与本文所述用于标准MAPS试验的标记靶 特异性报道物杂交，或者此保护片段本身可用一可检测分子共价或非共价标记，来 检测结合的保护片段。
如需要，为标准化NPA-MAPS试验，可包含一个或多个对照.例如，可采用对应 于预计以基本衡定数量存在于一系列样品的各样品中的某核酸(组成性产生的 mRNA，基因组DNA的一部分，tRNA或rRNA)的一个或多个保护片段。试验中，检测 和定量内部标准化对照，如基因组DNA，以测定存在的不同量核酸(mRNA)能力，是 此试验采用保护片段的一个优点。
因为标准化用的标准品的量可能低于感兴趣mRNA的表达量，可能要调整该试 验，使对应于所表达基因的信号不超过对应于标准品的信号。调整信号水平的方法 是本领域常规为技术人员所知道。例如，可采用本文所述平衡信号强度(弱化信号， 细调)的任何一种方法(如采用封闭性接头；标记比设计用于检测mRNA更高水平的 用于检测标准品的信号部分；置于设计用于检测标准品的位点上(此位点含有针对 该标准化核酸不同部分或对应于该核酸不同部分的保护片段的)多个特异性接头)。 可通过本文所述方法之一，同时或顺次检测标准化用的标准品和感兴趣的靶核酸 (如mRNA)。图28和29说明mRNA试验中采用内部DNA标准化标准品的典型实验。
在一优选实施例中，直接，例如不通过与靶特异性报道物杂交来标记此保护片 段。例如，通过配体-抗配体相互反应，如链霉亲和素酶复合物加入到生物素化保 护寡核苷酸中，使报道物与保护片段结合。在另一实施例中，用化学修饰此保护片 段(如直接交联辣根过氧化物酶(HRP)或荧光染料)并用此保护片段的核酸部分或不 用(如经酶或化学处理切除此修饰后)检测这种化学修饰。上述任一方法中保护片段 或在与相应接头分子杂交前后标记。
为了控制核酸酶保护程序适当地工作，即如希望的那样消化掉未杂交的核酸， 可设计出含有应被核酸酶(若保护程序适当地工作)切除的突出(未杂交)端的一个 或多个保护性片段。该突出端存在是否可通过与一互补的标记检测探针杂交测定， 或将该保护片段突出端部分用一可检测分子共价或非共价标记。可在样品与探针阵 列接触之前进行这种控制，或作为MAPS试验本身的一部分。此控制试验的例子见 实施例15所述。当然，由于不同的标记不难鉴别(如用不同的吸收光谱鉴别荧光)， 可在一试验中包含几种不同标记的寡核苷酸。另外，凝胶电泳分析的标准核酸酶保 护试验可用于试验开发期限间验证这些保护性片段是否如预期的那样被加工。
核酸酶正确消化的其它控制方法是本领域技术之一。例如，可在一试验中包括 已知对样品中的任何核酸酶没有特异性的核酸酶保护片段(如植物核酸试验中)，可 包括已知植物中所没有的动物基因的特异性保护片段。
测到靶分子后，检测探针(如HRP标记的)信号可能消失(如变性、杀伤、淬灭、 受抑制、被封用)，洗涤板去除产生的可能干扰下一步的试剂、药物或缓冲剂(变性 试剂)，然后可用不同的检测探针(如HRP标记的)测定该突出端。可在试验的不同 阶段加入具有相同信号产生基因的不同检测探针后，利用变性的信号，可采用两种 不同的荧光探针和双色测定而无须变性或阻断信号。
在本发明一实施例中，如上所述用一寡核苷酸针来筛选含有一种或多种多形性 的核酸。在一优选实施例中，此核酸(如DNA、基因组DNA或RNA、mRNA)含有一种 或多种SNP，常规上可用专业识别程序进行此程序。例如筛检含已知SNP的DNA或 此DNA所表达的mRNA，使“SNP-特异性”保护片段与含核酸(其可能含该SNP)的样 品杂交。“SNP-特异性”保护片段本文指含有SNP的已改变碱基的片段，或如果要 分析mRNA则含有此序列的逆互补片段。然后，在适当的凭经验确定的条件下用能 在错配位点(如单碱基错配)消化未杂交的单链核酸和切断双链(双链体)核酸(如 DNA-DNA杂交体，DNA-RNA杂交体等)的一种或多种适合的核酸酶处理样品。适合的 核酸酶包括如S1或RHA酶H。如果样品中存在含SNP的核酸并与SNP-特异性保护 片段杂交，该保护片段可从消化程序中完整保存下来并可进行MAPS试验，用对该 保护片段某序列特异性的检测探针或检测寡核苷酸检测。不含SNP的核酸将在该核 酸中SNP特异性保护片段和相应的野生型序列之间错配位点处被切断。如需要，位 于该切断点远端或近端的保护片段部分可用常规方法(如热变性、酶促切割等)去 除。可设计一试验，使该被切分子(或其一部分)不与接头结合，或该被切分子即使 其一部分与一接头结合仍不能被适当设计的检测探针或检测寡核苷酸所检测。实施 例29和图30与31说明本发明的此试验可检测出被表达的SNP中的一个碱基的错 配。实施例32(图41)说明一种检测SNP的试验，可用于例如检测基因组DNA中的 SNP。
NPA-MAPS试验可用于测定样品中靶分子的量。如果加入的保护片段摩尔量足够 大超过靶分子而驱使杂交反应完成，核酸酶保护步骤后剩下的保护片段量将反映出 样品中存在多少靶分子。实施例12和13描述了这种定量反应的例子。
本发明一实施例中，可用一探针阵列测定样品中不同类型的靶分子，如DNA、 RNA、胞内蛋白质和分泌蛋白的各种组合。这类试验的例子见图40和41。
NPA-MAPS试验可用于实施上述采用标准MAPS试验的任何方法。
在一优选实施例中，用质谱仪而不是在MAPS板上测试多核苷酸保护片段。在 最优选实施例的杂交或核酸酶消化步骤中，没有多核苷酸与固相表面结合(附着)。 杂交后，可用核酸酶或化学处理降解杂交的靶分子，剩余的保护片段与有多少片段 已知靶分子杂交成正比。或者可处理该样品，留下靶分子的(单链)杂交部分，或杂 交靶分子和保护片段形成的双链体作进一步分析。将待分析的样品用(乙醇沉淀或 通过吸附或亲和层析等)与其余的杂交和核酸酶混合物相分离、洗脱或溶解，并通 过高通量的环注射注入质谱仪。在一优选实施例中，将待分析的样品(如保护片段) 吸附于一表面，并用激光解吸分析，采用本领域熟知的方法。对于最高灵敏度，可 采用傅里叶变换质谱(FIMS)(或类似的其它先进方法)，可测出10-15摩尔或更低的 每种保护片段。
可设计出测定一份(或多份)样品的保护片段为所用质谱仪提供独特的信号。在 一实施例中，保护片段在杂交和核酸酶处理后各具有独特的分子量，它们的分子量、 特征性电离和片段化模式足以衡量它们的浓度。为获得更高灵敏度或帮助分析复杂 的混合物，可采用设计的能产生清晰独特信号的化学基团来修饰(或衍生)这些保护 片段。例如，各保护片段的衍生可用不同的天然或非天然氨基酸，通过酰胺键在寡 核苷酸链的杂交部分的一个或多个位置与该链结合。采用具有适当能量的质谱仪， 酰胺键产生的片段释放出特征性比例的氨基酸。此类方法中，采用中等大小的化学 基团(分子量约80-200)作为质谱标记是理想的，因为这种大小的分子通常不难检 测。另一实施例中，此化学修饰是一种含有明确质谱信号，如四烷基铵基因(其可 产生另一分子如氨基酸分子)的有机分子。另一实施细则例中，通过与众多试剂之 一反应增强了阳离子或阴离子信号。例如为增强阳离子检测可使吡喃盐(如2-4二 乙基，6-乙基吡喃四氟硼酸盐或许多其它化合物)与氨基反应形成吡啶盐：可采用 许多其它增强剂之一来产生其它阳电荷功能基团(见Quirke等(1994)，Analytical Chemistry 66；1302-1315)。类似地，可使本领域已知的许多试剂之一反应形成阴 离子增强基团。当然可在从核酸中切下后或与核酸结合时检测到这种化学修饰。通 过区别性鉴定各保护片段，可以在一次试验中测定大量的不同靶分子(如2、6、10、 16个或更多的不同靶分子)。可快速容易地进行许多这种试验，因此可如本文所述， 高通量地进行一种或一组这类试验。
不论寡核苷酸是直接通过其质量或采用独特的分子标记检测，可用已知浓度的 纯品完整特征分析每一待测分子的信号，这得以精确定量分析此信号。对于质谱法 检测的任何分子。其强度和图形不可能精确预测。分子离子化的倾向、分子片段化 时所有化学键的灵敏度、各片段带多个电荷或单个电荷的程度都太复杂而不能预 测。然而，对于具有固定能量和样品处理特征的所述仪器、信号的强度和图形非常 有重复性。因此，对于各个探针可用纯标准品的特征分析其信号和精确定量解释实 验产生的信号。
一方面，本发明涉及到检测一个或多个感兴趣的核酸的方法，所述方法包括使 含有感兴趣的核酸的样品经受一种或多种保护片段的核酸酶保护，并用质谱法测定 杂交后的双链体分子或被保护的核酸或保护片段。
用质谱分析核酸的方法是本领域熟知的。见Alper等(1998)，Scieuce 279， 2044-2045和美国专利5,605,798。
除了上述各种高通量试验外，本领域技术人员还知道许多其它方法。
采用多重探针试验的优点是能够在每个探针阵列(将经历与真实实验探针相同 的反应条件)中包含许多“对照”探针。例如，该阵列的各区可含有阳性和/或阴性 对照。本文所用术语“阳性对照探针”，指已知能与靶分子起实质反应，或与之以 已知的定量或定性方式起反应的对照探针，故可作为探针/靶分子相互反应的标准。 例如，这类探针可控制杂交效率。术语“阴性对照探针”本文用以指已知不与靶分 子起实质反应的对照探针。这类探针例如可控制杂交的特异性。这两类对照探针应 用的例子，考虑为用寡核苷酸探针阵列试验来筛检能调节某疾病的一组相关基因表 达的药物。作为变量如各样品中裂解细胞数，mRNA回收率或杂交效率的内部标准 化对照，一个探针阵列可包含的探针针对的有：预计其表达不会受到所测试药物调 节的一个或多个碱基水平，或组成性管家基因(如肌动蛋白，微管蛋白或其它的结 构基因)或DNA结合蛋白(如转录调控因子或其它)的特异性探针。另外，为了确定 被测药物是否会导致不良副作用，如细胞死亡或毒性，探针阵列可含有针对已知受 诱导后可引起凋亡(细胞程序性死亡)过程的基因，或在细胞创伤(如热激蛋白)或细 胞中毒(如P450基因)条件下被诱导的基因的特异性探针。
可在一阵列中包含其它对照探针以“精细调谐”试验的灵敏度。例如，考虑一 种测试的药物能调节与某具体疾病相关的mRNA的产生时。如果先前分析已表明， 此组基因中一种相关的mRNA(称为mRNA-A)产生的量比信号不佳的其它mRNA高，可 调整接头而“精细调谐”此试验，使信号强度相等。“封闭性接头”含有针对mRNA-A 靶分子的锚特异性寡核苷酸序列，但缺乏探针特异性序列，可将其加入以稀释靶特 异性接头池，从而降低该试验对此mRNA的灵敏度。本领域技术人员可用常规方法 确定封闭性和非封闭性接头的恰当比例。对于某具体靶分子的检测，用无活性元件 稀释活性元件“精细调谐”，也可在该试验的其它步骤中进行。例如，可在检测水 平上用“无活性”的靶特异性报导分子(如用靶特异性相同但无信号传递分子(如寡 核苷酸序列)或用灭活的或无活性形式的信号传递分子)稀释标记的靶特异性报导 分子。本文所用的术语“信号传递分子”，指标记分子，或任何能发射可检测信号， 或能产生荧光分子，发冷光酶或各种本文所述信号的物质。在一特别优选的实施例 中，在含靶分子复合物与检测接头(见实施例23和图24关于复合性夹心型检测方 法章节)接触步骤中进行此“精细调谐”。可设计一组检测接头来精细调谐测试各靶 分子的灵敏度。例如，如果已知样品中某具体靶分子水平很高，可用含靶特异性部 分(如寡核苷酸序列)但不含报道试剂特异部分，或含靶特异性部分和报道试剂特异 性部分(已预先结合于一无活性报道试剂)的“封闭性检测接头”(其量凭经验确定) 来稀释针对靶分子的检测接头。也即可缺失针对报道试剂的特异性部分或阻止(封 闭)其与报道试剂相互反应(杂交)。这种精细调谐本文有时称为信号“弱化”。图 28说明进行这种信号弱化的实验。
本发明试验所测样品可能含有上述任何靶分子或其它分子。待测液体样品体积 可相应于测试区域的大小，从约100纳升至100微升。一优选实施例中，将约1 微升液滴加入到1536孔微滴板的各孔中，可采用适合高通量分析的各种方法之一， 如移液器、喷墨分散或采用反复加样针夹，使样品与探针阵列接触。在探针和靶分 子发生有效结合或其它稳定性相互反应的条件(盐浓度、PH、温度、培育时间等， 见上)下培育样品。这些条件按常规确定。培育后，用凭经验确定的条件任选处理(如 洗涤)样品以去除未结合的靶分子，此条件应能保留特异性反应物完整，但能去除 非特异性结合物质。例如，可在实现探针/靶分子结合所用条件相同或更严谨的条 件下洗涤样品一至十次。
可用各种方法之一制备含靶RNA(如mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA或总RNA)的 样品。例如，可将从体外细胞培养物提取到的mRNA接种于表面的诸区域中，如微 滴板的各孔中。任选的，在达到所需细胞密度后，用感兴趣的制剂，如刺激剂或潜 在的治疗剂处理这些细胞，可用各种方法之一，如反复加样针夹(获自Beckman的 96或384头针夹)，通过移液或喷墨分散，将制剂加入细胞，与细胞一起培育适当 时间如15分钟至48小时(取决于试验)。可用本领域已知的常规方法(通常可购试 剂盒式)从体外或体内来源的组织或细胞抽取到总RNA，mRNA等。
在一实施例中，在存在或不存在核酸酶保护片段情况下裂解(或渗透破裂)细 胞，直接利用粗制裂解液(例如在微滴板孔中)而不进一步纯化去除其它细胞成分。 如果在没有核酸酶保护片段时裂解细胞，可任选地将这些保护片段依次加入裂解 液。
在测定核酸酶保护片段的优选实施例中，使感兴趣的细胞(如微滴板孔表面上 的细胞，组织中的细胞或整个微生物样品等)接触含有表面活性剂或洗涤剂(如SDS 约0.01-0.5％ W/V)的水溶液(裂解液)接触来制备样品，制剂(如甲酰胺约8- 60％V/V)、盐酸胍(如约0.1-6M)、异硫氰酸胍(如约0.05-8M)或脲素(如约40-46％w/v 或约7M)单独或与一种或多种其它制备组合，可作为离液剂，这些水溶液可加入标 准缓冲剂成为缓冲液，在一优选实施例中，该缓冲液是约0.5-6XSSC，更优选给 3XSSC。任选地该水溶液还可含有适当浓度的tRNA，如0.1-2.0mg/ml，优选约 0.5mg/ml。也可将核酸酶保护片段加入此水溶液，然后将其加入细胞。各保护片段 的最佳浓度可凭经验用常规方法确定一优选实施例中，各保护片段的浓度约3- 300pM，更佳为约30pM。
