基于KRINGLE域结构的蛋白质骨架库及其应用 |
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| 申请号 | CN200980131306.8 | 申请日 | 2009-08-07 | 公开(公告)号 | CN102149858A | 公开(公告)日 | 2011-08-10 |
| 申请人 | 亚州大学校产学协力团; | 发明人 | 金容星; 权明姬; 李昌翰; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了Kringle域结构，包括：除对保持Kringle域的骨架构造重要的保守 氨 基酸残基，在氨基酸残基上诱导人工突变；基于Kringle域结构的 蛋白质 骨架变体，通过特异性结合靶分子，调节来源于Kringle域库的蛋白质骨架靶分子的 生物 活性。本发明而且还提供了构建同源/异源低聚物的方法，其用连接子通过Kringle域变体 单体 的 串联 装配，提供多特异性结合与多个靶。另外，本发明提供通过将Kringle域变体的靶结合环嫁接入另一个具有相同或不同靶结合特异性的Kringle域变体的其它非结合环而制备多特异性单体和多价单体的方法。此外，基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体特异性结合靶分子，DNA编码蛋白质骨架变体，或用于 预防 、检测、诊断、 治疗 或缓解 疾病 或紊乱，特别是癌症以及其它免疫相关疾病的方法和组合物，包括：给动物更优选给人类施用有效量的相关分子。 | ||||||
| 权利要求 | 1.制备基于Kringle域结构的蛋白质骨架库的方法，所述方法包括：在除了对保持 |
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| 说明书全文 | 基于KRINGLE域结构的蛋白质骨架库及其应用技术领域[0001] 本发明涉及构建基于Kringle域结构的蛋白质骨架库，结合各种靶分子以调节其生物活性的来源于Kringle域库的蛋白质骨架变体，构建同源/异源低聚物的方法，其中所 述低聚物通过Kringle域结构变体单体的串联装配，提供多特异性结合与多个靶。此外，本 发明涉及通过将Kringle域结构变体的靶结合环(target-binding loop)嫁接入另一个具 有相同或不同靶结合特异性的Kringle域结构变体的其它非结合环而制备多特异性单体 和多价单体的方法。进一步地，本发明提供了用于预防、检测、诊断、治疗或缓解疾病或紊 乱，特别是癌症以及其它免疫相关疾病的Kringle域结构变体的方法和组合物，以及给动 物施用有效量的Kringle域结构变体。 背景技术[0002] 通过蛋白质氨基酸序列以及二级结构和三级结构的分析，很多蛋白质由分隔开的域(或模块)组成。对于蛋白质，域是指一个单独的功能和/或结构单元。至少，一个 相同的域可分布于各种蛋白质中，并且一个蛋白质可由各种不同的域组成。域的具体信息 可在生物信息学的网站，如Prosite(Hulo N等，Nucleic Acids Res，36：D245-249，2008； Website：http://kr.expasy.org/prosite/)、SMART(Letunic I等，Nucleic Acids Res.， 34：D257-D260，2006；Website：http://smart.embl-heidelberg.de/)上搜索到，域的代表性例子包括免疫球蛋白样、纤连蛋白II和III、Kringle等等。 [0003] 生物分子间的相互作用(例如，蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸相互作用)在各种生命现象如细胞的生长、分化和发育，细胞间/细胞外信号转导，以及质量运输中发挥 重要作用。作为已知的特异性结合靶分子以控制靶分子生物活性的分子，抗体(全长抗体 或其片段)的开发处于领先。然而，因为抗体在纯化的表达和低溶解度的各种问题，其应 当在动物细胞-表达细胞株中表达，纯化的费用非常昂贵，并且在还原细胞内环境下其稳 定性非常低。为解决上述问题，已尝试开发除抗体之外的特异性结合靶分子的蛋白质，例 如能解决关于抗体问题的抗体(Review Article：Hey，et al.，Trends in Biotech.23： 514-522，2005；Skerra，Current Opin.Biotech.，18：295-304，2007)。这些蛋白被称为蛋白质骨架，替换(alternative)蛋白质骨架，替换骨架，非抗体蛋白质骨架，或替换结合蛋 白(在下文中，被称为“蛋白质骨架”)(Skerra A，FEBS J，275：2677-2683，2008；Skerra，Current Opin.Biotech.，18：295-304，2007；Nygren P.，et al.，J.Immunol Method，290： 3-28，2004)。蛋白质骨架的模型通过构建蛋白质库制备，所述库通过在蛋白质表面暴露的 残基或环结构诱导随机或设计的诱变、由此保留赋予结构稳定性的氨基酸序列以保留其结 构骨架而构建，分离特异性结合至靶分子的变体。 [0004] Kringle域在包括人的不同物种的蛋白质中作为分隔开的模块出现，并且，在一个蛋白中存在几十个或数百Kringle域(参见表1)(Castellino，et al.，J Mol Evol， 26：358-369，1987；Ikeo，et al.，J Mol Evol，40：331-336，1995；Cao，et al.，Curr Med Chem-Anti-Cancer agents，2：667-681，2002)。对于自然界中存在的多种生物体，从893种蛋白质中发现了1663种不同的Kringle域，并39种Kringle域其氨基酸序列彼此不同的分 布于31种人类蛋白质(参见：Prosite(Hulo N，et al.，Nucleic Acids Res，36：D245-249， 2008；网址：http://kr.expasy.org/prosite/；SMART(Letunic I，et al.，Nucleic Acids Res，34：D257-D260，2006；网 址：http://smart.embl-heidelberg.de/)(Castellino，et al.，J Mol Evol，26：358-369，1987；Ikeo，et al.，J Mol Evol，40：331-336，1995)。在Kringle域之间存在有包括约20个氨基酸的环(间-Kringle域)。Kringle域的确切功 能未知，但Kringle域在结合各种生物分子(例如蛋白、肽、碳水化合物、细胞膜、磷脂等 等)以赋予相应蛋白质结合活性并控制相应蛋白质的各种生物活性中起重要作用(Cao， et al.，Curr Med Chem-Anti-Cancer agents，2：667-681，2002)。Kringle域通常分布 于生长因子、蛋白酶、凝血因子、横跨膜受体等等(Castellino，et al.，J Mol Evol，26： 358-369，1987)。特别地，Kringle域独立于其它蛋白质而存在，或与其它蛋白质(例如内 皮抑素、血管抑素)一同存在，还可以用于抑制血管生成(抗血管生成)。血管抑素具有4 个Kringle域，并且血管抑素的这种结构是用于抑制血管生成所必需的(Cao，et al.，Curr Med Chem-Anti-Cancer agents，2：667-681，2002)。与纤维蛋白溶解相关的血纤维蛋白溶 酶原和血纤维蛋白溶酶中Kringle域的赖氨酸结合位点，已被认定为两个蛋白的细胞外基 质分子和细胞受体之间的结合位点，并且Kringle域的赖氨酸结合位点因而被认为对于两 个蛋白的纤维蛋白溶解功能重要(Cao，et al.，Curr Med Chem-Anti-Cancer agents，2： 667-681，2002)。 [0005] 表1 [0006]蛋白质名称 Kringle域数量 凝血素 2 血纤维蛋白溶酶原 5 尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活物(uPa) 1 组织型血纤维蛋白溶酶原激活物(tPa) 2 凝血因子XII(Hagenman因子) 1 载脂蛋白A 38 肝细胞生长因子/分散因子(HGF/SF) 4 巨噬细胞刺激蛋白(MSP)/HGF样蛋白 4 HGF激活物 1 Kremen 1 神经胰蛋白酶/马达蛋白(Neurotrypsin/motopsin) 1 血浆透明质烷结合蛋白(PHBP) 1 丝氨酸蛋白酶(Hermandid momus) 1 ROR 1&2 1 果蝇神经元特异性受体激酶 1 果蝇受体激酶 1 线虫ROR受体酪氨酸激酶 1 肌肉特异性酪氨酸激酶(Musk)(Torpedo，Xenopus) 1 [0007] 包含Kringle域的蛋白质，以及所述蛋白质中的Kringle域数目如表1所列。 [0008] Kringle是一种在各种生物体如人类的多种蛋白中具有独立三级结构的域或模块。典型的Kringle域由约80个氨基酸组成，并具有与3个二硫键(S-S键)相连的三级结 构，其在结构上提供了坚固环状结构(Castellino，et al.，J Mol Evol，26：358-369，1987； Ikeo，et al.，J Mol Evol，40：331-336，1995；Castellino，et al.，Ciba Found Symp，212： 46-60，1997；Marti，et al.，Biochemistry，38：15741-15755，1999)。典型的Kringle域具有1-6、2-4以及3-5三种二硫键结合模式。更确切地说，二硫键结合模式在半胱氨酸1 和80之间、半胱氨酸22和63之间以及半胱氨酸51和75之间形成(Ikeo，et al.，J Mol Evol，40：331-336，1995；Castellino，et al.，Ciba Found Symp，212：46-60，1997；Marti，et al.，Biochemistry，38：15741-15755，1999)。 [0009] 自然界的生物体中超过893种蛋白质(至少31种人类蛋白质)中发现了Kringle域。就Kringle域来说，它们的一些赋予结构稳定性的氨基酸是保守的，但其它的氨基酸在 氨基酸或核苷酸水平上不保守。因此，通过保守Kringle域的氨基酸序列来构建变体库是 必需的，其中所述序列赋予通常的结构特性以形成结构骨架(例如，3个细胞内二硫键(以 1-6、2-4以及3-5二硫键结合模式)以及因而制备的环结构)，并将设计突变或随机突变引 入环结构的结构柔性区域以获得各种自然界不存在的氨基酸序列组合，以及通过分离和鉴 定变体来表征基于Kringle域结构骨架的变体，所述变体特异性结合于所设计库的多种靶 分子。同样，由于基于Kringle域结构的变体控制所述靶分子的生物活性，它们可用于开发 预防、检测、诊断、治疗以及缓解各种疾病的方法和组合物。 发明内容[0010] 技术问题 [0011] 本发明的一个方面提供了基于Kringle域结构构建蛋白质骨架库的方法。 [0012] 本发明的另一方面提供了基于来源于所构建库的Kringle域结构的蛋白质骨架变体，其与各种靶分子特异性结合以调节靶分子的生物活性。 [0013] 本发明还有一个方面提供了编码基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体的DNA及包含其的表达载体，其中所述变体特异性结合靶分子。 [0014] 本发明还有一个方面提供了表达和纯化基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体的方法，其中所述变体特异性结合靶分子。 [0015] 本发明还有一个方面提供了通过人类抗体IgG1的Fc域与基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体单体融合而制备Fc融合蛋白质骨架变体的方法，其中所述Fc融合蛋白质 骨架变体诱导亲和力和免疫反应。 [0016] 本发明还有一个方面提供了通过基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体单体组合的构建同源或异源低聚物的方法，以及制备赋予所述多特异性的异源低聚物的方法。 [0017] 本发明还有一个方面提供了通过将Kringle域变体的靶结合环嫁接入另一个具有相同或不同靶结合特异性的Kringle域变体的其它环，以制备多特异性单体和多价单体 的方法。 [0018] 然而，本发明的另一个方面提供了用于预防、检测、诊断、治疗或缓解疾病或紊乱，特别是癌症和其它免疫相关疾病的方法和组合物，包括：给动物施用治疗有效量的基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体。 [0019] 技术方案 [0020] 根据本发明的一个方面，提供了一种制备基于Kringle域结构的蛋白质骨架库的方法。在此，所述方法包括；在除保持Kringle域的结构骨架上重要的保守氨基酸残基以外 的氨基酸残基上诱导人工突变。 [0021] 根据本发明的一个示范性具体实施例，所述对保持Kringle域的结构骨架上重要的保守氨基酸残基可包括但不特别地限于，选自C1，G6，Y9，D10，G11，T16，G19，C22，Q23，W25，P30，H31，H33，G34，K48，N49，Y50，C51，R52，N53，P54，D55，P61，W62，C63，F64，T65，E73，L74，C75，P78，R79以及C80的至少一个残基。 [0022] 根据本发明的一个示范性具体实施例，所述人工突变可在氨基酸残基2，3，4，5，7，8，12，13，14，15，17，18，20，21，24，26，27，28，29，32，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46， 47，56，57，58，59，66，67，68，69，70，71，72，76和77中选择的至少一个残基上发生，并且所述氨基酸残基可以是被缺失的或被一个选自丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸或甘氨酸的残基所代替，但本发明并不特别局限于此。 [0023] 如上所述，Kringle域残基的编号系统依赖于标准的Kringle域编号惯例(Cao Y et al.(2002)Curr.Med.Chem.Anticancer Agents，2(6)：667-681；Marti DN et al.(1999)Biochemistry 38(48)：15741-15755)。 [0024] 根据本发明的另一个示范性具体实施例，所述方法可进一步包括：在除对保持Kringle域的结构骨架重要的保守氨基酸残基外的氨基酸残基上诱导人工突变，因此通过 应用作为模板的Kringle域基因和引物，在自然界存在的Kringle域基因上进行PCR，所述 Kringle域具有不存在于自然界的氨基酸序列。 [0025] 在这种情况下，来源于蛋白质骨架库的变体可以是基于Kringle域结构的蛋白变体，所述蛋白变体具有下述氨基酸序列： [0026] CXxXxGXxYDGXxXxTXxGXxCQXWXxXxPHXHGXxXxXxXxXxXxKNYCRNPDXxXxPWCFTXxXxXxXELCXxPRC(序列号：19)。 [0027] 其中，X代表选自丝氨酸、酪氨酸、脯氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸或天冬氨酸的残基，而x代表谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸和甘氨酸。 [0028] 根据本发明的一个示范性具体实施例，所述Kringle域可以是来源于人类血纤维蛋白溶酶原的Kringle域，但本发明并不特别局限于此。 [0029] 根据本发明的一个示范性具体实施例，所述引物选自序列号：1至序列号：8所组成的组，但本发明并不特别局限于此。 [0030] 根据本发明的一个示范性具体实施例，Kringle域的例子可包括血纤维蛋白溶酶原的Kringle域，但本发明并不特别局限于此。那么，血纤维蛋白溶酶原的Kringle域具有 序列号：49中所阐述的氨基酸序列，并且血纤维蛋白溶酶原变体的Kringle域的至少一个 氨基酸序列是突变的，更确切地说，替换、缺失、反转或易位均包括在本发明的范围内。 [0031] 根据本发明的一个示范性具体实施例，编码血纤维蛋白溶酶原Kringle域的基因可包括具有序列号：50所阐述DNA序列的基因，或者是考虑遗传密码兼并的与所述DNA序 列具有超过80％同源性的基因，但本发明并不特别局限于此。 [0032] 另外，本发明提供了基于Kringle域构建的在本发明蛋白质骨架库的制备方法中制备的蛋白质骨架库。 [0033] 根据本发明的一个示范性具体实施例，所述库可包括序列号：13所阐述的库，但本发明并不特别局限于此。根据本发明的一个示范性具体实施例，所述库还可包括选自序 列号：14到序列号：18的蛋白质骨架库，但本发明并不特别局限于此。 [0034] 此外，本发明还提供了将具有高亲和性的基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体筛选至靶分子的方法。在此，所述方法包括：蛋白质骨架库与靶分子反应。 [0035] 在本发明的筛选蛋白质骨架变体的方法中，靶分子的例子可包括但不特别限于：死亡受体(DR)4、死亡受体(DR)5、肿瘤坏死因子α(TNFα)、糖蛋白IIβIIIα受体或糖 蛋白IIβIIIα、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、酪氨酸激 酶抑制剂、表皮生长因子受体、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子受体 (PDGFR)、干细胞因子受体(c-kit)、Fms样酪氨酸激酶3(Flt-3)、白细胞介素1、白细胞介素 6、白细胞介素32以及白细胞介素2受体、CD3、CD11a、CD14、CD15、CD16、CD20、CD32、CD64或Raf。 [0036] 此外，本发明提供了对靶分子具有高亲和力的Kringle域变体，所述变体在筛选基于Kringle域结构、对靶分子具有高亲和力的蛋白质骨架变体的方法中制备。 [0037] 根据本发明的一个示范性具体实施例，所述变体可以是基于Kringle域结构的具有至少一个选自下述氨基酸序列的蛋白质骨架变体，但本发明并不特别局限于此。 [0038] 表2 [0039] [0040] 根据本发明的又一示范性具体实施例，所述变体可以是基于Kringle域结构的具有至少一个选自下述氨基酸序列的蛋白质骨架变体，但本发明并不特别局限于此。 [0041] 表3 [0042] [0043] 根据本发明的又一示范性具体实施例，所述变体可以是基于Kringle域结构的具有至少一个选自下述氨基酸序列的蛋白质骨架变体，但本发明并不特别局限于此。 [0044] 表4 [0045] [0046] 此外，本发明提供了一种用蛋白质骨架变体单体制备Fc融合结构，同源低聚物或异源低聚物的方法，所述蛋白质骨架变体单体在用于筛选基于本发明Kringle域结构的蛋 白质骨架变体的方法中制备，其结合相同的靶分子。 [0047] 本发明还提供了用于制备可同时结合多个靶分子的低聚物的方法。在此，所述方法包括：分离蛋白质骨架单体，如本发明的基于Kringle域结构筛选蛋白质骨架变体的方 法所制备的，其分别结合两个或多个不同靶分子，并应用连接子串联装配所述单体以制备 低聚物。 [0048] 另外，本发明提供了一种通过将Kringle域变体的靶结合环嫁接入另一个具有相同或不同靶结合特异性的Kringle域变体的其它环，以制备多特异性单体或多价单体的方 法。在此，所述方法包括：从Kringle域库分离蛋白质骨架单体，如本发明的基于Kringle 域结构筛选蛋白质骨架变体的方法所制备的，其分别结合两个或多个不同靶分子，并分析 蛋白质骨架单体的结合环。 [0049] 此外，本发明提供了一种用于治疗或预防癌症的组合物，包含本发明的对靶分子具有峰值特异亲和力的Kringle域变体作为活性成分。 [0050] 本发明还提供了一种用于治疗或预防由TNFα过表达或过量导致的自身免疫病的组合物，其包含本发明的对靶分子具有高特异亲和力的蛋白质骨架变体。 [0051] 下文中更详细地描述了本发明的示范性具体实施例。 [0052] 依据本发明，蛋白质骨架(或模板蛋白)库中应用Kringle域包括1663种Kringle域，其具有不同的氨基酸序列并分布于自然界各种生物体的893种蛋白质中，或优选包 括39种Kringle域，其具有不同的氨基酸序列并分布于31种来源于人类蛋白质中(参 见：Prosite：http://kr.expasy.org/prosite/；SMART：http://smart.embl-heidelberg. de/)。 [0053] 依据本发明，Kringle域可以是来源于人类蛋白质，如凝血素、血纤维蛋白溶酶原、血纤维蛋白溶酶、尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活物(uPa)、组织型血纤维蛋白溶酶原激活物(tPa)、凝血因子XII(Hagenman因子)、载脂蛋白A、肝细胞生长因子/分散因子(HGF/ SF)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP/HGF样蛋白)、穿膜蛋白(Kremen)、神经胰蛋白酶(神经胰蛋 白酶/马达蛋白)或血浆透明质烷结合蛋白(PHBP)。 [0054] 依据本发明，术语“靶分子”指自然界中的分子，如蛋白质、磷脂、细胞膜、核酸(DNA、RNA)、碳水化合物、离子等等，并且所述靶分子包括单分子或它们的复合分子。所述靶分子还可包括细胞、组织或自然界中不存在的新类型分子。 [0055] 依据本发明，源于人类的DR5是一种属于(死亡受体5；TRAIL受体2；DR5)TNF受体家族的受体，其结合TRAIL，并在C末端具有细胞内死亡域(Pan，et al.，Science 277： 815-818，1997)。当DR5结合至TRAIL，诱导多种癌肿细胞系体外或体内的细胞凋亡。 [0056] 依据本发明，源于人类的DR4是一种属于(死亡受体4；TRAIL受体1；DR4)TNF受体家族的受体，其结合TRAIL，并在C末端具有细胞内死亡域(Pan，et al.，Science 276： 111-113，1997)。当DR4结合至TRAIL，诱导多种癌肿细胞系体外或体内的细胞凋亡(Pan， et al.，Science276：111-113，1997)。 [0057] 依据本发明，源于人类的肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种由各种细胞，如单核细胞或巨噬细胞分泌的炎性细胞因子与具有各种功能的炎症诱导蛋白(Pennica D，et al.， Nature，312：724-729，1984；Feldmann M，Nature Rev.Immunol，2：364-371，2002；Zhang G，Curr Opin Struct Biol，14：154-160，2004)。TNFα与各种疾病，如关节炎、抗胰岛素性、脂类代谢等等相关。TNFα通过在各种表达TNF受体(TNFR1、TNFR2)中诱导细胞死亡从而诱 发疾病而起作用(Feldmann M，Nature Rev.Immunol，2：364-371，2002；Zhang G，Curr Opin Struct Biol，14：154-160，2004)。 [0058] 本发明的用于构建基于Kringle域结构的蛋白质骨架库的方法，被用于保持赋予Kringle域典型的结构稳定性的氨基酸序列(例如，3个分子内二硫键(以1-6、2-4以及 3-5二硫键结合模式)及其周围的保守氨基酸残基)，并使得环结构区域包含自然界中不存 在的氨基酸的各种组合，其中所述环结构区域通过二硫键形成。 [0059] 从本发明的基于Kringle域结构的蛋白质骨架库中，可以筛选并分离到特异性结合各种靶分子以控制所述靶分子生物活性的Kringle域变体。 [0060] 由于本发明的特异性结合靶分子的Kringle域结构变体不仅结合所述靶分子的特异性位点，而且特异性结合所述靶分子的不同位点，因而可以分离结合靶分子的多克隆 的Kringle域结构变体。 [0062] 本发明的结合靶分子的Kringle域变体可构建为单体形式或通过单体组合成低聚物，并且，仅特异性结合一个靶分子的多特异性低聚物可通过相对于各种靶分子所选择 单体的组合构建。 [0063] 基于对结合相同靶分子或两个或多个不同靶分子不同位点的本发明单体的结合环的分析，多价单体或多特异性单体可通过将Kringle域变体的靶结合环嫁接入另一个具 有相同或不同靶结合特异性的Kringle域变体的其它环而制备。 [0064] 本发明的特异性结合靶分子DR4和DR5的Kringle域变体用作可在不同癌症细胞系中诱导细胞死亡的单体。本发明的Kringle域变体还可以构建为结合其相同靶分子的低 聚物形式，并用于生产可同时结合靶分子DR4和DR5的双重特异低聚物，因而最大化对肿瘤 细胞凋亡的效果。所选择的结合各种靶分子的单体还可以组合以制备特异性结合至少一个 靶分子的多特异性低聚物。基于结合环的分析，可以通过将结合环嫁接入具有相同靶分子 的相同Kringle域变体以制备多价单体，还可以通过将结合环嫁接入针对相同或不同靶分 子的相同或不同Kringle域变体以制备多特异性单体。 [0065] 本发明的可特异性结合靶分子TNFα的Kringle域变体用于治疗疾病(如关节炎、克罗恩氏病(Crohn’s disease))，上述疾病是因为以单体中和各种TNFα中TNFα过量 存在而导致的。本发明的Kringle域变体还可以构建为结合靶分子TNFα的低聚物形式， 以及与标记分子(例如标签)或抗体的恒定区(Fc)融合以最大化生物活性。结合不同靶 分子的所选择单体还可组合以制备特异性结合至少一个靶分子的多特异性低聚物。基于结 合环的分析，可以通过将结合环嫁接入具有相同靶分子的相同Kringle域变体以制备多价 单体，还可以通过将结合环嫁接入针对相同靶分子的相同或不同Kringle域变体以制备多 特异性单体。 [0066] 本发明的另一个示范性具体实施例提供了用于预防、检测、诊断、治疗或缓解疾病或紊乱，特别是癌症或其它免疫相关疾病的方法和组合物，包括：给动物更优选给人类施用 有效量的Kringle域变体的单体、低聚物、融合蛋白、多价单体、多特异性单体等等。 [0067] 本发明的一个示范性具体实施例提供了一种蛋白质，其包含特异性结合靶分子的人造单体。根据一些示范性具体实施例，所述蛋白质的单体域具有一个、两个、三个或多个 二硫键。 [0068] 在本发明中，术语“单体域”或“单体”指发现于蛋白质或多肽中的单独的区域。所述单体域在缺乏侧面天然氨基酸序列时在溶液中形成三级结构。本发明的单体域可选择用于特异性结合靶分子。 [0069] 在本发明中，术语“环”指通过单体域蛋白骨架结构的结合，通常暴露于环境的单体域的区域，并且与靶分子的结合相关。 [0070] 在本发明中，术语“低聚物”指包含至少两个单体域的肽。低聚物中分隔的单体可通过连接子连接。同源低聚物由相同的Kringle域变体组成，异源低聚物由两个或多个不 同Kringle域变体组成。 [0071] 本发明的术语“靶分子”包括广泛的物质以及从单个分子至复合靶分子的分子。靶分子可以是被蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物或肽域所识别的其它分子。靶分子包括在如 本文所公开的筛选分析中，或可被定义为促进或抑制特殊性蛋白的相互作用。 [0072] 在本发明中，术语“连接子”指连接两个或多个分隔单体域或结合分隔单体域的一个或一组区域。当连接子连接分隔单体域和低聚物时，连接子保持单体域的分隔状态。适 合的连接子包括多肽、多核苷酸及其类似物。适合的连接子选择性的替换在碳骨架中导入 了至少一个氧原子的亚烃基。连接子可包括原始序列及其变体或合成序列的一些部分。 [0073] 在本发明中，术语“载体”指可在宿主中独立于从宿主染色体复制的多核苷酸。载体的例子包括质体。通常，载体具有其复制起始区，并可包括转录和转移终止子、转录和转 移起始序列以及用于控制特定核酸表达的启动子。 [0074] 在本发明中，术语“重组”指核酸、蛋白质或载体被异源核酸或蛋白的施加而修饰，或天然核酸或蛋白质的改变。相应地，重组细胞表达基因不以原始(非重组)细胞的形式被发现，或表达其根本不表达的基因或者是异常但并非良好表达的基因。 [0075] 在本发明中，术语“基于Kringle域结构的蛋白变体”或“基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体”，指行使功能以保持Kringle域的结构但包含天然氨基酸序列中并不存在 的氨基酸序列的蛋白质，所述序列赋予Kringle域实际存在的典型结构稳定性，其保守地 形成结构骨架[例如，3个细胞内二硫键(以1-6、2-4和3-5二硫键模式)以及因而制备的 环骨架结构，但所述环结构也包括了不存在于自然界的各种氨基酸的组合。除自然界中存 在Kringle域的蛋白质外，基于Kringle域的这些蛋白质变体可特异性结合多种靶分子以 控制其生物活性。 [0076] 在本发明中，表述“蛋白质骨架库”指由蛋白质骨架组成的库，所述蛋白质骨架的赋予Kringle域结构典型结构稳定性的氨基酸序列是保守的，但其各种不存在于自然界的 氨基酸序列处于环结构。这种蛋白质骨架库可以应用各种技术制备，如重叠PCR、DNA改组、 易错PCR、人工DNA合成等等。增殖库还可以插入到酵母表面表达载体或动物细胞表面表达 载体，转化并表达。由于蛋白质骨架库的大小并无限制，但库的大小在转化过程中受限制， 7 13 库的多样性通常在大约10 至10 的范围内。从这种表达的蛋白质骨架库中，可以筛选并 分离到某种特异性结合各种靶分子的蛋白质骨架变体。 [0077] 在本发明中，表述“不存在于自然界的氨基酸”指排列在天然多肽相应位置氨基酸以外的氨基酸。 [0078] 本发明的低聚物包括两个或多个单体。例如，本发明的低聚物可包含2个至约4个、2个至约8个、2个至约10个或3个至约10个单体域，并可特别地包含约4、5、6或7个 单体域。在一些示范性具体实施例中，每个单体域特异性结合一个靶分子。在一些示范性 具体实施例中，每个单体域结合一个靶分子的不同位点。结合同一靶分子的多个单体域促 成结合效应使得低聚物相对于个别单体具有提高的靶分子结合亲和力。 [0079] 在另一个示范性具体实施例中，低聚物包含对不同靶分子有特异性的单体域。例如，单体域中的各种低聚物可特异性结合病毒复制系统的不同成分，或结合靶细胞或靶组 织的不同靶分子。类似地，治疗性分子可通过容许治疗性物质结合低聚物的单体以靶向细 胞或组织，所述低聚物包含对所述细胞或组织有特异性的另一单体域。 [0080] 低聚物可包含各种单体组合。例如，选自单个低聚物的单体域可以是同样的或彼此相同的。 [0081] 与本发明相一致，例如，低聚物可选自以下组中的一个，该组为：(1)同源低聚物(即A1-A1-A1-A1在相同域中)；(2)异源低聚物，(即A1-A2-A3-A4)。 [0082] 在本发明中，所选择的单体域可通过连接子连接以形成低聚物。 [0083] 所选择单体域通过连接子的连接，可用多种本领域已知技术获得。例如，可通过限制性酶处理和连接、基于PCR的自动重叠反应或其它重组方法获得涂覆被选择单体的多核 苷酸组合连接。 [0084] 连接子可以是天然的或合成的，或者是天然连接子或合成连接子的组合。例如，合成连接子可以是具有随机的序列和大小的连接子。 [0085] 在本发明中，所选择的单体域可通过基于结合环分析的环嫁接入形成多价单体或多特异性单体。 [0086] 结合环分析可通过实施例所述以及图3所显示的、基于环1-7的酵母细胞表达技术获得。 [0087] 环嫁接可应用本领域的各种已知技术获得。例如，编码所选择单体的多核苷酸组合连接可通过限制性酶处理以及重连接、基于PCR的自启动重叠反应或其它重组方法获 得。 [0088] 有益效果 [0089] 如上所述，根据本发明的示范性具体实施例的基于Kringle域结构构建蛋白质骨架库的方法，可应用基于Kringle域结构的蛋白质骨架库，通过保留赋予Kringle域典型结 构稳定性的氨基酸序列并使得环结构区域包含不存在于自然界的各种氨基酸序列，用于筛 选和分离特异性结合各种靶分子以调节靶分子生物活性的Kringle域变体，其中所述环结 构区域通过二硫键形成。 [0090] 本发明示范性具体实施例中的特异性结合靶分子的Kringle域变体，还可用于从靶分子中分离多克隆Kringle域变体，因而它们不仅可以结合所述靶分子的特定区域，还 可以特异性结合所述靶分子的数个区域。 [0091] 另外，本发明示范性具体实施例中的特异性结合靶分子的Kringle域变体，可用于制备特异性结合至少一个靶分子的多特异性低聚物，因为它们可在毕赤酵母宿主细胞的 液相中表达和纯化，通过应用这些单体或其组合构建入低聚物，并且所选择的结合多种靶 分子的单体相互结合。 [0092] 例如，本发明示范性具体实施例中的特异性结合靶分子DR4以及DR5的Kringle域变体，可用作可在不同癌症细胞系中诱导细胞死亡的单体。本发明示范性具体实施例中 的Kringle域变体还可以构建成结合其相同靶分子的低聚物形式，并用于生产同时结合靶 分子DR4和DR5的双特异性低聚物，因而最大化在癌症细胞凋亡上的效果。此外，本发明示 范性具体实施例中的特异性结合靶分子DR4以及DR5的Kringle域变体，可用于生产同时 结合靶分子DR4和DR5的双特异性低聚物，因而最大化在癌症细胞凋亡上的效果。本发明 示范性具体实施例中的Kringle域变体还可用于制备同时结合靶分子DR4和DR5的多特 异性单体，因而最大化在癌症细胞凋亡上的效果。本发明示范性具体实施例中的Kringle 域结构变体，可通过嫁接结合各种靶分子所选择单体的靶结合环来制备多特异性单体，并 且本发明示范性具体实施例中的特异性结合靶分子TNFα的Kringle域变体，还可通过 以单体中和各种类型的TNFα来治疗TNFα过量存在导致的疾病(即关节炎、克罗恩氏 病(Crohn’s disease))。本发明示范性具体实施例中的Kringle域变体还可用于最大化 生物活性，因为它们可构建成结合靶分子TNFα的低聚物形式，并可与标记分子(例如标 签)或抗体的恒定区(Fc)融合。本发明示范性具体实施例中的特异性结合靶分子TNFα 的Kringle域变体，还可通过结合不同靶分子的所选择单体的组合，用于制备特异性结合 至少一个靶分子的多特异性低聚物。此外，本发明示范性具体实施例中的特异性结合靶分 子TNFα的Kringle域变体，可通过嫁接结合环进入针对相同靶分子的相同Kringle域变 体来制备多价单体。 [0093] 如上所述，本发明提供了用于预防、检测、诊断、治疗或缓解疾病或紊乱，特别是癌症以及其它免疫相关疾病的方法和组合物，包括：给动物更优选给人类施用有效量的 Kringle域变体的单体、低聚物、融合蛋白、多价单体、多特异性单体等等。 附图说明 [0094] 图1显示了人类中存在的具有不同氨基酸序列的39种Kringle域的保守氨基酸序列。 [0095] 图2显示了具有最保守氨基酸残基及其保持率的来源于人类Kringle域。 [0096] 图3显示了基于(PDB ID＝1B2I)血纤维蛋白溶酶原Kringle域2的三级结构的7个环，每个环具有较低保守的氨基酸序列。在此，图3a和b显示了血纤维蛋白溶酶原 Kringle域2的二级结构和3个二硫键，图3c和d显示了血纤维蛋白溶酶原Kringle域2 的表面。 [0097] 图4显示了蛋白质骨架单体在构建基于Kringle域结构的蛋白质骨架库并分离特异性结合靶分子的蛋白质骨架单体后的应用。图4a显示了筛选的每个靶分子Kringle域 变体亲和力的提高，图4b显示了根据每个靶分子的生物机制的Kringle域变体的低聚物构 建，图4c显示了筛选的每个靶分子Kringle域变体Fc融合结构的构建，图4d显示了每个 靶分子Kringle域变体结合环的分析，以及多价单体和多特异性单体的构建。 [0098] 图5显示了为应用可特异性结合各种靶分子的蛋白结构骨架而构建Kringle域库的特定策略，其基于人类血纤维蛋白溶酶原Kringle域2。 [0099] 图6是显示构建Kringle域蛋白质骨架库的过程的示意图。图6a显示了通过8个引物重叠制备Kringle域蛋白质骨架库基因的过程，图6b显示了酵母表面表达的过程。 [0100] 图7-图12显示了筛选的Kringle变体克隆在还原条件(图7、图9和图11)或非还原条件(图8、图10和图12)下15％SDS-PAGE上的分析，在纯化后关于靶分子DR4 的筛选Kringle变体克隆KD404、KD408、KD409、KD413、KD415、KD421、KD437、KD445、KD456和KD459；关于靶分子DR5的筛选Kringle变体克隆KD502、KD503、KD505、KD506、KD509、 KD537、KD542、KD548、KD555和KD559；以及关于靶分子TNFα的筛选Kringle变体KDT01、 KDT02、KDT08和KDT26。 [0101] 图13-图15显示了应用高效液相层析法(HPLC，The Agilent 1200Series LCTM Systems and Modules，Agilent，USA)的尺寸排阻色谱(Superdex 200 10/300GC，GE Healthcare，Sweden)的实验结果，以确定抗DR4、抗DR5及抗TNFαKringle域以单体形式 存在。 [0102] 图16-图18显示了通过应用ELISA，关于靶分子DR4的筛选Kringle域变体克隆KD404、KD408、KD409、KD413、KD415、KD421、KD437、KD445、KD456和KD459，关于靶分子DR5的筛选Kringle域变体KD502、KD503、KD505、KD506、KD509、KD537、KD542、KD548、KD555和KD559，关于靶分子TNFα的筛选Kringle域变体KDT01、KDT02、KDT08和KDT26的亲和力的 定量分析。 [0103] 图19-图21显示了通过应用ELISA，关于靶分子DR4与筛选Kringle域变体KD404、KD408、KD409、KD413、KD415、KD421、KD437、KD445、KD456和KD459，靶分子DR5与筛选Kringle域变体KD502、KD503、KD505、KD506、KD509、KD537、KD542、KD548、KD555和KD559，靶分子TNFα与筛选Kringle域变体KDT01、KDT02、KDT08和KDT26交叉反应的定量分析。 [0104] 图22-图27显示了通过竞争性ELISA，针对靶分子如TRAIL的抗DR4和抗DR5筛选Kringle域变体每个结合位点的分析，以比较抗DR4和抗DR5Kringle域变体的结合位 点。 [0105] 图28显示了野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2、抗DR4Kringle域变体、KD413和KD415、抗DR5Kringle域变体、KD506和KD548、以及抗TNFαKringle域变体KDT26的通 过应用圆二色性(CD)的二级结构分析结果。 [0106] 图29显示了基于Kringle域的抗DR4、抗DR5以及抗TNFα蛋白质骨架变体在热力学应力下应用ELISA的结合活性分析结果。 [0108] 图31-图34为显示了Kringle域变体和人类抗体IgG1的Fc域的融合结构示意图，并显示了SDS-PAGE以及HPLC结果，表明融合结构以二聚体形式存在。 [0109] 图35-图39显示了抗DR4、抗DR5以及抗TNFαKringle域变体与Fc融合的抗DR4、抗DR5以及抗TNFαKringle域变体，通过亲和性ELISA的结合亲和力测量结果。 [0110] 图40-图46显示了应用MTT法的分析结果，表明细胞死亡在细胞系HCT116(图40)、H460(图41)、U87MG(图42)、HepG2(图43)、Jurkat(图44)以及HL60(图45)中， 通过抗DR4KD413、KD415、KD413-Fc和KD415-Fc Kringle域变体(0.001～5μM)，以及抗 DR5KR506、KD548、KD506-Fc和KD548-Fc Kringle域变体(0.001～5μM)以浓度依赖方式 诱导，基于Kringle域的抗DR4和抗DR5蛋白质骨架变体中，在Fc Kringle域变体培养60 小时后，全部具有生物活性。野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2和TRAIL用作对照物 (图46)。 [0111] 图47-图48显示了MTT测定的结果，表明基于Kringle域的抗DR4和抗DR5蛋白质骨架变体诱导的细胞死亡被纯化的DR4和DR5抑制。 [0112] 图49-图54显示了应用FACS，以实施例6描述的方法，测量抗DR4和抗DR5Kringle域变体KD413、KD415、KD506和KD548与BJAB细胞系(人类B淋巴细胞，B淋 巴瘤)、DR5完全失活的BJAB DR5-/-细胞系、H460细胞系以及DR4过表达的H460细胞系 细胞表面DR4和DR5结合水平的结果。 [0113] 图55显示了应用FACS分析具有膜联蛋白V-FITC和PI染料的Jurkat和HL60细胞系获得的结果。 [0114] 图56-图57显示了在肿瘤接种后，野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2、抗DR4和抗DR5Kringle域变体KD413和KD548、以及TRAIL被直接注射入肿瘤，每两天测量肿瘤体 积所获得数据以及提取的肿瘤的数据。 [0115] 图58-图59显示了鉴定抗TNFαKringle域变体体外或体内生物活性所获得的结果。图58显示了评估野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2、抗TNFαKringle域变体、 KDT26和KDT26-Fc、以及英夫利昔单(infliximab)抗抑制TNFα介导的WEHI 164细胞系 细胞死亡的结果。图59显示了阐明TNFα介导的人类IgG英夫利昔单抗毒性体内抑制的 log-rank(Mantel-Cox)检验，KDT26-Fc作为对照。P值标示于右边。 [0116] 图60-图64显示了通过以(G4S)4连接子连接抗DR4Kringle域变体，KD413以及KD415、抗DR4Kringle域变体KD506以及KD548、抗TNFαKringle域变体KDT26而构建的同 型二聚体的示意图，而且还表现了以ELISA检测的同型二聚体对靶分子的亲和性。 [0117] 图60显示了构建的同型二聚体的示意图。图61显示了以ELISA检测的抗DR4KD413和KD415同型二聚体对靶分子DR4的亲和性。图62显示了以ELISA检测的抗 DR5KD506和KD548同型二聚体对靶分子DR5的亲和性。图63显示了以ELISA检测的抗 TNFαKDT26同型二聚体对靶分子TNFα的亲和性。 [0118] 图64-图68显示了通过以(G4S)4连接子连接抗DR4Kringle域变体，KD413以及KD415与抗DR5Kringle域变体，KD506而构建的异源二聚体的示意图，而且还表现了以 ELISA检测的异源二聚体对靶分子的亲和性。 [0119] 图64显示了构建的异源二聚体的示意图。 [0120] 图65显示了KD413-KD415异源二聚体对靶分子DR4的亲和性，图66显示了KD413-KD506异源二聚体对靶分子DR4的亲和性，图67显示了通过ELISA检测的 KD413-KD506异源二聚体对靶分子DR5的亲和性。图68是以夹心(sandwich)ELISA检测的 KD413-KD506结合DR4和DR5的图片。 [0121] 图69显示了被选择针对每个靶分子的Kringle域变体的结合环的分析。简要地，Kringle域变体的每个环以野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2的氨基酸序列回复突变 (back-mutated)，然后在酵母细胞表面表达，对DR4、DR5、DcR1、DcR2以及TNFα的结合活 性通过液式细胞计检查，然后以MFI(平均荧光强度)分析结合水平。 [0122] 图70显示了嫁接入Kringle域变体的环的实施例作为示意图。例如，该图显示了Kringle域的环5和6被嫁接入三维立体结构反方向的环3和4，且环结构基本相似于环5 和6。 [0123] 图71-图73是以夹心(sandwich)ELISA检测的，构建作为二价单体的Kringle域变体KD413-4，以及构建作为结合靶分子的双特异单体Kringle域变体KD506-4以及 KD413-5的定量结果。图71是抗DR4二价单体KD413-4同时结合涂覆在底部的靶分子DR4 以及可溶性DR4的结果。图72是抗DR4/DR5双特异性单体KD413-5同时结合涂覆在底部 的靶分子DR4以及可溶性DR5的结果。图73是抗DR4/DR5双特异性单体KD506-4同时结 合涂覆在底部的靶分子DR5以及可溶性DR4的结果。KD413L56、KD506L567以及KD548L56 用作对照物，分别地并以夹心(sandwich)ELISA证实其不是二价或双特异的。 实施例 [0124] 在下文中，更详细地描述本发明的非限制实施例。 [0125] 实施例1：人类Kringle域的氨基酸序列及结构的特点 [0126] 39种具有不同氨基酸序列的Kringle域分布于31种人类蛋白质中(参见：Prosite(Hulo N.，et al.，Nucleic Acids Res，36：D245-249，2008；Website：http:// kr.expasy.org/prosite/；SMART(Letunic I.，et al.，Nucleic Acids Res，34： D257-D260，2006；Website：http://smart.embl-heidelberg.de/)(Castellino，et al.，J Mol Evol，26：358-369，1987；Ikeo，et al.，J Mol Evol，40：331-336，1995)。含有Kringle域的典型实例包括载脂蛋白A(38个Kringle域)、凝血因子XII(1个Kringle域)、肝细胞 生长因子(HGF，4个Kringle域)、肝细胞生长因子样蛋白(4个Kringle域)、肝细胞生长 因子激活物、血纤维蛋白溶酶原(5个Kringle域)、凝血酵素(2个Kringle域)、组织型血 纤维蛋白溶酶原激活物(TPA，2个Kringle域)、以及尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活物(1 个Kringle域)。 [0127] 图1显示了存在于人类的39种具有不同氨基酸序列的Kringle域的保守氨基酸序列。如图1所示，每个Kringle域由约80个氨基酸组成，6个保守的半胱氨酸位于特定位 置，并且不同的非保守氨基酸分布于其它位置(Cao，et al.，Curr.Med.Chem.12：667-681， 2002)。氨基酸以5种颜色表示，取决于其保留率，每个氨基酸位点的所有其它氨基酸均予 以表示。结果表明，各种异常的氨基酸存在于氨基酸序列的较低保守区域。这表明可以保 留赋予Kringle域典型结构稳定性的氨基酸序列(例如，3个细胞内二硫键(以1-6、2-4和 3-5二硫键模式)及其周围的保守氨基酸残基)，并构建在具有相对较低保守氨基酸位点的 氨基酸组合库。 [0128] 图2显示了具有最保守氨基酸残基及其保留率的源于人类的Kringle域。100％保守残基是半胱氨酸(Cys1、Cys22、Cys51、Cys63、Cys75和Cys80)及周围提供Kringle域结 构稳定性的残基。大多数位于其它位点的氨基酸具有超过40％或70％的保留率，第35个 最保守氨基酸残基是甘氨酸，其保留率约为35％。典型Kringle域的2维结构以其6个保 守半胱氨酸残基间的二硫键为特征，并具有1-6、2-4以及3-5二硫键结合模式。更确切地 说，二硫键结合模式在半胱氨酸1和80之间、半胱氨酸22和63之间以及半胱氨酸51和75 之间形成(Ikeo，et al.，J Mol Evol，40：331-336，1995；Castellino，et al.，Ciba Found Symp，212：46-60，1997；Marti，et al.，Biochemistry，38：15741-15755，1999)。6个保守半胱氨酸用于形成3个二硫键，其增强Kringle域的结构稳定性(Magnusson，et al.，Leiden Universitaire Pers.pp.25，1975)。 [0129] 图3显示了基于(PDB ID＝1I5K)血纤维蛋白溶酶原Kringle域2三级结构的具有较低保守氨基酸序列的7个环。在此，图3a和图b显示了血纤维蛋白溶酶原Kringle 域2的二级结构和3个二硫键，图3c和图d显示了血纤维蛋白溶酶原Kringle域2的表 面。为开发对各种靶分子具有高亲和力和高特异性的蛋白结构骨架，如抗体的互补决定区 (CDR)，最理想的是应用具有柔性环结构的蛋白，所述环结构包含赋予结构稳定性的恒定氨 基酸区，并且其周围区域的氨基酸可能突变。在这方面，基于Kringle域折叠，确定了环1 到环7的可导入各种氨基酸组合的区域。环1到环7分别由残基2至13(环1)、残基14 至21(环2)、残基23至36(环3)、残基37至50(环4)、残基52至62(环5)、残基64至 74(环6)、残基76至79(环7)组成。血纤维蛋白溶酶原Kringle域2具有约26％的β折 叠结构，约13％的β转角，约15％的31螺旋结构，以及约6％的310螺旋结构，提示血纤维 蛋白溶酶原Kringle域2具有不规则环的结构特征(Marti DN，et al.，Biochemistry，38： 15741-15755，1999)。 [0130] 实施例2：基于Kringle域的变体单体融合以构建低聚物的方法，制备多特异性低聚物的方法以及与标记分子融合的构建方法 [0131] 图4显示了在构建基于Kringle域的蛋白质骨架库以及分离特异性结合靶分子的蛋白质骨架单体之后的蛋白质骨架单体的应用。图4a显示了蛋白质骨架单体作为结合靶 分子以控制靶分子生物活性的单体的应用，图4b显示了应用蛋白质骨架单体作为同源低 聚物或异源低聚物，如二聚体、三聚体等等的方法，其通过以连接子连接筛选的单体并组合 连接的单体使得其能以高亲和力和高特异性结合靶分子。当异源低聚物中的靶分子不同 时，异源低聚物具有同时识别靶分子A和B以重新调节靶分子生物活性的优点。当然，所述 靶分子可以不是两个，但多于两个。相应地，大量的靶分子可用于形成多特异性低聚物。构 建和生产低聚物的优点是，因亲和力效应而对靶分子的亲和力提高，并可通过结合靶分子 各个区域的单体的组合以有效调节靶分子的生物活性，并且由于低聚物的大体积，其在药 物动力学上有优势。图4c显示了基于所筛选的Kringle域与标记分子(例如，6xHis标签、 C-myc标签、锌指蛋白、卷曲螺旋型蛋白、DNA结合蛋白、酶)或抗体恒定区(Fc)融合以构建 融合蛋白的方法。因此赋予蛋白质骨架单体附加功能。当标记分子与Kringle域融合，标记 分子的特征可被附加导入Kringle域，并且融合蛋白可用于纯化、分析、显影、治疗等目的。 当抗体的恒定区与Kringle域融合，融合蛋白可用于在体内诱导具有多种生物活性的免疫 细胞，除此之外还可用于纯化和显影。同样，由于融合蛋白的大体积，其在药物动力学上有 优势。图4d显示了如上所述在结合一个或两个靶分子的所选择Kringle域变体中对结合 靶分子结合环的分析，然后结合环嫁接入不参与结合靶分子的其它环，从而赋予了新功能。 首先，当多价单体通过将靶结合环嫁接入针对相同靶分子的相同Kringle域变体的非结合 环而构建时，仅有被嫁接入的二价单体可用于诱导亲和力效应。多结合单体可用于各种因 蛋白质持续保持13kDa的分子量而不可能应用抗体的药物递送系统。其次，当多特异性单 体通过将靶结合环嫁接入针对相同或不同靶分子的相同或不同Kringle域变体的非结合 环而构建时，被嫁接入的多特异性单体可用于克服仅有靶向每个靶分子的缺点，并诱导协 同效应。同样，多特异性单体可用于各种因蛋白质持续保持13kDa的分子量而不可能应用 抗体的药物递送系统。 [0132] 实施例3：基于Kringle域结构的蛋白质骨架库的构建策略及构建 [0133] 基于实施例1所描述的人类Kringle域的氨基酸序列分析结果和结构特征，Kringle域库通过在环1至环7的区域导入氨基酸突变，但保留Kringle域的稳定结构骨架 而构建，并基于Kringle域从Kringle域库分离蛋白质骨架变体。在此，蛋白质骨架变体发 挥作用特异结合各种靶分子以调节靶分子的生物活性。为了这个目的，建立了构建Kringle 域库的策略以保持恒定氨基酸序列，其赋予Kringle域的典型结构稳定性(例如，3个细胞 内二硫键(以1-6、2-4以及3-5二硫键模式)及其它们周边的保守氨基酸残基)，并将突变 导入环结构区域，其通过二硫键和结构柔性产生，以获得各种不存在于自然界的氨基酸序 列的组合。 [0134] 图5显示了基于人类血纤维蛋白溶酶原Kringle域2，为应用特异性结合各种靶分子的蛋白结构骨架构建Kringle域库的特定策略。更确切地说，具有最高保留率并形 成具有结构重要性的二硫键的6个半胱氨酸残基(C1、C22、C51、C63、C75和C80)，在人类 Kringle域的氨基酸序列中保留。在Kringle域中形成疏水核的氨基酸同样保留(K48、N49、 Y50、C51、R52、N53、P54、D55、P61、W62、C63、F64和T65)(Marti，et al.，Biochemistry 38： 15741-15755，1999)。此外，被视为具有高保留率的氨基酸残基(G6、Y9、D10、G11、T16、G19、Q23、W25、P30、H31、H33、G34、E73、L74、P78和R79)同样保守。最后，Kringle域具有的结合活性被去除而构建仅对靶物质具有特定亲和力的蛋白结构骨架。赖氨酸(Lys)或其类似 物结合至由氨基酸残基如Y36、I37、D55、R56、E57、W62、C63、F64、R71、W72、E73和L74形成的结合位点(Marti，et al.，Biochemistry 38：15741-15755，1999)。上面所提到的氨基酸残基可被除氨基酸残基D55、W62、C63、F64、E73和L74以外的其它残基替换。结果是，突变 的氨基酸残基数为2、3、4、5、7、8、12、13、14、15、17、18、20、21、24、26、27、28、29、32、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、56、57、58、59、66、67、68、69、70、71、72、76和77。在总共 45个氨基酸残基导入突变。 [0135] 基于Kringle域结构构建蛋白质骨架库的目的在于分离以高亲和力特异性结合不同靶分子的变体。那就是说，这些Kringle域变体必须特异地结合靶分子，如生物高分子 (蛋白质/核酸/脂质/碳水化合物等)以及小分子。为了这个目的，设计构建蛋白质骨 架库，所以所述蛋白质骨架库包含添加在体细胞峰值突变(somatic hypermutation)的原 始抗体上的氨基酸Tyr、Ser和Arg，并且可能形成分子间非共价键(氢键、离子键、疏水键 等等)的氨基酸可被导入每个突变位点。为了这个目的，交替导入的三联体NMC和VRG诱 导在Kringle域的每个残基上的氨基酸突变。三联体VRG编码第一个V(V＝A、C或G)，第 二个R(R＝A或G)以及第三个G。三联体VRG可被5个氨基酸残基Gln(1/5插入概率)、 Arg(2/5插入概率)、Lys(1/5插入概率)、Glu(1/5插入概率)以及Gly(1/5插入概率)所 替换。三联体NMC编码第一个N(N＝A、T、C或G)、第二个M(M＝A或C)以及第三个C。在 此，三联体NMC可被8个氨基酸残基Ser(1/8插入概率)、Tyr(1/8插入概率)、Pro(1/8插 入概率)、His(1/8插入概率)、Thr(1/8插入概率)、Asn(1/8插入概率)、Ala(1/8插入概 率)以及Asp(1/8插入概率)以相同概率替换。由于这种构建氨基酸替换库的策略可用于 替换具有不同物理化学特性的氨基酸，其可以赋予基于Kringle域的蛋白质骨架库特异性 结合各种靶分子的能力。 [0136] 为构建Kringle域库，在此设计和应用了8种引物(表5)。这8种引物具有重叠区域，并全都具有55℃或更高的熔点(Tm)。这8种引物(序列号：1到8)用于执行重叠 PCR，从而构建Kringle域结构库表达载体(图6)(Lee HW，et al.，Biochem Biophys Res Commun，343：896-903，2006)。为扩增Kringle域库的基因，应用了正向引物(序列号：9) 和反向引物(序列号：10)。 [0137] 为将人类Kringle域库转化为酵母，应用酵母表面表达载体和同源重组机制，将扩增的人类Kringle域表达载体(10μg/μl)和人类Kringle域/酵母表面表达载体 (pCTCON，Colby，et al.，Methods enzymol，388：248-258)(1μg/μl)混合，电穿孔进入酵母细胞十次以构建库(Lee HW，et al.，Biochem Biophys Res Commun，343：896-903，2006； Kim YS，et al.，Proteins：structure，function，and bioinformatics，62：1026-1035， 6 2006)。Kringle域库的大小通过连续稀释库确定为2×10 细胞，在选择性培养基中培养库 并计算生长的菌落。 [0138] 表5 [0139] [0140] 用于构建Kringle域库的寡核苷酸DNA序列如表5所列。 [0141] 实施例4：基于Kringle域结构的蛋白质骨架库分析 [0142] 为确定蛋白质骨架库(其中血纤维蛋白溶酶原Kringle域2基因被构建作为骨架)是否如上所设计的构建，随机地从构建的酵母库中回收构建的酵母表面表达载体以 分析插入Kringle域的核苷酸序列(Lee HW，et al.，Biochem Biophys Res Commun，343： 896-903，2006；Kim YS，et al.，Proteins：structure，function，and bioinformatics，62： 1026-1035，2006)。核苷酸序列应用正向引物(序列号：11＝5′-GTT CCA GAC TAC GCT CTG CAG G-3′)和反向引物(序列号：12＝5′-GAT TTT GTT ACA TCT ACA CTG TTG-3′) 进行分析，并且其氨基酸序列通过标准代码的方式确定。Kringle域库的核苷酸序列被证实 为序列号：13，如所需库构建方法中所确定的。从Kringle域库随机选择克隆的DNA序列， 确定克隆的DNA序列为序列号：14到18。序列号：14到18包含在Kringle域库的核苷酸 序列中，并通过分析Kringle域库的一些核苷酸序列证实Kringle域库按上面的设计构建。 [0143] 表6 [0144] [0145] 基于Kringle域结构构建的蛋白质骨架库的DNA序列如表6所示。 [0146] 实施例5：各种靶分子的制备 [0147] 调查了实施例4中从基于Kringle域结构的蛋白质骨架库中构建的特异性结合各种靶分子的单体是否被分离和筛选。源于人类细胞死亡受体5(TRAIL受体2，在下文中称为 ‘在下文中)、细胞死亡受体4(TRAIL受体1，在下文中称为‘在下文中)以及TNFα用作模 型靶分子。 [0148] 靶分子(DR4、DR5和TNFα)的表达和纯化已经在本申请人已发表的论文中详细描述(Lee HW.et al.，Biochem Biophys Res commun，330：1205-1212；Kim MS.et al.，J Mol Biol，374：1374-1388，2007)。就靶分子DR4来说，DR4的细胞外域(氨基酸残基1-216) 应用限制性酶NheI/HindIII在框架内(in frame)克隆为细菌表达载体(Lee HW.et al.， Biochem Biophys Res commun，330：1205-1212)。在这种情况下，细菌表达载体被设计为含有T7启动子-DR4-6xHis标签(pCRT7NT-TOPO)。就靶分子DR5来说，DR5的细胞外域(氨 基酸残基1-130)应用限制性酶NheI/XhoI在框架内克隆为细菌表达载体(Lee HW.et al.， Biochem Biophys Res commun，330：1205-1212)。在这种情况下，细菌表达载体被设计为含有T7启动子-DR5-6xHis标签(pET21b，(Invitrogen，USA))。就靶分子TNFα来说，TNFα 的细胞外域(氨基酸残基1-157)应用限制性酶NheI/HindIII在框架内克隆为细菌表达载 体(Kim MS.et al.，J Mol Biol，374：1374-1388，2007)。在这种情况下，细菌表达载体被设计为含有T7启动子-TNFα6xHis标签(pET23d，Invitrogen，USA)。 [0149] 所有的靶物质应用相同方法表达。在37℃培养大肠杆菌细胞直至OD600值达到约0.6。然后，1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，SIGMA-ALDRICH Co.，USA)加入至 大肠杆菌细胞以便于蛋白质表达，并且大肠杆菌细胞随后在30℃进一步培养10小时。通 过离心分离机(Mega21R，(Hanil，orea))收集大肠杆菌细胞并应用超声波(SONICS，Vibra TM Cell ，USA)匀浆。通过离心分离机(Mega 21R，(Hanil，Korea))仅获取无匀浆大肠杆菌上 层清液，通过特别有效地纯化His-标签蛋白的Talon树脂(Clontech，Inc.，USA)纯化靶物 质。当纯化的靶物质在SDS-PAGE上电泳时，DR4、DR5和TNFα分别具有约16kDa、16kDa以 及17kDa的分子量，并以90％或更高纯度纯化。 [0150] 为确定纯化靶物质，如DR4、DR5和TNFα的活性，通过应用质子表面共振(surfacePlasmon resonance)(SPR)技术 (Biacore2000，GE Healthcare Co.，United Kingdom) 确证对TRAIL的亲和力来测定DR4和DR5的活性，并通过确证对REMICADE(infliximab， Centocor，Inc.，USA)的亲和力来测定TNFα的活性。 [0151] 实施例6：从基于Kringle域结构的蛋白质骨架库中分离特异性结合各种靶分子的单体(筛选抗DR4、抗DR5以及抗TNFαKringle域) [0152] 为筛选对来源于Kringle域库的靶物质DR4、DR5和TNFα具有高特异亲和力的TM Kringle域，实施例5所纯化的靶物质DR4、DR5和TNFα，应用EZ-LINK Sulfo-NHS-LC-生 物素标记试剂盒Biotinylation kit(Pierce Inc.，USA)生物素化，并随后在37℃与表达在 酵母细胞表面的Kringle域库反应1小时。与生物素化靶物质反应并表达在酵母细胞表面 TM 的Kringle域库，在4℃与Anti-Biotin MACIBead (130-091-147，Miltenyi Biotec Inc.， Germany)反应20分钟，并最后在酵母细胞表面应用免疫磁性分离(MACS)方法(浓缩)，在 表达对靶物质DR4、DR5和TNFα高亲和性的Kringle域的酵母中浓化。然后，MACS方法连 续进行三次，之后连续执行荧光激活细胞分选术(FACS)方法三次。FACS方法如下述的执 TM 行。从细菌纯化的靶物质DR4、DR5和TNFα应用EZ-LINK Sulfo-NHS-LC-生物素标记试 剂盒Biotinylation kit(Pierce Inc.，USA)生物素化。然后，PE结合的抗生蛋白链菌素 (抗生蛋白链菌素-R-藻红蛋白轭合物(conjugate)(SA-PE)，分子探针(Eugene，USA))再 次分别地黏附靶物质，获得的靶物质应用荧光激活细胞分选术(FACS)方法进行分析。 [0153] Kringle域库首先黏附源于小鼠的抗c-myc 9e10mAb(Ig Therapy，Korea)，所以其可以带有c-myc标签表达于酵母细胞表面，其次以FITC结合的抗小鼠抗体(mAb，Sigma)染 色，因而可以测量Kringle域库的表达水平。 [0154] 为使Kringle域变体库顺次进行MACS和FACS法，以筛选对靶物质DR4、DR5和TNFα具有高特异性亲和力的Kringle域变体克隆，执行了每一个MACS和FACS法，并应用 FACS分析对100nM生物素化靶分子的亲和力。同样，作为对照，分析了对血纤维蛋白溶酶原 Kringle域2和筛选前蛋白质骨架库的亲和力。 [0155] 通过上面提到的高速筛选方法浓化每个靶分子的高亲和力/特异性克隆，并最终获得各个克隆(Lee HW.et al.，Biochem Biophys Res commun，330：1205-1212；Kim MS.et al.，J Mol Biol，374：1374-1388，2007)。 [0156] 分离了对靶分子DR4具有高特异亲和力的Kringle域变体克隆KD404、KD408、KD409、KD413、KD415、KD421、KD437、KD445、KD456和KD459。 [0157] 分离了对靶分子DR5具有高特异亲和力的Kringle域变体克隆KD502、KD503、KD505、KD506、KD537、KD542、KD548、KD555、KD558和KD559。 [0158] 分离了对靶分子TNFα具有高特异亲和力的Kringle域变体克隆KRT01、KRT02、KRT08和KRT26。 [0159] 从对靶分子具有高特异性亲和力的酵母克隆中回收质体以确定Kringle域变体的DNA序列和氨基酸序列。应用正向引物(序列号：11)和反向引物(序列号：12)分析DNA 序列，并通过标准代码的方式确定氨基酸序列。 [0160] 关于每个靶分子DR4、DR5和TNFα筛选的各个克隆的氨基酸序列和保守氨基酸序列如表6所示。根据Kringle域库构建物的构建策略，当氨基酸随机突变时，每个氨基酸在 X位点上出现的概率为12.5％，在Z位点出现的概率为16.7％(图4)。然而，存在非随机 突变但具有高概率突变倾向的氨基酸位点如表6所列。 [0161] 基于Kringle域变体的氨基酸序列分析，分析了抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域变体的N-糖基化。结果是，KD404Kringle域变体具有一个N-糖基化位点。基于Kringle 域变体氨基酸序列分析而分析的抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域变体的等电点(pI)， 在所有克隆中处于约pH8.0的范围内(Expasy assay，Webpabe：www.expasy.org)。 [0162] 实施例7：基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5和抗TNFα蛋白质骨架变体的表达与纯化 [0163] 在基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体中，抗DR4变体(KD404，KD408，KD409，KD413，KD415，KD421，KD437，KD445，KD456和KD459)、抗DR5变体(KD502，KD503，KD505，KD506，KD509，KD537，KD542，KD548，KD555和KD559)、以及抗TNFα变体(KDT26，KDT01， KDT02和KDT08)在框架内(in frame)分别利用限制性酶NheI/BamHI克隆为毕赤酵母表达 载体(pPICZaA，Invitrogen，USA)。在这种情况下，毕赤酵母表达载体被设计为含有AOX3启 动子-Mfa-分泌靶序列-Kringle域-myc标签-6X His标签(pPICZaA，Invitrogen，USA)。 [0164] 所述表达如下执行。酵母(毕赤酵母Pichia pastoris-GS115，Invitrogen，USA)于30℃在BMGY培养基(缓冲的甘油复合物，1％酵母提取物(Becton，Dickinson and Company，USA)+2％蛋白胨(Becton，Dickinson and Company，USA)+1.34％酵母氮 碱(Becton，Dickinson and Company，USA)+100mM pH 6.0磷酸钾(SIGMA-ALDRICH Co.， USA)+1％甘油(BIO BASIC Inc.，Canada))中培养至OD600值达到约15-20，并进一步在BMMY 培养基(缓冲的甲醇复合物，1％酵母提取物(Becton，Dickinson andCompany，USA)+2％ 蛋白胨(Becton，Dickinson and Company，USA)+1.34％酵母氮碱(Becton，Dickinson and Company，USA)+100mM pH 6.0磷酸钾(SIGMA-ALDRICH co.，USA)+0.5％甲醇(Merck & Co.， Inc.USA))中培养3天，但每24小时向培养基中加入0.5％甲醇用于蛋白质表达。表达的 蛋白质从上清液中纯化，在此应用了特别有效地纯化6纯化，在标签蛋白质的Talon树脂 (resin)(Clontech，Inc.，USA)。 [0165] 图7-图12显示了有关靶分子DR4的筛选Kringle变体克隆KD404、KD408、KD409、KD413、KD415、KD421、KD437、KD445、KD456和KD459，有关靶分子DR5的筛选Kringle变体 克隆KD502、KD503、KD505、KD506、KD509、KD537、KD542、KD548、KD555和KD559，以及有关靶分子TNFα的筛选Kringle变体KDT01、KDT02、KDT08和KDT26的纯化，以及所筛选Kringle 变体克隆在还原状态(图7、图9和图11)或非还原状态(图8、图10和图12)下在15％ SDS-PAGE上的分析。Kringle域以98％或更高纯度纯化。所有纯化的Kringle域在还原和 非还原SDS-PAGE中显示出约13kDa的分子量。这提示表达和纯化的Kringle域以单体形 式存在于溶液中而不通过人工二硫键方式形成二聚体或低聚物。应用Bradford法和BCA 法定量Kringle域的浓度和量。 [0166] 图13-图15显示了为确证抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域是否以单体形式存在，应用高效液相层析法(HPLC，The Agilent 1200Series LC Systems and Modules， TM Agilent，USA)的分子量排阻层析(Superdex 20010/300GC，GE Healthcare，Sweden)实验 结果。