用于在体内进行蛋白质的选择性进化的方法 |
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| 申请号 | CN200680032319.6 | 申请日 | 2006-08-07 | 公开(公告)号 | CN101258244B | 公开(公告)日 | 2012-02-15 |
| 申请人 | 基因技术股份公司; | 发明人 | M·里斯; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及在体外进化方法中产生 蛋白质 的变体，所述方法包括下列步骤：(A)提供体外表达系统，其包含：(i)编码待改变的蛋白质Y的核酸序列S；(ii)能够结合蛋白质Y和/或至少一种其变体Y’的靶分子X，(iii)能够转录核酸序列S的RNA聚合酶(Pol)，(iv)能够反转录核酸S的转录物的逆转录酶(RT)，其中靶分子X与Pol偶联而蛋白质Y与RT偶联，或者靶分子X与RT偶联而蛋白质Y与Pol偶联；(B)在一定的条件下温育来自(A)的体外表达系统，所述条件使得能够进行转录、反转录和翻译从而形成蛋白质Y的变体Y′和编码其的核酸序列S′，并且有利于形成具有改善的对靶分子X的结合特性的变体Y′；(C)分离和任选地表征具有改善的结合X的结合特性的那些变体Y′，和/或分离编码Y′的核酸序列变体S′。 | ||||||
| 权利要求 | 1.用于产生蛋白质Y的变体Y’的方法，其包括下列步骤： |
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| 说明书全文 | 用于在体内进行蛋白质的 选择性进化的方法[0001] 描述 [0002] 本发明涉及在体外进化方法中产生蛋白质的变体。 [0003] 发明背景 [0004] 生物技术在医学、化学工业和农业科学领域中的日益增加的重要性日益需要对于其各自使用目的而经最佳调整的蛋白质。首先，这些蛋白质主要是从环境中分离的，大部分在所谓的环境基因组筛选(Metagenom-Screenings)的范围内。逐渐地，它们随后通过各种方法进行改造以使它们适应计划的“人工”使用条件。 [0005] 因此，例如，需要与它们的天然变体相比更为热稳定、具有其他底物特异性或者显示更高活性的酶。例如药物蛋白质应当具有更长的半衰期以能够使用更少的剂量，或者应当通过与靶分子的高亲和力和特异性结合来抑制疾病相关性代谢途径或感染途径。 现有技术 [0006] 部分地通过合理的蛋白质设计方法来达到该调整。然而，迄今从蛋白质的所希望的功能(表型)推断出其结构，或者从蛋白质的三维结构推导出相应的一级序列的可能性只是非常有限的。然而为了实现蛋白质功能的增加，目前使用部分进化方法，其用术语“定向进化”概括。 [0007] 根据目前的现有技术，迄今的定向进化方法基本上基于产生待改善的蛋白质的大量变体(后代)，并就改善的衍生物对其进行选择。在该情况下，所研究的突变体的数目在11 一些情况下可以是非常巨大的， 但通常低于10 。如果考虑只有100个氨基酸的蛋白质， 100 130 11 那么理论上存在20 ＝10 个不同的其变体。因此，大小为10 的文库只涵盖了可能的变体的非常小的一部分。在这样的文库中发现理论上最佳的变体的概率几乎为零。 [0008] 为了就与靶分子的最大亲和力来筛选大量的变体，已开发了许多方案(例如，酵母双杂交、细菌展示、噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示)。 [0009] 对于筛选其他特性例如酶活性，大部分需要允许研究只是相对少量的变体6 (＜10)的测定法形式。这些方法的共同点是它们被限制于产生突变体文库以及随后对其进行选择。尽管使用这些方案可能手工地来进行复制(＝最后进行的选择的“胜者”的突变体的下一代)，但是其和前述步骤一样费时费力。