一种生化试剂盒及其应用方法 |
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| 申请号 | CN201811575706.5 | 申请日 | 2018-12-22 | 公开(公告)号 | CN109652861A | 公开(公告)日 | 2019-04-19 |
| 申请人 | 阅尔基因技术(苏州)有限公司; | 发明人 | 罗俊峰; 陈苗苗; 杨继伟; 刘香琼; 欧阳虎; 陈云弟; | ||||
| 摘要 | 本 发明 适用于生化技术领域，提供了一种生化 试剂 盒 及其应用方法，该试剂盒包括：盒体以及存放于盒体中的试剂；试剂包括：浓度为5～40μM的试剂A，浓度为0.5～10μM的试剂B，浓度为500～50000units/mL的试剂C，浓度为1～10mM的试剂D，浓度为500～50000units/mL的试剂E，浓度为1～100μM的试剂F，浓度为500～50000units/mL的试剂G；和浓度为1～10μM的试剂H；试剂A为Cas12a和/或Cas9；试剂B为sgRNA；试剂C为聚合酶；试剂D为硫代核苷酸；试剂E为核酸外切酶；试剂F为含有分子标签序列的试剂；试剂G为酶制剂；试剂H为含有通用测序引物序列和酶的试剂。利用本发明的试剂对基因区域进行富集并构建基因文库，可较传统富集方式缩短3～5倍的时间，富集区域的局限性小，且操作简便，试剂成本较低。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种生化试剂盒，其特征在于，包括盒体以及存放于所述盒体中的试剂； |
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| 说明书全文 | 一种生化试剂盒及其应用方法技术领域[0001] 本发明属于生化技术领域，尤其涉及一种生化试剂盒及其应用方法。 背景技术[0003] 现有的基因区域富集技术多采用基因杂交捕获的方式，但是，这种杂交捕获技术的杂交时间长达4-24小时，并且仅适用于短基因区域(总长度小于或等于24kb的连续/非连续区域)；且在对这些基因区域进行富集时通常需要用到修饰有生物素的探针、杂交反应液和封闭试剂，整个富集的操作过程复杂且成本相对较高。 [0004] 由此可见，现有的基因富集技术存在杂交时间长、富集区域局限性大、且操作复杂成本高的问题。 发明内容[0005] 本发明实施例提供一种生化试剂盒，旨在解决现有的基因富集技术存在杂交时间长、富集区域局限性大、且操作复杂成本高的问题。 [0006] 本发明实施例是这样实现的，一种生化试剂盒，包括盒体以及存放于所述盒体中的试剂； [0007] 所述试剂包括：浓度为5～40μM的试剂A，浓度为0.5～10μM的试剂B，浓度为500～50000units/mL的试剂C，浓度为1～10mM的试剂D，浓度为500～50000units/mL的试剂E，浓度为1～100μM的试剂F，浓度为500～50000units/mL的试剂G；和浓度为1～10μM的试剂H； [0008] 所述试剂A为Cas12a和/或Cas9；所述试剂B为sgRNA；所述试剂C为聚合酶；所述试剂D为硫代核苷酸；所述试剂E为核酸外切酶；所述试剂F为含有分子标签序列的试剂；所述试剂G为酶制剂；所述试剂H为含有通用测序引物序列和酶的试剂。 [0009] 进一步的，所述试剂B为由sgDNA oligos经过转录而成的sgRNA(small guide RNA)混合物。 [0010] 进一步的，所述试剂C为Klenow Fragment(3'→5'exo-)和/或DNA聚合酶I。 [0011] 进一步的，所述试剂D为 [0012] 1-Thio-2'-Deoxyadenosine-5'-Triphosphate,1-Thio-2'-Deoxycytidine-5'-Triphosphate,1-Thio-2'-Deoxyguanosine-5'-Triphosphate,1-Thio-2'-Deoxythymidine-5'-Triphosphate中的其中一种或其任意组合的混合物。 [0013] 进一步的，所述试剂E为T7核酸外切酶、T5核酸外切酶、RecJf核酸外切酶、核酸外切酶VII、核酸外切酶V、Lambda核酸外切酶、核酸外切酶III、核酸外切酶T或者核酸外切酶I中的一种或者其任意组合的混合物。 [0014] 进一步的，所述分子标签序列的结构包括碱基数目在5～100个的通用序列区、碱基数目在0-24个的分子标签区和碱基数目在0-16个随机引物区。 [0015] 进一步的，所述试剂G为Klenow Fragment(3'→5'exo-)、T4DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Phi29聚合酶、Bst聚合酶、T4连接酶或者Taq连接酶中的一种或其任意组合的混合物。 [0016] 进一步的，所述试剂H为碱基数目为5～100个的通用测序引物序列和高温聚合酶的混合物。 [0017] 优选的，所述试剂包括：浓度为20μM的试剂A，浓度为2μM的试剂B，浓度为5000units/mL的试剂C，浓度为5mM的试剂D，浓度为5000units/mL的试剂E，浓度为15μM的试剂F，浓度为5000units/mL的试剂G；和浓度为5μM的试剂H。 [0018] 本发明实施例还提供了上述试剂盒的应用方法，包括如下步骤： [0019] 将所述试剂A和试剂B稀释至使用浓度后混合形成混合液Ⅰ； [0020] 将所述混合液Ⅰ与样本基因组DNA进行孵育，得到第一孵育物； [0021] 将所述试剂C和试剂D稀释至使用浓度后混合形成混合液Ⅱ，并加入到所述第一孵育物中，形成第一处理液； [0022] 将所述试剂E稀释至使用浓度后加入到所述第一处理液中，得到第二处理液； [0023] 将所述试剂F和试剂G稀释至使用浓度后加入到所述第二处理液中，得到第三处理液； [0024] 将所述试剂H稀释至使用浓度后加入到所述第三处理液中，以扩增所述第三处理液中的样本基因组DNA，形成完整的可供高通量测序的文库。 [0025] 本发明实施例提供的试剂盒，该试剂盒中包括上述试剂A～H，利用上述试剂A～H对基因区域进行富集，构建基因测序文库时，不需要用到修饰有生物素的探针，也不需要亲和素磁珠，降低了试剂的生产成本；并且在针对目标区域(基因区域)进行富集时，不需要用到传统的成本较高的杂交反应液和封闭试剂，因此可进一步节省这部分试剂的成本(50-350元)，并且，利用本发明提供的试剂进行目标区域富集构建基因文库的时间相比于传统的试剂建库时间缩短了3～5倍，可进一步降低1～1.5倍的成本；并且本发明提供的试剂可适用于短目标区域(总长度小于或等于24kb的连续/非连续区域)和长目标区域(总长度大于24kb的连续/非连续区域)的基因富集，即对于富集基因的长度的局限很小，适用范围广、实用性更强。 