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抗体库筛选的一般策略

申请号 CN201280061145.1 申请日 2012-12-14 公开(公告)号 CN103998934A 公开(公告)日 2014-08-20
申请人 默克专利股份有限公司; 发明人 S·贝克尔; T·海泽勒; A·玛斯; H·科尔马;
摘要 本 申请 公开了一种报道分子选择性共价连接复制实体的普遍适用的方法,该方法允许人们从单轮的库筛选中获得特异性的结合剂。例如,展示对任何给定靶标的结合剂的 噬菌体 颗粒和 酵母 细胞的选择性 生物 素化可通过应用偶联的酶反应包括过 氧 化物酶、 氧化酶 和过氧化氢酶获得。
权利要求

1.一种分离特异性标记的复制实体的方法,所述方法包括
a)提供在反应混合物中的一组复制实体,其在其表面上展示受体分子的变体且具有与所述表面连接的第一酶或第二酶,
b)如果所述实体与所述第二酶连接,将与所述第一酶连接的配体分子加入到步骤a)的混合物中,或如果所述实体与所述第一酶连接,将与所述第二酶连接的所述配体加入到步骤a)的混合物中,
c)将第二酶的底物加入到反应混合物中,该底物在酶促反应中被所述第二酶利用来生产被所述第一酶利用的产物,将所述第一酶的共底物转变成与各个复制实体物理连接的反应性标志分子,从而特异性标记复制实体,和
d)分离特异性标记的复制实体。
2.根据权利要求1的方法,步骤a)的反应混合物包含能分解所述第一酶和/或第二酶的过剩产物的第三酶。
3.根据权利要求1的方法,其中所述复制实体选自噬菌体、噬菌粒、或细胞。
4.根据权利要求3的方法,其中所述复制实体为酵母细胞,优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
5.根据权利要求1的方法,第一酶为过化物酶,第二酶为氧化酶,而第三酶为过氧化氢酶。
6.根据权利要求2的方法,第二酶的底物为葡萄糖且产物为H2O2。
7.根据权利要求1的方法,所述第一酶的共底物为与标志分子缀合的酪酰胺。
8.根据权利要求7的方法,所述标志分子为生物素、(2,4)-二硝基苯基、荧光素或地高辛配基衍生物。
9.根据权利要求7的方法,所述酪酰胺与标志分子通过可裂解的接头连接,优选二硫键或可被蛋白酶裂解的肽序列,优选以下结构的含可裂解二硫键的生物素酪酰胺:
10.根据权利要求7的方法,所述标志分子为生物素,且分离步骤e)通过在抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白基质上的亲和色谱法完成。
11.根据权利要求7的方法,所述标志分子为荧光素或荧光抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的生物素且分离步骤e)通过荧光激活细胞分选完成。
12.根据权利要求1的方法,其中所述标志分子为生物素且所述分离包括链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包覆的顺磁颗粒的磁性细胞分选,其中顺磁颗粒与生物素标记的实体结合。
13.一种非天然存在的复制实体,其在其表面上呈现各种受体分子且含有与其表面偶联的酶。
14.权利要求13的实体,所述酶为选自过氧化物酶或氧化酶。
15.权利要求13的实体,其中受体分子为抗体或抗体衍生的片段
16.试剂盒,其包含底物、共底物和权利要求13的实体。
17.根据权利要求16的试剂盒,所述实体选自噬菌体、噬菌粒、或细胞,细胞优选为酵母细胞,更优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),所述受体分子为抗体,与所述实体表面连接的所述酶为葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶,所述底物为葡萄糖且所述共底物为与标志分子偶联的酪酰胺,优选生物素。
18.以下结构的生物素酪酰胺:

说明书全文

抗体库筛选的一般策略

[0001] 噬菌体展示技术最初是在早于25年前被George Smith引入的(Smith1985),并且已经变成分子生物技术中不可或缺的工具用来自巨大库的预先确定的结合特性鉴定肽特别是鉴定抗体分子。从那以后,许多改进被报道,筛选概念现在可以用来鉴定针对几乎任何靶蛋白的结合分子(Bradbury等,2011)。而且,近年来细菌特别是酵母菌表面展示已经变成越来越普及的替代方式用于噬菌体展示库筛选应用(Pepper等,2008,van Blois等,2011)。
[0002] 库筛选通常涉及将一群结合分子暴露于复制实体的表面并使它们与目标物的相互作用配偶体(partner)接触,其在抗体展示的情况下为抗原分子。设计实验装置使得那些展示靶标-特异性抗体的噬菌体颗粒或微生物细胞可从群体中分离出来,例如通过生物淘选或细胞分选分离。理想地,需要单轮筛选以获得期望的蛋白变体。然而,特定结合剂的富集受非特异性结合限制,其需要递归多轮的筛选和扩增以从库中获得最佳结合剂(Vodnik等,2011)。尤其第一轮筛选很关键,因为对于巨大的库可以预见特定的结合剂仅仅构成初始群的极小部分使得非特异性结合剂很大程度上超出特异性相互作用的结合剂。因此,必须仔细地控制条件并使其最优化用于每一单个筛选实验,其中筛选实验是足够严格的以除去非特异性结合剂但足够温和以保留完整的特异性相互作用的库成员的靶向结合(Liu等2009)。