应用PBS(pH7.4，137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl，SIGMA-ALDRICH co.，USA)作为洗脱缓冲液，并且其流速为0.5ml/分钟。白蛋白(66kDa)、卵白蛋白(45kDa)、糜蛋白酶 原(25kDa)以及核糖核酸酶A(13.7kDa)用作蛋白质大小标准参照物。由于在所有Kringle 变体克隆中观察到一个顶点，揭示了抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域以单体形式存在。 [0167] 实施例8：基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体对抗DR4、抗DR5和抗TNFα的亲和力、交叉反应性的测量以及结合位点分析 [0168] 为测量基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5和抗TNFα蛋白质骨架变体对靶分子的亲和力与交叉反应性，执行了酶联免疫吸附试验(ELISA)。靶分子DR4、DR5、TNFα和 DcR1、DcR2通过其在37℃反应1小时被吸附至96孔EIA/RIA板(COSTARCorning In.，USA)， 以0.1％PBST(0.1％Tween20，pH 7.4，137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl，SIGMA-ALDRICH Co.，USA)10分钟洗涤3次。靶分子在1％PBSB(1％BSA，pH 7.4，137mM NaCl，10mM磷酸 盐，2.7mM KCl，SIGMA-ALDRICH Co.，USA)中吸附至96孔EIA/RIA板1小时，然后以0.1％ PBST(0.1％Tween 20，pH 7.4，137mM NaCl，10mM磷酸盐，2.7mM KCl，SIGMA-ALDRICH Co.，USA)10分钟洗涤3次。然后，结合抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域变体，并以0.1％ PBST 10分钟洗涤3次。抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域变体首先结合源于小鼠的抗 c-myc9e10mAb(Ig Therapy，Korea)，其次结合碱性磷酸酶(AP)结合的抗小鼠mAb(Sigma)。 每种Kringle域变体与棕榈酸对硝基苯酯(pNPP，Sigma-aldrich Co.，USA)反应并定量在 405nm的吸光度。 [0169] 图16-图18显示了通过ELISA定量分析筛选到靶分子DR4的KD404、KD408、KD409、KD413、KD415、KD421、KD437、KD445、KD456、KD459Kringle变体克隆的亲和力，筛选到靶分子DR5的KD502、KD503、KD505、KD506、KD509、KD537、KD542、KD548、KD555、KD559Kringle变体克隆的亲和力，筛选到靶分子TNFα的KDT01、KDT02、KDT08、KDT26Kringle变体克隆的 亲和力。图16显示了通过ELISA定量分析所筛选克隆对靶分子DR4亲和力。在292nM至 3794nM的水平测量亲和力。图17显示了通过ELISA定量分析所筛选克隆对靶分子DR5的 亲和力。在294nM至5396nM的水平测量亲和力。图18显示了通过ELISA定量分析所筛选 克隆对靶分子TNFα的亲和力。在29nM至3829nM的水平测量亲和力。 [0170] 图19-图21显示了通过ELISA定量分析筛选到靶分子DR4的KD404、KD408、KD409、KD413、KD415、KD421、KD437、KD445、KD456、KD459Kringle域变体克隆的交叉反应性，筛选到靶分子DR5的KD502、KD503、KD505、KD506、KD509、KD537、KD542、KD548、KD555、KD559Kringle域变体克隆的交叉反应性，以及筛选到靶分子TNFα的KDT01、KDT02、KDT08、 KDT26Kringle域变体克隆的交叉反应性。图19显示了通过ELISA定量分析所靶分子DR4 对筛选克隆DcR1、DcR2、DR4和DR5的交叉反应性。大多数克隆特异性结合靶分子DR4。 KD404Kringle变体克隆与DcR1和DR5具有很强的交叉反应性，KD449Kringle变体克隆与 其它靶分子具有较弱的交叉反应性。这表明，由于大多数对于DR4的筛选Kringle域变体仅 结合靶分子但与其它分子不具有结合亲和力或弱结合其它分子的，它们没有交叉反应性。 图20显示了通过ELISA定量分析靶分子DR5对筛选克隆DcR1、DcR2、DR4和DR5的反应性。 大多数克隆特异性结合靶分子DR5。KD542、KD548和KD559Kringle变体克隆与其它靶分子 具有交叉反应性。这表明，由于大多数对于DR5筛选的Kringle域变体仅结合靶分子但与 其它分子不具有结合亲和力或弱结合其它分子的，它们没有交叉反应性。图21显示了通过 ELISA定量分析在TNFα上克隆DR4和DR5，靶分子TNFα对筛选克隆KDT01、KDT02、KDT08 和KDT26的反应性。所有的抗TNFαKringle域变体特异性结合靶分子TNFα。这表明由于 大多数对于TNFα筛选的Kringle域变体仅结合靶分子但与其它分子不具有结合亲和力或 弱结合其它分子的，它们没有交叉反应性。 [0171] 图22-图27显示了通过竞争性ELISA分析靶分子对筛选的Kringle域变体，如TRAIL每个结合位点，以比较抗DR4和抗DR5Kringle域变体的结合位点。图22、图23、图24 和图25显示了应用竞争性ELISA分析TRAIL、抗DR4以及抗DR5Kringle域变体结合位点的 结果。图22显示了抗DR4Kringle域变体KD413具有与TRAIL不同的结合位点。图23显示 了抗DR4Kringle域变体KD415具有与TRAIL不同的结合位点。图24显示了抗DR5Kringle 域变体KD506具有与TRAIL不同的结合位点。图25显示了抗DR5Kringle域变体KD548具 有与TRAIL不同的结合位点。图26显示了抗DR4Kringle域变体KD413和KD415并不共享 对相同靶分子的结合位点。图27显示了抗DR5Kringle域变体KD506和KD548并不共享对 相同靶分子的结合位点。 [0172] 实施例9：基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5和抗TNFα蛋白质骨架变体的二级结构分析及其热力学稳定性评估 [0173] 远-UV CD光谱(190-260nm)被用于分析针对靶分子的基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5以及抗TNFα蛋白质骨架变体的二级结构。每个基于Kringle域结构的抗DR4、 抗DR5以及抗TNFα蛋白质骨架变体以100μg/ml的浓度置于0.1cm石英试杯(quartz cuvette)的PBS(pH 7.4)中，并引用J-715分光偏振计(Jasco Inc.，Japan)，在190nm至 260nm的波长范围内每0.5nm测量一次。PBS缓冲液(pH 7.4)用作对照物以校正图表，测 量四次以获得平均图表。 [0174] 图28显示了应用圆形二色性(circular dichroism，CD)分析野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2、抗DR4Kringle域变体KD413和KD415、抗DR5Kringle域变体KD506和 KD548、抗TNFαKringle域变体KDT26二级结构的分析结果。所筛选的Kringle域变体显 示出与野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2相似的光谱，并在波长202至205nm范围内 具有最大负峰值以及在220nm具有弱负转折点。这些CD光谱揭示，所筛选的Kringle域变 体具有典型随机结构以及弱折叠结构。CD光谱还揭示了，尽管在Kringle域变体的大环区 域导入很多突变，Kringle域变体保持了它们相似于野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2 的二级结构。 [0175] ELISA以及差示扫描量热仪(DSC)被用于评估针对靶分子的基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5以及抗TNFα蛋白质骨架变体的热力学稳定性。为评估热动应力在针对靶 分子的基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5以及抗TNFα蛋白质骨架变体的结合活性上的 影响，连续14天每天在基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5以及抗TNFα蛋白质骨架变体 上在37℃和50℃交替施加热动应力。应用ELISA，以实施例8中所描述的相同方式，测量经 受热动应力的基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5以及抗TNFα蛋白质骨架变体的结合活 性。图29显示了应用ELISA，测量基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5以及抗TNFα蛋白 质骨架变体在热动应力下结合活性的结果。结果揭示了抗DR4、抗DR5以及抗TNFα蛋白质 骨架变体与其原始结合活性相比，具有84％或更高的结合活性。 [0176] 为确证基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5以及抗TNFα蛋白质骨架变体在热动应力下保持其结合活性的事实，应用差示扫描量热仪(DSC)分析了抗DR4、抗DR5以及抗 TNFα蛋白质骨架变体的最大热容温度(Tm)。在4℃至90℃的温度范围内以1℃/min的速 率测量蛋白质骨架变体的热力学变性。测量值应用相同组成的缓冲液校正，但缓冲液中不 含有Kringle域变体。测量基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5以及抗TNFα蛋白质骨 架变体的最大热容温度并转化为功能比热(在恒定压力下的最大热容，Cp)温度(Chang Y。 et al.，Biochemistry36(25)：7652-7663)。 [0177] 图30显示了野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2与基于Kringle域结构的抗DR4、抗DR5以及抗TNFα蛋白质骨架变体的示差扫描热量结果，及其最大热容温度。野生 型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2，抗DR4Kringle域变体KD413、KD415，抗DR5Kringle域 变体KD506、KD548以及抗TNFαKringle域变体KDT26的最大热容温度如下：分别为，野 生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2(49.8℃)，抗DR4Kringle域变体KD413(50.5℃)、 KD415(46.7 ℃)，抗 DR5Kringle域 变 体 KD506(49.8 ℃)、KD548(57.2 ℃ )以 及 抗 TNFαKringle域变体KDT26(51.9℃)。图30显示了尽管Kringle域变体的环区域大范围 引入许多突变，Kringle域变体具有相似于野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2的热力 学稳定性。 [0178] 实施例10：Fc融合的抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域的表达和纯化 [0179] 在实施例7所描述的基于Kringle域结构的蛋白质骨架变体中，来源于人类免疫球蛋白G1铰链区的Fc域，通过应用限制性酶AflII/XbaI，在框架内(in frame)克隆入包 含抗DR4变体(KD413和KD415)、抗DR5变体(KD506和KD548)和抗TNFα变体(KDT26)的 毕赤酵母表达载体(pPICZaA，Invitrogen，USA)。 [0180] 所述表达以实施例7所描述的相同方式进行。从上清液中纯化靶蛋白，并应用纯化Fc蛋白特别有效的蛋白A-凝胶(Sepharose)FF柱(rProtein A-Sepharose FF column， GE Healthcare，USA)。 [0181] 图31-图34显示了Kringle域变体与人类抗体IgG1Fc域的融合，并显示了表明融合结构以二聚体形式存在的SDS-PAGE和HPLC结果。图31显示了Fc融合的Kringle域 变体，并显示了Fc融合Kringle域变体作为二价体作用。图32和图33显示了抗DR4、抗 DR5和抗TNFαFc融合Kringle变体纯化后应用15％SDS-PAGE在还原条件(图32)或非 还原条件(图33)下的分析结果。Fc融合Kringle域纯化为98％或更高纯度。所有纯化 的Kringle域在还原SDS-PAGE显示约38kDa的分子量并在非还原SDS-PAGE显示约76kDa 的分子量。这表明所表达和纯化的Fc融合Kringle域在液相中以二聚体形式存在，并且二 聚体易于通过铰链区的二硫键形成。Fc融合Kringle域的浓度和量通过Bradford和BCA 方法定量。 [0182] 图34显示了为通过高效液相层析法法(HPLC，the Agilent 1200Series LCSystems and Modules，Agilent，USA)确定抗DR4、抗DR5和抗TNFαFc融合Kringle域 TM 是否以二聚体形式存在，应用分子量排阻层析(Superdex 200 10/300GC，GE Healthcare， Sweden)在抗DR4、抗DR5和抗TNFαFc融合Kringle域上的实验结果。