[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及二代测序文库构建，更具体来说，是一种二代测序建库试剂组分质控方法及使用的模板组合。

[0002] 目前基因测序随着成本的降低，二代测序也被广泛使用。对二代测序技术而言，基本可以分为两步分构成，第一步文库的构建，第二步针对已构建的文库进行测序，测序质量的好坏和准确性很大程度上受到文库质量的制约。

[0003] 但是建库过程中使用到的试剂较多，且针对不同的样本建库结果存在明显的区别。特殊样本如FFPE样本，对建库试剂的要求比较高，容易出现建库失败或者建库产出不合格的情况。鉴于其样本的特殊性，建库失败的原因推测有：1)样本差，序列中间存在较多缺刻、修饰等；2)建库人员操作失误，造成部分实验步骤失败；3)建库试剂质量存在问题，导致建库失败；鉴于上述问题我们无法判断问题出现原因。目前针对样本质控有较为全面的阐释，因此较为容易解决样本问题。操作误差可以通过较为细致的实验记录来进行判断，也较为容易进行判断。但是建库试剂由于建库过程中所用试剂较多，无法明确判断是全部试剂失效或者是部分试剂失效，因此针对建库试剂的质控迫在眉睫。

[0004] 目前市面上的建库试剂盒常规建库方法分为：步骤1)对DNA片段进行末端补平以及修复；步骤2)连接适配的接头；步骤3)对加上接头的文库进行扩增。文库质量的成功与否以分别涉及到以上四个步骤；因此对于以上三个步骤每个反应中关键步骤的把控，对于判断建库试剂组分是否合格至关重要。

[0005] 因此本领域需要一种对二代测序建库试剂盒建库试剂主要实验步骤的质控方法。

[0006] 为了对建库过程中各个步骤进行质控，发明人选择了几种同一来源的不同片段作为质控步骤的模板，分别对建库流程中各步骤进行质控，来判断建库试剂是否合格以及出现质量问题的试剂组分。

[0007] 因此，在第一方面，本发明提供了一种对建库流程进行质控的方法，所述方法包括：

[0008] 将A序列末端补平磷酸化加A，A序列为双链序列SEQ ID NO.4，其中最后四个核苷酸GATC为单链末端；

[0009] 将B序列末端补平磷酸化加A，B序列为双链序列SEQ ID NO.8，其中开始四个核苷酸TGCA为单链末端；

[0010] 将C序列末端补平磷酸化加A，C序列为双链序列SEQ ID NO.11。

[0011] 在一个实施方案中，所述方法还包括：

[0012] 将D序列末端补平磷酸化加A，D序列为双链序列SEQ ID NO.14；

[0013] 将E序列与接头连接，E序列为双链序列SEQ ID NO.17；

[0014] 将F序列进行PCR扩增，F序列为双链序列SEQ ID NO.20；

[0015] 将G序列进行文库片段纯化，G序列为双链序列SEQ ID NO.23。

[0016] 在一个实施方案中，所述方法还包括制备序列A和序列B的步骤：使用引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2扩增SEQ ID NO.24，然后用限制性内切酶BamHI-HF进行切割；使用引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6扩增SEQ ID NO.24，然后用限制性内切酶BamHI-HF进行切割。

[0017] 在一个实施方案中，所述方法还包括制备序列D-G的步骤：使用引物对SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19；SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22扩增SEQ ID NO.24。

[0018] 在第二方面，本发明还提供了一种对建库过程中的步骤进行质控的模板组合，所述模板组合包括：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ SEQ ID NO.14、ID NO.17、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.23。

[0019] 在第三方面，本发明还提供了用于制备本发明第二方面的模板组合的引物组，所述引物组包括选自如下的引物对：

[0020] SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19；SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。

[0021] 利用本发明的模板组合、引物组、方法，可以实现对二代测序建库试剂盒建库试剂主要实验步骤的质控。附图说明

[0022] 通过以下附图对本发明进行说明

[0023] 图1是设计质控模板片段在SEQ ID NO.24载体上的分布。

[0024] 图2是从SEQ ID NO.24载体制备A片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。

[0025] 图3是从SEQ ID NO.24载体制备B片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。