[0003] 由于获得高亲和性结合剂的概率随库的大小而增加(Steiner,Forrer2008),已经10
建立了越来越大的可超过10 不同变体的库(Rothe等,2008,Brockmann等,2011)。然而,已知在每个筛选轮次中发生的重复扩增将减少在库筛选实验中可鉴定的候选物的多样性并限制其数量。(Derda et al.2011)。因此,非常期望将筛选轮的数目减少至最小,最好是减少至单轮。从概念上,这可以通过建立一种方法来实现,其中靶标和库成员之间瞬时和相对弱的相互作用转化为标记分子的共价连接,其可作为纯化处理使用,并允许应用相当严格的条件除去非特异性结合的库成员。
[0004] 催化报道分子沉积(CARD)已经广泛用于蛋白生物素化的免疫组织化学(Bobrow等,1989,1991,1992)。它依赖于辣根过化物酶(HRP)介导的生物素酪酰胺基团的形成,其中生物素酪酰胺基团容易与附近的蛋白质起反应导致生物素和蛋白质上的酪酸残基之间形成共价键(附图1)。为了建立靶分子结合的噬菌体或细胞表面展示库成员的选择性3
生物素化,我们利用了HRP介导的生物素化需要过氧化氢存在的事实。本文中描述的 CARD系统结合了三种不同酶即过氧化物酶、氧化酶和过氧化氢酶的活性。首先,将HRP偶联到起始群的所有成员上,以在噬菌体展示库的实验环境中使用为例(附图1a)。通过HRP的噬菌
3
体生物素化需要生物素酪酰胺(附图5)和过氧化氢的存在。在 CARD装置(setup)中H2O2由与目标抗原缀合的第二酶产生(附图1b,c)。作为半乳糖或葡萄糖氧化酶的糖氧化酶通过电子转移催化糖氧化为氧,这导致过氧化氢的形成。过氧化氢仅仅在那些抗原-氧化酶复合物结合的噬菌体颗粒上以较高的浓度产生,因为反应混合物含有非常有效地分解过氧化氢的作为第三酶的过氧化氢酶。结果H2O2迁移至HRP且随后仅极接近于HRP处有氧化酶的结合抗原的噬菌体发生噬菌体生物素化。然后特异性标记的噬菌体可通过固定化的链霉抗生物素蛋白的生物淘选收集并在噬菌体感染细菌之前经受非常严格的洗涤条件。
[0005] 然而在本领域中没有提及CARD用于提高噬菌体、细菌或酵母菌展示系统的效
[0006] 在本领域非常需要提高这种效力。如上所解释的,特定结合剂的分离还很大程度上靠经验,要求实验设置基本上适应包含给定的展示系统和特定配体的每一个特定的装置。
[0007] 因此,本发明的目的是提供一种尤其(i.a.)可以减少分离高特异性的结合剂所需要的选择/扩增步骤的有效的展示系统。
[0008] 本发明公开了令人惊奇地易于建立和高效改进本领域已知的展示系统。
[0009] 在第一实施方案中本发明涉及一种分离特异性标记的复制实体的新方法,所述方法包含
[0010] a)提供在反应混合物中的一组复制实体,其在其表面上展示受体分子的变体且具有与所述表面连接的第一酶或第二酶中的任何一种,
[0011] b)如果所述实体与所述第二酶连接,将与所述第一酶连接的配体分子加入到步骤a)的混合物中,或如果所述实体与所述第一酶连接,将与所述第二酶连接的所述配体加入到步骤a)的混合物中,
[0012] c)将第二酶的底物加入到反应混合物中,该底物在酶促反应中被所述第二酶利用来生产被所述第一酶利用的产物,将所述第一酶的共底物(cosubstrate)转变成与各个复制实体物理连接的反应性标记分子,从而特异性标记复制实体,和
[0013] d)分离特异性标记的复制实体。
[0014] 在优选的实施方案中步骤a)的反应混合物另外包含第三酶,该酶能分解所述第一酶和/或第二酶的过剩产物。
[0015] 在其它优选的实施方案中复制实体选自噬菌体、噬菌粒、或细胞。
[0016] 在其它优选的实施方案中复制实体为酵母细胞,优选酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0017] 在其它优选的实施方案中第一酶为过氧化物酶,优选辣根过氧化物酶,第二酶为氧化酶,优选葡萄糖氧化酶,且第三酶为过氧化氢酶。
[0018] 在其它优选的实施方案中第二酶的底物为葡萄糖且产物为H2O2。
[0019] 在其它优选的实施方案中所述第一酶的共底物为与标志分子缀合的酪酰胺。
[0020] 在其它优选的实施方案中标志分子为生物素、(2,4)-二硝基苯基、荧光素或地高辛配基(digoxygenin)衍生物。
[0021] 在其它优选的实施方案中酪酰胺通过可裂解的接头、优选二硫键或可被蛋白酶裂解的肽序列与标志分子连接。
[0022] 在其它优选的实施方案中标志分子为生物素,且分离步骤d)通过在抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白基质上的亲和色谱法来完成。
