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采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂

申请号 CN201811599011.0 申请日 2018-12-26 公开(公告)号 CN109680042A 公开(公告)日 2019-04-26
申请人 武汉爱博泰克生物科技有限公司; 发明人 冯延叶; 赖煦卉; 孙大鹏; 赵骞; 吴知才;
摘要 本 发明 公开了一种采用 磁珠 混样处理DNA的测序文库标准化方法及 试剂 盒 ,本发明利用固定数量的磁珠捕获DNA分子,使得获取固定量的DNA分子变得容易,后续的混样中只需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据即可,省去了前期处理的测DNA浓度,测DNA文库摩尔浓度等繁琐的步骤,大大简化了多个不同样本DNA文库上机测序前的处理过程,可以实现自动化操作,成本低,实用性强。
权利要求

1.一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法,其步骤如下:
1)消化过程:
对DNA文库中的DNA分子,利用外切酶从DNA分子末端消除基,暴露出黏性末端;
2)捕获过程:
2.1)磁珠和步骤1)获得的具有黏性末端的DNA分子结合,其中磁珠为已知用量的带有DNA结合片段的磁珠,所述DNA结合片段与DNA分子黏性末端特异性结合;
2.2)利用DNA聚合酶补齐黏性末端上可能存在的缺口或者切掉Flap DNA结构,再用DNA连接酶将缺刻连接起来;
3)漂洗过程:
将已捕获DNA分子的磁珠吸附在磁架上,使用磁珠漂洗缓冲液洗掉未结合的DNA分子;
4)混样:
针对多个不同样本DNA文库,通过的重复步骤1)~3)以获得已捕获不同DNA分子的多种磁珠,并按照相同或相似的量将多种磁珠混合在一起;
5)洗脱:
使用DNA洗脱液和内切酶从步骤4)获得的混合的多种磁珠上洗脱DNA分子,得到可上机测序的文库样本。
2.根据权利要求1所述采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法,其特征在于:所述磁珠为链霉素亲和磁珠,它通过生物素与DNA结合片段相连。
3.一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化试剂盒,它的应用对象为具有黏性末端的DNA分子,包括如下组分:
(1)用于结合生物素修饰的DNA分子的链霉素亲和磁珠;
所述链霉素亲和磁珠通过生物素修饰分子结合有DNA结合片段,所述DNA结合片段包括特殊修饰碱基、DNAlinker、用于结合目标DNA分子的特异性DNA序列;
所述特殊修饰碱基为用于在特殊条件下释放目标DNA的碱基;
所述DNAlinker的长度为1~100bp;
所述特异性DNA序列的长度为长度3~200bp;
(2)工具酶
所述工具酶包括外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA内切酶;
(3)工具酶反应体系
各个工具酶对应的反应所需要的缓冲液;
(4)磁珠漂洗缓冲液
所述磁珠漂洗缓冲液用于漂洗磁珠,洗掉未结合的DNA分子;
(5)DNA洗脱液
所述DNA洗脱液用于从磁珠上洗脱目标DNA分子。
4.根据权利要求3所述采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化试剂盒,其特征在于:
所述DNA结合片段从5’到3’依次为DNAlinker、特殊修饰碱基、特异性DNA序列。
5.根据权利要求3所述采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化试剂盒,其特征在于:
所述外切酶,选自Exo I,Exo III,Exo T5,lambda Exo,ExoT7;
所述DNA聚合酶,选自Taq聚合酶、B家族DNA聚合酶;
所述DNA连接酶,选自T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、TaqDNA连接酶、E.coli DNA连接酶;
所述DNA内切酶,选自UDG、EndoVIII、EndoIV、Fpg。
6.根据权利要求3所述采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化试剂盒,其特征在于:
所述特殊修饰碱基还包括用于防止链延伸的碱基和/或防止目标DNA文库的3’端OH延伸的碱基。
7.根据权利要求3所述采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化试剂盒,其特征在于:
所述特殊修饰碱基为dUTP、8-oxo-dGTP、dITP、AP位点、RNA碱基。

说明书全文

采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域,具体地指一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂盒。