[0026] 图4是从SEQ ID NO.24载体制备C片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。

[0027] 图5是从SEQ ID NO.24载体制备D片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。

[0028] 图6是从SEQ ID NO.24载体制备E片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。

[0029] 图7是从SEQ ID NO.24载体制备F片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。

[0030] 图8是从SEQ ID NO.24载体制备G片段中得到的片段进行Qsp100毛细管电泳的检测结果。

[0031] 图9是在质控过程中A片段比对结果。

[0032] 图10是在质控过程中B片段比对结果。

[0033] 图11是在质控过程中C片段比对结果。

[0034] 图12是在质控过程中D片段比对结果。

[0035] 图13是在质控过程中E片段上机测序以及结果判定。

[0036] 图14是在质控过程中F片段上机测序以及结果判定。

[0037] 图15是在质控过程中G和F片段上机测序以及结果判定。

[0038] 实验步骤实例如下：

[0039] 为了对建库过程中各个步骤进行质控，发明人选择了几种同一来源的不同片段作为质控步骤的模板，分别对建库流程中各步骤进行质控，来判断建库试剂是否合格以及出现质量问题的试剂组分。

[0040] 具体操作方法如下：

[0041] 步骤一：

[0042] 获得末端修复、磷酸化、加A、接头连接、PCR扩增，每步的质控模板；

[0043] 使用SEQ ID NO.24载体为模板，使用不同的引物、酶进行扩增得到不同作用的质控片段。

[0044] 设计质控模板片段分布如图1所示。

[0045] 片段对应的目的以及质控步骤列表如下：

[0046]

[0047] 一)制备5’端突出的模板片段(A片段)；

[0048] 1)使用SEQ  ID  NO .24载体为模板，使用引物对A-F/R(A-F:TGAGTTAGCTCACTCATTAGGCAC(SEQ ID NO.1)；A-R：TTTTCCCAGTCACGACGTTGT(SEQ ID NO.2))，在KAPA高保真聚合酶的作用下得到片段大小约为215bp的平末端片段。

[0049] 具体序列如下(下划线部分表示酶切位点)：

[0050] >5'-3’TGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAA(SEQ ID NO.3)。

[0051] 实验步骤如下：

[0052] ①按照下表配制PCR扩增体系配制：

[0053]试剂 体积
SEQ ID NO.24(质粒)5ng/ul 1μl
5×HiFi buffer 10μl
10mMdNTP 1.5μl
KAPA高保真聚合酶 1μl
A-F/R引物(10uM) 2.5μl
无核酸酶污染的水 36.5μl
总体积 50μl

[0054] ②设置PCR程序如下：

[0055] Heat lid 105℃

[0056] 95℃维持4min

[0057] 30循环：98℃维持20s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0058] 72℃维持5min

[0059] 4℃保持

[0060] ③PCR纯化后按照模板：磁珠比例为1:1.5的比例进行纯化。纯化后进行定量质检。

[0061] 将所得到的片段进行Qsp100毛细管电泳检测，在215bp附近有一个峰(见图2A)。

[0062] 2)然后以上述215bp的平末端片段为模板，在限制性内切酶BamHI-HF(酶切位点为回文序列GGATCC，酶切位点在两条链的两个G之间)的作用下得到片段大小约为150bp的5’端突出的A片段。

[0063] A片段具体序列片段信息如下：

[0064] >5'-3’TGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATC(SEQ ID NO.4)。

[0065] 实验步骤如下：

[0066] ①按照下表配制酶切体系配制：

[0067]试剂 体积
A引物扩增后产物(1ug) x
BamHI-HF(酶) 1
CutSmart缓冲液10x 5
无核酸酶污染的水 44-x
总体积 50μl

[0068] ②设置PCR程序如下：

[0069] 37℃维持1h；

[0070] ③将所得到的片段进行Qsp100毛细管电泳检测，在150bp附近有一个峰(见图2B)。

[0071] ④通过切胶回收可以得到片段大小约为150bp的5’端突出的A质控模板片段。

[0072] 二)制备3’端突出的模板片段(B片段)；

[0073] 2)使用SEQ  ID  NO .24载体为模板，使用引物对B-F/R(B-F:CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGA(SEQ ID NO.5)；B-R:CTCTTCGCTATTACGCCAGCT(SEQ ID NO.6))在KAPA高保真聚合酶的作用下得到片段大小约为215bp的平末端片段。