[0023] 在其它优选的实施方案中标志分子为荧光素或荧光抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的生物素且分离步骤d)通过荧光激活细胞分选完成。
[0024] 在其它优选的实施方案中标志分子为生物素且分离包括在与生物素标记的实体结合的链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包覆的顺磁颗粒的帮助下进行磁性细胞分选。
[0025] 本发明特别优选的实施方案为非天然存在的复制实体,在其表面上展示多种受体分子并含有与其表面偶联的酶。
[0026] 本发明更特别优选的实施方案为前段的非天然存在的复制实体,酶选自过氧化物酶或氧化酶。
[0027] 本发明的更特别优选的实施方案为前段的非天然存在的复制实体,其中受体分子为抗体或抗体衍生的片段
[0028] 本发明的更特别优选的实施方案为包含本发明的非天然存在的复制实体、底物、共底物的成套试剂盒。
[0029] 本发明更特别优选的实施方案为前段的试剂盒,实体选自噬菌体、噬菌粒、或细胞,细胞优选酵母细胞,更优选酿酒酵母,受体分子为抗体,与实体表面连接的酶为葡萄糖氧化酶或辣根过氧化物酶,底物为葡萄糖且共底物为与标志分子偶联的酪酰胺,优选生物素。
[0030] 例如,为了建立靶结合分子的噬菌体或细胞表面展示库成员的选择性生物素化,在一优选的实施方案中本发明利用了辣根过氧化物酶(HRP,E.C.1.11.1.7)介导的生物素3
化需要存在过氧化氢的事实。本文中描述的 CARD系统结合了三种不同酶即过氧化物酶、氧化酶和过氧化氢酶的活性。首先,HRP偶联到在筛选噬菌体颗粒群的噬菌体展示库的实验设置范围之内的起始群的所有成员上(附图1a)。噬菌体被HRP生物素化需要生物素酪酰胺
3
和过氧化氢的存在。在 CARD装置(setup)中H2O2通过与目标抗原缀合的第二酶产生(附图1b,c)。作为半乳糖或葡萄糖氧化酶的糖氧化酶通过电子转移催化糖氧化为氧,这导致过氧化氢的形成。过氧化氢仅仅在那些抗原-氧化酶复合物结合的噬菌体颗粒上以较高的浓度产生,因为反应混合物含有非常有效地分解过氧化氢的作为第三酶的过氧化氢酶。结果H2O2迁移至HRP且随后仅极接近于HRP处有氧化酶的结合抗原的噬菌体发生噬菌体生物素化。然后特异性标记的噬菌体可通过固定化的链霉抗生物素蛋白的生物淘选收集并在噬菌体感染细菌之前经受非常严格的洗涤条件。
[0031] 在本专利实施例部分中发明人描述了3CARD应用于单一结构域抗体库筛选和本发明使HRP偶联到噬菌体表面上和使氧化酶与靶蛋白缀合的直接方法,该方法使得噬菌体上的组合酶反应导致在单轮筛选中选择性生物素化和分离。
[0032] 为了使本文中描述的噬菌体展示筛选法起作用,发明人必须显示氧化酶和过氧化物酶的偶联反应可在噬菌体颗粒上进行,其中经抗原/抗体相互作用与噬菌体表面偶联的氧化酶产生的过氧化氢最终导致所结合的噬菌体的选择性标记并从而导致基因型表型偶联。此外,必须建立一种简单的使目标靶蛋白与氧化酶缀合的方法。
[0033] 为了解决这些问题,进行依赖于骆驼科(camelid)VHH单链抗体片段的噬菌体展示模型实验,其中单链抗体片段选择性结合绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)LipH分子伴侣(Wilhelm等,2007)。采用噬菌体展示载体pAK200通过VHH片段与截短的pIII的基因融合实现噬菌体上抗LipH VHH结构域的呈现(Habicht等,2007)。
[0034] 通过下面的附图部分解释本发明:
[0035] 附图1显示3CARD噬菌体展示筛选工序的概要。(a)辣根过氧化物酶(HRP)共价沉积于展示抗体变体(AB)库的噬菌体颗粒的表面。(b,c)抗原-氧化酶缀合物(AgOx)产生过氧化氢(H2O2)和与HRP的偶联反应,其中偶联反应将生物素酪酰胺(BT)转变为被俘获于噬菌体表面的基团。
[0036] 图2显示在噬菌体上的偶联的酶反应。(a)与噬菌体颗粒的表面偶联的HRP。LipH蛋白与微量滴定板的孔偶联。展示抗LipH VHH(αLipH VHH)的噬菌体或作为对照的无关蛋白用HRP(+HRP)修饰并加入孔中(深灰色条)。未缀合的αLipH VHH噬菌体充当对照(浅灰色条)。对于未加修饰的抗LipH-VHH噬菌体,噬菌体的靶蛋白结合通过添加过氧化物酶缀合的抗pVIII抗体来证实。HRP活性通过添加TMB和在450nm下测量吸光度进行检测。(b)噬菌体上氧化酶介导的HRP的活化。微量滴定板的孔分别用LipH-GOase缀合物涂覆或作为对照时用血清白蛋白(BSA)涂覆。在添加HRP修饰的抗LipH VHH噬菌体(黑条)或对照噬菌体(白条)和板洗涤之后加入半乳糖并在加入TMB之后在450nm下测量HRP活性。误差条代表三次测量的标准差。
[0037] 附图3显示通过3CARD筛选富集结合剂。(a)结合LipH噬菌体与对照噬菌体1:10,000(白色)和1:100,000(灰色)的混合物在筛选之前(第0轮)和在第1、2、和3轮筛选之后的LipH结合的噬菌体ELISA。与微量滴定板包覆的LipH结合的噬菌体采用过氧化物酶-缀合的抗pVIII抗体和生色的HRP底物通过在450nm下的吸光度测量来测定。
