不同表面密度的分子的制备和应用 |
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| 申请号 | CN200780024729.0 | 申请日 | 2007-06-29 | 公开(公告)号 | CN101583580B | 公开(公告)日 | 2012-10-31 |
| 申请人 | 高晓莲; 周小川; 张小林; 洪爱玲; 朱奇; 虞佩琳; | 发明人 | 高晓莲; 周小川; 张小林; 洪爱玲; 朱奇; 虞佩琳; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及微阵列合成的定量和数量的方面以及用微阵列作为脱离微阵列表面应用的合成分子的高容量制备器件和用微阵列作为在微阵列表面应用的分析器件。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种由两个或更多位点组成的表面功能化的方法包括： |
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| 说明书全文 | 不同表面密度的分子的制备和应用[0002] 本发明部分工作受美国国立卫生研究院经费资助(NIH，项目号：R21CA126209和R43GM076941)。 [0003] 相互参照相关应用 [0005] 发明背景发明领域 [0006] 本发明涉及微阵列合成的定量和数量的方面以及用微阵列作为脱离微阵列表面应用的合成分子的高容量制备器件和用微阵列作为在微阵列表面应用的分析器件.[0007] 本发明特别涉及到在一个微阵列的不同位点控制表面分子密度来制备一个密度变化阵列的方法。这些阵列可以用于在阵列表面或脱离表面的应用，如用于高通量定量测量蛋白结合、核酸结合及生物标志物的灵敏检测。阵列所包含的密度变化位点可用于获得分子化合物的结合和解离曲线，并且对于有精确检测需要的临床医学应用有特殊的价值。 [0008] 本发明也涉及修饰微阵列表面的领域，用于至少提高平行阵列合成分子数量至10倍以上。这些高容量阵列将在阵列表面或脱离表面的情况下应用于基因组或蛋白质组范围的检测分析。分子的修饰也提供了大量材料用于准备纳米阵列、单分子阵列、结构研究或核酸、蛋白和多聚糖的序列分析或其他类型的生物多聚物和嵌合生物多聚物、亲和纯化、药物筛选、生物标志物检测、遗传分析、核酸图谱、蛋白或其他类型的生物分子表达谱、临床诊断及病患样品分析、序列文库制备、基于微珠的核酸序列文库制备、蛋白、多肽和其他类型分子的文库制备。 [0009] 本发明也涉及到合成包含修饰分子阵列的方法。阵列上所合成的分子将在阵列表面或脱离表面应用于基因组或蛋白质组范围的分析。分子修饰将提供独特的配体阵列用于不仅可以分析蛋白质、核酸、糖，也包括细胞和细胞生物，分子修饰也提供大量的材料用于准备纳米阵列、单分子阵列的制备、核酸、蛋白质、多糖、其他类生物聚合体和嵌合生物聚合体的结构和序列分析、亲和纯化、药物筛选、生物标志物检测、遗传分析、核酸图谱、蛋白或其他类型的生物分子的表达谱、临床诊断及病患样品分析、序列文库制备、基于微珠的核酸序列文库制备、蛋白、多肽和其他类型分子的文库制备。 [0010] 相关现有技术的描述 [0011] 基因组学(在这里基因组学广泛定义为细胞分子及其相互作用相关的科目，包括核酸、蛋白、多肽、糖、脂质、代谢分子和其他功能分子)和相关科学的快速发展创造了微型化技术的需要。众所周知，每一轮在现有技术上进一步微型化都需要在方法和器件上有重大进展。当今，受人关注的人类基因组中的30亿碱基对和超过十万个蛋白及其异构体正是需要微型化技术研究的一个明显的例子。对于这么大数字的遗传密码和它们的产物，已经有大量关于对它们的分析(找出编码子)和做表达谱(检测它们有多少存在，及存在的数量)的信息。这些信息对于从根本上理解细胞分子关联准则，鉴定个人遗传问题、健康状况、疾病状况、药物反应、免疫反应是必要的。 [0012] 对生物分子进行分析和做表达谱要求保证特异性和灵敏性。虽然这些对于当前很多分析手段来说普遍具备，但这些分析方法一次只能进行一个反应或分析。在理想情况下，至少样品的一种成分不存在竞争(或交叉反应的可能)。因此，获得的结果可能是特异性的。例如，用Northern杂交来分析RNA需要选择一个特异的探针与靶标分子杂交来与其他非特异探针竞争。另一个例子是，在蛋白激酶分析试剂盒需要包括蛋白激酶和一个多肽作为酶的底物或是在蛋白激酶分析试剂盒里需要包括蛋白激酶、多肽和一个用于衡量酶活性或抑制影响的多肽抑制剂。传统分析的结果由于其简单的实验条件而变得更加可靠。这些实验不需要较多的重复或是检测特异性的完整曲线。 [0013] 高通量分析意味着同时处理多个不同样品和/或进行广泛分析，也可同时分析同个生物系统的多种样品。当前的微孔板能同时进行96,384或1536个平行反应，反应体积在微升到亚微升之间。使用这些微孔板需要液控自动器件、加样板和巨大的储存空间。如果用微孔板进行基因组水平上的高通量分析在实际操作上会有困难，因为这会遇到花费太高，消耗太大的问题。例如，假如一个1百万人的群体需要测试1万个重要的遗传位点，那总的实验数量将达到100亿次。如果每次实验消耗10微升的试剂/溶液，总共将需要10万升分析溶液。显然，即使我们目前已经有丰富的信息关于人类基因组、疾病相关的基因组、单核苷酸多态性(SNP)、DNA甲基化、组蛋白修饰、DNA插入/缺失/置换和其他类型的基因组信息(见国家生物信息中心，NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，但只能负担起很少的测试。因此，减少分析体积及分析器件的微型化十分有必要。 [0014] 高通量分析也广泛地用于全细胞和活细胞分析，如分析细胞凋亡、蛋白表达或细胞中酶活、基于表型的显性药物筛选、细胞毒性和细胞周期。当前的平台，如贝克曼细胞实TM验室(Beckman Coulter’sCell Lab )支持样品杯，微离心管和24，96，384孔板或细胞计数器，能以每秒大于10万次的速度进行分析。现在它在高容量的荧光标记下可能同时分析多个变数和参数。这些技术上的进步以及现代光学显微设备，如共聚焦和全内反荧光显微镜，对于我们深度理解体内系统提供了强有力的工具。对于在当前系统上进一步改进也显得十分必要。如，平均在一个1千或1百万的人群中有一个事例对于诊断或研究具有重要意义。这就期望来收集这些感兴趣的细胞/事例，如上面所讨论，使用适当的工具或方法，尽量详细地分析这些细胞/单体。 [0015] 微阵列是一种在最近20年发展起来并且飞速用作高通量筛选工具的反应和试样分析元件。微阵列每个位点尺度在微米之间，在每平方厘米的范围里有成千到百万的分析位点。某些试样可能每个芯片只需要皮升甚至更少的反应溶液。微阵列不需要用到像微孔板方法里的液体分配器件，并且首次能进行基因组范围的高通量分析，且大大减少了反应溶液的使用量。 [0016] 正如上述，当一种高通量的方法能平行进行单个反应分析，那可以发展成multiplex反应分析，包括用混合分析分子和样品 [0017] 基于微珠库的multiplex检测已经完成了，每个微珠带有一种类型的分子，如多肽、小分子有机物、寡核苷酸或其他类型的分析分子和样品。 [0018] 许多微型化器件已经出现，他们共同的特征是能以纳升或更小的反应体积进行分析。然而，在微型化器件缩小的同时，迅速增加在其中放置多样内容的困难。这样就妨碍了许多研发器件成为廉价、易用、多用途的商业产品。 [0019] 一种制备分析器件内容的方法是预先合成或是准备大量不同的分子然后将其放在分析器件的不同的反应位点上，例如cDNA或是DNA寡核苷酸点样微阵列。随着分析数量的增加和材料量的减少，材料准备的花费变得繁重，并且有时不可能去合成或准备分析所要用的众多不同的分子。因此，该方法对于需要分析几百个特征对象的时候有局限性，如抗体微阵列、多糖微阵列或小分子微阵列，但还是适用于寡核苷酸DNA，这些特征对象数量在1千或少于3万。对于分析纳升级或更小体积时，自动化器件会遇到许多技术上的挑战，并且它们达不到足够的精确度，也难以准确将分析材料分配到反应位点。能提供这些功能的器件对于常规实验上的使用也显得过于昂贵。 [0020] 已经开发了可供选择的方法来原位合成高密度的分子阵列，即，这些分子通过逐步加入单体或封闭体直接在固相表面合成。这些方法克服了预合成的困难，并且已被广泛TM用于基于DNA寡核苷酸微阵列的分析(例如，Affymetrix’s GeneChip ，Nimblegen DNATM 微阵列，Agilent’s喷墨DNA微阵列，Atactic Technologies/LC Sciences’μParaflo DNA/RNA微阵列)和基于多肽微阵列的分析(synthesis硝化纤维结构原料上的JPT点合TM 成，Atactic Technologies’μParaflo 多肽微阵列)。 [0021] 多数的高密度阵列包含标准寡核苷酸DNA，这主要受限于合成方法是基于依靠光去保护机制的单体合成。任何标准化学基团的修饰需要准备与之相关的依赖于光保护的新的单体，制作阵列的相应合成也需要被优化。广泛的努力涉及一个新型序列及其他们与标准合成修饰有关的未知结果，使基于光依赖的保护基团的方法受限于包括标准寡核苷酸DNA的阵列。依赖常规的化学和可以修饰化学残基的化学本身共同协作，通过使用喷墨器件可以合成阵列。然而，这种合成方法要求一套兼容的合成器件来提供额外的试剂，从而也使喷墨方法受限于包括标准寡核苷酸DNA的阵列。 [0022] μParaflo微阵列合成方法克服了上述的各种限制。该方法基于传统的化学，如用于DNA和RNA寡核苷酸的DMT酰胺化化学，用于多肽化学的Boc或Fmoc化学和光激活的光化生成试剂，如一种酸或碱用于合成寡核苷酸DNA和RNA或是多肽。该方法是通过直接使用商品化的单体在阵列分子中加入修饰，并且包含的修饰残基已被合成。寡核苷酸或多肽的修饰赋予了它们新颖的结合特征或酶活性。这种阵列不仅在研究上有重要的应用，同时也应用于诊断、药物筛选、疾病处理和其它领域。 [0023] 因为在基因组和蛋白质组领域需要在纳升或更小体积下进行上百万次的分析，因此极大地需要在很小的规模上而非当前的96孔板上平行合成分子。同时也急需有一种技术能用高密度阵列合成器件中来合成不同的分子，例如修饰的寡核苷酸、修饰的多肽、带标签的分子，用于脱离阵列表面后的各种检测、定量分析和先导化学物的开发。在过去的十年里，阵列作为高通量分析的手段已经被很好的接受，但大多数原位平行合成阵列的方法(GeneChip of 15A ffymetrix，Nimblegen，Febit，Agilent，Combimatrix)是局限于制备未修饰的DNA寡核苷酸。作为生物分析制作的的阵列没有达到从阵列表面上切除的用于下一步反应所要求的合成质量或者没有办法得到足够的数量，以及从表面移除，如制备纳米阵列、单分子分析、用于基因组扩增的基因组范围特意引物制备或是基因组范围的用于DNA或RNA的特异探针。目前，一个Paraflo反应器已被用于平行合成成千上万个寡核苷酸DNA，并可获得这些产物用于组装构建长链DNA。这些DNA构建子可以作为蛋白基因用于产生天然类型或自定义的蛋白。使用微型化的器件合成DNA减少了至少30倍的花费，并且至少提高十倍以上的分析容量。在这里并不需要液控自动器件来分配样品。尽管可能恢复对每种类型的分子单独合成，但许多需要multiplex反应的应用需要有分子文库，因此，需要使用含大量不同的分子混合物或分组的混合物。 [0024] 多样化合成阵列分子的领域里，由于糖基结合，如醇肽、甘油类似物，在细胞活性的糖调节、细胞转移、细胞互作、细胞蛋白互作和蛋白间互作的重要功能，因此它们备受关注。这些互作阐明了很多由传染性病原、恶性引发的免疫应答、受精、胚胎发育、淋巴细胞交换、肿瘤源、癌症转移引起的病原性、免疫原性的信号路径。因此，糖基化多肽具有潜在作为疫苗的化合物模型。迄今，基于糖基化多肽的分析依靠传统的免疫学方法通量较低，但存在有许多这些化合物的异构体。我们对这些化合物基团的了解十分有限。合成糖基化和糖基修饰的多肽阵列能加速研究这个重要领域并且开发基于糖基化多肽的试剂用于分析、诊断和治疗应用。 [0025] 可寻址阵列与随机阵列相比，一个明显的优势为具有可跟踪的分析位点作为参照、阳性或阴性对照和其它类型的控制，并且有重复数据点用于数据处理分析。这里必要的特征是能确保高质量和可靠的分析结果。执行的功能如合成或分析的质控点分析、基线信号纠正以及对阵列上的信号强度或是重复结果的多套数据归一化和根据这些特征推算出定量结果。在可寻址阵列上，总可以通过设计和测试比较数据组来排除可能的假阳性和/或阴性信号。合成的微珠分子文库不带有编码机制而不能达到这些要求。 [0026] 发明概述 [0027] 本发明描述用阵列原位平行合成控制每个表面反应位点分子密度的方法。这些密度变化的分子阵列在应用分析中有常例可寻，通常有微孔板(如96，384微孔板)装有分析分子或浓度变化的底物或检测和做图谱的生物分子，如核酸、蛋白、抗体、酶、糖和各种诊断分子；诊断分析；疾病治疗；个人健康分析和其它微型化生物分析中有类似方法的分析出现。这些密度变化的分子阵列也在其他应用分析中发现，如生物化合物分析、细胞组分分析、细胞膜化合物分析和全细胞分析。 [0028] 这种密度变化是通过控制混合常规的合成的单体来实现的。这些单体有的能在去保护后与表面的下个单体官偶联，另有的单体能与表面官能团反应但不能在去保护后继尔与表面的下个单体官偶联(终止单元)。试剂的混合比例决定了表面密度的稀释因子。 [0029] 这种密度变化特征将通过使用能与表面官能团反应的试剂来控制，并且连续反应也允许产生比例大于1的另外的单元位点(多分枝单元)。 [0030] 这种密度变化特征将通过表面固定有官能集团的微珠的表面修饰来控制。这种修饰是将带在，从而能够进行后续的反应。 [0031] 将描述用于原位平行合成的表面固定微珠的方法。微珠具有不同的大小、形状和/或由不同材料制备以适用多步反应或合成。 [0032] 上述用于在表面控制密度变化的方法可结合使用于产生整数或非整数的倍数变化。 [0033] 这里也描述了减小合成质量对数据的影响的方法。当在表面合成不同的分子时，其合成的质量不总是可知的。因此，必须减少合成质量对于最终数据数量的影响。 [0034] 这里也描述了在表面合成分子的方法，这些修饰的分子通过标准的，众所周知的化学合成方法获得。其中的一种修饰方法是使用Huisgen环加反应(点击化学)。 [0035] 这里也描述了在表面合成分子的方法，这些修饰的分子通过标准的，众所周知的化学合成方法获得。方法之一披露的修饰方法是通过联接微珠到合成的分子上形成偶联微珠的分子。 [0036] 这里所描述的合成方法并不局限于每个位点一种类型的分子；两种或更多的不同类型分子能通过使用混合物或两步独立合成步骤在一个位点合成。 [0037] 使用上述方法之一合成的表面分子可以在表面上使用，也可以从表面上键裂解收集为混合物或几组混合物使用。可以在不同的连接节点进行键裂解反应，并且在一些例子中可以产生连接有微珠的分子库，一个微珠带有一种类型的分子。 [0038] 对连接在表面或脱离表面分子的应用包括但不局限于单分子阵列、纳米阵列、微珠阵列、基于微珠的DNA测序、单分子测序、合成纯化所合成的分子、分析物的亲和纯化、multiplex PCR、基因组范围的靶标特异PCR、基因组范围的靶标特异结合和分析、构建寡核苷酸、多肽、糖/低聚糖或其他类型的分子文库。附图说明 [0039] 图1-说明分子阵列里的密度变化反应或分析位点概念。 [0040] 图2-说明一组密度变化的阵列位点。 [0041] 图3-是在密度变化的阵列位点上合成表面分子的步骤图。 [0043] 图5-是一例荧光图显示在所合成的分子上直接标记后的密度变化的分子阵列位点。 [0044] 图6-是一例在密度变化的分子阵列位点上抗体与合成分子结合条形图。 [0046] 图8-说明一个蛋白激酶底物的多肽阵列。 [0047] 图9-说明一个包含了密度变化位点的蛋白激酶底物多肽阵列。 [0048] 图10-说明一个包含了密度变化位点的蛋白激酶底物多肽阵列检测蛋白磷酸化的曲线图。 [0049] 图11-说明在多肽阵列结合数据上用依赖于链长的校正因子来弥补合成无效产生的负信号的曲线图。 [0050] 图12-显示了部分微流体阵列芯片图。(A)图示空微流体微室(B)图示包含有固定微珠的微室。 [0051] 图13-是一个在含有TentaGel微珠的玻璃板上合成寡核苷酸的显微鏡图(白光)。该图是在合成寡核苷酸反应多次循环后拍摄的。 [0052] 图14-说明在含微珠阵列位点上合成，并且含微珠的位点是可以有密度变化的。 [0053] 图15-说明叠氮炔烃化物Huisgen环加化学反应(点击化学)。 [0054] 图16-说明使用叠氮炔烃化物Huisgen环加化学反应(点击化学)合成共轭生物聚合物阵列。 [0055] 图17-显示抗半乳糖在糖基化多肽阵列上的结合。 [0056] 图18-说明合成微珠修饰的分子阵列。 [0057] 发明内容详述 [0058] 除非另有定义，否则这里使用的所有科技术语的含义与该领域通常所理解的含义相同。另外，特别的要素已在下面定义，以便更清楚容易地参考。 [0059] 此处使用的定义，下列术语和用语应具有的含义如下。除非另有规定，所有的技术和科学所用词汇具有作为一般的在领域中普通技巧理解的相同涵义。 [0060] 这里单数形式＂a，＂＂an，＂和＂the＂也可以是复数，除非上下文另外注明。 [0061] 下列在此文中出现的术语通常的含义在横线后出现： [0062] 激活-在化学反应里，激活表示降低能态使化学反应发生。 [0063] 可寻址阵列-是分子在该阵列的特定位置是可知的。 [0064] 阵列分子-是由阵列总点数和单位面积中的点数来定义的多个不同的分子在不同的表面位点有低、中、高或很高的阵列密度。当前，一个在每平方厘米区域上有几千个分子的阵列是高密度阵列；非常高或极度高的阵列在一张片上有百万个分子(1”x3”)。阵列的这些不同特征主要取决于它们制备方法。 [0065] 样品-一种底物或是化合物，是检测或分析的对象。阵列实验的一种分析物处理后用于阵列分析的可以是蛋白、蛋白溶液、生物蛋白样品，如细胞溶解物、核酸序列、核酸溶液、生物核酸样品，如基因组DNA或总RNA。 [0066] 阵列控制位点，参照位点-阵列包含了一些位点，这些位点并不用于样品分析，但用于技术的质量评估，如合成、结合等。 [0067] 阵列部署-可寻址阵列的二维图，一个包含写有鉴定序列及位置的文件。 [0068] 阵列位点-在多位点表面上的离散的区域。 [0069] 阵列、芯片-这些术语可交换使用来指分割一个空间的一套位点。这些位点的数量通常至少两排和两列。每排、每列或每个阵列位点数量的上限设置通过三原子分子调节尺寸。位点的单位密度至少9每平方厘米并且每单位区域的数量上限设置通过三原子分子调节尺寸。阵列位点可能但并不需要在表面调整位置。每个阵列有预先确定的格式，如玻璃板有或没有阵列位点边界，每个阵列位点也叫特征点。在独立位点上的分子不需要有同样的化学结构。重要的阵列特征包括：阵列位点几何形、表面、流通阵列室、阵列室、子阵列、阵列限制区(96-孔阵列)。 [0070] 分析分子-用于分析样品的分子。 [0071] 分析样品-包含分析物的样品。 [0072] 微珠阵列-阵列内容是由微珠提供。 [0073] 微珠、粒子、微球、纳米粒子、纳米微珠-这些术语可互换使用，指小的物体(尺寸从微米到纳米)。本描述中较频繁使用微珠。微珠可以但不局限于下列材料来制备，塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、聚丙烯酸、顺磁性材料、氧化钍溶胶、石墨、二氧化钛、橡胶或交联葡聚糖，如琼脂糖、纤维素、尼龙、交联胶和聚四氟乙烯。微珠可以是或不是球形，可以是长的，可以是或不是多孔的，可以是或不是表面包被，可以是或不是包含如氨基或羟基的功能基团，可以是或不是滑的，可以有或没有光学特性、磁性、亲和纯化特性。 [0074] 结合/溶解曲线-结合与分子浓度相关的曲线图，这里的分子是分析物或是与分析物互作用的配体。 [0075] 建造单元、单体-这些术语可以互换使用，但更常用单体来代表核苷酸或受保护的氨基酸。 [0077] 嵌合体或嵌合分子-一种化合物包含至少两个基团、基序、序列或部分来自不同的共同家族的分子。嵌合体或嵌合分子的例子如嵌合DNA-RNA寡核苷酸、来自两个不同蛋白的嵌合多肽或嵌合糖-多肽。 [0078] 键裂解、偶联-打断或形成一个化学键。 [0079] 偶联-在两个分子间形成化学键。 [0080] 树状聚合物-有分枝结构的分子，尤其本发明的丛枝聚合物有多个分枝臂，可用于在分子合成时生长多条链。 [0081] 三原子分子尺寸-如水分子(H-O-H)，它的宽度是2.75埃。 [0082] DNA阵列-DNA寡核苷酸阵列、RNA寡核苷酸阵列、DNA/RNA寡核苷酸阵列、RNA阵列可以互换叫做核酸和寡核苷酸阵列。 [0083] 功能化表面、合成启动基-表面能被激活进行化学反应。通常，这些官能团是氨基或羟基基团或是分别有两者保护的基团。 [0084] 糖基化多肽芯片-糖基修饰多肽。 [0085] 高容量阵列-阵列(每个阵列位点产生皮摩尔或更多)作为合成器产生比常规阵列(每个阵列位点产生法摩尔或更多)更多的分子。 [0086] 杂交、清洗、剥离-核酸杂交实验步骤，杂交描述了两条互补链结合的过程。 [0087] 固定-使分子与表面反应在它们之间形成化学键。 [0088] 原位平行合成-同时从头合成多序列分子阵列。 [0089] 连接臂、表面链接臂、空间臂-“连接臂”和“空间臂”是锚定基团，在分子间起到锚或拴的作用。连接臂或空间臂的链长由它们的线性旋转键决定。连接臂也确定了分子与固相支持物表面的第一个分子间的锚定。氨基或羟基硅烷常在玻璃表面作为连接臂。空间臂的例子包括但不局限于聚乙二醇、烷基、包含分枝侧链分子、丛枝聚合物、寡核苷酸、多肽、多肽类似物。 [0090] 修饰的核苷酸、修饰的多肽、修饰的糖基-化合物包含的化学基团不同于或额外多于它们的天然组成。 [0091] multiplex反应、单一反应-包含多于两个参与分子的反应或分析，如10个模板和20个引物的PCR反应。 [0093] 中和试剂、感光剂、稳定剂-这些合成试剂用于反应溶液中的酸或碱中和，转移放射能量和/或捕获基团。 [0094] 核酸-由核苷酸聚合形成，核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸或是两者的修饰形式。该术语也应被理解包括作为由核苷酸类似物制备成的RNA或DNA类似物，在具体应用中所描述的单链(如正义链或反义链)或双链聚核苷酸。 [0095] 寡-与化学基团名字结合使用。如寡核苷酸、寡糖，表示化学基团链较短(一些或几百个残基)。 [0096] 寡核苷酸-是寡聚核苷酸的缩写。 [0097] 在阵列表面、在表面对离阵列表面、离表面阵列分子应用-在表面应用阵列分子或使用化学或酶法来剥离表面分子并且收集进行其他应用，如作为寡核苷酸混合物用于突变或DNA合成。 [0098] 多肽-由20个天然的氨基酸聚合的氨基酸低聚物。 [0099] 多肽阵列-表面区域包含多于96个多肽序列固定于1平方厘米的区域。 [0100] PGA-P，PGB-P，光化生成酸前体、光化生成碱前体、光化生成酸、光化生成碱、光稳基团保护单体-这些是平行合成试剂，通过光射线激活。 [0101] 多聚-与化学基团名字结合使用。如多聚核苷酸、多聚糖，表示化学基团链较长(几百、上千和更长的延伸残基)。 [0102] 预定-实验前所计划、安排的目标对象。 [0103] 保护基团、保护和去保护-这些术语指化学基团能封闭分子中的官能团，其中的化学行为叫“保护”和“去保护”。 [0104] 蛋白激酶底物多肽阵列一个阵列包含蛋白激酶底物蛋白多肽或多肽阵列用于蛋白激酶分析。 [0105] 蛋白磷酸化多肽阵列-一个阵列包含磷酸化的多肽并且用于探测蛋白的磷酸化结合位点，如SH2蛋白。 [0106] 放射强度-放射的剂量，起到测量放射时间和放射能量的作用。 [0107] 反应位点、阵列位点、分析位点-互换使用来描述自然和激活状态的阵列位点。 [0108] 常规建造单元-用成熟的DMT化学或Boc或Fmoc化学合成寡核苷酸或多肽。使用标准的单体进行这些合成，常规建造单元。常规建造单元也暗示了它们在合成循环中有典型的去保护和保护步骤。 [0109] SNP，Chip-on-Chip，CGH-核酸分析和做图谱的相关技术。SNP：单核苷酸多态性，Chip-on-Chip：用芯片(微阵列)进行染色体免疫沉淀分析，CGH：比较基因组杂交。 [0111] 点、打印、印、喷-这些术语指液体处理的方式。 [0112] 表面-设定板、磁珠或固体对象朝外的边/区域。表面是易于接近用于合成或分析。 [0113] 表面密度、稀释、浓缩、密度变化位点-表面密度是通过单位表面区域所含有分子的数量来衡量。表面密度增加是“浓缩”反之是“稀释”。阵列的位点有不同的表面密度。 [0114] 合成循环、合成步骤-在寡核苷酸或多肽合成时重复的反应步骤。每个反应循环由几个合成步骤组成。 [0115] 标签、标记-在蛋白上连上分子、蛋白、组织或细胞样品。亲和标签例如用于抗Flag抗体结合的多肽Flag，用于标记和检测分子和细胞组分观察的荧光染料标签。 [0116] 终止单元、多分枝单元-终止单元如添加在合成中能终止进一步的反应；多分枝单元是二、三或更多分枝的树状聚合物。终止单元是可逆或不可逆的。 [0117] TFMSA-化学名：三氟甲磺酸。 [0118] 下述包括的例子是本发明的具体阐明。在这些例子中所揭示的技术在该领域应当更有价值。发明者所揭示的这些代表性技术在本发明实践中起到非常好的作用。然而，依照本发明所揭示的，该领域的这些技术可以在特殊的实例中做许多变化来提升价值。这些所揭示和获得的同样或类似的结果没有背离本发明的范围和主旨。 [0119] 这里所描述的方法是用于制造和使用阵列器件。这些阵列器件是根据合成分子的浓度变化和质量要求进行功能和容量上的改进。一个阵列由很多分离的反应位点组成，这些位点可以用于分子的合成，如寡核苷酸、多肽、糖类、其他类似物或其他类型的有机分子。在这些反应位点合成的分子有一定的密度分布，这种密度是通过单位面积所含有的分子数来衡量。以一个线性多肽为例，它单独占有40埃空间，那么在50x50平方微米的阵列位点上平均能合成法摩尔数量的分子。每个阵列位点平均需要纳升或更少的分析溶液用于实验。 