在此，实验条件与实 施例7所述的实验条件相同。应用乙醇脱氢酶(150kDa)、卵白蛋白(45kDa)、胰凝乳蛋白酶 原(25kDa)以及核糖核酸酶A(13.7kDa)作为蛋白质的大小标准参照物。在Fc融合Kringle 变体的所有克隆中测得一个峰值，其表明Fc融合抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域以二 聚体形式存在。 [0183] 实施例11：Fc融合抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域亲和力的分析 [0184] 为分析Fc融合抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域对靶分子的亲和力，应用ELISA如实施例8所述分析Fc融合抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域对靶分子的亲和力。 [0185] 图35-图39显示了应用亲和力ELISA的测量抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域变体和Fc融合抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域变体的结合亲和力的结果。从图35-39 的ELISA结果，所测得的Fc融合抗DR4、抗DR5和抗TNFαKringle域的亲和力为：KD413-Fc 为60±8nM，KD415-Fc为53±6nM，KD 506-Fc为43±6nM，KD548-Fc为58±5nM，KDT26-Fc 为3.8±0.4nM。 [0186] 实施例12：基于Kringle域结构的抗DR4和抗DR5蛋白质骨架变体体外生物活性的鉴定 [0187] 为评估所纯化抗DR4、抗DR5Kringle域变体在癌症细胞系中的细胞死亡，TRAIL-敏感性细胞系HCT116(人类结肠癌细胞系(即结肠癌细胞)，美国菌种保藏中 心(ATCC)CCL-247)、H460(人类NSCLC细胞系(即肺癌细胞)，美国菌种保藏中心(ATCC HTB-177))、Jurkat(人类急性T细胞白血病细胞系(即血癌细胞)，ATCC TIB-152)和 HL60(人类急性早幼粒细胞性白血病细胞系(即血癌细胞)，ATCC CCL-240)、以及TRAIL耐 受细胞系U87MG(人类胶质母细胞瘤细胞系(即脑癌细胞)，ATCC HTB-14)和HepG2(人类 肝肿瘤细胞系(即肝癌细胞)，ATCC HB-8065)用作模型细胞系。抗DR4和抗DR5Kringle 域变体(0.001-5μM)以模型细胞系处理，应用MTT检测评估其细胞死亡(Park KJ.et al.， Cancer Research，67：7327-7334，2007，Orogen N.et al.，Cancer Research，60(22)： 6259-6265，2000)。 [0188] 为从培养容器(T型烧瓶)中分离粘附细胞系HCT116、H460、U87MG和HepG2，所述粘附细胞系以1ml的TE(胰蛋白酶trypsin-EDTA)缓冲液处理，然后应用加入5ml 10％胎 牛血清白蛋白(FBS，GIBCO Invitrogen Co.，USA)的Dulbecco′s改良的伊格尔(eagle) 培养基(DMEM，GIBCO Invitrogen Co.，USA)终止TE反应。然后，每种培养的粘附细胞 系在1000rpm的转速离心5分钟。收获的粘附细胞系以加入10％胎牛血清白蛋白(FBS， GIBCO Invitrogen Co.，USA)的DMEM(GIBCO Invitrogen co.，USA)重悬，以每孔1悬，以 4 细胞分入96孔板，在5％CO2培养器中在37℃培养24小时，然后用于MTT检测。浓化的 细胞系Jurkat和HL60以加入10％胎牛血清白蛋白(FBS，GIBCO Invitrogen Co.，USA)的 RPMI1640(Dulbecco′s改良伊格尔(Eagle)培养基(Welgene，USA))重悬，以每孔1悬，以 4 细胞分入96孔板，在5％CO2培养器中37℃培养24小时，然后用于MTT检测。 [0189] 图40-图46显示了应用MTT检测的分析结果，表明所述细胞死亡在细胞系HCT116(图40)、H460(图41)、U87MG(图42)、HepG2(图43)、Jurkat(图44)和HL60(图 45)中，通过抗DR4KD413、KD415、KD413-Fc和KD415-Fc Kringle域变体(0.001～5μM) 以浓度依赖方式诱导，所述域变体在Fc Kringle域变体60小时培养后，在基于Kringle域 的抗DR4和抗DR5蛋白质骨架变体中具有生物活性。当野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle 域2(PgnKD2)处理的对照物在培养相同时间后，在对照物中未观察到细胞死亡(图46)。当 TRAIL处理的对照物在培养相同时间后，仅在TRAIL敏感细胞系HCT116、H460、Jurkat和 HL60中观察到细胞死亡(图46)。如下所述测量每个细胞系的EC50(导致50％细胞死亡 的蛋白质浓度)。在此，细胞系以HCT116、H460、U87MG、Jurkat和HL60的顺序存在。KD413 具有5.3±0.2μM、5.9±0.5μM、0.9±0.2μM、0.09±0.03μM和1.4±0.2μM的EC50值， KD415具有11.0±0.9μM、5.3±0.4μM、4.9±0.6μM、0.2±0.1μM和0.13±0.02μM的 EC50值，KD413-Fc具有0.38±0.08μM、0.22±0.06μM、0.14±0.04μM、0.06±0.01μM和 0.02±0.01μM的EC50值，KD415-Fc具有0.18±0.04μM、0.20±0.08μM、0.20±0.05μM、 0.08±0.01μM和0.06±0.01μM的EC50值，KD506具有6.3.±0.5μM、10.4±1.4μM、 5.8±0.6μM、0.2±0.1μM 和 0.21±0.01μM 的 EC50 值，KD548 具 有 9.3±0.8μM、 9.9±0.7μM、4.6±0.4μM、0.3±0.1μM和 0.26±0.02μM 的 EC50 值，KD506-Fc具 有 0.08±0.03μM、0.23±0.05μM、0.20±0.06μM、0.08±0.01μM和0.23±0.04μM的EC50 值，以及KD548-Fc具有0.52±0.06μM、0.45±0.04μM、0.40±0.06μM、0.07±0.01μM 和0.22±0.04μM的EC50值。这些结果表明，特异性筛选的Kringle域变体可特异性结 合靶分子以显示其生物活性。由于Kringle域变体针对抗原具有如实施例8所述的不同 结合位点，具有不同结合位点的Kringle域变体还可能在共同处理时具有协同效应。如图 40-图46所示，其揭示了当抗DR4Kringle域变体KD413和KD415同时处理时，由于协同效 应其具有10～100倍高的EC50值。在3个细胞系HCT116、H460和U87MG中的EC50值为 0.053±0.005μM、0.066±0.004μM和0.121±0.008μM。当抗DR5Kringle域变体KD506 和KD548共同处理时，由于协同效应其具有10～100倍高的EC50值。在3个细胞系HCT116、 H460和U87MG中的EC50值为0.021±0.002μM、0.064±0.005μM和0.142±0.012μM。 [0190] 图47和图48显示了应用MTT检测的评估结果，表明经由基于Kringle域结构的抗DR4和抗DR5蛋白质骨架变体的细胞死亡被纯化的DR4和DR5所抑制。这表明经由基于 Kringle域结构的抗DR4和抗DR5蛋白质骨架变体的细胞死亡由细胞表面的DR4和DR5诱 导。1μM的抗DR4和抗DR5Kringle域变体KD413、KD415、KD506和KD548，与DR4和DR5反 应1小时，DR4和DR5都从10μM E.coli纯化而来。然后，上面所提到的HCT116和H460 细胞系以每种抗DR4和抗DR5Kringle域变体处理，并在处理后应用MTT检测分析40小时。 野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2和TRAIL用作对照物。无论有没有DR4和DR5，野生 型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2并不诱导细胞死亡，并且，TRAIL在DR4和DR5存在时部 分抑制细胞死亡。经由抗DR4Kringle域变体KD413和KD415的细胞死亡仅被DR4所抑制。 经由抗DR5Kringle域变体KD506的细胞死亡仅被DR5所抑制。然而，由于抗DR5Kringle 域变体KD548具有对DR4和DR5的结合活性(图20)，其细胞死亡在DR4和DR5如TRAIL样 存在时部分地被DR4和DR5所抑制。 [0191] 图49-图54显示了应用实施例6所述方法中的FACS，通过测量抗DR4和抗DR5Kringle域变体KD413、KD415、KD506和KD548，对浓化的细胞系BJAB(人类B淋巴细胞， B细胞淋巴瘤)、DR5完全失活的BJAB DR5-/-细胞系、H460细胞系以及过表达DR4的H460 细胞系细胞表面的DR4和DR5结合水平所获得的结果。图49和图50显示了当DR5完全失 活时，抗DR4Kringle域变体KD413和KD415保持与细胞表面的结合水平，但抗DR5Kringle 域变体KD506和KD548特异性结合细胞表面的DR5，因为其具有下降的与细胞表面的结合水 平。图51和图52显示了当DR4过于表达时，抗DR4Kringle域结构变体KD413和KD415具 有上升的与细胞表面的结合水平，但抗DR4Kringle域结构变体KD413和KD415特异性结合 细胞表面的DR4，因为抗DR5Kringle域结构变体KD506和KD548保留了与细胞表面的恒定 结合水平。图53显示了图49和50所显示数据的制图，图54显示了图51和图52所显示 数据的制图。 [0192] 实施例13：基于Kringle域结构的抗DR4和抗DR5蛋白质骨架变体的细胞死亡机制分析 [0193] 为分析基于Kringle域结构的抗DR4和抗DR5蛋白质骨架变体的细胞死亡是否为凋亡机制，如实施例11所述，浓化的细胞系Jurkat和HL60以抗DR4和抗DR5Kringle域处 理35小时，并分别以膜联蛋白(annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI)染色，然后如实施例6所 述应用FACS测量。同样，浓化的细胞系以0.5μg/ml的(～30nM)TRAIL处理4小时作为 对照物，然后应用FACS进行分析。 [0194] 图55显示了通过以膜联蛋白(annexin)V-FITC和PI染料染色Jurkat和HL60细胞系，并应用FACS分析所述Jurkat和HL60细胞所获得的结果。当以TRAIL处理作为 对照物时，其特征在于起始凋亡，膜联蛋白(annexin)V-FITC±/PI-在Jurkat细胞系中 以39.6％的比例分布，在HL60细胞系中以39.7％的比例分布，并且抗DR4Kringle域变体 KD413在Jurkat细胞系中以17.5％的比例分布，在HL60细胞系中以35.9％的比例分布。 同样，抗DR5Kringle域变体在Jurkat细胞系中以40.6％的比例分布，并在HL60细胞系中 以21.35％的比例分布，其表明凋亡是细胞死亡机制。 [0195] 实施例14：基于Kringle域结构的抗DR4和抗DR5蛋白质骨架变体的体内生物学鉴定 [0196] 为了抗DR4和抗DR5Kringle域变体的体内生物学鉴定，每个HCT116和U87MG细6 胞系分别以每只小鼠5×10 细胞的浓度，注射入4周龄雌性BALB/c无胸腺裸鼠(CAnN. Cg-Foxnlnu/Crl，15-20g，Orientbio Inc.(Korea))右腿内。在大约7天后，当肿瘤长到约 3 50mm 时，分别以抗DR4和抗DR5Kringle域变体KD413和KD548处理7只小鼠。在此，野生 型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2和TRAIL用作对照物。所述处理每两天共进行7次，抗 DR4和抗DR5Kringle域变体KD413和KD548以及野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2以 20mg/kg的剂量直接注射到小鼠肿瘤内，TRAIL以15mg/kg的剂量直接注射入小鼠肿瘤内 (Ashkenazi A&Herbst RS J Clin Invest，118(6)：1979-1990，2008，Ashkenazi A.et al.，J Clin Invest 104(2)：155-162，1999)。肿瘤的大小通过应用测量肿瘤长度和宽度获得 2 2 的值，根据方程式0.5×(长度)×(宽度) 计算(van der Sloot AM.et al.，Proc Natl Acd Sci USA，103(23)：8634-8639，2006，Pukac L.et al.，Br J Cancer 92(*)1430-1441， 2005)。注射野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2、抗DR4和抗DR5Kringle域变体KD413 和KD548以及TRAIL的小鼠在行为、外表和体重上未显示特殊变化，在肿瘤注射23天后处 死小鼠。然后，提取肿瘤并称重。 [0197] 图56和图57显示了通过每两天测量肿瘤体积所获得的数据以及在接种肿瘤后所提取肿瘤的数据，野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2、抗DR4和抗DR5Kringle域变体 KD413和KD548以及TRAIL直接注射入肿瘤内。图56显示了由HCT116细胞系获得的结果， 图57显示了由TRAIL抗性细胞系U87MG获得的结果。