因此，相应的方法通常只涉及1至2代。因此，所提及的方案在真正的意义上不是进化方法，而更确切地说是现存的变体库的排他性选择(ausschlieβliche Selection)。因此，不能利用在许多代上的逐步适应的潜能，但这是可能从天文数目的可能性中鉴定出最具有活性的变体所必需的先决条件。 [0010] 具有其三个先决条件(复制、突变和选择)的进化原理能够在给定的系统内导致从简单至高度适应的结构的定向发展。所谓的“盲眼钟表匠(blinden Uhrmacher)”的该模型使得能够产生复杂性而无需设计输入(planerisches Zutun)和无需必要的结构数据知识。 [0011] 在1989年，Bauer等人(PNAS(1989)86，7937-7941)能够证明，在其中存在Qβ复制酶和在一端接种任何RNA的毛细管之中，发生了连续的进化过程。聚合前沿(Polymerisationsfront)沿着毛细管出现，在该过程中，出现的RNA聚合物进化达到噬菌体特异性序列/二级结构，因为这些序列由复制酶更快速地复制。尽管该实验不具有直接的实际用途，但其清楚地证明复制、突变和选择这三种因素的潜能。 [0012] WO 02/22869描述了用于分子文库的体外进化的方法。在其中使用“双杂交”系统。然而，此处只使用具有增加的错误率的聚合酶， 但不使用逆转录酶。因此该文献涉及所谓的“易错PCR”。 [0013] WO 2004/024917描述了用于酶的定向进化的方法，其中蛋白质和其编码DNA在空间上偶联并被封闭在区室中。所述蛋白质以具有肽标签的融合构建体的形式存在。起始材料为DNA文库。然而，对于选择不使用配体-蛋白质相互作用，并且RNA聚合酶并不引入突变。 [0014] WO 2005/030957公开了以融合蛋白偶联至编码DNA的蛋白质的体外选择。 [0015] Bernath，K.等人(J.Mol.Biol.(04.02.2005)345(5)，1015-1026)也描述了相似的系统。 [0016] WO 01/51663公开了用于修饰核酸的整合的系统和方法。在其中，特别地使用利用Qβ复制酶的NASBA。然而，没有公开关于通过RNA聚合酶引入突变的提示。 [0017] 尽管已知由逆转录酶和其他蛋白组成的融合蛋白，但是并没有关于在体外进化中使用RT融合蛋白或T7-RNA聚合酶融合蛋白的提示。 [0018] 还已详细地研究了Qβ复制酶系统(McCaskill和Bauer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90，4191-4195)。这个出版物描述了Qβ复制酶系统中的进化波动(Evolutionswellen)。RNA前沿的迁移速度随着复制子的适合度(Fitness)增加而加快。然而，不能从该出版物中推导出本发明的系统。 [0019] WO 2004/108926公开了具有改善的结合能力的蛋白质的人工进化。所述蛋白质在RNA复制子中编码，所述RNA复制子通过错误复制而形成准种类(Quasi-Spezies)。然而，在此涉及体内表达。 [0020] 迄今为止仍不存在获得使得能够进化蛋白质的体外系统。仍然存在对于这样的系统和方法的需求，所述系统和方法用于具有改善的特性的蛋白质的定向进化，其避免了费时费力地建立和筛选突变体文库。 [0021] 本发明涉及用于产生蛋白质Y的变体Y’的方法，其包括下列步骤： [0022] (A)提供体外表达系统，其包含 [0023] (i)编码待改变的蛋白质Y的核酸序列S， [0024] (ii)能够结合蛋白质Y和/或至少一种其变体Y’的靶分子X， [0025] (iii)能够转录核酸序列S的RNA聚合酶(Pol)， [0026] (iv)能够反转录核酸S的转录物的逆转录酶(RT)， [0027] 其中靶分子X与Pol偶联而蛋白质Y与RT偶联， [0028] 或者靶分子X与RT偶联而蛋白质Y与Pol偶联， [0029] (B)在一定的条件下温育来自(A)的体外表达系统，所述条件使得能够进行转录、反转录和翻译从而形成蛋白质Y的变体Y’和编码其的核酸序列S’，并且有利于形成具有改善的对靶分子X的结合特性的变体Y’， [0030] (C)分离和任选地表征具有改善的结合X的结合特性的那些变体Y’，和/或分离编码Y’的核酸序列变体S’。 [0031] 特别地，本发明涉及用于产生蛋白质Y的变体Y’的方法，其包括下列步骤： [0032] (A)提供体外表达系统，其包括 [0033] (a)核酸序列S，其编码 [0034] (a1)可由聚合酶(Pol)反式激活的转录控制序列， [0035] (a2)待改变的蛋白质Y，和 [0036] (a3)逆转录酶(RT)， [0037] 或者备选地 [0038] (a3’)聚合酶(Pol)， [0039] 其中编码(a2)和(a3)或(a3’)的序列片段在(a1)的可反式激活的转录控制序列的控制下编码融合蛋白， [0040] (b)蛋白质复合物，其包含 [0041] (b1)能够结合待改变的蛋白质Y的至少一种变体的组分X，和 [0042] (b2)用于转录来自(a)的核酸序列S的RNA聚合酶Pol，或者备选地 [0043] (b2’)逆转录酶(RT)， [0044] (B)在使得能够形成蛋白质Y的变体Y’的条件下温育来自(A)的体外表达系统， [0045] (C)分离和任选地表征具有改善的结合X的结合特性的那些变体Y’，和/或分离编码Y’的核酸序列变体S’。 [0046] 因此，本发明包括一方面允许在实验室中选择给定的变体文库同时又包含复制机制的自主系统。在此，如在天然进化的情况下一样，选择将通过更好地适应的变体的优先复制来进行。 [0047] 因此，本发明提供了使得能够进行具有改善的特性特别是具有改善的结合特性的蛋白质的进化的方法。本发明的系统将体外转录与体外翻译和反转录相组合。令人吃惊地证实，可以在体外系统中组合这三个过程，从而得到天然进化方法。在该系统中，产生编码待改变的蛋白质的核酸序列的mRNA转录物，然后该转录物通过反转录而重新反转录成cDNA，所述cDNA随后可再次被转录和反转录。 [0048] 使用RNA聚合酶和逆转录酶的该类型扩增已知为PCR的另一种选择。此类已知的核酸扩增方法中的一种是NASBA原理(参见，例如，Romano等人，1995，J.Virol.Methods，54(2-3)：109-119；Romano等人，1997，Immunol.Invest.26(1-2)：15-28)。 [0049] 优选地，通过使用众所周知由于不具有校正功能而具有一定错误率的逆转录酶的反转录步骤，从转录物开始产生了cDNA，所述cDNA通过突变而与原始模板具有一些差异。 如果再次转录和反转录这些cDNA，那么就得到大量在核酸水平上的变体，其编码待改变的蛋白质的变体。 [0050] 在本发明的体外系统中，翻译转录物以形成蛋白质和原始编码的蛋白质的变体。 [0051] 在本发明的表达系统中，在确定的空间中以足够的量存在对于转录、反转录和翻译所需的试剂(例如，引物、dNTPs、NTPs、tRNAs、氨基酸等)。如果在确定的空间于特定位置处例如通过接种(Animpfen)来提供核酸序列S、靶分子X、RNA聚合酶和逆转录酶，那么在进行转录、反转录和翻译时，在接种位置消耗相应的试剂，并形成渐进性的 所谓反应前沿，在所述反应前沿处存在那些转录物、蛋白质和最后形成的反转录物(cDNA)。 [0052] 优选地，如此构建所使用的复制系统，从而其允许在复制过程中产生足够的突变率。通过以实验中世代的总数目作为一个世代中胜者的后代数目的指数来计算理论上以这400 种方式检测的初始构建体的变体的数目(例如每代10个后代，并具有40代＝10 种可能 400 的变体)。尽管这10 种单个变体中的每一个变体不可能在一个实验中明确地以物理形式存在，但系统本身在复杂的可能地域中寻找总是向上导致绝对最大值的“路径”。