与96、384或1536孔板相比，这里所描述使用的阵列在每个位点所需要的分析溶液至少能节省1000倍。由于在基因组或蛋白质组增加成万的分析，在很多实验室，这些实验将消耗大量的试剂和溶液才能在实际中进行高通量大规模的实验。这将会用到上千升分析溶液，因而购买、储存和处理的费用将高的惊人。因此，只能大量减少分析材料的使用量才能克服广泛分析基因组和蛋白质组实验的障碍。这些大规模的实验对于了解人类生物学和高等生物医学科学将会提供非常有价值的信息。 [0120] 我们非常期望能在阵列平台上进行目前在96、384、1536孔板上进行的实验。微孔板通常被用做放置底物分子，如一系列已知的多肽按照不同的浓度放置于孔板上，然后添加蛋白结合溶液和检测抗体溶液。通过读取检测信号，通常有荧光、化学发光或比色信号，来获得生物物理参数，如蛋白的结合/解离常数、抗体底物系统中的酶联免疫分析、酶底物活性检测，蛋白、核酸、糖、脂和/或各种小分子系统依赖于时间的参数。在酶促分析中，包含底物分子的密度变化位点与酶相互作用，获得的系列数据能反应出作为浓缩的底物分子产物的构成。在各个时间点记录实验。这些数据能用于获得酶促反应的参数，如最大反应速度和平衡常数。上述的这些基本知识能在大量的文献和书籍，如物理化学中找到。 [0121] 因此，本发明提供了用于控制表面密度的合成方法。本发明尤其揭示了恒定或表面密度变化的分子阵列的制备方法，不同类型的表面也适合于合成。合成的应用包括生成高密度的滴定板来同时进行对核酸、蛋白和其他类型的分子小体积定量分析，而传统的方法需要在微孔板里甚至有时是在单个反应试管里使用大量体积的溶液进行反应。定量分析提供了多个定量相关的数据点，因此，这种分析提供了更加可靠的信息。这结果应当适于直接关系人类健康的关键分析，如病人的临床诊断、预测、监控，个人基因型分析和应用。 [0122] 本发明的合成方法是基于在含有众多反应位点的固相表面或阵列表面，并且这些位点适合进行原位平行合成。用于平行合成的表面可以是玻璃、二氧化硅、多聚物，如多聚苯乙烯、处理的多聚苯丙烯、嵌合的多聚苯乙烯-多聚乙烯乙二醇、聚二甲基硅氧烷和它们的修饰物或其他耐化学试剂的物质，如二氯甲烷或甲酰二甲胺。对于打算在阵列表面应用的合成，表面也将不会产生检测干扰，如吸收或发散背景信号，这些信号可能足够强到掩盖了分析物中一些比较弱的信号。表面可以是平的或多孔的，可以有薄膜包被而确定阵列的位点也可以没有，可以是包含构造的式样而确定阵列的位点也可以没有。表面可以包含分割栏或分栏使阵列的位点显露，并允许在合成过程中或结束后进行不同的处理。对于每种表面，将会根据该领域已知的阵列合成技术选择合适的平行合成方法。 [0123] 本发明所描述的阵列将在装载有微珠的表面进行合成，这里装载微珠是指通过在微珠和表面形成化学键来固定微珠，并在微珠上进行原位平行合成分子。 [0124] 一个具体实施例，图1阐明在不同反应位点有可控密度变化的分子阵列的概念。第一排(100)说明密度变化位点的位置，第二排(105)说明密度变化因子是使用没稀释或浓缩合成的初始密度1的倍数。该因子的大小是由使用的反应试剂决定。图1显示在相邻的位点该因子等于2，在12个位点里分子的密度总的有2048倍的变化。实际上，可以通过稀释和浓缩在不同的反应位点构建连续比例的密度变化。在一个有3849位点的阵列上，将等同于构建了40个传统的96孔板。这个微型化的分析设备将至少提高40倍的通量但仅消耗小部分的试剂和溶液且只需要一小部分人力。高密度阵列甚至有更大的潜力，一个阵列包含100，200，400，800，10000，100000或更多传统96微孔板都是可能的。 [0125] 该领域的专业人士很清楚，表面分子的密度衡量单位面积的分子数量，因此是二维参数，而分子浓缩衡量单位空间的分子，因此是个三维参数。即使这样，如果考虑由两个分子中心到中心所定义的空间分离距离，这两个参数可以比较，两个表面位点的相对表面密度代表了在同个反应器里两个样品的相对浓度。因此，密度变化阵列的意义在于它能应用于分析物与表面分子互作的定量分析。当前的国内标准里，用已知的序列和相关的密度变化数据点来分析未知的分析物能用于获得参数，并接近于传统生化分析。 [0126] 密度变化位点可以通过几种方法建立。一种方法是允许在表面使表面官能团和添加的激活分子部分激活或反应。一个具体实施例，表面的官能团是受保护的氨基基团。这个保护基是光敏的，完全的光射线将会完全去除这个保护基；而部分光发射剂量将只会部分去除表面的氨基。去保护的百分比与光射剂量的强度是成比例的。另一个方法是表面的保护氨基是酸或碱敏感的，如DMT或Boc的酸敏基团和Fmoc的碱敏感基团。去保护的百分比与不同光剂量诱导产生的酸或碱是成比例的。这些酸或碱是由已存在的光化生成酸前体或光化生成碱前体在光照下产生的，这在Pellois等(2001)和LeProust等.(2001)的工作中已有说明。(Pellois，J.P，Wang，W.and Gao，X.(2000)Peptide synthesisbased ont-Boc chemistry and solution photogenerated acids(基于t-Boc化学和光化生成酸溶液的多肽合成).J.Comb.Chem.2，355-360；Leproust，E.，Zhang，H.，Yu，P.，Zhou，X.，Gao，X.(2001)Characterizationof oligodeoxyribonucleotide synthesis onglass plates(玻璃平面上脱氧寡核苷酸的合成特性).NucleicAcids Res.29，2171-2180)。然而，靠光射来控制的方法不能用于提高表面分子的密度。 [0127] 我们可以选择化学合成方法，通过添加合适的试剂可达到增加、不变或减少阵列位点上分子的密度(图2)。本发明的一个具体实施例，该方法是让分枝单元分子(205)与表面官能团反应来增加在预设位点(200)的分子密度。理论上，表面密度可以在每个双配位基树状聚合物的偶联步骤中提高2倍，并且在4个合成循环后，表面积的分子应当提高8倍以上(210)。本发明的另一个具体实施例，将常规单体与(215)与表面官能团反应从而使表面分子密度不变(220)。而另一个本发明的具体实施例，将含有终止单元(225)的混合物与表面官能团反应来减少在预设位点的分子密度(230)。所使用试剂的相对浓度可以根据图1表格(105)的第二排，其中#9点是根据图2(215)，如Boc-或Fmoc-保护的氨基酸与表面氨基基团偶联，并且这些氨基酸将进行下一步的合成反应。根据图1，点#8通过#1进行8步合成并且将参入多分枝单元，如N，N-(Boc)2LysCO2H或N，N-(Fmoc)2LysCO2H或N，N-(NPPOC)2LysCO2H(这里NPPOC是2-(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl，一个光敏基团)。根据图1，步骤#10到#12将被合成3步，合成试剂常规的单体和终止单元以1：1的比例混合。常规的单体可以如受保护的氨基酸，如Boc-Ala、Fmoc-Ala或NPPOC-Ala，终止单元可以如Ac-Ala。在每个合成步骤，混合试剂中的终止单元将会封闭50％表面分子。随后的制备密度变化(密度增加、不变或降低)位点的步骤在图3中说明。 [0128] 通常在微型化器件上通过原位合成的每种类型，或不同位点的几种类型，或同一位点的几种类型的分子数量能提高到几倍或更多。这并不局限于上述的方法，但是可在很多偶联和链的延伸反应里使用。双配位基树状聚合物将会提高合成时的分子密度，在每个循环步骤以2的因子在增加，类似于聚合链式扩增中的指数增长。对于一个有n分枝的位k点扩增因子，分子数是n，k是反应的循环数。 [0129] 该领域的专业人士清楚地知道，由于在合成过程中有一些分子生成不足，实际上表面的密度变化因子比起理论上的偏小。影响在密度变化位点的合成的因子，也包括表面修饰的影响。尤其当表面分子密度增加时，能让分子平行直接对准的空间会变小。对于一定程度的一定的分子系统，可能会有不适宜的空间互作或表面能带正负电荷，可能就减少或限制了分子密度进一步提高。其中，对于一个阵列最终的表面密度必须考虑将影响最优合成的因素和其他不适宜的因子降低到最小。 [0130] 密度变化的位点可以像96孔板那样安排，整个阵列的部署可以仔细考虑，在阵列表面预先设定的位置/地址合成每种序列和密度变化的位点。使用原位平行合成方法对于一个阵列位点的特定密度或与其相关的其他阵列位点的相对密度不需要相同。在不同的反应位点，在链延伸过程中通过合成不同数量的丛枝聚合物可能就有不同的“扩增”因子。这样会有不同的按化学计量组成配比值的分子产生。所合成的分子不局限于多肽，也可以是DNA和RNA的寡核苷酸、糖类、其他种类的多聚物和混合合成的分子。 [0131] 整个阵列合成方法的方案开始于密度变化方式的设计，合成的步骤通过对要合成的序列的部署进行合成。