误差条显示三次测量的标准差。(b,c)采用位于与pIII编码序列融合的基因的侧面的引物在第2轮筛选之后获得的各个噬菌粒的PCR筛选。对于显示抗LipH VHH的噬菌体,可预期
676bp片段,对于含有较小的微蛋白质编码序列的对照噬菌体,产生了394bp片段。P:来自充当PCR对照的显示抗LipH VHH的噬菌粒中的噬菌粒DNA。
[0038] 图4显示在针对各个靶标的3CARD筛选之后64个单独的克隆的噬菌体ELISA。微量滴定板分别用各个靶蛋白西妥昔单抗、凝血因子XIII、和Saglin涂覆。噬菌体结合采用生色的HRP底物TMB通过添加过氧化物酶-缀合的抗pVIII抗体和在450nm下的吸光度测量来检测。对作为可溶性蛋白质的表达和Kd测定已经进行过选择的克隆标有星号。指示未结合的吸光度的平均值根据具有最低的OD450值的每次实验中的十个克隆来测定。超出此值至少2.5因子的克隆被认为是潜在的靶蛋白结合剂并以黑条显示。
[0039] 附图5显示生物素酪酰胺的化学结构。
[0040] 附图6显示(a)生产向量的流程图,含有氧化酶或靶蛋白的编码序列,分别具有基因融合的螺旋序列。(b)含有LipH-氧化酶(L+G,160kDa),LipH-Ecoil(L,55kDa)和GOase-Kcoil(G,70kDa)的不含SDS的蓝色非变性凝胶。该模型显示所形成的缀合产物。
[0041] 附图7显示所得的GOase-Kcoil和LipH-Ecoil的融合产物的GFC色谱图。
[0042] 附图8显示证实ox.GOX与LipH偶联的coomassie凝胶。在最初的两行中显示离析物(葡糖氧化酶70kDa,LipH 50 kDa)。在第3行中所得到的170kDa相互作用产物的存在也由Western印迹证实(没有显示)。
[0043] 附图9显示分别不添加生物素酪酰胺(黑条)或半乳糖(灰条)的模拟3CARD筛选的噬菌体ELISA。筛选按照所描述的进行(参见“Validation of genotype-phenotype coupling”),具有结合/非结合噬菌体的相同混合比例。在三轮淘选之后没有结合剂的富集可通过噬菌体ELISA或PCR筛选(0/10)被检测到。阳性:采用能与包覆的LipH结合的抗LipH噬菌体的噬菌体ELISA。阴性:展示无关蛋白的噬菌体的背景结合。采用过氧化物酶-缀合的抗pVIII抗体和测量生色的HRP底物在450nm下的吸光度来测定与微量滴定板包覆的LipH结合的噬菌体。实验以一式三份进行。
[0044] 附图10显示初始库中47个单一克隆的噬菌体ELISA。正如所料,在初始库LibA和LibB中没有检测到靶蛋白Saglin和西妥昔单抗的特定结合剂。作为阳性对照使用已经选择的结合西妥昔单抗和Saglin的噬菌体(最后的孔)。
[0045] 附图11显示噬菌体库对西妥昔单抗的结合剂的单轮筛选。A:筛选的技术现状,B:3CARD筛选。产生ELISA信号>0.3的克隆被认为是结合剂。A:1个克隆,B:36个克隆。PD:传统的噬菌体展示筛选。
[0046] 附图12显示噬菌体库对LipH的结合剂的单轮筛选。A:筛选的技术现状,B:3CARD筛选。产生ELISA信号>0.2的克隆被认为是结合剂。A:0个克隆,B:2个克隆。PD:传统的噬菌体展示筛选。
[0047] 附图13分别显示生物素酪酰胺(A)和含可裂解的二硫键(B)的生物素酪酰胺的结构。
[0048] 附图14显示噬菌体库对CTLA4的结合剂的筛选。左图:采用生物素酪酰胺,右图生物素-SS-酪酰胺)。产生ELISA信号>0.2的克隆被认为是结合剂。左图:2个克隆,右图4个克隆。
[0049] 附图15显示噬菌体库对MreB的结合剂的筛选。左图:采用生物素酪酰胺,右图生物素-SS-酪酰胺。产生ELISA信号>0.15的克隆被认为是结合剂。左图:2个克隆,右图8个克隆。
[0050] 附图16显示噬菌体库对硫氧还蛋白的结合剂的筛选。左图:采用生物素酪酰胺,右图生物素-SS-酪酰胺。产生ELISA信号>0.2的克隆被认为是结合剂。左图:3个克隆,右图6个克隆。
[0051] 本发明人表明通过采用3CARD将抗体与其抗原的瞬时相互作用转化为永久的标记,即生物素共价偶联于噬菌体或微生物细胞的表面,可显著地加速不同库的筛选。这通过应用在噬菌体或酵母菌表面上的偶联的酶反应实现,其中靶标-结合的氧化酶产生H2O2,它是噬菌体结合的过氧化物酶活化生物素酪酰胺所需要的。生物素酪酰胺已经广泛用于免疫组织化学,还用于选择性标记酶展示细胞。由于其在溶液中半衰期短,酶-生成的酪酰胺基团在形成的位点上反应因此允许生物素的位点特异性共价沉积(Bobrow等,1989,1991,1992,Becker等,2007,2008,Lipovsek等,2007)。
