采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂盒 |
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申请号 | CN201811599011.0 | 申请日 | 2018-12-26 | 公开(公告)号 | CN109680042A | 公开(公告)日 | 2019-04-26 |
申请人 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司; | 发明人 | 冯延叶; 赖煦卉; 孙大鹏; 赵骞; 吴知才; | ||||
摘要 | 本 发明 公开了一种采用 磁珠 混样处理DNA的测序文库标准化方法及 试剂 盒 ,本发明利用固定数量的磁珠捕获DNA分子,使得获取固定量的DNA分子变得容易,后续的混样中只需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据即可,省去了前期处理的测DNA浓度,测DNA文库摩尔浓度等繁琐的步骤,大大简化了多个不同样本DNA文库上机测序前的处理过程,可以实现自动化操作,成本低,实用性强。 | ||||||
权利要求 | 1.一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法,其步骤如下: |
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说明书全文 | 采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂盒技术领域背景技术[0002] 现有的自动化上机测序文库的标准化操作中,多个不同样本DNA文库构建成功后,需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据。具体地讲,一般地的上机测序过程是:DNA文库先经过qubit测定DNA浓度、qPCR测定DNA文库摩尔浓度、Bioanalyzer分析DNA分子片段大小等检测后,确定DNA库准确的分子摩尔量;一张测序芯片lane的总数据量是一定的;如果多个样品DNA预期获取的测序数据量不同,那么要获得准确的下机测序数据就需要准确分配每个样品DNA的摩尔比例即可。目前上述方法存在几个大问题:需要大量检测实验、较多的人工操作、不能自动化操作、成本高等。 发明内容[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷,提供一种可以不依赖繁琐的检测步骤、包含较少人工干预、可以实现自动化操作的采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法及试剂盒,大大提高工作效率、显著降低成本。 [0004] 为实现上述目的,本发明提供了一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化方法,其步骤如下: [0005] 1)消化过程: [0006] 对DNA文库中的DNA分子,利用外切酶从DNA分子末端消除碱基,暴露出黏性末端; [0007] 2)捕获过程: [0008] 2.1)磁珠和步骤1)获得的具有黏性末端的DNA分子结合,其中磁珠为已知用量的带有DNA结合片段的磁珠,所述DNA结合片段与DNA分子黏性末端特异性结合(DNA结合片段所包含的序列可以特异性地与文库末端序列(如P5/P7序列)结合); [0009] 2.2)利用DNA聚合酶补齐黏性末端上可能存在的缺口或者切掉Flap DNA结构,再用DNA连接酶将缺刻连接起来; [0010] 3)漂洗过程: [0012] 4)混样: [0013] 针对多个不同样本DNA文库,通过的重复步骤1)~3)以获得已捕获不同DNA分子的多种磁珠,并按照相同或相似的量将多种磁珠混合在一起; [0014] 5)洗脱: [0015] 使用DNA洗脱液和内切酶从步骤4)获得的混合的多种磁珠上洗脱DNA分子,得到可上机测序的文库样本。 [0017] 本发明还提供了一种采用磁珠混样处理DNA的测序文库标准化试剂盒,它的应用对象为具有黏性末端的DNA分子,包括如下组分: [0018] (1)用于结合生物素修饰的DNA分子的链霉素亲和磁珠; [0019] 所述链霉素亲和磁珠通过生物素修饰分子结合有DNA结合片段,所述DNA结合片段包括特殊修饰碱基、DNAlinker、用于结合目标DNA分子的特异性DNA序列; [0020] 所述特殊修饰碱基为用于在特殊条件下释放目标DNA的碱基; [0021] 所述DNAlinker的长度为1~100bp; [0022] 所述特异性DNA序列的长度为3~200bp,特异性结合DNA分子在被消化后暴露的黏性末端; [0023] (2)工具酶 [0024] 所述工具酶包括外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA内切酶; [0025] (3)工具酶反应体系 [0026] 各个工具酶对应的反应所需要的缓冲液; [0027] (4)磁珠漂洗缓冲液 [0028] 所述磁珠漂洗缓冲液用于漂洗磁珠,洗掉未结合的DNA分子; [0029] (5)DNA洗脱液 [0030] 所述DNA洗脱液用于从磁珠上洗脱目标DNA分子。 [0031] 优选地,所述DNA结合片段从5’到3’依次为DNAlinker、特殊修饰碱基、特异性DNA序列。 [0032] 可选地,所述工具酶包括外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA内切酶; [0033] 所述外切酶,不限于Exo I,Exo III,Exo T5,lambda Exo,ExoT7等; [0034] 所述DNA聚合酶,不限于Taq聚合酶、Phusion等具有DNA合成功能的聚合酶; [0035] 所述DNA连接酶,不限于T4DNA连接酶、T7DNA连接酶、TaqDNA连接酶、E.coli DNA连接酶等; [0036] 所述DNA内切酶,不限于UDG、EndoVIII、EndoIV、Fpg等; [0037] 优选地,所述特殊修饰碱基还包括用于防止链延伸的碱基和/或防止目标DNA文库的3’端OH延伸的碱基。 [0038] 可选地,所述特殊修饰碱基不限于dUTP、8-oxo-dGTP、dITP、AP位点、RNA碱基等。 [0039] 测序文库的标准过程是多个不同样本DNA文库构建成功后,需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据。 [0040] 本发明的有益效果:利用固定数量的磁珠捕获DNA分子,使得获取固定量的DNA分子变得容易,后续的混样中只需要按照DNA分子摩尔比例分配每个样本的上机测序数据即可,省去了前期处理的测DNA浓度,测DNA文库摩尔浓度等繁琐的步骤,大大简化了多个不同样本DNA文库上机测序前的处理过程,可以实现自动化操作,成本低,实用性强。附图说明 [0041] 图1为本发明方法的原理图。 [0042] 图2为本发明方法中的标准捕获试剂消化能力测试。 [0043] 图3为本发明方法的NGS文库标准化效果测试。 具体实施方式[0044] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 [0045] 实施例1:DNA文库构建 [0046] 本实施例中,使用ABclonal商业化RapidMaxDNALibPrepKitforillumina(RK20217)构建DNA文库,最终的DNA文库使用三种不同化学修饰的PCR引物进行文库扩增。第一种PCR引物对是TPC1primer(5’-AATGATACGGCGACCACCGAG-3’)/TPC2 Primer(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’);第二种PCR引物对是TPC1*primer(5’- AATGATACGGCGACCACCGA*G-3’)/TPC2*Primer(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G-3’);第三种PCR引物对是S4TPC1primer(5’-A*A*T*G*ATACGGCGACCACCGAG-3’)/S4TPC2 Primer(5’-C*A*A*G*CAGAAGACGGCATACGAG-3’)。*代表硫代修饰的磷酸硫脂键。具体的文库准备步骤详见商业化试剂盒操作说明书。以下所示是基本的DNA文库构建步骤: [0047] 1 End Prep Reaction [0048] 1.1配制反应体系如下 [0049] [0050] 1.2运行反应程序 [0051] 20℃/30min,65℃/30min,4℃/hold. [0052] 2 Ligation [0053] 2.1配制反应体系如下 [0054] [0055] 2.2运行反应程序 [0056] 20℃/15min,12℃/hold. [0057] 3 Post-ligation Cleanup [0058] 按照1.0x AMPure XP磁珠比例进行DNA纯化。