背景技术

[0002] 现有的自动化上机测序文库的标准化操作中,多个不同样本DNA文库构建成功后,需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据。具体地讲,一般地的上机测序过程是:DNA文库先经过qubit测定DNA浓度、qPCR测定DNA文库摩尔浓度、Bioanalyzer分析DNA分子片段大小等检测后,确定DNA库准确的分子摩尔量;一张测序芯片lane的总数据量是一定的;如果多个样品DNA预期获取的测序数据量不同,那么要获得准确的下机测序数据就需要准确分配每个样品DNA的摩尔比例即可。目前上述方法存在几个大问题:需要大量检测实验、较多的人工操作、不能自动化操作、成本高等。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷,提供一种可以不依赖繁琐的检测步骤、包含较少人工干预、可以实现自动化操作的采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂盒,大大提高工作效率、显著降低成本。
[0004] 为实现上述目的,本发明提供了一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法,其步骤如下:
[0005] 1)消化过程:
[0006] 对DNA文库中的DNA分子,利用外切酶从DNA分子末端消除基,暴露出黏性末端;
[0007] 2)捕获过程:
[0008] 2.1)磁珠和步骤1)获得的具有黏性末端的DNA分子结合,其中磁珠为已知用量的带有DNA结合片段的磁珠,所述DNA结合片段与DNA分子黏性末端特异性结合(DNA结合片段所包含的序列可以特异性地与文库末端序列(如P5/P7序列)结合);
[0009] 2.2)利用DNA聚合酶补齐黏性末端上可能存在的缺口或者切掉Flap DNA结构,再用DNA连接酶将缺刻连接起来;
[0010] 3)漂洗过程:
[0011] 将已捕获DNA分子的磁珠吸附在磁架上,使用磁珠漂洗缓冲液洗掉未结合的DNA分子;
[0012] 4)混样:
[0013] 针对多个不同样本DNA文库,通过的重复步骤1)~3)以获得已捕获不同DNA分子的多种磁珠,并按照相同或相似的量将多种磁珠混合在一起;
[0014] 5)洗脱:
[0015] 使用DNA洗脱液和内切酶从步骤4)获得的混合的多种磁珠上洗脱DNA分子,得到可上机测序的文库样本。
[0016] 上述方案中,所述磁珠为链霉素亲和磁珠,它通过生物素与DNA结合片段相连。
[0017] 本发明还提供了一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化试剂盒,它的应用对象为具有黏性末端的DNA分子,包括如下组分:
[0018] (1)用于结合生物素修饰的DNA分子的链霉素亲和磁珠;
[0019] 所述链霉素亲和磁珠通过生物素修饰分子结合有DNA结合片段,所述DNA结合片段包括特殊修饰碱基、DNAlinker、用于结合目标DNA分子的特异性DNA序列;
[0020] 所述特殊修饰碱基为用于在特殊条件下释放目标DNA的碱基;
[0021] 所述DNAlinker的长度为1~100bp;
[0022] 所述特异性DNA序列的长度为3~200bp,特异性结合DNA分子在被消化后暴露的黏性末端;
[0023] (2)工具酶
[0024] 所述工具酶包括外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA内切酶;
[0025] (3)工具酶反应体系
[0026] 各个工具酶对应的反应所需要的缓冲液;
[0027] (4)磁珠漂洗缓冲液
[0028] 所述磁珠漂洗缓冲液用于漂洗磁珠,洗掉未结合的DNA分子;
[0029] (5)DNA洗脱液
[0030] 所述DNA洗脱液用于从磁珠上洗脱目标DNA分子。
[0031] 优选地,所述DNA结合片段从5’到3’依次为DNAlinker、特殊修饰碱基、特异性DNA序列。
[0032] 可选地,所述工具酶包括外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA内切酶;
[0033] 所述外切酶,不限于Exo I,Exo III,Exo T5,lambda Exo,ExoT7等;
[0034] 所述DNA聚合酶,不限于Taq聚合酶、Phusion等具有DNA合成功能的聚合酶;
[0035] 所述DNA连接酶,不限于T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、TaqDNA连接酶、E.coli DNA连接酶等;
[0036] 所述DNA内切酶,不限于UDG、EndoVIII、EndoIV、Fpg等;
[0037] 优选地,所述特殊修饰碱基还包括用于防止链延伸的碱基和/或防止目标DNA文库的3’端OH延伸的碱基。
[0038] 可选地,所述特殊修饰碱基不限于dUTP、8-oxo-dGTP、dITP、AP位点、RNA碱基等。
[0039] 测序文库的标准过程是多个不同样本DNA文库构建成功后,需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据。
[0040] 本发明的有益效果:利用固定数量的磁珠捕获DNA分子,使得获取固定量的DNA分子变得容易,后续的混样中只需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据即可,省去了前期处理的测DNA浓度,测DNA文库摩尔浓度等繁琐的步骤,大大简化了多个不同样本DNA文库上机测序前的处理过程,可以实现自动化操作,成本低,实用性强。附图说明
[0041] 图1为本发明方法的原理图。
[0042] 图2为本发明方法中的标准捕获试剂消化能力测试。
[0043] 图3为本发明方法的NGS文库标准化效果测试。