[0052] 对于基因型-表型连接的发生,必须小心地控制生物素化反应并局限于能与预定的相互作用配偶体发生特异性相互作用的稀有库成员的群。为此目的,建立偶联的酶反应,其中形成HRP的酪酰胺基团的活性通过氧化酶形成过氧化氢来控制。在这种情况下,溶液中的抗原-氧化酶缀合物大大过量超过噬菌体颗粒。然而,过量的H2O2(是HRP活化酪酰胺所需要的)的产生,可通过添加有效和连续分解过氧化氢的过氧化氢酶来避免。而且,该偶联反应在一定的pH下进行,该pH对于各个氧化酶进一步减少过量的过氧化氢是次最优的。因此,仅极接近于氧化酶的HRP分子有机会在被过氧化氢酶分解之前俘获过氧化氢分子。总之,该系统继承若干层的安全以确保选择性生物素标记靶标结合的噬菌体,这通过使H2O2仅仅可被抗原结合的噬菌体上的HRP获得和产生由于其半衰期短而局部起作用的酪酰胺基团来实现。
[0053] 以发明人的最佳认知,这是首次将偶联的酶反应应用于噬菌体展示筛选。永久标记结合靶标的噬菌体的单一酶方法十多年前已经由McCafferty及其同事作过描述。它被称为‘探路者技术’且依赖于HRP介导的在细胞表面或靶蛋白上特异性位点的抗体展示噬菌体的生物素化(Osbourn等,1998)。在该实验设置中,过氧化物酶不直接与噬菌体颗粒偶联。相反,使用过氧化物酶-缀合的针对靶蛋白的配体,例如使用在远离噬菌体抗体结合部位结合靶蛋白的抗体。靶标结合的噬菌体和靶标上的HRP的共定位导致噬菌体生物素化。该方法仅仅应用于细胞表面暴露的靶蛋白,这使得在经与链霉抗生物素蛋白珠粒结合俘获噬菌体之前通过细胞离心和洗涤除去过量的过氧化物酶-配体缀合物和未结合的噬菌体颗粒(不管是否被生物素化)成为可能。在此描述的该方法可成功地应用于筛选可溶性靶标,这是由于通过添加过氧化氢酶强烈地减少了不能结合靶蛋白的噬菌体颗粒的交叉-生物素化,其中过氧化氢酶消除过量的过氧化物酶底物过氧化氢。
[0054] 将结合剂和靶蛋白的瞬时相互作用转化为共价生物素标记提供以下主要优点:可应用非常严格的洗涤条件用以除去非特异性结合吸附基质的噬菌体。我们已经运用了扩大的洗涤工序,包括使用洗涤剂以及降低pH至2.2,因为已知生物素链霉抗生物素蛋白的相互作用在那些条件下是稳定的(Hofmann等,1980)。可预见在低pH下噬菌体-结合的靶蛋白复合物会变性并因此离解,这可能对于噬菌体感染大肠杆菌细胞(要求无屏蔽的pIII蛋白)是有益的。由于我们观察到与磁珠结合的噬菌体颗粒可直接用于细菌感染,未费力就破坏了甚至在pH2.2下仍然稳定的很稳定的生物素链霉抗生物素蛋白相互作用和使噬菌体颗粒从基质上解除吸附。使用含可裂解接头的生物素酪酰胺缀合物可进一步降低不希望的非特异性结合的噬菌体的背景,其中可裂解的接头允许从链霉抗生物素蛋白基质中选择性释放生物素化的噬菌体。
[0055] 本文中描述的工序产生介质亲和性结合剂。这不是预料不到的,因为两个库均已经用于VHH分离,它们应用传统的噬菌体展示(LibA)和酵母菌表面展示(LibB)策略产生具有相似亲和性的结合剂(数据没有显示)。而且,LibB由未免疫的羊驼(llamas)产生,可以预料由于缺少体内亲和力成熟其本身含有低等和中等亲和性结合剂的广泛组成部分3
(repertoire)。目前尚待以实验阐明是否 CARD噬菌体展示筛选可以区别低亲和性结合剂和高亲和性结合剂因此可用于亲和力成熟筛选。由于氧化酶-靶标缀合物的浓度可自由变化因此通过经靶标浓度的降低或经解离速率(off-rate)筛选法的亲和性选择来筛选高亲和性结合剂也许是可行的(Hawkins,Russell1992)。对于亲和性选择,噬菌体可与少量的可溶性氧化酶缀合的抗原混合使得抗原相对于噬菌体过量但抗原的浓度低于抗体的离解
3
常数(Kd)。然后将与抗原结合的噬菌体通过 CARD标记并通过俘获至磁珠进行分离。对于
3
解离速率筛选法,可将抗体预加载氧化酶-偶联的抗原并在 CARD俘获到链霉抗生物素蛋白-包覆的顺磁性珠粒之前稀释到过量的未缀合的抗原中。
[0056] 总之,本文中描述的策略对超过109种不同变体的非常大的噬菌体或微生物展示库的初始筛选特别有用,其中在第一轮筛选中相对巨大背景的非特异性噬菌体富集稀少的靶向结合剂很重要。经偶联的酶反应和报道分子沉积的基因型表型连接还可适用于在细菌和酵母细胞的表面上展示的库的筛选,它是将来应用令人感兴趣的分支。
[0057] 提供以下实施例用于示例的目的,但决不用来限制本发明的范围。特别地,在实施例中及本发明的说明书中其它地方阐述的不同实施方案的特定的新的组合始终被考虑,即使在它们没有被明确提及的情况下。
[0058] 实施例1:氧化酶与靶蛋白的缀合
[0059] 确定氧化酶和靶蛋白的共价连接的两种直接的偶联方法。第一种缀合流程图依赖于可在大肠杆菌(E.coli)中表达的半乳糖氧化酶(GOase)的M1变体的使用(Sun等,2001)。为了使靶蛋白与GOase偶联,使用先前建立的依赖于酶和目标蛋白之间卷曲螺旋形成的程序。为此目的,赋予靶蛋白和氧化酶羧基末端六组氨酸标记,之后赋予含有谷氨酸(Ecoil)或赖氨酸残基(Kcoil)的卷曲螺旋序列,已知这形成紧密的杂二聚体(Steinman等,2010)。Ecoil序列(EVSALEK)5与LipH基因稠合,而Kcoil序列(KVSALKE)5与半乳糖氧化酶的羧基末端稠合。两种蛋白质分别在大肠杆菌(E.coli)中表达和纯化。杂二聚体形成仅仅通过混合氧化酶和LipH来获得并被非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实(附图6,7)。