21μl洗脱磁珠。取20μl adapter-ligated DNA用于后续PCR反应。 [0059] 4 PCR [0060] 4.1配制反应体系如下 [0061] [0062] [0063] 4.2运行反应程序 [0064] 98℃/45s;8cycles(98℃/10s,60℃/30s,72℃/30s);72℃/1min;4℃/hold.[0065] 5 Post-PCR Cleanup [0066] 使用1.0x AMPure XP DNA纯化磁珠进行DNA的PCRcleanup。31μl水洗脱磁珠。取30μl DNA文库。 [0067] Qubit定量,三种文库的产量基本一致,没有显著差异。 [0068] 实施例2:DNA文库消化能力测试 [0069] 本实施例使用的是尚未商业化的标准捕获试剂,组成是50mMTrisHCl pH7.9,5U exonuclease T7,2U Phusion,120U E.coli DNA ligase,10U T4PNK,50uM NAD+,0.5mM ATP,0.2mM dNTP.该试剂能够实现DNA文库的消化过程和捕获过程。本实施例测试标准捕获试剂对DNA文库的消化能力。以实施例1中三种文库产物为底物,测试标准捕获试剂在不同时间点对DNA文库的消化效果。 [0070] 以下所示是实验过程: [0071] 配制反应体系如下 [0072] [0073] [0074] 在50℃温度下,反应0,5,10,20,30分钟; [0075] 在不同反应时间点,加入10μl 0.5MEDTA终止反应; [0076] 加入6×DNA loading buffer,进行2%琼脂糖胶电泳。 [0077] 实验结果如图2所示,TPC1/2*DNA文库和S4TPC1/2DNA文库在30min后出现文库轻微降解;TPC1/2DNA文库在30min后降解完全。实验说明硫代修饰可以延缓标准捕获试剂内外切酶的消化作用。 [0078] 实施例3:标准捕获磁珠探针测试 [0079] 本实施例使用的是尚未商业化的标准捕获试剂,包含了外切酶、聚合酶、连接酶、修饰酶等在内的几种工具酶混合溶液(同实施例2),能够实现DNA文库的消化过程和捕获过程。本实施例测试标准捕获试剂对DNA文库的捕获能力。本实施例使用普通的DNA文库作为底物,测试标准捕获试剂与捕获磁珠探针的文库捕获能力,如图1。以下所示是具体实验过程: [0080] 配制反应体系如下 [0081] [0082] 在50℃温度下,反应20分钟; [0083] 加入10μl 0.5M EDTA终止反应; [0084] 使用磁力架吸附捕获磁珠,去除上清; [0085] 使用1×TE buffer漂洗磁珠2次; [0086] 使用20μl DNA洗脱液进行DNA洗脱; [0087] 使用Qubit测定洗脱DNA含量。 [0088] 实验结果:在标准捕获试剂与捕获磁珠探针存在条件下,DNA文库捕获/回收效率在84.5%。 [0089]实验组 实验组1 实验组2 实验组3 实验组4 DNA浓度ng/μl N/A 3.38 N/A N/A [0090] 实施例4:NGS文库标准化测试 [0091] 本实施例使用的是尚未商业化的NGS DNA文库Pooling标准化试剂(同实施例2),包含标准捕获试剂和捕获磁珠探针。本实施例以多种不同含量的DNA文库为底物,测试DNA文库标准化效果。本实验涵盖DNA文库消化、文库捕获、文库洗脱等步骤,然后再通过qPCR定量标准化文库进行检验。以下所示是具体实验过程: [0092] 1.DNA文库消化与捕获 [0093] 配制如下反应 [0094] [0095] 在50℃温度下,反应20分钟; [0096] 加入10μl 0.5M EDTA终止反应; [0097] 使用磁力架吸附捕获磁珠,去除上清; [0098] 使用1x TE buffer漂洗磁珠2次; [0099] 2.DNA文库洗脱 [0100] 加入20μl DNA洗脱液进行DNA洗脱,重选磁珠,放置37℃反应15min,75℃灭活20min; [0101] 使用磁力架吸附捕获磁珠,保留上清; [0102] 3.标准化文库的qPCR定量 [0103] 使用商业化DNA文库qPCR定量试剂盒,测定标准化后文库DNA含量。 [0104] 实验结果如图3所示:在同样的捕获磁珠探针投入量,及多个不同DNA含量文库情况下,NGS DNA文库Pooling标准化试剂能够捕获/回收文库能力保持一致。 |