抗体制备方法及所得抗体和抗体库 |
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| 申请号 | CN201110034648.7 | 申请日 | 2011-01-31 | 公开(公告)号 | CN102618940A | 公开(公告)日 | 2012-08-01 |
| 申请人 | 艾比玛特生物医药(上海)有限公司; | 发明人 | 孟逊; 王小清; 陈泽庸; 汪国兴; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种针对感兴趣的 蛋白质 制备其 抗体 的方法，其能够针对所有蛋白质高效、快速、低成本地制备具有高度特异性的抗体，并且能够明确抗体所针对的表位，进而建立起 覆盖 感兴趣的蛋白质表面的表位库以及针对所有表位的抗体库。这些抗体证明能够用于检测，蛋白功能研究和抗体制药。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种制备针对感兴趣的蛋白质的抗体的方法，包括： |
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| 说明书全文 | 抗体制备方法及所得抗体和抗体库技术领域[0001] 本发明涉及筛选和/或制备感兴趣蛋白质的特异性抗体的方法。本发明具体涉及一种高通量、低成本和高成功率的方法，其可用于在蛋白质组规模预测感兴趣蛋白质的表位，制备其特异性抗体，以及筛选和检测所产生的抗体。 背景技术[0002] 基因组技术的发展，在基因的层面上为生物功能的研究、疾病的诊断和治疗、以及药物的开发等领域提供了大量的基础信息。但是对于大多数的生物体系来说，单纯的基因信息并不足以阐明其作用机制。此外，如果要利用这些信息以及作用机制来实现应用的目的，如对病理状况进行鉴定和分析、对药物的作用机制及效果进行验证和判断，则需要更进一步地在蛋白质的层面上获取更多的信息，例如分析和研究各种蛋白质的结构、功能、表达、定位、修饰、以及相互作用等性质。 [0003] 对蛋白质各种性质的鉴定需要借助很多的技术手段，如质谱、层析、电泳、芯片以及各种标记技术等，这其中的很多技术手段都需要通过抗原抗体的相互作用来实现。此外，抗原抗体相互作用本身也是非常重要的技术手段，其可以广泛地应用于科研、医疗以及药物开发等各个领域，例如治疗性抗体药物的开发等。随着蛋白质研究的深入进展，对各种抗体乃至抗体库的需求也日益增加，例如需要针对某物种蛋白组中所有蛋白制备其特异性抗体库，或者针对某一特定类别的蛋白如激酶、G蛋白受体等制备其特异性抗体等等。但是目前已知的仅仅是针对几千种蛋白的有限抗体，而且其特异性也满足不了很多技术手段的需要。因此，能够针对任何感兴趣蛋白快速、高效且大量地制备高度特异的抗体将具有十分重要的意义。 [0004] 目前常用的获取抗体方法包括杂交瘤技术、重组抗体技术、各种分子展示技术，以及将上述这些技术与高通量的方法结合的技术等。 [0005] 抗体的制备，通常主要是通过天然或重组蛋白或其片段来免疫动物，使动物体内产生能够特异地识别和结合所述蛋白的抗体。然后根据需要再 使用各种技术手段从动物的细胞中获取抗体，如单克隆抗体或者多克隆抗体等。单克隆抗体的获取通常需要借助杂交瘤技术，该方法在免疫动物后，需要取动物细胞进行融合以获得产生抗体的杂交瘤，再进行克隆建株以产生抗体，随后再对抗体进行纯化和鉴定。根据需要可以再进一步确定其抗原表位。这种产生单克隆抗体的杂交瘤技术最早应用于鼠模型 和Milstein，Nature vol.256，1975)，如今已广泛的应用于各种动物模型，其详细过程可参见各种教科书和操作手册的介绍(如Bazin，“Rat hybridomas andrat monoclonal antibodies”，CRC rdPress，1990；Goding，“Monoclonal antibodies：principles and practice”，3 edition，Academic Press，1996；Shepherd和Dean“Monoclonal antibodies”Oxford University Press，2000等)。此方法虽然目前仍广泛应用于抗体制备，但其也具有很多缺点，如制备周期很长、制备技术非常复杂、不能够完全识别表位、以及成本高昂等缺点，而且这种方法也并不能应用于所有的蛋白质，例如对于很多免疫原性低或者具有毒性的抗原来说，这种方法就不适用(SinclairNR(et al，2004)B cell/antibodytolerance to our own antigens.Front Biosci 9：3019-3028)。 [0006] 此外，为获得具有特异性的单克隆抗体，目前常用的是将化学合成的肽片段偶联至载体蛋白，然后免疫小鼠。此方法一次得到针对同一蛋白质单一表位的抗体，而由于肽片段本身免疫原性的差异，这种策略的整体成功率不高。特别是对于同源性很高的蛋白，筛选出来的肽的免疫原性很差，很难刺激小鼠机体产生强免疫反应。另一常用策略是采用全长蛋白质或者蛋白质片段制备免疫原，部分解决了上述问题，但却又存在蛋白表达整体成功率不高的缺陷(一般表达纯化体系为30-70％)(Thorsten Kohl，ChristianSchmidt，Stefan Wiemann，Annemarie Poustka and Ulrike Korf.Drew，2003)。对于在所用动物中具有高同源性的蛋白质片段，动物免疫应答一般较弱，制备单克隆抗体的成功率较低(Sinclair NR et al，2004，Automated productionof recombinant human proteins as resource for proteome research ProteomeScience 2008，6：4；Sinclair NR(2004)B cell/antibody tolerance to our ownantigens.Front Biosci 9：3019-3028)。 [0007] 重组抗体技术可以与各种分子展示技术相结合，从而针对多种抗原来产生对靶具有高度亲和力的抗体，并且可以同步确定抗原表位，因而常用于药物开发中(Christine Rothe，Stefanie Urlinger，Makiko Yamashita et al.TheHuman Combinatorial Antibody Library HuCAL GOLD Combines Diversification of All Six CDRs According to the N atural Immune System witha Novel Display Method for Efficient Selection of High-Affinity Antibodies.J.Mol.Biol.(2008)376，1182-1200，2007)。但重组抗体技术的操作复杂，成本高昂，产量较低，而且还经常存在非特异性结合，从而限制了其大规模的应用。(Levitan，B.Stochastic modeling and optimization of phage display.J.Mol. Biol. 277，893-916(1998).Bradbury et al，2004)为提高免疫和筛选效率，可以将上述技术与高通量的方法相结合，例如采用多种免疫原同时免疫并使用芯片技术进行筛选的高通量策略，如CN200510026873.0所述。但这种免疫策略需要大量高免疫原性的免疫原，这对于难以进行表达和提纯的蛋白质或者对于免疫原性很低的蛋白质来说，也是很难实现的。 [0008] 另外传统的多免疫原同时免疫的方法只能在产生抗体后根据需要再通过特定技术如表位定位(epitope mapping)来被动地确定该抗体所针对的表位(参见Glenn E.Morris，“Methods in Molecular Biology：Epitope MappingProtocols”，Humana Press，1996)。所述表位有时也并非感兴趣蛋白质所特有的，通常也可在同物种的很多其它蛋白质中出现，因而所产生的抗体的特异性较低。 [0009] 为解决上面提到的各种问题，需要新的抗体制备和筛选方法，从而能够针对所有蛋白质高效、快速、低成本的制备和筛选出高度特异的抗体。 [0010] 发明概述 [0011] 本发明提供了一种制备感兴趣的蛋白质的抗体的方法，该方法包括：(a)预测和/或选择位于感兴趣的蛋白质表面的肽片段；(b)合成或表达一或多个所述肽片段；(c)利用步骤(b)的产物免疫动物，任选组合佐剂进行免疫；(d)用来自步骤(c)的经免疫的动物的淋巴细胞来获得抗体；(e)用步骤(a)的肽片段和/或天然构象的所述感兴趣的蛋白质筛选步骤(d)中所获得的抗体，得到所述感兴趣的蛋白质的抗体库。 [0012] 在一个实施方案中，本发明的方法可通过如下方法预测或选择所述步骤(a)中的肽片段：(i)根据感兴趣的蛋白质的序列，通过计算如下参数来确定表面肽，所述参数选自：溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域预测、或以上任意组合；(ii)将步骤(i)所确定的表面肽与感兴趣的蛋白质所来源物种的蛋白质组进行序列比对，筛选出所述感兴趣的蛋白质 的特异性肽片段；和(iii)将步骤(i)所确定的表面肽与其他物种的同源蛋白质进行序列比对，筛选出所述感兴趣的蛋白质的保守序列。 [0013] 在一个实施方案中，本发明方法步骤(a)中所述肽片段是感兴趣的蛋白质的线性表面身份肽和/或构象型表面身份结构域。在一个实施方案中，所述身份肽具有如下特点：长度是6-12个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、不位于跨膜区、而位于无序区域。在另一个实施方案中，所述身份结构域是长度为100-500个氨基酸的、预期具有3维结构的序列特异性蛋白质片段。 [0014] 在一个实施方案中，本发明方法步骤(b)通过与增强免疫原性和/或增加拷贝数的蛋白质的融合蛋白的形式重组表达所述一或多个肽片段。在一个实施方案中，所述增强免疫原性和/或增加拷贝数的蛋白质是病毒样颗粒蛋白质载体。在一个实施方案中，所述病毒样颗粒蛋白质载体为乙肝病毒核衣壳(HBC)蛋白。在一个实施方案中，所述一或多个肽片段插入到HBC蛋白的环、N端或C端，例如插入位点位于HBC蛋白的第77和第82位氨基酸残基之间。在一个实施方案中，通过接头连接的2-10个肽片段插入到HBC蛋白中。所述接头可以是(GGGGS)n，其中n为任意整数，例如1、2、3或4。 [0015] 在一个实施方案中，本发明所述方法步骤(b)中一或多个肽片段进一步与免疫增强载体蛋白偶联。在一个实施方案中，所述免疫增强载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(KLH)。 [0016] 在一个实施方案中，本发明所述方法步骤(b)中的一或多个肽片段是化学合成的。 [0018] 在一个实施方案中，本发明方法步骤(c)的免疫在多位点进行，例如在选自以下位点的至少2个位点进行：颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟、前腿腋窝、后腿肌肉。 [0019] 在一个实施方案中，进行多次免疫，时间间隔为2-14，例如3-4天。 [0020] 在一个实施方案中，本发明方法步骤(c)的免疫包含如下步骤： [0021] (A).首次免疫，在颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉 [0022] 使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫； [0023] (B).第二次免疫，在颈背部、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫； [0024] (C).第三次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫；和 [0025] (D).第四次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫。 [0026] 在一个实施方案中，在第一天进行首次免疫，在第5天进行第二次免疫，在第8天进行第三次免疫，在第11天进行第四次免疫。 [0027] 本发明方法步骤(d)可以通过至少一种选自如下方法来获得抗体：(1)将来自步骤(c)经免疫的动物的淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞并表达从而获得抗体；(2)从来自步骤(c)经免疫的动物的淋巴细胞中分离出抗原特异性B细胞，再利用PCR来克隆和表达抗体基因从而获得抗体；或者(3)从来自步骤(c)经免疫的动物的淋巴细胞中分离出mRNA，然后通过噬菌体展示、或核糖体展示、或酵母展示、或细菌展示、或杆状病毒展示、或哺乳细胞展示、或mRNA展示来获得抗体。 [0028] 在一个实施方案中，本发明的方法获得主要包含单一IgG亚型的抗体。 [0029] 在一个实施方案中，本发明方法步骤(e)的抗体库是针对一个物种所有感兴趣蛋白质的抗体库。在另一个实施方案中，本发明方法步骤(e)的抗体库是包含了针对一种感兴趣的蛋白质的所有表位的抗体的抗体库。 [0030] 在一个实施方案中，本发明方法步骤(e)通过亲和力排序筛选步骤(d)中所获得的抗体。 [0031] 本发明的方法还可以进一步包括筛选功能性抗体或检测性抗体的步骤(f)。例如，所述检测性抗体通过Western印迹、IP、IF、IHC、流式细胞计数、ELISA或其任意组合进行筛选；所述功能性抗体通过可阻断或中和测定来进行筛选。 [0033] 图1：多克隆位点设计图示与核苷酸序列。 [0034] 图2：人造HBc图示。 [0035] 图3：H载体结构图。 [0036] 图4：4A1抗体Western结果验证。C2C12细胞以含蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，1％Triton-X-100，1％脱氧胆酸钠0.1％SDS裂解液)裂解，SDS-PAGE电泳，然后转移至PVDF膜，加入1∶5稀释的单克隆抗体细胞株的培养上清，以ECL Plus(Amersham)检测。WB：western印迹。 [0037] 图5：4A1抗体IF验证数据。5×103个BHK细胞接种到细胞载玻片上于37℃培养过夜，冰甲醇(-20℃)固定15min，1×PBS洗涤2×3min，1％BSA室温封闭1h后，加入单克隆抗体细胞株培养上清1∶1室温孵育1小时，洗涤，加入二抗抗小鼠Dylight549(Abcam)1∶400和DAPI 1∶4000室温孵育1h，洗涤，荧光显微镜(Olympus)镜检拍照。 [0038] 图6：针对GPR116蛋白获得的抗体1A6的Western结果验证。WB：western印迹。 [0039] 图7：针对Aof1蛋白获得的抗体2F1的Western结果验证。WB：western印迹。 [0040] 发明详述： [0042] 本发明提供了一种制备感兴趣的蛋白质的抗体的方法，其能够高效、快速、低成本地制备所述蛋白质的高度特异性抗体，进而建立覆盖感兴趣的蛋白质表面表位的表位库以及针对所有表位的抗体库。本发明还提供了明确抗体所针对的特定表位的方法。 [0043] 本发明提供了一种制备感兴趣的蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：(a)预测和/或选择位于感兴趣的蛋白质表面的肽片段；(b)合成或表达一或多个所述肽片段；(c)利用步骤(b)的产物免疫动物，任选组合佐剂进行免疫；(d)用来自步骤(c)的经免疫的动物的淋巴细胞来获得抗体；(e)用步骤(a)的肽片段和/或天然构象的所述感兴趣的蛋白质筛选步骤(d)中所获得的抗体，得到针对所述感兴趣的蛋白质的抗体库。 [0044] 如本文所用，术语“感兴趣的蛋白质”是指任意的天然蛋白质，或者 是经可变剪接(alternative splicing)而得到的天然蛋白质的同种型，或者是天然蛋白质的突变型，或者上述各种蛋白质的任意组合。本文所述“可变剪接”是指在同一个mRNA前体中，通过不同剪接方式(即通过不同剪接位点组合外显子)而产生不同的mRNA剪接异构体的过程。通过可变剪接所获得的蛋白质产物互为同种型，其可能会表现出不同功能和结构特性，或者在相同细胞中由于表达水平不同而导致不同表型。本文所述“突变型”是指天然蛋白质通过一或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加所获得的突变蛋白质。 [0045] 本文所用术语“肽片段”是指所述感兴趣的蛋白质中连续或者非连续的氨基酸序列，其可以是连续的线性多肽，也可以是构成结构域构象的非连续多肽的组合。 [0046] 在本发明的一个实施方案中，通过如下方法预测或选择所述步骤(a)中的肽片段：(i)根据感兴趣的蛋白质的序列，通过计算如下参数来确定表面肽，所述参数选自：溶剂可接近性、无序指数、蛋白-蛋白相互作用的结构域预测、或以上任意组合；(ii)将步骤(i)所确定的表面肽与感兴趣的蛋白质所来源物种的蛋白质组进行序列比对，筛选出所述感兴趣的蛋白质的特异性肽片段；和(iii)将步骤(i)所确定的表面肽与其他物种的同源蛋白质进行序列比对，筛选出所述感兴趣的蛋白质的保守序列。在一个实施方案中，步骤(a)中所述肽片段是感兴趣的蛋白质的线性表面身份肽和/或构象型表面身份结构域。 [0047] 本文所用术语“表面肽”是指位于天然蛋白质表面的线性肽片段和/或位于蛋白质表面构成结构域构象的非连续多肽的组合。本文所用术语“身份肽(signature peptide)”是指与同物种蛋白质组中的其它蛋白质的序列相比较，感兴趣的蛋白质所独有的线性连续肽序列。本文所用术语“身份结构域(signature domain)”是指与同物种蛋白质组中的其它蛋白质的结构域相比较，感兴趣的蛋白质所独有的结构域。本文所用术语“表面身份肽”和“表面身份结构域”分别是指位于蛋白质天然构象表面的“身份肽”和“身份结构域”。 [0048] 本文所用术语“溶剂可接近性”是代表蛋白内氨基酸暴露于构像蛋白表面程度的一个指标(参见Bent Petersen，Thomas Nordahl Petersen，PernilleAndersen Morten Nielsen and Claus Lundegaard.A generic method for assignment of reliability scores applied to solvent accessibility predictions.BMCStructuralBiology 2009，9：51)。 [0049] 本文所用术语“无序指数”是代表氨基酸复杂程度的一个参数(参见Predrag Radivoj ac，Lilia M.Iakoucheva，Christopher J.Oldfield，ZoranObradovic，Vladimir N.Uversky，and A.Keith Dunker.Intrinsic Disorder andFunctional Proteomics.Biophysical Journal Volume 92，1439-1456(2007))。 [0050] 本文所用术语“蛋白-蛋白相互作用的结构域预测”是指在蛋白与蛋白相互作用时，一些结构域在相互作用中扮演关键作用，通过分析蛋白氨基酸组成，可以预测两个蛋白以何种方式结合，较经典的软件如Autodock。(参见Bin Liu，Xiaolong Wang，Lei Lin，Buzhou Tang，Qiwen Dong and XuanWang.Prediction of protein binding sites in protein structures using hiddenMarkov support vector machine.BMC Bioinformatics2009，10：381)。 [0051] 本文所用术语“蛋白质组”是指由某物种的基因组、或者某种细胞或组织所表达的所有蛋白质的集合。 [0052] 本发明所述的序列比对可通过本领域已知的各种方法进行，例如使用各种常用软件或者在线服务来进行，例如由NCBI所提供的BLASP等。 [0053] 本发明所述的预测和/或选择是指：首先基于生物信息学的方法，针对特定的蛋白质，通过二级结构预测、同基因组比较、同源蛋白质结构预测来定义出具有蛋白质特异性且对该蛋白质具有较高覆盖范围的身份肽和/或身份结构域以作为潜在的表位。 [0054] 此类生物信息学的方法已广泛的应用于蛋白结构、功能以及相互作用的预测，如Berglund L等人(参见Protein Science，17：606-613，2008)介绍了针对整个人蛋白质组进行蛋白组层面的特异性表位筛选的方法，其中基于8、10、12氨基酸残基的滑动窗(sliding window)序列比对，用启发式(heuristic)方法来针对整个人蛋白质组预测每个人类蛋白质的序列一致性，基于此方法可对90％的人蛋白质找出至少一个特异性表位。Anderson HP等人(参见Protein Science，15：2558-2567，2006)介绍了利用蛋白3D结构数据来预测非连续表位的方法DiscoTope，这种方法基于抗原-抗体蛋白质复合物的X-ray晶体结构所确定的非连续性表位集合来评估氨基酸统计学、空间信息和表面可接近性。Yan CH等人(参见BMC Bioinformatics，7：262，2006)介绍了由氨基酸序列来预测潜在的DNA-结合位点的方法，其使用朴素贝叶斯分类器来预测特定的氨基酸序列是否为DNA结合位点。 [0055] 在一个实施方案中，本发明所述的身份肽是长度为6-12个氨基酸、高亲水性、高抗原性、非信号肽、非跨膜区以及位于无序区域的肽。在一个实施方案中，本发明所述的身份结构域是长度为100-500个氨基酸、预期具有3维结构的序列特异性蛋白质片段。 [0056] 在一个实施方案中，本发明所述方法步骤(a)预测和/或选择位于感兴趣的蛋白质表面的多个肽片段，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、直至位于感兴趣的蛋白质表面的所有可作为潜在表位的肽片段。 [0057] 在一个实施方案中，所述多个肽片段被设计为一个免疫抗原串联多肽。例如，所述免疫抗原串联多肽可以如下设计。对感兴趣的蛋白质的免疫参数如抗原性、亲水性、可接近性、等电点、信号预测、跨膜预测、特异性等参数的设定规则可参见Kolaskar AS等FEBS Lett.276(1-2)：172-4，1990；Parker JM 等 Biochemistry.25(19)：5425-32，1986；Emini EA等J Virol.55(3)：836-9，1985。对于任意一个感兴趣的蛋白质，首先根据预测的等电点和信号肽结果排除蛋白质中的这些区域。例如设置一个滑动窗，长度为5-20个氨基酸，在蛋白质上顺次移动一个氨基酸，将滑动窗的序列加入一个集合。例如，对于一个长度为n个氨基酸的蛋白质(假设它没有信号肽和跨膜区)，总共会产生n-9条短肽序列(移动框长度为10个氨基酸)。对每一短肽，计算(可参见Kolaskar AS等FEBS Lett.276(1-2)：172-4，1990；Parker JM等Biochemistry.25(19)：5425-32，1986；Emini EA 等J Virol.55(3)： 836-9，1985)它的等电点、可接近性、免疫原性、亲水性和根据BLAST方法的种属内特异性。 在等电点大于3.5时，计算每条短肽的上述参数的加权平均值(0.2*免疫原性+0.1*可接近性+0.2*亲水性+0.5*种属内特异性)。根据加权平均值对这些短肽进行排序，选出分数最大同时肽段间重叠(overlap)＜3的短肽，例如选择7条短肽。 [0058] 本发明所述肽片段可以通过本领域已知的任何技术获得，例如重组表达或者化学合成，即本发明所述肽片段可以使用原核或真核表达系统用本领域已知的重组表达方法表达或者所述肽片段可以通过常规化学方法合成。 [0059] 在一个实例中，例如对于难以进行表达及纯化的蛋白质或者具有很低免疫原性的蛋白质，为了制备特异性抗体，利用高免疫原性表达载体、高成功率的可溶蛋白质表达系统辅助产生这些蛋白质的潜在抗原。例如，可以提及的是病毒样颗粒蛋白载体乙肝病毒核衣壳(HBC)蛋白。 [0060] HBC蛋白质是一种可携带各种来源的肽的非感染性类病毒颗粒载体，可用来结合靶肽以产生高效价抗体反应，因而在疫苗制备中广泛应用。HBC蛋白质可在特定位点如环、N端或C端等携带外源氨基酸，可将高达238个氨基酸的外源序列展示在蛋白质表面以促进免疫反应发生。关于HBC载体的详细描述可参见：Good MF等，Science，235：1059-1063，1987；PumpensP和Grens E，Intervirology，44：98-114，2001；Clarke BE等，Nature330： 381-384，1987；Francis MJ等，Nature 330：168-170，1987；Whitacre DC等Expert Rev.Vaccines 8：111565-1573，2009。 [0061] 在一个实施方案中，本发明方法步骤(b)中的一或多个肽片段插入到HBC蛋白的环、N端或C端，例如插入到HBC蛋白的第77和第82位氨基酸残基之间的位置。本发明的多个肽片段例如2-10个肽片段还可以通过接头连接，然后插入到HBC蛋白中。所述接头可以是本领域常规使用的任何街头，例如(GGGGS)n，其中n为任意整数，例如n＝1、2、3或4。 [0062] 例如，在一个实例中，选择N条免疫原性、特异性较高的肽片段(5≤N≤20)，其长度可以为M(5≤M≤20)个氨基酸。为了避免不同肽片段之间产生新的抗原表位，在不同肽片段之间插入一或多个弱免疫原性接头GGGGS将所述肽片段串联到一起。对于不同的蛋白质长度，可以选择不同的肽片段长度(5≤M≤20)，插入的片段数目可在5-20之间，肽片段的长度例如是6-12氨基酸，片段数目例如是小于10。 [0063] 在本发明的实施方案中，上述步骤(b)中表达的一或多个肽片段还可以进一步与免疫增强载体蛋白偶联，所述免疫增强载体蛋白例如是匙孔血蓝蛋白(KLH)。KLH蛋白是一种源于巨型匙孔帽贝(Megathura crenulata)的携氧金属蛋白，其常被用作产生抗体的载体蛋白。其所具有的多个表位以及其与哺乳动物的来源蛋白的差异性使得其成为了良好的用于产生抗体的载体蛋白。关于KLH蛋白的使用可参见Harris JR等，Micron.30(6)：597-623，1999以及WO 2001/047552。 [0064] 本发明步骤(c)所述免疫动物可以通过本领域任何已知方法进行。本发明用来进行免疫的动物可以是本领域常用的动物，例如小鼠、大鼠、兔、棉羊、山羊、马、牛等。 [0065] 在一个实施方案中，可以使用适当佐剂，从而快速高效地获得高效价且亚型较单一的抗体。在一个的实施方案中，通过本发明的方法可以获得 主要包含单一IgG亚型的抗体。本发明所使用的佐剂可选自：弗氏完全佐剂、铝、CpG、或其任意组合。 [0066] 在一个实施方案中，本发明方法包括对动物进行多位点免疫。利用多位点免疫策略快速产生高亲和性抗体的具体方案例如参见Kilpatrick KE等人(Hybridoma 16：(4)381-389，1997)。通过佐剂来调节抗体的亲和性以及亚型的方案例如参见Karagouni L等Scand.J.Immunol.31：745-754，1990以及Petty RE等Immunology 32：49-55，1977。 [0067] 本发明所述在多位点对动物进行免疫可以在选自以下位点的至少2个位点进行： 颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟、前腿腋窝、后腿肌肉。 [0068] 在本发明的一个实施方案中，对动物进行多次免疫。多次免疫之间的时间间隔可以根据本领域常规技术知识确定，例如2-14天，如3或4天。 [0069] 在一个实施方案中，本发明方法步骤(c)所述免疫包含如下步骤： [0070] (A).首次免疫，在颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫； [0071] (B).第二次免疫，在颈背部、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫； [0072] (C).第三次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫；和 [0073] (D).第四次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用步骤(b)表达产物以及铝+CpG的佐剂进行免疫。 [0074] 在更具体的实施方案中，本发明方法步骤(c)的免疫包含如下步骤： [0075] (A).首次免疫，在颈背部、尾根、后足掌、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用在250μl缓冲液中的20μg步骤(b)表达产物以及250μl弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用在500μl缓冲液中的20μg步骤(b)表达产物以及25μl铝+10μg CpG的佐剂进行免疫； [0076] (B).第二次免疫，在颈背部、后侧腹股沟以及前腿腋窝使用在250μl缓冲液中的10μg步骤(b)表达产物以及250μl弗氏完全佐剂进行免疫；并在后腿肌肉使用在500μl缓冲液中的10μg步骤(b)表达产物以及25μl铝+10μg CpG的佐剂进行免疫； [0077] (C).第三次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用在500μl缓冲液中的10μg步骤(b)表达产物以及25μl铝+10μg CpG的佐剂进行免疫；和 [0078] (D).第四次免疫，在后腿肌肉、尾根以及前腿腋窝使用在500μl缓冲液中的10μg步骤(b)表达产物以及25μl铝+10μg CpG的佐剂进行免疫。 [0079] 在一个实施方案中，在第1天进行首次免疫，在第5天进行第二次免疫，在第8天进行第三次免疫，在第11天进行第四次免疫，第14天融合，得到的抗体绝大多数为亲和力成熟的IgG亚型，IgG亚型抗体相对于IgM具有亲和力高、稳定性好以及易于纯化的优势。 [0080] 本发明方法步骤(d)所述用来自经免疫的动物的淋巴细胞获得抗体可以本领域已知的任何方法进行。本文所用术语“淋巴细胞”是指淋巴器官的细胞或者由淋巴器官所产生的细胞，所述淋巴器官包括中枢淋巴器官(又称作初级淋巴器官)和周围淋巴器官(又称作次级淋巴器官)。前者包括胸腺、腔上囊或其相当器官(如哺乳动物的骨髓)，后者包括脾、淋巴结等。 [0081] 在一个实施方案中，所述抗体通过至少一种选自如下的方法获得：(1)将来自步骤(c)经免疫的动物的淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞并表达从而获得抗体；(2)从来自步骤(c)经免疫的动物的淋巴细胞中分离出抗原特异性B细胞，再利用PCR来克隆和表达抗体基因从而获得抗体；或者(3)从来自步骤(c)经免疫的动物的淋巴细胞中分离出mRNA，然后通过噬菌体展示、或核糖体展示、或酵母展示、或细菌展示、或杆状病毒展示、或哺乳细胞展示、或mRNA展示来获得抗体。 [0082] 杂交瘤技术的详细介绍可参见Bazin，“Rat hybridomas and ratmonoclonal antibodies”，CRC Press，1990；Goding，“Monoclonal antibodies：principles and rdpractice”，3 edition，Academic Press，1996；Shepherd 和 Dean“Monoclonal antibodies”Oxford University Press，2000等文献。 [0083] 本发明方法步骤(d)也可通过噬菌体展示、或核糖体展示、或酵母展示、或细菌展示、或杆状病毒展示、或哺乳细胞展示、或mRNA展示来获得抗体。这些方法均为本领域常用技术，其具体的操作可参考相应的教科书和操作手册。例如可参见Mondon P等Front.Biosci.13：1117-1129，2008。以噬菌体展示技术为例，其是通过将分离的抗体基因插入到噬菌体DNA中，从而抗体分子上能与抗原结合的可变区域被连接到噬菌体衣壳蛋白上。 [0084] 当噬菌体感染大肠杆菌后，单链DNA在大肠杆菌内进行复制，而噬菌体则重新组装并分泌到培养基中，同时并不裂解大肠杆菌。噬菌体与靶抗原共同温育，结合的噬菌体分离后，再进行扩增和纯化从而能够筛选出大量克隆。