对于可替代的缀合方法使用可商购获得的葡萄糖氧化酶。由于该酶被葡糖基化,靶蛋白的蛋白缀合可通过末端糖部分的高碘酸盐氧化之后用位于靶蛋白表面上的赖氨酸残基将所得形成席夫容易地实现(Greg T.Hermanson,1996)。为此目的,将源自镰刀霉属物种(Fusarium spec.)的氧化的葡萄糖氧化酶用摩尔过量的LipH蛋白温育,该融合利用LipH部分的六组氨酸标记通过金属螯合亲和色谱法由未缀合的氧化酶纯化(附图8)。
[0060] 实施例2:噬菌体上偶联的酶反应
[0061] 为了研究在没有抗原结合的负面干扰的情况下辣根过氧化物酶(HRP)是否能与丝状噬菌体的表面偶联,将展示抗LIPH VHH的噬菌体颗粒和展示无关肽的对照噬菌体与被氧化的HRP一起温育并用聚乙二醇通过几倍的噬菌体沉淀纯化。微量滴定板的孔用靶蛋白涂覆。对固定化抗原展示抗LipH VHH抗体的HRP包覆的噬菌体的结合可以通过采用生色底物TMB测量过氧化物酶活性证实(附图2a)。还有待阐明偶联反应是否能在噬菌体表面上发生,其中氧化酶输送HRP需要的过氧化氢,微量滴定板用LipH-GOase缀合物涂覆。分别加入,展示抗LipH VHH的HRP-包覆的噬菌体或展示无关抗原的对照噬菌体。在洗涤和加入半乳糖之后,可以检测过氧化物酶活性(附图2b)表明偶联反应在噬菌体上发生。
[0062] 实施例3:基因型-表型偶联的验证
[0063] 为了验证基因型-表型偶联,将呈现抗LipH VHH的噬菌体与对照噬菌体分别以1:10,000和1:100,000的比例混合。在HRP缀合和加入LipH-GOase复合物之后通过添加半乳糖、生物素酪酰胺和过氧化氢酶启动偶联的酶反应。在30min温育之后通过与链霉抗生物素蛋白-包覆的磁珠结合俘获生物素化的噬菌体。在分别用PBS、PSB-吐温和pH2.2的甘氨酸缓冲液彻底洗涤之后,直接使用噬菌体-结合的珠粒感染大肠杆菌(E.coli)细胞。应用两轮以上相同的筛选工序,呈现抗LipH-VHH的噬菌体的富集通过噬菌体ELISA和PCR分析得到证实。在这两种混合物中在单轮筛选之后靶向结合的噬菌体累积到显著的程度(附图3a)。在第2轮筛选之后各个克隆的PCR分析显示1:10,000稀释的16个克隆中的6个克隆和1:100,000稀释的16个克隆中的3个克隆含有676bp片段,指示存在VHH基因。将此混合实验重复几次获得近似结果使该方法的方案最优化和确保其重现性。富集依赖于生物素酪酰胺和半乳糖二者的存在(附图9)。
[0064] 实施例4:3CARD VHH库筛选
[0065] 为了研究3CARD噬菌体展示筛选是否能用于从噬菌体库中快速选择抗原结合剂,8
使用两种骆驼科VHH噬菌体展示库。LibA含有大约10 种具有随机杂色的高变环序列的骆
9
驼科可变重链的变体(Habicht等,2007)。LibB为初级( )VHH结构域库(3×10 克
隆),其采用公开方法通过将12种非免疫的羊驼类的VHH所有组成部分(repertoire)克隆到噬菌体展示载体pAK200中来获得(Monegal等,2009)。三种不同的与葡萄糖氧化酶偶联的靶蛋白用于筛选,即西妥昔单抗(一种抗表皮生长因子受体抗体(Robert等,2001)),Saglin(一种来自按蚊属的唾腺蛋白,其参与通过疟原虫属(Plasmodium)的孢子体(疟疾的致病因子)的蚊虫侵入过程(Okulate等2007)),凝血因子XIII(一种在血液凝固中起作用的人谷氨酰胺转移酶(Komaromi等,2010))。分别在第1或2轮筛选之后,噬菌体由64个个体克隆产生,并通过噬菌体ELISA探测靶向蛋白结合,指示对所有三个靶标靶向结合的噬菌体克隆的积累(附图4)。
[0066] 将来自每次筛选的一种推定结合剂的编码序列转入表达载体pEX中,产生各个VHH蛋白并由大肠杆菌(E.coli)细胞溶胞产物纯化。与各个靶蛋白的相互作用通过干涉测量得到证实并获得中等纳摩尔范围的离解常数(表1)确证筛选流程是稳固的足以在一轮或两轮筛选中从不同的库中获得抗几种无关靶标的单域抗体。在筛选之前没有付出努力从初始的噬菌体库中除去氧化酶、过氧化物酶或噬菌体蛋白结合剂,它们因此可构成所选噬菌体群体的显著部分。
[0067] 表1由3CARD筛选获得的VHHs的I离解常数(Kd)
[0068]
[0069] 实施例5:氧化酶通过卷曲螺旋形成与抗原缀合
[0070] 为了获得氧化酶和靶标抗原的杂二聚体,绿假单胞菌(P.aeruginosa)LipH在具有C-末端六组氨酸标记随后有酸性螺旋(EVSALEK)5编码序列的大肠杆菌(E.coli)中表达(Steinmann等,2010)。同样,赋予半乳糖氧化酶M1C-末端六组氨酸纯化标记,之后赋予(KVSALKE)5。这两种蛋白质通过金属螯合亲和色谱法纯化并筛选实验之前以1:1的摩尔比混合。