[0074] 具体序列如下(下划线部分表示酶切位点)：

[0075] >5'-3’CAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGA(SEQ ID NO.7)。

[0076] 实验步骤如下：

[0077] ①按照下表配制PCR扩增体系配制：

[0078]

[0079]

[0080] ②设置PCR程序如下：

[0081] Heat lid 105℃

[0082] 95℃维持1min

[0083] 30循环：98℃维持20s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0084] 72℃维持2min

[0085] 4℃保持

[0086] ③PCR纯化后按照模板：磁珠比例为1:1.5的比例进行纯化。纯化后进行定量质检。

[0087] 将所得到的片段进行Qsp100毛细管电泳检测，在215bp附近有一个峰(见图3A)。

[0088] 3)然后在限制性内切酶PstI-HF(酶切位点为回文序列CTGCAG，酶切位点为GA之间)的作用下得到片段大小约为130bp的3’端突出的B片段。

[0089] B片段的具体序列如下：

[0090] >5'-3’TGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGA(SEQ ID NO.8)。

[0091] 实验步骤如下：

[0092] ①按照下表配制酶切体系配制：

[0093]试剂 体积
B引物扩增后产物(1ug) x
Pstl-HF(酶) 1
CutSmart缓冲液10x 5
无核酸酶污染的水 44-x
总体积 50μl

[0094] ②设置PCR程序如下：

[0095] 37℃维持1h；

[0096] ③将所得到的片段进行Qsp100毛细管电泳检测，在130bp附近有一个峰(见图3B)。

[0097] ④通过切胶回收可以得到片段大小约为150bp的3’端突出的质控模板B片段。

[0098] 三)制备平末端模板片段(C片段)

[0099] 3)使用SEQ ID NO.24载体为模板，使用引物对C-F/R(C-F:

[0100] ACAAGCTGTGACCGTCTCC(SEQ ID NO.9)；C-R:AAGTGCCACCTGACGTCTAA(SEQ ID NO.10))在KAPA高保真聚合酶的作用下得到片段大小约为150bp的平末端片段。

[0101] C片段的具体序列如下：

[0102] >5'-3’ACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTT(SEQ ID NO.11)。

[0103] 实验步骤如下：

[0104] ①按照下表配制PCR扩增体系配制：

[0105]试剂 体积
SEQ ID NO.24(质粒)5ng/ul 1μl
5×HiFi buffer 10μl
10mMdNTP 1.5μl
KAPA高保真聚合酶 1μl
C-F/R引物(10uM) 2.5μl
无核酸酶污染的水 36.5μl
总体积 50μl

[0106] ②设置PCR程序如下：

[0107] Heat lid 105℃

[0108] 95℃维持1min

[0109] 30循环：98℃维持20s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0110] 72℃维持2min

[0111] 4℃保持

[0112] ③PCR纯化后按照模板：磁珠比例为1:1.5的比例进行纯化。纯化后进行定量质检，得到质控模板C片段。

[0113] 将所得到的片段进行Qsp100毛细管电泳检测，在150bp附近有一个峰(见图4)。

[0114] 四)制备接3’加A质控模板片段(片段产物未加A，检测酶是否能加A，数据检测到则酶加A，未检测到，则酶失效)(D片段)

[0115] 使用SEQ ID NO.24载体为模板，使用磷酸化修饰的引物对D-F/R(D-F:

[0116] GCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTG(SEQ ID NO.12)；

[0117] D-R:GCGCCACATAGCAGAACTTT(SEQ ID NO.13))在KAPA高保真聚合酶的作用得到片段大小约为150bp的5’磷酸化的平末端片段。

[0118] D片段的具体序列如下：

[0119] >5'-3’GCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGC(SEQ ID NO.14)。

[0120] 实验步骤如下：

[0121] ①按照下表配制PCR扩增体系配制：

[0122]试剂 体积
SEQ ID NO.24(质粒)5ng/ul 1μl
5×HiFi buffer 10μl
10mMdNTP 1.5μl
KAPA高保真聚合酶 1μl
D-F/R引物(10uM) 2.5μl
无核酸酶污染的水 36.5μl
总体积 50μl