从阵列上至少收集一套最低是一个的序列的密度变化的数据。最终的阵列部署文件用于指导合成阵列。 [0132] 一个多肽阵列合成的具体实施例，在密度变化的位点合成人类流感病毒红血球凝聚素(HA)抗原表达多肽YPYDVPDYA(序列号NO：4)。这些多肽在不同阵列位点合成并偶联荧光分子来检测信号，这些信号与每个密度变化位点的分子密度成比例(图4)。合成的密度变化从16倍稀释(1/16)到16倍浓缩(16)，产生1/16，1/8，1/4，1/2，1，2，4，8，16的密度位点。曲线上显示了两组密度变化位点2倍稀释或浓缩的比例关系。溶于1x PBS缓冲液中的抗HA抗体(100g/mL)用于多肽阵列表面，密度变化位点的结合数据揭示了两组密度变化位点2倍稀释或浓缩的比例关系。S形曲线图说明了多肽的密度变化产生的曲线等同于浓度变化产生的曲线。这个结合曲线产生的结合常数根据经典的等温结合模型通过曲线拟合通常求得在10^(-7)M，与在多肽阵列上用高亲和的抗体结合的结果是一致的。由于已知的抗HA抗体与它的抗原表达的结合常数大约是10^(-8)M，因而上述获得的结合常数可以作为校正值使用。从阵列或溶液中测得的数据差异可以互相弥补。 [0133] 更进一步的结合实验阐明了在包含有多肽配体序列的多肽芯片上同时测量多个结合曲线。结合实验使用抗HA抗体(Roche)，浓度从0.1到60000ng/mL。结合过程在pH6.8的TBS缓冲液中4℃反应1小时以上。信号由偶联一个荧光染料(cy3或cy5)二抗产生，该二抗能识别抗HA而结合到多肽序列。根据激光扫描仪所标识的标准曲线来获得扫描的信号强度。使用Origin软件进行曲线拟合来获得结合常数。 [0134] 在实施例中，可以通过在最新合成一步里直接标记荧光分子或给在表面合成的分子结合一个荧光标签的分子来监控合成过程。图5是一幅密度变化位点多肽阵列包含了抗体结合序列的荧光图片。密度变化位点合成从第一循环的16倍浓度稀释，循环9给出了9个位点的，序列为：DYKH，DYKW，DYKA，DYA和一个单氨基酸A。这些阵列位点的相对密度通过荧光信号强度梯度变化来显示。对A分子观测荧光信号。明确的讲，荧光信号强度来自阵列表面多肽所结合的cy3标记的抗FLGA多肽抗体(AFM2)。多肽序列由单个氨基酸代码字母表示(A：丙氨酸，D：天冬氨酸，H：组氨酸，K：赖氨酸，W：色氨酸，Y：酪氨酸)(图6)。合成反应起始于表面的Boc氨基基团，选择位点进行去保护反应使氨基暴露，然后与1：16比例混合的常规氨基酸和链终止氨基酸偶联反应。在第二批位点再进行去保护反应使氨基暴露，然后与1：8比例混合的常规氨基酸和链终止氨基酸偶联反应。用1：4和1：2比例混合的常规氨基酸和链终止氨基酸重复去保护和偶联反应。随后进行去保护以及使用常规的氨基酸进行偶联反应。再次重复去保护反应使氨基暴露，然后偶联N，N’-(Boc)2赖氨酸。去保护和与N，N’-(Boc)2偶联反应重复进行三次以上。如上显示，合成的第9步产生密度变化的分子位点。随后合成多肽的如当前所描述的进行。一个实施例，在预设的密度变化位点去除Boc基团来产生自由氨基用于随后与Boc丙氨酸偶联。在反复的合成循环中，在预设位点进行选择性去保护和偶联反应产生的多肽阵列包含了多肽密度变化位点。结合曲线图(图6)进一步显示了多肽密度变化位点等同于浓度变化位点，与抗体结合后产生不同的结合强度。多肽阵列能作为测定结合曲线的滴定板用于检测结合反应和抗体对多个抗原表达亲和性能的比较研究。 [0135] 多种抗体会交叉结合到多肽上导致非特异的结合。利用抗体作为纯化标签或是作为诊断试剂是为了避免出现非特异地结合。高密度多肽阵列提供了大范围多肽与抗体非特异结合的检测，而且提供了这些多肽的序列，并且进一步提供这种互作的定量检测(结合曲线)。多肽具有的这些作用对于特异抗体和抗原表达扫描，减少假阳性和假阴性提供强有力的工具。使用结合曲线而非单个结合数据点也是鉴定生物标志物的有效方法，能使该方法更灵敏、可靠。 [0136] 多肽阵列包含蛋白激酶底物多肽，并且用上述抗原表达多肽阵列的方法合成密度变化的位点。图7说明一种蛋白激酶的分析方式，包括多肽芯片和蛋白激酶。芯片表面的多肽序列暴露在酶和酶反应溶液中。这些作为酶底物的多肽也因此被磷酸化。磷酸化基团通过偶联一个能特异识别磷酸基团的着色染料分子来检测。本领域专业人士都了解，蛋白激酶分析有许多不同的方式，因此基于多肽芯片的激酶分析并不局限于所提到的方式。 [0137] 本发明提供了用于在密度变化多肽阵列序列上的磷酸盐着色各种染料的方法。通过使用磷酸特异试剂cy3-Pro-Q(Invitrogen，CA，USA)与含有pS和pT底物的磷酸化多肽序列的多肽芯片反应来获得荧光图片。观察得到pS和pT底物的磷酸化多肽获得的信号一致，也能获得密度梯度曲线。可以根据信号强度来定量在独立位点的多肽密度。磷酸盐着色试剂可以是在磁成像里使用的化合物或其它在生物样品里使用的对照试剂。由于这些多肽与抗体结合较弱并且序列特异性不强，使对它们的检测较困难，但该方法克服了pS和pT多肽检测遇到的常见问题。本发明方法可用于在多肽芯片上灵敏地检测和定量分析激酶活性。 [0138] 本发明提供平行合成包含密度变化位点的磷酸化多肽阵列的方法。根据在图1、图2和图3所描述的化学程序，首次设计了包含密度变化位点的阵列，并且表面根据表面密度变化的部署进行官能团化。在该表面，通过已有平行合成多肽阵列的方法，如Zhou等(2004)所描述的uParaflo方法合成磷酸化多肽阵列，也可选择使用Frank及其合作者所描述的喷点方法18，19。 [0139] 图8是一幅蛋白激酶在pY-磷酸化多肽芯片上反应的荧光图片。实验使用Src激酶，p60c-src(Invitrogen)。芯片包含了23个已知的激酶底物和它们的从序列长度和组成上改变的突变体，一些阳性和阴性参照位点和一些人造多肽序列。对于每个多肽底物，在磷酸化位点，以YEEI中的酪氨酸(Y)为例，有3个序列存在，分别是YEEI，pYEEI和AEEI。包含pY的序列参考包含Y的序列直接合成(作为激酶反应的底物)。也还有8-22个未合成多肽的位点作为背景位点。在图中显示的多肽序列是YVPM(第一列)和YEEIP(第二列)相关的两个重复的序列。序列在图片右边列出。结果显示，YEE和YEEI在使用Src激酶后被磷酸化，并且比较来看，YEEIP是活性较低的底物，而YVPM活性最低。激酶反应和磷酸化检测条件是：10×酶保存液(0.5mg/mL)，50μLpH7.5的反应缓冲液(50mM HEPES，0.1mM EDTA，和0.01％Brij35，0.1mg/mL BSA，0.1％β-巯基乙醇，0.07mM ATP，10mM MgCl2)25℃反应30分钟。整个阵列添加200μL cy3-Pro-Q溶液(磷酸盐着色试剂)，室温持续放置20分钟。然后按产品说明用2mL pH4.0的脱色缓冲液(50mM Na2CO3，20％的乙腈)洗涤芯片。用常规的芯片扫描仪(Axon GenPix4000B)采集图片并且扣除背景信号强度后进行显示。 [0140] 信号强度分析使用下面的方程： [0141] 相对磷酸化效率：fp＝(IY-IA)/(IpY-IA) [0142] 对于一个多肽，I代表信号强度，IY代表含Y的序列，会受激酶的磷酸化作用，IpY代表合成的磷酸化多肽，IA代表含Y的序列中Y替换成A。通过使用阳性参照(pY序列)和阴性参照(A序列或其他不能磷酸化的氨基酸)来获得相对磷酸化效率，fp作为分数或百分数，对激酶反应的结果进行定量分析。该方法利用多肽阵列可寻址的优势来减少假阳性的读出并提高数据分析的可靠性。 [0143] 如图9所示，一个蛋白激酶底物多肽阵列给出对PKA分析的荧光图片。通过来自cy3-ProQ(特异的磷酸盐着色试剂，Invitrogen)的阳性信号来显示包含有磷酸化丝氨酸(pS)残基的多肽序列。两列的序列是：1.RR-X-SL(序列号NO：17-31)2.RR-X-AL，X(序列号NO：31-44)在图9中标记，并且N端乙酰化。提出了两套冗余数据。使用本发明所揭示的合成方法使密度变化的范围从初始合成密度的32倍稀释到16倍。每个多肽序列在10个密度变化的位点合成。包含X-S的序列是PKA潜在的底物，包含X-A的序列作为阴性对照，而包含X-pS的序列作为阳性对照。PKA反应条件：1mL PKA激酶反应缓冲液(50mM Tris，10mM MgCl2，2mM ATP，0.1％BSA，pH7.5)进流入芯片20min。然后用2500U的cAMP-独立蛋白激酶(PKA)(New England BioLabs)催化亚单位的50μL激酶反应溶液替换先前溶液，并且在30℃反应30min或更长时间。通过4mL Milli-Q水清洗来终止反应。检测：200μL Pro-Q着色溶液(Invitrogen)循环通过芯片20min，然后4mL Milli-Q水清洗。