[0071] 实施例6:高碘酸钠氧化
[0072] 将18.8mg高碘酸钠(87.8μmol,Sigma)在1ml H2O中稀释。将待氧化的蛋白、HRP或葡萄糖氧化酶(Sigma)二者之一,在H2O中稀释至10mg/ml的终浓度。为了氧化将200μl蛋白溶液与20μl的高碘酸钠原液混合。在黑暗中于室温温育20min之后,反应混合物用以100mM pH9.1的酸钠缓冲液预平衡的PD10柱子(GE Healthcare)纯化。1.4ml的含有氧化蛋白的洗脱液用硼酸钠缓冲液填满至2ml并于-20℃等份存储。
[0073] 实施例7:与葡萄糖氧化酶偶联的靶蛋白
[0074] 将0.1mg的在1mg/ml浓度下的高碘酸盐氧化的葡萄糖氧化酶与等摩尔量或更少当量的在200μl缓冲液中的靶蛋白一起在黑暗中于室温温育180min,之后分别采用Superdex75pg16/60或Superdex200pg16/60柱子进行凝胶过滤色谱并收集初期洗脱的部分。
[0075] 关键步骤:应通过非变性凝胶电泳或通过凝胶过滤色谱检验缀合物形成。由于杂二聚体缀合物的产生可能随靶蛋白表面上可得触及到的赖氨酸残基的数目变化,通常推荐通过采用琼脂糖或Superdex柱子的凝胶过滤色谱通过收集初期的洗脱级分来纯化缀合产物。
[0076] 实施例8:与M13噬菌体偶联的HRP
[0077] 在HRP偶联之前,从噬菌体库中除去链霉抗生物素蛋白结合剂。为此目的,将10
100μl pAK200-VHH噬菌体(3*10 噬菌体)与10μl链霉抗生物素蛋白-Dynabeads(T1,Invitrogen)一起在振动器中在40rpm下于室温温育30min。采用磁性粒子集中器分离珠粒后,将上清液转入1.5ml反应管中并加入100μl氧化的HRP(2mg/ml在pH9,1的硼酸盐缓冲液中)。将反应混合物在缓慢搅动下在黑暗中于室温温育45min。为了除去未偶联的HRP,加入200μl噬菌体沉淀缓冲液(20%PEG6000,1,5M NaCl),之后在上温育45min。在台式离心机中离心之后(30min),将噬菌体沉淀(pellet)溶解于50μl PBS中。
[0078] 实施例9:噬菌体上偶联的酶反应
[0079] 将5μl(3pMol)抗原-氧化酶缀合物加入到50μl HRP缀合的噬菌体悬浮液中并在轻微搅动下于4℃温育90min。然后,通过添加PBS缓冲液将反应体积增加至500μl。当采用GOase作为报道分子酶时通过加入硼酸盐缓冲液将pH调至9.1。然后,加入1μl过氧化氢酶(2mg/ml)和2.5μl生物素酪酰胺原液(11.5μM)。通过分别添加10μl10mM葡萄糖或10μl10mM半乳糖开始酶反应。将反应混合物在黑暗中于室温温育15min并通过添加200μl过氧化氢酶(2mg/ml)停止反应。三分钟之后加入700μl噬菌体沉淀并将混合物在冰上温育45min。通过在台式离心机中离心收集噬菌体沉淀(20min,4℃)并再悬浮于200μl PBS中。
[0080] 关键步骤:通过在各氧化酶次最优的(suboptimal)pH下进行反应降低氧化酶活性是必要的。为此目的,当使用GOase时,在噬菌体上偶联的酶反应将在pH9.1的硼酸盐缓冲液中进行,这远远地超出了该酶的最佳pH(pH7.0)以减慢酶促反应的速度和避免过量的过氧化氢产生。在葡萄糖氧化酶的情况下最佳pH为5.5,所以反应将在pH7.4的PBS中进行。添加破坏过量过氧化氢的过氧化氢酶也很重要,其中过量的过氧化氢由不与噬菌体结合的氧化酶产生,其可扩散离开它的形成位置并充当位于附近的噬菌体颗粒的过氧化物酶的底物。
[0081] 实施例10:生物素化的噬菌体的俘获
[0082] 将20μl链霉抗生物素蛋白偶联的磁珠(Dynabeads T1,Invitrogen)加入到样品中并通过搅动温育30min。然后将珠粒用200μl PBS缓冲液洗涤五次。使用磁性颗粒收集器将珠粒从上清液中分离。之后将收集的珠粒悬浮于200μl PBS缓冲液中并转入新管中以消除潜在塑料结合的抗体-噬菌体。收集珠粒并再悬浮于200μl10mM甘氨酸-HCl pH2.2中并温育8min以从珠粒上除去非特异性结合的噬菌体。将此步骤重复一次。最后,将珠粒用PBS吐温缓冲液(0.05%在PBS缓冲液中的吐温20)洗涤五次和用PBS缓冲液洗涤五次。
[0083] 实施例11:大肠杆菌(E.coli)细胞的感染
[0084] 在最后的洗涤步骤之后,将含结合的噬菌体的链霉抗生物素蛋白-包覆的珠粒再悬浮于200μl PBS中用于大肠杆菌ER 2738(稀释到20ml细菌液体培养物于0.5的OD600)的感染,并在不摇动的情况下于37℃温育30min。通过离心收集细胞,将其溶解于1.5ml PBS中并以500μl等分试样在含有氯霉素(25μg/ml)的琼脂板上划线并于37℃温育过夜。
[0085] 实施例12:噬菌体产生的一般方法
