双靶向作用 |
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| 申请号 | CN201380063422.7 | 申请日 | 2013-12-05 | 公开(公告)号 | CN104981482A | 公开(公告)日 | 2015-10-14 |
| 申请人 | 迪塔莱斯有限公司; | 发明人 | R·贝克曼; K·詹森; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及基于 抗体 的双靶向分子，并且涉及用于产生这类双靶向分子的方法，包括基于文库的方案。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于产生双特异性抗体或其功能性双特异片段的方法，包括步骤： |
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| 说明书全文 | 双靶向作用技术领域发明背景[0002] 本发明涉及双特异性抗体或其功能片段的新设计。 [0003] 在文献中，已经报道了产生双特异性抗体分子的多种方案。这些方案可以分成两类：1)产生双特异性抗体样式，其中识别两个靶或两个表位的两个互补位均位于一个互补性VH-VL对形成的一个异二聚抗体可变区内部并且均包含属于这个互补性VH-VL对的CDR残基，和2)产生其他双特异性抗体样式，其中识别两个靶或表位的两个互补位不是都位于一个互补性VH-VL对形成的一个异二聚抗体可变区内部并且不是都包含属于同一个互补性VH-VL对的CDR残基。 [0004] 在第一类方案内部，已经在文献中描述了可预测地工程化双特异性抗体分子的仅两种方法，并且这些方法将在下文[0014]至[0015]部分中详细讨论。然而，考虑这项工作的背景，将首先总结第二类方案。 [0005] 这种第二类方案(其中识别两个靶或表位的两个互补位不是都位于一个互补性VH-VL对形成的一个异二聚抗体可变区内部并且不是都包含属于同一个互补性VH-VL对的CDR残基)构成了非常庞大的由各种现有技术人员从事的工作，并且已经描述了这类双特异性抗体的众多不同例子。 [0006] 在属于第二类方案中的第一组例子中，具有不同特异性的两种或更多种抗体片段(包括Fab片段、单链Fv或单结构域抗体)通过化学键接或通过遗传融合借助一种或多种肽接头组合。在这组例子中公开的双特异性抗体样式包括以下：a. 双 体 抗 体 (Perisic 等 人 ,Structure.1994 Dec 15；2(12):1217-26； Kontermann,Acta Pharmacol Sin.2005 Jan；26(1):1-9；Kontermann,Curr Opin Mol Ther.2010 Apr；12(2):176-83)。 b.TandAb等(Cochlovius等人,Cancer Res.2000 Aug 15；60(16):4336-41)。 c.通过肽接头以遗传方式融合的对不同靶特异的单结构域(例如Domantis：WO 2008/096158；Ablynx：WO 2007/112940) d.其他(综述参见：Enever等人,Curr Opin Biotechnol.2009 Aug；20(4):405-11.Epub 2009 Aug 24；Carter,Nat.Rev.Immunol.6,343(2006)；P.Kufer 等 人 ,Trends Biotechnol.22,238(2004))。 [0007] 为了改善它们在医学应用中的潜在用途，可以使用多种技术延长上述双特异性抗体样式的体内血清半寿期，所述技术包括以下：a.添加血清白蛋白或血清白蛋白结合实体 b.PEG化 c.通过遗传融合如HAP化添加蛋白质聚合物(Schlapschy等人,Protein Eng Des Sel.2007 Jun；20(6):273-84 Epub 2007 Jun 26) 或 XTEN(Schellenberger,Nat.Biotechnology 12(2009)1186)。 [0008] 在这组例子中，双特异性抗体包含缺少Fc区的抗体片段，并因此通常不显示与新生Fc受体FcRn天然结合，不显示完整IgG抗体的天然效应子功能(例如ADCC和CDC)，并且通常不能按照与IgG抗体相同的方式借助超抗原衍生的亲和树脂(如对Fc区特异的蛋白A树脂)纯化。缺少Fc区的这些后果可能限制这类双特异性抗体的可实现血清半寿期、作为活性药物成分的可行应用和制备上经济。 [0009] 在属于第二类方案的第二组例子中，双特异性抗体包含IgG样分子和一个或几个额外的附加结合结构域或实体。这类抗体包括其中单链Fv已经与重链或轻链的一个末端融合的IgG-scFv融合蛋白(加利福尼亚州立大学，Biogen Idec,CAT/MedImmune)，和双可变结构域(dvd-IgG)分子，其中额外VH结构域和接头与重链的N末端融合并且额外VL结构域和接头与轻链的N末端融合(Abbott)。从总体上看，这些方案在构建体的制造、可及性和稳定性方面存在缺点。 [0010] 在属于第二类方案的第三组例子中，双特异性抗体包含IgG样抗体，所述抗体已经以这样的方式产生或修饰，从而它们在不添加其他结合结构域或实体的情况下显示出两种特异性。这类抗体包括IgG分子，在所述IgG分子中，例如使用工程化隆起(Ridgway等人,Protein Eng.1996 Jul；9(7):617-21)，使用链交换法(Davis等人,Protein Eng Des Sel.2010 Apr；23(4):195-202.Epub 2010 Feb 4)，或使用工程化反电荷法(Novo Nordisk)，已经修饰天然同型二聚的CH3域以变成异二聚体，因而潜在地使得IgG样分子的两半部分能够通过添加至Fc区、通常N端Fab区的结合实体结合两种不同的靶。在这个第三组例子中的抗体还包括这样的IgG分子，其中修饰不天然参与抗原接触的一些结构性环以结合除了通过可变区CDR环天然结合的一种靶之外还有的其他靶，例如通过在Fc区内点突变(例如，与FcgRIIb结合的Xencor Fc)或通过结构性环的多样化(例如具有多样化CH3域的f-star Mab2)。这些方案在稳定性、制造、价态和亲和力/应用有限方面存在缺点。 [0011] 与第二分类中双特异性抗体的全部以上例子相反，第一类中的双特异性抗体具有对两种靶特异的两个互补位，所述互补位均包含位于相同异二聚VH-VL抗体可变区内部的CDR残基。本领域中已经描述归属于这个第一类的仅4个类型的抗体分子。这四个类型中，第一类型抗体不真正是双特异的，因为它不能特异性识别两种不相关的靶；第二类型抗体天然存在，但不知道它是否可以可预测地工程化，因为没有这种研究的例子公开；并且根据出版物，仅第三和第四类型的抗体可以工程化，针对两种不相关的靶具有特异性。归属于这个第一类的四类型抗体分子如下： [0012] 交叉反应抗体，其具有与两种或更多种结构上相关的抗原或表位对应的单一宽泛特异性。对于这类抗体，两种抗原在序列和结构上相关。例如，抗体可以与来自不同物种的相关靶如鸡卵清溶菌酶和火鸡溶菌酶(WO 92/01047)或与处于不同状态或样式的相同靶如半抗原和与载体缀合的半抗原(Griffiths AD等人,EMBO J 1994 13:14 3245-60)交叉反应。可以就交叉反应性而人为地工程化抗体。例如，已经将抗体工程化以识别来自不同物种的两种相关抗原(例如Genentech：结合人LFA1的抗体经工程化还结合恒河猴LFA1，产生成功的药物Raptiva/依法珠单抗)。类似地，WO 02/02773描述了具有“双特异性”的抗体分子。提到的抗体分子是针对多种结构相关的抗原产生或选择的抗体，具有可以容纳两种或更多种结构上相关的靶的单一结合特异性。然而，如上文提到，全部这些交叉反应抗体不真正是双特异的并且未工程化以特异性识别两种不相关的靶。 [0013] 另外，存在天然存在的多反应性自身抗体(Casali和Notkins,Ann.Rev.Immunol.7,515-531)。这些多反应性抗体具有识别结构上不相关的至少两种(通常更多种)不同抗原或表位的能力。还已经显示，对单克隆抗体使用噬菌体展示技术对随机肽库的选择将鉴定匹配抗原结合位点的一系列肽序列。一些序列是高度相关的，匹配共有序列，而其他序列十分不同并且已经被称作模拟表位(mimotope)(Lane和Stephen,Current Opinion in Immunology,1993,5,268-271)。因此清楚的是，一些异二聚VH-VL抗体的结合位点具有与不同和有时不相关抗原结合的潜力。但是，如上文提到，这类多反应性抗体可能存在，但尚未使用本领域所述的可预测方法人为地工程化。 [0014] 本领域所述的一种方法涉及“二合一”抗体，其中所述方法允许双特异性抗体的人为工程化，所述双特异性抗体能够通过两个互补位结合结构上不相关的两种靶，所述两个互补位均位于一个互补性异二聚VH-VL对内部并且均包含属于这个互补性VH-VL对的CDR残基。使用或多或少不同于先前交叉反应性工程化方法的方法，将这些“二合一”抗体工程化以包含两个重叠的互补位。这项研究已经在WO 2008/027236中并且由Bostrom等人描述(Bostrom等人,Science.2009 Mar 20；323(5921):1610-4)。在公开的例子中，分离对一种靶(HER2)特异的异二聚VH-VL抗体可变区并随后将轻链再次多样化以实现针对第二靶(VEGF或死亡受体5)的额外特异性。对于所产生的抗体之一，通过结构解析表征结合作用，并且发现一种抗体-抗原复合物中与HER2接触的13个VH和VL CDR残基中有11个残基还与备选的抗体-抗原复合物中的VEGF接触。尽管公开的“二合一”抗体对HER2保持纳摩尔亲和力，Bostrom等人(2009)公开的克隆中仅一个克隆对额外靶VEGF具有300nM的纳摩尔亲和力，而四个其他克隆对该额外靶具有微摩尔亲和力。显而易见，这种方法已经实现与结构上不相关的两种靶结合，这两种靶之间的表面相容性程度需要使两个重叠互补位的特异性成为可能。尚未详细描述高度特异的这类“二合一”抗体怎样针对仅两种靶，并且是否可以观察到这类抗体的某种总体非特异性结合作用或“粘合性”，这潜在地由需要位于两个互补位的重叠部分中的侧链的某些构象灵活性引起。 [0015] 本领域所述的第二种方法涉及包含单结构域抗体互补对的抗体，其中所述方法允许双特异性抗体的人为工程化，能够通过两个互补位结合结构上不相关的两种靶，所述两个互补位均位于一个互补性异二聚VH-VL对内部并且均包含属于这个互补性VH-VL对的CDR残基。WO 2003/002609和US 2007/026482已经描述了异二聚VH-VL抗体，其中重链可变结构域识别一种靶并且轻链可变结构域识别结构上不相关的第二靶，并且其中具有不同特异性的两个单结构域合并成一个联合异二聚VH-VL可变区。在这类抗体的已公开例子中，首先将单结构域分别作为非配对VH结构域或作为非配对VL结构域选择以结合两种不相关的靶，并且此后合并成对两种靶特异的联合异二聚VH-VL可变区。 [0016] 对属于第一类双特异性抗体(所述双特异性抗体能够通过两个互补位结合两种靶，两个互补位均位于一个互补性异二聚VH-VL对内部并且均包含属于这个互补性VH-VL对的CDR残基)的全部分子而言，不需要额外的结构域或实体与IgG分子融合，不需要IgG分子的结构性环多样化并且不需要利用限制性异质双特异性Fc区来实现双特异性。这个具有几种潜在的益处： [0018] 不需要潜在地易遭蛋白酶解或潜在地有免疫原性的接头，这导致抗体作为活性药物成分的可发展性改进。 [0019] 不可能出现VH结构域和VL结构域的不希望有的配对，从而在表达期间避免包含错配的异二聚VH-VL可变区的潜在副产物，因为仅需要一个独特VH区和一个独特VL区。 [0020] 因为与常规的单特异性抗体相比，不需要额外的二硫键，所以预计表达不减少或不形成异常共价聚集物。 [0021] 在一个互补性异二聚VH-VL对内部包含两个互补位的双特异性异二聚可变区可以与不同恒定结构域(包括Fc区)组合。这提供几个优点：a.使用充分建立的方法，例如与制造常规单特异性IgG中使用的那些方法相同的方法，潜在地改善制造。 b.患者和动物模型中调节FcRn介导的血清半寿期。 c.无需选择与不同同种型相关的效应子功能，范围从无细胞毒性、基本上惰性表现(例如在设计用于阻断受体的抗体中)至侵入的细胞毒表现(例如在设计成杀伤肿瘤细胞的抗体中)。 [0022] 通过与交叉反应性工程化相关的方法衍生的“二合一”抗体的以上第三例子在其医学适用性方面潜在地大为受限于两种不相关的靶竞争CDR环内部重叠性残基、至少部分共有的结合残基。另外，在首先实现对一种靶的特异性、随后再次多样化并且随后找到对额外靶特异的克隆时，“二合一”抗体的内在依次选择过程是耗时和不可预测的，因为仅有限数目对第一靶特异的抗体可以再次多样化成可选择的文库，但是不知道哪种第一特异性克隆将对预工程化额外的所需特异性可操作。最后，“二合一”抗体的分离和亲和力成熟因以下事实而严重复杂化：对可变结构域序列旨在增加与一种靶结合的任何改善可能潜在引起对另一种靶的亲和力降低。 [0023] 通过轻链CDR环残基结合一种靶并通过重链CDR环残基结合另一种靶的以上第四例子因以下事实而严重复杂化：一些潜在重要的负责与第一靶结合的轻链CDR残基在最终、包装的双特异性异二聚抗体可变区中与一些潜在重要的负责与第二靶结合的重链CDR残基直接毗邻。这意味着在其结合状态下，由这类抗体识别的第一靶可以因空间位阻潜在地与这类抗体识别的第二靶竞争，因而潜在地限制这类抗体的医学适用性。另外，如果通过选择方法和筛选方法独立地分离这类抗体的轻链和重链，如US 2007026482(Abbott实验室)的历史例子中描述的那样，将它们组合成双特异性抗体可以潜在地影响组合的双特异性分子中针对各个靶的最初独立结构域的亲和力，原因在于CDR中重链和轻链配对时可能潜在发生的构象变化。最后，预先分离的VH和VL可变结构域与多种CDR环组合可能导致不可预测的抗体稳定性，因为 和Plückthun(1998)和 等人(2005)已经描述：在VH结构域和VL结构域之间发生抗体重链和轻链的重要相互作用和彼此稳定作用。 [0024] 相反，在一个互补性异二聚VH-VL对内部包含两个互补位的双特异性异二聚可变区可以作为抗体片段如Fab片段或单链Fv使用并且将不需要存在Fc区以实现它们的双特异性，从而允许在不存在哺乳动物N-糖基化机制的情况下选择微生物制造，以及它们用于其中需要低分子量或短血清半寿期的治疗性或诊断性应用中。 [0025] 因此，尽管在一个互补性异二聚VH-VL对内部具有两个互补位的方案提供诸多优点，但是上文所描述的迄今追求过的尝试已经取得有限的成功。 [0026] 因此，仍然存在为双特异性抗体提供改进样式的庞大未满足需求，所述改进样式综合了在一个互补性异二聚VH-VL对内部具有两个互补位的优点，同时避免用现有构建体观察到的问题。 [0027] 现有技术迄今尚未实现或提出已经由本发明提供的这个问题的解决方案，即为每个互补性异二聚VH-VL对设计两个互补位，其中每个互补位使用来自VH结构域和VL结构域这两者的CDR区的残基。发明简述 [0028] 本发明涉及特征在于对于每个互补性异二聚VH-VL对具有两个互补位的新双特异性抗体，其中每个互补位使用来自VH结构域和VL结构域这两者的CDR区的残基。 [0029] 因此，在第一方面，本发明涉及一种用于产生双特异性抗体或其功能性双特异片段的方法，所述方法包括步骤：(A)鉴定对第一目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段，包括步骤：将(i)根据本发明第三方面的抗体或其功能片段的集合，或(ii)抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，其中所述抗体可变结构域序列包含VL结构域和VH结构域的组合， a.其中所述VL结构域是基于选自SEQ-ID NOs:1、3、5和7的构架，其中所述VL结构域根据SEQ-ID NOs:8、12、18、19、27或28任一项中、尤其SEQ-ID NOs:8、12、18或19任一项中或SEQ-ID NOs 27或28任一项中所示的多样化方案多样化，并且 b.其中所述VH结构域是基于选自SEQ-ID NOs:2、4和6的构架，其中所述VH结构域根据SEQ-ID NOs:9、13、20或21任一项中所示的多样化方案多样化； 特别地，选自以下任一个集合的抗体或其功能片段的集合：Lib3-L、Lib4-L、Lib4-LE和Lib5-L， 与所述第一目的靶接触并且筛选或选择对所述第一目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段；和 (B)鉴定对第一目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段，包括步骤：将(i)根据本发明第二方面的抗体或其功能片段的集合，或(ii)抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，其中所述抗体可变结构域序列包含VL结构域和VH结构域的组合， a.其中所述VL结构域是基于选自SEQ-ID NOs:1、3、5和7的构架，其中所述VL结构域根据SEQ-ID NOs:10、14、16、22、23或29任一项中、尤其SEQ-ID NOs:10、14、16、22或23任一项中或SEQ-ID NO:29中所示的多样化方案多样化，并且 b.