关于噬菌体展示技术可参见刘佳等细胞与分子免疫学杂志(Chin.J.CellMol.Immunol.)2004：20(6)773-775、CN03131796.0、WO2009/109572以及WO 2009/085462。 [0085] 本发明方法所产生的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。在一个实施方案中，本发明涉及用本发明方法筛选和制备的针对一个物种所有感兴趣蛋白质的抗体库。在另一个实施方案中，本发明涉及用本发明方法筛选和制备的包含了针对一种感兴趣的蛋白质的所有表位的抗体的抗体库。 [0086] 本发明中所用的术语“抗体”、“单克隆抗体”、“多克隆抗体”、“表位”等是本领域所常用的术语，其含义符合本领域技术人员一般的理解，也可以参考常用的教科书和手册对其的定义。 [0087] 本发明所用的术语“抗体库”是指包含了多种不同的抗体的一种抗体集合，其可以包含针对多种不同蛋白的抗体，也可以包含针对同一蛋白不同表位的抗体。 [0088] 本发明方法步骤(e)中所述“筛选”是用步骤(a)的肽片段和/或天然构象的感兴趣的蛋白质来筛选步骤(d)获得的抗体。在一个实施方案中，本发明方法步骤(e)通过亲和力排序筛选步骤(d)中所获得的抗体。对抗体进行亲和性鉴定的方法可参见Griswold WR等Immunology letters，1984：229-232；Van Heyningen V等Journal of Immunological Methods，62：147-153，1983；以及Rath S等Journal of Immunological Methods，106：245-249，1988。 [0089] 在一个实施方案中，本发明方法还进一步包括筛选功能性抗体或检测性抗体的步骤(f)。例如，所述检测性抗体可以通过Western印迹、IP、IF、IHC、流式细胞计数、ELISA或其任意组合进行筛选，或所述功能性抗体通过可阻断或中和测定来进行筛选。 [0090] 本文所述检测性抗体是指可以与抗原反应并且可以通过本领域技术手段例如Western印迹、IP、IF、IHC、流式细胞计数或ELISA等检测的抗体。 [0091] 本文所述功能性抗体是指可以与抗原反应并且对抗原的生物学功能产生作用例如阻断或中和等的抗体。 [0092] 例如，通过如下方法筛选针对所述感兴趣的蛋白质的抗体：将所述感兴趣的蛋白质或其片段生物素化，在真核细胞例如293细胞中过表达，将所述过表达的生物素化蛋白质或其片段加入链霉抗生物素包被的平板中，之后加入本发明方法步骤(e)所获得的抗体进行ELISA测定，获得反应阳性的抗体。 [0093] 本发明获得的一种单克隆抗体4A1是由杂交瘤细胞株4A1产生的，所述杂交瘤细胞株4A1于2011年1月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC C201107。本发明获得的另一种单克隆抗体1A6是由杂交瘤细胞株1A6产生的，所述杂交瘤细胞株1A6于2011年1月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C201108。本发明获得的一种单克隆抗体2F1是由杂交瘤细胞株2F1产生的，所述杂交瘤细胞株2F1于2011年1月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C201109。 [0094] 在另一个方面，本发明提供了根据本发明方法获得的抗体库。在一个实施方案中，所述抗体库包含针对所有感兴趣蛋白质的抗体。在一个实施方案中，所述抗体库包含针对位于一种感兴趣蛋白质的表面上的所有表位的抗体。在一个实施方案中，所述抗体库中的抗体是单克隆抗体。 [0095] 在另一个方面，本发明还提供了确定产生的抗体所针对的表位的方法，包括用上述步骤(a)中所预测和/或筛选的肽片段构建检测抗原来对本发明所产生的抗体进行筛选以确定表位的步骤。 [0096] 本文所用术语“检测抗原”是指利用上述步骤中所预测和/或筛选的肽片段所构建的融合蛋白，该检测抗原可用于针对多个蛋白进行筛选，其中针对每个所要筛选的蛋白均含有一个表位。 [0097] 在一个实施方案中，本发明所采用的筛选策略是可以针对N个蛋白质的筛选策略，每个蛋白质设计的表位数和蛋白质数均可以是N个(5≤N≤20)，前提条件是对每种蛋白质所选择的表位数目一致。 [0098] 例如针对5种蛋白质，每个蛋白质在免疫抗原设计的时候确定了5个抗原表位，分别以A、B、C、D，E表示(见表1)，例如免疫抗原1的表位分别是A1、B1、C1、D1和E1。此处表位数和蛋白数均可以是N个(5≤N≤20)。 [0099] 5个蛋白质的检测抗原采用1列内的五个多肽表位做为一个新的蛋白序列(见表1，例如检测抗原A包含A1、A2、A3、A4和A5)。 [0100] 在筛选的过程中，每个融合后的阳性克隆孔(采用免疫抗原筛选得到)，分别采用5个检测抗原筛选，通过典型的ELISA筛选，从而明确每个阳性克隆针对哪个多肽表位。在此结果的基础上，优先挑取针对每个表位的阳性细胞进行建株和后续鉴定，从而避免在未知表位的情况下，阳性克隆只是针对某个最优势表位的细胞株最多，造成得到的细胞株的同质性。 [0101] 表1免疫抗原设计方法 [0102]检测抗原A 检测抗原B 检测抗原C 检测抗原D 检测抗原E 免疫抗原1 A1 B1 C1 D1 E1 免疫抗原2 A2 B2 C2 D2 E2 免疫抗原3 A3 B3 C3 D3 E3 免疫抗原4 A4 B4 C4 D4 E4 免疫抗原5 A5 B5 C5 D5 E5 [0103] 综上所述，本发明的方法通过生物信息学技术预测和/或选择位于感兴趣的蛋白质表面的肽片段作为潜在表位。本发明方法可以高效、快速、低成本地获得针对感兴趣的蛋白质的抗体，而且本发明方法可以获得针对位于感兴趣的蛋白质天然构象表面的表位的所有抗体。另外，本发明方法还可以通过组合筛选来确定位于感兴趣的蛋白质天然构象表面的表位，鉴定抗体所识别的特定表位，以及进一步对所产生的抗体进行检测和筛选。 [0104] 对于抗体应用成功的几个关键因素，包括抗体的识别位点(表位)，亲和力以及特异性。对于单克隆抗体，在不知道表位的情况下，得到的抗体往往集中于某个免疫原性优势表位，表位的单一性，会导致抗体应用不成功，主要与该表位的位置有关。明确知道抗体识别的表位，优先得到多个表位的抗体，会降低表位位置不正确的影响，大大提供细胞株应用的成功率。 [0105] 本发明的优势在于对于大样本抗体制备，本方法具有成功率高(＞90％以上蛋白能够得到Western应用成功抗体)，成本低的特点。对于高同源性蛋白质，受体蛋白结构域以及小鼠本身蛋白质均具有很高的成功率。对于小鼠自身蛋白抗体制备的意义在于，从中筛选得到的功能性抗体，可以用于小鼠动物模型的抗体治疗试验，对于临床前研究具有重要意义。对于膜受体蛋白，采用功能性结构域制备抗体，更有利获得具有阻断功能抗体，有利于抗体药物开发，采用本发明方法构建的抗体文库，可以用进一步开发功能性抗体。同时高通量的表位筛选策略，保证得到的每个细胞株明确知道对应的识别表位信息，对于研究抗体与蛋白的相互作用，以及采用多个表位抗体共同确定某种蛋白表达信息，均具有很重要意义。 [0106] 以下结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。下述实施例仅用于说明本发明，无意对本发明做出任何限制。在不脱离本发明的精神和实质的情况下，本领域人员可以对本发明做出多种改动和变化，这些改动和变化同样在本申请权利要求要求保护的范围内。 实施例 [0107] 实施例1：载体改造 [0108] A、HBC载体改造的设计 [0109] 首先用一段设计好的多克隆位点(MCS：GGATCCTATCAGATCTATCGGGTACCGTATCGCGGCCGCTTCCATATGGAATTC(SEQ ID NO：1))来替换乙肝病毒核衣壳蛋白(HBc)cDNA的c/e1环，即编码HBc蛋白第76-82位氨基酸的核苷酸。所述MCS的示意图与序列详见图1。然后，将所述MCS的两端连接编码L-N和L-C两个接头的核苷酸序列并替换编码HBc蛋白第76-82位氨基酸的核苷酸，其中L-N和L-C两个接头两端的E代表谷氨酸，G代表甘氨酸，S代表丝氨酸。随后，将编码6×His标签(HHHHHH)、β-gal(MTMITDSL)、接头(EFH)等序列元件的核苷酸序列添加到此cDNA之前，改造后的HBc核苷酸序列如图2所示。 [0110] B、全基因合成 [0111] 用DNA Works软件(得自http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)通过密码子优化设计HBc核苷酸序列，如下所示： [0112] CCATGGGCAGCAGCCACCATCATCACCACCACATGACCATGATCACCGATAGCCTGGAGTTCCATATCGATCCGTACAAGGAATTTGGCGCGACCGTGGAACTGCTGAGCTTCCTGCCGAGCGACTTTTTTCCAAGCGTGCGTGACCTGCTGGATACGGCGAGCGCACTGTATCGTGAAGCGCTGGAAAGCCCGGAACATTGCAGCCCGCATCATACCGCGCTGCGTCAGGCGATTCTGTGCTGGGGCGAACTGATGACCCTGGCGACCTGGGTGGGCGGCAATGAAGAAGGTGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTATCAGATCTATCGGGTACCGTATCGCGGCCGCTTCCATATGGAATTCGGTGGCGGCGGCAGCGGCGGTGGTGGCAGCGAAGAAGACCTGGTTGTGAGCTATGTGAACACCAATATGGGCCTGAAGTTTCGTCAGCTGCTGTGGTTTCATATTAGCTGCCTGACCTTTGGCCGCGAAACCGTGATTGAATACCTGGTGAGCTTTGGCGTGTGGATTCGTACCCCACCGGCGTATCGTCCGCCGAATGCGCCAATTCTGAGCACCCTGCCGGAAACGACCGTTTAAGAGCTCCG TCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAG(SEQ ID NO：2) [0113] 优化的HBC核苷酸序列利用下表2所示的引物序列合成，所示引物序列由赛百盛(中国上海)公司合成。 [0114] 表2全基因合成引物序列 [0115]引物名称 引物序列(5′-3′) H_01 CATG CCATGGGCAGCAGCCACCATCATCACCACCACATGACC (SEQ ID NO：3) H_02 CTCCAGGCTATCGGTGATCATGGTCATGTGGTGGTGATGA (SEQ ID NO：4) H_03 TGATCACCGATAGCCTGGAGTTCCATATCGATCCGTACAAGG(SEQ ID NO：5) H_04 CCACGGTCGCGCCAAATTCCTTGTACGGATCGATATGGAA(SEQ ID NO：6) H_05 TGGCGCGACCGTGGAACTGCTGAGCTTCCTGCCGAGCGAC(SEQ ID NO：7) H_06 CAGGTCACGCACGCTTGGAAAAAAGTCGCTCGGCAGGAAG(SEQ ID NO：8) H_07 CAAGCGTGCGTGACCTGCTGGATACGGCGAGCGCACTGTA(SEQ ID NO：9) H_08 TCCGGGCTTTCCAGCGCTTCACGATACAGTGCGCTCGCCG(SEQ ID NO：10) H_09 CGCTGGAAAGCCCGGAACATTGCAGCCCGCATCATACCGC(SEQ ID NO：11) H_10 CAGCACAGAATCGCCTGACGCAGCGCGGTATGATGCGGGC(SEQ ID NO：12) H_11 GTCAGGCGATTCTGTGCTGGGGCGAACTGATGACCCTGGC(SEQ ID NO：13) H_12 TTCATTGCCGCCCACCCAGGTCGCCAGGGTCATCAGTTCG(SEQ ID NO：14) H_13 GGTGGGCGGCAATGAAGAAGGTGGTGGCGGTAGCGGCGGT(SEQ ID NO：15) H_14 ACCCGATAGATCTGATAGGATCCGCCACCGCCGCTACCGC(SEQ ID NO：16) H_15 GGATCCTATCAGATCTATCGGGTACCGTATCGCGGCCGCT(SEQ ID NO：17) H_16 CCGCCGCCACCGAATTCCATATGGAAGCGGCCGCGATACG(SEQ ID NO：18) H_17 ATTCGGTGGCGGCGGCAGCGGCGGTGGTGGCAGCGAAGAA(SEQ ID NO：19) H_18 TCACATAGCTCACAACCAGGTCTTCTTCGCTGCCACCACC(SEQ ID NO：20) H_19 CCTGGTTGTGAGCTATGTGAACACCAATATGGGCCTGAAG(SEQ ID NO：21) H_20 AACCACAGCAGCTGACGAAACTTCAGGCCCATATTGGTGT(SEQ ID NO：22) H_21 TCGTCAGCTGCTGTGGTTTCATATTAGCTGCCTGACCTTT(SEQ ID NO：23) H_22 AATCACGGTTTCGCGGCCAAAGGTCAGGCAGCTAATATGA(SEQ ID NO：24) H_23 GCCGCGAAACCGTGATTGAATACCTGGTGAGCTTTGGCGT(SEQ ID NO：25) H_24 CGCCGGTGGGGTACGAATCCACACGCCAAAGCTCACCAGG(SEQIDNO：26) H_25 CGTACCCCACCGGCGTATCGTCCGCCGAATGCGCCAATTC(SEQ ID NO：27) H_26 GTCGTTTCCGGCAGGGTGCTCAGAATTGGCGCATTCGGCG(SEQ ID NO：28) H_27 ACCCTGCCGGAAACGACCGTTTAAGAGCTCCGTCGACAAG(SEQ ID NO：29) H_28 CCG CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCTTAAA(SEQ ID NO：30) [0116] 合成好的引物H 01到H 28各取5μl，浓度为25μM/L(浓度？)混合，以此混合引物为模板，在PFU酶(申能博彩，中国上海)的催化下进行第一轮PCR扩增，PCR条件为94℃，2min；30个循环(94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min)；72℃，10min；10℃，10min。再取 2μl第一轮PCR产物作为模板，用引物H 01和H 28.浓度为25μM/L进行扩增，条件如上所述。1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段(具有上述优化的HBC核苷酸序列的片段)。 [0117] 将上述得到的HBc DNA通过NcoI/XhoI(NEB，MA)酶切4h，回收酶切产物(DNA回收试剂盒得自天根，中国北京)。通过T4连接酶(NEB，MA)连接到酶切后的pET28a载体上(Novagen，Merck，Germany)，并转化到TOP10感受态细胞中。次日长出的克隆经过菌落PCR验证与BamHI/EcoRI酶切验证(NEB，MA)后，挑取其中三个阳性克隆进行测序，测序引物为T7启动子引物(博尚生物，中国上海)。经测序鉴定成功的新载体被命名为H载体，结构如图3所示。 [0118] 实施例2：人结蛋白(Desmin)免疫抗原设计和表达纯化 [0119] 人结蛋白与小鼠相应蛋白同源性为97％，其全长氨基酸序列为： [0120] 1 MSQAYSSSQR VSSYRRTFGG APGFPLGSPL SSPVFPRAGF GSKGSSSSVT SRVYQVSRTS [0121] 61 GGAGGLGSLR ASRLGTTRTP SSYGAGELLD FSLADAVNQE FLTTRTNEKV ELQELNDRFA [0122] 121NYIEKVRFLE QQNAALAAEV NRLKGREPTR VAELYEEELR ELRRQVEVLT NQRARVDVER [0123] 181DNLLDDLQRL KAKLQEEIQL KEEAENNLAA FRADVDAATL ARIDLERRIE SLNEEIAFLK [0124] 241KVHEEEIREL QAQLQEQQVQ VEMDMSKPDL TAALRDIRAQ YETIAAKNIS EAEEWYKSKV [0125] 301SDLTQAANKN NDALRQAKQE MMEYRHQIQS YTCEIDALKG TNDSLMRQMR ELEDRFASEA [0126] 361SGYQDNIARL EEEIRHLKDE MARHLREYQD LLNVKMALDV EIATYRKLLE GEESRINLPI [0127] 421QTYSALNFRE TSPEQRGSEV HTKKTVMIKT IETRDGEVVS EATQQQHEVL (SEQ ID NO：31) [0128] 基于几种人工神经网络和hidden Markov分析预测蛋白序列中的跨膜螺旋、裂解位点和信号肽，结果表明结蛋白无跨膜结构或信号肽，亲疏水性氨基酸分布较均匀。 [0129] 根据本文详细描述部分所述免疫抗原串联多肽设计方法，产生11-12个氨基酸的肽。对每一个肽，计算等电点、可接近性、免疫原性、亲水性和根据BLAST方法的种属内特异性。在等电点大于3.5时，计算每条肽序列的上述参数的加权平均值(0.2*免疫原性+0.1*可接近性+0.2*亲水性+0.5*种属内特异性)。根据加权平均值对这些肽进行排序，选出分数最大同时肽段间重叠＜3的肽。如此从结蛋白的氨基酸序列中挑选5条长度为11-12个氨基酸的线性表面身份肽(见表3)，这些肽之间用接头GGGGS连接，形成免疫抗原串联多肽。 [0130] 根据对该蛋白进行检索，发现其并不含有跨膜结构以及信号肽序列，对蛋白全长根据上述原则进行分析，确5个表面身份肽序列。最终确定结蛋白的H载体展示的免疫抗原串联多肽序列为：RETSPEQRGSEV-GGGGS- KVSDLTQAANK-GGGGS-RLKGREPTRVAE-GGGGS-VEVLTNQRARVD-GGGGS-EESRINLPIQTY(SEQ ID NO：32)。 [0131] 表3免疫抗原串联多肽选择 [0132] [0133] B、串联多肽序列全基因合成方法 [0134] 经密码子优化，确定需要全基因合成的编码SEQ ID NO：32的免疫抗原串联多肽序列的核苷酸序列为： [0135] GACACggatccCGTGAAACCAGCCCGGAACAGCGTGGCAGCGAAGTGGGTGGTGGAGGTTCTAAAGTGAGCGATCTGACCCAGGCGGCGAATAAAGGGGGAGGCGGCAGCCGTCTGAAAGGCCGTGAACCGACCCGTGTGGCGGAAGGTGGGGGTGGAAGCGTGGAAGTGCTGACCAATCAGCGTGCGCGTGTGGATGGCGGTGGCGGCTCGGAAGAAAGCCGTATTAATCTGCCGATTCAGACCTATGgaatttcgTGTC(SEQ ID NO：38) [0136] 根据全基因合成方法，见表4，共设计10条引物序列。全基因合成方法参考实施例1。简而言之，合成好的引物1_01到1_10各取5μl，浓度为25μM混合，以此混合引物为模板，在PFU酶(申能博彩，中国上海)的催化下进行第一轮PCR扩增，PCR条件为94℃，2min； 30个循环(94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min)；72℃，10min；10℃，10min。再取2μl第一轮PCR产物作为模板，用引物1_01和1_10，浓度为25μM，进行扩增，条件如上所述。1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段(即为需要的全基因合成的核苷酸序列)。 [0137] 表4免疫抗原全基因合成所用引物的核苷酸序列 [0138] [0139] [0140] 实施例3：免疫抗原串联多肽的表达纯化 [0141] 实施例2中通过全基因合成的序列SEQ ID NO：38利用BamHI/EcoRI酶切后，再与BamHI/EcoRI酶切并回收的实施例1所述的H载体通过T4连接酶在室温进行2h连接。连接产物与CaCl2法制备的Rosetta感受态细胞(Novagen，Merck，Germany)在冰上(4℃)孵育0.5h，再于42℃热激活90s，热激后的菌液补加200μl-500μl无抗性LB液体培养基，培养基成分为：10g/LTryptone(Oxoid，England)，5g/L Yeast Extract(Oxoid，England)，10g/L NaCl(国药集团，中国上海)，然后在37℃摇床上100rpm慢摇45min，最后涂板于含相应抗生素的LB平板上。在37℃培养箱将细菌平板培养过夜。 [0142] 次日，挑转化菌落于自身诱导系统培养基中，培养基组分为：10g/LTryptone(Oxoid，England)，5g/L酵母提取物(Oxoid，England)，3.3g/L(NH4)2SO4(国药集团，中国上海)，6.8g/L KH2PO4(国药集团，中国上海)，7.1g/LNa2HPO4(国药集团，中国上海)，0.5g/L葡萄糖(国药集团，中国上海)，2.0g/L a-Lactose(国药集团，中国上海)， 0.15g/L MgSO4(国药集团，中国上海)。37℃，250rpm表达过夜。