这些动物实验结果表明，抗DR4和抗 DR5Kringle域变体KD413和KD548有效地抑制了TRAIL敏感细胞系HCT116和TRAIL抗性 细胞系U87MG在体内的肿瘤生长。 [0198] 实施例15：基于Kringle域结构的抗TNFα蛋白质骨架变体生物活性的评估 [0199] 野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2和英夫利昔单抗(infliximab)(Remicade Johnson & Johnson)用作对照。然后，抗TNFαKringle域变体KDT26，以及 针对人类TNFα的抗TNFαKringle域变体KDT26的Fc融合形式KDT26-Fc，在WEHI 164细 胞系中鉴定(小鼠纤维肉瘤，ATCC CRL-1751)(MinSoo，Kim.et al.，J Mol Biol 374(5)： 1374-1388，2007，MooYoung，Song.et al.，Exp Mol Med 40(1)：35-42，2008)。WEHI 164细 4 胞系以1×10 细胞/孔的浓度三倍接种入96孔板，并在添加了10％(v/v)FBS的RPMI 1640 中培养20小时。然后，向培养基中加入2μg/ml放线菌素D，然后以0.1nM到2μM的野生 型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2、抗TNFαKringle域变体KDT26和KDT26-Fc、以及英夫 利昔单抗(infliximab)处理，并培养20小时通过MTT检测以评估细胞死亡。应用Sigma plot软件(Sigma plot，SPSS Inc.)确定IC50(50％抑制浓度)。 [0200] 图58显示了评估TNFα在WEHI 164细胞系中，对野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2、抗TNFαKringle域变体KDT26和KDT26-Fc、以及英夫利昔单抗(infliximab) 细胞死亡抑制所获得的结果。英夫利昔单抗(Infliximab)、KDT26以及KDT26-Fc所测得的 IC50值分别约为2nM、0.78±0.03μM和5.2±0.7nM。 [0201] 为进行体内TNFα细胞毒性中和(neutralizing)测试，KRT26-Fc(5和25μg/小鼠)、英夫利昔单抗(infliximab)(5和25μg/小鼠)以及人类抗体对照物IgG1(Sigma) (5μg/小鼠)在无菌条件下腹膜内注射入13只6周龄C57BL/6小鼠(Orientbio)。在腹 膜内注射1小时后，0.4μg的人类TNFα和7mg D-半乳糖胺(GalN，Sigma)，其剂量被确认 为在施用12小时后具有90％的致死率，腹膜内注射入每只小鼠(MooYoung，Song.et al.， Exp Mol Med 40(1)：35-42，2008)。每6小时记录小鼠的存活率，并应用log-rank检验分 析。 [0202] 图59显示了表明TNFα调节的人类IgG1英夫利昔单抗(infliximab)毒性体内抑制以及KDT26-Fc作为对照物的log-rank(Mantel-Cox)检验。P值在右边标明。在此， 以5μg/小鼠剂量英夫利昔单抗(infliximab)注射的小鼠所测得的P值为0.0001，25μg/ 小鼠剂量英夫利昔单抗(infliximab)注射的小鼠所测得的P值为0.0001，5μg/小鼠剂量 KDT26-Fc注射的小鼠所测得的P值为0.002，25μg/小鼠剂量KDT26-Fc注射的小鼠所测得 的P值为0.0038。这表明抗TNFαKringle域变体KDT26-Fc可有效地作为动物模型。 [0203] 实施例16：应用结合相同靶分子的Kringle域骨架变体的单体制备同源低聚物的方法 [0204] 实施例2所述的同源低聚物的优点如下：因为亲和力效应，对靶分子的亲和力上升，靶分子的生物活性可被结合靶分子不同位点的单体组合有效控制，并且它们因同源低 聚物的大小比单体大而在药物动力学方面具有优势。 [0205] 同源二聚体通过在Kringle域间的连接子(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4[(G4S)4]，连接抗DR4Kringle域变体KD413和KD415、抗DR5Kringle域变体KD506和KD548以及抗 TNFαKringle域变体KDT26而构建。 [0206] 换言之，具有(G4S)4连接子的Kringle域结构同源二聚体在框架内(in frame)克隆入毕赤酵母表达载体(pPICZaA，Invitrogen，USA)，所述载体中已应用限制性酶BamHI/ AflII(图60)克隆入KD413、KD415、KD506、KD548和KDT26。在这种情况下，毕赤酵母表达 载体被设计为含有AOX3启动子-MFa-分泌信号序列-Kringle域-myc标签-6ycng标签的 序列(pPICZaA，Invitrogen，USA)。 [0207] 所构建的Kringle域同源二聚体的表达和纯化以实施例8所述的相同方式施行。 [0208] 同样，如实施例8所述进行ELISA检测以测量所构建Kringle域同源二聚体对靶分子的亲和力，并且ELISA检测的结果与Kringle域变体单体的结果相比较(图61、图62 和图63)。 [0209] 图60-图63显示了应用(G4S)4连接子连接抗DR4Kringle域变体KD413和KD415、抗DR5Kringle域变体KD506和KD548以及抗TNFα [0210] Kringle域变体KDT26而构建的同源二聚体的示意图，并且还代表了通过ELISA检测的同源二聚体对靶分子的亲和力。 [0211] 图60显示了所构建同源二聚体的示意图。图61显示了通过ELISA检测的抗DR4KD413和KD415同源二聚体对靶分子DR4的亲和力。抗DR4KD413同源二聚体的亲和力 值为43±5nM，抗DR4KD415同源二聚体的亲和力值为87±6nM。图62显示了通过ELISA检 测的抗DR5KD506和KD548同源二聚体对靶分子DR5的亲和力。抗DR5KD506同源二聚体的 亲和力值为31±3nM，抗DR5KD548同源二聚体的亲和力值为53±7nM。图63显示了通过 ELISA检测的抗TNFαKDT26同源二聚体对靶分子TNFα的亲和力。抗TNFαKDT26同源二 聚体的亲和力值为8±1nM。 [0212] 实验结果显示，当Kringle域变体单体转换为Kringle域变体同源二聚体时，由于亲和力效应，对靶分子的亲和力增加了约10倍。 [0213] 实施例17：通过连接具有不同靶结合特异性的Kringle域变体制备多特异性低聚物的方法 [0214] 如实施例16所述，应用(G4S)4连接子连接抗DR4Kringle域变体KD413和KD415、抗DR5Kringle域变体KD506构建异源二聚体。 [0215] 所构建的Kringle域异源二聚体的表达与纯化以实施例8所述的相同方式施行。 [0216] 图64-图68显示了应用(G4S)4连接子连接抗DR4Kringle域变体KD413和KD415与抗DR5Kringle域变体KD506而构建的异源二聚体的示意图，并且还代表了通过ELISA检 测的异源二聚体对靶分子的亲和力。 [0217] 图64显示了所构建的异源二聚体KD413-KD415和KD413-KD506的示意图。 [0218] 图65显示了KD413-KD415异源二聚体对靶分子DR4的亲和力，图66显示了KD413-KD506异源二聚体对靶分子DR4(左图)和DR5(右图)的亲和力，图67显示了 KD413-KD506对板-涂层(coated)DR4和可溶性DR5的亲和力，其通过夹心(sandwich) ELISA检测。如数据所示，KD413-KD415异源二聚体显示相比于其各个单体更高的亲和力， 因为它们识别DR4的不同区域(图65)。KD413-KD506异源二聚体同时结合DR4和DR5(图 66)，其通过夹心(sandwich)ELISA确认(图67)。然而，KD413仅结合DR4且KD506仅结合 DR5。 [0219] 实验结果显示，当结合不同靶分子的两个Kringle域变体连接至Kringle域变体异源二聚体时，Kringle域变体获得了双特异性。 [0220] 实施例18：特异性结合DR4、DR5或TNFα的Kringle域变体的结合环图谱 [0221] Kringle域具有如实施例1所述的7个环，并且基于Kringle域结构的蛋白质骨架库通过修饰所有7个环而构建。作为结果，抗DR4Kringle域变体KD413和KD415、抗 DR5Kringle域变体KD506和KD548以及抗TNFαKringle域变体KDT26含有可结合靶分 子的7个环。为考察7个环中哪个环涉及对靶分子的识别，抗DR4Kringle域变体KD413 和KD415、抗DR5Kringle域变体KD506和KD548以及抗TNFαKringle变体KDT26的一 些环以野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2回复突变(back-mutated)。保留环1、2、 3和4的抗DR4Kringle域变体KD413和KD415、抗DR5Kringle域变体KD506和KD548以 及抗TNFαKringle域变体KDT26Kringle域变体的氨基酸序列，并且环的其余部分具有 野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2的氨基酸序列的克隆被分别命名为KD413L1234、 KD415L1234、KD506L1234、KD548L1234和KDT26L1234。通过应用相同方法，保留环5、6和7 的Kringle域变体氨基酸序列，并且环的其余部分具有野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle 域2的氨基酸序列的克隆被分别命名为KD413L567、KD415L567、KD506L567、KD548L567和 KDT26L567。保留环5和6的Kringle域变体的氨基酸序列，并且环的其余部分具有野生型 血纤维蛋白溶酶原Kringle域2的氨基酸序列的克隆被分别命名为KD413L56、KD415L56、 KD506L56、KD548L56和KDT26L56。保留环5的Kringle域变体的氨基酸序列，并且环的 其余部分具有野生型血纤维蛋白溶酶原Kringle域2的氨基酸序列的克隆被分别命名为 KD413L5、KD415L5、KD506L5、KD548L567和KDT26L5。新构建的克隆如实施例3所详述的被 克隆入酵母表面展示载体pCTCON。 [0222] 图69显示了表达于酵母细胞表面新构建克隆对DR4、DR5、DcR1和DcR2的结合活性分析，其通过流式细胞术检测，然后以MFI(平均荧光密度)分析结合水平。KD413仅结合 DR4，不具有对其它靶分子的交叉反应性，KD413L56具有最高的对靶分子DR4的亲和力。因 此，该结果表明环5和6对于结合靶分子DR4非常重要。KD415仅结合DR4，不具有对其它靶 分子的交叉反应性，KD415L567具有最高的对靶分子DR4的亲和力。因此，该结果表明环5、 6和7对于结合靶分子DR4非常重要。KD506仅结合DR5，不具有对其它靶分子的交叉反应 性，KD506L567具有最高的对靶分子DR5的亲和力。因此，该结果表明环5、6和7对于结合 靶分子DR5非常重要。如实施例8所述，KD548同时结合DR4和DR5，KD548L56具有最高的 对靶分子DR5的亲和力。因此，该结果表明环5和6对于结合靶分子DR5非常重要。KDT26 仅结合TNFα，不具有对其它靶分子的交叉反应性，KDT26L56具有最高的对靶分子TNFα的 亲和力。因此，该结果表明环5和6对于结合靶分子DR5非常重要。 [0223] 实施例19：通过将Kringle单体的靶结合环嫁接入具有相同或不同靶特异性的Kringle域结构单体的非结合环制备多价Kringle单体或多特异性Kringle单体的方法 [0224] 在实施例18中，通过结合图谱分析，确认了所选择针对DR4、DR5和TNFα的Kringle域变体的识别环。通过将结合环嫁接入相同或不同Kringle域单体的其它不参与 或弱参与与靶分子结合的环，构建了多价Kringle单体和多特异性Kringle单体。 [0225] 在抗DR4KD413中，由于环5和6在与靶分子DR4的结合中起重要作用，KD413的环5和6被嫁接入KD413三维结构中相对起始的环3和4，如图70所示。新构建的克隆被 命名为KD413-4。进一步的，KD413的环5和6被嫁接入KD506三维结构中相对起始的环3 和4，因为在抗DR5KD506中，环5、6和7在与靶分子DR5的结合中起重要作用。新构建的克 隆被命名为KD506-4。同样，KD548的环5和6被嫁接入KD413的环3和4，生成被命名为 KD413-5的克隆。 [0226] 图70显示了Kringle域变体环嫁接的例子作为示意图。例如，该图显示了Kringle域的环5和6被嫁接入三维结构中相对起始的环3和4，并且环的结构基本相似于环5和 6。 [0227] 图71-图73是Kringle域变体KD413-4构建为结合靶分子的二价单体，且Kringle域变体KD506-4和KD413-5构建为结合靶分子的双特异性单体的夹心(sandwich)ELISA定 量结果。图71是抗DR4二价单体KD413-4同时结合板涂层(coated)的靶分子DR4和可溶 性DR4的结果。KD415L56用作对照物并且确认不存在二价结合。图72是抗DR4/DR5双特 异性单体KD413-5同时结合板涂层(coated)的靶分子DR4和可溶性DR5的结果。KD413L56 用作对照物并且确认不存在二价结合。图73是抗DR4/DR5双特异性单体KD506-4同时结 合板涂层(coated)的靶分子DR5和可溶性DR4的结果。KD506L567用作对照物并且确认不 存在二价结合。 [0228] 这些结果建议，多价单体或多特异性单体可通过将蛋白质骨架变体单体的结合环嫁接入相同或不同单体的其它环区域制备，其中所述结合环结合相同靶分子或两个或多个 不同靶分子的相同或不同位点。 |
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