细胞与该水溶液一起培育直至细胞因渗透而破裂和/或裂解，DNA和/或mRNA从 细胞释放入水溶液中。将细胞与该水溶液一起培育凭经验确定的时间(约1-60分 钟)，培养的最适温度凭经验确定(约37-115℃，优选约90-115℃)。
例如，在一实施例中，在约90-115℃，宜约105℃的水溶液中培育细胞约1-60 分钟，优选5-20分钟，使DNA和RNA以变性形式从细胞中释放出来而能结合保护 片段。若需要例如当需要在缺乏RNA时测定DNA，可在培养混合液中加入各种常规 核糖核酸酶之一。选择适当的核糖核酸酶和优化消化条件是常规工作，技术人员不 难确定。
另一实施例中，将细胞在90-100℃，优选95℃水溶液中培育约5-20分钟，宜 为10分钟来制备mRNA，任选存在一种或多种保护片段。此时，mRNA基本上以能结 合保护片段的变性形式从细胞中释放出来，而DNA仍基本上留在细胞内或与细胞结 合，或因其双链性质不能得到，或从细胞中释放出来但其形式不能结合保护片段(如 未变性)。不希望受任何具体机制的束缚，看来当核酸从裂解的/渗透破裂的细胞中 释放出来时，它已充分变性而能结合保护片段形成稳定的双链体，从而抵抗内源性 或外源性试剂或酶和细胞内蛋白质(如核酸酶)的降解，并变性或/或灭活。
用上述方法制备好感兴趣的核酸后，可稀释样品至适当体积，使水溶液不能抑 制外源加入的蛋白质如核酸酶(如S1核酸酶)、聚合酶(如PCR反应所需的聚合酶) 或结合性蛋白(如链霉亲和素)的功能。上述稀释液的量、水溶液中所用化合物的成 份和量可凭经验用常规方法确定。
对于本发明的任何方法，可用本领域熟知的和/或本文所述的各种方法之一来 标记靶分子(如用于检测核酸酶保护片段)。例如，可将靶分子直接或间接与能提供 检测信号的化学基团交联，如化学发光分子或能催化产生化学发光分子的酶或荧光 分子如荧光素或Cy5，或时间分辨荧光分子如一种整合性镧素金属，或放射活性化 合物。或者靶分子可在其与探针反应后用一个或多个标记的靶特异性报导子(如图 1所示抗体，寡核苷酸或上述与探针和靶结合的一般类型分子之一)标记。
一种荧光分子可能是“高转化磷光体”即一种吸收长波和在长波激发(红外)， 然后发射较短波长(如可见光)的荧光剂。因为高转化磷光体吸收的波长比典型的待 分析样品中存在的大多数潜在干扰物质更长，与吸收较低波长的磷相比，高转化磷 光体可降低样品中物质所引起的干扰。大多数高转化磷光体的狭窄发射光谱也得以 同时测定大量的不同高转化磷。本领域熟知和常见的高转化磷光体包括稀土金属离 子，如钇(Yb)、铒(Tm)和镨(Pr)，特别是氧硫化物盐的形式。已描述了多达80种 或以上的独立的可检测高转化磷光体(见《生物制剂检测和鉴定》(Biological Agent Detection and Identification)，1999年4月27-30日，DARPA，Biological Warfare Defense，Defense Sciences Office)可将这些磷任选地结合于一表面， 如微球或乳胶珠表面。象其它荧光标记，可通过向充分靠近的接头、靶分子或报导 子上的标记转移能量，检测高转化磷光体。另外，如本文所述其它信号传递分子， 可用高转化磷光体测定靶分子的量，并可用于本文所述各种方法，例如测定核酸酶 保护片段。
当然，高转化磷光体也可用于检测以任何其它方式在一表面上分布的靶分子， 如直接结合于表面，直接结合于表面上不同寡核苷酸阵列或通过双功能接头结合于 基本上均匀分布或以所需组织或模式分布在表面上的锚(不同或基本上相同)的靶 分子(包括核酸酶保护片段)。可采用任何表面如流通系统或珠等固体表面。用于本 发明任一试验的珠可以是任何材料、磁性和/或非磁性材料制成的任何类型的珠， 一种试验所用的珠可以在大小和/或形状上基本上相同或不同。
也可采用各种更复杂的夹心型检测方法。例如，一靶分子可与一双功能分子杂 交，该双功能分子含有对该靶分子特异的第一部分和可被共同(即相同)报道试剂， 如标记的多核苷酸、抗体等识别的第二部分。
对于本发明的任何方法，可采用各种复杂的夹心型检测方法来标记靶分子。例 如可使靶分子与一双功能(或多功能)分子(检测接头)相互反应，如杂交，该双功能 分子含有对此靶分子特异的第一部分和对“报道试剂”特异的第二部分。本文所用 术语“对XX特异”指探针和靶分子的相互反应。
本文所用术语“报道试剂”指标记的多核苷酸、抗体和本文所述与探针和靶分 子相关的任何通用性分子。检测接头的这两部分可识别(相互反应或与其结合)上述 任何方式与探针和靶分子相关的各自结合伙伴。检测接头也可包含其他序列，如对 某靶分子有特异性，但与相应锚结合接头的靶特异性部分不同(不重叠)的序列。检 测接头中的序列可起着检测探针或报道试剂的识别序列作用。一优选实施例中检测 接头是多核苷酸。
可设计检测接头以至可在一试验中使用所需数量的常用报道试剂。例如，可设 计一组检测接头，各检测接头对不同的靶分子是特异的，但含有相同(共同)或有限 数量报道试剂之一的结合位点。在一试验中使用有限数量(如一种)的报道试剂来标 记各种靶分子的能力，提供了减少成本和降低背景的优点。当然，可利用检测接头 /报道试剂的诸种组合来检测以任何形式分布在表面上的靶分子，例如可用高转化 磷光体检测的上述类型的靶分子排列。
在一最佳实施例中，可设计检测接头来检测核酸酶保护片段，方法是优先标记 核酸酶保护程序中(如实施例15中所述)已被核酸酶从控制性“突出端”序列切下 的保护片段。此种检测方法见图24的图解说明。在此实施例中，检测接头含有的 第一部分对靶分子特异，第二部分对共同的控制性突出端序列特异，该控制性突出 端序列在一优选实施例试验开始时，存在于几乎所有的核酸酶保护片段上。若需要， 在核酸酶保护反应时从核酸酶保护片段切下该控制性突出端序列，检测接头的靶特 异性部分，将与切下的保护片段杂交，但检测接头的控制性突出端特异部分将不被 结合并保留用于进一步杂交。另一方面，如果控制性突出端特异性序列没从保护片 段切下，例如，由于核酸酶保护程序的核酸酶消化不完全，检测接头的靶特异性部 分和控制性突出端特异性部分将与保护片段杂交，而不能用于进一步杂交。在一优 选实施例中，含有核酸酶保护片段和结合的检测接头的复合物在下一步与含有信号 分子(如荧光色素、半抗原、酶和任何携带有可检测信号或产生信号部分的其它分 子)和对检测接头的控制性突出端特异部分有特异性的分子杂交。该报道试剂将优 先结合并标记那些核酸酶保护片段中的控制性突出端序列被切下的复合物(即该复 合物中检测接头的控制性突出端特异性部分可用于进一步与报道试剂杂交)。
夹心检测方法的其它许多变化是本领域技术人员所知道的。通过这些方法可在 有利实现结合或其它稳定性相互反应的条件下，将靶分子与靶特异性报道分子一起 培育，或将靶/检测接头复合物与报道试剂一起培育，并进行常规检测(见上)。例 如，可在约15℃至45℃(宜在室温上下)培育荧光寡核苷酸报道分子(浓度约 10nM-1μM或以上，优选约30nM以6XSSPE-T或其它缓冲液配制)和结合的靶分子约 15分钟至2小时或以上(优选约30-60分钟)。培育后，可任选地处理样品(如洗涤) 去除未结合的靶特异性报道剂，所用的处理条件凭经验确定，应能保留特异性反应 物完整，但去除非特异性结合物质。例如，可在与用于实现靶/报道物结合的条件 相似或比其更严谨的条件下洗涤样品1-10次或以上。
用靶特异性报道剂寻靶对初步杂交反应可提供另一层特异性，例如，当靶特异 性报道剂寻靶靶核酸酶序列的不同部位而非探针寡核苷酸时，或探针和报道剂抗体 识别靶抗原的不同表位时。另外，用靶特异性报道剂寻靶可能能够“调谐”反应的 灵敏度。例如，若某靶mRNA是低水平表达的相关表达模式的一部分，可通过使结 合的靶与几个(约2-5个或以上)靶特异寡核苷酸报道剂杂交，每个与该靶mRNA的 不同部分特异性杂交，来增强信号水平(信号放大)。
检测两种独立标记的能力得以在MAPS试验中增加控制类型。为具体锚位点(图 7显示3个典型的锚位点，每个含有多个基本相同的锚(A、B和C))设计的某些(约 10-100％)接头可具有附着于一端的一个标记(如荧光剂)。例如，可将罗丹明或Cy5 荧光剂连接在该接头的5’端。这种修饰后的接头称为“对照接头”。接头和对照接 头的混合物与锚结合后，将含有靶分子的样品与产生的探针阵列一起培育，可利用 携带了不同荧光剂(如荧光素或另一可检测标记如化学发光剂)的靶特异性报道剂 (或可用荧光剂或其它可检测标记直接标记靶分子)并可确定两种信号的比例。对照 接头的存在允许校准测定区内和之间功能性(如能与接头反应)锚的数目(即测定此 阵列各位点结合靶分子的容量，目的是使信号标准化)，作为定量结合的靶分子的 基础，帮助定位锚位点和/或提供一阳性对照，如当样品缺乏靶分子而致没有信号 时。本发明一实施例中，也可采用两种不同的标基(如荧光团)来检测两群不同的靶 分子，然而，通过空间分辨信号识别靶分子存在的能力得以采用一种标记检测不同 的靶分子。
独立检测标记(如能发射可鉴别波长的荧光素标记，如荧光素、罗丹明或不同 的高转化磷)能给本发明方法添加灵活性。例如，可用其自身的独特可检测标记直 接或间接标记两个或多个靶分子的每一个，除鉴定表面上靶分子的定位或凭借靶分 子所定位珠的大小鉴定靶分子外，这得以根据对标记(如发射颜色)的特异性特征检 测靶分子。本发明另一实施例中可分别测定某区域中一个位点的多个靶分子。例如 可检测含一组(基本上相同的)锚的某位点中的两个或多个(如2.3.4.5.6或以上) 靶分子，即可采用一组接头，各接头具有对相同锚特异的锚特异性部分和对不同靶 分子特异的靶特异性部分。如果采用一组(例如4个)接头四个接头均可结合一位点 上锚的成员，则4个不同的靶分子得以在该位点上结合起来，如果这些靶分子每一 个都用一不同的可鉴别标记物(直接或间接)标记，研究者可确定该位点中存在四个 靶分子的每一个。因此，一区域中的5个锚(一组锚)的阵列可用于上述情况来检测 多达20个不同的靶分子。图24和25说明了些种试验。类似地，在固体表面如珠 或流通装置上一位点内均匀分布或以所需方式分布着一种锚时可分别检测多个，例 如84个或更多的靶分子，珠的大小或分散情况等其它方面可用于提供关于靶分子 身份或靶分子组的信息。
具有不同靶特异性的多个接头(约2-50个或以上)与所述位点中的锚(或是一组 基本上相同的锚或一“混合位点”)的结合，本文有时称为“混合接头”，它形成了 本发明其它实施例的基础，将会为本领域技术人员所理解。例如在所述位点中锚可 结合于对多个不同保护片段有特异性的接头混合物，各接头对应于(特异于)感兴趣 的核酸(如mRNA)的不同部分。一位点存在多个不同的接头使得能大大提高检测样 品中低含量感兴趣的靶分子(如mRNA)的灵敏度。
可设计各位点使对应于mRNA不同部分的接头数目与样品中mRNA含量成反比 (以经验确定方式)。例如，若在初步实验中发现样品中感兴趣mRNA的量大大超过 第两种感兴趣mRNA，可调整对应于此两种mRNA不同部分的接头相对数目，以使对 应于各mRNA的信号相对强度基本上相同。即可调整信号强度使对应于第一种mRNA 的信号不超过对应于第两种mRNA的信号。以上方式可调整试验使其能同时测定样 品中含量大不相同的多种mRNA，平衡对应于各mRNA的信号强度。
在本发明另一实施例中，如上所述的位点可含有多个无关或不同靶分子或保护 片段的特异性接头，使得用一个锚阵列可检测数目大大增加的靶分子或保护片段。 例如，350个锚阵列的每个点含有10种不同靶分子的特异性接头，那么此阵列可 用于检测多达3500种靶分子。实际上这种安排使我们可将能检测低密度靶分子的 阵列转变成能检测高密度靶分子的阵列。
用本申请中所述的检测方法可顺次或同时检测一位点中结合的多个分子(如保 护片段)“检测接头”和“报道试剂”的讨论见以上关于复合性夹心型检测方法章 节。在一实施例中用第一套检测系统(如检测接头/报道试剂或其特异性检测探针) 检测所述位点的第一靶分子(如保护片段)，然后用常规方法(如提高PH以灭活含有 新产生化学发生信号的酶的报道试剂)去除或灭活第一套检测接头/报道试剂或探 针，并用对同一位点第两种靶分子有特异性的第二套检测接头/报道试剂或检测探 针检测第两种靶分子，按需要进行多轮检测。在另一实施例中，将第一套检测接头 /报道试剂或检测探针加入以上组合物中，但不去除或灭活，然后加入第二套检测 接头/报道试剂或检测探针。此例中，通过减去对应于第一靶分子的信号量可测出 对应于第二靶分子的信号量。另一实施例中，将第一和第二套检测接头/报道试剂 或检测探针基本上同时加入以上组合物中，用本文所述区别性检测标记分别检测。 本文所述任一检测方法中，检测接头可含有针对相同或不同报道试剂的特异性部 分。例如，若4种靶分子结合于某所述位点中的诸接头，4种靶分子各自的特异性 检测接头可以各含有针对某特异性报道试剂的特异性部分。因而，如上所述用4 种不同的报道试剂，当含有的4种检测接头与诸靶分子杂交后，诸靶分子即可依次 或同时检测出来。其它检测方法及上述方法的组合本领域技术人员将会明白。
当然“混合接头”对于含一个(非重复性)区域的表面也有其优点。
本发明另一实施例中，感兴趣的靶分子的特异性“锚”不与接头结合，直接与 靶分子结合。该靶分子进而可任选地与检测接头或与检测探针反应。