次日将菌液离心(6,000g， 5min)，上清弃去，沉淀用裂解液(50mM Tris、500mM NaCl、4M尿素、1mM PMSF，pH7.4)重悬并于室温裂解过夜。 [0143] 预先用25ml(5倍柱体积)裂解液平衡Ni2+-NTA柱(Qiagen，Germany)，静置待用。细胞裂解液离心(15,000g，10min)后将上清上柱，室温孵育1h。孵育后，待裂解液从柱上自然流净，用30ml洗涤液(4M尿素，50mMTris、500mM NaCl，30mM咪唑，pH 7.4)洗涤，最后用 5ml洗脱液(4M尿素，50mM Tris、500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集蛋白。洗脱的蛋白透析到缓冲液(pH5.8的磷酸盐缓冲液中，缓冲液组分为：25.39g/LNaH2PO4-H2O(国药集团，中国上海)，5.73g/LNa2HPO4-12H2O(国药集团，中国上海)。中途换液2次，共透析24小时。 [0144] 透析后共得到1.5mg多肽，浓度为0.3mg/ml，纯度＞95％。 [0145] 实施例4：检测抗原设计和表达纯化 [0146] A、检测抗原设计 [0147] 收集包括结蛋白在内的以下五个蛋白质的免疫抗原串联多肽序列信息，所述序列分别见表5。 [0148] 表5五个蛋白质免疫抗原设计 [0149] [0150] 按照检测抗原设计策略，确定相应的检测抗原序列。主要策略是根据表5的5个蛋白串联多肽序列，分别将每个蛋白的5个表面身份肽序列命名为ABCDE，再将每个蛋白的A表位重新组合，得到检测抗原A，以此类推得到B-E检测抗原。具体检测抗原信息见表6。 [0151] 表6检测抗原氨基酸序列 [0152] [0153] B、检测抗原全基因合成 [0154] 表6所示设计好的检测抗原序列经过DNA Works软件进行密码子优化，用于合成优化的检测抗原核苷酸序列的引物由赛百盛(中国上海)公 司合成。优化后5个检测抗原的核苷酸序列如下： [0155] 检测抗原A： [0156] CGTGAAACCAGCCCGGAACAGCGTGGCAGCGAAGTGCTGCGTCCGAGCACCAGCCGTAGCCTGTATGCGAGCAAGAAAAAATGGAATCTGGGCAGCAATGCGAAAGATGACAAAAACATTGGCGGCGACGAGGATGATAAGGTGCAGGAAGGCAACGAAAGCTATCAGCAAAGCTGC(SEQ IDNO：59) [0157] 检测抗原B： [0158] AAAGTGTCAGACCTGACCCAGGCGGCGAATAAGAACATTAACGAAACCAGCCAGCATCACGATGATCTGGAAGATGGCGTGCGTCAGAGCCGTGCGAGCGATAAAGAAGAAATGGGCGGCATTACCCAGACCCCGTATAAAGAGGATGCACATTTTCAGTGCCCGCATAATAGCAGC(SEQ IDNO：60) [0159] 检测抗原C： [0160] CGTCTGAAAGGCCGTGAACCGACCCGTGTGGCGGAAGCGATTAACACCGAATTTAAGAATACCCGTACCTGCAAAGGCAGCCAGAATAAATCGAAACCGCTGTGCTATCCGCGTGGCAGCAAACCGGAAGATGCGCGTAAACGGTGGCAGAATGAAAAACTGGGCCTGGAT(SEQ ID NO：61) [0161] 检测抗原D： [0162] GTGGAAGTGCTGACCAATCAGCGTGCGCGTGTGGATGAACAGCTGAAAGGCCAGGGCAAAAGCCGTCTGGGTGTGAAAGTGTATGATTATCAGGAAGATGGCAGCGTGGATCATCTGAGCCTGAAAGAATTTAGCGAACTGGAAGAAGACATCAGCCGTGGGCTGCAGGGCACCTAT(SEQ IDNO：62) [0163] 检测抗原E： [0164] GAAGAAAGTCGTATTAATCTGCCGATTCAGACCTATCAGCGTGAGGAAGCGGAAAATACCCTGCAGTCGTTTGAAGCGAAAAACATTACCTGGTTCAAAGATGGCAAAGGCCAGCGGGATCTGTATAGCGGCCTGAACCAACGTGGTCCGGGCGAAGATCCGAATGGCACCCTGATTATT(SEQ IDNO：63) [0165] 根据检测抗原核苷酸序列以及在合成序列中引入BamH I和EcoR I酶切位点，各设计8条引物，序列见表7-11。全基因合成方法同实施例1。 [0166] 检测抗原A合成好的引物201到210各取5μl，浓度为25μM，混合，以此混合引物为模板，在PFU酶(申能博彩，中国上海)的催化下进行第一轮PCR扩增，PCR条件为94℃，2min；30个循环(94℃，30s；60℃， 30s；72℃，1min)；72℃，10min；10℃，10min。再取 2μl第一轮PCR产物作为模板，用引物201和210，浓度为25μM，进行扩增，条件如上所述。 1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段(即为需要的全基因合成的核苷酸序列)。 [0167] 检测抗原B-E全基因核苷酸合成方法与检测抗原A完全相同，只是使用的引物序列不同。 [0168] 通过全基因合成的检测抗原核苷酸序列通过BamH I和EcoR I双酶切后被连接到经相同的酶切后的pET32a载体中(Novagen，Merck，Germany)。 [0169] 表7检测抗原A全基因合成引物 [0170] [0171] 表8检测抗原B全基因合成引物 [0172] [0173] [0174] 表9检测抗原C全基因合成引物 [0175] [0176] 表10检测抗原D全基因合成引物 [0177] [0178] 表11检测抗原E全基因合成引物 [0179] [0180] G、检测抗原表达与纯化 [0181] 上述采用全基因合成方法制备的5条相关检测抗原的DNA序列通过BamHI/EcoRI酶切位点整合到PET32a载体(Novagen)中之后，获得五种质粒。 [0182] 自身诱导系统培养基组分为配方为10g/L Tryptone(Oxoid，England)，5g/L酵母提取物(Oxoid，England)，3.3g/L(NH4)2SO4(国药集团，中国上海)，6.8g/L KH2PO4(国药集团，中国上海)，7.1g/L Na2HPO4(国药集团，中国上海)，0.5g/L葡萄糖(国药集团，中国上海)，2.0g/L a-Lactose(国药集团，中国上海)，0.15g/L MgSO4(国药集团，中国上海)。。 [0183] 将所述质粒分别转化到Rosseta菌株中，挑转化菌落于自身诱导系统培养基(见实施例3)，37℃250rpm表达过夜。次日将菌液离心(6,000g，5min)，上清弃去。沉淀用裂解液(50mM Tris、500mM NaCl、4M尿素、蛋白酶抑制剂，pH 7.4)重悬并于室温裂解过夜。2+ [0184] 预先用25ml(5倍柱体积)裂解液平衡Ni -NTA柱，静置待用。细胞裂解液离心(15,000g，10min)后将上清上柱，室温孵育1h。孵育后，待裂解液从柱上自然流净，用30ml洗涤液(4M尿素，50mM Tris，500mMNaCl，30mM咪唑，pH 7.4)洗涤，最后用5ml洗脱液(4M尿素，50mM Tris，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)洗脱并收集蛋白。 [0185] 检测抗原A纯化量为0.8mg，纯度为80％；检测抗原B纯化量为0.65mg，纯度为90％；检测抗原C纯化量为1.2mg，纯度为85％；检测抗原D纯化量为1.5mg，纯度为75％； 检测抗原E纯化量为0.9mg，纯度为95％。 [0186] 实施例5：单克隆抗体制备 [0187] A、免疫方法 [0188] 寡聚核苷酸佐剂：50μl铝佐剂(Thermo Fisher，USA)+1μgDNA佐剂，序列为tccatgacgttcctgacgtT(SEQ ID NO：104)，小写的碱基为需要硫代修饰的位点，委托赛百盛(中国上海)公司合成。 [0189] 实验中关于蛋白质抗原的每只小鼠每次免疫剂量可以是在2-200μg之间的任意剂量，每次免疫的间隔时间可以是2-14天。针对合成蛋白结蛋白(SEQ ID NO：32)的免疫方法和剂量如下。 [0190] 免疫方法：3只Balb/c小鼠，8-10周龄，体重18-20g。20μg抗原与氟氏完全佐剂(Sigma)乳化完全，免疫位点位后足掌、尾根以及前肢腋下以及腹股沟，每点50μL左右。20μg抗原与寡聚核苷酸佐剂完全混合，免疫小鼠后腿肌肉，每点50-100μL。 [0191] 第8天取10μg抗原与氟氏完全佐剂(Sigma)乳化完全，免疫小鼠前肢腋下以及腹股沟，每点50-100μL。20μg抗原与寡聚核苷酸佐剂混合，免疫小鼠尾根以及后腿肌肉，每点50-100μL。 [0192] 第12天，10μg抗原与寡聚核苷酸佐剂完全混合，免疫小鼠后腿肌肉。 [0193] 第14天小鼠眼眶取血，ELISA方法检测血清效价，小鼠血清效价均大于1∶32000。 [0194] B、细胞融合和筛选 [0195] 相关培养基配制：使用基础培养基为1640培养基(Thermo，USA)，完全培养基血清浓度为15％，血清购自(Biowest，Spain)，HAT和HT母液购自(Sigma，Germany) [0196] 第15天，断颈杀死小鼠，取2只小鼠淋巴结细胞与SP20细胞(ATCC，USA)融合悬浮细胞(最终细胞浓度约106/ml)，铺4块384孔板，每孔80μL。细胞板37℃、5％CO2培养6天后，全换HT完全培养基。融合后8天，取10μL细胞上清，稀释5倍，用于ELISA测定。 [0197] 免疫原(携带有SEQ ID NO：32的多肽序列的H载体蛋白)用0.01M Na2CO3/NaHCO3缓冲液稀释至1μg/ml，每孔加入100μL，4度包被过夜，甩净板内溶液，PBST洗涤3次，250μL/孔。5％牛奶37℃封闭1h，甩净板内溶液，PBST洗涤3次，250μL/孔。取融合细胞板上清，每孔20μL，补加5％牛奶80μL，37℃孵育1h，甩净板内溶液，PBST洗涤3次， 250μL/孔。每孔加入100μL HRP标记羊抗鼠抗体(Abmart，1∶8000)，37℃孵育1h，甩净板内溶液，PBST洗涤5次，250μL/孔。加入辣根过氧化物酶底物TMB(Sigma)溶液，37℃孵育15min，每孔加入50μL 2M H2SO4溶液终止反应，读取450nm处吸光光度值。 [0198] 检测抗原A-E分别用0.01M Na2CO3/NaHCO3缓冲液稀释至1μg/ml，每孔加入 100μL，4℃包被过夜，甩净板内溶液，PBST洗涤3次，250μL/孔。5％牛奶37℃封闭1h，甩净板内溶液，PBST洗涤3次，250μL/孔。 [0199] 取经初步鉴定是阳性的克隆孔上清50μL，补加200μL 5％牛奶，分别取50μL加入检测抗原1-5酶标板中。37℃孵育1h，甩净板内溶液，PBST洗涤3次，250μL/孔。每孔加入100μL HRP标记羊抗鼠抗体(Abmart，1∶8000)，37℃孵育1h，甩净板内溶液，PBST洗涤5次，250μL/孔。加入辣根过氧化物酶底物TMB(Sigma)溶液，37℃孵育15min，每孔加入50μL2M H2SO4溶液终止反应，读取450nm处吸光光度值。 [0200] 表位筛选数据见表12。针对不同检测抗原阳性的孔即为针对不同抗原表位的抗体，筛选结果见表13。SEQ ID NO：32多肽的5个多肽序列，根据N端至C端序列，依次命名为A、B、C、D、E表位。 [0201] 因为每个检测抗原只带有一个与免疫抗原相关的蛋白表面身份肽，所以对于每个检测抗原阳性克隆(OD值大于0.5)，针对是免疫抗原(SEQ IDNO：32多肽)的第一个多肽序列。举例说明，检测抗原A4孔对应ELISA检测是阳性(见表12，OD＝2.092)，因为检测抗原A带有的SEQ ID NO：32多肽的第一个表面线性身份肽-RETSPEQRGSEV的序列(见表5和表6)，所以根据这个结果能够判定A4孔克隆抗体的识别表位为第一个表面线性身份肽-RETSPEQRGSEV。以此策略判定不同的阳性孔识别的序列。 [0202] 表12融合阳性克隆孔表位筛选结果 [0203] [0204] 表13表位筛选结果及对应克隆号 [0205]表位 表位序列 细胞株数 A RETSPEQRGSEV(SEQ ID NO：105) 3 B KVSDLTQAAN(SEQ ID NO：106) 4 C RLKGREPTRVAE(SEQ ID NO：107) 3 D VEVLTNQRARVD(SEQ ID NO：108) 3 E EESRINLPIQTY(SEQ ID NO：109) O [0206] 分别挑取每个表位2个阳性孔进行有限稀释法进行亚克隆，经过3轮亚克隆得到10株稳定的杂交瘤细胞株，并收集相应细胞株培养上清用于实施例6抗体验证。这些细胞株分别针对结蛋白四个多肽表位(SEQ ID NO：105-108)。其中7个细胞株经鉴定亲和力KD小于10nM。 [0207] 实施例6：抗体验证数据 [0208] A、Western blotting实验步骤 [0209] C2C12细胞(ATCC，USA)以含蛋白酶抑制剂(Roche)的RIPA缓冲液(50mM Tris pH7.4，150mM NaCl，1％Triton-X-100，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS裂解液)裂解，BCA定量(申能博彩)，5X上样缓冲液稀释，100℃10分钟变性后每泳道上样20-30ng，10％SDS-PAGE胶电泳，PVDF转膜后，以5％脱脂牛奶封闭1h，加入抗结蛋白单克隆细胞株上清1∶5(实施例5选择的细胞株的细胞培养上清)室温孵育1小时，1×PBST洗涤3×5min，加入二抗偶联HRP的抗小鼠IgG(Abmart，M21001S)以1∶5000室温孵育30min，1×PBST洗涤3×5min，以ECL Plus(Amersham，USA)检测。 [0210] B、免疫荧光(IF)实验步骤 [0211] 5×103个BHK细胞(ATCC，USA)接种到细胞载玻片上(SUPERGRADE MICROSCOPE SLIDES)37℃培养过夜，冰甲醇(-20℃)固定15min，1×PBS洗涤2×3min，1％BSA室温封闭1h后，加一抗抗结蛋白单克隆细胞株(实施例5得到的10株稳定的杂交瘤细胞株)培养上清1∶1室温孵育1小时，1×PBST洗涤3×5min，加入二抗抗小鼠Dylight549(Abcam)1∶400和DAPI 1∶4000室温孵育1h，1×PBST洗涤3X5min，荧光显微镜(Olympus)镜检拍照。 [0212] 不同表位抗体经Western验证，实施例5获得的7个细胞株能够特异性识别C2C12细胞系内源结蛋白，其中命名为4A1的细胞株(于2011年1月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C201107)产生的抗体4A1具有最好的亲和力和特异性，在Western blotting和免疫荧光均取得令人满意的结果(见附图4和5)。 [0213] 实施例7：膜受体蛋白GPR116结构域特异性抗体制备 [0214] A、蛋白表面身份结构域选择： [0215] GPR116蛋白为一种膜受体蛋白，种属为人，NCBI号为NP_001091988.1蛋白全长如下： [0216] 1MKSPRRTTLC LMFIVIYSSK AALNWNYEST IHPLSLHEHE PAGEEALRQK RAVATKSPTA [0217] 61EEYTVNIEIS FENASFLDPI KAYLNSLSFP IHGNNTDQIT DILSINVTTV CRPAGNEIWC [0218] 121SCETGYGWPR ERCLHNLICQ ERDVFLPGHH CSCLKELPPN GPFCLLQEDV TLNMRVRLNV [0219] 181GFQEDLMNTS SALYRSYKTD LETAFRKGYG ILPGFKGVTV TGFKSGSVVV TYEVKTTPPS [0220] 241LELIHKANEQ VVQSLNQTYK MDYNSFQAVT INESNFFVTP EIIFEGDTVS LVCEKEVLSS [0221] 301NVSWRYEEQQ LEIQNSSRFS IYTALFNNMT SVSKLTIHNI TPGDAGEYVC KLILDIFEYE [0222] 361CKKKIDVMPI QILANEEMKV MCDNNPVSLN CCSQGNVNWS KVEWKQEGKI NIPGTPETDI [0223] 421DSSCSRYTLK ADGTQCPSGS SGTTVIYTCE FISAYGARGS ANIKVTFISV ANLTITPDPI [0224] 481SVSEGQNFSI KCISDVSNYD EVYWNTSAGI KIYQRFYTTR RYLDGAESVL TVKTSTREWN [0225] 541GTYHCIFRYK NSYSIATKDV IVHPLPLKLN IMVDPLEATV SCSGSHHIKC CIEEDGDYKV [0226] 601TFHTGSSSLP AAKEVNKKQV CYKHNFNASS VSWCSKTVDV CCHFTNAANN SVWSPSMKLN [0227] 661LVPGENITCQ DPVIGVGEPG KVIQKLCRFS NVPSSPESPI GGTITYKCVG SQWEEKRNDC [0228] 721ISAPINSLLQ MAKALIKSPS QDEMLPTYLK DLSISIDKAE HEISSSPGSL GAIINILDLL [0229] 781STVPTQVNSE MMTHVLSTVN VILGKPVLNT WKVLQQQWTN QSSQLLHSVE RFSQALQSGD [0230] 841SPPLSFSQTN VQMSSMVIKS SHPETYQQRF VFPYFDLWGN VVIDKSYLEN LQSDSSIVTM [0231] 901AFPTLQAILA QDIQENNFAE SLVMTTTVSH NTTMPFRISM TFKNNSPSGG ETKCVFWNFR [0232] 961LANNTGGWDS SGCYVEEGDG DNVTCICDHL TSFSILMSPD SPDPSSLLGI LLDIISYVGV [0233] 1021GFSILSLAAC LVVEAVVWKS VTKNRTSYMR HTCIVNIAAS LLVANTWFIV VAAIQDNRYI [0234] 1081LCKTACVAAT FFIHFFYLSV FFWMLTLGLM LFYRLVFILH ETSRSTQKAI AFCLGYGCPL [0235] 1141AISVITLGAT QPREVYTRKN VCWLNWEDTK ALLAFAIPAL IIVVVNITIT IVVITKILRP [0236] 1201SIGDKPCKQE KSSLFQISKS IGVLTPLLGL TWGFGLTTVF PGTNLVFHII FAILNVFQGL [0237] 1261FILLFGCLWD LKVQEALLNK FSLSRWSSQH SKSTSLGSST PVFSMSSPIS RRFNNLFGKT [0238] 1321GTYNVSTPEA TSSSLENSSS ASSLLN(SEQ ID NO：110) [0239] 根据http://pfam.sanger.ac.uk/search/sequence预测蛋白表面身份结构域，选择第166-307位氨基酸残基的蛋白质片段用于构建免疫抗原和检测抗原，其中第166-307位氨基酸残基的蛋白质片段包括两个重要结构域。 [0240] B、目的片段扩增 [0241] 根据上述片段两端氨基酸序列以及引入酶切位点需要设计上游引物：CGCGGATCCCTTCAGGAAGATGTTACCCTGAA(SEQ ID NO：111) 和 下 游 引 物：CGCGAATTC AACATCTATTTTCTTCTTGCACT(SEQ ID NO：112)。 [0242] 以购买的GPR116CDNA质粒为模板(业力，中国)，模板量为50ng，PCR条件为94℃，2min；94℃30s--60℃30s--72℃1min，30个循环；72℃，10min；10℃，10min。 [0243] 切胶回收450bp左右的目的片段，BamHI/EcoRI酶切位点整合到实施 例1中的H载体中之后，获得五种质粒。分别插入相同酶切的H载体和PET32a载体，分别用于表达免疫抗原和检测抗原。 [0244] 构建好的H和PET32a表达载体，分别转化Rosetta感受态细胞(Novagen，Merck，Germany)。免疫抗原和检测抗原表达纯化方法分别参见实施例3和实施例4。免疫抗原产量为1.7mg，纯度80％；检测抗原产量为2.3mg，纯度95％。 [0245] C、免疫方法 [0246] 针对蛋白GPR116的免疫方法和剂量如下。 [0247] 选择3只Balb/c小鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司，上海)8-10周龄进行免疫。 [0248] 第1天，20μg(剂量可以是2-200ug)上述制备的免疫抗原与氟氏完全佐剂(Sigma)乳化完全，免疫位点为前肢腋下以及腹股沟，共4个点，每点50μL左右。 [0249] 第14天取10μg抗原与氟氏不完全佐剂(Sigma)乳化完全，免疫小鼠前肢腋下以及腹股沟。 [0250] 第21天小鼠眼眶取血，ELISA方法检测血清效价，小鼠血清效价均大于1∶32000。 [0251] 第28天，选择效价最高小鼠，用50μg抗原进行腹腔加强。 [0252] D、细胞融合和杂交瘤筛选 [0253] 第31天，断颈杀死小鼠，小鼠脾细胞与SP20细胞融合，HAT完全培养基悬浮细胞，铺4块384孔板，每孔80μL。