一种抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体及其淘选方法专利检索- 组合化学专利检索查询-专利查询网

一种抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体及其淘选方法
申请号	CN201610238854.2	申请日	2016-04-18	公开(公告)号	CN105777902A	公开(公告)日	2016-07-20
申请人	郑州师范学院;			发明人	陈龙欣; 李闰婷; 马润林; 张丽萌; 张龙; 兰燕虎;
摘要	本发明属于生物技术领域，涉及一种抗体及抗体药物的开发和生产，具体涉及一种抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体及其淘选方法。所述ScFv单克隆抗体由轻链可变区VL和重链可变区VH组成，所述VL的碱基序列如SEQ ID NO：10所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述VH的碱基序列如SEQ ID NO：11所示，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。实验证明，本发明的抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体文库构建及其淘选方法可以淘选得到特异性识别并结合蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白分子的ScFv抗体。所以，本发明所述抗体文库构建及其淘选方法对筛选用于蝗虫微孢子虫感染的检测与蝗虫防治具有广泛的应用前景。
权利要求	1.一种抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体，其特征在于：所述ScFv单克隆抗体的碱基序列如SEQ ID NO：12所示，所述碱基序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO： 9所示。 2.如权利要求1所述的抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体，其特征在于：所述ScFv单克隆抗体由轻链可变区VL和重链可变区VH组成，所述VL的碱基序列如SEQ ID NO：10所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述VH的碱基序列如SEQ ID NO：11所示，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。 3.如权利要求2所述的抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体，其特征在于：所述轻链可变区VL含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述重链可变区含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。 4.如权利要求1所述的抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体，其特征在于：所述ScFv单克隆抗体包括由ScFv通过二硫键形成全长的抗体，以及重链可变区和轻链可变区形成的ScFv、Fab、Fab2、IgG、Fv、Fv2、ScFv2或ScFv-Fc2抗体片段。 5.一种抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体的淘选方法，其特征在于：所述淘选方法具体步骤如下： (1)用蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白刺激Balb\c小鼠免疫，重复三次，每次间隔2周；第三次两周后，提取脾脏总RNA作为模板，制备抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体DNA文库； (2)以抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体DNA文库为模板，构建抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体DNA文库； (3)将抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体DNA文库，经电转化导入大肠杆菌XL1-blue中，构建具有抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库； (4)将具有抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库，包装为抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体文库； (5)从抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体文库中，筛选获得展示了高亲和力抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆； (6)抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆的活性测定。
说明书全文	一种抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体及其淘选方法技术领域 [0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种抗体及抗体药物的开发和生产，具体涉及一种抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体及其淘选方法。背景技术 [0002] 蝗虫是我国农牧业生产中的重要害虫，是三大自然灾害之一，至今尚未根除。蝗虫微孢子虫是专性侵染蝗虫的生物制剂，微孢子虫的孢壁蛋白在微孢子虫侵染寄主的过程中起着重要的作用。国外已报道有五种蝗虫微孢子虫，而我国1985年才从美国得到蝗虫微孢子虫(Antonospora locustae)浓缩液，并在东亚飞蝗体内孢子增殖获得了成功。蝗虫微孢子虫是一类可以侵染蝗虫等100多种直翅目昆虫的专性寄生的原生生物，是目前唯一种己经发展成为生物制剂的微孢子虫商品。长期以来，人们对蝗虫微孢子虫研究只停留在分离与鉴定方面，而关于其内部的信息却鲜有报道。蝗虫微孢子虫成熟孢子的形态大多为椭圆形，有一团胞原质和一根螺旋盘卷的极丝，并有两个核。