最后，多肽芯片用 4mL去色缓冲液(100mM NaHCO3/CH3CO2H，pH4.5，20％乙腈)在室温下清洗，然后进行图片采集。 [0144] PKA对20RR-X-SL多肽序列反应随密度变化相关数据的曲线图如图10所示。每个序列在变化密度的位点合成(图9)。曲线图反映了测得的荧光信号/反应时间(30分钟)对密度变化的任意位点(AU)。个别来讲，在一个多肽的每个密度位点，能作图确定反应时间对应的反应速率。每个多肽在每个密度位点的反应初始速率(vo)从曲线图的斜率获得。类似于上述的一个曲线图而速率是vo得到一条曲线，在该图上根据生化教科书(例如，Biochemistry(生物化学)，5th Ed.Berg，J.M.，Tymoczko，J.L.，Stryer，L.(2002)W.H.Freeman and Company，New York，pp.200-222)可以确定最大反应速率(Vmax)和KM值。这些动力学参数也可以从Lineweaver-Burke双倒数曲线图X轴(＝-1/KM)和Y轴(＝1/Vmax)的距离获得。 [0145] 蛋白激酶底物阵列的应用与多个领域相关。多肽阵列可以作为激酶检测工具来鉴定复杂生物样品中的激酶或新蛋白鉴定，也可以用于作细胞激酶图谱。由于蛋白激酶起着重要的作用，多肽阵列的应用不仅对研究有重大的影响，而且也在诸如疾病诊断、治疗靶标鉴定和抑制子扫描方面影响重大。 [0146] 本发明提供了一个改善阵列实验定量检测性能的方法。下面的数据处理程序包括从结合信号中去除噪音。值得注意的，这些噪音是合成质量的差异产生的。对于阵列的不同分子基团，由于合成质量的不确定性，不正确的检测信号在增加，并且也难以十全十美地合成。因此，在阵列数据分析里考虑到合成质量参数将十分有用。按照本发明方法，在芯片最后合成一步用1％的荧光素与表面所合成分子的官能团，如多肽末端氨基，直接偶联。合成后激活荧光素并采集图片。IF代表荧光信号，Ibg1代表背景信号。该多肽阵列包含抗FLGA抗原表达多肽(总共414个序列)和各种长度在2到12mer的多肽，每个至少4个重复(#050013)。支链多肽用Boc化学合成的TFMSA方法去保护。合成的阵列用水和结合TBS缓冲液清洗。结合实验用100ng/mL的抗FLGA M2(AFM2)，pH7.5的TBS缓冲液在4℃反应 1h。通过添加cy5-IgG(100ng/mL)，在pH7.5的TBS缓冲液4℃反应30min着色来检测结合情况。用微阵列扫描仪(Axon GenPix 4000B)来采集抗体结合所带有的cy5信号。整套数据包括cy5信号(Ib)、背景信号(Ibg2)和先前图片的荧光信号(IF)。从这些数据中，原始结合强度通过Ib＝Ib-Ibg2确定，直接荧光素标记的强度通过ΔIF＝IF-Ibg1确定。比率RbF(＝Ib/IF)给出了合成分子单位荧光读数或该数值叫校正结合数。下一步，RbF和ΔIb通过整体信号强度平衡，通过比较对比两组结合强度(校正/原始)得到矫正因子。414序列产生的数据通过上述方法作图在图11显示。对每种长度序列，有获得两组校正因子：分别沿着 1110线和1120线。1110线的斜率大于1120线。与相同的序列相比，线1110的序列组有较大的校正因子。产生较大校正因子的原因是对于某些氨基酸合成的产量偏低。对于每条线，线1110或1120，表现的趋势是序列越长，校正因子就越大。这种结果与合成效率受长度影响是一致的。当校正因子小于1时，如对于一些短序列，实际分析的信号强度会小于没有校正的信号强度。 [0147] 对于合成上的缺陷，结合信号校正的方法有许多益处。通常，一种假定是结合强度越高，在无需考虑链长的区别和/或序列组成时，则结合越强。然而，以多肽合成为例，合成的产率达不到100％并且20个氨基酸也会导致不同的合成产率。合成中的这些缺陷可能会导致分析结合数据时的错误。例如，如果每步的合成产率是95.0％，一个3mer的序列将是12mer序列的1.6倍。当评估结合数据时，就必须考虑合成产率的差异。直接荧光标记提供了用于定量合成分子数量的手段，合成时受链长度影响的因素也会被扣除。同样的方法，由于不同氨基酸所导致的合成产率的不同也会被扣除。分析数据基于信号比值(表面分子)来评估。 [0148] 必须注意的是荧光或其他类型的标记分子较高的背景信号可能影响后续的分析。这点可通过降低标记的百分比或通过偶联带有标记的可切除连接子来克服。在获取合成的信号后，去除不影响后续分析应用的标记。一个可去除的在表面所合成的序列和标记物之间的连接子可以是碱稳定的，如酯连接，或含1-2二醇基团的连接子，或是酸稳定的，如那些切除后产生甲酰胺基团，还原性切除，如二硫化物连接子，或是光稳定的，或可酶切的，或是其他该领域众所周知的技术。为了合成后读取的信号与在表面序列的数量成比例，选择标记和条件非常重要。 [0149] 上面的讨论必须普遍应用于酶反应、杂交和其他各种阵列数据的信号分析。对于不同的阵列系统，如多肽、修饰的多肽、磷酸化多肽、末端带染料多肽、寡核苷酸、糖类，比率参数会有不同并且对于不同的合成、分子和直接标记信号有相应的校正方法。 [0150] 本发明方法如上述讨论的用于密度变化阵列设计、合成、质控和数据分析不局限于多肽阵列。通常的程序和步骤适用于制备和使用DNA/RNA寡核苷酸阵列、糖阵列和包含这些基团分子化学修饰的不同家族阵列。 [0151] 本发明提供了有效合成多肽阵列的方法。基于光化生成试剂，如光化生成酸或碱的传统的化学方法平行合成已经被阐明用于合成DNA/RNA、多肽阵列和修饰的DNA/RNA、多肽阵列。多肽阵列里的一个实施例，合成时的去保护使用一种光化生成酸前体，三芳基硫盐。在该条件下，去除在链末端的N-Boc基团的去保护时间多于10分钟，或多于12分钟更完全地去除氨基基团。对于多肽合成中需要如此长的时间是有问题的。比较硫盐和碘盐的去保护效率，后者仅需要少于1分钟或少于30秒的时间就能完全去除Boc保护基团，大大节省了多肽阵列合成的时间。新试剂适合多肽阵列合成，由于需要增加合成步骤，因此对于密度变化的阵列非常重要。 [0152] 比较两组去保护条件的实验：反应A用碘盐和含有2-异丙基硫杂蒽酮的CH2Cl2在去保护步骤里去除表面氨基基团酸稳定的Boc基团。反应B是使用不同的光化生成酸前体。去保护使用不同的光照时间(从1秒到10分钟)。在全部的去保护步骤完成后将荧光基团偶联到表面的多肽。点越黑，强度越强，去保护的条件越有效。反应A在20秒到1分钟里比起反应B在7分钟或更多的时间里更有效。去保护Boc基团能在秒的时间尺度里被激活。使用碘盐合成多肽阵列用抗FLAG抗体AFM2的标准结合实验验证，并且实验结果与先前的结果具有可比性。 [0153] 减少循环合成时间对于实际进行原位平行合成多肽十分关键。合成循环时间也是合成设备的一个功能参数，因此，改进设备也会缩短合成时间。这些包括强的检测光源(不会降低光解析度)，给芯片传热，在芯片合成区域应用微波和其他众所周知的用于加快有机反应速度的方法。 [0154] 本发明提供了一个极大提高阵列作为合成器件的能力的方法。这里所定义的高密度阵列表面是在单位合成区域有数目众多的分子，因此，高容量的阵列由高密度阵列表面组成。一个方法是在支持表面装载和固定多孔合成媒介。如当前所用的平面玻璃作为阵列合成的表面。多孔合成媒介如聚苯乙烯微珠(Pierce，美国)、TentaGel微珠(Rapp-Polymere，德国)和可控多孔玻璃珠(CPG orLCAA-CPG，Sigma，美国)能产生至少10倍以上的材料，并且也可以获得100，1000倍或更多。本发明的一个具体实施例，将10μm的TentaGel微珠装入微流体阵列芯片，如Zhou et al.2004所描述(Zhou，X.，Cai，S.，Hong，A.，Yu，P.，Sheng，N.，Srivannavit，O.，Yong，Q.，Muranjan，S.，Rouilard，J.M.，Xia，Y.，Zhang，X.，Xiang，Q.，Ganesh，R.，Zhu，Q.，Makejko，A.，Gulari，E.，and Gao，X.(2004)Microfluidicpicoarray synthesis of oligodeoxynucleotides and simultaneously assembling of multiple DNA sequences(脱氧寡核苷酸的微流体皮克阵列合成以及多序列DNA共组装).Nucleic Acids Res.32，5409-5417)。芯片表面用氨基丙基硅烷连接子引出，而后氨基基团与琥珀酸酐反应。TentaGel微珠来自德国Rapp-Polymere，公司。微珠装入阵列位点(微流体微室)(图12，1210是空的反应微室而1215是装有微珠的微室)。微珠与阵列表面的氨基基团反应显著地增加了表面合成的能力。TentaGel微珠广泛地作为固相支持用于寡核苷酸和多肽的合成。 [0155] 图13所示的一个实施例，在具有10um TentaGel微珠玻璃板上合成寡核苷酸。按照Zhou等叙述的玻璃表面功能化的方法(2001(Zhou，X.，Cai，S.，Hong，A.，Yu，P.，Sheng，N.，Srivannavit，O.，Yong，Q.，Muranjan，S.，Rouilard，J.M.，Xia，Y.，Zhang，X.，Xiang，Q.，Ganesh，R.，Zhu，Q.，Makejko，A.，Gulari，E.，and Gao，X.(2004)Microfluidic picoarray synthesis of oligodeoxynucleotides andsimultaneously assembling of multiple DNA sequences(脱氧寡核苷酸的微流体皮克阵列合成以及多序列DNA共组装).Nucleic Acids Res.32，5409-5417)，并且置于一个1umol DNA合成柱。柱子连接到DNA合成仪(Expedite8909，Applied Biosystems(应用生物系统))并且用标准的DMT化学和供货商提供的标准方法合成15mer的寡核苷酸。合成后，去除核酸碱基的保护基团。进行四个测试来验证合成：(a)用荧光素直接标记合成的寡核苷酸，用所描述的方法(Leproust，E.，Zhang，H.，Yu，P.，Zhou，X.，Gao，X.(2001)Characterization of oligodeoxyribonucleotide synthesis on glass plates(在玻璃平面上的脱氧寡核苷酸合成的特性).Nucleic Acids Res.29，2171-2180)检测荧光信号。(b)对从表面切除的产物进行紫外吸收扫面，在260nm处作阳性信号读取。装有TentaGel微珠的合成比直接在玻璃表面合成产生至少1000倍的寡核苷酸产物。(c)用高效液相分析从装有微珠玻璃板上合成的寡核苷酸，测得的保留时间为16min，与标准样品一致的条件(HPLC(RC列)：C18，8×10.10μ，流速：1.5mL/min，紫外检测波长：200-600nm，溶剂A是CH3CN，流动相B是0.05M TEAA缓冲液加1％的CH3CN，梯度：5％A，2min，，5-35％A，20min)。(d)在装有微珠的玻璃板上进行杂交反应。与在装有微珠的玻璃板上合成的寡核苷酸杂交反应的互补链在CPG机上合成。用500μL含有0.5μM的cy3标记的寡核苷酸进行杂交反应。用同样的反应条件及试剂与未进行寡核苷酸合成的装有微珠的玻璃板反应用于对比。用落射荧光显微镜采集玻璃板图像，有合成寡核苷酸的玻璃板能观测到强烈的荧光信号。 [0156] 如上述本发明的方法，在装有微珠的玻璃板上合成的寡核苷酸从表面切除用于进行脱离阵列的应用(图14)。所有的阵列位点无需相同的表面密度或容量(14100，14105，14110)。表面和微珠之间以及微珠和寡核苷酸之间的连接子在所描述的合成和去保护的条件(Gao，X.and Yu，P.“Novel reagentscompounds and methods of making and using the same”(新型试剂化合物以及其制作和应用的方法).PCT International Publication WO 2005/000859)下是稳定的。例如，连接子可以是靠氨基键连接的烷烃链。对于在阵列表面的应用(14115)，在每个阵列位点有大量的表面分子，可以提高检测的灵敏性。由于检测的下限与传统的DNA寡核苷酸阵列一样，而检测上线大大提高从而也提高了该阵列的检测动力学范围。对于离阵列表面的应用(14，120，14，125)，设计了可切除的键使切除的产物可以不带有微珠(14，120)或带有微珠(14，125)。尽管能在分子合成的最后去保护阶段进行切除反应，但最佳情况是在最后去保护成功之后进行切除反应。在寡核苷酸合成中使用连接子有详细的讨论(Gao，X.andYu，P.“Novel reagents compounds and methods of making and using the same”(新型试剂化合物以及其制作和应用的方法).PCT International Publication WO 2005/000859)。 [0157] 本发明方法中，装载微珠阵列的合成密度是由微珠的特殊构造决定的。这里的例子使用的是10um的TentaGel微珠，每个微珠有亚皮摩尔的官能团，每克有百万个微珠。如果阵列位点有50×50平方微米，那每个阵列位点可能合成有好几百皮摩分子或多于10^(14)的分子。因此，装载有微珠的玻璃板可用于合成生产，举一个例子，如合成纳摩的分子(图13)。重要的是，在阵列合成器件里成百上千或百万的分子同时合成。当需要多批次合成制备上百万不同的分子时，它优于96或384孔板。通过先前的合成技术来利用所合成的材料在面对大规模应用时也会受到限制。阵列合成器件技术优于先前基于微孔板的合成技术已经有到较好的评估，并且对于纳级或更小级别的生物分析器件进行超高通量的基因组或蛋白质组实验是必不可少的。 [0158] 这里所阐述的方法不局限于玻璃板材料和TentaGel微珠，微珠尺寸不局限于10um和球形。其他来源的不同化学(如PDMS，聚苯乙烯)或物理(total plat，having etched，layered，multi-sided(总平面，蚀刻，分层，多面))结构的在其领域里用于高密度合成的材料也可选择用于阵列的合成。阵列表面可以修改成包含孔、洞、浅或深的渠道或其他的物理修饰，使阵列表面分成亚区或增加其他特征方便随后的各种处理，包括装载微珠、合成和在阵列或离阵列的应用。微珠的选择有多种考虑：微珠的尺寸可以从微米到纳米，微珠的几何形态可以是球状、凹状、方形或棒状，微珠的特性包括磁性、光学特性或其他类型的活性特征，微珠的材料可以是多聚物、人工多聚物、金、银或其他金属复合物、小晶体或其他能形成所期望尺寸的功能微珠。我们所需要的微珠有一种或几种上述的特征。 [0159] 这里所阐述的方法不局限于寡核苷酸合成，也不局限于在一个阵列位点合成一种类型的分子。本领域的一些技术已经具有较高的价值，包括多肽、寡核苷酸类似物、多肽类似物或普通的聚酰胺和聚磷酸二酯序列、糖类(Synthesis and medical applications of oligosaccharides(低聚糖的合成和医学应用).Nature446，1046-1051)和它们的共轭物。使用该领域众所周知的在一个阵列位点合成一种类型以上的分子的技术，该项技术可以随机合成或正交合成两个或更多不同的分子。 [0160] 这里提供制备寡核苷酸混合物，或每珠装载一个序列或没有。寡核苷酸混合物有广泛的应用：附着微珠的混合物样品能用于检测特异性靶标的应用，如作为探针来富集或选择DNA测序，基于微珠的快速DNA测序，如454 Life Sciences和Roche(www.454.com)和Applied Biosystems(www.appliedsystems.com)的技术，基因组范围的DNA测序，如Solexa-Illumina(www.illumina.com)技术，纳级阵列，单分子阵列，靶标特异的实时定量PCR，基因组范围的各种DNA合成(SNP，Chip-on-Chip，CGH，methylation ampping)，RNA测序和作图，标签纯化，标记，检测，或条形码，微珠阵列分析核酸、蛋白和其他类型的分子。这些应用要求微珠上有1，10，100或1000个同样的分子或探针，并且偶联微珠的分子能结合同样多的靶标分子。一个阵列合成器件能制备法摩尔(6.0×10^8个分子)的材料用于 100,000或更多的实验。装载有微珠的阵列制备的材料用于1,000,000或更多的实验。寡核苷酸混合物能用于如Zhou等(2004)描述的合成DNA，它们能作为前体材料用于构建功能DNA、RNAs、蛋白、生物聚合复合物、小型基因组、生物体或细胞。 [0161] 应用的一个具体实施例，一组癌激活相关的50,000基因(平均长度1.5kbp)进行1,000,000次测试，重复3次(每个序列读3次)(总共读取50,000,000,000个序列)。这项任务只能靠当前的大规模测序技术完成。然而，目前已知的技术如454DNA测序技术是使用空白微珠随机捕获序列进行测序。这种处理会出现很多微珠捕获了太多的序列，也有很多微珠没有捕获任何序列。一部分微珠载有正确数量的序列遵循经典的统计分布。此外，微珠载有的单一序列可能是冗余的，这种趋势取决于特殊序列的丰度。丰度越高，微珠上载有该序列的几率就越大。一种解决的办法是在微珠上载有单一探针，使之与预定的靶标杂交。然而，这种简单的解决办法要求高通量合成寡核苷酸。提供一组从总RNA中选择3,000个基因的探针，那么就可以保证每次测序序列是通过杂交而非随机选择的。