只有沿着该路径的变体才在实验过程中存在；所述地域的所有点(变体)在理论上都是可能的。 [0053] 本发明的发明者已发现可以以这样的方式控制蛋白质变体的形成，即优选地进行特定的所形成的突变核酸的转录、反转录和翻译，所述核酸编码具有改善的特性的蛋白质变体。因此，编码改善的蛋白质变体的此类cDNA和转录物以更大的量存在并更快速地在聚合前沿处移动。 [0054] 如下产生对于形成非常特定的、改善的变体所必需的进化压力。 [0055] 待改变的蛋白质Y能够结合靶分子X。在本发明范围内，改变蛋白质Y，从而形成其中至少一些可具有改善的与靶分子X结合的结合特性的变体Y’。为了有利于产生这样的变体和任选地更进一步改变此类变体以更大地改善结合特性，如此选择本发明方法中的条件从而X和具有改善的结合特性的变体Y’之间的结合导致编码具有改善的结合特性的变体Y’的那些转录物被优先反转录。从而得倒编码具有改善的结合特性的变体Y’的cDNA。通过促进具有改善的结合特性的变体Y’的转录物的反转录还在数量上有利于变体的再次转录和翻译。 [0056] 为了实现该目的，优选形成由RNA聚合酶、逆转录酶、X和变体Y’组成的复合物，其使得能够反转录那些编码所述变体Y’的转录物。因为RT与编码具有改善的对于X的结合特性的变体Y’的转录物的空间接近性，所以该转录物由与改善的变体Y’相复合(或与其形成融合蛋白)的相同RT反转录。图1示意性地显示了本发明的一个备选的 方法。 [0057] 优选地，在本发明的方法中，Y由核酸S编码为与蛋白质P的融合蛋白，其中蛋白质P是参与转录或反转录的蛋白质。因此，P可以是RNA聚合酶(Pol)或逆转录酶(RT)，或者其可以是可与RNA聚合酶或逆转录酶相缔合或与它们相结合的蛋白质。 [0058] 在本发明方法的两种优选备选方案(1和2)中，蛋白质Y或者(1)与RT相缔合或被编码为与RT的融合蛋白，或者(2)与Pol相缔合或被编码为与Pol的融合蛋白。 [0059] 优选地，Y由核酸序列S编码为融合蛋白。然而，其还可由核酸序列S编码为蛋白质Y，并在翻译后与相应的其他组分相缔合。这可通过蛋白质相互作用或通过结合分子(例如生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白等)来实现。将Y或Y’偶联至RT或Pol的其他可能性尤其包括通过共价连接的化学偶联或通过交联分子例如所谓的连接体如双功能交联剂的连接。在此合适的连接试剂可以毫无问题地由本领域技术人员选择出来。 [0060] 在本发明方法的第一种备选方案的一个变化形式中，由蛋白质Y和RT组成的复合物还可由两个不同的核酸序列S1和S2编码，所述核酸序列S1和S2各自在合适的转录控制序列的控制之下，其中在这样的情况下不出现融合蛋白，而是可以以另一种类型和方式例如通过生物素/抗生物素蛋白或链霉抗生物素产生Y和RT之间的结合。也就是说，核酸序列S在该情况下以两个核酸序列S1和S2的形式存在。重要的是，在翻译结束时，待改变的蛋白质Y结合至RT蛋白，或者以与RT蛋白相复合的形式存在。 [0061] 根据所提及的备选方案，靶分子X或者(1)与Pol，或(2)与RT相缔合，或者与各个组分形成融合蛋白。 [0062] 靶分子X可以是蛋白质、肽或核酸或者另一种分子。因此，可以以核酸(例如在质粒上编码的)的形式提供靶分子X，并在本发明的表达系统中表达其，或者可以以分子的形式提供靶分子X。 [0063] 在第一种备选方案中，由表达盒以与逆转录酶的融合蛋白的形式 编码待改变的蛋白质Y。所述表达盒以核酸序列S的形式提供，所述核酸序列S在本发明的进化方法过程中被转录和翻译。除了转录和反转录外，本方法允许核酸S的转录物的翻译。由此，在第一种备选方案中出现包含待改变的蛋白质Y和逆转录酶RT的融合蛋白。 [0064] 然而，还可根据第二种备选方案，以与X的复合物的形式(或者同样地作为融合蛋白，或者作为其中RT以另一种类型和方式偶联至X的复合物)提供逆转录酶。