当蝗虫微孢子虫被寄主蝗虫吞食后，就在其肠道内发芽释放出的孢原质，进入脂肪体，开始在寄主的细胞内繁殖。 [0003] 微孢子虫的孢壁蛋白是孢子壁的主要成分，是最先直接与宿主接触的部分，因此在侵染过程扮演重要的角色。目前提取微孢子虫孢壁蛋白的方法有两种，一种是孢子发芽法，另一种是机械破碎法。对孢壁蛋白的研究，不仅主要着重于组分、分子量及其抗原性，还对其功能进行了研究。有研究表明微孢子虫在侵染宿主过程中，先与宿主细胞吸附，而后将孢子激活，孢壁蛋白在吸附过程中明显起着非常重要的作用。微孢子虫孢壁蛋白与微孢子虫侵染作用机理的研究虽然己经取得了一些进展，但仍有很多问题尚未解决。例如，孢壁蛋白在不同的宿主细胞中是否相同，若不同，是何原因？孢壁蛋白在微孢子虫生活周期中到底扮演何种角色，起何种作用？本发明通过研制一种蝗虫微孢子虫孢壁蛋白AlocSWP2的单链抗体，旨在为快速检出蝗虫微孢子虫提供合适的免疫试剂，同时也将对蝗虫微孢子虫孢壁蛋白的研究起到推进作用，为研究蝗虫微孢子虫侵染蝗虫的机理提供一定的途径。发明内容 [0004] 本发明的目的在于提供一种对蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白分子具有高亲和力和低解离速率的抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体噬菌体克隆，该抗体噬菌体克隆从构建的大容量免疫噬菌体抗体库中筛选获得；本发明还提供该抗体噬菌体克隆的淘选方法。 [0005] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案： [0006] 一种抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体，所述ScFv单克隆抗体的碱基序列如SEQ ID NO：12所示，所述碱基序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。 [0007] 所述ScFv单克隆抗体由轻链可变区VL和重链可变区VH组成，所述VL的碱基序列如SEQ ID NO：10所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述VH的碱基序列如SEQ ID NO：11所示，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。 [0008] 所述轻链可变区VL含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述重链可变区含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。 [0009] 所述ScFv单克隆抗体包括由ScFv通过二硫键形成全长的抗体，以及重链可变区和轻链可变区形成的ScFv、Fab、Fab2、IgG、Fv、Fv2、ScFv2或ScFv-Fc2抗体片段。 [0010] 一种抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体的淘选方法，所述淘选方法具体步骤如下： [0011] (1)用蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白刺激Balb\c小鼠免疫，重复三次，每次间隔2周；第三次两周后，提取脾脏总RNA作为模板，制备抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体DNA文库； [0012] (2)以抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体DNA文库为模板，构建抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体DNA文库； [0013] (3)将抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体DNA文库，经电转化导入大肠杆菌XL1-blue中，构建具有抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库； [0014] (4)将具有抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库，包装为抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体文库； [0015] (5)从抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体文库中，筛选获得展示了高亲和力抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆； [0016] (6)抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆的活性测定。 [0017] 本发明的有益效果为：本发明提供一种对蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白有高亲和力，在噬菌体表面展示的，可用于高效筛选的抗体免疫噬菌体文库的构建及其淘选方法。实验证明，本发明的抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体文库构建及其淘选方法可以淘选得到特异性识别并结合蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白分子的ScFv抗体。所以，本发明所述抗体文库构建及其淘选方法对筛选用于蝗虫微孢子虫感染的检测与蝗虫防治具有广泛的应用前景。附图说明 [0018] 图1为三次免疫后血清效价检测。 [0019] 图2为三次免疫间接ELISA检测曲线。 [0020] 图3为血清的免疫印迹实验，其中1:阴性对照；2：不带标签的AlocSWP2蛋白。 [0021] 图4为小鼠脾脏总RNA检测，其中M:DNA Maker Trans2k Plus II；RNA:小鼠脾脏的总RNA。 [0022] 图5为凝胶电泳检测VL基因PCR产物，其中M：Trans2K PlusII DNA Maker；1-51：轻链的17条κ链上游引物(MSCVκ-1-MSCVκ-17)分别与下游的3条引物(MSCJκ4-BL、MSCJκ5-BL、MSCJκ12-BL)进行配对的PCR产物，结果依次类推；52：轻链的1条λ链上游引物(MSCVL-1)与下游的引物(MSCJL-BL)进行配对的PCR产物。 [0023] 图6为凝胶电泳检测VH基因PCR产物，其中M：Trans2K PlusII DNA Maker；1-57：重链的19条上游引物(MSCVH1-MSCVH19)分别与下游的3条引物(MSCG1ab-B、MSCG3-B、MSCGM-B)进行配对的PCR产物，结果依次类推。 [0024] 图7为VH和VL基因的OverlapPCR，其中M：Trans2K Plus II DNA Maker；1-32：VH和VL的Overlap PCR产物。 [0025] 图8为ScFv片段的酶切，其中M：Trans2K PlusII DNA Maker；1-2：SfiI酶切ScFv片段的产物。 [0026] 图9为三轮淘选产出噬菌体与蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白结合力检测结果。 [0027] 图10为单克隆噬菌体与蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白结合力检测结果。具体实施方式 [0028] 1.抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白单链ScFv抗体DNA文库的制备 [0029] 用重组蛋白AlocSWP2免疫4-6周龄雌性Balb\c小鼠，每次免疫两周后尾部静脉取血，免疫三次后，利用间接ELISA检查免疫后的血清效价，4天后进行加强免疫。P/N≥2.1判定为阳性。从图1中可见血清的效价至少为1:64000，且与蝗虫微孢子虫的AlocSWP1没有交叉反应。可以进行下游的实验。 [0030] 对三次免疫的血清进行ELISA检测，血清的稀释比为1:8000。从图2中可以见三次免疫ELISA的数值逐次升高。为了检测血清中有无针对AlocSWP2的特异性抗体，用没有标签的AlocSWP2进行Western Blotting检测，如图3所示，在大约22kD左右出现了一条亮带，证实免疫后的血清中存在针对AlocSWP2的特异性抗体。 [0031] 2.构建抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体DNA文库[0032] 2.1小鼠脾脏总RNA的提取及cDNA的合成 [0033] 在无菌的环境下解剖小鼠，提取脾脏后迅速放入液氮中。然后用购自Lifetech的Trizol试剂提取总RNA。经过0.8％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。以总RNA为模板，合成cDNA，NanoDrop2000C测浓度，存放于-80℃冰箱或直接用于下面的实验。 [0034] 2.2PCR扩增小鼠抗体的VL和VH基因 [0035] PCR引物：按照Carlos F.Barbas III、Dennis R.Burton、Jamie K.Scott和Gregg J.Silverman所著《Phage Display》所述在金唯智生物科技有限公司(北京)合成引物如下： [0036] 表1 扩增小鼠轻链(κ)的上游引物 [0037] [0038] 表2 扩增小鼠轻链(κ)的下游引物 [0039] [0040] [0041] 表3 扩增小鼠轻链(λ)的引物 [0042] [0043] 表4 扩增小鼠重链的上游引物 [0044] [0045] 表5 扩增小鼠重链的下游引物 [0046] [0047] [0048] 简并碱基为：R(A,G),Y(C,T),M(A,C),K(G,T),S(G,C),W(A,T),H(A,T,C),B(G,T,C),V(G,A,C)，D(G,A,T)把轻链和重链按等物质量进行混合，引物如表6所示： [0049] 表6 Overlap PCR的引物 [0050] [0051] PCR扩增程序：94℃ 5min，(94℃ 15s，56℃ 15s，72℃ 30s)32个循环，72℃ 10min，12℃ 1min。 [0052] 2.3Overlap PCR扩增小鼠抗体的ScFv基因 [0053] SfiI双酶切VH和VL基因片段后，切胶回收按照等量进行混合，酶切体系为：VH或VL基因片段3μg；10×CutSmart Buffer为5μL；SfiI限制性内切酶1μL；补充去离子水至总体系为50μL；50℃酶切3h，胶回收。利用Overlap Extension Primers RSC-F和Overlap Extension Primers RSC-B引物进行Overlap PCR，如图7。 [0054] Overlap PCR后回收切胶回收大小为750bp左右的条带，用于SfiI酶切，酶切结果如图8所示，酶切后进行回收。 [0055] 将同时具有2个SfiI酶切末端的抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体DNA文库，与按照Carlos F.Barbas III、Dennis R.Burton、Jamie K.Scott和Gregg J.Silverman所著《Phage Display》所述的同样同时具有2个对应SfiI酶切末端的pComb3载体，在NEB的T4DNA连接酶的作用下进行连接，连接条件为：SfiI酶切末端的pComb3载体1μL；SfiI酶切末端的的目的基因4μL，10×T4DNA Ligase Buffer为1μL；T4DNA Ligase为1μL，补充去离子水到总体系为10μL；16℃水浴中3h。最终得到抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白的ScFv单克隆抗体免疫噬菌体DNA文库。 [0056] 3.构建具有抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库 [0057] 将抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体DNA文库，通过电穿孔法转化入大肠杆菌XL1-blue中，在含有100μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL 四环素的2×YT固体培养基上，37℃条件下培养14-16h，通过有限稀释法计数，得到3×106个单克隆菌落，收集全部单克隆菌落并混匀，得到计数克隆测定库容为3×106CFU的，具有抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库。 [0058] 4.包装抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体文库[0059] 具有抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库，细菌增殖后用含有100μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL四环素的2×YT液体培养基，稀释至OD600值约为0.5，在20MOI的Progen公司的Hyperphage辅助下，37℃200rpm振荡培养12h包装噬菌体。 [0060] 包装完成后，离心收集培养基上清。按照培养基上清：沉淀溶液为4:1的比例，向培养基上清中加入沉淀溶液(无菌的20％(w/v)PEG-8000，2.5M NaCl)，混合均匀后，冰浴沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mL 磷酸盐缓冲液中，离心去除不可溶的沉淀。再次按照溶液上清：沉淀溶液为4:1的比例，向溶液上清中加入沉淀溶液，混合均匀后冰浴沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mL PBS(pH7.4)中，离心去除不可溶的沉淀。溶液上清即为抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体免疫噬菌体文库，测定噬菌体的滴度为7 5×10CFU/mL。 [0061] 5.高亲和力噬菌体克隆筛选 [0062] 以蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白为抗原按照1μg/100μL包被96孔酶标板的1个孔，4℃孵育过夜。弃尽孔内液体，PBS(pH7.4)洗涤1次。弃尽孔内液体，加入200μL封闭液(2％脱脂奶粉溶解于含有0.25％Tween20的PBST(pH7.4)中)，37℃封闭板孔。弃尽孔内液体，PBS(pH7.4)洗涤1次。弃尽孔内液体，加入100μL噬菌体，37℃孵育4h。弃尽孔内液体，含有0.25％Tween20的PBST(pH7.4)洗涤20次。弃尽孔内液体，向孔内加入100μL浓度为1.75μg/mL的胰酶，室温孵育15min。反复吹吸3-4次，转移所有液体至1mL新鲜的OD600值为0.5的XL1-blue(F’)中，37℃孵育1h。取其中的1μL进行1000倍稀释涂布于含有1％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL四环素的2×YT固体培养基平板上用于计数，余下的全部涂布于，大的方形含有1％葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL四环素的2×YT固体培养基平板上，37℃培养16-18h。收集全部菌落于10mL含有100μg/mL氨苄青霉素和15μg/mL四环素的2XYT液体培养基中混匀，取其中一部分稀释至OD600值≤0.3，37℃260rpm振荡培养至OD600值≈0.5。在20MOI的的Hyperphage辅助下，37℃200rpm振荡培养12-16h包装噬菌体。包装完成后，离心收集培养基上清。按照培养基上清：沉淀溶液为4:1的比例向培养基上清中加入沉淀溶液，混合均匀后冰浴沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，离心去除不可溶的沉淀。再次按照溶液上清：沉淀溶液为4:1的比例向溶液上清中加入沉淀溶液，混合均匀后冰浴沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mL PBS(pH7.4)中，离心去除不可溶的沉淀。计数溶液中噬菌体的滴度。 [0063] 重复以上亲和筛选过程2次。 [0064] 经过3轮亲和筛选过程，测定投入和产出的噬菌体的数目，产出/投入比增加了约20000倍，说明特异性结合蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白蛋白的噬菌体得到了有效富集。 [0065] 用ELISA试验证明3轮淘选产出的噬菌体结合蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白分子的亲和力显著提高，以100μL溶解于PBS中的3μg/mL蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白包被ELISA板孔，4℃过夜，弃尽板孔内溶液，以PBST(0.25％Tween20)配置的2％脱脂乳每孔200μL 37℃封闭2h。弃尽板孔内溶液，每孔加入100μL以PBST(0.25％Tween20)配置的2％脱脂乳稀释的5×108PFU噬菌体，37℃孵育1h，弃净板孔内溶液，以200μL PBST(0.25％Tween20)洗板20次后，每孔加入100μL以PBST(0.25％Tween20)配置的2％脱脂乳1:5000稀释的GE的HRP标记的羊抗M13抗体，37℃孵育1h。弃尽板孔内溶液，以200μL PBST(0.25％Tween20)洗板3次后，每孔加入100μL ThermoFisher的Quantablu底物显色液，30分钟内读值并进行统计分析。结果如图9所示。 [0066] 6.筛选结合蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白的阳性噬菌体抗体单克隆[0067] 挑取第3轮淘选之后产出的共10个单克隆进行序列测定，并对其进一步分析氨基酸序列和CDR区。结果如SEQ ID NO：1-12所示。 [0068] 7.噬菌体克隆的活性测定 [0069] 用ELISA试验证明淘选出的全人源抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白单链ScFv抗体的噬菌体克隆，可以特异性识别并结合蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白分子。以100μL溶解于PBS中的3μg/mL蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白包被ELISA板孔，4℃过夜。弃尽板孔内溶液，以PBST(0.25％Tween20)配置的2％脱脂乳每孔200μL 37℃封闭2h。弃尽板孔内溶液，8 每孔加入100μL以PBST(0.25％Tween20)配置的2％脱脂乳稀释的5×10PFU噬菌体，37℃孵育1h。弃净板孔内溶液，以200μL PBST(0.25％Tween20)洗板20次后，每孔加入100μL以PBST(0.25％Tween20)配置的2％脱脂乳1:5000稀释的GE的HRP标记的羊抗M13抗体，37℃孵育 1h。弃尽板孔内溶液，以200μL PBST(0.25％Tween20)洗板3次后，每孔加入100μLThermoFisher的Quantablu显色液，30分钟内读值并进行统计分析。结果如图10所示。

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