其中所述VH结构域是基于选自SEQ-ID NOs:2、4和6的构架，其中所述VH结构域根据SEQ-ID NOs：11、15、17、24、25或26任一项中所示的多样化方案多样化； 特别地，选自以下任一个集合的抗体或其功能片段的集合：Lib3-H、Lib4-H、Lib4-HE_ini和Lib4-HE， 与所述第二目的靶接触并且筛选或选择对所述第二目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段；和 (C)将对步骤(A)中鉴定的抗体之一的所述第一靶上的表位特异的互补位与对步骤(B)中鉴定的抗体之一的所述第二靶上的表位特异的互补位组合， 然而条件是排除来自根据本发明第四方面的特征c的集合的抗体或其功能片段中的互补位与来自根据本发明第五方面的特征c的集合的抗体或其功能片段中的互补位的组合。 [0030] 在第二方面，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，所述抗体可变结构域序列至少包含Vκ VL结构域和VH结构域，其中(ia)将位置Vκ54和Vκ60的至少之一多样化和/或(ib)将位置VH1和VH27的至少之一缺失，并且(ii)将根据图1A选自Lib2位置的至少3个额外CDR残基多样化，条件是至少一个多样化残基位于VH结构域内部并且至少一个多样化位置位于VL结构域内部，并且其中没有多样化根据图1A来自Lib1_A位置的残基、尤其没有多样化来自Lib1位置的残基。 [0031] 在第三方面，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，所述抗体可变结构域序列至少包含Vκ VL结构域和VH结构域，其中(ia)将位置Vκ4、Vκ92和Vκ97至少之一多样化和/或(ib)将位置Vκ1缺失，并且(ii)将根据图1A选自Lib1_A位置的至少3个额外CDR残基多样化，条件是至少一个多样化残基位于VH结构域内部并且至少一个多样化位置位于VL结构域内部，并且其中没有多样化根据图1A来自Lib2的残基。 [0032] 在第四方面，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，其中所述抗体可变结构域序列包含VL结构域和VH结构域的组合，a.其中所述VL结构域是基于选自SEQ-ID NOs:1、3、5和7的构架，其中所述VL结构域根据SEQ-ID NOs:8、12、18、19、27或28任一项中、尤其SEQ-ID NOs:8、12、18或19任一项中或SEQ-ID NOs:27或28任一项中所示的多样化方案多样化；并且 b.其中所述VH结构域是基于选自SEQ-ID NOs:2、4和6的构架，其中所述VH结构域根据SEQ-ID NOs:9、13、20或21任一项中所示的多样化方案多样化； a.条件是排除根据SEQ-ID NOs:18或19中所示的多样化方案多样化的基于SEQ-ID NO:1的VL结构域和根据SEQ-ID NOs:20或21中所示的多样化方案多样化的基于SEQ-ID NO:2的VH结构域的组合。 [0033] 在第五方面，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，其中所述抗体可变结构域序列包含VL结构域和VH结构域的组合，a.其中所述VL结构域是基于选自SEQ-ID NOs:1、3、5和7的构架，其中所述VL结构域根据SEQ-ID NOs:10、14、16、22、23或29任一项中、尤其SEQ-ID NOs:10、14、16、22或23任一项中或SEQ-ID NO:29中所示的多样化方案多样化；并且 b.其中所述VH结构域是基于选自SEQ-ID NOs:2、4和6的构架，其中所述VH结构域根据SEQ-ID NOs：11、15、17、24、25或26任一项中所示的多样化方案多样化； [0034] 条件是排除根据SEQ-ID NOs:22或23中所示的多样化方案多样化的基于SEQ-ID NO:1的VL结构域和根据SEQ-ID NOs:24、25或26中所示的多样化方案多样化的基于SEQ-ID NO:2的VH结构域的组合。 [0035] 在第六方面，本发明涉及编码本发明文库的核酸序列的集合。 [0036] 在第七方面，本发明涉及包含本发明核酸序列集合的载体的集合、尤其表达载体的集合。 [0037] 在第八方面，本发明涉及包含本发明核酸序列集合或本发明载体集合的宿主细胞集合。 [0038] 在第九方面，本发明涉及一种用于产生根据本发明任一项的抗体或其功能片段的集合的方法，所述方法包括步骤：(i)表达本发明的核酸序列，(ii)从本发明的载体表达核酸序列，和/或(iii)在引起或允许核酸序列表达的条件下培育本发明的宿主细胞集合。 [0039] 在第十方面中，本发明涉及一种用于鉴定对目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段的方法，所述方法包括步骤：将本发明的抗体或其功能片段的集合与目的靶接触并筛选或选择对所述目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段。 [0040] 在第十一方面，本发明涉及通过本发明方法可获得的抗体或功能片段。 [0041] 在第十二方面，本发明涉及通过本发明方法可获得的双特异性抗体或其功能性双特异片段。 [0043] 下图1显示在本发明的一些实施方案中其全部或子集应当在抗体文库中多样化的优选CDR位置的列表(A)，在本发明的一些实施方案中构架区内也可以在抗体文库中多样化的优选的任选增强性位置的列表(B)，和其全部或子集优选在本发明的全部文库中即在其中Lib1或Lib1_A残基多样化的文库中和在其中Lib2残基多样化的文库中保持不变的CDR位置的列表(C)。 [0044] 下图2以示意性方式显示新双特异性抗体的发现过程，使用俯视图(上方)视角以显示异二聚VH-VL抗体支架怎样首先分别在代表Lib1或Lib1_A和Lib2 CDR残基的两个区域中多样化；这产生两个文库，所述文库分别受到选择以获得两个抗体克隆，一个克隆通过第一互补位结合第一靶或表位并且第二克隆通过第二互补位结合第二靶或表位；随后通过将第一抗体克隆中的Lib1或Lib1_A位置内选择的靶特异性残基引入第二抗体克隆中，或将第二抗体克隆中的Lib2位置内选择的靶特异性残基引入第一抗体克隆中，将这些克隆组合成本发明的双特异性抗体。图2还以示意性方式显示从俯视图(上方)视角可见的构架区中根据本发明的那些潜在增强性残基的位置。 [0045] 图3显示我们已经测试过的四个初始文库设计(文库Lib D1L1、Lib D1L2、Lib D1H1和Lib D1H2)。我们产生了这四个文库的每一个文库作为编码人Fab片段的合成基因的汇集物，所述人Fab片段具有所示的VH3-VK1配对作为异二聚VH-VL支架。每个文库中的合成基因在位置方面恒定，对于所述位置，特定氨基酸以单字母代码显示并且在“X”标记的位置多样化。使用本领域已知的标准方法，将四个文库各自作为噬菌体展示文库产生并且针对几种抗原分选。从这四个文库选择的抗体克隆已经组合成图4中详述的双特异性抗体。图3进一步显示了三个额外的优选文库设计(Lib D1H3、Lib D2L1和Lib D2H1)。 [0046] 图4给出根据本发明产生的双特异性抗体的序列的例子。 [0047] 图5显示图4中公开的抗体的特异性，通过抗MBP抗GST双靶向克隆HM2LG1的ELISA分析展示。 [0048] 图6显示了说明本发明双特异性构建体的高特异性的BiacoreTM数据。 [0049] 图7显示亲本抗体和针对VEGF和IL6的双特异性抗体的BiacoreTM分析。 [0050] 图8显示说明两种靶与本发明的双特异性构建体的独立共结合的BiacoreTM数据：A：GMCSF+抗体+IL6的共结合；B：抗LC+抗体+IL6的共结合 [0051] 图9显示根据本发明使用的文库构架(或支架)的总览。 [0052] 图10显示根据本发明使用的多样化策略的总览。残基“X”是进行多样化的残基。以删除线和粗体显示为 的残基在文库的一些克隆中是被缺失的，因此产生长度变异性。 发明详述 [0053] 与构建双特异性抗体的既往方案相比，本发明的特殊性是迄今未知的对于每个互补性异二聚VH-VL对具有两个互补位的可能性，其中每个互补位使用来自VH结构域和VL结构域这两者的CDR区的残基。 [0054] 因此，本申请涉及包含由重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域组成的至少一个可变结合结构域的抗体或其功能片段，其中所述结合结构域包含针对两个不相关表位的两个互补位，其中(i)每个互补位与其表位的结合不阻碍另一个互补位同时与其相应表位的结合，并且其中(ii)两个互补位均包含来自至少一个VH CDR的至少一个残基和来自至少一个VL CDR的至少一个残基。 [0055] 因此，在第一方面，本发明涉及一种用于产生双特异性抗体或其功能性双特异片段的方法，所述方法包括步骤：(A)鉴定对第一目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段，包括步骤：将(i)根据本发明第三方面的抗体或其功能片段的集合，或(ii)抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，其中所述抗体可变结构域序列包含VL结构域和VH结构域的组合， c.其中所述VL结构域是基于选自SEQ-ID NOs:1、3、5和7的构架，其中所述VL结构域根据SEQ-ID NOs:8、12、18、19、27或28任一项中、尤其SEQ-ID NOs:8、12、18或19任一项中或SEQ-ID NOs 27或28任一项中所示的多样化方案多样化，并且 d.其中所述VH结构域是基于选自SEQ-ID NOs:2、4和6的构架，其中所述VH结构域根据SEQ-ID NOs:9、13、20或21任一项中所示的多样化方案多样化； 特别地，选自以下任一个集合的抗体或其功能片段的集合：Lib3-L、Lib4-L、Lib4-LE和Lib5-L， 与所述第一目的靶接触并且筛选或选择对所述第一目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段；并且 (B)鉴定对第一目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段，包括步骤：将(i)根据本发明第二方面的抗体或其功能片段的集合，或(ii)抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，其中所述抗体可变结构域序列包含VL结构域和VH结构域的组合， c.其中所述VL结构域是基于选自SEQ-ID NOs:1、3、5和7的构架，其中所述VL结构域根据SEQ-ID NOs:10、14、16、22、23或29任一项中、尤其SEQ-ID NOs:10、14、16、22或23任一项中或SEQ-ID NO:29中所示的多样化方案多样化，并且 d.其中所述VH结构域是基于选自SEQ-ID NOs:2、4和6的构架，其中所述VH结构域根据SEQ-ID NOs：11、15、17、24、25或26任一项中所示的多样化方案多样化； 特别地，选自以下任一个集合的抗体或其功能片段的集合：Lib3-H、Lib4-H、Lib4-HE_ini和Lib4-HE， 与所述第二目的靶接触并且筛选或选择对所述第二目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段；并且 (C)将对步骤(A)中鉴定的抗体之一的所述第一靶上的表位特异的互补位与对步骤(B)中鉴定的抗体之一的所述第二靶上的表位特异的互补位组合， 然而条件是排除来自根据本发明第四方面的特征c的集合的抗体或其功能片段中的互补位与来自根据本发明第五方面的特征c的集合的抗体或其功能片段中的互补位的组合。 [0056] 在第一方面的某些实施方案中，本发明涉及一种方法，所述方法还包括步骤：(D)在宿主细胞中表达编码步骤(A)至(C)中所产生的双特异性抗体或其功能性双特异片段的核酸序列或将该核酸翻译成代表双特异性抗体或其功能性双特异片段的蛋白质。 [0057] 在第二方面，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，所述抗体可变结构域序列至少包含Vκ VL结构域和VH结构域，其中(ia)将位置Vκ54和Vκ60的至少之一多样化和/或(ib)将位置VH1和VH27的至少之一缺失，并且(ii)将根据图1A选自Lib2位置的至少3个额外CDR残基多样化，条件是至少一个多样化残基位于VH结构域内部并且至少一个多样化位置位于VL结构域内部，并且其中没有多样化根据图1A来自Lib1_A位置的残基、尤其没有多样化来自Lib1位置的残基。 [0058] 在第二方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中在(i)中，将位置Vκ60多样化，但是不将位置Vκ54多样化。 [0059] 在第二方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中在(i)中，将位置Vκ60多样化，但是不将位置Vκ54多样化。 [0060] 在第二方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中在(i)中，将位置Vκ54多样化，但是不将位置Vκ60多样化。 [0061] 在第二方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中在(i)中，将两个位置Vκ54和Vκ54均多样化。 [0062] 在第二方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中将VH结构域的CDR1和CDR3以及VL结构域的CDR2的每一者中的至少一个残基多样化。 [0063] 在第二方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中将根据图1B的Lib2E_A位置的至少一个残基、尤其来自Lib2E位置的至少一个残基在所述可变结合结构域中额外地多样化。 [0064] 在第二方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中将VL和VH中的至少14个残基多样化，尤其其中将VL CDR2中的至少4个残基多样化，并且将VH CDR1和VH CDR3中的至少10个残基多样化。 [0065] 在第二方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中将15、16、17、18、19或20个残基多样化。 [0066] 在第三方面，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，所述抗体可变结构域序列至少包含Vκ VL结构域和VH结构域，其中(ia)将位置Vκ4、Vκ92和Vκ97至少之一多样化和/或(ib)将位置Vκ1缺失，并且(ii)将根据图1A选自Lib1_A位置的至少3个额外CDR残基多样化，条件是至少一个多样化残基位于VH结构域内部并且至少一个多样化位置位于VL结构域内部，并且其中没有多样化根据图1A来自Lib2的残基。 [0067] 在第三方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中在(i)中，将位置Vκ4多样化，但是不将位置Vκ92或位置Vκ97多样化。 [0068] 在第三方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中在(i)中，将位置Vκ92多样化，但是不将位置Vκ4或位置Vκ97多样化。 [0069] 在第三方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中在(i)中，将位置Vκ97多样化，但是不将位置Vκ4或位置Vκ92多样化。 [0070] 在第三方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中在(i)中，将选自Vκ4、Vκ92和Vκ92的两个位置多样化。 [0071] 在第三方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中在(i)中，将全部三个位置Vκ4、Vκ92和Vκ92多样化。 [0072] 在第三方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中将VL结构域的CDR1和CDR3以及VH结构域的CDR2的每一者中的至少一个残基多样化。 [0073] 在第三方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中将根据图1B的Lib1E_A位置的至少一个残基在所述可变结合结构域中额外地多样化。 [0074] 在第三方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中将VL和VH中的至少14个残基多样化，尤其其中将VH CDR2中的至少4个残基多样化，并且将VL CDR1和VL CDR3中的至少10个残基多样化。 [0075] 在第三方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，其中将15、16、17、18、19或20个残基多样化。 [0076] 在第四方面，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，其中所述抗体可变结构域序列包含VL结构域和VH结构域的组合，a.其中所述VL结构域是基于选自SEQ-ID NOs:1、3、5和7的构架，其中所述VL结构域根据SEQ-ID NOs:8、12、18、19、27或28任一项中、尤其SEQ-ID NOs:8、12、18或19任一项中或SEQ-ID NOs:27或28任一项中所示的多样化方案多样化；并且 b.其中所述VH结构域是基于选自SEQ-ID NOs:2、4和6的构架，其中所述VH结构域根据SEQ-ID NOs:9、13、20或21任一项中所示的多样化方案多样化； 条件是排除根据SEQ-ID NOs:18或19中所示的多样化方案多样化的基于SEQ-ID NO:1的VL结构域和根据SEQ-ID NOs:20或21中所示的多样化方案多样化的基于SEQ-ID NO:2的VH结构域的组合。 [0077] 在第四方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，所述集合选自以下任一个集合：Lib3-L、Lib4-L、Lib4-LE和Lib5-L。 [0078] 在第五方面，本发明涉及抗体或其功能片段的集合，其中所述集合包含抗体可变结构域序列的多样性集合，其中所述抗体可变结构域序列包含VL结构域和VH结构域的组合，c.其中所述VL结构域是基于选自SEQ-ID NOs:1、3、5和7的构架，其中所述VL结构域根据SEQ-ID NOs:10、14、16、22、23或29任一项中、尤其SEQ-ID NOs:10、14、16、22或23任一项中或SEQ-ID NO:29中所示的多样化方案多样化；并且 d.其中所述VH结构域是基于选自SEQ-ID NOs:2、4和6的构架，其中所述VH结构域根据SEQ-ID NOs：11、15、17、24、25或26任一项中所示的多样化方案多样化； 条件是排除根据SEQ-ID NOs:22或23中所示的多样化方案多样化的基于SEQ-ID NO:1的VL结构域和根据SEQ-ID NOs:24、25或26中所示的多样化方案多样化的基于SEQ-ID NO:2的VH结构域的组合。 [0079] 在第五方面的具体实施方案中，本发明涉及一个集合，所述集合选自以下任一个集合：Lib3-H、Lib4-H、Lib4-HE_ini和Lib4-HE。 [0080] 在第六方面，本发明涉及编码本发明文库的核酸序列集合。 [0081] 在第七方面，本发明涉及包含本发明核酸序列集合的载体的集合、尤其表达载体的集合。 [0082] 在具体的实施方案中，所述载体是噬菌体展示载体。 [0083] 在第八方面，本发明涉及包含本发明核酸序列集合或本发明载体集合的宿主细胞集合。 [0084] 在第九方面，本发明涉及一种用于产生根据本发明任一项的抗体或其功能片段的集合的方法，所述方法包括步骤：(i)表达本发明的核酸序列，(ii)从本发明的载体表达核酸序列，和/或(iii)在引起或允许核酸序列表达的条件下培育本发明的宿主细胞集合。 [0085] 在第十方面中，本发明涉及一种用于鉴定对目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段的方法，所述方法包括步骤：将任一本发明的抗体或其功能片段的集合与目的靶接触并筛选或选择对所述目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段。 [0086] 在具体的实施方案中，所述筛选或选择是使用噬菌体展示。 [0087] 在第十方面的某些实施方案中，本发明涉及一种方法，所述方法还包括步骤：在宿主细胞中表达编码对目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段的核酸序列或将该核酸翻译成代表对目的靶具有结合特异性的抗体或其功能片段的蛋白质。 [0088] 在第十一方面，本发明涉及通过本发明方法可获得的抗体或功能片段。 [0089] 在第十二方面，本发明涉及通过本发明方法可获得的双特异性抗体或其功能性双特异片段。 [0090] 在最后方面，本发明涉及包含本发明的抗体分子或其功能片段或双特异性抗体或其双特异性功能片段以及任选地可药用载体和/或赋形剂的药物组合物。 [0091] 如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白(Ig)分子，其定义为属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD类(或其任何亚类)的蛋白质，包括全部常规已知的抗体及其功能片段。抗体/免疫球蛋白分子的“功能片段”特此定义为抗体/免疫球蛋白分子的保留抗原结合区的片段(例如，IgG可变区)。抗体的“抗原结合区”一般存在于抗体分子的一个或多个高变区(或互补决定区，“CDR”)即CDR-1、-2和/或-3区中；然而，可变“构架”区还可以在抗原结合中发挥重要作用，如通过为CDR提供支架发挥重要作用。优选地，“抗原结合区”包含可变轻链(VL)的至少4至103个氨基酸残基和可变重链(VH)的至少5至109个氨基酸残基、更优选地包含VL的至少3至107个氨基酸残基和VH的至少4至111个氨基酸残基、并且特别优选地是完整VL链和VH链(VL的氨基酸位置1至109和VH的氨基酸位置1至113；根据WO 97/08320编号)。用于本发明中的优选抗体分子类别是IgG。 [0092] 本发明的“功能片段”包括F(ab')2片段、Fab片段、scFv或包含单个免疫球蛋白可变结构域或单结构域抗体多肽的构建体的结构域，例如单个重链可变结构域或单个轻链可变结构域。F(ab')2或Fab可以经工程化以最小化或完全移除在CH1结构域和CL结构域之间存在的分子间二硫键相互作用。 [0093] 抗体可以衍生自对动物免疫，或衍生自重组抗体文库，包括基于下述氨基酸序列的抗体文库，所述氨基酸序列已经以计算机方式设计并由合成产生的核酸编码。例如，通过分析人序列的数据库并且利用从其中获得的数据设计多肽序列，实现抗体序列的计算机方式设计。用于设计和获得计算机方式产生的序列的方法例如在Knappik等人J.Mol.Biol.(2000)296:57；Krebs等人,J.Immunol.Methods.(2001)254:67；和授予Knappik等人的美国专利号6,300,064中描述。 [0094] 在本发明的上下文中，术语“双特异性抗体分子”指一种抗体分子，包括抗体分子的功能片段，其包含针对两种不同靶生物分子或在一种靶生物分子上存在或在两种不同分子上如在靶生物分子和第二生物分子上存在的两个不同表位的特异性结合位点。 [0095] 如本文所用，由于结合特异性不是绝对特性，而是相对特性，所以当结合分子能够在这类靶生物分子和一种或多种参考分子之间区分时，这种结合分子是“对靶如靶生物分子(或这种生物分子的表位)特异的”、“特异性识别它”或“与之特异性结合”。在其最常见的形式(并且当未提到定义的参比时)，“特异性结合”指结合分子在目的靶生物分子和不相关生物分子之间区分的能力，例如，如根据本领域已知的特异性测定法确定。这类方法包括但不限于蛋白质印迹法、ELISA、RIA、ECL、IRMA试验和肽扫描法。例如，可以实施标准ELISA测定法。可以通过标准显色(例如辣根过氧化物酶的第二抗体，以及四甲基联苯胺和过氧化氢)实施评分。通过光密度评分某些孔中的反应，例如，在450nm评分。常见背景(＝阴性反应)可以是约0.1OD；常见阳性反应可以是约1OD。这意指阳性评分和阴性评分之间的比率可以10倍或更高。一般，通过不使用单一参比生物分子，而是使用一组约三种至五种不相关生物分子如奶粉、BSA、转铁蛋白等，确定结合特异性。 [0096] 在本发明的上下文中，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的90％和110％之间。 [0097] 但是，“特异性结合”还可以指结合分子在靶生物分子和作为参考点使用的一种或多种密切相关的生物分子之间区分的能力。额外地，“特异性结合”可以涉及结合分子在其靶抗原的不同部分(例如靶生物分子的不同结构域、区域或表位)之间或在靶生物分子的一个或多个关键氨基酸残基或成段氨基酸残基之间区分的能力。 [0098] 在本发明的上下文中，术语“互补位”指给定抗体分子的部分，所述部分是靶和抗体分子之间特异性结合所需要的。