附图说明 [0026] 图1是本发明实施例提供的分子标签序列的结构示意图； [0027] 图2是本发明实验例一的原理说明示意图； [0028] 图3是本发明实施例提供的sgDNA候选序列的结构示意图； [0029] 图4是本发明实施例提供的特异性序列区与目标DNA正负链区域上表现为按照顺序式、叠瓦式或者混合式的示意图； [0030] 图5是本发明实验例一的测序结果图； [0031] 图6是本发明实验例二的原理说明示意图； [0032] 图7是本发明实验例二的测序结果图； [0033] 图8是本发明实验例三的原理说明示意图； [0034] 图9是本发明实验例三的测序结果图； [0035] 图10是本发明实验例四的原理说明示意图； [0036] 图11是本发明实验例四的测序结果图； [0037] 图12是本发明实验例五的原理说明示意图； [0038] 图13是本发明实验例五的测序结果图。 具体实施方式[0039] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0040] 在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。 [0041] 本发明的试剂盒能适用于现有的自动化工作平台和高通量测序平台，提高反应通量，缩短筛查诊断时间。 [0042] 在本发明实施例中，上述试剂A为Cas12a/Cpf1、Cas9中的一种或多种的混合物，独立存放于试剂盒中，并置于-15～-80℃保存，优选的置于-20℃条件下保存，存储浓度优选为20μM，使用时稀释至浓度为2～200pmol/rxn。 [0043] 在本发明实施例中，上述试剂B为由sgDNA oligos经过转录而成的RNA混合物，独立存放于试剂盒中，并置于-15～-80℃保存，优选的置于-20℃条件下保存，存储浓度优选为2μM，使用时稀释至浓度为2pmol/rxn。 [0044] 进一步的，在使用过程中，将上述试剂A和试剂B进行预先混合，再与样本基因组进行混合。一般来说，样本基因组DNA的投入量为1～1000ng，优选的投入量为500ng。 [0045] 上述试剂A和试剂B的预混物对体外DNA不具有编辑活性，根据sgRNA中特异性序列区长度的不同，在体外可以表现出切割活性，也可以不具有切割活性，但具有寻址/结合DNA的活性。 [0046] 在本发明实施例中，上述试剂C独立存放于试剂盒中，-20℃保存(适合范围-15℃～-80℃)，存储浓度为5000units/ml(适合范围500-50000units/ml)，使用浓度为2units/rxn(适合范围0.5～5units/rxn)。 [0047] 在本发明实施例中，上述试剂D独立存放于试剂盒中，-20℃保存(适合范围-15℃～-80℃)，存储浓度为5mM(适合范围1-10mM)，使用浓度为5nmol/rxn(适合范围0.5～40nmol nmol/rxn)。 [0048] 在使用过程中，将上述试剂C和试剂D同时加入到样本基因组DNA中，共同孵育样本基因组DNA。 [0049] 在本发明实施例中，上述试剂E独立存放于试剂盒中，-20℃保存(适合范围-15℃～-80℃)，存储浓度为5000units/ml(适合范围500-50000units/ml)，使用浓度为2units/rxn(适合范围0.5～5units/rxn)，使用时，与样本基因组DNA共同孵育。 [0050] 在本发明实施例中，上述试剂F独立存放于试剂盒中，-20℃保存(适合范围-15℃～-80℃)，存储浓度为15μM(适合范围1～100μM)，使用浓度为1μM(适合范围0.1～10μM)。 [0051] 上述试剂F为含有分子标签序列的试剂，其分子标签序列的结构如下图1所示，分为通用序列区、分子标签区和随机引物区。并且，通用序列区的碱基数目在5～100个，分子标签区的碱基数目在0～24个，随机引物区的碱基数目在0～16个。 [0052] 在本发明实施例中，在分析过程中，相同的分子只能提供一份信息，而采用上述“三分”结构式的分子标签序列，就可以让PCR产物的每个分子都能够被区分开，从而提高了数据的利用率。 [0053] 在本发明实施例中，上述试剂G独立存放于试剂盒中，-20℃保存(适合范围-15℃～-80℃)，存储浓度为5000units/ml(适合范围500-50000units/ml)，使用浓度为2units/rxn(适合范围0.5～5units/rxn)。 [0054] 在使用过程中，将上述试剂F和试剂G同时添加到样本基因组DNA中，与样本基因组DNA共同孵育。 [0055] Cas酶，比如Cas9核酸酶和Cas12a/cpf1，是由RNA介导链(single guide RNA，sgRNA)介导的核酸酶，可以催化双链DNA特异位点切割。它们的识别位点PAM(Protospacer Adjacent Motif)分别是NGG和TTN。Cas酶在DNA双链上依靠PAM位点进行寻址，搜寻与sgRNA匹配的DNA序列，然后对DNA链进行特异性切割，形成不同切割类型，比如Cas9核酸酶(S.pyogenes)能够形成平末端，Lba Cas12a/Cpf1能够形成5’粘性末端，而Spy Cas9Nickase只是切断DNA双链中的一条，形成一个切刻位置。本发明的试剂盒利用Cas酶在体外也能够特异性寻找目标位置的特性，配合sgRNA序列特异性评估软件，可以批量获得高效率的sgRNA候选序列，并且通过对目标基因区域的富集可快速构建得到可用于高通量测序平台的基因文库，大大缩短了基因文库的构建时间以及成本。 [0056] 本发明实施例还提供了一种试剂盒的应用方法，包括如下步骤： [0057] 步骤一、将所述试剂A和试剂B稀释至使用浓度后混合形成混合液Ⅰ。 [0058] 在本发明实施例中，利用sgRNA(single guide RNA)设计软件，如Cas-sgRNA Designer在目标基因区域中设计包含有编码sgRNA序列的模板DNA寡核苷酸序列并合成这些序列(Template DNA oligos containing the sgRNA-encoding sequence，简称sgDNA oligos)；再利用T7转录试剂将sgDNA oligos转录为sgRNA。可以理解的是，上述sgRNA设计软件除了Cas-sgRNA Designer外，还可以是现有的其他类型的sgRNA设计软件，只要能够实现该功能即可，在本发明中不做限制。具体的编码设计过程也可以参照现有的设计编码过程，在此不做赘述。 [0059] 将试剂A和试剂B稀释至各自的使用浓度后再混合后，形成含有Cas酶和sgRNA的试剂，即混合液Ⅰ。 [0060] 步骤二、将所述混合液Ⅰ与样本基因组DNA进行孵育，得到第一孵育物。 [0061] 在本发明实施例中，样本基因组DNA可以为人体中的各种基因组，例如，HBD和HBB基因等。 [0062] 步骤三、将所述试剂C和试剂D稀释至使用浓度后混合形成混合液Ⅱ，并加入到所述第一孵育物中，形成第一处理液。 [0063] 在本发明实施例中，混合液Ⅱ为有聚合酶和硫代核苷酸的试剂，利用混合液Ⅱ处理上述第一处理液，并在第一处理液中的样本基因组DNA的3’端加A，形成3’端A碱基粘性末端，即修复样本基因组DNA。 [0064] 步骤四、将所述试剂E稀释至使用浓度后加入到所述第一处理液中，得到第二处理液。 [0065] 在本发明实施例中，利用上述试剂E处理第一处理液，可去除上述步骤四种没有被修复的样本基因组DNA片段，得到第二处理液。 [0066] 步骤五、将所述试剂F和试剂G稀释至使用浓度后加入到所述第二处理液中，得到第三处理液。 [0067] 在本发明实施例中，往第二处理液中加入上述试剂F和试剂G，进行TA连接，形成可扩增的样本基因组DNA片段。 [0068] 步骤六、将所述试剂H稀释至使用浓度后加入到所述第三处理液中，以扩增所述第三处理液中的样本基因组DNA，形成完整的可供高通量测序的文库。 [0069] 在本发明实施例中，加入上述试剂H，对上述第三处理液中的样本基因组DNA进行扩增，形成完整的可供高通量测序的文库分子，可利用该文库进行二代高通量测序，筛查相关的基因疾病。 [0070] 为了进一步说明本发明提供的试剂盒以及应用方法的技术效果，下面通过几个示例性的实验例进行详细的说明。 [0071] 实验例一、基于Cas9有切割活性复合物的对人基因组不同基因总共6kb区域进行富集和连接建库的应用 [0072] 在本实施例中，活性复合物是指Cas9与sgRNA结合之后形成的复合体，sgRNA特异性序列区在16-20nt时，该复合体具有寻址能力和切割活性，相对于后续实验例中的“无切割活性复合物”，是当sgRNA特异性区域在14nt时，形成的复合体只有寻址能力，而没有切割活性。 [0073] 图2为本实施例的原理说明示意图，如图2所示，原理步骤1-1：样本基因组DNA片段，与预制好的的Cas-sgRNA进行孵育，形成Cas-sgRNA复合体1和Cas-sgRNA复合体2。 [0074] 原理步骤1-2：Cas-sgRNA复合体1和Cas-sgRNA复合体2会将DNA片段切割成Cas-sgRNA-DNA复合体1、Cas-sgRNA-DNA复合体2和冗余DNA片段三种类型，其中Cas-sgRNA复合体2中含有目标区域DNA片段，被切割的DNA形成平末端。 [0075] 原理步骤1-3：通过高温将Cas蛋白灭活，Cas-sgRNA复合体被解离，其中Cas-sgRNA-DNA复合体1解离成DNA片段、解离的Cas-sgRNA复合体1，Cas-sgRNA-DNA复合体2解离成目标区域DNA片段和解离的Cas-sgRNA复合体2。 [0076] 原理步骤1-4：加入Klenow exo-酶和硫代dATP，使DNA平末端形成3’硫代A碱基突出粘性末端，其中目标区域DNA片段两端都能形成3’硫代A碱基突出粘性末端，其他片段只有一端可以形成3’硫代A碱基突出粘性末端。 [0077] 原理步骤1-5：利用核酸外切酶I和核酸外切酶III无法降解3’硫代碱基的特性，双端带有硫代A碱基的目标区域DNA片段得以保留下来，其他DNA片段都会被核酸外切酶降解掉。 [0078] 原理步骤1-6：在核酸外切酶处理过的溶液中，加入连接酶和测序接头，进行TA连接。 [0079] 原理步骤1-7：经过连接，获得完整的可扩增文库DNA片段，进过PCR扩增之后，即可以进行二代高通量测序了。 [0080] 在本示例性实验例中，利用本发明提供的试剂盒中的试剂构建基因测序文库的过程如下： [0081] 1、sgDNA oligos的筛选和制备 [0082] 1.1sgDNA oligo设计。本实验例选用Cas-sgRNA Designer软件，对AR、CATSPER1、CHD7、CYP11B1、CYP17A1、CYP21A2、COL4A5、UTY、FMR1、NR0B1、SOX3等基因的多个区域设计29条寡聚脱氧核糖核苷酸片段(Seq ID 1-29)作为上游引物Primer F，其中sgRNA的特异性序列区为16nt，另外设计通用寡聚脱氧核糖核苷酸片段TracrRNA(Seq ID 30)作为下游引物Primer R。 [0083] 在本实验例中，采用Cas-sgRNA Designer软件筛选sgRNA序列的过程如下： [0084] 接收用户输入的一个或多个目标基因区域，其中用户输入的内容可以为“chr16:189,137-232,194”这样的位置信息，该位置信息对应的版本号是GRCh37/hg19，并向用户输出可用于oligo合成的序列。此外，还可接收用户输入的序列信息 ，如 “ATCGTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTAG……..”，同样可向用户输出相应的可用于oligo合成的序列。 [0085] 根据Cas酶的Pam序列(proto-spacer adjacent motif)对目标基因区域进行搜索，提取相应的序列作为sgDNA候选序列； [0086] 输出所述sgDNA候选序列在基因组的同源性参数Evalue和Hits； [0087] 计算出所述sgDNA候选序列的CG％含量，同时计算所述sgRNA候选序列的剪切效率Fc＝(CG％×Hits×En)/Evalue，其中En为常数； [0088] 将高于预设Fc阈值的所述sgDNA候选序列进行碱基合成。 [0089] 其中，sgDNA候选序列的结构如下图3所示分成三个部分：转录启动区，特异性序列区和结构稳定区。其中，转录启动区的碱基数目在5-50个；特异性序列区的碱基数目在10-25个，与目标基因组某一段序列互补；结构稳定区的碱基数目在1-75个；特异性序列区与目标DNA正负链区域上表现为按照顺序式、叠瓦式或者混合式，如下图4所示。 [0090] 1.2制备sgDNA双链作为转录的模板。将上述步骤1.1中设计得到的29条Primer F(100μM)等体积混合，混合液Primer F Mix和Primer R(100μM)作为扩增引物加入下述PCR体系：2×KAPA HiFi HotStart Readymix 10μL，100μM Primer F Mix1μL，100μM Primer R 1μL，水8μL。在PCR仪上设置以下程序，进行PCR：98℃30s，35循环(98℃10s，55℃40s，72℃ 20s)，72℃2min，4℃∞。 [0091] 1.3利用T7试剂转录制备sgRNA [0092] 取0.2ml PCR管，按顺序在冰上加入以下试剂：上述PCR产物8μL，NTP混合物缓冲液10μL，T7转录酶2μL。混合均匀后，置于37℃孵育2-4h。转录完成后，用30μL水稀释体系并加入2μL DNaseⅠ，37℃处理15min。 [0093] sgRNA纯化：将磁珠从2-8℃冰箱中取出，充分颠倒混匀后室温平衡30min。在sgRNA产物中加入1.8倍体系的磁珠，混匀磁珠与产物，室温孵育5min。瞬时离心，将PCR管放入磁力架上，吸附3分钟，直至液体澄清。保持PCR管在磁力架上，吸出上清液，注意不要吸到磁珠。向PCR管中加入200μL新配制的80％乙醇，30s后吸出，此过程保持PCR管在磁力架上。重复80％乙醇清洗操作一次。将PCR管瞬时离心3-5s，用10μL吸头吸出残余液体；保持开盖，室温晾干3-5min，直至磁珠表面没有反光水膜，管壁上亦无水珠残留。将PCR管从磁力架上取下，向管中加入30-100μL RNase-Free Water，混匀磁珠，室温放置5分钟；瞬时离心3-5s，将PCR管放回磁力架吸附2分钟，直至液体澄清，将上清转移到新的离心管中。 [0094] sgRNA的检测：使用NanoDrop测定sgRNA的浓度及纯度，确认其A260/A280比值大于2.0。用水将sgRNA稀释至使用浓度2μM。 [0095] 1.4试剂A和试剂B的准备和应用 [0096] 取0.2mL离心管，按顺序加入以下组分：水24μL，10×Cas9反应缓冲液3μL，sgRNA(2μM)1μL，Cas9核酸酶(2μM)1μL。混合均匀后，室温放置10min。取1μL磁珠纯化后基因组(100ng)加入体系，移液器吸打5-10次混匀，置于37℃反应1h。酶切结束后，反应体系置于70℃10min灭活Cas9。 [0097] 1.5试剂C和试剂D的准备和应用 [0098] 取0.2ml PCR管，按顺序加入以下试剂：片段筛选后DNA 24.6μL,10×Klenow聚合酶缓冲液3μL，1mM硫代dATP(N-8001，TriLink Biotechnologies)0.6μL，Klenow exo-(NEB)1.8μl。移液器吸打5-10次混匀，37℃30min。 [0099] 1.6试剂E的准备和应用：加入核酸外切酶III(NEB)和核酸外切酶I(NEB)各1μL，37℃30min，80℃20min，保持在4℃。 [0100] 1.7试剂F和试剂G的准备和应用 [0101] 连接测序接头：将适用于Illumina测序平台的接头稀释至15μM，按顺序加入试剂配制连接反应：核酸外切酶反应产物32μL，水0.5μL，连接缓冲液15μL，DNA连接酶5μL，稀释接头2.5μL。移液器吸打5-10次混匀，置于20℃孵育15min。 [0102] 连接接头后纯化：加入0.8倍体积的磁珠到基因组中，涡旋混匀，室温静置5分钟；将PCR管短暂离心，并置于磁力架中；静置3分钟，等待溶液澄清后，小心移除管中上清；保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；重复： 保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清； PCR管低速离心15sec，放回磁力架，小心移除余液，开盖置于室温风干约5分钟(避免磁珠沉淀开裂)；加入22μL的Elution Buffer(10mM Tric-HCl,pH 8.0)重悬磁珠，涡旋混匀，室温静置2分钟；PCR管短暂离心后，置于磁力架上5分钟，将20μL上清移入新的PCR管中备用。 [0103] 1.8试剂H的准备和应用 [0104] 连接产物扩增：取0.2ml PCR管，按顺序加入以下试剂：2×KAPA Hifi Hotstart ReadyMix(高保真DNA聚合酶预混液)25μL，10×文库扩增引物混合物5μL，连接接头纯化产物20μL。设置以下PCR扩增程序进行PCR：98℃45s,(98℃15s,60℃30s,72℃30s)6-20循环(具体循环数根据起始基因组浓度而定),72℃1min,保持4℃。 [0105] PCR产物纯化：加入1倍体积的磁珠到基因组中，涡旋混匀，室温静置5分钟；将PCR管短暂离心，并置于磁力架中；静置3分钟，等待溶液澄清后，小心移除管中上清；保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；重复：保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；将PCR管低速离心15sec，放回磁力架，小心移除余液，开盖置于室温风干约5分钟(避免磁珠沉淀开裂)；加入22μL的Elution Buffer(10mM Tric-HCl,pH 8.0)重悬磁珠，涡旋混匀，室温静置2分钟；PCR管短暂离心后，置于磁力架上5分钟，将20μL测序文库移入新的PCR管中。取适量文库进行琼脂糖凝胶电泳和Qubit，确认文库大小和浓度。常规Illumina Hiseq 2500进行测序，测序分析的结果如图5所示。 [0106] 本实施例涉及多个基因共18个区段，片段长度在200～400bp之间，在图5(IGV_2.3.59软件截图)中示例X染色体上SOX3基因的外显子区域，在该区域，设计了3个sgRNA，可以将该区域切割成两部分chrX:139586423-139586657和chrX:139586658-139586965，从IGV呈现的reads可以看出，3个sgRNA和Cas9形成的复合体正确地切割了正确的位置，因此绝大多数reads都有相同的末端。由于我们的测序模式2×150，因此在chrX:139586423- 139586657这个只有235bp的区域段会有overlap(因此小于300)，而在chrX:139586658- 139586965这个308的区域段会有8个碱基的gap。在这个区域段，测序的深度大约是100+×，对于遗传分析来说，这是足够的。 [0107] 实验例二、基于Cas9无切割活性复合物的对人类HBD和HBB基因进行富集和连接建库的应用 [0108] 图6为本实验例的原理说明示意图，如图6所示，原理步骤2-1：样本基因组DNA先进行超声打断，其中基因DNA片段2-2是包含有目标区域DNA片段的，基因组DNA片段2-1并未包含有目标区域，片段化后的基因组DNA与预制好Cas-sgRNA复合体进行孵育；经过孵育，由于Cas-sgRNA复合体只有寻址活性没有切割活性，因此基因DNA片段2-2在结合了Cas-sgRNA复合体3和Cas-sgRNA复合体4之后并没有被切割，基因DNA片段2-1由于未包含目标区域，因此也不会被Cas-sgRNA寻址到并结合；然后我们加入甲醛溶液，将Cas-sgRNA复合体3和Cas-sgRNA复合体4固定在DNA上； [0109] 原理步骤2-2：加入Lambda核酸外切酶和核酸外切酶I，基因DNA片段2-1被完全降解，基因DNA片段2-2由于蛋白质的空间位阻作用，目标区域DNA片段被保留下来； [0110] 原理步骤2-3：将Cas-sgRNA解离，将只剩下目标区域DNA片段的基因DNA片段2-2释放出来； [0111] 原理步骤2-4：加入Klenow exo-酶和硫代dNTP，进行末端修复和加A形成粘性末端； [0112] 原理步骤2-5：加入连接酶和二代高通量测序文库接头，进行TA连接； [0113] 原理步骤2-6：连接后，形成完整的可扩增文库DNA片段，PCR扩增之后，可以进行二代高通量测序。 [0114] 在本示例性实验例中，利用本发明提供的试剂盒中的试剂构建基因测序文库的过程如下： [0115] 2.1sgDNA oligos的筛选和制备 [0116] sgDNA oligos的设计。用Cas-sgRNA Designer软件，对HBB和HBD基因进行顺序式探针设计，共109条dsgRNA序列(Seq ID 31-139)，其中sgRNA的特异性序列区为14nt；按照上述实验例1方法，制备dsgRNA，并用水稀释至使用浓度2uM。 [0117] 2.2制备sgDNA双链作为转录的模板，同实验例1中的相应环节。 [0118] 2.3试剂A和试剂B的准备和应用 [0119] 样本基因组的片段化： [0120] 基因组用超声破碎仪按照500bp peak打断，仪器设置参数为：Peak Incident Power(W)105,Duty Factor 5％,Cycles per Burst 200,Treatment Time(s)80。 [0121] 试剂A与试剂B的混合液Ⅰ与片段化的样本基因组DNA共同孵育。 [0122] 取0.2mL离心管，分别按顺序加入以下组分：水24μL，10×Cas9反应缓冲液3μL，sgRNA(2μM)1μL，Cas9核酸酶(2μM)1μL。混合均匀后，室温放置10min。取1μL片段化基因组(100ng)加入体系，移液器吸打5-10次混匀，置于37℃反应1-2h。 [0123] 甲醛固定Cas9/dsgRNA/DNA复合物体系：取1管Cas9酶切体系，加入37％甲醛溶液(终浓度为1％)，置于37℃反应15min。反应结束后加入2.5mM甘氨酸溶液(终浓度为0.125mM)室温放置5min终止甲醛固定作用。 [0124] 2.4试剂C的准备和应用 [0125] 切除非目标基因组部分：按顺序加入以下试剂：Lambda(NEB)1μL，核酸外切酶I(NEB)1μL，10×Lambda反应缓冲液5μL，用水补足相应体积。混匀后，置于37℃反应30min。反应结束后，80℃孵育20min灭活。加入1μL RNaseA，室温静置5min，去除体系内dsgRNA； [0126] 磁珠纯化剩余产物：加入1.8倍体系的磁珠到上清液中，涡旋混匀，室温静置5分钟；将PCR管短暂离心，并置于磁力架中；静置3分钟，等待溶液澄清后，小心移除上清；保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；重复：保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清； PCR管低速离心15sec，放回磁力架，小心移除余液，开盖置于室温风干约5分钟(避免磁珠沉淀开裂)；加入29μL的NFW重悬磁珠，涡旋混匀，室温静置2分钟；PCR管短暂离心后，置于磁力架上5分钟，将25μL上清移入新的PCR管中备用。 [0127] 2.5试剂D和试剂E的准备和应用 [0128] 取0.2ml PCR管，按顺序加入以下试剂：片段筛选后DNA 24.6μL,10×Klenow聚合酶缓冲液3μL，1mM硫代dNTP for each(N-8001～N-8004，TriLink Biotechnologies)0.6μL，Klenow exo-(NEB)1.8μl。移液器吸打5-10次混匀，37℃30min；75℃灭活20min。得到末端修复与加A产物。 [0129] 2.6试剂F和试剂G的准备和应用 [0130] 连接接头：将接头稀释至15μM浓度。按顺序加入试剂配制接头连接反应：末端修复加A产物30μL，水0.5μL，连接缓冲液15μL，DNA连接酶5μL，稀释接头2.5μL。移液器吸打5-10次混匀，置于20℃孵育15min。 [0131] 连接接头后纯化：加入0.8倍体积的磁珠到基因组中，涡旋混匀，室温静置5分钟；将PCR管短暂离心，并置于磁力架中；静置3分钟，等待溶液澄清后，小心移除管中上清；保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；重复： 保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清； PCR管低速离心15sec，放回磁力架，小心移除余液，开盖置于室温风干约5分钟(避免磁珠沉淀开裂)；加入22μL的Elution Buffer(10mM Tric-HCl,pH 8.0)重悬磁珠，涡旋混匀，室温静置2分钟；PCR管短暂离心后，置于磁力架上5分钟，将20μL上清移入新的PCR管中，得到连接接头纯化产物。 [0132] 2.7试剂H的准备和应用 [0133] 文库扩增：取0.2ml PCR管，按顺序加入以下试剂：2×KAPA Hifi Hotstart ReadyMix 25μL，10×文库扩增引物混合物5μL，连接接头纯化产物20μL。设置以下PCR扩增程序进行PCR：98℃45s,(98℃15s,60℃30s,72℃30s)6-20循环(具体循环数根据起始基因组浓度而定),72℃1min,保持4℃。 [0134] 纯化扩增产物：加入1倍体积的磁珠到基因组中，涡旋混匀，室温静置5分钟；将PCR管短暂离心，并置于磁力架中；静置3分钟，等待溶液澄清后，小心移除管中上清；保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；重复：保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；PCR管低速离心15sec，放回磁力架，小心移除余液，开盖置于室温风干约5分钟(避免磁珠沉淀开裂)；加入22μL的Elution Buffer(10mM Tric-HCl,pH 8.0)重悬磁珠，涡旋混匀，室温静置2分钟；PCR管短暂离心后，置于磁力架上5分钟，将20μL测序文库移入新的PCR管中。 [0135] 文库的质控：取适量文库进行琼脂糖凝胶电泳和Qubit，确认文库大小和浓度。常规Illumina Hiseq 2500进行测序。其中测序结果如图7所示。 [0136] 如图7所示，图中示出了2个样本Lib496和Lib497，与实施例1不同的地方在于，本实施例利用特异区域只有14nt的sgRNA屏蔽了Cas9酶的切割活性，利用其寻址/结合活性在DNA上形成Cas9-sgRNA-DNA复合体，阻碍外切酶的切割，留下被sgRNA定位的区域。在IGV软件中(如图7)我们可以看到，由于我们设计的sgRNA是顺序设计的，覆盖了HBD基因的内含子区域，在测序结果中也体现出reads覆盖了全基因。与实施例1不同，本实施例的样本基因组DNA事先经过随机打断，因此reads呈现出了符合实验设计思路的随机状态，即，包含有某一段区域的断口是多种多样的，并不是只有一个确定的断口。本次测序结果显示，在lib496样本中，HBD测序深度最高为311×，最低为145×，在lib497样本中，HBD测序深度最高为388×，最低为158×，HBD的平均深度大于200×，满足实际分析需要。 [0137] 实验例三、基于Cas9无切割活性复合物的对人类HBD和HBB基因进行富集、随机扩增建库的应用 [0138] 图8为本实验例的原理说明示意图，如图8所示，原理步骤3-1：样本基因组DNA不需要打断，长度在几Kb到几十Kb之间，其中基因DNA片段3-2是包含有目标区域DNA片段，基因组DNA片段3-1并未包含有目标区域，基因组DNA与预制好Cas-sgRNA复合体进行孵育；经过孵育，由于Cas-sgRNA复合体只有寻址活性没有切割活性，因此基因DNA片段3-2在结合了Cas-sgRNA复合体5和Cas-sgRNA复合体6之后并没有被切割，基因DNA片段3-1由于未包含目标区域，因此也不会被Cas-sgRNA寻址到并结合；然后我们加入甲醛溶液，将Cas-sgRNA复合体5和Cas-sgRNA复合体6固定在DNA上。 [0139] 原理步骤3-2：加入Lambda核酸外切酶和核酸外切酶I，基因DNA片段3-1被完全降解，基因DNA片段3-2由于蛋白质的空间位阻作用，目标区域DNA片段被保留下来。 [0140] 原理步骤3-3：将Cas-sgRNA解离，将只剩下目标区域DNA片段的基因组DNA片段3-2释放出来。 [0141] 原理步骤3-4：加入聚合酶，随机引物等扩增试剂，进行第一轮PCR扩增，由于其他未包含有目标区域的片段被外切酶降解，随机引物扩增的区域就主要集中在含有目标区域的基因组DNA片段中。 [0142] 原理步骤3-5：加入第二轮PCR扩增试剂，形成完整的文库DNA片段。 [0143] 在本示例性实验例中，利用本发明提供的试剂盒中的试剂构建基因测序文库的过程如下： [0144] 3.1试剂A和试剂B的准备和应用：sgRNA的制备同实施验例2相同。 [0145] 试剂A和试剂B的混合物和DNA的孵育同实施例2中基本相同，其不同之处仅在于，样本基因组DNA无需超声打断。 [0146] 3.2试剂C的准备和应用：同上述实验例2。 [0147] 3.3试剂D和试剂E的准备和应用：取0.2ml PCR管，按顺序加入以下试剂：2×KAPA Hifi Hotstart ReadyMix 30μL，10mM引物混合物(Seq ID 140-141)5μL，纯化产物25μL。设置以下PCR扩增程序进行PCR：98℃2mins,(98℃1min,25℃2mins,72℃2mins)4个循环,72℃1min,保持4℃。扩增结束后，加入核酸外切酶I继续37℃孵育20分钟。得到含有分子标签的产物。 [0148] 3.4试剂F的准备和应用 [0149] 二次扩增：取新的0.2ml PCR管，按顺序加入以下试剂：2×KAPA Hifi Hotstart ReadyMix 25μL，文库扩增引物混合物(Seq ID 142-143)5μL，上一步中含有分子标签的产物20μL。设置以下PCR扩增程序进行PCR：98℃45s,(98℃15s,60℃，30s,72℃30s)6-20循环,72℃1min,保持4℃。 [0150] 磁珠纯化：3.2.4.2.1.加入1.8倍体系的磁珠到上清液中，涡旋混匀，室温静置5分钟；将PCR管短暂离心，并置于磁力架中；静置3分钟，等待溶液澄清后，小心移除上清；保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；重复：保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清； PCR管低速离心15sec，放回磁力架，小心移除余液，开盖置于室温风干约5分钟(避免磁珠沉淀开裂)；加入29μL的NFW重悬磁珠，涡旋混匀，室温静置2分钟；PCR管短暂离心后，置于磁力架上5分钟，将25μL上清移入新的PCR管中备用。构建好的文库用常规Illumina Hiseq 2500进行测序，测序结果详见图9。 [0151] 如图9所示，图中示出了3个样本Lib115～117，与上述实施例2一样，本实施例利用特异区域只有14nt的sgRNA屏蔽了Cas9酶的切割活性，利用其寻址/结合活性在DNA上形成Cas9-sgRNA-DNA复合体，阻碍外切酶的切割，留下被sgRNA定位的区域，与实施例2不同的地方在于，本实施例的样本基因组DNA并没有事先进行超声打断，而是利用随机引物获得随机片段，在IGV软件中(如图9)我们可以看到，reads覆盖了HBD全基因，并且reads呈现出了符合实验设计思路的随机状态。本次测序结果显示，在Lib115～117三个样本，HBD测序深度最高依次为为494×，412×，457×，最低为261×，173×，260×，平均深度大于250×，满足实际分析需要。 [0152] 实验例四、基于Cas12a有切割活性复合物的对人类HBD和HBB基因进行富集、连接建库的应用 [0153] 图10为本实验例的原理说明示意图，如图10所示，原理步骤4-1：样本基因组DNA，与预制好的的Cas-sgRNA进行孵育，形成Cas-sgRNA复合体7和Cas-sgRNA复合体8。 [0154] 原理步骤4-2：Cas-sgRNA复合体7和Cas-sgRNA复合体8会将DNA片段切割成Cas-sgRNA-DNA复合体7、Cas-sgRNA-DNA复合体8和冗余DNA片段三种类型，其中Cas-sgRNA复合体2中含有目标区域DNA片段，被切割的DNA形成5’突出粘性末端。 [0155] 原理步骤4-3：通过高温将Cas蛋白灭活，Cas-sgRNA复合体被解离，其中Cas-sgRNA-DNA复合体7解离成DNA片段、解离的Cas-sgRNA复合体7，Cas-sgRNA-DNA复合体8解离成目标区域DNA片段和解离的Cas-sgRNA复合体8。 [0156] 原理步骤4-4：加入Klenow exo-酶和硫代dNTP，DNA 5’突出粘性末端被补平并形成3’硫代A碱基突出粘性末端，其中目标区域DNA片段两端都能形成3’硫代A碱基突出粘性末端，其他片段只有一端可以形成3’硫代A碱基突出粘性末端。 [0157] 原理步骤4-5：利用核酸外切酶I和核酸外切酶III无法降解3’硫代碱基末端的特性，双端带有硫代碱基的目标区域DNA片段得以保留下来，其他DNA片段都会被核酸外切酶降解掉。 [0158] 原理步骤4-6：在核酸外切酶处理过的溶液中，加入连接酶和测序接头，进行TA连接。 [0159] 原理步骤4-7：经过连接，获得完整的可扩增文库DNA片段，进过PCR扩增之后，即可进行二代高通量测序了。 [0160] 在本示例性实验例中，利用本发明提供的试剂盒中的试剂构建基因测序文库的过程如下： [0161] 4、sgDNA oligos的筛选和制备 [0162] 4.1sgDNA oligo设计。本实验例用Cas-sgRNA Designer软件，对HBB和HBD基因进行顺序式探针设计，共129条sgDNA oligo序列(Seq ID 143-272)，其中sgDNA的特异性序列区为20nt；各个片段按照相同比例混合作为制备sgRNA模板的上游引物Primer F，另外设计通用寡聚脱氧核糖核苷酸片段Cas12aSgT7(Seq ID 273)作为下游引物Primer R。 [0163] 4.2制备sgDNA双链作为转录的模板。其具体步骤与实验例1相同。 [0164] 4.3使用T7转录制备sgRNA。与实验例1中基本相同，其不同之处仅在于将纯化后sgRNA用水稀释至使用浓度4μM。 [0165] 4.4试剂A和试剂B的准备和应用 [0166] 取0.2mL离心管，分别按顺序加入以下组分：水24μL，10×Cas12a反应缓冲液3μL，sgRNA(4μM)1μL，Cas12a核酸酶(2μM)1μL。混合均匀后，室温放置10min。取1μL样本基因组DNA(100ng)加入体系，移液器吸打5-10次混匀，置于37℃反应1-2h。 [0167] 4.5试剂C和试剂D的准备和应用 [0168] 取0.2ml PCR管，按顺序加入以下试剂：片段筛选后DNA 24.6μL,10×Klenow聚合酶缓冲液3μL，10mM硫代dNTP 0.6μL(N-8001～N-8004，TriLink Biotechnologies，Klenow exo-(NEB)1.8μl。移液器吸打5-10次混匀后37℃孵育30min。 [0169] 4.6试剂E的准备和应用 [0170] 在上一步反应体系中，加入核酸外切酶III(NEB)和核酸外切酶I(NEB)各1μL，37℃30min，80℃，20min，保持4℃。 [0171] 4.7试剂F和试剂G的准备和应用 [0172] 取0.2ml PCR管，按顺序加入以下试剂：上一步反应体系溶液30μL，2μL 15μM Illunima测序接头，32μL Ligation high Ver.2，混合均匀后，16℃孵育1小时。 [0173] 4.8试剂H的准备和应用 [0174] 文库扩增：取0.2ml PCR管，按顺序加入以下试剂：2×KAPA Hifi Hotstart ReadyMix 25μL，10×文库扩增引物混合物5μL，连接接头纯化产物20μL。设置以下PCR扩增程序进行PCR：98℃45s,(98℃15s,60℃30s,72℃30s)6-20循环(具体循环数根据起始基因组浓度而定),72℃1min,保持4℃。 [0175] 纯化扩增产物：加入1倍体积的磁珠到基因组中，涡旋混匀，室温静置5分钟；将PCR管短暂离心，并置于磁力架中；静置3分钟，等待溶液澄清后，小心移除管中上清；保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；重复：保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；PCR管低速离心15sec，放回磁力架，小心移除余液，开盖置于室温风干约5分钟(避免磁珠沉淀开裂)；加入22μL的Elution Buffer(10mM Tric-HCl,pH 8.0)重悬磁珠，涡旋混匀，室温静置2分钟；PCR管短暂离心后，置于磁力架上5分钟，将20μL测序文库移入新的PCR管中。 [0176] 文库的质控：取适量文库进行琼脂糖凝胶电泳和Qubit，确认文库大小和浓度。文库进行常规Illumina Hiseq 2500进行测序，经过分析，图11中示出了Lib0224和Lib0225的结果，Cas12a与Cas9在蛋白质的特性上面有很大不同，Cas12a的Pam位点的序列类型更为丰富，由于本实施例采用的是顺序设计sgRNA，并且比较密集，从图11可以看出reads的分布也是随机的，Lib0224和Lib0225的最深测序深度为664×和585×，最低深度为368×和318×，平均深度大于450×，完全满足遗传分析的需求。 [0177] 实验例五、基于dCas9无切割活性复合体的对人类HBB和HBD基因进行富集、捕获和连接构建文库的应用 [0178] 图12为本实验例的原理说明示意图，如图12所示，原理步骤5-1：将样本基因组DNA随机打断，其中基因DNA片段5-2是包含有目标区域DNA片段，基因组DNA片段5-1并未包含有目标区域，基因组DNA与预制好dCas-SNAP-sgRNA复合体进行孵育，dCas-SNAP是一种带有SNAP蛋白标签的只有寻址/结合活性没有切割活性的Cas9酶；经过孵育，由于dCas-SNAP-sgRNA复合体只有寻址活性没有切割活性，因此基因DNA片段5-2在结合了dCas-sgRNA复合体5和dCas-sgRNA复合体6之后并没有被切割，基因DNA片段3-1由于未包含目标区域，因此也不会被dCas-sgRNA寻址到并结合。 [0179] 原理步骤5-2：加入Anti-SNAP-Beads，与SNAP标签结合。 [0180] 原理步骤5-3：经过洗涤步骤，只有与磁珠结合的基因组DNA片段5-2被保留的下来，没有与dCas-SNAP-sgRNA复合体结合的基因组DNA片段5-1被清除。 [0181] 原理步骤5-4：通过灭活，dCas-SNAP-sgRNA复合体被解离，基因组DNA片段5-2被释放出来。 [0182] 原理步骤5-5：加入Klenow exo-、硫代dNTP等试剂，基因组DNA片段5-2被末端修复，并形成3’硫代A碱基突出粘性末端。 [0183] 原理步骤5-6：加入连接试剂和3’端带有硫代保护的测序接头，进行TA连接。 [0184] 原理步骤5-7：连接之后，获得完整的可扩增文库DNA片段，同时加入Lambda外切酶和核酸外切酶I去除多余的测序接头和其他DNA杂质。 [0185] 在本示例性实验例中，利用本发明提供的试剂盒中的试剂构建基因测序文库的过程如下： [0186] 5、sgDNA oligos的筛选和制备 [0187] 5.1sgDNA oligo设计 [0188] sgRNA制备所需寡聚核糖核苷酸的设计。本实验例选用Cas-sgRNA Designer软件，对HBB和HBD基因的设计109条寡聚脱氧核糖核苷酸片段(Seq ID 274-382)作为制备sgRNA模板的上游引物Primer F，其中sgRNA的特异性序列区为16nt，Seq ID 30作为下游引物Primer R。 [0189] 5.2制备sgDNA双链作为转录的模板 [0190] 将上述步骤109条Primer F(100μM)等体积混合，混合液Primer F Mix和Primer R(100μM)作为扩增引物加入下述PCR体系：2×KAPA HiFi HotStart Readymix 10μL，100μM Primer F Mix 1μL，100μM Primer R 1μL，水8μL。在PCR仪上设置以下程序，进行PCR：98℃30s，35循环(98℃10s，55℃40s，72℃20s)，72℃2min，4℃∞。 [0191] 5.3转录制备sgRNA，与上述实验例1相同。 [0192] 5.4试剂A和试剂B的准备和应用 [0193] dCas9与样本基因组DNA孵育：取0.2mL离心管，按顺序加入以下组分：水24μL，10×NEBuffer3.1 3μL，sgRNA(2μM)1μL， Spy dCas9 (2μM，M0652T，NEB)1μL。混合均匀后，室温放置10min。加入500ng基因组，移液器吸打5-10次混匀，置于37℃反应1h。 [0194] 甲醛固定dCas9/sgRNA/DNA复合物体系：在上一步反应体系中，加入37％甲醛溶液(终浓度为1％)，置于37℃反应15min。反应结束后加入2.5mM甘氨酸溶液(终浓度为0.125mM)室温放置5min终止甲醛固定作用。 [0195] 捕获dCas9/sgRNA/DNA复合物：在上一步反应体系中，加入SNAP-Capture Magnetic Beads(S9145S)50μL，常温孵育1小时，每隔10分钟颠倒混匀一次；孵育结束后，在磁力架上静置5分钟，去除液体，注意不要触碰磁珠，PBS反复荡洗两次，加入22μL TE溶液，80℃孵育20分钟，离心吸取上清20μL到新的PCR管中，立即进行下一步。 [0196] 5.5试剂C和试剂D的准备和应用 [0197] 取0.2ml PCR管，按顺序加入以下试剂：上一步富集的DNA片段溶液20μL,Kapa End Repair mix 3μL，10×缓冲液3μL 10mM硫代dNTP各0.6μL(N-8001～N-8004，TriLink Biotechnologies)，移液器吸打5-10次混匀，37℃30min。 [0198] 5.6试剂E的准备和应用 [0199] 加入核酸外切酶III(NEB)和核酸外切酶I(NEB)各1μL，37℃30min，80℃20min，保持4℃。 [0200] 5.7试剂F和试剂G的准备和应用 [0201] 连接接头：按顺序加入试剂配制接头连接反应：上述核酸外切产物30μL，水0.5μL，连接缓冲液15μL，DNA连接酶5μL，15μM接头2.5μL。移液器吸打5-10次混匀，置于20℃孵育15min。 [0202] 连接产物纯化：加入0.8倍体积的磁珠到基因组中，涡旋混匀，室温静置5分钟；将PCR管短暂离心，并置于磁力架中；静置3分钟，等待溶液澄清后，小心移除管中上清；保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；重复：保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清； PCR管低速离心15sec，放回磁力架，小心移除余液，开盖置于室温风干约5分钟(避免磁珠沉淀开裂)；加入22μL的Elution Buffer(10mM Tric-HCl,pH 8.0)重悬磁珠，涡旋混匀，室温静置2分钟；PCR管短暂离心后，置于磁力架上5分钟，将20μL上清移入新的PCR管中备用。 [0203] 5.8试剂H的准备和应用 [0204] 连接产物扩增：取0.2ml PCR管，按顺序加入以下试剂：2×KAPA Hifi Hotstart ReadyMix 25μL，10×文库扩增引物混合物5μL，连接接头纯化产物20μL。设置以下PCR扩增程序进行PCR：98℃45s,(98℃15s,60℃30s,72℃30s)6-20循环(具体循环数根据起始基因组浓度而定),72℃1min,保持4℃。 [0205] 扩增产物纯化：加入1倍体积的磁珠到基因组中，涡旋混匀，室温静置5分钟；将PCR管短暂离心，并置于磁力架中；静置3分钟，等待溶液澄清后，小心移除管中上清；保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；重复：保持PCR管在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温静置30sec，小心移除上清；PCR管低速离心15sec，放回磁力架，小心移除余液，开盖置于室温风干约5分钟(避免磁珠沉淀开裂)；加入22μL的Elution Buffer(10mM Tric-HCl,pH 8.0)重悬磁珠，涡旋混匀，室温静置2分钟；PCR管短暂离心后，置于磁力架上5分钟，将20μL测序文库移入新的PCR管中。文库的质控。取适量文库进行琼脂糖凝胶电泳和Qubit，确认文库大小和浓度。常规Illumina Hiseq 2500进行测序，测序结果详见图13，在之前的实施例2和3中，利用特异性区域只有14nt的sgRNA屏蔽掉Cas9酶的切割活性，只保留寻址/结合活性，本实施例中,NEB生产的工程酶dCas9是一种带有氨基酸突变的Cas9酶，消除了酶的切割活性，保留寻址/结合活性，并且带有SNAP蛋白质标签，在dCas9-sgRNA-DNA复合物形成之后，可以被相应的磁珠结合并洗脱下来，由于样本基因组DNA先进行了随机打断，因此在图13实例Lib502和Lib504结果中，reads呈现随机分布，符合实验预期，同时HBD测序深度最高依次为为383×和387×，最低为171×和225×，平均深度大于250×，满足实际分析需要。 |
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