[0123] ②设置PCR程序如下：

[0124] Heat lid 105℃

[0125] 95℃维持1min

[0126] 30循环：98℃维持20s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0127] 72℃维持2min

[0128] 4℃保持

[0129] ③PCR纯化后按照模板：磁珠比例为1:1.5的比例进行纯化。纯化后进行定量质检，得到质控模板D片段。

[0130] 将所得到的片段进行Qsp100毛细管电泳检测，在150bp附近有一个峰(见图5)。

[0131] 五)制备接头连接质控模板片段(E片段)

[0132] 使用SEQ ID NO.24载体为模板，使用磷酸化修饰的引物对E-F/R(E-F:

[0133] GGATGGCATGACAGTAAGAGA(SEQ ID NO.15)；

[0134] E-R:CGATCAAGGCGAGTTACATGA(SEQ ID NO.16))在TaKaRa rTaq酶的作用下的大片段大小约为150bp的5’端已经磷酸化且3’端已经加A的平末端片段。

[0135] E片段的具体序列如下：

[0136] >5'-3’GGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGA(SEQ ID NO.17)。

[0137] 实验步骤如下：

[0138] ①按照下表配制PCR扩增体系配制：

[0139]试剂 体积
SEQ ID NO.24(质粒)5ng/ul 1μl
5×HiFi buffer 10μl
10mMdNTP 1.5μl
rTaq酶 1μl
E-F/R引物(10uM) 2.5μl
无核酸酶污染的水 36.5μl
总体积 50μl

[0140] ②设置PCR程序如下：

[0141] Heat lid 105℃

[0142] 95℃维持1min

[0143] 30循环：98℃维持20s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0144] 72℃维持2min

[0145] 4℃保持

[0146] ③PCR纯化后按照模板：磁珠比例为1:1.5的比例进行纯化。纯化后进行定量质检，得到质控模板片段E(图6)。

[0147] 六)制备PCR扩增质控模板片段(F片段)；

[0148] 使用SEQ ID NO.24载体为模板，使用引物对F-F/R(F-F

[0149] CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTTATCTACACGACGGGGAGT(SEQ ID NO.18)；

[0150] F-R:GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTTTCTACGGGGTCTGACG(SEQ ID NO.19))在rTaq酶的作用下得到片段大小约为250bp的大片段。

[0151] F片段的具体序列信息如下(下划线部分引入引物扩增结合序列)：

[0152] >5'-3’GTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGA(SEQ ID NO.20)。

[0153] 实验步骤如下：

[0154] ①按照下表配制PCR扩增体系配制：

[0155]试剂 体积
SEQ ID NO.24(质粒)5ng/ul 1μl
5×HiFi buffer 10μl
10mMdNTP 1.5μl
rTaq酶 1μl
F-F/R引物(10uM) 2.5μl
无核酸酶污染的水 36.5μl
总体积 50μl

[0156] ②设置PCR程序如下：

[0157] Heat lid 105℃

[0158] 95℃维持1min

[0159] 30循环：98℃维持20s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0160] 72℃维持2min

[0161] 4℃保持

[0162] ③PCR纯化后按照模板：磁珠比例为1:1.5的比例进行纯化。纯化后进行定量质检，得到质控G片段(图7)。

[0163] 七)制备二聚体等小片段质控模板片段(G片段)；

[0164] 使用SEQ ID NO.24载体为模板，使用引物对G-F/R(G-F:

[0165] CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTTACTCTAGCTTCCCGGC(SEQ ID NO.21)；G-R:

[0166] GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGCAATGATACCGCGAGAC(SEQ ID NO.22))在rTaq酶的作用下得到片段大小约为150bp的小片段。

[0167] G片段的具体序列信息如下：

[0168] >5'-3’CGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAG(SEQ ID NO.23)。