细胞板37℃、5％CO2培养6天后，全换HT培养基。融合后8天，取10μL细胞上清，稀释5倍，用于ELISA测定。 [0254] 初筛ELISA操作与实施例5相同，不同之处在于包被抗原为经PET32a表达的与TRX融合的检测抗原，检测抗原本身也携带有选择的166-307aa的结构域序列，其他构件与H载体完全不同。因为免疫抗原除了所述结构域部分序列外，还携带有H载体蛋白的其他部分，这部分也是会产生相应的抗体。与TRX融合的检测抗原就是用于确认得到的细胞株识别的是所述表面结构域部分，而不是H载体蛋白表达的其他组分。包板浓度1μg/ml，包板溶液为pH9.6碳酸盐缓冲液(Na2CO3/NaHCO3)。 [0255] 挑选OD值最高的100个阳性克隆进行亚克隆和建株，所得到的是针 对GPR116蛋白表面身份结构域(上述选择的特异性结构域)的抗体库(68株)。从中可以筛选得到针对多种应用的细胞株，50株以上细胞株分泌抗体亲和力经测定小于10nM，说明抗体库内抗体亲和力处于一个很高的水平。 [0256] E、验证数据 [0257] Western验证基本方法与实施例6同，选择验证的裂解液为Y79细胞(ATCC，USA)裂解液。图6示出使用上述50株细胞株中的杂交瘤细胞株1A6产生的单克隆抗体1A6的Western结果，该细胞株于2011年1月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C201108。50株细胞抗体能够检测特异性检测内源GPR116蛋白。50％以上细胞株在免疫共沉淀以及免疫荧光方面验证应用成功。 [0258] 实施例8：小鼠自身蛋白-Aof1蛋白抗体制备 [0259] A免疫抗原设计和表达 [0260] Aof1蛋白(含黄素胺氧化酶结构域蛋白)为小鼠自身蛋白质。对于自身蛋白质，传统的重组蛋白表达方法是很难制备得到高亲和力抗体。采用本发明方法策略，成功制备了高亲和力的抗体库。 [0261] Aof1蛋白氨基酸全长为： [0262] 1MAASRGRSKK RSNLELSPDN LPLRSSGRQA KKKAVEIPDE DEDGSSEKKY RKCEKAGCTA [0263] 61AYPVCFASAS ERCAKNGYTS RWYHLSCGEH FCNECFDHYY RSHKDGYDKY SAWKRVWTSN [0264] 121GKTEPSPKAF MADQQLPYWV QCTKPECGKW RQLTKEIQLT PHMARTYRCG MKPNTITKPD [0265] 181TPDHCSFPED LRVLEVSNHW WYPMLIQPPL LKDSVAAPLL SAYYPDCVGM SPSCTSTHRA [0266] 241TVTAATTTTG SASPGEMEPS KAAPSSLVLG MNRYFQPFYQ PNECGKALCV RPDVMELDEL [0267] 301YEFPEYSRDP TMYLALRNLI LALWYTNCKE ALTPQKCIPH IIVRGLVRIR CVQEVERILY [0268] 361FMTRKGLINT GVLTVAAGQH LLPKHYHNKS VLVVGAGPAG LAAARQLHNF GMKVTVLEAK [0269] 421DRIGGRVWDD KSFKGVVVGR GPQIVNGCIN NPVALMCEQL GISMRKLGER CDLIQEGGRI [0270] 481TDPTVDKRMD FHFNALLDVV SEWRKDKTLL QDVPLGEKIE EIYRAFVKES GIQFSELEGQ [0271] 541VLQFHLSNLE YACGSSLHQV SARSWDHNEF FAQFAGDHTL LTPGYSTIIE KLAEGLDIRL [0272] 601KSPVQSIDYT GDEVQVTTTD GMGHSAQKVL VTVPLAILQR GAIQFNPPLS EKKMKAINSL [0273] 661GAGIIEKIAL QFPYRFWDSK VQGADFFGHV PPSASQRGLF AVFYDMDSQQ SVLMSVITGE [0274] 721AVASLRTMDD KQVLQQCMGI LRELFKEQEI PEPTKYFVTR WSTEPWIQMA YSFVKTFGSG [0275] 781EAYDIIAEEI QGTVFFAGEA TNRHFPQTVT GAYLSGVREA SKIAAF(SEQ ID NO：113) [0276] 根据对该蛋白进行检索，发现其并不含有跨膜结构以及信号肽序列，对蛋白全长根据上述原则进行分析，确5个表面身份肽序列。 [0277] 用于构建免疫抗原串联多肽的表面身份肽选择方法与实施例2相同， 共选择7个短肽，序列见表14。 [0278] 表14：表面身份肽信息 [0279] [0280] Specific Score计算： [0281] 1、把蛋白序列截成10个aa的小段(逐步切割，1-10，2-11，3-12...) [0282] 2、把得到的所有10肽段在该蛋白种属内去做blast [0283] 3、每条目标肽的specific score计算公式为：i)选择每个目标多肽最同源的20个序列； [0284] ii)列出这20个序列中每个序列与目标多肽相比后相同的氨基酸数；iii)计算这些相同氨基酸数的平均值；iv)目标多肽的specific score为：100-平均值 [0285] 4、选specific score分值高的多肽段，结合其抗原性、亲水性、跨膜结构、信号肽等因素，最后选择出表面多肽最终确定Aof1蛋白的H载体展示的串联多肽序列为：KKYRKCEKAG-GGGGS-AASRGRSKKR--GGGGS-RSSGRQAKKK-GGGGS-VRGLVRIRCV-GGGGS-KYSAWKRVWT-GGGGS-RILYFMTRKG-GGGGS-MARTYRCGMK(SEQ ID NO：121) [0286] 经密码子优化，确定需要合成的全基因序列为： [0287] GACACggatccAAGAAATACCGTAAATGCGAGAAAGCAGGAGGTGGCGGCGGAAGCGCGGCTTCCCGTGGCCGTTCAAAAAAACGTGGCGGTGGAGGGTCCCGGAGCAGCGGCCGTCAGGCGAAAAAGAAGGGTGGTGGGGGATCTGTGCGTGGCCTGGTGCGTATTCGTTGCGTTGGGGGGGGTGGATCAAAATACTCTGCGTGGAAACGTGTGTGGACCGGCGGAGGCGGCAGTCGTATCCTGTATTTCATGACCCGTAAAGGAGGAGGGGGAGGCT CGATGGCGCGTACCTATCGTTGTGGGATGAAAgaattcGTGTC(SEQ IDNO：122) [0288] 在此基础上确定的全基因合成所用引物序列见下表，全基因合成方法同实施例4。 [0289] 合成好的引物164_01到164_14各取5μl，浓度为25μM，混合，以此混合引物为模板，在PFU酶(申能博彩，中国上海)的催化下进行第一轮PCR扩增，PCR条件为94℃，2min；30个循环(94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min)；72℃，10min；10℃，10min。再取2μl第一轮PCR产物作为模板，用引物16401和16414(浓度为25μM)进行扩增，条件如上所述。 1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，即为需要的全基因合成的核苷酸序列。 [0290] 表15Aof1全基因合成引物表 [0291] [0292] [0293] B免疫抗原串联多肽表达 [0294] 表达方法与实施例3相同。共得到1.5mg重组表达的免疫抗原串联多肽，蛋白纯度为85％。 [0295] C检测抗原合成 [0296] 检测抗原构建策略与实施例4相同，以包括Aof1蛋白在内的7个免疫原为基础(见表16)，来构建7个检测抗原(见表17)。表达纯化方法与实施例4相同。 [0297] 检测抗原1纯化量为0.75mg，纯度为85％；检测抗原2纯化量为0.9mg，纯度为70％；检测抗原3纯化量为1.3mg，纯度为75％；检测抗原4纯化量为0.95mg，纯度为95％； 检测抗原5纯化量为1.9mg，纯度为65％；检测抗原6纯化量为1.1mg，纯度为80％；检测抗原7纯化量为0.9mg，纯度为85％。 [0298] 表16：7个免疫抗原串联多肽序列 [0299] [0300] 表17：7个检测抗原 [0301] [0302] [0303] C：免疫方法 [0304] 针对蛋白Aof1的免疫方法和剂量如下。 [0305] 第1天10μg抗原(携带有SEQ ID NO：121多肽序列的H载体蛋白)与寡聚核苷酸佐剂(详细方法见实施例5关于寡聚核苷酸佐剂的解释)完全混合，免疫小鼠后腿肌肉，共两点，每点50-100μL。 [0306] 第8天取20μg抗原与寡聚核苷酸佐剂混合，免疫小鼠尾根以及后腿肌肉，每点50-100μL。 [0307] 第12天，10μg抗原与寡聚核苷酸佐剂完全混合，免疫小鼠后腿肌肉。 [0308] 第14天小鼠眼眶取血，ELISA方法检测血清效价，小鼠血清效价均大于1∶32000。 [0309] D、细胞融合和表位筛选 [0310] 第15天取两只小鼠淋巴结细胞进行融合。细胞融合、阳性克隆筛选方法、表位筛选方法，与实施例5相同。 [0311] 针对不同检测抗原阳性的孔即为针对不同抗原表位的抗体，筛选结果见表18。共得到针对6个表位的抗体，阳性克隆数不等。 [0312] 表18Aof1蛋白单克降抗体识别表位数据 [0313]表位 表位序列 克隆数 A GKLLGQGAFG(SEQ ID NO：151) 5 B PDSPETSKEV(SEQ ID NO：152) 8 C GGSVKDQLKA(SEQ ID NO：153) 10 D RKYTRQILEG(SEQ ID NO：154) 0 [0314]E VKLGDFGASK(SEQ ID NO：155) 38 F MDEQEALNSI(SEQ ID NO：156) 15 G LTHHFAQLMY(SEQ ID NO：157) 6 [0315] 分别挑取每个表位2-5个阳性孔进行有限稀释法进行亚克隆，经过3轮亚克隆得到30株稳定的杂交瘤细胞株，针对6个表位。E抗体验证数据 [0316] Western验证基本方法与实施例6同，细胞系为Hela宫颈癌细胞系(ATCC，USA)，图7示出使用上述30株细胞株中的一个细胞株2F1产生的单克隆抗体2F1的Western结果，所述细胞株于2011年1月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C201109。其中5个表位，15个细胞株Western应用成功。 |
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