一种检测结核病的试剂盒 |
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| 申请号 | CN201510505395.5 | 申请日 | 2015-08-17 | 公开(公告)号 | CN105087794A | 公开(公告)日 | 2015-11-25 |
| 申请人 | 广东省结核病控制中心; | 发明人 | 周琳; 陈亮; 陈涛; 钟球; 郭卉欣; 李海成; 陈瑜晖; 廖庆华; 陈珣珣; 舒杨; 周杰; 王威; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了与结核病相关的microRNA标志物，该标志物为microRNA 451a，microRNA542，microRNA125b，microRNA146a，microRNA29c，microRNA365，microRNA889，microRNA335和microRNA342。可以通过核酸芯片、qPCR或者测序等技术对上述microRNA标志物进行定量检测，从而用于临床上对结核病的辅助诊断或者对 治疗 结果的评估等，提高结核病诊断的灵敏度和特异性，为临床治疗评估提供新的依据。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种检测结核病的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有对microRNA 451a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889中至少一种microRNA进行定量检测的试剂。 |
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| 说明书全文 | 一种检测结核病的试剂盒技术领域[0001] 本发明涉及microRNA的检测及其运用，更具体的，本发明涉及microRNA 451a，microRNA542，microRNA125b，microRNA146a，microRNA29c，microRNA365，microRNA889，microRNA335，microRNA342在结核病诊断及治疗评估中的作用。 背景技术[0002] 结核病是全球最严重的传染性疾病之一，给全人类的健康带来了重大的威胁。然而，目前却缺乏有效的诊断技术。结核诊断金标准-结核菌培养，耗时2-6周，检出率只有30%左右；痰涂片检出率不到30%左右；结核抗体快速检测（胶体金检测），虽然快速，但是检出率不到50%；核酸检测（GeneXpert）虽然方便快速，但是对于菌阴患者灵敏低且费用高； 干扰素释放检测（IGRA），虽然灵敏，但是操作复杂，且价格昂贵，而且还不能却分潜伏感染和活性结核。因此，新的诊断技术对于结核病的防治具有重要的意义。 [0003] MicroRNA是一类长约19~24 nt的非编码单链小RNA分子。在细胞内microRNA发挥了重要的作用，它可以通过与靶基因3’UTR区互补结合， 抑制靶基因翻译，进而调控生物体的生长发育, 并参与多种疾病过程。 研究表明microRNA在细胞生长、凋亡、分化、极性形成、分泌、代谢等过程中发挥重要作用。 通过对microRNA在不同组织和疾病中的表达谱分析发现， microRNA的表达谱具有明显的组织特异性，在一些疾病中microRNA的表达谱改变具有明显的特征，因此可以作为疾病诊断及治疗标志物。MicroRNAs作为分子标志物，克服了蛋白质分子标志物在抗体制备和定量分析上所遇到的瓶颈。尤其是血清microRNAs具有样本易于采集、保存期长及检测手段简便等特点，临床应用价值也更明显,已成为生物标志物及转化医学研究的热点领域。 [0004] 关于microRNA与结核病的相关性，目前已经有些报道。但是目前还没有确定哪些microRNA和TB具有明确的相关，可以用于TB的诊断或者治疗评估。本专利公开了几个与TB相关的microRNA，及其检测引物和在TB诊断和治疗评估中的运用。 发明内容[0005] 为了解决以上问题，本发明公开了与结核病相关的microRNA序列及其检测引物和探针，以及在结核病的检测、预后中的运用。 [0006] 本发明的目的在于提供一种检测结核病的试剂盒。 [0007] 本发明所采取的技术方案是：一种检测结核病的试剂盒，该试剂盒含有对microRNA 451a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和 microRNA889中 至 少 一 种microRNA进行定量检测的试剂。 [0008] microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889联合作为结核病检测和/或预后的生物标记物的应用。 [0009] 一种检测结核病的试剂盒，该试剂盒含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342 和microRNA889进行定量检测的试剂。 [0010] 进一步的，该试剂盒含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行荧光定量PCR检测引物SEQ ID NO:10~27。 [0011] 进一步的，该试剂盒中含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行反转录的引物SEQ ID NO:1~9。 [0012] 进一步的，该试剂盒中含有如下探针序列SEQ ID NO:28~36。 [0013] 一种检测结核病的核酸芯片该芯片含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342 和microRNA889进行定量检测的试剂。 [0014] 一种结核病的预后诊断试剂盒，该试剂盒含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342 和microRNA889进行定量检测的试剂。 [0015] 一种结核病的预后诊断核酸芯片，其特征在于：该芯片含有对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测的试剂。 [0016] 本发明的有益效果是：本发明为结核病提供了新的诊断和预后评估的方法。本发明检测血浆/血清中的稳定的microRNA，而传统潜在分子诊断方案检测蛋白质，在定量测定方面，microRNA的定量精度和灵敏度非常高，使用qPCR技术甚至可以达到单分子检测的能力；而传统方法检测蛋白质，灵敏度较低，且定量精度较差。 附图说明 [0017] 图 1 为 microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889在结核病不同阶段的表达情况；图2为 microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA8895单独区分TB感染者和健康者的ROC曲线； 图3为 microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA8895联合区分TB感染者和健康者的ROC曲线。 具体实施方式[0018] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。 [0019] 实施例1样本：健康人血清50份，结核菌潜伏感染者血清50份，活动性结核病患者血清50份，结核病治愈者血清50份； 本实施例对上述样本血清中的microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行定量检测，具体操作步骤如下： 1）血清microRNA提取：提取试剂盒：GIAGEN公司的miRNeasy Serum/Plasma Kit。 [0020] ）逆转录：将上步提取的microRNA利用Tiangen生物科技有限公司的逆转录试剂盒Quant qRT-PCR kit (SYBR Green)进行逆转录；逆转录引物如下：microRNA125b逆转录引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACgtccca（SEQ ID NO:1）； microRNA146a逆转录引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACaaccca（SEQ ID NO:2）； microRNA29C逆转录引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACtaaccg（SEQ ID NO:3）； microRNA365逆转录引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACataagg（SEQ ID NO:4）； microRNA335逆转录引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACacattt（SEQ ID NO:5）； microRNA542逆转录引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACtttcag（SEQ ID NO:6）； microRNA342逆转录引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACacgggt（SEQ ID NO:7）； microRNA889逆转录引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACacaatg（SEQ ID NO:8）； microRNA451a逆转录引物： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACaactca（SEQ ID NO:9）； 其中选择microRNA29C作为内参基因。 [0021] ）荧光定量PCR：取上步反转录产物作为模板，分别对microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889进行qPCR定量检测，qPCR的操作按照Tiangen生物科技有限公司的试剂盒SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)进行操作；qPCR的引物如下：microRNA125b-F： CGCTCACAAGTCAGGCTCT（SEQ ID NO:10）， microRNA125b-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID NO:11）； microRNA146a-F： CGCCGTGAGAACTGAATTCCA（SEQ ID NO:12）， microRNA146a -R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID NO:13）； microRNA29c-F： CGCCGTAGCACCATTTGAAAT（SEQ ID NO:14）， microRNA29c -R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID NO:15）； microRNA365-F： CGCCGTAATGCCCCTAAAAAT（SEQ ID NO:16）， microRNA365-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID NO:17）； microRNA335-F： CGCCGTCAAGAGCAATAACG（SEQ ID NO:18）， microRNA335-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID NO:19）； microRNA542-F： CGCCGTGTGACAGATTGATAA（SEQ ID NO:20）， microRNA542-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID NO:21）； microRNA342-F： CGCTCTCACACAGAAATCGC（SEQ ID NO:22）， microRNA342-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID NO:23）； microRNA889-F： CGCCGTTAATATCGGACAAC（SEQ ID NO:24）， microRNA889-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID NO:25）； microRNA451a-F： CGCCGAAACCGTTACCATTAC（SEQ ID NO:26）, microRNA451a-R：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID NO:27）。 [0022] 检测探针分别为：microRNA125b-P： CGCTCACAAGTCAGGCTCT（SEQ ID NO:28）； microRNA146a-P：GCCGTGAGAACTGAATTCCA（SEQ ID NO:29）； microRNA29c-P：CGCCGTAGCACCATTTGAAAT（SEQ ID NO:30）； microRNA365-P：CGCCGTAATGCCCCTAAAAAT（SEQ ID NO:31）； microRNA335-P：CGCCGTCAAGAGCAATAACG（SEQ ID NO:32）； microRNA542-P：CGCCGTGTGACAGATTGATAA（SEQ ID NO:33）； microRNA342-P：CGCTCTCACACAGAAATCGC（SEQ ID NO:34）； microRNA889-P：CGCCGTTAATATCGGACAAC（SEQ ID NO:35）； microRNA451a-P：CGCCGAAACCGTTACCATTAC（SEQ ID NO:36）； 荧光定量PCR反应条件：50℃ 2min； 95℃ 2min； 95℃ 15s，60℃ 32s，40 循环；获取溶解曲线。 [0023] ）结果分析：各样品中microRNA 451a，microRNA542，microRNA125b，microRNA146a，microRNA29c，microRNA365，microRNA889，microRNA335和microRNA342的荧光定量PCR检测结果如图 1所示，从图1中可看出所检测的9个microRNA在结核病患者外周血清中显著上调，在治愈的TB患者外周血中又显著下调，说明microRNA 451a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA29c、microRNA365、microRNA335、microRNA542、microRNA342和microRNA889可以作为结核病检测和预后的生物标记物。 [0024] 利用统计法，对上述9个microRNA单独作为临床诊断结核分枝杆菌感染指标的诊断进行效能评估，检测单个指标检测TB的灵敏度和特异性性，及对应的ROC曲线，如图2和表1所示。 [0025] 表1为9种microRNA单独区分结核分枝杆菌感染者和健康者的效能评价从图2和表1中可以看出，各microRNA诊断效能ROC (Receiver Operating Characteristic)曲线下面积（Area Under the ROC Curve，AUC）均在0.66以上，说明利用上述9种microRNA可用于检测结核分枝杆菌，可见这些指标在活动性结核的诊断上具有一定的意义。（请确认上述描述是不可行）利用统计法，对上述9个microRNA联合作为临床诊断结核分枝杆菌感染的指标，对联合指标的诊断效能进行评估，检测联合指标检测TB的灵敏度和特异性性，及对应的ROC曲线，如图3和表2所示。 [0026] 表2为9种microRNA联合区分结核分枝杆菌感染者和健康者的效能评价从 图 3和 表 2 中 可 以 看 出，其 诊 断 效 能 为：ROC (Receiver Operating Characteristic)曲线下面积（Area Under the ROC Curve，AUC）为0.925，非常接近1，说明利用上述9种microRNA可用于检测结核分枝杆菌的正确率非常高。其区分的效能分别为敏感性95、特异性90，可见本发明9种microRNA的联合指标在活动性结核的检测上具有很好正确率、高灵敏性及高特异性。 [0027] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 |
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