该技术能确保测序的效率和覆盖全部序列，否则不可能完成该任务。如果研究在低通量和随机试验的条件下没办法完成，这种深度测序能充分帮助获得基因组序列以及获得深度认识。 [0162] 本发明提供合成分子阵列表面化学修饰的方法。化学修饰使给阵列合成分子引入新的特征，因此给阵列应用开辟新的方向，超越了核酸杂交和经典的基于多肽的分析。一个修饰反应的例子是通过共价键将糖基团和多肽连接，产生新的修饰多肽用于扫描抗体结合、细胞受体结合、蛋白结合、疫苗筛选和其他包括糖类及小分子的常规应用。一种有用的反应是Huisgen cycloaddition(点击化学)(图15)，它能使末端炔(1505)与叠氮化物(1510)反应复合形成trizol(1515)，该反应偶联了R和R1的基团使链延伸。叠氮化物的连接基团化合1520可以是烷基、乙烯基、寡聚甘油和聚酰胺等。由于点击化学反应条件比较容易满足并且在水环境中适合生化分子反应，因此在过去几年里已经快速普及。这里描述的实验是将一个α半乳糖多糖叠氮化物连接到多肽上，在阵列表面形成生物共轭物。一个合成首选的实施例(图16)，一个包含受Boc保护的氨基表面基团的多肽阵列(1605)。选择性地去保护阵列位点，来激活表面氨基基团(1610)，然后顺序偶联丙炔酸(X＝无)(1615)，形成末端炔基(1620)。在点击反应条件下，叠氮化合物(1625)的R是个连接子，连接了荧光素。这个物质(1625)再“单击”到末端炔基形成共轭物(Z＝trizole)(1630)。在这个阵列表面，通过点击化学方法不断重复去保护、偶联炔基羧酸反应步骤，并且在不同阵列位点生成含R1、R2或R3基团的生物共轭物(1635)文库。例如，这种生物共轭物是多肽衍生化合物。 [0164] 本发明一个首选的具体实施例，反应使用当前所描述的光化生成酸法和Boc化学合成多肽序列，包括首次合成。在制备多肽后，对第一组反应位点去保护，并且氨基基团与丙炔酸偶联，第二组位点去保护，并且氨基基团与4-戊酸偶联，重复去保护和偶联步骤，在该位点偶联6-庚炔酸。这些位点包含末端炔基。然后多肽芯片表面与FITC-叠氮化物在乙醇和水混合液，存在CuSO4和Ph3P条件下反应2小时。整个部署图片在图17顶部显示。显示一张荧光图片以炔基终止的多肽连接有FITC(荧光素)在环加成FITC-叠氮化物和表面炔基之后。显示的荧光信号与设计的部署一致，说明了点击化学方法非常适合用在阵列表面合成修饰的多肽。 [0165] 另一个较佳的具体修饰例子，反应条件与上述方法类似，并且安排好所选择的去保护和偶联步骤，如在一个序列的不同位点进行multiple修饰(1640)(图16)。 [0166] 阵列包含了修饰的分子，如糖基化的多肽，其具有作为生物标志物结合配体的价值，它们比常规的DNA或多肽分子有更多的官能团。 [0167] 本发明提供使用原位平行合成的方法制备修饰分子的阵列。这种合成方法基于合成循环中通过照相平板光发射法、光化生成酸或碱、电产酸或碱来激活，或是将反应试剂输送到反应位点。阵列合成不局限于一定的特殊结构，如阵列附属的器件或开放表面、阵列亚区域或限制区域、阵列的尺寸。然而，关键的是阵列必须允许在第一和第二预定的区域进行修饰反应等等。 [0168] 在阵列表面的修饰和生物共轭反应不局限于糖基共轭的多肽、寡核苷酸、糖，分子基团可能是蛋白、抗体、细胞、微珠，如TentaGel珠。这里所提到的微珠也包括胶体CdSe-ZnS或其他类型用于组织和体内着色的磁珠，磁珠，对于快速纯化样品十分有用。微珠的表面可能带有的官能团，如羟基、氨基、巯基、生物素基、N-琥珀酰亚胺、叠氮化物、烯烃基或炔基。微珠表面可以有选择的由活性分子包被，如链霉素、抗体、GST、HIS6等。 [0169] 本发明的一个首选具体实施例，一个微珠，一种混有有成千到百万的包含了不同的化合物的微珠将在接下来几年里在高通量分析和生化微型化应用里有巨大的需求。这些微珠可以作为特异结合的探针、酶分析的底物、聚合链反应的引物和目前高通量模式里的众多应用。一个设想是通过使用数百万的纳米级微珠在表面形成阵列来使当前的一些应用微型化。该表面可以或不必要有分离微珠的栅格，可以通过包被来保持微珠。很多不同类型的微珠由不同的材料制备，如金、合成的多聚物和交接合成的多聚物、溶胶和玻璃，并且尺寸可以从纳米到微米。 [0170] 本发明提供利用阵列作为合成工具制备微珠文库的方法。当前熟知的用分离组合的方法制备微珠文库，但该方法只是一个库并且它的随机性使控制变得困难。自动点样或其它将分子固定到微珠的方法已有使用，但这些方法仅适用于制备上千个不同化合物的微珠文库。这是由于化合物需要预先合成而后合成几千以上的大量化合物又受到财力和时间的限制。本发明提供在表面合成阵列化合物来构建微珠文库。 [0171] 特别地讲，本发明揭示了直接“拷贝”表面包含的各种化合物制备成微珠文库的方法。下面给出该方法的几个例子。 [0172] 合成阵列在玻璃板表面图18(18000)的运作如所发表的进行(5)。对于合成的每个生物多聚物有一个锚定基团加入，例如在末端位置((18100)，(18105)，(18110))。锚定分子是那些能与引入的分子形成共价键或高亲和键。在阵列合成后，表面分子有粘附性的微珠装载到阵列表面(18115)。阵列表面分子能与微珠接触结合(18120)。然后从阵列表面切下表面分子(18125)。在每个接触区域，仅有一种类型的分子与微珠结合。因此，实验结果产生了一个微珠带有一种化合物的微珠文库(18130)。 [0173] 另外一个具体实例，在微珠进入到位点后分隔独立的反应位点。在表面分子与微珠结合后从表面切下这些分子。该实验产生了一个微珠带有一种化合物的文库。 [0174] 在上述实验中，在微珠进入到位点后，反应位点独立分隔。在表面分子与微珠结合后从表面切下这些分子。该实验产生了一种化合物带有一个微珠的文库。 [0175] 在表面离散的位点合成或固定分子。对于每个合成的生物多聚物的末端位置都连接了一个锚定基团。锚定基团是个可反应基团或是一个能被激活的基团以形成能与进来的微珠反应的连接子。合成后，能粘附表面分子的微珠装载到阵列表面。在接触时，表面分子与微珠结合。然后，从阵列表面切下表面分子。在每个接促区域，一种类型的分子与一个微珠结合，因此，该实验产生了一种化合物带有一个微珠的文库。 [0176] 在上述实验中，合成完成后，能粘附表面分子的微珠装载到阵列表面。在接触时，表面分子与微珠结合。然后，从阵列表面切下表面分子。在每个接触区域，一种类型的分子与一个微珠结合，因此，该实验产生了一种化合物带有一个微珠的文库。 [0177] 在上述实验中，合成分子结合的锚定基团可以是生物素，它能与链霉素或抗生素蛋白微珠结合；可以是硫醇基团，它能结合金粒子；可以是氨基基团，它能结合乙醛包被的微珠；可以是硫醇，它与小球表面的顺丁烯二酰亚胺反应；也可以是其他类型的适配系统。 [0178] 可以调整表面分子的密度和微珠的直径，以便于控制与微珠结合的分子数量。 [0179] 测试显示了表面分子与微珠紧密结合或键合，使微珠固定。表面分子的锚定基团和微珠表面受体的锚定基团产生强烈的互作，以致包含合成分子的表面对微珠有自发的粘性。 [0180] 本发明一个首选具体实例是微珠文库制备的应用。下面描述的方法用于“用基因组测序系统超快速从头测序人类解脲棒杆菌基因组”(www.454.com)，获得基因组DNA样品。制备一个包含所需要序列的寡核苷酸阵列，并且以生物素做末端，从阵列表面上切下的这些序列有3’OH。所制备的微珠文库是作为靶DNA序列特异的引物(DNA序列信息可以从NCBI或EBI获得)。将微珠与基因组DNA混合，通过PCR扩增靶DNA。这些样品通过454基因组测序仪测序。靶标特异的测序能提高总的碱基读数并且测序覆盖唯一的碱基。 [0181] 在不脱离本发明的范围和宗旨的条件下，对本发明中提到的方法和系统可以进行各种修改和变更。虽然本发明在特殊的例子中已经描述过，但是应当清楚本发明权力声明绝不仅仅局限于这些特殊的例子。确实，精通分子生物学、遗传学、化学或相关领域的人显然明白本发明的执行方式可以有各种不同的修改，以下的权力声明中就包括了这些修改。 [0182] 虽然为了更清楚的了解，本发明先前已经通过说明和例子作了一些细节上的描述，但显而易见，本发明领域通常的专业人士可以根据本发明的描述，在不脱离本发明的范围和宗旨的条件下，对本发明中提到的方法和系统可以进行各种修改和变化。 [0183] 参考文献： [0184] 1.Lam K.S.，and Renil，M.(2002)From combinatorial chemistry to chemical microarray(从组合化学到化学微阵列).Current Opinion in Chemical Biology，6：353-358. 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