互补位可以是连续的，即由抗体分子中存在的相邻氨基酸残基形成，或是不连续的，即由这样的氨基酸残基形成，所述氨基酸残基处于氨基酸残基的一级序列中(如氨基酸残基的CDR氨基酸序列中)的不同位置，但在抗体分子采取的三维结构中密切靠近。 [0099] 在本发明的上下文中，术语“表位”指给定靶的部分，所述部分是靶和抗体之间特异性结合所需要的。表位可以是连续的，即由靶中存在的相邻结构性元件形成，或是不连续的，即由这样的结构性元件形成，所述结构性元件处于靶的一级序列中(如作为靶的蛋白质的氨基酸序列中)的不同位置，但在该靶在天然环境下如体液内采取的三维结构中密切靠近。 [0100] 在一个实施方案中，抗体或其功能片段是双特异性抗体。 [0101] 在本发明抗体或功能片段的其他实施方案中，每个互补位与其相应表位在两种表位同时存在下结合的量是在其它方面相同的条件下于另一个表位不存在时实现的结合量的至少25％。 [0102] 在本发明抗体或功能片段的其他实施方案中，结合量是至少50％、特别地至少75％并且更特别地至少90％。 [0103] 在本发明抗体或功能片段的其他实施方案中，第一互补位包含来自VL结构域的CDR1和CDR3以及VH结构域的CDR2中的残基，并且第二互补位包含来自VH结构域的CDR1和CDR3以及VL结构域的CDR2中的残基。 [0104] 在具体的实施方案中，抗体或其功能片段是人抗体或其功能片段。 [0105] 在其他实施方案中，本发明的抗体或功能片段基于人VH3家族重链序列和人Vκ1家族轻链序列。 [0106] 在其他实施方案中，本发明的抗体或功能片段基于人VH3家族重链序列和人Vλ1家族轻链。 [0107] 在其他实施方案中，本发明的抗体或功能片段选自单链Fv片段、Fab片段和IgG。 [0108] 在本发明抗体或其功能片段的其他实施方案中，可以通过突变(i)Lib1或Lib1_A位置之一或(ii)Lib2位置之一敲除与一个表位的结合作用，同时与另一个表位的结合作用保持完好。 [0109] 在本上下文中，短语“敲除结合作用”指这样的情况，其中对该表位的亲和力降低至少10倍(例如从1nM至10nM)，并且短语“结合作用保持完好”指这样的情况，其中对该表位的亲和力最多降低3倍(例如从1nM至3nM)。 [0110] 在具体的这类实施方案中，可以通过突变位置VL位置27或VH位置61之一或通过突变Lib2位置VL位置56或VH位置28之一，敲除与一个表位的结合作用。 [0111] 在具体的这类实施方案中，可以通过以下方式敲除与一个表位的结合作用：将第[0110]部分中列出的残基之一当残基选自D、N、E和Q时突变成R，或当残基与D、N、E或Q不同时将这种残基突变成D。 [0112] 因此，本发明涉及包含至少一个抗体可变结构域的结合分子，所述至少一个抗体可变结构域包含一条可变轻链和一条可变重链，其中所述抗体可变结构域与至少第一靶和第二靶结合，其中所述抗体可变结构域对所述第一靶的结合独立于所述抗体可变结构域对所述第二靶的结合，并且反之亦然，并且其中所述第一靶和第二靶既不是抗独特型抗体，也不是非生理肽如用于表位绘图的肽。 [0113] 在本发明的上下文中，当第一互补位与其相应表位(第一靶)在两种靶同时存在下结合的量是在其它方面相同条件下于另一种靶不存在时实现的结合量的至少25％时，抗体可变结构域对一种靶的结合“独立于”对另一种靶的结合。特别地，结合量是至少50％、特别地至少75％并且更特别地至少90％。 [0115] 在另一个方面，本发明涉及编码本发明抗体或其功能片段的核酸序列。 [0116] 在另一个方面，本发明涉及一种包含本发明核酸序列的载体。 [0117] 在另一个方面，本发明涉及一种包含本发明核酸序列的宿主细胞、或者包含本发明载体的宿主细胞。 [0118] 在另一个方面，本发明涉及一种用于产生本发明抗体或其功能片段的方法，所述方法包括在体外或从适宜宿主细胞(包括本发明宿主细胞)表达本发明核酸序列或本发明载体的步骤。 [0119] 在某些这类实施方案中，抗体分子或其功能片段选自单链Fv片段、Fab片段和IgG。 [0120] 在最后方面，本发明涉及包含本发明的抗体分子或其功能片段或双特异性抗体或其双特异性功能片段以及任选地可药用载体和/或赋形剂的药物组合物。可以配制组合物，例如用于一日一次施用、一日2次施用或一日3次施用。 [0121] 短语“可药用的”，如与本发明组合物相联系使用的情况下，是指这类组合物的分子实体和其它成分，它们是生理可耐受的并且在施用至哺乳动物(例如，人)时一般不产生不利反应。术语“可药用的”还可以意指由联邦或州政府的监管机构批准或者列于美国药典或其他普遍认可的药典中，用于哺乳动物并且更具体适用于人类中。 [0122] 在本发明的上下文中，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的90％和110％之间。在具体的实施方案中，该术语意指在给定值或范围的95％和105％之间。在具体的实施方案中，该术语意指给定值或范围的100％。 [0123] 应用于本发明药物组合物的术语“载体”指活性化合物(例如，双特异性抗体片段)与之一起施用的稀释剂、赋形剂或运载体。这类药用载体可以是无菌液体，如水、盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液和油，包括石油来源、动物来源、植物来源或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。合适的药用载体在A.R.Gennaro的第20版"Remington's Pharmaceutical Sciences"中描述。 [0124] 本发明组合物的有效成分(例如，双特异性抗体片段)可以用于治疗至少一种疾病或病症，其中所述治疗药适应于或经适当制备用于如本文中公开的具体施用(例如，一日一次施用、一日2次施用或一日3次施用)。为此目的，包装插页和/或患者信息含有相应的信息。 [0125] 本发明组合物的有效成分(例如，双特异性抗体分子或其双特异性片段)可以用于制造治疗至少一种疾病或病症的药物，其中所述药物适应于或经适当制备用于如本文中公开的具体施用(例如，一日一次施用、一日2次施用或一日3次施用)。为此目的，包装插页和/或患者信息含有相应的信息。实施例 [0126] 以下例子说明本发明，不限制本发明的范围。 [0127] 尽管上文描述的第一类双特异性抗体分子(具有对两种靶特异的两个互补位，所述两个互补位均包含位于相同异二聚VH-VL抗体可变区内部的CDR残基)提供如上文所述的一系列潜在益处，我们假设可以产生一类全新的抗体分子，这些抗体分子属于这种第一类抗体分子，但是与文献中已经报道的上文所提到的四个例子完全不同。我们假设通过寻求一种全新方案，与上文提到的例子相比，有可能在属于这种第一类的抗体的人为工程化方面实现某种大幅度改善。这种假设考虑到如下事实：上文提到的历史方法在开发抗体作为活性药物成分方面具有某些明显的潜在局限。 [0128] 根据本发明，我们描述了一种全新类别的双特异性抗体，这些抗体解决了这些问题并且具有出乎意料和巨大的优点。我们推测，可以在异二聚抗体的VH-VL可变区内部工程化设计两个不同互补位，每种互补位包含来自重链和轻链这两者的CDR残基，但是彼此不重叠并且优选地彼此不紧密相邻，旨在避免一个结合部位中因另一个结合部位中突变所致的构象变化，并且旨在减少与抗体结合时两种靶之间竞争的可能性(通过将处于其结合状态的两种靶之间的可能空间位阻最小化)。我们进一步推测，这种新类别的抗体分子可以通过首先产生两个合成的抗体文库进行工程化，每个抗体文库处于包装的异二聚VH-VL对的背景下，在所述一个抗体文库中，可以将重链和轻链CDR位置的第一集合(Lib1或Lib1_A)多样化，并且在所述另一个抗体文库中，可以将重链和轻链CDR位置的不同的非重叠集合(Lib2)多样化。我们得出结论，如果可以产生这类文库并且成功地针对两种不相关的靶平行选择，则可以通过将针对第一靶的选择期间在Lib1位置中选出的特定残基引入具有针对第二靶选择期间在Lib2位置中选出的特定残基的抗体克隆，潜在地能够快速产生双特异性抗体。反之，我们还得出结论，如果可以产生这类文库并且成功地针对两种不同的靶选择，则可以通过将针对第二靶的选择期间在Lib2位置中选出的残基引入具有针对第一靶选择期间在Lib1或Lib1_A位置中选出的特定残基的抗体克隆，潜在地能够产生双特异性抗体。我们推测通过在定义的经包装的VH-VL对的相同或高度相似的支架内部产生两种文库，大大有助于以下这种策略：将定义第一特异性的来自第一抗体的一组残基引入具有第二特异性的第二抗体。 [0129] 在本申请中，我们显示我们已经成功地实施这项发明，产生几种针对两种完全不相关的靶的双特异性异二聚VH-VL抗体。重要地，这些抗体被快速产生并且仅对两种靶高度特异，不显示与额外的不相关靶结合。