靶分子不论标记的或未标记的可用本领域各种常规方法检测(例如见Fodor等 (1996)，美国专利5,605,798；Pirrung等(1997)，美国专利5,143,854； Koster(1997)，美国专利5,605,798；Hollis等(1997)，美国专利5,653,939； Heller(1996)，美国专利5,565,322；Eggers等(1997)，美国专利5,670,322； Lipshutz等(1995)，Biotechniques.19；442-447；Southern(1996)，Trends in Genetics 12；110-115)。检测方法包括酶法检测、比色法、SPA放射图象、质谱、 电方法、吸光度或冷发光检测(包括化学发光或电发光)和采用显微颗粒作标记产生 的光散射检测。另外，可采用电荷偶合装置(CCD)或荧光显微镜(如扫描或共聚焦荧 光显微镜)或扫描系统CCD阵列或光电倍增管或用阵列为基础的检测技术(如可测 出测定区每10微米的表面电势或如果分辨率足够高可采用表面等离子体共振)或 者，一阵列可含有一标记(如一对能量转移探针如荧光素和罗丹明之一)，该标记可 通过能量转移给接头、靶分子或报道剂上的标记(或受修饰)而检测出。在荧光检测 体系中有荧光强度，荧光(Fp)时间分辨荧光、荧光共振能量转移和均匀性时间释放 荧光(HTRF)等种类。通过模式识别(对于每种特异性标记的靶分子通过其相对于其 它点或线的位置发现它的相应点或线)，然后标记物强度的定量检测可实现重复性 捧状密码样模式的分析。可常规生产和/或商品化购得用于分析一维或二维阵列的 棒状密码识别装置和计算机软件(例如见Rava等(1996)，美国专利5,545,531)。
可用于检测的另一方法是2-光子荧光，包括结合于阵列表面组分的内原性或偶 联荧光色素产生的荧光，通过紧密结合于阵列表面，例如紧密并置于基上形成阵列 的基质，或紧密并置于错分子或接头中包含的其它试剂或掺入该结合的复合体中而 增强。其它荧光方法或利用包括终身荧光、偏振、能量转移等。例如，这类方法允 许同时检测和区分同一位点内的多种靶分子在某些情况下区别结合标记物和未结 合标记物，不需要洗去阵列中未结合的标记物，因而有利于测定此阵列的迅速可逆 性或弱相互反应。
制备和使用本发明阵列的方法，包括制备本文所述的表面或区域合成或纯化及 附加或装配例如本文所述锚、接头、探针和检测探针等物质，以及检测和分析本文 所述被标记的物质，这是熟知和常规技术。除以上引用参数文献公开的方法外，可 参见Affymax、Affymetrix、Nanogen、Protogene、Spectragen、Millipore和Beckman 的专利(本发明所用的产品可从他们获得)分子生物学和蛋白质科学的标准教课书， 包括以上引用的和cozette等(1991)，美国专利5,063,081；Southern(1996)，生 物技术的目前观点(Current Opinion in Biotechnology)，7；85-88；Chee等(1996)， Science.274；610-614和Foder等(1993)，Nature.364；555-556。
附图简述
图1说明寡核苷酸的设计方案，其中有接头1含有针对锚1的特异性部分和针 对靶分子mRNA1的另一特异性部分，其中标记的检测探针1特异性针对靶mRNA1 的某序列，此序列不同于此靶特异性部分的序列。
图2说明含有15个测定区的表面，每个测定区含6种寡核苷酸锚组成的阵列。
图3说明受体结合试验接头的设计，其中接头的锚特异性部分通过生物素链霉 亲和素分子与探针部分(受体蛋白质)相连，该受体的特异性配体用荧光标记分子标 记。B为生物素，SA为链霉亲和素，Rec；受体蛋白，配体：该受体的天然或合成 配体。*结合于配体的荧光标记分子。
图4说明含有21个测定区的表面，各区再细分为16个亚区
图5a、5b和5c说明图4所示表面所组装成的三片。
图6为二测定区，每区含一线性探针阵列(或锚阵列)形式为棒状密码。
图7图解说明含3种锚(A、B和C)的一测定区，每种锚有多个拷贝(“组”)每 组锚的位置称为一“位点”。
图8说明在MAPS板上测定特异性逆转录酶产生的cDNA阵列。
图9说明采用核酸酶保护程序的试验(NPA-MAPS试验)。制备细胞或组织的RNA 样品为细波形线。在RNA样品中加入一组多核苷酸保护片段，绘制成粗黑色和淡色 线。保护片段的黑色section部分代表与特异性RNA靶分子互补并与其杂交的区段。 淡色部分代表突出端部分二与该互补序列毗邻但不与靶RNA互补序列。过量加入该 保护片段，所有存在的靶分子与保护片段杂交后，用适当的核酸酶混合物处理样品， 并用化学处理破坏不想要的未杂交RNA和未杂交多核苷酸。例如S1核酸酶可破坏 单链DNA。因此过量的保护片段被水解因为是结合保护片段的突出端未杂交部分。 加入核糖核酸酶(包括核糖核酸酶H)或在碱液中加热样品可水解RNA。剩下的是已 切下的保护片段的集合物，其反映了样品中曾经存在过多少各种靶RNA。用MAPS 杂交试验测定剩下的保护片段。
图10说明MAPS试验中的杂交特异性。
图11说明锚与接头结合的动力学。
图12说明两种寡核苷酸靶分子的MAPS试验。
图13说明灵敏度转移的定量测定。
图14说明4种接头/锚组合的解链温度测定。
图15说明采用NPA-MAPS的mRNA试验
图16说明采用NPA-MAPS的稀释曲线。
图17说明检测含磷酸酪氨酸残基肽的
图18说明绘制EST图谱试验的第一步：将对应于EST的接头装配绘制在MAPS 板基因锚阵列上。附着在微滴板16孔各孔表面的接头会有16种不同的寡核苷酸探 针排成4×4矩阵，第一位点有与第一EST序列某部分互补的寡核苷酸1。对待测的 16种EST也如此。
将从基因产生的cDNA或mRNA获得的EST加入所有16孔中，在适当条件下使 之杂交。因此，含16种EST序列之一的cDNA或mRNA将在安置有其互补探针的位 点装配。
图19说明绘制EST图试验的后续步骤：在MAPS板中加入探针寡核苷酸，此板 各孔接受对应于一种作图的EST的检测寡核苷酸。如用荧光成象作为检测方法，各 检测寡核苷酸与检测所用分子如荧光素交联。各检测寡核苷酸与一种EST互补，但 与EST一特异性探针不同，故与一种EST互补的探针和检测寡核苷酸二者可同时结 合。洗涤后，按图中编号各孔加入一检测寡核苷酸，即将含有与第一种EST互补序 列的检测寡核苷酸加入第一孔，如此等等。
图20a和b说明绘制图18和图19所示EST图试验的结果。检测寡核苷酸杂交 后，用适当的严谨性条件洗涤，用CCD-荧光摄影仪拍摄滴板的16孔。图20a显示 程式化后的结果。预计各EST-特异性检测寡核苷酸应标记受对应的EST特异性探 针抑制的mRNA或cDNA。例如探针5装配了该位点中含第五种EST序列的cDNA或 mRNA，故第5种检测寡核苷酸也应与同一位点中的cDNA或mRNA杂交。这是这些程 式化数据与各检测寡核苷酸标记相匹配探针的情况。此外，前三种检测寡核苷酸标 记受前三种探针抑制的cDNA或mRNA，显示这些序列位于同一基因。与此相似，最 后5种EST看来是相连的，图20b提供了从这些数据分派的连接。
图21说明图18-20所示探针，检测寡核苷酸和EST#1.2和6的关系。
图22说明一高通量试验。
图23说明制备扩增靶分子的方法。
图24说明采用检测接头和报道试剂的试验。
图25说明多重荧光剂的用途。
图26说明一高通量试验
说明THP-1细胞基因与两个样品细胞的空间安排(选自图26)。
图28说明采用信号弱化的试验。
图29说明在同一孔，例如基因组DNA作为标准化对照的孔中，测定相同样品 的基因组DNA和表达的RNA试验。左图说明单测定DNA，右图说明同时测定DNA和 GAPDH、RNA(在阵列的各角落中测定)。
图30和31说明测定表达的SNP。
图32-35说明试验的灵敏度和重复性。
图36说明本发明包括的一些试验构型的类型。
图37说明用PCR扩增核酸酶保护片段。
图38说明连接酶扩增核酸酶保护片段。
图39说明核酸酶保护扩增核酸酶保护片段。
图40和41描述同时测定同一样品中的蛋白质和mRNA的试验。
图42说明用聚合酶扩增核酸酶保护片段，说明用于检测SNP。
实施例
实施例1  杂交的特异性(见图10)
用喷墨分配器生产出通用MAPS板，Pixus系统(Cartesian Technologies Inc Irvine.CA)在微滴板各孔中形成相同的DNA坐标方格。所有寡核苷酸购自 Biosource International(Camarillo.CA)对于MAPS板，以如Key所示的模式(图 左侧)在每孔中分配7种不同的寡核苷酸锚。各寡核苷酸以含500mM磷酸钠PH8.5 和1mMEDTA的2μM溶液的10纳升液滴分配至二点到DNA结合板(Corning Costar) 孔中并使干燥。结合后，用50mM Tris PH8.1封闭诸孔，然后用含0.1％SDS的5× SSP缓冲液洗去未共价结合于表面的寡核苷酸。
将荧光标记接头寡核苷酸加入洗涤的板中，使其在含0.1％Triton X-100的6 ×SSPE中室温杂交30分钟。这是接头结合的一种优选方法，接头寡核苷酸合成时 Cy5衍生化处理，有25对碱基的区段与特异性锚定寡核苷酸互补。七套锚和接头 的序列如下(均为5’到3’)：
#1锚*：SEQ ID：1
TCCACGTGAGGACCGGACGGCGTCC
接头**：SEQ ID：2
GTCGTTTCCATCTTGGAGTCATAGGATACTGAGTGGACGCCGTCCGGTCCTCACGTGGA
RNA模拟物(小鼠C-juu)：SEQ ID：3
CTATGACTGCAAAGATGGAAACGACGATACTGAGTTGGACCTAACATTCGATCTCATTCA
检测寡核苷酸***：SEQ ID：4
TGAATGAGATCGAATGTTAGGTCCA
#2锚*：SEQ ID：5
CACTACGGCTGAGCACGTGCGCTGC
接头**：SEQ ID：6
CTAGGCTGAAGTGTGGCTGGAGTCTGCAGCGCACGTGCTCAGCCGTAGTG
RNA模拟物(小鼠MIP-2)：SEQ ID：7
AGACTCCAGCCACACTTCAGCCTAGGATACTGAGTCTGAACAAAGGCAAGGCTAACTGAC
检测寡核苷酸***：SEQ ID：8
GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG
#3锚*：SEQ ID：9
GTCAGTTAGCCTTGCCTTTGTTCAG
接头**：SEQ ID：10
ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGGGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG
RNA模拟物(小鼠GAPDH)：SEQ ID：11
CCTTCATTGACCTCAACTACATGGTGATACTGAGTGGAGAAACCTGCCAAGTATGATGAC
检测寡核苷酸***：SEQ ID：12
GTCATCATACTTGGCAGGTTTCTCC
#4锚*：SEQ ID：13
GAACCGCTCGCGTGTTCTACAGCCA
接头**：SEQ ID：14
CTACCGAGCAAACTGGAAATGAAATTGGCTGTAGAACACGCGAGCGGTTC
RNA模拟物(小鼠L32蛋白)：SEQ ID：15
ATTTCATTTCCAGTTTGCTCGGTAGGATACTGAGTGAGTCACCAATCCCAACGCCAGGCT
检测寡核苷酸***：SEQ ID：16
AGCCTGGCGTTGGGATTGGTGACTC
#5锚*：SEQ ID：17
CTCGTTCCGCGTCCGTGGCTGCCAG
接头**：SEQ ID：18
CTGGCAGCCACGGACGCGGAACGAG
#6锚*：SEQ ID：19
CGGTCGGCATGGTACCACAGTCCGC
接头**：SEQ ID：20
GCGGACTGTGGTACCATGCCGACCG
#7锚*：SEQ ID：21
GCGCGCCGCGTTATGCATCTCTTCG
接头**：SEQ ID：22
CGAAGAGATGCATAACGCGGCGCCG
*合成的锚通过C12臂以酰胺键结合在5’端。
**合成的接头通过Cy5结合在5’端。
**合成的检测寡核苷酸通过生物素结合在5’端。
将一接头或接头混合物(如图中所示)成堆加入各孔中(标为“all”是将所有7 种接头的混合物回到该孔中)。培育和用5×SSP洗3次后用Tundra摄象机(IRI， St.Catherines Ontario)摄取图左部分所示的荧光图片。可见接头通过与其互补的 锚特异性结合，自身组装至该表面。
重复此过程除了每孔分配8种不同的锚外，并且接头随后优先与其结合，在24、 96、384、864或1536孔板的每孔中用36，64种等不同的锚重复整个过程。
实施例2  结合动力学(见图11)
显示不同浓度Cy5衍生接头1号与其固定的互补锚的杂交率。如图1制备通用 MAPS板，除每孔有4个点结合锚1外。室温在含0.1％吐温20的5×SSP中培育， 用5×SSP洗孔三次，测定结合的荧光。用Tundra摄象机拍摄此板的荧光照片，扣 除背景计算出各孔中每个点的综合荧光强度。以一式二份二个孔每孔中4个点综合 强度的平均值和标准差作图。
实施例3  荧光接头
用一种寡核苷酸锚按照上述方法点在每孔中一个点(上两排孔)，4个点(中间4 排孔)或16个点(下两排孔)产生通用MAPS板。通过实施例1所述优选方法使每孔 结合互补的荧光标记接头。清洗用Tundra拍摄的该板荧光照片后，各点的荧光量 报告为有多少功能性接头已与靶分子杂交。重复点测到的信号量是高度重复性的。
实施例4  结合曲线