具体实施方式

[0044] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0045] 实施例1:DNA文库构建
[0046] 本实施例中,使用ABclonal商业化RapidMaxDNALibPrepKitforillumina(RK20217)构建DNA文库,最终的DNA文库使用三种不同化学修饰的PCR引物进行文库扩增。第一种PCR引物对是TPC1primer(5’-AATGATACGGCGACCACCGAG-3’)/TPC2 Primer(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’);第二种PCR引物对是TPC1*primer(5’-
AATGATACGGCGACCACCGA*G-3’)/TPC2*Primer(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G-3’);第三种PCR引物对是S4TPC1primer(5’-A*A*T*G*ATACGGCGACCACCGAG-3’)/S4TPC2 Primer(5’-C*A*A*G*CAGAAGACGGCATACGAG-3’)。*代表硫代修饰的磷酸硫脂键。具体的文库准备步骤详见商业化试剂盒操作说明书。以下所示是基本的DNA文库构建步骤:
[0047] 1 End Prep Reaction
[0048] 1.1配制反应体系如下
[0049]
[0050] 1.2运行反应程序
[0051] 20℃/30min,65℃/30min,4℃/hold.
[0052] 2 Ligation
[0053] 2.1配制反应体系如下
[0054]
[0055] 2.2运行反应程序
[0056] 20℃/15min,12℃/hold.
[0057] 3 Post-ligation Cleanup
[0058] 按照1.0x AMPure XP磁珠比例进行DNA纯化。21μl洗脱磁珠。取20μl adapter-ligated DNA用于后续PCR反应。
[0059] 4 PCR
[0060] 4.1配制反应体系如下
[0061]
[0062]
[0063] 4.2运行反应程序
[0064] 98℃/45s;8cycles(98℃/10s,60℃/30s,72℃/30s);72℃/1min;4℃/hold.[0065] 5 Post-PCR Cleanup
[0066] 使用1.0x AMPure XP DNA纯化磁珠进行DNA的PCRcleanup。31μl洗脱磁珠。取30μl DNA文库。
[0067] Qubit定量,三种文库的产量基本一致,没有显著差异。
[0068] 实施例2:DNA文库消化能力测试
[0069] 本实施例使用的是尚未商业化的标准捕获试剂,组成是50mMTrisHCl pH7.9,5U exonuclease T7,2U Phusion,120U E.coli DNA ligase,10U T4PNK,50uM NAD+,0.5mM ATP,0.2mM dNTP.该试剂能够实现DNA文库的消化过程和捕获过程。本实施例测试标准捕获试剂对DNA文库的消化能力。以实施例1中三种文库产物为底物,测试标准捕获试剂在不同时间点对DNA文库的消化效果。
[0070] 以下所示是实验过程:
[0071] 配制反应体系如下
[0072]
[0073]
[0074] 在50℃温度下,反应0,5,10,20,30分钟;
[0075] 在不同反应时间点,加入10μl 0.5MEDTA终止反应;
[0076] 加入6×DNA loading buffer,进行2%琼脂糖胶电泳
[0077] 实验结果如图2所示,TPC1/2*DNA文库和S4TPC1/2DNA文库在30min后出现文库轻微降解;TPC1/2DNA文库在30min后降解完全。实验说明硫代修饰可以延缓标准捕获试剂内外切酶的消化作用。
[0078] 实施例3:标准捕获磁珠探针测试
[0079] 本实施例使用的是尚未商业化的标准捕获试剂,包含了外切酶、聚合酶、连接酶、修饰酶等在内的几种工具酶混合溶液(同实施例2),能够实现DNA文库的消化过程和捕获过程。本实施例测试标准捕获试剂对DNA文库的捕获能力。本实施例使用普通的DNA文库作为底物,测试标准捕获试剂与捕获磁珠探针的文库捕获能力,如图1。以下所示是具体实验过程:
[0080] 配制反应体系如下
[0081]
[0082] 在50℃温度下,反应20分钟;
[0083] 加入10μl 0.5M EDTA终止反应;
[0084] 使用磁力架吸附捕获磁珠,去除上清;
[0085] 使用1×TE buffer漂洗磁珠2次;
[0086] 使用20μl DNA洗脱液进行DNA洗脱;
[0087] 使用Qubit测定洗脱DNA含量。
[0088] 实验结果:在标准捕获试剂与捕获磁珠探针存在条件下,DNA文库捕获/回收效率在84.5%。
[0089]实验组 实验组1 实验组2 实验组3 实验组4
DNA浓度ng/μl N/A 3.38 N/A N/A
[0090] 实施例4:NGS文库标准化测试
[0091] 本实施例使用的是尚未商业化的NGS DNA文库Pooling标准化试剂(同实施例2),包含标准捕获试剂和捕获磁珠探针。本实施例以多种不同含量的DNA文库为底物,测试DNA文库标准化效果。本实验涵盖DNA文库消化、文库捕获、文库洗脱等步骤,然后再通过qPCR定量标准化文库进行检验。以下所示是具体实验过程:
[0092] 1.DNA文库消化与捕获
[0093] 配制如下反应
[0094]
[0095] 在50℃温度下,反应20分钟;
[0096] 加入10μl 0.5M EDTA终止反应;
[0097] 使用磁力架吸附捕获磁珠,去除上清;
[0098] 使用1x TE buffer漂洗磁珠2次;
[0099] 2.DNA文库洗脱
[0100] 加入20μl DNA洗脱液进行DNA洗脱,重选磁珠,放置37℃反应15min,75℃灭活20min;
[0101] 使用磁力架吸附捕获磁珠,保留上清;
[0102] 3.标准化文库的qPCR定量
[0103] 使用商业化DNA文库qPCR定量试剂盒,测定标准化后文库DNA含量。
[0104] 实验结果如图3所示:在同样的捕获磁珠探针投入量,及多个不同DNA含量文库情况下,NGS DNA文库Pooling标准化试剂能够捕获/回收文库能力保持一致。
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