令人惊讶地，产生的双特异性抗体不仅显示高的生物物理稳定性(这尚未对通过轻链CDR环残基结合一种靶并通过重链CDR环残基结合另一种靶的抗体展示)，甚至与产生“二合一”抗体中所用的支架相比并且与作为上市药物中的有效成分使用的已建立的单特异性抗体克隆相比，也显示极高的生物物理稳定性。最后并且还令人惊讶地，使用针对GM-CSF和TNF-α的双特异性抗体的例子，我们能够显示，在提供参与TNF-α结合的推定性互补位的Lib1或Lib1_A结合区内部CDR位置中的单个保守点突变基本上消除与TNF-α的结合作用，同时与GM-CSF的结合作用保持完好，并且显示，在提供参与GM-CSF结合的推定性互补位的Lib2结合区内部CDR位置中的单个保守的点突变彻底消除与GM-CSF的结合作用，同时与TNF-α的结合作用保持完好。这表明，本发明的抗体实际上可以按高度特异性方式而不借助一般“粘合性”结合两种不相关的靶，并且与本领域已知的上述双特异性抗体相反，设计作为非重叠互补位的两个结合部位基本上独立地发挥作用，尽管二者均位于一个异二聚VH-VL可变区中并且尽管二者均包含属于相同异二聚可变区的CDR残基。本发明的抗体因此具有胜过现有双特异性抗体的关键优点。 [0130] 在本发明的优选实施方案中，优选的发现过程包括以下步骤：(1)基于相同或高度相似的异二聚VH-VL抗体支架，通过将第一文库和第二文库中的不同CDR位置多样化，产生一对文库，(2)任选地还包括将两个文库之一中的或将两个文库中的VH-VL支架中选择的构架位置多样化，以潜在地增强选自这两个文库的克隆的结合特性，(3)针对两种靶分子或表位独立地选择两个文库并且表征结合物，以鉴定具有所需特性的靶特异性或表位特异性抗体克隆，(4)将选自一个文库并且对第一靶或表位特异的抗体克隆中多样化位置内选出的全部残基或残基亚集(优选地大部分残基，但是不少于3个残基)引入选自另一个文库并且对第二靶或表位特异的靶特异性抗体克隆。为了这个发现过程最佳地发挥作用，一些关键残基基团发挥重要作用： [0131] 通过以计算机方式检查异二聚VH-VL抗体的分子模型并且通过实施没有特异性的无选择的异二聚VH-VL抗体“仿制物(dummies)”诱变(数据未显示)，我们导出可能潜在地经多样化以形成针对第一靶的第一潜在结合位点的一系列CDR残基(Lib1或Lib1_A残基)和可能潜在地经多样化以形成针对第二靶的第二潜在结合位点的一系列CDR残基(Lib2残基)。我们还导出抗体构架区中的一系列潜在增强性残基，所述增强性残基在折叠的抗体分子中与Lib1、Lib1_A或Lib2 CDR残基紧邻并且可以潜在地经多样化以调节这些特性并且增强包含Lib1或Lib1_A CDR残基的第一互补位与第一靶(Lib1E或Lib1E_A增强性残基)的结合和包含Lib2 CDR残基的第二互补位与第二靶(Lib2E或Lib2E_A增强性残基)的结合。最后，我们导出将优选地在两个文库中保持相同或非常相似的一系列CDR残基，以维持两个文库中抗体分子的中央核心区的包装方式不变，所述CDR残基随后还将存在于全部组合的双特异性抗体克隆中，其中所述双特异性抗体克隆包含一组靶-1特异性Lib1或Lib1_A残基和任选地Lib1E或Lib1E_A残基以及一组靶-2特异性Lib2残基和任选地Lib2E或Lib2E_A残基。我们得出结论，这种不变的包装的核心区将使得两个结合部位彼此屏蔽，引起针对第一靶的第一互补位或多或少地免受因针对第二靶的第二互补位的变化而产生的有害构象效应影响。实际上，我们已经能够证实，亲本抗体克隆的亲和力和结合动力学通常与衍生自亲本克隆的组合的双特异性抗体克隆密切匹配。使用示例性抗原VEGF和IL6，实施例8说明了这点，其中将具有38nM亲和力的亲本抗体IL6P和具有11nM亲和力的VEGFP组合以产生对IL6具有40nM亲和力并对VEGF具有7.8nM亲和力的双特异性抗体VH6L。两个结合位点的这种出人意料高水平的独立性使得有可能并且平行地按照对“二合一”抗体(以上的第三历史例子)或双特异性配对的单结构域异二聚体(以上的第四历史例子)而言不可能的方式对它们进行亲和力成熟。我们还得出结论，不变的核心区可以在两个结合部位之间实现这样的间距，所述间距潜在地允许它们在无竞争情况下独立地结合两种靶，其中取决于每个靶分子的本质和分子大小，所述竞争由重叠性互补位或由第一结合的靶和第二未结合的靶之间的空间位阻引起。实际上，使用示例性抗原GMCSF和IL6，对于新类别的本发明双特异性抗体分子，我们已经能够证实，对于某些组合的克隆，两种抗原与单个VH-VL可变区的共结合是可能的。另外，实施例9显示，第二抗原与可变区共结合的亲和力可以与第一靶是否存在或不存在无关。其他类型的历史双特异性抗体尚未展示出实现与相同VH-VL可变区的这种共结合的可能性和共结合亲和力的可能独立性，并且这代表本发明新抗体的独特优点。在一些新的双特异性抗体中，还可以通过突变(如实施例10中列出的那些突变)展示独立的结合行为。在这类抗体中，可能通过在Lib1或Lib1_A位置产生点突变，敲除或大幅度降低对第一靶的亲和力，同时对第二靶的亲和力保持完好，并且反之亦然，通过在Lib2位置产生点突变，敲除或大幅度降低对所述第二靶的亲和力，同时对所述第一靶的亲和力保持完好。实施例1：文库构建 [0132] 用于文库Lib D1L1和Lib D1H1的合成基因汇集物购自GeneArt，而用于文库D1L2和D1H2的合成基因汇集物购自Sloning Biotechnology。将全部四个文库克隆至新构建的噬菌体展示载体中，其中通过添加M13复制起点、驱动抗体重链和轻链表达的两个合成的核糖体结合位点以及编码以下部分的合成基因：驱动抗体多肽分泌入大肠杆菌周质的两个信号肽、人CH1和CK恒定结构域和M13蛋白III的与人CH1恒定结构域的C末端融合的截短C末端部分，我们从主链pUC19(其购自NEB)建立所述噬菌体展示载体。将这些文库转化至TG1大肠杆菌细胞中，以产生各自具有109转化多样性的4个文库。从转化的TG1大肠杆菌细胞，使用M13KO7辅助噬菌体和如下文描述的标准分子生物学方法(Barbas等人,Phage Display:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,第1版,2001；Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,第3版,2001)，将四个文库作为展示多样化Fab片段的噬菌体文库产生。 实施例2：淘洗 [0133] 可以根据标准淘洗程序，针对固定化靶MBP和GST，从在噬菌体上的Fab粒子文库选择结合物(Barbas等人,Phage Display:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,第1版,2001；Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,第3版,2001)。实施例3：筛选 [0134] 可以通过感染细菌宿主细胞，拯救实施例2中选出的噬菌体粒子(Barbas等人,Phage Display:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,第1版,2001；Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press,第3版,2001)。将Fab蛋白质从各个克隆表达并对靶MPB和GST测试特异性结合。将阳性命中在下一个步骤中用来克隆双特异性构建体。 实施例4：双特异性抗体的克隆 [0135] 将抗体基因基于所需的氨基酸序列设计并且作为合成基因或合成基因片段购自GeneArt或DNA2.0。使用购自Roche的聚合酶Pwo Master和购自Thermo Fisher Scientific的编码所需点突变的合成寡核苷酸，根据制造商的说明书，通过PCR或重叠PCR产生编码具有点突变的抗体变体的基因。通过修饰购自New England Biolabs的质粒pUC19产生大肠杆菌Fab表达载体。通过添加驱动抗体重链和轻链表达的两个合成的核糖体结合位点、驱动抗体链分泌入大肠杆菌周质的两个合成的信号肽序列和潜在地实现单链生成的一个M13噬菌体起点，修饰pUC19主链。根据制造商的说明书，使用购自Roche的限制性核酸内切酶，通过限制酶切消化，随后使用购自Promega的LigaFast连接，将合成的抗体基因、抗体基因的合成片段和PCR产生的编码点突变的抗体基因变体克隆至这种大肠杆菌Fab表达载体中。将连接反应转化至购自Stratagene或Zymoresearch的感受态TG1大肠杆菌细胞中。