[0086] 让含有噬菌粒pAK200-VHH的大肠杆菌菌株ER2738(Gough1983,Woodcock1989)在50ml dYT(CM25μg/ml,TET100μg/ml)中于37℃(振摇,200rpm)生长至OD600为0.1并加入10μl的辅助噬菌体M13VCS。感染通过将细胞在37℃下温育45分钟进行。加入卡那霉素(75μg/ml)并将培养物于37℃(200rpm)温育直至一个OD600达到0.5。然后,加入
50μl1M IPTG以诱导VHH-pIII合成并于28℃继续温育12h。通过噬菌体沉淀收获产生的噬菌体。为此目的,通过离心(3200g,12min,4℃)收集细胞并将35ml的上清液转入50ml高速离心管(falcon tube)中。加入8ml噬菌体沉淀缓冲液(20%PEG6000,1,5M NaCl)并将混合物在冰上温育4小时。通过离心(20200g,4℃,30min)收集沉淀的噬菌体。将所得噬菌体沉淀(pellet)溶解于1.6ml PBS中,噬菌体通过添加400μl沉淀缓冲液再沉淀,于
4℃温育10min。在离心之后(16000g,10min,RT)将残留的噬菌体沉淀(pellet)溶解于1ml PBS中。噬菌体滴度通过ER2738感染连续稀释的噬菌体颗粒或通过测定O.D320和OD269的分光光度法来测定(Smith,Scott1993)。在再使用以前将噬菌体于4℃储存。
[0087] 表2由3CARD筛选获得的VHHs的噬菌体滴度。
[0088]
[0089]
[0090] 实施例13:生物素酪酰胺的合成
[0091] 将10mg(17.96μmol)硫代-NHS-LC-生物素(Thermo Scientific)在800μl无水DMF中稀释并与2mg(11.51μmol)酪酰胺(Sigma-aldrich)在200μl无水DMF中的溶液混合。然后加入3μl三乙基胺并将反应混合物在室温下温育2h。为了中止剩余的过量的硫代-NHS-LC-生物素(Pierce)将20μl1-丙胺加入到溶液中。在于室温温育4h之后所得产物不经进一步纯化于-20℃储存。生物素-酪酰胺的形成通过HPLC和LC-MS证实。生物素酪酰胺的化学结构如附图5所示。
[0092] 实施例14:与技术现状的噬菌体展示的比较
[0093] 为了显示本发明的噬菌体库筛选方法优于现有技术的筛选方法,将传统的筛选和3CARD筛选采用相同的筛选条件平行进行。靶标:西妥昔单抗和LipH(靶标以及筛选方法已经在本发明中描述)。3CARD筛选按照一轮筛选的描述进行。对于传统的筛选,采用与3CARD(4.5nM)相同浓度的生物素化的靶蛋白。将噬菌体库与生物素化的靶蛋白一起在室温下温育。20min之后,结合靶标的噬菌体被俘获到链霉抗生物素蛋白包覆的磁珠(magnetobeads)(15min)。用1ml TPBS珠粒洗涤珠粒10次之后剩余的结合的噬菌体用pH2.2的甘氨酸缓冲液洗脱并用于感染大肠杆菌(E.coli)细胞。一轮筛选之后噬菌体由96个个体克隆制备并采用噬菌体ELISA探测它们结合各靶蛋白的能力。结果如附图11和
12所示。
[0094] 实施例15:3CARD技术的更优选的实施方案
[0095] 作为标记结合靶标的噬菌体的新化合物使用在生物素和连接分子的酪酰胺部分之间含有二硫(disulfiude)键的生物素酪酰胺衍生物。因此,生物素部分可通过添加弱还原剂如例如二硫苏糖醇(dithiotreitol)从标记的噬菌体裂解。
[0096] 生物素酪酰胺的合成
[0097] 10mg(17.96μmol)硫代-NHS-LC-生物素和Sulfu-NHS-SS-生物素(Thermo Scientific)分别在800μl无水DMF中稀释并与2mg(11.51μmol)酪酰胺(Sigma-aldrich)在200μl无水DMF中的溶液混合。然后加入3μl三乙基胺并将反应混合物在室温下温育2h。为了分别中止剩余的过量的硫代-NHS-LC-生物素和硫代-NHS-SS-生物素将20μl1-丙胺加入到溶液中。在于室温温育4h之后所得产物不经进一步纯化于-20℃储存。
生物素酪酰胺的形成通过HPLC和LC-MS证实。
[0098] 采用此新标记分子对结合靶标的噬菌体再进行三次筛选。作为靶蛋白,使用大肠杆菌蛋白MreB、人CTLA4(细胞毒性T-淋巴细胞抗原4)胞外域和硫氧还蛋白。
[0099] 对于噬菌体库筛选,使用与已经描述的相同的噬菌体。靶标-氧化酶偶联也按照所描述的进行。噬菌体标记之后,生物素化的噬菌体被俘获到链霉抗生物素蛋白包覆的磁珠(magnetobeads)。彻底洗涤之后,被俘获的噬菌体在使用生物素酪酰胺的情况下直接用于感染大肠杆菌细胞(附图14-16,左区)。对于采用生物素-SS-酪酰胺标记的噬菌体,磁珠结合的噬菌体颗粒通过添加50mM作为还原剂的二硫苏糖醇裂解。洗脱的噬菌体然后用于感染大肠杆菌细胞。对于每次筛选,噬菌体由96个单一的克隆制备并采用噬菌体ELISA探测它们结合各靶蛋白的能力。
[0100] 在一个单一的筛选轮次之后,该筛选已经提供结合靶标的噬菌体。采用改进的底物和改进的噬菌体分离步骤,阳性候选物的数量增加到较高的数量。
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