在实施例3所述制备的板中加入不同浓度的靶寡核苷酸，已结合的接头含有与 该靶分子某部分互补的25聚序列。靶分子溶于含0.05％SDS的5×SSC中总体积为 30或100微升。给此板加盖50℃培育过夜。当靶分子与固定的接头杂交后，用化 学发光优选方法显影靶分子。加入30nM的含有与该靶分子不同部分(并非与接头相 同部分互补)互补的25聚序列生物素化检测寡核苷酸，可在洗去过量的未结合靶分 子之后30分钟加入生物素化检测寡核苷酸，或可与靶分子一起加入杂交过夜。检 测寡核苷酸结合后用5×SSC洗表面二次，用含0.1％吐温20和1％PEG(SSPTP)的1 ×SSP洗一次，加入以SSPTP配的1∶50.000稀释的250μg/ml辣根过氧化物酶偶 联的链霉亲和素(HRP：SA购自Pierce.Rockford，I11)室温5小时。用SSPTP洗各 孔4次，用Super Signal Ulfra reagent(Pierce)洗一次，然后培育。5分钟后用 Tundra摄象机收集发光照片，例如可积累CCD阵列中的图象5分钟，某些孔内靶 分子浓度低至5×10-13M水平也可显现。靶浓度约10-10M时信号量通常达到饱和。 重复点测得的信号量有高度重复性。
实施例5  两种寡核苷酸试验(见图12)
显示采用上述优选方案时两种不同靶寡核苷酸的MAPS杂交试验结合曲线用4 种不同寡核苷酸锚在每孔中各点4处制备用MAPS板。对于第二和第四号锚，将其 互补接头寡核苷酸自身装配到所述表面上。以所示浓度每孔40微升加入两种靶分 子，50℃培育过夜，通过结合各靶分子特异性生物素化检测寡核苷酸，然后加入 HRP：SA并化学发光摄影显现各靶分子结合的量。下图中测定了显影强度。采用 Tundra Imager包中软件扫描上图所示箭头之间线的显影强度。最低浓度1.1pM的 靶分子，扫描图象显示各点有很明确的高斯(gaussian)峰，而最右侧样品靶浓度为 零未见可辨别的背景峰。
实施例6  灵敏度迁移(见图13)
可采用MAPS杂交试验通过使一组寡核苷酸结合于表面并标记它们来测定其浓 度。此试验对于中等或低浓度寡核苷酸工作良好，此例中可鉴别两种样品，因为如 一样品含更多寡核苷酸将结合得更多。另一方面，如果寻靶寡核苷酸浓度对该表面 而言已饱和(如高到足以占据全部结合位点)那么浓度再高也不可结合得更多，以至 不能测定其含量。然而，可通过加入未标记的竞争性配体来迁移靶分子的结合曲线。
获得的四种不同靶寡核苷酸结合数据均在3nM浓度时饱和了该表面(达到最高 结合)。通过向所有孔加入未标记的竞争性靶分子，标记的寡核苷酸结合曲线发生 迁移，以至浓度较高时结合较少，从而提高达到饱和的水平。例如在靶分子1和3 中，但不在2和4中加入竞争性寡核苷酸，只对靶分子1和3迁移了此试验的灵敏 度。用这种方法可在一个试验孔中检测更广泛不同浓度的靶寡核苷酸，如果已预知 寡核苷酸的相对量。
可如上所述确定靶寡核苷酸之一的结合数据。图13显示该试验中加入竞争性 寡核苷酸使结合曲线迁移可用于测定较高浓度的靶分子。
实施例7  四种探针的解链温度(见图14)
将随温度升高MAPS试验测定的4种不同荧光标记接头寡核苷酸与寡核苷酸锚 特异性杂交的量绘制成图。先使4种寡核苷酸以300nM浓度50℃杂交1小时，然 后用无探针的SSC洗涤诸孔，如上所述通过荧光法(50℃点)测定结合量，再55℃ 培育此表面30分钟，测定结合的荧光，如此对所有温度进行测定。
实施例8  检测方法
直接比较了两种检测方法。在含有4种寡核苷酸锚附着的每孔4个点的MAPS 板中每孔加入两种寡核苷酸，此两种寡核苷酸均含有共价结合的Cy5部分或含有生 物素基团。按综述所述进行表面荧光测定和荧光接头测定。按MAPS试验所述利用 随后加入的HRP：SA和化学发光底物进行化学发光测定。产生的信号数量级大约相 同。然后，含有各孔分开的微滴板的几何形态，偶尔产生的液体气泡或液体的混浊， 表面荧光摄像中的反射光都可能干扰数据的解释。
实施例9  化学发光产品
作为MAPS试验的检测程序，应比较可得到的作为辣根过氧化物酶化学发光底 物的两种产品。按实施例8准备MAPS板与生物素化接头寡核苷酸一起培育，加入 碱性磷酸酶偶联的链霉亲和素(A/KPhos：SA)或HRP：SA洗涤后，诸孔加入CDP- Star(Tropix)和A/KPhos：SA或ECL和HRP：SA。按制造商提议用SA衍生的酶和底 物标记，用于Western印迹的标记。这两种(及其它可得到的)底物均可用于评估与 MAPS板杂交的寡核苷酸。
实施例10  0.6mm分辨率
准备每孔含有4种不同的寡核苷酸锚每孔各1个点，节距(中心之间的距 离)0.6mm的MAPS板，测定当前MAPS试验系统的分辨率。如上所述使Cy5衍生接 头或生物素化接头杂交并检测和扫描，对于表面荧光测定分辨率较高(节距可能要 减少)对于化学发光检测方法，不能完全分开相邻的点。也许计算机去卷积可明确 分辨这种相隔的单个峰。
实施例11  测定核酸酶保护
在测定核酸酶保护方案的杂交和核酸酶处理最佳条件的试验中，采用 Ambion(Austin Texas)的试剂盒提供条件，缓冲剂和酶。以三种缓冲液之一制备8 个样品。Hyb Buff1是100％杂交缓冲液(Ambion)；Hyb Buff2是75％杂交缓冲液和 25％杂交稀释液(Ambion)；Hyb Buff3为各50％；合成含60个残基与测试mRNA互补 的70寡核苷酸(Biosource International Camarillo CA)并按Ambion的 Psoralen-biotin标记法提出的方案用Psoralen荧光素(Schleicher and Schuell Keane，NH)标记。简言之，将保护片段以TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA PH8) 稀释至50μg/ml，取20μl煮沸10分钟，置冰水中快速冷却，加入4微升用DMF 配的130μg/ml Psoralen一荧光素，用手持长波长UV光源照射样品90℃45分钟 用饱和丁醇抽提去除游离的Psoralen一荧光素。所用mRNA是GAPDH反义mRNA，用 T7启动子和MaxiScript试剂盒(Ambion)从反义质粒(pTR1-GAPPH-小鼠反义控制模 板，Ambion)制备。分别合成60聚互补部分作为短保护片段并类似地标记。保护片 段的序列如下：
全长保护片段，SEQ ID：23
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTC TAA
短保护片段，SEQ ID：24
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTT
混合20nM的保护片段和60nM的GAPDHmRNA，最终体积10微升，22℃或37℃ 杂交二小时，杂交后按制造商说明加入200微升核酸酶混合物(Ambion核酸酶保护 试剂盒1∶200核酸酶混合物稀释液)在相同温度下再培育30分钟，加入杂交抑制 液(Ambion)停止水解，乙醇沉淀寡核苷酸并洗涤。加入10微升1X凝胶加样缓冲 液(Ambion)，在15％TEB尿素凝胶上分离。使凝胶在流动缓冲液中转动30分钟。 放在塑料板上，用能选择激发和发射光波长的荧光滤板Tundra摄象机拍照。在CCD 阵列上积累图象2分钟。最佳条件是37℃在Hyb Buff2中或22℃在Hyb Buff3中培 育样品。这些样品中没有残留可测到的全长保护片段，但可见数量明显的大小与短 保护片段看来相同的全长保护片段的一部分。
实施例12  NPA-MAPSR mRNA试验(见图15)
采用完整的NPA-MAPS方案，杂交和核酸酶处理条件与实施例11所述相同，测 试了10份样品，均含有相同量的70聚寡核苷酸保护片段和不同量的GAPDH mRNA。 将10微升以50％杂交缓冲液在含0.08mg/ml酵母菌RNA(Ambion)的50％稀释缓冲液 配的杂交样品加热至90℃6分钟，简单离心后加热至70℃5分钟，让其冷却至19 ℃，培育19小时。取各样品60微升等份作MAPS试验。样品加入2微升10NNaoH和2微升0.5MEDTA加热至90℃15℃分钟，37℃15分钟，静置室温20分钟。然后 用2微升10MHC1和12微升含2MHEPES PH7.5的20×SSC中和样品，加入20nM 该保护的特异性生物素化检测寡核苷酸与1微升10％SDS。混合样品加热至80℃5 分钟。向MAPS板二孔中移入各样的35微升二等份(每份样品分成二份在MAPS板上 一式二份测定)。按标准MAPS方案，采用针对已附着保护片段的特异性自身装配的 Cy5衍生接头制备此板。给MAPS板加盖，50℃培育过夜，如前所述进行检测和发 光测定。最后一个样品试验期间不加核酸酶作为对照，以显示保护片段单独如何用 MAPS检测。此图下部分提供了上排孔的扫描强度(通过图象分析)样品中存在的 GAPDH mRNA量(各样品等份加入MAPS板后一式二份孔中的量)列于图中。
用于MAPS板测定的寡核苷酸如下：
锚*：SEQ ID：25
CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC
接头**：SEQ ID：26
CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG
保护片段(与GAPDH的小鼠反义的mRNA互补)：SEQ ID：27
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTC TAA
检测寡核苷酸***5’端标记为生物素：SEQ ID：28
AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT
*合成的锚通过C12臂以酰胺键结合在5’端。
**合成的接头通过Cy5结合在5’端。
**合成的检测寡核苷酸通过生物素结合在5’端。
实施例13  稀释曲线NPA-MAPS(见图16)
以数量表示实施例12和图15中所示资料并绘制成稀释曲线。将每种mRNA浓 度一式二份两孔的所有8个点的平均值和标准差绘成图。
Fraction Bound＝Max Bound*1/(1+IC50/L)
其中Max Bound是饱和时的最大结合，Fraction Bound是配体浓度时的结合时， L和IC50是Fraction Bound为Max Bound之一半时的配体浓度。图中以红点表示 曲线，IC50的最佳拟合值见图中标记为IC50＝4.2。
实施例14  小鼠肝脏RNA总提取物中GAPDH mRNA的NPA-MAPS试验
用NPA-MAPS试验测定了小鼠RNA总提取物中的GAPDH mRNA，并制作稀释曲线。 用Qiagen试剂盒制备小鼠肝脏的总RNA，以含0.5M醋酸镁的70％EtOH沉淀RNA， 并重悬于含0.05％SDS和1-8nM保护片段的10微升5×SSC中，加入的保护片段是 长70个碱基，其中60个碱基与小鼠GAPDH互补的寡核苷酸，采用与小鼠GAPDH mRNA 互补的片段(保护片段)或用此序列的互补片段作为阴性对照(反义片段)。
加热含保护片段的RNA样品至90℃5分钟，然后使样品至70℃并慢慢冷却至室 温(Promega)，置19℃30分钟，加入1.6微升10N NaoH和2.7微升0.5M EDTA中 止反应。加热样品至90℃15分钟，然后37℃15分钟，以变性破坏RNA，用1.6 微升10M HCl中和，在含0.05％SDS并加有200mM HEPES PH7.5r 5×SSC(加入 30nM生物素化检测寡核苷酸)中MAPS板上培育过夜。如上所述洗涤并用SA-HRP显 色。信号量的减少与小鼠RNA量(各样品含500.170.50.5或0.5μg的小鼠总RNA) 的减少相平行。试验包括的两个对照品中没加S1核酸酶。只观察到互补性保护片 段的信号。
所用寡核苷酸为：
反义对照(与实施例12相同)
锚*：SEQ ID：25
CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC
接头**：SEQ ID：26
CTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG
保护片段(与GAPDH的小鼠反义的mRNA互补)：SEQ ID：27
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGCTTGTC TM
检测寡核苷酸***5’端标记为生物素：SEQ ID：28
AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCAT
有义GAPDH mRNA样品
锚*：SEQ ID：25
CGCCGGTCGAGCGTTGTGGGAGCGC
接头**：SEQ ID：29
ATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG
保护片段(与GAPDH的小鼠反义mRNA互补)：SEQ ID：30
AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATGCATTGCTGACAATCTTGAGTGAGTTGTCATATTTCTCGGCTTGTC TAA
检测寡核苷酸***：SEQ ID：31
CGAGAAATATGACAACTCACTCAAG
*合成的锚通过C12臂以酰胺键结合在5’端。
**合成的接头通过Cy5结合在5’端。
**合成的检测寡核苷酸通过生物素结合在5’端。
实施例15  核酸保护MAPS试验与对照