实施例5：抗体表达和纯化 [0136] 将携带Fab表达构建体的TG1大肠杆菌克隆在购自Carl Roth的LB和TB固体培养基和液体培养基中培育，所述培养基补充有购自VWR的羧苄青霉素和葡萄糖。在摇床中的锥形烧瓶内过夜进行液体培养物中的抗体表达并通过向生长培养基添加购自Carl Roth的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱导。通过将表达培养物离心，澄清含有分泌的Fab片段的培养上清液。澄清的培养上清液补充以购自PAA实验室的1％体积链霉素/青霉素溶液、购自VWR的2％体积1M Tris pH 8.0和购自GE Healthcare的0.4％体积STREAMLINE rProtein A树脂。将补充的培养上清液在转动的培养箱上温育3小时或过夜以实现Fab片段与蛋白A树脂结合。随后将树脂转移至重力流动柱中，使用购自Invitrogen的30个床体积的2x PBS pH 7.4洗涤1次，使用购自VWR的含有10mM Tris pH 6.8和100mM NaCl的5个床体积的缓冲液洗涤1次，并使用购自VWR的含有10mM柠檬酸pH 3和100mM NaCl的缓冲液洗脱。通过添加8％体积的1M Tris pH 8.0中和洗脱的Fab片段。根据制造商的说明书，使用来自GE Healthcare的illustra NAP-5脱盐柱，将中和的纯化Fab片段缓冲交换入纯1xPBS pH 7.4(含有1.06mM KH2PO4，2.97mM Na2HPO4-7H2O，155.17mM NaCl并且无其他补充物；Invitrogen目录号10010056)中。实施例6：抗体稳定性测量 [0137] 使用差示扫描量热法(DSC)在1xPBS pH 7.4(Invitrogen目录号10010056)中确定缓冲交换的纯化Fab片段的生物物理稳定性。对于全部测量，使用来自MicroCal的配备自动进样器和受VPViewer2000 CapDSC软件控制的毛细室微量量热计。将全部Fab片段对不含抗体的纯缓冲液(1xPBS pH 7.4；Invitrogen目录号10010056)扫描。设定扫描参数以分析从32℃至105℃和115℃之间的温度窗口，扫描前恒温2分钟，扫描后恒温0分钟并且无增益。对于筛选应用，将扫描速率设定至250℃/小时，并且对于再分析最稳定的组合突变体，设定至60℃/小时。以筛选模式(扫描速率250℃/小时)确定的Fab片段绝对熔化温度比在分析模式(扫描速率60℃/小时)下高3.7℃至4.5℃，但是克隆的排序在两种模式下相同。在扣除PBS参比后使用来自MicroCal的Origin 7.0软件测定Fab片段的熔化温度。实施例7：抗体特异性测量 [0138] 为了检验选自Lib1和Lib2文库的抗体针对一种靶的特异性和设计成结合两种靶的双特异性抗体的特异性，使用标准方法进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。简而言之，通过用溶解于1xPBS中的链霉亲和素包被，结合20nM生物素酰化靶(GST，MBP，HEL或VEGF)在PBS-T(溶解于1xPBS中的0.3％ Tween-20)并用PBS-T中的5％脱脂奶粉封闭，准备Nunc Maxisorp板。此后，在微量滴定板中添加将抗体克隆作为可溶性Fab片段表达的50μl大肠杆菌TG1培养上清液，随后使用山羊抗人κ轻链多克隆抗体(Sigma)或对与可溶性Fab表达构建体中重链C末端融合的Strep-II标签特异的小鼠抗Strep标签抗体(IBA)，检测结合的Fab片段。使用HRP标记的第三抗体检测第二抗体，使用TMB底物(KPL)对ELISA显色，并且使用来自PerkinElmer的设定至450nm的Victor平板读数仪，对信号定量。发现分泌至大肠杆菌培养上清液中的Dummy1 Fab不结合这四种靶，Fab LG1(已经从文库Lib D1L1选出)仅结合GST，Fab HM2(已经从文库Lib D1H1选出)仅结合MBP，并且Fab DT3(组合Fabs LG1和HM2中存在的全部靶特异性残基)仅结合GST和MBP。克隆均不结合对照靶HEL或VEGF(图5)。每种Fab使用两个独立菌落，一式两份进行实验。实施例8：亲本抗体和双特异性抗体的亲和力 [0139] 针对人VEGF(Peprotech目录编号100-20)和人IL6(Peprotech目录编号200-06)选择抗体文库。分离的亲本抗体克隆当中，将IL6P和VEGFP组合成双特异性抗体克隆VH6L。图4中显示VH6L的序列，所述序列显示在轻链氨基酸4处的额外点突变。为了评估亲本抗TM 体和双特异性抗体的亲和力，进行Biacore 分析以便分析IL6P、VH6L和VEGFP的结合行为。为此，使用胺偶联法，将抗轻链捕获抗体固定到CM5芯片上，获得12000RU。将Fab片段捕获至400-500RU水平，并且在芯片上方通过范围从0nM至450nM的IL6和VEGF浓度系列。如图7中所示，克隆IL6P与IL6结合，但是不与VEGF结合；克隆VEGFP与VEGF结合，但是不与IL6结合；组合的克隆VH6L与IL6和VEGF二者结合。如表1中所示，亲本抗体和双特异性抗体对靶的亲和力是相似的。IL6P和VH6L的解离常数KD分别是38nM和40nM，并且VEGFP和VH6L的解离常数分别是11nM和7.8nM。 表1.亲和力测量 配体 样品 ka Kd KD IL6P IL6 1.1E+05 4.1E-03 3.8E-08 VH6L IL6 1.2E+05 4.7E-03 4.0E-08 VEGFP IL6 N/A N/A NB IL6P VEGF N/A N/A NB VH6L VEGF 9.5E+04 7.4E-04 7.8E-09 VEGFP VEGF 1.1E+05 1.1E-03 1.1E-08 实施例9：两种抗原与相同VH-VL可变区的共结合 [0140] 为了显示本发明的双特异性抗体可以通过相同的VH-VL可变区同时结合两种不TM同抗原，使用对人GMCSF和人IL6特异的双特异性抗体克隆GH6L进行Biacore 实验。图 4中显示GH6L的序列，所述序列显示在轻链氨基酸4处的额外点突变。使用携带GH6L重链和轻链cDNA和信号肽cDNA的标准哺乳动物表达载体，通过瞬时转染HEK293-6E细胞，以人TM IgG1样式表达抗体。使用蛋白A树脂，将表达的IgG亲和纯化。对于Biacore 分析，使用胺偶联法，将GMCSF(Peprotech目录编号300-03)或抗轻链捕获抗体固定到CM5芯片上，分别导致4000RU和12000RU固定化的GMCSF和抗轻链捕获抗体。 [0141] 将GH6L捕获到制备的表面上，并且在每种情况下在其上方流过IL6(Peprotech目录编号200-06)的浓度系列，并使用BIA评价软件分析数据。从图8A中可见，捕获到GMCSF上的GH6L可以与IL6结合。注射GMCSF的对照实验不产生信号，这表明IL6结合信号因在相同VH-VL可变区的同时结合所致，而不是与芯片表面上的GMCSF不相互作用的GH6L的“游离臂”的结合。在图8B中，通过类属性抗轻链捕获抗体捕获GH6L以测量GH6L在不存在GMCSF情况下的IL6结合亲和力。比较图8A和图8B，可以见到无论GH6L是否与GMSCF结合，GH6L均以相似的亲和力与IL6结合。实施例10:独立的结合行为 [0142] 对于本发明的几种双特异性抗体，可以使用位于Lib1或Lib1E_A或Lib2结合区内部的单个残基的位点定向诱变，显示两个结合位点的独立行为。在一种情况下，突变针对靶A和靶B的双特异性抗体克隆。 [0143] 通过在提供参与靶A结合作用的推定性互补位的Lib1或Lib1E_A结合区内部掺入单一保守LCDR3点突变H93Y，对靶A的亲和力大大取消，而对靶B的亲和力保持完好。 [0144] 在另一方面，通过提供参与靶B结合作用的推定性互补位的那个抗体克隆的Lib2结合区内部掺入单一保守LCDR2点突变W56Y，对靶B的亲和力完全取消，而对靶A的亲和力保持完好。 [0145] 在另一种情况下，突变针对靶C和靶D的双特异性抗体克隆。通过在提供参与靶C结合作用的推定性互补位的Lib1或Lib1E_A结合区内部掺入单一保守LCDR1点突变N27D，对靶C的亲和力大大取消，而对靶D的亲和力保持完好。 [0146] 另一方面，通过在提供参与靶D结合作用的推定性互补位的该第二抗体克隆的Lib2结合区内部掺入单一HCDR1点突变L28D或单一LCDR2点突变Y56D，对靶D的亲和力取消，而对靶C的亲和力保持完好。***** [0148] 本文中援引的全部专利、申请、出版物、试验方法、文献和其他材料因而通过引用的方式并入至相应专利法下可能达到的程度。 |
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