[0169] 实验步骤如下：

[0170] ①按照下表配制PCR扩增体系配制：

[0171]试剂 体积
SEQ ID NO.24(质粒)5ng/ul 1μl
5×HiFi buffer 10μl
10mMdNTP 1.5μl
rTaq酶 1μl
G-F/R引物(10uM) 2.5μl
无核酸酶污染的水 36.5μl
总体积 50μl

[0172] ②设置PCR程序如下：

[0173] Heat lid 105℃

[0174] 95℃维持1min

[0175] 30循环：98℃维持20s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0176] 72℃维持2min

[0177] 4℃保持

[0178] ③PCR纯化后按照模板：磁珠比例为1:1.5的比例进行纯化。纯化后进行定量质检(图8)。

[0179] 步骤二

[0180] 使用所制备的质控模板片段对建库中的各步骤进行质控检测；

[0181] 1)质控5’端突出片段末端补平；

[0182] A)将得到的质控模板A片段，模拟打断末端磷酸化质控底物进行下面的实验。

[0183] B)按照下表进行末端补平、加A体系mix准备：

[0184]试剂 体积
A片段 35μl
ER&dA Buffer 12μl
ER&dA Enzyme 3μl
总体积 50μl

[0185] 设置PCR程序反应如下：

[0186] Heat lid 85℃

[0187] 30℃维持30min

[0188] 72℃维持30min

[0189] 4℃维持∞

[0190] C)反应完成后的产物进行接头连接反应，具体反应体系和程序为：

[0191]试剂 体积
来自上步的反应体系 50μl
Adapter for Illumina(按照需要浓度) 5μl
Eco Ligation Buffer 22μl
Eco Ligation Enzyme 3μl
总体积 80μl

[0192] 设置PCR反应程序如下：

[0193] Heat lid off

[0194] 20℃维持30min；

[0195] 4℃维持∞

[0196] 连接反应完成后进行0.8倍磁珠纯化，纯化实验完成后使用22μl的Nuclease-free water洗脱，最终回收20μl的洗脱产物。

[0197] D)PCR的引物扩增，引入测序序列，具体反应体系以及程序如下：

[0198]试剂 体积
上步回收样品 20μl
PCR Master Mix 25μl
TPE1.0(10μM) 2.5μl
TPE2.0Index-6(10μM) 2.5μl
总体积 50μl

[0199] 设置PCR反应程序如下：

[0200] Heat lid 105℃

[0201] 95℃维持45s

[0202] 30循环：95℃维持15s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0203] 72℃维持2min

[0204] 4℃保持

[0205] PCR程序运行完成后，使用1X纯化磁珠进行产物的纯化以及质检；

[0206] E)上机测序以及结果判定：

[0207] A片段比对结果如图9所示(片段位置111-261)：

[0208] 通过比对发现下机数据中，A片段位置信息准确且存在较高的测序深度。

[0209] 结论：A片段末端成功进行了磷酸化。

[0210] 2)质控3’端突出片段末端补平

[0211] A)将得到的质控模板B片段，模拟打断末端磷酸化质控底物进行下面的实验。

[0212] B)按照下表进行末端补平、加A体系mix准备：

[0213]试剂 体积
B片段 35μl
ER&dA Buffer 12μl
ER&dA Enzyme 3μl
总体积 50μl

[0214] 设置PCR程序反应如下：

[0215] Heat lid 85℃

[0216] 30℃维持30min

[0217] 72℃维持30min

[0218] 4℃维持∞

[0219] C)反应完成后的产物进行接头连接反应，具体反应体系以及程序如下：

[0220]试剂 体积
来自上步的反应体系 50μl
Adapter for Illumina(按照需要浓度) 5μl
Eco Ligation Buffer 22μl
Eco Ligation Enzyme 3μl
总体积 80μl

[0221] 设置PCR反应程序如下：

[0222] Heat lid off

[0223] 20℃维持30min；

[0224] 4℃维持∞

[0225] 连接反应完成后进行0.8倍磁珠纯化，纯化实验完成后使用22μl的Nuclease-free water洗脱，最终回收20μl的洗脱产物。

[0226] D)PCR的引物扩增，引入测序序列，具体反应体系以及程序如下：

[0227]试剂 体积
上步回收样品 20μl
PCR Master Mix 25μl
TPE1.0(10μM) 2.5μl
TPE2.0Index-6(10μM) 2.5μl
总体积 50μl