根据第二种备选方案，由核酸S编码的融合蛋白包含RNA聚合酶Pol而非RT。在该情况下，必须在反应开始时提供RNA聚合酶。因此，如果在允许转录和翻译的条件下进行所述方法，那么通过翻译产生的由S编码的聚合酶Pol在随后的循环中可使用起始核酸S以及任选地其变体S’作为转录模板。 [0065] 转录控制序列优选是可选自适合于RNA聚合反应的所有常用启动子的启动子。T7、T3和SP6 RNA聚合酶启动子优选用于本发明的目的。然而，也可选择其他启动子。 [0066] 因此，为了进行转录而提供RNA聚合酶，其优选选自T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。依赖于所选择的本发明方法的备选方案，RNA聚合酶可以由核酸编码，或者可以以蛋白质(或融合蛋白或复合物)的形式引入表达系统中。 [0067] 对于本发明的目的，重要的是，如果在X和Y或X和Y’之间发生结合，那么该结合使逆转录酶RT在空间上接近转录物。也就是说，产生了由P/X/(Y或Y’)/RT组成的空间复合物。这意味着，在转录反应和翻译反应发生后，刚转录的编码Y’的mRNA分子在空间上接近与蛋白质X相偶联的RNA聚合酶Pol。如果现在蛋白质X和Y或Y’之间发生结合，其中Y或Y’与RT复合，那么优选地RT蛋白在空间上直接接近转录物。在RNA转录物与蛋白RT之间通过Y或Y’的空间接近性促进Y’的转录物的反转录。 [0068] 因此，可以在mRNA水平上产生核酸序列S的变体，然后这导致同样代表变体的翻译产物。以这种方式可以产生待改变的蛋白质Y的变体，即变体Y’。在此，出现与蛋白质X更好地或更差地结合的变 体。 [0069] 在优选的实施方案中，具有更好的与蛋白质X结合的特性的变体Y’的进化优势在于，在转录后短时间内，功能性RT直接接近其自已的转录物从而接近Y’，并优先反转录Y’。由此更快速和/或更多地产生编码改善的变体Y’的cDNA。 [0070] 然后，具有选择优势的这些变体反过来用作起始核酸序列S’，所述起始核酸序列S’可再次被转录、反转录和翻译。以这种方式，优先地从而增加地产生核酸序列变体S’和蛋白质Y的变体Y’，它们可在所述方法进行适当的时间后进行分离。以相同的方式还可以在逆转录酶的变体的产生中利用RT的错误率。 [0071] 本发明的系统经通过选择聚合酶和/或逆转录酶和/或条件来产生原始提供的核酸序列S的变体S’，并从而产生由其编码的蛋白质特别是蛋白质Y的变体Y’，来利用该效应。 [0072] 优选使用具有特定错误率的DNA依赖性RNA聚合酶，从而导致具有突变的转录物。这些突变可以是例如点突变，例如可通过聚合酶产生置换、缺失或插入。 [0073] RNA聚合酶和RT都不具有校正功能，从而有着比具有校正功能的聚合酶更高的突变率。 [0074] 因此，优选使用比相应的野生型聚合酶具有更高的错误率的聚合酶。具有增加的突变率的聚合酶在本领域内是已知的。T7聚合酶和T3聚合酶还有SP6聚合酶是优选的。从T7聚合酶，已经存在具有增加的错误率的变体(Brakmann和Grzeszik，2001，Chem.Biohem.2，212-219)。 [0075] 以相同的方式，还可以使用能够产生具有一定突变率的转录物的逆转录酶。 [0076] 对于Pol和RT，优选地分别使用不具有5’-3’外切核酸酶活性的聚合酶和逆转录酶。为了本发明的目的，可利用RNA聚合酶或逆转录酶的错误率，或两者的错误率。 [0077] 为了产生转录物或/和反转录物，对于所述具有增加的错误率的 Pol和RT分子来说备选地或补充地，还可以以其他方式来增加突变率。例如，可使用诱变剂、作为Pol和/或RT的底物的核苷酸类似物或/和还有例如UV照射。可由专业人员来选择此类诱变物质，因为它们在本领域内是已知的。 [0078] 本发明的方法适合用于体外实施。