提取小鼠肝脏mRNA，按实施例14所述进行核酸酶保护，不同的是GADPH特异 性保护片段含有与小鼠GAPDH互补的60个核苷酸，该片段3’端有15个“突出的” 核苷酸与靶分子不互补。杂交和核酸酶消化后，剩下的保护片段如实施例14所示 与MAPS板杂交，例外的是采用两种不同寡核苷酸检测片段检测固定的保护片段。 一个检测片段与该保护片段的GAPDH特异性部分互补，另一对照片段与该保护片段 的15个碱基突出部分互补。将各检测片段加到不同的重复样品(即不同孔中)上， 两种检测片段可用相同的检测分子标记。在本实施例中两种片段用HRP标记。不加 核酸酶，可观察到两种检测片段产生的信号。当核酸酶消化时，只能测到对应于 GAPDH序列的信号。GAPDH特异性信号的量比缺乏核酸酶消化时所见的量少，因为 加入的保护片段相对于存在的GAPDH mRNA是过量的。这使得GAPDH mRNA的量被限 制于保护性杂交，这样形成的双链杂交体量(因此保护片段的量受到保护不被核酸 酶消化)可反映mRNA的量。当反应混合物中无mRNA时，加入核酸酶也不可能测到 信号。以上发现证明如希望的那样该试验的杂交和消化步骤发生了。
当所述试验中加入了对应于各种靶分子的保护片段时，各保护片段可含有相同 的15个碱基的突出部分，这得以用一种检测片段测定所有样品的残留突出物。
实施例16  筛选能改变疾病状态相关基因表达的转录试验
采用人肿瘤衍生的细胞系，发现其此正常细胞以较高水平表达30种基因(即这 30种基因比与正常细胞相比可表达更多mRNA，然后表达更多该基因编码的蛋白质。 转录试验通过测定每种基因产生多少mRNA而测定有多少基因被使用)。用MAPS板 作核酸酶保护试验(NPA-MAPS)测定8800种化合物，观察在存在这些化合物时培养 细胞能否降低30种相关基因中的某些基因表达而不影响6种正常(组成型“管家”) 基因的表达。具有此作用的化合物可能用于进一步开发治疗这种肿瘤的药物。在 100块96孔聚苯乙烯板的每一孔中加入1万-10万个细胞，培养细胞2天直至细胞 覆盖各孔表面。每块板有8孔不加化合物让细胞生长，其余88孔加入不同化合物 测定其作用。一次用100块板，可测定或筛选8800种化合物。在存在化合物时培 养细胞24小时，然后收获细胞用于试验。按照制备96孔板样品中RNA(如按照 Qiagen RNeasy96试剂盒)的说明书处理各板中的细胞。制得RNA后，用NPA-MAPS 方法测定36种不同mRNA每一种的量，包括30种相关基因和6种正常“管家”基 因。各孔中加入36种DNA寡核苷酸保护片段，各对应于一种感兴趣基因，在选定 的严谨条件下使其与它们的靶mRNA序列杂交。然后加入S1核酸酶以破坏过剩的未 杂交DNA，并化学处理样品破坏RNA。剩下的36种基因每一种的寡核苷酸保护片段 与每份样品处理细胞中存在多少mRNA成比例。
通过每孔加入36种不同的接头寡核苷酸，制备100块96也板，每块板每孔中 含有多个36种不同寡核苷酸锚组成的阵列。接头在每孔表面自身装配将该通用板 转变成MAPS板，其含有该36种寡核苷酸保护片段每一种的特异性探针。各接头具 有针对36种锚之一的特异性部分和针对36种保护寡核苷酸之一某区段的特异性部 分。将100块样品板每孔的寡核苷酸样品加入100块MAPS板的对应孔中。在选定 的严谨条件下杂交后，加入针对各靶分子结合有化学发光酶的检测寡核苷酸，这样 每孔各特异性点发出的光与样品中存在多少mRNA成比例。感兴趣的是显示相关基 因数量减少但不影响6种管家基因的孔。对这些样品而言加入细胞的化合物可能是 开发抗肿瘤药物的起点。
实施例17  诱导型和组成型基因表达
基本上如实施例14所述，制备未感染(对照)或感染腺病毒一小时后(感染的) 的小鼠肝脏RNA。每份样品用60微克肝RNA，一式二份准备。各试验孔含三套一式 二份位点，对应于上述三种基因，各位点含有一寡核苷酸锚，与一接头结合，该接 头含有与一保护片段互补的探针，该保护片段对应于三种基因之一。基本上按图 12所述进行核酸酶保护MAPS试验，并收集图象和扫描。显示收集的原始图象资料 和三种mRNA靶分子之一二孔的强度扫描。扫描线上的数字是每种情况的综合强度 值和标准并(n＝4)。未预料到管家基因GAPDH会改变，显示感染样品中中等程序增 加1-3倍，但无统计学意义。M1P-2和C-jun的转录分别提高了4和6倍。这些发 现证明M1-2P和C-jun两种基因与对照组成型表达基因GAPDH相比较在对腺病毒感 染的反应中表达增加。
实施例18  筛选选择性抑制酪氨酸或丝氨酸激酶的化合物的酶试验(见图17)
激酶是能使磷酸结合于蛋白质的酶。许多激酶已显示能刺激正常和肿瘤细胞的 生长。因而可利用能抑制特异性激酶(但不是所有的激酶)的化合物来测试激酶是否 参与了致病机制，如果是，该化合物可作为药物开发的起点。例如，五种酪氨酸激 酶：src、Lck、fyn、Zap70和yes参与了刺激细胞生长或调节炎症反应。各激酶 的底物已部分得到鉴定如含有一个酪氨酸的短肽。某些激酶的底物特异性有所重 叠，因此，不同激酶可能同等磷酸化某些肽，但优先磷酸化其它肽。对于该项五种 激酶，选出的36种肽底物显示了特异性谱和特异性重叠。
采用100块96孔板，每孔含36种通用性寡核苷酸锚。制备36种接头将该通 用性寡核苷酸阵列(只有锚)转变成含肽底物的阵列。合成36种肽底物并将各肽通 过酰胺键共价结合于含5’氨基的一寡核苷酸。这些寡核苷酸含有能与锚特异性杂 交的序列。将肽/寡核苷酸接头加和MAPS板的所有孔中使其身安装在孔表面上。
为了筛选，各孔加入适当浓度的五种激酶(尽可能平衡底物磷酸化的速度)和 8800种待测化合物之一。测定各化合物直接抑制分离的酶的能力。加入只结合酪 氨酸已磷酸化的肽的标记的抗体来检测备阵列中肽磷酸化的数量。感兴趣的是显示 某些点但不是所有点上磷酸酪氨酸降低的孔。可进一步测定这些孔加入的化合物作 为所测定的某些激酶的可能选择性抑制剂。
此试验方案见图17的上图。制备一种嵌合性接头分子，该分子中与一种锚之 一互补的25对碱基寡核苷酸与酪氨酸磷酸激酶的肽底物交联。该嵌合型寡核苷酸 一肽底物可自身安装在寡核苷酸锚阵列上。用此激酶磷酸化该嵌合体的肽部分。使 进行酶促反应后用结合了检测荧光团或酶的抗磷酰酪氨酸或抗磷酰丝氨酸抗体测 定此肽磷酸化的量。
此试验的结果见下图，采用同质双功能交联接头DSS(Pierce)将寡核苷酸接头 的5’氨基结合于合成的含磷酰化酪氨酸的肽的N端。此肽序列的单字母为 TSEPQpYQPGENL(SEQ ID：32)，其中pY代表磷酰酪氨酸。直接用此嵌合体或先置于 PH14，60分钟以部分水解酪氨酸的磷酸基团。磷酰化或部分磷酰化的嵌合分子在 所示浓度自身安装在MAPS板中互补性锚上1小时。用含0.3％BSA的SSPTP洗涤和 封闭诸孔后加入用SSPTP作1∶3000稀释的偶联有HRP的抗磷酰酪氨酸抗体 (Upstate Biotechnology的抗体4G10.Lake Placid.NY)1小时，用化学发光底物 SuperSignal Blaze检测结合抗体的量。将显示的图象在CCD阵列上积累1分钟。 如预期那样，发现结合于寡核苷酸一肽的磷酸量有差别。这种差别是测定用不同的 可能抑制剂处理时如何活化一系列激酶的试验的基础。
实施例19  检测SH2功能域和磷酰肽之间相互反应的选择性抑制剂的结合试验
SH2功能域作用是某些生长调节蛋白质的停靠亚单位。此功能域能以不完全的 特异性结合含磷酰酪氨酸的蛋白质或肽。即某些磷酰酪氨酸肽能特异性结合一个或 几个SH2蛋白，而其它能广泛结合多种SH2蛋白。
用于此试验的接头是共价结合于寡核苷酸的磷酸化肽。选择肽的能结合一组 SH2蛋白的部分，此种接头可将通用MAPS板转变成含有该组SH2蛋白的特异性配 体的板。制备含有这些配体的100块96孔MAPS板。分离这些蛋白质并用例如Cy5 荧光分子标记。
为了筛选SH2功能域/磷酸肽相互反应的抑制剂在100块96孔MAPS板的每孔 中加入该组标记的SH2蛋白，并且每孔中加入不同的待测化合物。检测每种化合物 单独对SH2蛋白与其磷酰肽相互作用的影响。此试验是测定结合的SH2蛋白与结合 于各表面的肽接头相结合时产生的荧光。对于显示某些点而不是所有点的荧光减少 的孔，可进一步测试此孔中所加的化合物，是否可作为SH2停靠的推定选择性抑制 剂。
实施例20  高通量筛选(见图22)
用高通量MAPS板显示了对一次实验96孔的信号检测，测定了80孔中16份重 复样品与同一寡核苷酸的杂交。如图所示，1280个杂交试验的重现性很高。最左 和最右柜作为标准化该寡核苷酸不同浓度时所产生信号的对照。
以相似方式，每孔可检测16种不同的寡核苷酸并在此板的80个不同孔中重复 此测定，当然每孔可测定更高数目的不同寡核苷酸或其它探针(如100种核苷酸探 针)，多块板可同时测定(如100块96孔微滴板)可对每份样品进行大量测定(如在 后一情况时，约100种不同试验)可同时测定大量样品(如在后一情况时，约96×100 或9600个不同样品)提供了非常高的处理量。
实施例21 制备扩增的靶分子(见图23)
通过在引物寡核苷酸的5’端引入一化学修饰，使PCR引物(引物1)结合于一固 相载体(如珠或反应管)。此引物从5’-3’含有该化学修饰，限制性酶切位点和与感 兴趣的靶分子(如感兴趣mRNA的cDNA拷贝)互补的序列。作为PCR引物，采用结合 的引物1加引物2(从5’-3’含有针对检测寡核苷酸的特异性序列和与靶分子而不是 引物1的不同部分互补的序列)进行PCR，扩增靶DNA，PCR扩增后洗涤扩增的靶DNA 去除过量的反应物质，并用对引物1上限制性位点有特异性的限制性酶切割使靶 DNA从固相载体上释放下来。扩增的引物也释放入液相中。可采用加热和/或化学 方法灭活限制性酶并使双链DNA产物变性。然后可使释放的单链DNA靶分子接触含 有锚和/或接头的表面，并可用与引物2的特异性检测序列互补的检测寡核苷酸检 测此靶分子 。    
实施例22 制备扩增的靶分子
通过在引物寡核苷酸的5’端引入一化学修饰，使PCR引物(引物1)结合于一固 相载体(如珠或反应管)。此引物从5’-3’含有该化学修饰，可被蛋白酶切断的肽序 列和与感兴趣的靶分子(如感兴趣mRNA的cDNA拷贝)互补的序列。除了肽，任何其 它可被特异性切断的元件也可使用。如实施例21所述，PCR扩增后，变性和(任选) 洗涤仍结合于固相载体的PCR产物，使其成为结合于载体上的单链分子。可切断此 洗涤的结合分子并释放(如用适当的蛋白酶处理)下来，与含有锚和/或接头的表面 接触。或者，使扩增的靶分子链释放，变性后，与含有锚和/或接头的表面接触。 或者只扩增靶分子的一条链与接头接触(如杂交)，这样消除了与扩增靶分子的反向 链竞争杂交，从而降低了本底。可设计出对扩增靶分子两条链之一或二者具有特异 性的接头。
实施例23  采用检测接头和报道试剂的试验(见图24)
对含有感兴趣mRNA的样品进行核酸酶保护程序，用作保护片段的寡核苷酸含 有靶特异部分和与该mRNA不互补的控制性突出端部分。核酸酶消化后，如需要可 切下该控制性突出部分，见此图右侧说明，使产生的核酸酶保护片段与检测接头杂 交，此接头含有靶特异部分和控制性突出端特异部分，此图左侧所示的试验中，检 测接头的控制性突出端部分与保护片段剩余的控制性突出端序列杂交。在该试验以 后的步骤中，一报道试剂(其含有能与该检测接头控制性突出端特异部分反应的部 分)与此复合物相互反应。此图左侧所示试验中，此报道试剂与仍有的能进行杂交 的检测接头控制性突出端特异部分杂交。依靠此报道试剂产生的信号可检测到此复 合物。相反，此图右侧所示试验中，该报道试剂不能结合此复合物，因为基没有可 杂交的互补序列，因此没有该复合物的相关信号。
本发明的许多试验中，报道试剂可与检测接头中的任何序列反应，不限于针对 控制性突出端的特异性序列。
实施例24  多重荧光团(见图25)
图25显示含有五个位点A-E的某区域，各位点含有基本上相同锚的A-E的不 同组。与位点A处锚杂交的有4种不同类型的接头，各含有对锚A的特异部分。然 而，各锚含有针对靶1、2、3或4的不同的靶特异部分。因此，当靶分子与锚/接 头复合物杂交后，靶分子1、2、3或4就可能定位于位点A上。类似的，四种不同 的接头可与位点B杂交，每接头含针对锚B的特异部分，但其靶特异部分是针对靶 分子5、6、7或8的以相似方式，靶分子9-12可与位点C结合，靶分子13-16与 位点D，靶分子17-20与位点E结合。如用不同的独立的可检测荧光团，如高转化 磷直接或间接标记每种靶分子就可分别检测5个位点上的所有20种靶分子。
实施例25  高通量方式的试验
此实施例中，采用本发明的转录试验以为高通量筛选作准备的方式，检测和定 量基因表达模式的变化，自动化进行该试验的所有步骤。不具体叙述常规洗涤步骤， 所有反应按本领域所知和/或本文所述常规程序进行。
在96孔V形底微滴孔板上培养，THP-1单核细胞，每孔5万或15万个细胞， 细胞不处理或用佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸(PMA)分化48小时，然后用脂多糖(LPS) 激活4小时。处理后以异硫氰酸胍裂解细胞，冻存直至需要时用结合生物素聚dT 的链霉亲和素顺磁颗粒获得mRNA。或者用三种试剂(Sigma Chemical Co.，St Louis， MO)抽提获得总RNA。对含有mRNA或总RNA的样品进行核酸酶保护程序，采用13 种60聚单链寡核苷酸的混合物作为DNA保护片段，这些单链寡核苷酸各自从5’- 3’含有：针对感兴趣的13种靶分子(GAPDH。IL-1 TNF-α，组织蛋白酶G、COX-2、 周期蛋白-2、波形蛋白、LD78-β、HMG-17、骨桥蛋白、血小板球蛋白、血管紧张素 或肌动蛋白)之一的特异性25聚体、-10聚臂、针对共同寡核苷酸检测探针的特异 性25聚体和15聚共同控制性突出端序列。mRNA就此转变成此试验所测出的“对 应的DNA保护片段”的化学计量，对照实验中这些对应的DNA保护片段与针对控制 性突出端序列的特异性探针一起培育，显示基本上只有针对感兴趣mRNA分子的特 异性序列存在于该对应的保护片段中，如所预计的那样，如果发现核酸酶消化时。
按本发明方法准备好表面，96孔DNA结合板的每孔中置有一16种不同25聚寡 核苷酸锚的阵列。采用14种不同的锚，一种锚用于此阵列四个角中的3个，采用 13种不同的锚，各自位于此阵列的其余位置。然后使该锚以确定的正交模式与60 聚寡核苷酸接头杂交，每个接头从5’-3’含对应于13种感兴趣的靶分子之一的25 聚体、-10聚体臂和针对锚之一的特异性25聚体。这样，此多种重复的16点阵列 的各点在阵列中的确定位置(位点)定位了十三种靶特异性接头之一。见图18此正 交阵列说明。对应于GAPDH(一种组成性表达的管家基因，用作内部标准化对照)的 接头位于各阵列中的三个位点。对照实验表明，此实验所用的接头以及保护片段和 检测寡核苷酸显示了所需的特异性。
使上述含有制备的对应保护片段混合物的样品与此锚/接头阵列杂交。采用未 处理或经诱导培养物产生的样品。然后，通过与标记的检测寡核苷酸杂交检测各位 点是否存在杂交的保护片段和数量。为了标准化各位点的信号量，用适当量的本文 所述阻断性寡聚物稀释检测寡核苷酸。加工各位点的信号量并按对照GAPDH的信号 标准化。8份重复样品以及三次不同日期的独立实验制备的样品所获数据有再现 性。下表显示一次实验中13种转录物相对丰度的小结。
                       相对密度(105细胞/孔) 基因 对照 诱导的 比率 平均值 CV(n＝16) 平均值 CV(n＝16) GAPDH IL-1 TNF GAPDH 组织蛋白酶G COX-2 周期蛋白-2 波形蛋白 LD78 HMG-17 骨桥蛋白 血小板球蛋白 GAPDH 血管紧张素 肌动蛋白 空白 10110 527 229 9591 10394 415 1729 25641 1298 8286 5604 -53 10299 3575 12741 108 7％ 36％ 35％ 11％ 31％ 39％ 23％ 25％ 39％ 19％ 42％ - 13％ 28％ 27％ - 9833 8124 2249 10031 19648 3557 2960 71074 13437 2405 19053 31761 10136 6561 21802 234 9％ 38％ 36％ 17％ 46％ 25％ 25％ 20％ 20％ 20％ 46％ 23％ 12％ 31％ 23％ - 0.97 15.40 9.80 1.05 1.89 8.58 1.71 2.77 10.35 0.29 3.40 ＞100 0.98 1.84 1.74
实施例26  多重阵列板数据定量的计算机算法
一种优选的算法能找到MAPS板所有点的位置并自动计算出各数据点信号幅度 的最佳拟合估计值。优选用计算机程序执行此算法。
1-选择小部分图像数据40×40盒，含该图像各像素(图像单元)的强度值，此 图像包括被查的第一孔。
2-用16种未知物确定计算各像素位置预期强度的函数，这些未知物是13个 不同微阵列点每一点的幅度(即DNA阵列各位置真实信号有多亮)。对于每孔中 4×4(＝16)点有13个点如此，因为16个点中的某些是同一靶分子的重复点。
X偏移和Y偏移确定此具体孔中4×4点阵列的确切位置。
此孔中图象的背景强度。
各像素位置的此函数计算出该像素和各点之间的距离，通过点幅度乘以所述距 离的脉冲反应函数，增加了各点对该像素观察强度的贡献。对于所用图像，通过高 斯和相应(常量)半径的Lorentzian之和确定该脉冲反应函数。
3-通过快速猜测诸参数值开始对当前的孔进行拟合。为此计算此图像预计有 点子的16个区域的平均图像强度。减去这16个平均值的偏移，用一常数换算此差 异。凭经验确定此偏移和换算常数。重安排结果以使16点与13个幅度匹配。背景 和偏移采用任何小号码。
4-通过曲线拟合优化拟合的值(对16种未知物)。具体采用带线性化拟合函数 的Marquadt程序的线性最小平方算法，拟合16种未知物为40×40＝1600等式(当 然不是所有等式都是线性独立的)。
5-利用X、Y偏移为当前孔拟合以提高的精确性估计何处坐标方格，将会用是 微板的下一孔。预计相对于下一毗邻孔(通过图像系统60放大系数变换为像素号码 的距离)为9厘米偏移。因为孔间距离相对于此板尺寸较小，利用位置的局部估计 是最准确的。
6-随着位置估计的改进确定下一孔图像的较小，移至30×30像素块。这使得 拟合更快。
回到第二步并对每孔重复。
实施例27 高通量筛选(见图26和27)
图26说明了采用检测接头和一个报道试剂作为试验的原始图像数据，该试验 测定了96份不同的细胞样品中13种天然mRNA的表达。96孔板每孔含105个未处 理(左半图)THP-1细胞或用PMA和LPS诱导成为单核细胞(右半图)。
表达模式变化一致，诱导了IL-1、TNF、COX-2、波形蛋白、LD78、骨桥蛋白和 β-血小板球蛋白。关闭了组织蛋白酶G，周期蛋白-6，HMG-17和血管紧张素，GAPDH 和肌动蛋白不变。
图27提供THP-1细胞基因的空间安排，和两个样品孔的资料(选自图26)。
此实验用的寡核苷酸列于下表。对于某此靶分子，用一含有25个与保护片段 互补碱基，但不含报道试剂互补序列的不完全检测接头寡核苷酸稀释检测接头，降 低了信号的强度。这些不完全寡核苷酸称为“弱化因子”。
表1提供了上述原始数据的数量限定，此筛选试验的高通量进行。在96孔板 中培养和处理细胞，平均每孔105个细胞，这是微孔板常规操作的细胞数，以高通 量形式测定了细胞小样品的13种基因表达模式。如表1小结，试验获得的结果证 实和扩展了文献所报道的。此试验可检测到每个细胞低于一个拷贝的基因表达。参 考文献反映了各种相关细胞类型如U-937细胞的积累观察资料。我们测定的背景信 号很低，对照与诱导条件结合之间差异明显。采用检测接头，只用一种报道试剂就 能降低试验背景，这是由于含HRP的报道试剂总浓度低得多。
表1相对丰度(每个细胞的RNA分子+)MAPS96-16格式、105细胞/孔 基因 对照 诱导的 文献 GAPDH IL-1β TNF 组织蛋白酶G COX-2 周期蛋白-2 波形蛋白 LD78-b HMG-17 骨桥蛋白 血小板球蛋白 血管紧张素 肌动蛋白 30±*7％ **nd 3.0±0％ 53±8％ nd 2.8±11％ nd nd 336±5％ nd nd 0.5±18％ 79±7％ 30±14％ 684±14％ 214±23％ nd 8.3±23％ 0.5±46％ 37±33％ 3360±28％ 33±23％ 18±23％ 66±15％ 0.1±66％ 43±21％ 无变化 升高 升高 降低 升高 无变化 升高 升高 降低 无报道 升高 无报道 无变化
+估计值，假设GAPDH为30/细胞  *％CV(Std Dev/Mean as a％)(n＝48)，**nd 未测。
实施例27中所用的寡核苷酸和检测接头及各探针是：
固定的探针：CACCTCCAAACAGTGAAGGAGAGCA(偶联于HRP)(SEQ ID：33)
靶#1；ID：MI7851GAPDH9572-513)
锚：长度＝25
CGCCGGTCGAGGCGTTGTGGGAGCGC(SEQ ID：34)
靶：长度＝60
TGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTT(SEQ ID：35)
接头：长度＝60
ATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTGATACTGAGTGCGCTCCCACAACGCTCGACCGGCG(SEQ ID：36)
保护片段：长度＝75
AAGCAGTTGGTGGTGCAGGAGGCATTGCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCTCAGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：37)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACGTAGTTGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAG(SEQ ID：38)
弱化因子：长度＝25
TGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAG(SEQ ID：39)
靶#2；ID：MI5840 ILI-β(4392-4333)
锚：长度＝25
TCCACGTGAGGACCGGACGGCGTCC(SEQ ID：40)
靶：长度＝60
CGACACATGGGATAACGAGGCTTATGTGCACGATGCACCTGTACGATCACTGAACTGCAC(SEQ ID：41)
接头：长度＝60
CACCTGTACGATCACTGAACTGCACGATACTGAGTGGACGCCGTCCGGTCCTCACGTGGA(SEQ ID：42)
保护片段：长度＝75
GTGCAGTTCAGTGATCGTACAGGTGCATCGTGCACATAAGCCTCGTTATCCCATGTGTCGGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：43)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCGACACATGGGATAACGAGGCTTAT(SEQ ID：44)
弱化因子：长度＝25
CGACACATGGGATAACGAGGCTTAT(SEQ ID：45)
靶#3；ID：MI0988 TNF(780-721)
锚：长度＝25
CACTACGGCTGAGCACGTGCGCTGC(SEQ ID：46)
靶：长度＝60
CGGAACCCAAGCTTAGAACTTTAAGCAACAAGACCACCACTTCGAAACCTGGGATTCAGG(SEQ ID：47)
接头：长度＝60
ACCACTTCGAAACCTGGGATTCAGGGATACTGAGTGCAGCGCACGTGCTCAGCCGTAGTG(SEQ ID：48)
保护片段：长度＝75
CCTGAATCCCAGGTTTCGAAGTGGTGGTCTTGTTGCTTAAAGTTCTAAGCTTGGGTTCCGGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：49)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCGGAACCCAAGCTTAGAACTTTAAG(SEQ ID：50)
弱化因子：长度＝25
CGGAACCCAAGCTTAGAACTTTAAG(SEQ ID：51)
靶#4；ID：MI7851 GAPDH(572-513)
(与靶#1相同)
靶#5；ID：MI6117组织蛋白-G(373-314)
锚：长度＝25
GAACCGCTCGCGTGTTCTACAGCCA(SEQ ID：52)
靶：长度＝60
GCGGACCATCCAGAATGACATCATGTTATTGCAGCTGAGCAGAAGAGTCAGACGGAATCG(SEQ ID：53)
接头：长度＝60
TGAGCAGAAGAGTCAGACGGAATCGGATACTGAGTTGGCTGTAGAACACGCGAGCGGTTC(SEQ ID：54)
保护片段：长度＝75
CGATTCCGTCTGACTCTTCTGCTCAGCTGCAATAACATGATGTCATTCTGGATGGTCCGCGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：55)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGCGGACCATCCCAGAATGACATCATG(SEQ ID：56)
弱化因子：长度＝25
GCGGACCATCCAGAATGACATCATG(SEQ ID：57)
靶#6 ID：M90100 COX-2(240-181)
锚：长度＝25
CTCGTTCCGCGTCCGTGGCTGCCAG(SEQ ID：58)
靶：长度＝60
CCGAGGTGTATGTATGAGTGTGGGATTTGACCAGTATAAGTGCGATTGTACCCGGACAGG(SEQ ID：59)
接头：长度＝60
ATAAGTGCGATTGTACCCGGACAGGGATACTGAGTCTGGCAGCCACGGACGCGGAACGAG(SEQ ID：60)
保护片段：长度＝75
CCTGTCCGGGTACAATCGCACTTATACTGGTCAAATCCCACACTCATACATACACCTCGGGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：61)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCCGAGGTGTATGTATGAGTGTGGGA(SEQ ID：62)
弱化因子：长度＝25
CCGAGGTGTATGTATGAGTGTGGGA(SEQ ID：63)
靶#7；ID：M74091周期蛋白(932-873)
锚：长度＝25
CGGTCGGCATGGTACCACAGTCCGC(SEQ ID：64)
靶：长度＝60
CACCTCCAAACAGTGAAGGAGAGCAGGGTCCAAATGGAAGTCAGAACTCTAGCTACAGCC(SEQ ID：65)
接头：长度＝60
GGAAGTCAGAACTCTAGCTACAGCCGATACTGAGTGCGGACTGTGGTACCATGCCGACCG(SEQ ID：66)
保护片段：长度＝75
GGCTGTAGCTAGAGTTCTGACTTCCATTTGGACCCTGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：67)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCACCTCCAAACAGTGAAGGAGAGCA(SEQ ID：68)
弱化因子：长度＝25
CACCTCCAAACAGTGAAGGAGAGCA(SEQ ID：69)
靶#8 ID：MI4144波形蛋白(1338-1279)
锚：长度＝25
GCGCGCCGCGTTATGCATCTCTTCG(SEQ ID：70)
靶：长度＝60
GTGGATGCCCTTAAAGGAACCAATGAGTCCCTGGAACGCCAGATGCGTGAAATGGAAGAG(SEQ ID：71)
接头：长度＝60
ACGCCAGATACGTGAAATGGAAGAGGATACTGAGTCGAAGAGATGCATAACGCGGCGCGC(SEQ ID：72)
保护片段：长度＝75
CTCTTCCATTTCACGCATCTGGCGTTCCAGGGACTCATTGGTTCCTTTAAGGGCATCCACGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：73)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGTGGATGCCCTTAAAGGAACCAATG(SEQ ID：74)
弱化因子：长度＝25
GTGGATGCCCTTAAAGGAACCAATG(SEQ ID：75)
靶#9；ID：D90145 LD78-b(2049-1990)
锚：长度＝25
GTTAGCATACGTGTCACCACACCGG(SEQ ID：76)
靶：长度＝60
CACCTCCCGACAGATTCCACAGAATTTCATAGCTGACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTG(SEQ ID：77)
接头：长度＝60
ACTACTTTGAGACGAGCAGCCAGTGGATACTGAGTCCGGTGTGGTGACACGTATGCTAAC(SEQ ID：78)
保护片段：长度＝75
CACTGGCTGCTCGTCTCAAAGTAGTCAGCTATGAAATTCTGTGGAATCTGTCGGGAGGTGGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：79)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCACCTCCCGACAGATTCCACAGAAT(SEQ ID：80)
弱化因子：长度＝25
CACCTCCCGACAGATTCCACAGAAT(SEQ ID：81)
靶#10；ID：X13546 HMG-17 M12623-mRNA(191-132)
锚：长度＝25
CGTCAGTCCGTCGGCCAGCTCTTCC(SEQ ID：82)
靶：长度＝60
CAAAGGTGAAGGACGAACCACAGAGAAGATCCGCGAGGTTGTCTGCTAAACCTGCTCCTC(SEQ ID：83)
接头：长度＝60
AGGTTGTCTGCTAAACCTGCTCCTCGATACTGAGTGGAAGAGCTGGCCGACGGACTGACG(SEQ ID：84)
保护片段：长度＝75
GAGGAGCAGGTTTAGCAGACAACCTCGCGGATCTTCTCTGTGGTTCGTCCTTCACCTTTGGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：85)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCAAAGGTGAAGGACGAACCACAGAG(SEQ ID：86)
弱化因子：长度＝25
CAAAGGTGAAGGACGAACCACAGAG(SEQ ID：87)
靶#11；ID：X13694骨桥蛋白(783-724)
锚：长度＝25
ATCCAGTTAACCACATGCTAGTACC(SEQ ID：88)
靶：长度＝60
CCGTGGGAAGGACAGTTATGAAACGAGTCAGCTGGATGACCAGAGTGCTGAAACCCACAG(SEQ ID：89)
接头：长度＝60
ATGACCAGAGTGCTGAAACCCACAGGATACTGAGTGGTACTAGCATGTGGTTAACTGGAT(SEQ ID：90)
保护片段：长度＝75
CTGTGGGTTTCAGCACTCTGGTCATCCAGCTGACTCGTTTCATAACTGTCCTTCCCACGGGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：91)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCCGTGGGAAGGACAGTTATGAAACG(SEQ ID：92)
弱化因子：长度＝25
CCGTGGGAAGGACAGTTATGAAACG(SEQ ID：93)
靶#12；ID：MI7017b血小板球蛋白(142-83)
锚：长度＝25
TTAGCGTTGGCCGAGGTTCATAGCC(SEQ ID：94)
靶：长度＝60
GTGTAAACATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCTCTCTTGGCAGCCTTCCTGATTTCTGCAG(SEQ ID：95)
接头：长度＝60
TTGGCAGCCTTCCTGATTTCTGCAGGATACTGAGTGGCTATGAACCTCGGCCAACGCTAA(SEQ ID：96)
保护片段：长度＝75
CTGCAGAAATCAGGAAGGCTGCCAAGAGAGCCACGGCCAGCTTGGAAGTCATGTTTACACGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：97)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGTGTAAACATGACTTCCAAGCTGGC(SEQ ID：98)
弱化因子：长度＝25
GTGTAAACATGACTTCCAAGCTGGC(SEQ ID：99)
靶#13；ID；MI7851 GAPDH9572-513)(与靶#1相同)
靶#14；ID：K02215 血管紧张肽(805-746)
锚：长度＝25
CATTACGAGTGCATTCGCATCAAGG(SEQ ID：100)
靶：长度＝60
CACGCTCTCTGGACTTCACAGAACTGGATGTTGCTGCTGAGAAGATTGACAGGTTCATGC(SEQ ID：101)
接头：长度＝60
GCTGAGAAGATTGACAGGTTCATGCGATACTGAGTCCTTGATGCGAATGCACTCGTAATG(SEQ ID：102)
保护片段：长度＝75
GCATGAACCTGTCAATCTTCTCAGCAGCAACATCCAGTTCTGTGAAGTCCAGAGAGCGTGGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：103)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCACGCTCTCTGGACTTCACAGAACT(SEQ ID：104)
弱化因子：长度＝25
CACGCTCTCTGGACTTCACAGAACT(SEQ ID：105)
靶#15；ID：MI0277肌动蛋白(2627-2568)
锚：长度＝25
ATCATGTAAGTCTTCGGTCGGTGGC(SEQ ID：106)
靶：长度＝60
GAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACGTGGACATC(SEQ ID：107)
接头：长度＝60
CATCATGAAGTGTGACGTGGACATCGATACTGAGTGCCACCGACCGAAGACTTACATGAT(SEQ ID：108)
保护片段：长度＝75
GATGTCCACGTCACACTTCATGATGGACTTGAAGGTAGTTTCGTGGATGCCACAGGACTCGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：109)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTA(SEQ ID：110)
弱化因子：长度＝25
GAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTA(SEQ ID：111)
靶#16；(此点不用)
实施例28  同时检测DNA和RNA(见图29)
在96孔V形底微滴板中培养THP-1人单核细胞，3万-15万细胞/每孔。对照 细胞不用PMA分化或不用LPS激活，因为某些基因(如IL-2、COX-2、LD78、骨桥 蛋白和血小板球蛋白)的RNA这些细胞中不存在，因而试验只测DNA，而GAPDH的 DNA和RNA二者都存在可予以测定。在水(裂解)溶液中加热细胞至105℃，裂解中 加入感兴趣的靶分子的特异性核酸酶保护片段。温度升高裂解物释放出测定形式的 DNA和RNA。为测定DNA加入的核酸酶保护片段为针对IL-1、COX-2、LD78、骨桥 蛋白和血小板球蛋白的保护片段。为同时测定DNA和RNA，加入上述核酸酶保护片 段以及针对GAPDH的特异性保护片段，如本文所述进行核酸酶保护反应。
基本上按实施例27所述形成阵列和进行保护片段的杂交。通过一系列检测接 头的杂交检测DNA和DNA+RNA。进行系列杂交是为了平衡RNA和DNA靶分子产生的 信号(见F)。当然，系列杂交不是该试验同时检测DNA和RNA靶分子所要求。第一 轮中加入IL-2、COX-2、LD78、骨桥蛋白和血小板球蛋白的检测接头。第二轮加入 GAPDH的检测接头。进行系列杂交以拍摄DNA信号，此信号比RNA信号弱得多，因 为每份样品的拷贝低得多，延长杂交时间以积累较高的信号强度。
图29提供了测定结果。左图说明只检测基因组DNA时，待测的IL-2、COX-2、 LD78、骨桥蛋白和血小板球蛋白的基因组序列均可在相应位点测到数量几乎相同。 表1为所测定的基因组DNA，显示在对照细胞中没有测到这些基因的DNA。右图为 测定的DNA和RNA，但收集的图像暴光时间短得多，因而DNA信号较左图弱得多， 表明同时检测DNA和RNA时，对照基因组序列可作为内部标准化参比品检测，基因 GAPDH表达水平比对照高得多。通过测定对照信号和表达的GAPDHmRNA的相对量， 可计算出每个细胞表达的mRNA量。
实施例29  检测表达的SNP(见图30和31)
图90说明了检测表达的SNP的一种试验。其中，设计的核酸酶保护片段，当 加入适当的酶(如RNA酶H)时，含SNP的RNA的该区域杂交，如果该核酸酶保护片 段与碱基错配的RNA(此处为SNP)杂交，此酶将切割此核酸酶保护片段。此实施例 中产生的切割片段不能与此阵列杂交(由于所用的杂交条件如温度的影响)。另一实 施例中可发生与此阵列杂交但检测接头不能结合切割的保护片段(由于所用的杂交 条件如温度影响)或切割的片段不能同时与此阵列和检测接头杂交时发生切割。
图31说明按本文常规方法进行此类试验的结果，用野生型肌动蛋白作为内部 对照，含有经基因工程产生的SNP的GAPDH的保护片段，与对应于野生型GAPDH 的保护片段。图31说明含野生型GAPDH和野生型肌动蛋白(左侧和放大的左图)或 含SNPGAPDH和野生型肌动蛋白(右侧和放大的右图)的多个样品的测定结果，放大 的中图说明该阵列设计。
实施例30  高通量筛选(见图32-35)
基本上按实施例28所述进行转录试验，不同的是寡核苷酸锚放置在放射性照 射过的板上而非DNA结合板上。采用实施例27所述相同的寡核苷酸锚，但改变阵 列中的某些靶分子，只有一种锚测定GAPDH，并加入微管蛋白、肌动蛋白和LDH。 测定的其它靶分子是IL-1、TNF-α、组织蛋白酶G、COX-2、G-CSF、GM-CSF、GST- Pil、HMG-17、b-血小板球蛋白、TIMP-1、MMP-9。图32说明此阵列、接头和核酸 酶保护片段序列见下，每孔采用大约3万个细胞(在PMA和LDH处理受处理细胞时 未对细胞的不断增殖作调整)。
序列：
靶#1：GAPDH(与实施例27靶#1相同)
靶#2：IL-1b(与实施例27靶#2相同)
靶#3  TNF-α(与实施例27靶#3相同)
靶#4  微管蛋白质(AF141347)
靶#15；ID：MI0277肌动蛋白(2627-2568)
锚：长度＝25
TAAGCGTCTCTAGGAAGGGACGTGG(SEQ ID：112)
靶：长度＝60
GACGTGGTTCCCAAAGATGTCAATGCTGCCATTGCCACCATCAAGACCAAGCGTACCATC(SEQ ID：113)
接头：长度＝60
CACCATCAAGACCAAGCGTACCATCGATACTGAGTCCACGTCCCTTCCTAGAGACGCTTA(SEQ ID：114)
保护片段：长度＝75
GATGGTACGCTTGGTCTTGATGGTGGCAATGGCAGCATTGACATCTTTGGGAACCACGTCGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：115)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGACGTGGTTCCCAAAGATGTCAATG(SEQ ID：116)
弱化因子：长度＝25
GACGTGGTTCCCAAAGATGTCAATG(SEQ ID：117)
靶#5 组织蛋白酶G(与实施例27的靶#5相同)
靶#6 Cox-2(与实施例27的靶#6相同)
靶#7；G-CSF(E01219)
锚：长度＝25
CGGTCGGCATGGTACCACAGTCCGC(SEQ ID：118)
靶：长度＝60
GAGGGAGCAGCCAGGAGGAATCATGTCAGGCCTGTGTGTGAAAGGAAGCTCCACTGTCAC(SEQ ID：119)
接头：长度＝60
GTGTGAAAGGAAGCTCCACTGTCACGATACTGAGTGCGGACTGTGGTACCATGCCGACCG(SEQ ID：120)
保护片段：长度＝75
GTGACAGTGGAGCTTCCTTTCACACACAGGCCTGACATGATTCCTCCTCTCTGCTCCCTCGCTTGTC TAAAGTCTG(SEQ ID：121)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGAGGGAGCAGACAGGAGGAATCATG(SEQ ID：122)
弱化因子：长度＝25
GAGGGAGCAGACAGGAGGAATCATG(SEQ ID：123)
靶#8；GM-CSF(E02975)
锚：长度＝25
GCGCGCCGCGTTATGCATCTCTTCG(SEQ ID：124)
靶：长度＝60
CACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACC(SEQ ID：125)
接头：长度＝60
TTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCGATACTGAGTCGAAGAGATGCATAACGCGGCGCGC(SEQ ID：126)
保护片段：长度＝75
GGTGATAATCTGGGTTGCACAGGAAGTTTCCGGGGTTGGAGGGCAGTGCTGCTTGTAGTGGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：127)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAA(SEQ ID：128)
弱化因子：长度＝25
CACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAA(SEQ ID：129)
靶#9；GST-PI1 X06547
锚：长度＝25
GTTAGCATACGTGTCACCACACCGG(SEQ ID：130)
靶：长度＝60
CAGGGAGGCAAGACCTTCATTGTGGGAGACCAGATCTCCTTCGCTGACTACAACCTGCGT(SEQ ID：131)
接头：长度＝60
CTCCTTCGCTGACTACAACCTGCTGGATACTGAGTCCGGTGTGGTGACACGTATGCTAAC(SEQ ID：132)
保护片段：长度＝75
CAGCAGGTTGTAGTCAGCGAAGGAGATCTGGTCTCCCACAATGAAGGTCTTGCCTCCCTGGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：133)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCAGGGAGGCAAGACCTTCATTGTGG(SEQ ID：134)
弱化因子：长度＝25
CAGGGAGGCAAGACCTTCATTGTGG(SEQ ID：135)
靶#10 HMG-17(与实施例27的靶#10相同)
靶#11；亲环蛋白 X52851
锚：长度＝25
ATCCAGTTAACCACATGCTAGTACC(SEQ ID：136)
靶：长度＝60
GGGTTTATGTGTCAGGGTGGTGACTTCACACGCCATAATGGCACTGGTGGCAAGTCCATC(SEQ ID：137)
接头：长度＝60
TAATGGCACTGGTGGCAAGTCCATCGATACTGAGTGGTACTAGCATGTGGTTAACTGGAT(SEQ ID：138)
保护片段：长度＝75
GATGGACTTGCCACCAGTGCCATTATGGCGTGTGAAGTCACCACCCTGACACATAAACCCGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：139)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGGGTTTATGTGTCAGGGTGGTGACT(SEQ ID：140)
弱化因子：长度＝25
GGGTTTATGTGTCAGGGTGGTGACT(SEQ ID：141)
靶#12 血小板球蛋白-b(与实施例27的靶#12相同)
靶#13；LDH X02152
锚：长度＝25
TCTCGGTCTGGAACGCCCGGCAACT(SEQ ID：142)
靶：长度＝60
GGTGGTTGAGAGTGCTTATGAGGTGATCAAACTCAAAGGCTACACATCCTGGGCTATTGG(SEQ ID：143)
接头：长度＝60
AAGGCTACACATCCTGGGCTATTGGGATACTGAGTAGTTGCCGGGCCTTCCAGACCGAGA(SEQ ID：144)
保护片段：长度＝75
CCAATAGCCCAGGATGTGTAGCCTTTGAGTTTGATCACCTCATAAGCACTCTCAACCACCGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：145)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGGTGGTTGAGAGTGCTTATGAGGTG(SEQ ID：146)
弱化因子：长度＝25
GGTGGTTGAGAGTGCTTATGAGGTG(SEQ ID：147)
靶#14；TIMP-1 X03124
锚：长度＝25
CATTACGAGTGCATTCGCATCAAGG(SEQ ID：148)
靶：长度＝60
CACCAAGACCTACACTGTTGGCTGTGAGGAATGCACAGTGTTTCCCTGTTTATCCATCCC(SEQ ID：149)
接头：长度＝60
CAGTGTTTCCCTGTTTATCCATCCCGATACTGAGTCCTTGATGCGAATGCACTCGTAATG(SEQ ID：150)
保护片段：长度＝75
GGGATGGATAAACAGGGAAACACTGTGCATTCCTCACAGCCAACAGTGTAGGTCTTGGTGGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：151)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTCACCAAGACCTACACTGTTGGCTGT(SEQ ID：152)
弱化因子：长度＝25
CACCAAGACCTACACTGTTGGCTGT(SEQ ID：153)
靶#15；MMP-9 J05070
锚：长度＝25
ATCATGTAAGTCTTCGGTCGGTGGC(SEQ ID：154)
靶：长度＝60
GCAACGTGAACATCTTCGACGCCATCGCGGAGATTGGGAACCAGCTGTATTTGTTCAAGG(SEQ ID：155)
接头：长度＝60
GGGAACCAGCTGTATTTGTTCAAGGGATACTGAGTGCCACCGACCGAAGACTTACATGAT(SEQ ID：156)
保护片段：长度＝75
CCTTGAACAAATACAGCTGGTTCCCAATCTCGCGATGGCGTCGAAGATGTTCACGTTGCGCTTGTCT AAGTCTG(SEQ ID：157)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGCAACGTGAACATCTTCGACGCCAT(SEQ ID：158)
弱化因子：长度＝25
GCAACGTGAACATCTTCGACGCCAT(SEQ ID：159)
靶#16；肌动蛋白  X10277
锚：长度＝25
CTGAGTCCTCCGGTGCCTACGTGGC(SEQ ID：160)
靶：长度＝60
GAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTACCTTCAACTCCATCATGAAGTGTGACGTGGACATC(SEQ ID：161)
接头：长度＝60
CATCATGAAGTGTGACGTGGACATCGATACTGAGTGCCACGTAGGCACCGGAGGACTCAG(SEQ ID：162)
保护片段：长度＝75
GATGTCCACGTCACACTTCATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGATGCCACAGGACTCGCTTGTC TAAGTCTG(SEQ ID：163)
检测接头：长度＝60
TGCTCTCCTTCACTGTTTGGAGGTGGATACTGAGTGAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTA(SEQ ID：164)
弱化因子：长度＝25
GAGTCCTGTGGCATCCACGAAACTA(SEQ ID：165)
图33显示该试验的再现性很高，当分析3万个细胞时，CV的范围约3-13％。
图34显示该试验的灵敏度很高。当测试的样品所含细胞少至1000个时仍可测 到GAPDH的靶mRNA。
图35基本上采用实施例25的方案和实施例27的阵列和靶分子进行，显示即 使样品所含细胞不到1000个也能测出许多靶mRNA，当RNA得自不到1万个细胞时 可测到低浓度表达的所有靶分子。
实施例31  任选的寡核苷酸试剂(见图36)
图36显示可用于本发明方法的几种寡核苷酸试剂。此图说明试验方案是：使 寡核苷酸锚通过其5’或3’(反向)端结合于一表面。此寡核苷酸锚有两个识别部分， 彼此毗邻(缩短)或被核酸臂隔开，每部分有5个核苷酸。
实施例32  核酸酶保护片段扩增方法(见图37-39和42)
图37说明用PCR扩增核酸酶保护片段。
图38说明用连接酶扩增核酸酶保护片段。通过选择a’作为α碱基序列，位于 连接的a’之外的25个碱基结合于此阵列，可选择杂交条件只让a’分子的连接的25 个碱基序列结合。利用a’和a接头结合区各部分中修饰的核苷酸可促进辨别，如 果热解离循环破坏了连接酶，可在每次循环时再加入。
图39说明通过核酸酶保护使核酸酶保护片段得到扩增，与该(核酸酶保护片段 6)互补的(DNAa)链可含有修饰的碱基。其可在(DNAa)的温度下杂交，或在(DNAa) 加入前可破坏(DNAa)。同样，(DNAa)的(接头a)可含有修饰的核苷酸。允许在低于 (核酸酶保护片段6)的温度下杂交，即使(接头a)/(DNAa)杂交体是25个碱基。 (DNAa)/(核酸酶保护片段6)是50个碱基的杂交体，尤其当从经验上考虑到溶液中 的DNA链是稀的，可通过高度浓缩，基本上无限制性高度浓缩(接头A)。流通装置 可用含有捕俘阵列的板来替换。线性阵列可用2-D或3-D阵列替换。
图42说明用聚合酶扩增核酸酶保护片段。核酸酶保护反应完成后核酸酶保护 片段从RNA上解离下来，加入含有RNA聚合酶(如T7聚合酶)双链启动子的一引物 (a’)和核酸酶保护片段模板延伸(如逆转录酶(RT)延伸以复制RNA或DNA或复制DNA 的Tag聚合酶)将利用其作为模板形成双链DNA复合物，带有靠近该核酸酶保护片 段序列未端的双链启动子区域。加入连接酶将使该启动子的第二链连接于核酸酶保 护片段链，除非第一碱基是错配的SNP。因此在核酸酶保护反应期间，S1剪去了未 受保护的碱基。由于此碱基被跳过，连接酶不会将启动子与核酸酶保护片段连接。 用连接酶时，b链被转变为延伸的b”链，掺入聚合酶启动子中，可用聚合酶扩增 并在加入RT引物b’后继续扩增。用启动子/核酸酶保护片段延伸端结合此阵列或 检测接头或检测探针。为检测SNP，安排此杂交使SNP位点大约处在用于与该阵列 (检测接头或检测探针等)杂交的序列的中部。延伸核酸酶保护探针的阵列(检测接 头或检测探针)，杂交区不必包括此未端的所有碱基(该延伸的核酸酶保护探针未端 的某些碱基可能突出在接头中无互补性杂交序列)。变化中没有描述采用聚合酶(如 T7)之前不需要连接，因此通过选择能将SNP定位在与a’杂交序列中部序列，进行 SNP检测。采用本文所述的SNP检测方案。不需要延伸a’链，但RNA聚合酶可能利 用与单链核酸酶保护片段(删去所示的RT延伸或改变所述的Tag聚合酶延伸步骤) 杂交的启动子来产生RNA。
从以上描述，本领域技术人员可能不难确定本发明的基本特征。在不背离本发 明的思路和范围下，可对本发明作修改以将其用于不同情况。
不必进一步详尽阐述，相信本领域技术人员通过以上描述，能以最充分程序应 用本发明。因此以上优选的具体实施例应解释为只是说明性的，并不以任何方式限 制本发明的其余内容。
以上所引用和图中引用的所有专利申请、专利和出版物的全部公开内容都纳入 本文参考文献。
本申请是1999年6月21日提交的美国专利申请编号09/337325的后续部分， 而09/337325是1998年12月22日提交的美国专利申请编号09/218166的后续部 分，而09/218166是1998年7月2日提交的美国专利申请编号09/190076的后续 部分。本申请要求1997年12月19日提交的先前专利申请60/068291的优先权。