[0228] 设置PCR反应程序如下：

[0229] Heat lid 105℃

[0230] 95℃维持45s

[0231] 30循环：95℃维持15s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0232] 72℃维持2min

[0233] 4℃保持

[0234] PCR程序运行完成后，使用1X纯化磁珠进行产物的纯化以及质检；

[0235] E)上机测序以及结果判定：

[0236] B片段比对结果如图10所示(片段位置250-395)：

[0237] 通过比对发现下机数据中，B片段位置信息准确且存在较高的测序深度。

[0238] 结论：B片段末端成功进行了磷酸化。

[0239] 3)质控磷酸化；

[0240] A)将得到的质控模板C片段，模拟打断末端磷酸化质控底物进行下面的实验。

[0241] B)按照下表进行末端补平、加A体系mix准备：

[0242]试剂 体积
C片段 35μl
ER&dA Buffer 12μl
ER&dA Enzyme 3μl
总体积 50μl

[0243] 设置PCR程序反应如下：

[0244] Heat lid 85℃

[0245] 30℃维持30min

[0246] 72℃维持30min

[0247] 4℃维持∞

[0248] C)反应完成后的产物进行接头连接反应，具体反应体系以及程序如下：

[0249]试剂 体积
来自上步的反应体系 50μl
Adapter for Illumina(按照需要浓度) 5μl
Eco Ligation Buffer 22μl
Eco Ligation Enzyme 3μl
总体积 80μl

[0250] 设置PCR反应程序如下：

[0251] Heat lid off

[0252] 20℃维持30min；

[0253] 4℃维持∞

[0254] 连接反应完成后进行0.8倍磁珠纯化，纯化实验完成后使用22μl的Nuclease-free water洗脱，最终回收20μl的洗脱产物。

[0255] D)PCR的引物扩增，引入测序序列，具体反应体系以及程序如下：

[0256]试剂 体积
上步回收样品 20μl
PCR Master Mix 25μl
TPE1.0(10μM) 2.5μl
TPE2.0Index-6(10μM) 2.5μl
总体积 50μl

[0257] 设置PCR反应程序如下：

[0258] Heat lid 105℃

[0259] 95℃维持45s

[0260] 30循环：95℃维持15s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0261] 72℃维持2min

[0262] 4℃保持

[0263] PCR程序运行完成后，使用1X纯化磁珠进行产物的纯化以及质检；

[0264] E)上机测序以及结果判定：

[0265] C片段比对结果如图9所示(片段位置617-765)：

[0266] 通过比对发现下机数据中，C片段位置信息准确且存在较高的测序深度。

[0267] 结论：C片段末端成功进行了磷酸化。

[0268] 备注：以上测序结果(之后文中描述的结果比对图同上)的序列比对图均为使用软件IGV(下载地址如下：http://software.broadinstitute.org/software/igv/download)。其中如图所示灰色填充部分表示测序深度；红色框区域表示序列比对的区域；下面的带方向的长条表示测序reads；reads有不同的方向，箭头表示方向。

[0269] 4)质控末端加A；

[0270] A)将得到的质控模板D片段，作为打断后加A的质控模板进行下面的实验。

[0271] B)按照下表进行末端补平、加A体系mix准备：

[0272]试剂 体积
D片段 35μl
ER&dA Buffer 12μl
ER&dA Enzyme 3μl
总体积 50μl

[0273] 设置PCR程序反应如下：

[0274] Heat lid 85℃

[0275] 30℃维持30min

[0276] 72℃维持30min

[0277] 4℃维持∞

[0278] C)反应完成后的产物进行接头连接反应，具体反应体系以及程序如下：

[0279]试剂 体积
来自上步的反应体系 50μl
Adapter for Illumina(按照需要浓度) 5μl
Eco Ligation Buffer 22μl
Eco Ligation Enzyme 3μl
总体积 80μl