表达环境可以是适合用于该目的的任何表达环境，优选使用毛细管。然而，不用毛细管，还可以选择二维表达环境，例如两个玻璃板之间的环境。也可能使用三维表达环境。 [0079] 如果使用毛细管，那么在一端，在所谓的接种区域，用核酸序列S对其进行接种。 [0080] 如果使用二维系统，那么可以在角落或在另一位置例如在中间用核酸序列S接种该系统。通过这样的二维系统增加了待改变的蛋白质Y的进化所采取的途径的自由度和数目。所述方法在两种情况下通过观察聚合前沿而保持可控制性。例如，这可通过标记试剂例如嵌入试剂来进行。然后，新的变体形成为更快速的、在毛细管系统中线性扩散或在二维系统中环形展开的前沿。然后，可在毛细管的末端或在二维系统的边缘或在任何其他位置上进行希望的变体的取样或分离。 [0081] 也可以使用大体积的三维表达系统。那么为此应当选择表达环境条件以使反应介质具有更粘稠的性质，因为毛细管作用力较不容易稳定大体积系统中的液体。 [0082] 沿着毛细管或二维或三维系统的聚合前沿的速度可用作变体形成的进程的指标，从而用作待改变的蛋白质Y和其变体Y’的结合特性的改善的指标。 [0083] 此外，相应地调整所有对于转录和翻译来说必需的反应条件。特别地，这些反应条件包括提供作为引物的相应的寡核苷酸和提供核苷酸特别是dNTPs、NTPs等。对于翻译需要相应的酶和试剂，例如核糖体、tRNA、氨基酸、能量载体(例如，GTP等)等。 [0084] 可由专业人员毫无问题地调整这些反应条件，还可由专业人员选择相应的引物寡核苷酸。 [0085] 本发明的方法允许在提供的系统中自主产生蛋白质Y的变体Y’。因此，可以使待改变的蛋白质Y以特定的方向自我发展，所述方向可通过变体Y’与靶分子X的结合能力来控制。 [0086] 因此，可以在本发明的方法中进化任何蛋白质Y。为此，简单地选择能够结合Y的相应的靶蛋白X，并获得具有改善的对于X的结合特性的变体，而无需费时费力的筛选。 [0087] 优选地，在反应前沿分离核酸序列变体S’(RNA或DNA或两者)。然而，还可分离Y’。 [0088] 此外，本发明还涉及用于产生具有改善的特性的蛋白质的试剂盒，其包含 [0089] (a)表达环境， [0090] (b)核酸序列S，其编码可由RNA聚合酶反式激活的表达控制序列，待改变的蛋白质Y，逆转录酶RT， [0091] (c)包含Pol和蛋白质X的复合物或编码该复合物的核酸序列，所述靶分子X能够结合待改变的蛋白质Y的至少一种变体Y’。 [0092] 此外，本发明还涉及用于产生具有改善的特性的蛋白质的备选试剂盒，其包含 [0093] (a)表达环境， [0094] (b)核酸序列S，其编码 [0095] (i)可由RNA聚合酶Pol反式激活的转录控制序列， [0096] (ii)待改变的蛋白质Y， [0097] (iii)RNA聚合酶Pol， [0098] (c)包含逆转录酶RT和蛋白质X的复合物或编码该复合物的核酸序列，所述靶分子X能够结合待改变的蛋白质Y的至少一种变体Y’。 [0100] 图1显示了权利要求1的方法的图解说明。聚合前沿和进化前沿在注满了NASBA反应混合物的毛细管系统中前进。此处在空间上优先产生这样的分子，其编码能够与偶联至T7 RNA聚合酶的蛋白质X相互作用的变体。 [0101] 实施例 [0102] 在大肠杆菌(E.coli)中表达由T7RNA聚合酶(NCBI Genbank，Acc.No.P00573)和蛋白A(Acc.No.CAA43604)组成的融合蛋白，通过亲和层析进行纯化，并将其在PBS/10％甘油中调整至5μg/ml的浓度。然后，以1∶1的比率将抗HIV Env抗体2F5(Hofmann-Lehmann等人，2001；Ferrantelli等人，2003)结合至嵌合融合蛋白的蛋白A结构域(＝RNA-Pol./2F5复合物)。 [0104] 来自Roche，Penzberg的大肠杆菌体外翻译反应混合物(快速翻译系统RTS)与PBS的比例为1∶1。 [0105] +RNA-Pol./2F5复合物至0.05μg/ml的终浓度。 [0106] +10mg/ml PEG4000以增加粘度。 [0107] +RT引物和第二链引物至2pmol/μl的终浓度。 [0108] +dNTP核苷酸至各0.1nmol/ml的终浓度。 [0109] +NTP核苷酸至各0.1nmol/ml的终浓度。 [0110] +任选地，溴化乙锭至0.1ng/μl的终浓度。 [0111] 在加热至37℃的小室中水平固定充满的毛细管，并在一端接种0.5μl的1μM双链DNA分子溶液。该DNA分子包含由HIV-Env和莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录酶(Acc.No.AA046154)组成的融合蛋白的开放阅读框。 [0112] 封闭反应小室，并且接种入的DNA的复制可以以聚合前沿(交替地作为转录物(tRNA)和反转录物(DNA))的形式沿着毛细管在存在有试剂的方向上(朝向另一端)传播。 [0113] 如果向混合物中加入溴化乙锭，则可以使用手持紫外灯在每个小时查明当前聚合前沿的位置，和确定反应的终点(到达毛细管的末端)。 [0114] 在到达毛细管末端后，从毛细管中取出2μl包含聚合前沿(RNA 和DNA)的反应混合物，并使用特异的寡核苷酸通过PCR反应来扩增所含有的DNA。将PCR产物亚克隆入合适的载体中，并转化入大肠杆菌中。 [0115] 384个克隆的序列分析给出了编码经进化的HIV-Env变体的不同序列的统计学分布，所述经进化的HIV-Env变体具有增强的对抗体2F5的亲和力。更详细的研究显示出造成亲和力增加的在变体内的重复蛋白质基元。 [0116] 参考文献 [0117] (1)Bauer，G.J.，J.S.McCasKill and H.Otten.1989.Traveling waves ofin vitro evolving RNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86：7937-7941 [0118] (2)Brakmann，S.and S.Grzeszik.2001.An Error-Prone T7 RNAPolymerase Mutant Generated by Directed Evolution.ChemBioChem.2：212-219。 [0119] (3)Kukarin，A.，M.Rong and W.T.McAllister.2003.Exposure of T7 RNApolymerase to the isolated binding region of the promoter allowstranscription from a single-stranded template.J Biol Chem.278：2419-2424。 [0120] (4)Romano，J.W.，K.G.Williams，R.N.Shurtliff，C.Ginocchio and M.Kaplan.1997.NASBA technology：isothermal RNA amplification inqualitative and quantitative diagnostics.Immunol Invest.26：15-28. [0121] (5)Tanese，N.，M.Roth and S.P.Goff.1985.Expression ofenzymaticallyactive reverse transcriptase in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82：4944-4948。 |
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