[0280] 设置PCR反应程序如下：

[0281] Heat lid off

[0282] 20℃维持30min；

[0283] 4℃维持∞

[0284] 连接反应完成后进行0.8倍磁珠纯化，纯化实验完成后使用22μl的Nuclease-free water洗脱，最终回收20μl的洗脱产物。

[0285] D)PCR的引物扩增，引入测序序列，具体反应体系以及程序如下：

[0286]试剂 体积
上步回收样品 20μl
PCR Master Mix 25μl
TPE1.0(10μM) 2.5μl
TPE2.0Index-6(10μM) 2.5μl
总体积 50μl

[0287] 设置PCR反应程序如下：

[0288] Heat lid 105℃

[0289] 95℃维持45s

[0290] 30循环：95℃维持15s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0291] 72℃维持2min

[0292] 4℃保持

[0293] PCR程序运行完成后，使用1X纯化磁珠进行产物的纯化以及质检；

[0294] E)上机测序以及结果判定：

[0295] D片段比对如图10所示(片段位置965-1114)：

[0296] 通过比对发现下机数据中，D片段位置信息准确且存在较高的测序深度。

[0297] 结论：D片段成功进行了加A反应。

[0298] 5)质控接头连接；

[0299] A)以E片段作为连接反应起始反应产物，按照下表进行连接反应体系mix准备：

[0300]

[0301]E片段 50μl
Adapter for Illumina(按照需要浓度) 5μl
Eco Ligation Buffer 22μl
Eco Ligation Enzyme 3μl
总体积 80μl

[0302] 设置连接反应程序如下：

[0303] Heat lid off；20℃维持30min；4℃维持∞

[0304] 连接反应完成后进行0.8倍磁珠纯化，纯化实验完成后使用22μl的Nuclease-free water洗脱，最终回收20μl的洗脱产物。

[0305] B)PCR的引物扩增，引入测序序列，具体反应体系以及程序如下：

[0306]试剂 体积
上步回收样品 20μl
PCR Master Mix 25μl
TPE1.0(10μM) 2.5μl
TPE2.0Index-6(10μM) 2.5μl
总体积 50μl

[0307] 设置PCR反应程序如下：

[0308] Heat lid 105℃

[0309] 95℃维持45s

[0310] 30循环：95℃维持15s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0311] 72℃维持2min

[0312] 4℃保持

[0313] C)PCR程序运行完成后，使用1X纯化磁珠进行产物的纯化以及质检；

[0314] D)上机测序以及结果判定(图11)(片段位置1120-1369)；

[0315] 通过比对发现该质控片段在下机数据中发现了E片段reads数，且较高的深度。

[0316] 结论：该反应过程中成功地进行了接头的连接反应，表明建库试剂中接头连接反应试剂合格。

[0317] 6)质控PCR反应；

[0318] A)以F片段为Pre PCR反应产物，进行Pre PCR反应，按照下表进行PCR反应体系mix准备：

[0319]试剂 体积
F片段 20μl
PCR Master Mix 25μl
TPE1.0(10μM) 2.5μl
TPE2.0Index-6(10μM) 2.5μl
总体积 50μl

[0320] 设置PCR反应程序如下：

[0321] Heat lid 105℃

[0322] 95℃维持45s

[0323] 30循环：95℃维持15s；60℃维持30s；72℃维持30s

[0324] 72℃维持2min

[0325] 4℃保持

[0326] B)PCR程序运行完成后，使用1X纯化磁珠进行产物的纯化以及质检；

[0327] C)上机测序以及结果判定(图12)(片段位置1656-1902)；

[0328] 通过比对发现在下机数据中F片段reads数存在较高的测序深度，且测序深度同理论推测一致。

[0329] 结论：在该反应过程中，F片段在PCR反应体系中进行了正常扩增，表明建库试剂中PCR反应试剂合格。

[0330] 7)二聚体等小片段的质控

[0331] A)将G和F片段扩增后的文库片段按照1:1的比例混合；

[0332] B)使用1X纯化磁珠进行混合产物的混合以及质检；

[0333] C)上机测序以及结果判断(图13)(片段位置1466-1620)；

[0334] 通过比对发现下机数据中未发现该G片段序列。

[0335] 结论：通过磁珠纯化成功地去掉了二聚体及片段较小的不合格文库。

[0336] 实验中所使用引物序列信息如下所示：

[0337]

[0338] SEQ ID NO.24：

[0339] GCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCC