作为一个新兴的生命科学领域，蛋白组学建立在基因组研究的基础上，又是后 者的重要发展。蛋白组是一个基因组的所有编码蛋白，蛋白组学则是“在蛋白水平上 研究基因表达，以深入研究生命过程(例如，疾病机理及药物效用)并解码基因表达 的控制规律”。基因组学已经提供了人们关于基因表达与调控对一些疾病和药物治疗 的影响的初步知识。新兴的技术包括基因表达序列分析(SAGE)和基因芯片(已大规模 商业化)，已经大幅度促进了基因组研究。例如，由艾菲矩阵公司(Affymetrix)所生 产的基因芯片(GeneChip)，可同时检测一组基因的表达水平的变化。使用这一技 术，在表面合成一组对应于感兴趣的基因的核酸探针，使之形成一微阵列。样品中 的信使核糖核酸(mRNA)在反转录，括增及荧光标记后，与微阵列中的对应探针分子 结合。使用这一技术，可以检测到最少2倍的信使核糖核酸表达水平变化。基因芯 片得到的基因表达水平数据可以用来生成对应于不同表型或生理状态的基因表达数 据库。但是，基因芯片不能用来研究蛋白的表达，而由于翻译后调控和修饰，蛋白 表达和基因表达往往有本质的不同。
蛋白在建立生命表型的过程中起到核心的作用。因此，与反映基因水平的的信 使核糖核酸相比，蛋白更直接地显示生命的功能。尽管信使核糖核酸表达水平与蛋 白表达水平相关，研究表明，由于不同的信使核糖核酸剪接方式和其它调控机理， 这一相关性并不密切。此外，基因组研究不可能提供对于生命状态举足轻重的翻译 后修饰的任何信息。
目前，大量的蛋白组研究依赖于聚丙烯酰胺双向电泳技术(2DPAGE)。根据不同 的蛋白分子量和等电点，样品(来源于细胞或组织裂解液，或体液)中的蛋白可以在 胶质中被分离。染色成像后经数据处理，对不同样品中蛋白表达水平的增减即可以 做半定量研究。例如，对照疾病和正常生理状态，以及比较药物作用前后的蛋白表 达。传统上，双向电泳所分离的蛋白可以进一步由艾德曼(Edman)方法分析氨基酸序 列。近年来，更多地应用质谱技术来进行未知蛋白的高通量分析研究。但是，双向 电泳技术本身需要花费大量的时间。而且，质谱技术需要昂贵的专门化设备，限制 了它的临床应用。在临床上广泛应用的固相蛋白免疫技术，如酶联免疫技术、荧光 免疫技术和放射性免疫技术，都很难应用于高通量蛋白组研究。
上世纪八十年代以来扩散限制的固相免疫反应受到了广泛的研究。为加速酶联 免疫技术的反应动力学，人们创造了一种新型的酶联过滤免疫技术(ELIFA，www.皮 尔斯.c皮摩尔/files/ACF15B.pdf)。但是，酶联过滤免疫技术是一种依赖于多孔板的 低通量的技术，只能在多孔板每个孔槽中固定一种捕获分子，因此其实验效率受制 于孔槽的数目。进一步说，酶联过滤免疫技术所需要的抗体和样品量也不能满足微 量分析的需要。
新兴的蛋白芯片，即蛋白微阵列技术，可以避免这些传统技术的缺点。芯片技 术是一种崭新而有效的高通量蛋白组研究工具，可研究蛋白表达、蛋白间相互作用 以及酶活性。目前大多数蛋白芯片技术是基于固定在表面上的捕获分子与样品溶液 中的待分析蛋白的反应。简单说，一系列的捕获分子，例如抗体，先被打印到表面 上以形成一微阵列。然后，少量的标记后的蛋白样品被加到微阵列表面上。经过一 段时间的振荡混合及反应，待分析物结合到它们对应的捕获分子上。这些反应可以 通过每个捕获分子微点的荧光信号来检测，其信号强度直接反映待分析物浓度、数 量及其与捕获分子的亲合力。因为一个微阵列可以包括很多种不同的捕获分子，它 就可以同时检测多种待分析蛋白的表达和蛋白间的相互作用。麦克白(Macbeath)和 和施莱伯(Schreiber)第一次展示了应用蛋白芯片技术进行高通量蛋白相互作用研究 的巨大潜力。在他们的一个实验中，两种捕获分子G蛋白(Protein G)和普乐可复结 合蛋白-结合蛋白(FRB)分别在一片载玻片上打印了10799次和1次。然后，该芯片 同花菁5标记的普乐可复结合蛋白反应，他们发现只有普乐可复结合蛋白-结合蛋白 微点有信号，表明普乐可复结合蛋白(FKBP12)被普乐可复结合蛋白-结合蛋白特异地 检测到。在另一实验中，三种不同捕获分子被打印到表面上，包括抗地高辛(Anti- DIG)、链菌素(Streptavidin)和普乐可复结合蛋白。然后，将生成的芯片与牛血白 蛋白-地高辛-艾力克萨488牛血白蛋白-生物素-花菁5(BSA-DIG-Alexa488 BSA- Biotin-CY5)和牛血白蛋白-六氢吡喧酮胺-花菁3(BSA-AP1497-Cy3)分别反应，发现 只有每种待分析物对应的捕获蛋白微点才有荧光信号。此外，如果与上述三种待分 析物蛋白的混合物反应，则所有微点都表现出荧光信号。这一实验进一步证明了蛋 白微阵列可以同时特异性地检测多种待分析物。
一些近期的研究结果进一步表现了蛋白芯片技术的有效性。但是，大多数的蛋 白芯片设计多仿照于基因微阵列的设计，即，捕获分子打印在载玻片上，反应通过 振荡完成。这一方法对蛋白组研究实际上并不适合，主要因为固相蛋白反应受到严 重的扩散限制，而通常所用的基因芯片材料则不适合固定蛋白捕获分子。具体来 说，固定在表面上的微阵列与待分析物之间的反应极度依赖于振荡混合，而后者的 效率往往受限制于待分析物分子在固-液界面的边界层中的缓慢扩散过程。因为蛋白 不能象DNA一样被括增，边界层中少量的蛋白极容易被消耗尽，因此扩散过程对蛋 白芯片反应的限制程度远比对基因芯片技术的限制严重。
另一方面，由于蛋白和核酸在物理化学性质上本质的不同，玻璃表面不适合固 定蛋白分子。核酸分子是一维的线性结构，而蛋白的构像是三维的，而且任何相对 于蛋白自然构像的偏差都可能影响蛋白的正常功能。因此，目前的蛋白芯片设计中 存在抗体在打印到表面后改变构像和活性的问题。另一方面，DNA之间的相互作用 较蛋白相互作用要更强和更为特异。DNA相互作用是通过一系列的碱基配对完成 的，可以保证很高的结合力和特异性。而蛋白相互作用往往是小范围内的作用。因 此，为达到一定的信号强度，蛋白芯片要求高的待分析物浓度，或者表面上大量的 捕获分子。因为蛋白样品不能被括增，所以只有后一方案可行。而常用的玻璃表面 达不到这一要求。然而，表面高浓度的捕获分子不可避免地导致扩散限制的缓慢的 反应动力。
为消除扩散限制的影响，人们尝试了不同的方法。纳米基因公司(Nanogene)运 用定向电泳技术来加速DNA芯片的反应，即，使待分析DNA分子在电场作用下向固 定的探针运动以加速反应。但是，蛋白的电性质远比DNA复杂，它们可能会在所加 电场下向不同的方向以不同的速度运动。近来基因逻辑公司(Genelogics)发展了一种 过滤型基因芯片技术：基因探针固定在活化了的多孔硅片上以形成芯片，待分析 DNA分子标记后滤过芯片，并与其上的基因探针分子反应。这一通过对流而不是扩 散的方法可以大幅度加速反应过程。而且，多孔硅片具有较大的表面积，可以固定 更多的探针分子以进一步提高信号强度。另一类似的设计是梅特基因公司(MetriGenix) 的4维DNA芯片。但是，硅片需要预先进行化学处理活化后才可以结合蛋白，而且 其活化层往往不稳定。

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种运用过滤型蛋白芯片技术检测 特异待分析物的系统集成和实验方法，包括一个或多个多孔纤维素膜作为芯片材 料，以及由一组对不同待分析物具有特异性的捕获分子在纤维素膜上形成的微阵 列。这种芯片系统可以容许含有样品蛋白的溶液滤过，并且捕获样品中特异的待分 析物分子。在不同的过滤型芯片系统设计中，纤维素膜可以是硝酸纤维素酯，或硝 酸纤维素酯和醋酸纤维素酯的混合酯。
在本发明通常所用的具体设计中，待分析物是取自细胞裂解液或体液样品的蛋 白或小分子化合物。捕获分子则可以是蛋白、小分子化合物或者核酸。
本发明提出的过滤装置，包括一个可以放置一个或一叠平行的蛋白芯片的芯片 室，以及一个使样品通过芯片反复过滤的驱动装置。
本发明描述检测特异待分析物的实验方法，包括过滤反应和反应后对待分析分 子的定量检测。本发明所用的一些具体设计中，所检测的待分析分子可以是对某一 疾病特异的标记分子。
本发明的一个目的是能够提供改善了的系统和方法，以便达成更灵敏，更特 异，也更快捷的待分析物检测。
本发明的另一目的是改进高通量多待分析物联检的实验方法。
本发明的另一目的是发展和改进对疾病诊断有特异性的检测方法。
以上及其他未提及的目的，以及本发明的具体特征和优越性将在后文(包括申报 条目)作进一步的详细说明。
附图说明
图1a-图1c比较硅片和纤维素膜的电子显微镜照片。图1a所示硅片厚度为150 微米。其中微通道直径约为1.5微米，结构横截面如图1b。图1c为混合酯纤维素膜 的截面图(比例尺：10微米)
图2a-图2b为多芯片过滤系统的模式图。基于传统的玻片载体和通过多芯片过 滤的反应分别图解于图2a和图2b。
图3a和图3b描述本专利装置的设计。图3a是整个系统，包括芯片室，注射 器，一可同时驱动多个注射器的泵(未在图中画出)和必需的“管子”。图3b给出芯片 室和注射器的详细设计。
图4示意我们研究反应动力学时所采用的微阵列。前五行是捕获分子，最后一 行是预先标记的标准蛋白。每一种打印的分子包括三种浓度。
图5a和图5b比较洗涤剂和洗涤方法对荧光标记了的蛋白与纤维素膜结合的影 响。
图6是洗涤剂对未标记蛋白与纤维素膜结合的影响。
图7a和图7b比较纤维素膜和玻璃片的反应结果。
图8比较癌胚抗原(CEA)与抗癌胚抗原(ACEA)(1毫克/毫升)结合时，过滤反应 和振荡反应不同的动力学。
图9a-图9d比较反应15分钟(图9a过滤，图9b振荡)和45分钟(图9c过滤， 图9d振荡)后的微阵列图像。
图10是经过60分钟反应后的标准化后的荧光强度。
图11a-图11c是检测低浓度蛋白的结果。图11a：过滤实验，待分析物浓度 0.064纳克/毫升。图11b：振荡实验，待分析物浓度0.064纳克/毫升。图11c：振荡 实验，待分析物浓度1.6纳克/毫升。
图12a-图12d表示用过滤型芯片技术检测不同待分析物时的动力范围。图12a 人血白蛋白(HSA)，抗-人血白蛋白(AHSA)浓度为1.0毫克/毫升。图12b：癌胚抗 原，抗-癌胚抗原浓度为1.0毫克/毫升。图12c：鼠免疫球蛋白(MGG)，羊抗鼠免疫 球蛋白(GAM)浓度为1.0毫克/毫升。图12d：新链霉素(Neutravidin)，酪蛋白-生物 素(Ca-Biotin)浓度为1.0毫克/毫升。
图13比较过滤型芯片和振荡型芯片检测癌胚抗原时的不同动力范围(抗-癌胚 抗原浓度为1.0毫克/毫升)。
图14是动力范围与捕获分子表面浓度的关系。
图15比较过滤型芯片和振荡型芯片表面上的非特异性结合造成的背景。
图16a-图16c表明过滤型芯片技术可以避免因长时间振荡反应所带来的非特异 性交叉反应。第一行，抗-人血白蛋白和抗-癌胚抗原；第二行，羊抗鼠免疫球蛋白 和蛋白G。(图16a，过滤，60分钟；图16b，振荡，60分钟；图16c，振荡，12小 时)
图17表明抗-人血白蛋白与表面人血白蛋白微点的结合与微点位置无关。实验 方法：人血白蛋白-艾力克萨546(HSA-Alexa546)沿13毫米直径的滤片的径向均匀 打印，然后该芯片与抗-人血白蛋白-艾力克萨647(AHSA-A647)反应。反应及成像 后，得到每个微点在两个荧光通道内的信号强度。图17所示是艾力克萨647 (Alexa-647)通道内的信号强度与A546通道内信号强度的比值。
图18表明用过滤方法同时反应8个芯片，所有芯片的结果类似。最上面两行 (芯片1-8)是多芯片重叠过滤反应的结果，最底下一行(芯片9-12)是振荡反应的结 果。每个芯片上的平均样品体积是60μl。
图19a-图19b进一步证明多芯片重叠过滤反应后信号强度的均一性。图19a和 19b分别是6芯片和8芯片重叠的情况。
图20a表明用不同芯片重叠可以特异性地检测到不同蛋白。本例中，一片“正” 芯片(含抗-人血白蛋白，上图)夹在多个“负”芯片(不含抗-人血白蛋白，下图)中 间。图20a正芯片，艾力克萨-647通道，显示被抗-人血白蛋白微点所捕获的人血 白蛋白-艾力克萨647分子(HSA-A647)。图20b正芯片，艾力克萨-488(Alexa-488) 通道。图20c负芯片，艾力克萨-647通道。图20d负芯片，艾力克萨-488通道。
图21比较链菌素-1号藻胆体(Streptavidin-P1L)(2微克/毫升)和链菌素-艾力 克萨647(20纳克/毫升)与牛血白蛋白-生物素(BSA-Biotin)微阵列的反应。注意链 菌素-1号藻胆体和链菌素-艾力克萨647中的链菌素摩尔浓度是一样的。结果包括 (a)过滤反应，链菌素-1号藻胆体，(b)过滤反应，链菌素-艾力克萨647，(c)振荡 反应，链菌素-1号藻胆体，(d)振荡反应，链菌素-艾力克萨647。
图22显示在多芯片重叠反应中使用1号藻胆体(P1L)时的均匀反应结果。图 22a和图22b分别是上面和下面的芯片。
图23表明双抗体夹心法的结果要优于直接标记蛋白的结果，并且过滤型双抗体 夹心技术要优于振荡型双抗体夹心技术。
图24表明双抗体夹心-过滤型芯片技术可以检测到正常人血液中5纳克/毫升的 癌胚抗原浓度变化。
图25显示胰腺癌病人血浆中的癌胚抗原的检测结果。对照取自两个正常人，而 癌症样品是三个。依据非配对-t统计，正常人和癌症病人血液样品的信号强度之间 的差别十分显著。
图26是核酸适合体(适合体)芯片的示意图。
图27显示适合体芯片的特异性。比较图27a，10纳克/毫升的凝血酶(Thrombin) -艾力克萨647，10分钟过滤反应，和图27b，1微克/毫升的白蛋白(人血白蛋白)-艾 力克萨647，10分钟的过滤反应。
图28比较适合体芯片过滤与振荡反应的反应动力学。
图29比较适合体芯片经过10分钟过滤反应(左图)和振荡反应(右图)后的芯片 图像。
图30是使用适合体芯片检测凝血酶时的动力范围

通过详细说明常用的具体设计和给出相应的例子，我们希望读者可以比较清晰 地了解我们的发明。在说明我们现用的材料，系统和实验方法时，我们需要指出本 发明并不限定于任何特定的材料，特定的抗体或其它捕获分子，特定的待分析物， 特定的实验条件，或者特定的实验方式方法，等等。根据具体情况，有经验的使用 者可以很容易地对实验设计做出相应的调整。此外，我们所采用的具体方法只是为 了描述本发明，而不是限制本发明的范畴。文中凡涉及“一”个/种捕获分子或待分析 物均泛指一类或多种。
为达成本发明的目标，我们提出了运用过滤型蛋白芯片技术检测特异待分析物的 系统集成和实验方法，包括一个或多个多孔纤维素膜作为芯片材料，一组对不同待 分析物具有特异性的捕获分子在纤维素膜上形成的微阵列。这种芯片系统可以容许 含有样品蛋白的溶液滤过，并且捕获样品中特异的待分析物分子。
在不同的过滤型芯片系统设计中，纤维素膜可以是硝酸纤维素酯，或硝酸纤维 素酯和醋酸纤维素酯的混合酯。为了使样品可以过滤过芯片，本系统中不能使用二 维的非通透的固体表面，例如载玻片。
纤维素膜的制造方法已相当成熟。一般来说，利用硝酸中的硝基集团取代羟基 可制造硝酸纤维素酯，利用醋酸中的醋酸集团取代羟基可制造醋酸纤维素酯。常用 的硝酸纤维素膜是90％硝酸纤维素酯和10％醋酸纤维素酯的混合物。
干燥的纤维素膜易溶于有机溶剂形成纤维素漆。溶剂蒸发后纤维素漆中的多聚 物形成一薄膜。通过加入不溶解纤维素的液体，例如水，就可以制造多孔的膜。孔 隙来源于溶剂和非溶剂不同的蒸发速度。因此，孔隙度和孔隙大小可以方便地通过 非溶剂成份的比例来控制。生成的薄膜即是如图1c所示的三维多孔结构。纤维素膜 的孔径可以在0.05至10微米之间，我们常用纤维素膜的孔径在0.2至5微米之 间。
在薄膜制造过程中加入表面活性剂可以使生成的纤维素膜易于结合水溶液中的 分子。常用活化剂包括洗涤剂十二烷基磺酸钠(SDS)和磷酸三丁酯(Triton X100)。捕 获分子的结合可以简单地通过溶剂的蒸发来完成。
根据需要，芯片载体也可以通过不同的化学修饰来改善其表面性质和功能。例 如，可以使蛋白与表面的共价结合。此外，芯片载体可以预先吸附一层聚乙二醇 (PEG)，以减少非特异性的待分析物-表面相互作用。捕获分子亦可以通过其它方式 结合到表面，例如生物素-抗生物素蛋白链菌素。表面修饰的类型取决于待检测样 品，以及固定某一类捕获分子的要求。
通常情况下待分析样品是蛋白。该蛋白可以是抗体。通常样品来源于细胞裂解 液或体液。因此，检验样品中对某一疾病或其它生理状态特异的蛋白就可以用来诊 断或预后该疾病或生理状态。此外，分析样品还可以是其它类型的分子。例如，一 个用来筛选特异药物的人工合成了的化学药品库。蛋白芯片的高通量特性使其尤其 适于大规模的筛选工作。
本发明中，多于十种的捕获分子可以打印到芯片上。在一些具体的系统中，捕 获分子可以是单克隆或多克隆抗体，也可以是其它蛋白、核酸或以上的混合物。这 些捕获分子可以是从生物体内纯化得到的，也可以是人工合成的。
“阵列”的定义是在芯片载体上一组具有可识别位点的捕获分子。“微阵列”是具 有极小尺度的阵列，只需要很小量的捕获分子和待测样品。在一个阵列里，所有类 型的分子都是可定位的，即其在阵列中的二维坐标可以可靠地确定出来。每种类型 的分子的定位是在打印时就决定了的，以确定样品中对应分子的类型。通常，阵列 是对称的网格结构，但是也可以是其它式样(例如小范围密集的小阵列簇)。
本发明对捕获分子在打印后形成的“微点”没有很严格的限制。一般来说，捕获 分子微点就是指对待分析物特异的蛋白或核酸在某一位置的集中吸附，其形状不一 定是圆形或近似圆形。方形或矩形(例如转膜后的蛋白带)，甚至三角型、椭圆型和 不规则形状的微点均可以应用在本发明所指微阵列中微点大小(通常定义为微点外切 圆的直径)在本发明中也没有严格的限制，通常是在0.1到0.5毫米之间。一般在矩 形或方形的阵列中，微点边缘的间距是在0.2到1毫米之间。
微阵列打印机，或称点样仪，有几家公司的产品可以满足本发明的需要。根据 不同的点样技术，它们可以分为接触式打印和非接触式(喷墨)打印两种类型。接触 式打印机包括艾菲矩阵(Affymetrix)，法玛西亚(Amersham Pharmacia)，生物机器人 (BioRobotics)和基因机器(GeneMachine)等公司的机型，点样是通过打印针头与芯片 表面接触而打印的。非接触式打印机，以珀金-埃尔默公司(Perkin-Elimer)的生物 芯片机型(Biochip)为代表，则是用压电装置在芯片表面上方400微米处射出样品。
选择合适的点样系统主要取决于实际的应用，包括通量、打印速度、待打印样 品(蛋白或DNA)，对打印容量精度的要求以及微点密度。通常，接触式打印机所用打 印针相对便宜，而且每一打印针不必单独控制，所以系统可以集成较多的针头。例 如，生物机器人公司的微格二号系统(MicroGridII)可以同时容纳64个打印针，可 以大幅度提高打印速度。与此不同，非接触式打印机，需要对每个打印笔单独做压 力和打印控制，所以每个打印笔比每个接触式打印机的打印针昂贵得多，也就限制 了系统的通量。样品盘的数目也影响打印的效率，但是通常可用外置的自动样品盘 加载机提高通量。具体的系统匹配最终取决于具体的实验环境。
与接触式打印机依赖于表面张力的打印方法相比，非接触式打印机主动地射出 样品，因而可以更可靠地打印高粘度的样品，比如高浓度的蛋白溶液。这一技术还 可以减少使用不同打印笔所造成的打印误差。生物芯片(Biochip)系统中每个打印笔 内都有一个单独的超声清洗装置，因而可以大幅度减少样品对笔头的污染。此外， 它还可以较好地控制样品打印容量，而接触式打印机则不行。其唯一不足是打印通 量较低(每平方毫米16个微点，而通常接触式可以达到64个)。
一种待分析样品可能会和多种捕获分子反应。例如，一个蛋白上可以有对应多 个克隆的抗体的位点。反过来，假如几种不同的待分析物有类似的结合位点，则一 种捕获分子也可能同时和这些待分析物结合。“蛋白结合的适合条件”通常是指待分 析蛋白与捕获分子之间在溶液中可以反应时的盐度、酸碱度、浓度、温度等条件。 通常，在这些条件下非特异性结合并不明显。因此，使用双抗体夹心法可以有效地 提高检测的特异性。
“正常生理状态”是指生物体或细胞内的典型状态。尽管一些生物体内具有较个 别的条件，一般说生物体和细胞内酸碱度在7左右(6.5-7.5)，以水为主要的溶剂， 温度在0-50摄氏度之间。盐浓度根据不同生物、器官、细胞和细胞区域，会有所不 同。
每种捕获分子至少特异性地结合一种待分析分子。本文中，“结合”和“捕获”都 是指待分析物和微阵列芯片上对待分析物特异的捕获分子之间的可检测的相互作 用。检测方法包括但不限于本文所涉及的技术。
本发明所采用的实验装置中，多个芯片可以平行叠放在一起，让样品一次可以 通过一组微阵列并反应，如图2b所示。实验装置的示意图见图3a和3b，包括一个 芯片室、与之相连的注射器和一个能往复驱动样品流动的泵。所用的泵可以同时以 预先设定的速度驱动多个注射器。通常，芯片室不与注射器相连的一端是不封闭 的，以便加载样品；相应地，该装置处于竖直状态，以避免系统中残存的气泡。
因此，本装置可以同时叠放1-10甚至更多的芯片，然后待分析样品可以完全过 滤通过整套芯片。当每个叠放的芯片上有预先打印的捕获分子时，任何一个芯片都 可以特异地检测不同的待分析物。例如，我们成功地测试了14片叠放在一起的芯 片，每片上有1600个微点。经过30分钟的反应，我们可以同时检测整个系统中 22，400个微点的反应结果。
本发明提供检测特异待分析物的实验方法，包括过滤反应，以及反应后对待分 析物结合的检测。本发明所用的一些具体设计中，所用检测的待分析物可以是对某 一疾病特异的标记分子。在某些实验中，待分析物取自细胞裂解液或体液。“体液” 可以是任何生物体的组织、器官所包容、分泌的液体。体液可以含有或不含有细 胞。与本发明相关的体液包括全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、精液、泪液、鼻 窦分泌物、胆汁和羊水。
在某些实验中，检测是通过直接标记待分析物来完成的。例如，待分析物可以 用荧光标记。另一种方法是用标记了的检测抗体来检测捕获在芯片上的待分析分 子。荧光信号可以由荧光扫描仪获得。除荧光方法外，还可以用比色、发光或放射 性同位素等检测方法。
在实验中，每一步反应后都要进行清洗以洗去非特异地结合的待分析物。然 后，再检测结合在特定捕获分子上的待分析物。
本发明涉及一系列检测微阵列芯片上的待分析分子的方法，包括必需化学试剂 和具体步骤。这些会在例子中详细说明。由这些方法可以比较容易地进一步发展其 它相关的检测方法。
本发明中对待分析物具有特异性的捕获分子可以是经过纯化的，就是说，在正 常状态下与该分子结合的其它分子(例如其它细胞成份、培养基及合成时所需化学药 品)都已经与之分离。
本发明可以用来进行蛋白之间相互作用研究。例如，一组纯化的蛋白样品可以 形成一个微阵列，然后该微阵列可以同一个探针分子进行反应(可以是小分子、肽、 蛋白或核酸)，以筛选与之结合的蛋白。
另外，本发明还可以研究微阵列与多个样品的相互作用。两种不同的待分析分 子可以顺序与微阵列反应。第二种待分析分子反应之前可以先把第一种待分析分子 解离掉。这一方法可以很快地研究多个样品与微阵列中的多个蛋白之间的相互作 用，因而可以比较完善地研究微阵列中蛋白的结合和功能特征。
微阵列技术中通常使用荧光检测方法。为了可靠地探测高密度阵列中小至100 微米的微点，通常使用具有高灵敏度高分辨率的荧光芯片扫描仪。目前，主要的扫描 仪供应商包括艾菲矩阵公司，法玛西亚公司，珀金-埃尔默公司和基因机器公司。激发 光源包括激光(具有良好的单色性和较少的荧光通道间互扰)或白光光源(可激发较多 波长的荧光分子)。探测器包括光电倍增管(图像通过逐点扫描获得)，或CCD相机 (同时成像多个像素)。目前，大多荧光芯片扫描仪采用激光-光电倍增系统，其最佳 分辨率可达到5微米。其灵敏度可以达到每平方微米1个荧光分子，但是，实际实 验中灵敏度会受到非特异性背景的影响。共聚焦显微技术和暗场技术也被应用到一 些芯片扫描仪中。但是，我们发现共聚焦扫描仪(如珀金-埃尔默公司的扫描阵列 (ScanArray)，聚焦深度30微米，分辨率1微米)不适用于不平整表面或比较厚的芯 片载体，因为这些样品要求比较大的成像厚度，因而共聚焦扫描仪不能有效地收集 芯片载体中所有的信号。暗场显微技术会减少信号，但是同时它又可以大幅度减少 粗糙表面(如纤维素膜)上杂散光产生的背景信号，从而提高信噪比。暗场扫描仪， 如基因机器公司的一个机型(GeneTac LSIV)，聚焦深度高达+/-500微米，分辨率可 至1微米，可以较我们现在使用的扫描阵列更好地检测纤维素膜上的微阵列。此 外，当分辨率和灵敏度不很重要时，通常用来检测电泳胶和转膜结果的荧光扫描仪 也可以用来扫描芯片。我们使用了FLA-3000荧光仪(富士，最高分辨率50微米，非 共聚焦)，发现其对纤维素膜上荧光的定量十分准确。
此外，还有多种检测方法可以应用于本发明中的芯片系统。例如，化学比色、 化学发光、化学荧光及其余荧光方法(如时间分辨、全反射、光波导光谱、纳米粒 子、红外、极化、相关、能量传递等)。此外，也可使用不需标记样品的技术，包括 表面等离子体共振(SPR)、布鲁斯特恩(Brewster)角度显微镜、椭圆偏振光、表面电 传感器、表面力传感器等等。石英晶体微天平技术和解离-质谱技术也可应用于本技 术。
如不加说明，技术名词采用常规用法和译法。本文中，“蛋白”是指由肽键连 接的氨基酸残基的聚合物，包括蛋白，多肽，以及任何大小、结构及功能的肽。蛋 白也可以指含有人工合成的氨基酸的聚合物。含有一个或多个人工氨基酸的氨基酸 聚合物在本文也称做“蛋白”。“蛋白片断”是指完整蛋白的一部份。例如，从细 胞中得到的完整蛋白经过酶消化后的含6-30个氨基酸的多肽。
本发明中主要采用纤维素膜作为过滤型芯片的载体。在实验中，一组捕获分子 被打印到一个或多个纤维素膜上形成微阵列芯片。然后使含有多种待分析物的样品 过滤通过这些芯片，使待分析分子易于同与其相应的捕获分子结合。尽管人们早就 认识到纤维素膜是一种具有高蛋白结合能力和高亲水性的材料，并且在玻璃片上加 纤维素涂层用来作为蛋白芯片载体也已经商业化，但这一材料从未应用于过滤型芯 片技术。本发明证明过滤型芯片技术可以消除传统方法中的扩散限制，从而加速反 应，提高灵敏度，拓宽动力范围，并达到更特异、更定量的检测。
纤维素膜是最常用的蛋白结合膜。纤维素膜的蛋白结合能力取决于具体的蛋 白、纤维素的侧链修饰(硝酸酯或醋酸酯)以及电性。对大多数蛋白来说，硝酸纤维 素的结合能力要比醋酸纤维素高5-10倍，是固定蛋白的常规材料，而后者常用于细 菌分离。纤维素的混合酯，是硝酸酯和醋酸酯的混合物。硝酸纤维素膜比其它膜更 适用于做蛋白芯片的载体，因为其蛋白结合能力、亲水性都较好，而非特异背景很 低。
另一种常用的蛋白结合膜是尼龙。尼龙的优点是比较容易对其进行化学修饰。 不同的带正电、带负电以及电中性的尼龙，分别适用于结合不同类型的分子。某些 类型的尼龙膜可以结合到每平方厘米400微克的蛋白。但是，这样高的蛋白结合能 力同时会导致较高的非特异性结合，因此尼龙膜往往很难封闭。我们测试了“高 电”(MagnaCharge)尼龙膜(奥斯莫尼克斯公司，Osmonics)，发现其背景不论使用牛血 白蛋白(BSA)、酪蛋白(Casein)还是GELATIN封闭都很高。但是，我们没有测试过的 一些尼龙膜如果与其他封闭试剂合用，仍然有可能应用于蛋白芯片。例如，“高 图”(MagnaGraph)尼龙膜(奥斯莫尼克斯公司)采用特殊处理以减少背景，就可能适合 蛋白芯片的某些应用。
我们还测试了另外一种可以使用在过滤型蛋白芯片系统中的膜，超结合膜 (UltraBind)(保罗-格尔曼公司，Pall Gelman)超结合膜是表面有活化醛基的的聚醚 砜膜。其优点是可以共价连接蛋白。反应结果与使用纤维素膜的结果类似。但是， 我们发现超结合膜的表面不如纤维素膜平整，而且散射光非常强。此外，与纤维素 膜不同，吐恩20不能有效地洗脱超结合膜膜表面非特异结合造成的背景。
玻璃和硅片都要求经过表面修饰后才能结合蛋白；与玻璃片相比，玻璃纤维滤 膜和硅片的多孔结构可以提供更大的结合表面积，因此可以固定更多的蛋白。图1b 所示的硅片曾用于过滤型基因芯片技术。但是，与修饰过的玻璃片类似，其疏水表 面不适合与蛋白结合。而且，玻璃或硅片的表面修饰不稳定，也不容易保持各批产 品间的一致性。
表1.比较不同蛋白结合表面

聚偏二氟乙稀(PVDF)也是免疫杂交中常用的膜。但是，它具有很强的疏水作 用，需要用有机溶剂预先湿润后才可以结合蛋白，而打印过程中不可能保持这一 点。尼龙膜具有较强的蛋白结合能力，但是也通常具有很高的非特异性背景。除多 聚物膜外，聚丙烯酰胺也可以镀在玻璃片上来固定蛋白。珀金-埃尔默公司拥有对这 一技术的专利。聚丙烯酰胺胶基质的缺陷是它机械强度非常差，需要用别的材料来 加固。与这些材料相比，纤维素具有高的蛋白结合能力，高度亲水的表面，以及比 较好的强度。
除了具有不同的机械性能，纤维素膜和硅片具有截然不同的微孔形态。图1中 的电子显微镜结果表明，纤维素膜中的纤维结构是随机的(图1a)，而硅片中的微孔 是垂直于滤片表面的(图1b[35])。实际上，纤维素膜和硅片通常分别被称作深度过 滤器和膜过滤器。一般来说，深度过滤器允许较快的流速，而且不容易被大的颗粒 堵塞；而膜过滤器常用来阻挡较大的颗粒，且易于被堵住。此外，纤维素膜比硅片 的价格要便宜得多。
常用蛋白芯片设计中的扩散-限制反应动力学
如前所述，固相反应中扩散限制是很常见的现象。当表面上捕获分子的浓度较 高时扩散限制更为显著。现举例说明：考虑一对分子A和B，结合后形成一个复合 物C
$A+B\underset{k_{\mathrm{off}}}{\overset{k_{\mathrm{on}}}{\iff }}C---\left(1\right)$
这里kon和koff是反应固有的结合和解离动力学常数。如果A固定在一表面上，且具 有表面浓度As，那么A-B之间在表面上的反应可以写作：
$A_S+B_S\underset{k_{\mathrm{off}}}{\overset{k_{\mathrm{on}}}{\iff }}{C}_S---\left(2\right)$
这里Bs是B在固-液界面上的体积浓度。C在表面上的生成速度即为：
$\frac{d{C}_S}{\mathrm{dt}}=k_{\mathrm{on}}{A}_S{B}_S-k_{\mathrm{off}}{C}_S---\left(3\right)$
C的生成速度应该等于B消耗的速度。在准定常状态下，后者进一步等于B分子从 溶液中向表面的输运速度。因此
$\frac{d{C}_S}{\mathrm{dt}}=k_{\mathrm{on}}{A}_S{B}_S-k_{\mathrm{off}}{C}_S=k_m(B_0-B_S)---\left(4\right)$
B0是B在溶液中的平均浓度，km则是质量输运系数。注意km具有速度的量纲。从上 式中消去Bs，求得
$\frac{d{C}_S}{\mathrm{dt}}=\frac{k_m{k}_{\mathrm{on}}}{k_m+k_{\mathrm{on}}{A}_S}{A}_S{B}_0-\frac{k_m{k}_{\mathrm{off}}}{k_m+k_{\mathrm{on}}A}{C}_S---\left(5\right)$
当B浓度很低，A的消耗可以忽略不计，As近似为常数，上式简化为
$C_S=\frac{k_{\mathrm{on}}}{k_{\mathrm{off}}}{A}_S{B}_0(1-e^{-k_{r}t})---\left(6\right)$
和
$k_r=\frac{k_{\mathrm{off}}}{1+A_S{k}_{\mathrm{on}}{k}_m^{-1}}---\left(7\right)$
由式6-7可见，表观反应动力常数kr同时依赖于固有反应速度常数和质量输运系 数。尽管增加捕获分子的浓度(As)可以提高Cs，即实验的信号，同时它也导致更低 的kt，即反应被减慢了。特别是，如果反应是靠振荡来完成的，边界层内的质量输 运完全依赖于扩散，km可以由B的扩散率和边界层厚度求得：km＝D/δ。对几万道 尔顿分子量的蛋白来说，D大约是5×10-7cm2/s。如果振荡速度是1厘米/秒，一个 载玻片上的边界层厚度大约为100微米。因此，km大约为5×10-5cm/s。假定As是 15微克/平方厘米，如果捕获分子是抗体(150,000道尔顿)，As即为100nM-cm＝ 1×10-7M-cm，对于典型表面抗原-抗体反应，kon＝105M/s，konAs就是1×10-2cm/s， 大约是km的一千倍。因此，表观反应动力常数kr就会比固有的koff还要慢三个数量 级。以上对扩散限制反应动力学的估计也适用于As或B0略有减少的情况。
过滤方法可以消除扩散限制和加速反应
与传统的非通透芯片载体不同，过滤型蛋白微阵列是打印在对蛋白样品可以通 透的载体上。我们也摈弃了传统的水平振荡方法，而是让样品滤过芯片。垂直于芯 片表面的流场可以有效地补充在芯片表面被消耗掉的待分析物分子，从而大幅度提 高km，加快反应速度。例如，如果km＝Vz＝0.1cm/s，则kr＝0.67koff，这 已经很接近于固有的koff。
多芯片过滤反应系统
本发明中还提出一种多芯片重叠技术。本发明中所使用实验装置可以重叠放置 1-10或更多的蛋白芯片，然后待分析的蛋白样品可以通过整个芯片集成。这一装置 和方法可以减少每个芯片所需要的样品体积，大幅度增加反应通量，而且同时提高多 个芯片的反应效率。
当叠放的芯片各不相同时，本系统中任何一层芯片上的捕获分子都可以特异性 地结合对应的待分析物。该方法可以用于包括10个芯片以上的比较大的系统。例 如，我们使用25毫米直径的芯片，微点间距0.5毫米，则每个芯片上打印1600个 微点；然后重叠放置13个负芯片和1个正芯片，我们同时实现了24000个微点的 反应。这相当于2-3个载玻片的通量。如果微点直径和间距进一步缩小，总的微点 数目还可以提高。因此，重叠反应系统可以大幅度提高微阵列技术的实验通量。
多芯片叠置的方法还可以减少每个芯片所需的样品量。为了消除芯片打印所带 来的误差，最好能够用多个芯片来分析同一样品；因此，对有限的样品量，每个芯 片所能得到的样品量和所需测试的芯片数目互为反比，互相矛盾。使用振荡方法 时，如果芯片上的样品体积过低，反应就完全为扩散所限制，导致极其缓慢的反应 速度。但是，如果使用本发明提出的多芯片过滤方法，尽管每个芯片上平均的样品 体积不大，但是总体积足以产生宏观的跨膜对流，从而大幅度提高反应效率。
荧光分子的选择
标记待分析物的荧光分子直接影响蛋白芯片的实验结果。目前芯片技术中多采 用直接标记分析分子的方法。与酶方法相比，荧光方法较直接，而且空间分辨率 好。而且，比同位素标记稳定，且基本没有生物毒性。
一种理想的荧光试剂应该有较宽的激发吸收光谱，以便能够容易地为微阵列扫 描仪中所配激光所激发。此外，它还应该有高的吸光系数和产光率，以及不易被光 漂白和自淬灭。因为白色的纤维素膜表面有比较强的散射作用，有红移30-70纳米 的背景光，荧光分子还最好有比较长的斯托克斯迁移，以避开杂散光背景。因为散 射效率随着入射光波长变长而迅速下降，所以，激发波长在长波段的荧光分子，例 如红外荧光分子，对于本发明所用系统尤其有用。最后，荧光分子的标记应该相对 简单。
根据以上原则，我们确定了艾力克萨647(分子探针公司，Molecular Probes)作 为首选的荧光标记分子。其吸光系数是234,000/(摩尔-厘米)，是所有商业荧光分 子中最高的，几乎是常用的花菁5(Cy5)的两倍。其量子产额也较好，而且光漂白和 自淬灭效应均较弱(分子探针公司)。
尽管人工合成的有机荧光分子广泛应用于基因和蛋白微阵列技术，它们有时效 果并不理想。这是因为它们的吸光系数相对还是较低，而且容易退色。此外，其光 谱往往也不是很合适。近来，人们进行了很多努力，提出了一些可以替代有机分子 的荧光剂。其中已显示良好前景的包括藻胆蛋白和量子微粒。表2比较了这些新型 荧光试剂与一些传统有机分子的优劣。
表2荧光试剂的比较


藻胆蛋白是一族有很强荧光信号的荧光蛋白，藻胆体则是多种藻胆蛋白的超聚 物。因为它们具有很宽的吸收波段，这些荧光蛋白可以很容易找到匹配的激发光 源。此外，它们的吸光系数和产光率比传统有机荧光团要高得多，因此就明亮得 多。我们使用马泰克生物公司(Martek Bio)所生产的1号藻胆体是百余个三种不同 类型的藻胆蛋白的聚合物。因为其具有多达1400个荧光团，其是目前市场上最明亮 的荧光试剂，比荧光素强300倍。在蛋白杂交(Western blotting)技术中，它可以 检测到含少于amol(10-15mol)蛋白的条带。这一灵敏度度与用酶的化学发光/荧光 方法相当。此外，1号藻胆体的斯托克斯(Stokes)红移长达178纳米，可以有效地 减少散射光的影响。
半导体纳米微粒“量子微粒”(Quantum Dot，量子微粒)是另外一族新兴的荧光试 剂。与传统的有机荧光分子R6G相比，量子微粒547(发射光谱峰值在547纳米的量 子粒)要明亮十倍，对光退色的抵抗能力要高100倍。更重要的是，量子粒的很窄的 荧光光谱可以通过调节量子粒的大小而连续调节，而其宽阔的吸收光谱使激发光的 选择有很大的自由度。例如，488纳米的激光可以激发所有发射光谱峰值在500纳 米以上的量子粒。所以，使用量子粒，可以提高检测的灵敏度，并且可以方便地实 现多颜色检测。
尽管藻蛋白和量子粒都初步显示出了良好的在生命科学中的应用前景，它们在 芯片技术中的应用还远没有被开发。特别的，量子粒还从未应用于固相反应中。因 此，在发展过滤型芯片技术的同时，我们研究了这些新兴荧光试剂的应用，并且证 明过滤方法可以最大限度地利用它们的优点。
实施例一
检测特异性、灵敏度、反应动力学和动力范围
我们实验研究了以下问题以描述本发明中过滤型芯片技术的主要特征，其中包 括纤维素膜对荧光标记了的蛋白和未标记的蛋白的结合能力。我们比较了纤维素膜 和载玻片为载体的蛋白芯片，并展示了过滤型蛋白芯片与振荡型芯片相比所具有的 优点，包括加快了反应速度、扩展了动力范围、降低了背景和提高了检测特异性。 我们还证明了高通量多芯片重叠过滤系统的反应特异性和均一性，以及运用过滤技 术可以提高藻胆体和量子微粒的应用。最后，我们展示了过滤型双抗体夹心技术及 其潜在的临床应用。
材料和实验方法
本发明所使用的主要的芯片材料是13毫米直径、0.8微米孔径的纤维素混合酯 滤片(主要成份是硝酸纤维素酯，以及起支持作用的醋酸纤维素酯，购自奥斯莫尼克 斯公司)。其最大蛋白结合能力是140微克/cm2。我们还比较测试了另外两种芯片 (均购自保罗-格尔曼公司)，包括0.45微米孔径的GP-4纤维素膜，和0.45微米的 超结合膜聚醚砜。
本研究中使用的主要蛋白包括人血浆白蛋白(人血白蛋白)，牛γ球蛋白(牛免疫 球蛋白)，新链霉素(购自皮尔斯公司，Pierce)，胎盘癌抗原(美国生物公司，US Biological)，鼠γ球蛋白(鼠免疫球蛋白，MGG))，蛋白G’(Protein G’)和链霉素，人 血白蛋白单克隆抗体(抗-人血白蛋白1，AHSA1；太平洋生物公司；抗-人血白蛋白- 克隆11，AHSA-Clonell；西格玛公司)，癌胚抗原单克隆抗体(抗-癌胚抗原_1，抗- 癌胚抗原_2，monoclonal mouse anti-CEA，MACEA_H，MACEA_L；太平洋生物公司)， 癌胚抗原多克隆抗体(多抗-癌胚抗原，polyclonal mouse anti-CEA)和多克隆山羊抗 鼠IgG(polyclonal goat-anti-mouse IgG，石地公司)。人血样品由艾蒙利大学胜利癌症 研究所杨丽博士提供。其它化学药品包括吐恩20(Tween20)、氨基化的载玻片(括宁 公司，Corning))和醋酸纤维(Dendrin)滤片室(保罗-格尔曼公司)。
荧光标记剂包括艾力克萨-488、艾力克萨-546、艾力克萨-647(分子探针公司) 和藻胆体1号藻胆体(马泰克生物公司)。量子微粒样品由艾蒙利大学生物医学工程 系聂述明博士提供。
芯片打印和成像
纤维素膜和载玻片上的芯片打印均由珀金--埃尔默公司所生产的生物芯片点样 仪完成。该仪器是一非接触式点样仪，可以比较精确地控制点样体积。尽管其打印 头上有四支平行的打印笔，为进一步消除各打印笔之间的差异所带来的打印误差， 所有的微阵列均由一个打印笔完成。
打印前抗体预先透析至打印缓冲液(0.05M磷酸二氢钠，0.05M磷酸氢二钠，pH 7.4)。这一缓冲液中没有常用PBS所含的氯化钠，避免了氯化钠在打印笔内结晶而 干扰打印。待打印样品可在4℃短期保存，或-20℃长期保存。
我们在实验中结合使用了两种类型的成像仪器。第一种是富士胶成像仪。其分 辨率略低，仅50微米，但其可以可靠地定量检测到三维微点的信号。另一仪器是珀 金--埃尔默所生产的共聚焦微阵列扫描仪。因为其聚焦厚度只有30微米，我们发现 该仪器不适合成像三维微点，并且信号极容易受不平整表面的影响。但是，由于其 有很高的分辨率和灵敏度，我们将它和富士胶成像仪互补使用。
蛋白分子的荧光标记
用荧光分子或生物素是通过蛋白上的赖氨酸结合到蛋白。有机荧光分子、量子 微粒和藻胆体的标记方法各不相同(藻胆体标记由供应商完成)。购买自分子探针公 司的艾力克萨(Alexa)荧光试剂和生物素-硝基多环芳香烃(DNP)预先合成为可与氨基 反应的琥珀酰亚胺酯，使其可以直接与需要标记的蛋白反应。标记过程按照常规进 行。简单说，蛋白样品浓缩后，加入5-10倍摩尔浓度的标记物，然后在室温下混合 反应1.5-2小时。反应后，去掉未与蛋白结合的多余的标记分子。根据不同的蛋白 量，这一分离步骤可以采取不同的方法。在我们所进行的绝大多数实验中，可用蛋 白的量少于1毫克，多余的标记分子通过离心-过滤器(Microcon)去除，以避免过度 稀释和损失样品。如果蛋白量大于每毫升1毫克，则使用含G-20胶的PD-10色谱柱 (法玛西亚公司，Amersham-Pharmacia)进行体积排除色谱分离。如果得到的蛋白样 品过稀，则用离心-过滤器进一步浓缩。为防止蛋白样品粘附在聚醚砜(PES)滤膜 上，离心前预先向蛋白样品内加入0.05％的吐恩20。
生物素的标记中使用生物素-硝基多环芳香烃(Biotin-DNP-SE)(分子探针公 司)。与生物素-SE相比，这一试剂有一在362纳米处有特异性吸收的硝基多环芳香 烃基团。传统的确定生物素标记效率的方法是HABA实验，其需要5～10微克的样 品，并且结果经常不准确。使用生物素-硝基多环芳香烃-SE则可以直接通过硝基多 环芳香烃的吸收来确定生物素标记的效率。据生产厂家报道，硝基多环芳香烃基团 不会影响生物素与链菌素和新链霉素的结合。我们也发现，新链霉素与用以上两种 分子分别标记的酪蛋白的反应结果相似。
过滤型和振荡型芯片实验过程
图3给出本发明所设计的过滤型芯片实验示意图。具体地说，直径为13毫米的 芯片室在上端开口以便于添加样品溶液。另一端则连接在一注射器上(贝克曼公司， BD Scientific)。注射器竖直固定在一个注射器泵上。样品加到芯片表面后，泵往 复运动带动过滤流动。本装置中所需的过滤样品体积大约为100微升。
过滤和振荡芯片实验过程类似于常见的固相免疫反应，如ELISA和蛋白杂交。 简单地说，先用2％牛血清白蛋白(牛血白蛋白)封闭芯片，然后把其放入芯片室中， 进行过滤反应。振荡反应中则把封闭好的每个芯片放入24-孔板的一个孔槽中，然 后再用常规摇床以每分钟200转的速度振荡。
结果
蛋白与纤维素膜结合的基本特征
荧光标记了的蛋白从表面的洗脱
为研究清洗方法和洗涤剂对用荧光标记了的蛋白从纤维素膜表面洗脱的影响， 我们使用艾力克萨-647标记的牛血白蛋白(BSA)和牛免疫球蛋白(BGG)。表3给出了 由一系列不同浓度的标记了的蛋白打印后所形成的微阵列。
为研究洗涤剂吐恩20的影响，我们比较了过滤TBS、0.05％-TTBS、0.05％-TPBS 和0.02％TPBS 60分钟后荧光微点的强度。为比较不同的洗涤方法，又用0.05％ TTBS分别以过滤(0.1cm/s，0.5cm/s)和200转/分振荡来清洗芯片。
由于荧光分子的存在可能会影响蛋白表面的化学性质及其与洗涤剂的相互作 用，标记了的蛋白和未标记的蛋白从纤维素膜表面的洗脱会略有不同。这里我们用 蛋白杂交的方法间接地研究未标记蛋白的洗脱。所用微阵列如图4所示。洗脱实验 后的芯片与含有所有用荧光标记了的待分析分子(人血白蛋白，30皮摩尔；癌胚抗原， 30皮摩尔；鼠免疫球蛋白，30皮摩尔；新链霉素，100皮摩尔)的样品反应。
表3.已标记蛋白-膜结合实验所需微阵列

如图5a所示，洗脱效率随吐恩20浓度的升高而提高。在含有0.2％吐恩20的 情况下，30分钟后大约80％的牛血白蛋白-艾力克萨647和67％的牛免疫球蛋白-艾 力克萨647被洗脱。
图5b表明，过滤的洗脱效率比振荡要高，而且流速越大，洗脱作用就越强。
未标记蛋白的洗脱结果可由荧光标记了的待分析物在各微点的信号得出。如图 6所示，尽管使用高浓度的吐恩20(0.2％)可以有效地减少芯片表面的非特异性结合 的荧光背景，同时减少牛血白蛋白-艾力克萨647微点的荧光信号，待分析物的结合 基本上没有受影响。因此，尽管上述结果可能仅限于我们测试的具体的蛋白，总的 来说吐恩20似乎更易于洗脱荧光标记了的蛋白，因此适当浓度的吐恩20和适当强 度的清洗可以减少纤维素膜表面背景以及提高芯片检测的信噪比。
纤维素膜芯片与载玻片芯片的对比
本实验所用的芯片模式与图4相同。打印后的载玻片被切割成0.8×0.8平方厘 米的小片，每一片上有一微阵列。然后将纤维素膜芯片以每秒0.4厘米的流速过滤 反应，而玻璃芯片则放在96孔板中以200转/分做振荡反应。
我们比较了两种芯片上的微点质量和反应结果。我们的结论与施莱希尔-舒乐公 司(S&S)和其它使用“快速”芯片的研究大致相同。总的说来，纤维素膜芯片的微点质 量和可重复性均比玻璃片上芯片好，定量更准确，灵敏度也更高。
我们发现，纤维素膜芯片上的微点比载玻片上的微点形状更规则，且微点与微 点间误差较小。由图7可见，前者上面微点成圆形，而后者上面微点不规则，且内 部浓度不均匀。特别是，载玻片上微点内有不均匀的盐结晶。纤维素膜上的微点间 误差比载玻片上的小，主要是因为其表面性质要均匀得多，而且蛋白吸收快，不象 玻璃表面的吸收-干燥过程很慢且不均匀。
类似地，纤维素膜芯片也有比较低的芯片-芯片间误差。除了不同的表面性质 外，振荡反应时也可能造成各个玻璃芯片的非均匀反应。
纤维素膜反应后，其上微点的荧光强度基本反映每个微点的捕获分子浓度，而 载玻片上的微点信号与打印时的捕获分子浓度完全无关。这是因为活化后的玻璃表 面的蛋白结合能力仍然很低，所以打印的捕获分子很容易造成表面的饱和，从而不 能成正比地吸收到载玻片上。因此，载玻片芯片可能不适合某些需要精确定量的研 究。此外，很难通过固定更多捕获分子来提高其灵敏度。
因为纤维素膜可以固定更多的捕获分子，所以尤其适于检测低浓度样品。实际 操作中，灵敏度还取决于具体的蛋白，以及所使用的检测仪器。尽管共聚焦类型的 扫描仪适用于载玻片表面的成像，最好不用其定量检测纤维素膜内的三维微点。
我们比较了两种仪器成像纤维素膜芯片和载玻片芯片的结果。使用非共聚焦的 胶成像仪(低灵敏度，低分辨率)时，经过过滤反应后可在纤维素膜表面检测到每毫 升64皮克的癌胚抗原，但经长时间反应我们仍未能在玻璃芯片表面检测到每毫升1 纳克的癌胚抗原。这一结果与施莱希尔-舒乐公司的结论一致。当使用共聚焦扫描仪 时，两芯片结果相似。
比较过滤型和振荡型芯片
过滤型和振荡型芯片技术所使用的芯片设计由图4给出。我们首先单独反应四 种待测试物中的一种，来测试微阵列的特异性。然后我们比较了过滤型和振荡型芯 片技术的反应动力学。样品是人血白蛋白、癌胚抗原、鼠免疫球蛋白和新链霉素的 混合物(各待分析物的浓度分别30皮摩尔、30皮摩尔、30皮摩尔和100皮摩尔)。 为进一步测试芯片的动力范围，我们使用一系列不同的样品浓度与之反应。我们还 证明了芯片表面反应的均一性。
使用过滤型芯片可以大幅度提高反应动力学。运用图4所示微阵列，我们证 明，使用过滤方法加速反应不仅适用于捕获分子是抗体的情形，而且可以加速其它 捕获分子的反应，包括其它蛋白、有机小分子和核酸。为显示这一点，图9比较两 个相同的芯片(图4)经过15和45分钟过滤和振荡反应后的荧光图像。注意尽管牛 血白蛋白-艾力克萨647的荧光信号在两个芯片上类似，几乎所有其它微点的信号在 过滤反应后要高于其在振荡型芯片上的信号，特别是两个多克隆抗体抗-癌胚抗原和 羊抗鼠免疫球蛋白(GAM)。
图8给出癌胚抗原与抗-癌胚抗原微点(由每毫升1毫克的抗-癌胚抗原形成)之 间的反应，以便进一步比较两类芯片的反应动力学。经过大约一个小时的反应后， 过滤反应开始接近平衡，而振荡反应信号只达到过滤反应信号的20％。经过室温下 过夜反应，振荡反应的信号略高于过滤反应1个小时后得到的信号。
所有微点的信号强度定量化后示于图10。显然，对具有高浓度的微点，过滤和 振荡反应之间的区别更为明显。这与理论模型的分析一致，因为高浓度捕获分子更 容易用尽表面的待分析分子，从而其反应更容易受到扩散的限制。
快速的反应直接保证了较高的检测灵敏度。如图11所示，经过30分钟的反 应，过滤型芯片对所有样品的检测灵敏度均可达到每毫升64皮克。
在同样反应时间内，过滤型芯片表现出更宽的线性动力范围。因为过滤型芯片 技术可以检测到极低浓度的蛋白，反应30分钟后即具有比较宽的动力范围，如图 12所示。除新链霉素的动力曲线有轻微弯曲外，其它待分析物都有超过三个数量级 的动力范围。相反，由于扩散限制的影响，在同样反应时间内，振荡反应不能有效 地检测到低浓度的待分析物，因此只具有非常狭窄的动力范围(略大于一个数量 级)。
图14中的误差范围清楚地表明，在应用过滤型芯片时，随着捕获分子表面浓度 的升高，信号的标准差减小。这表明高浓度抗体不但可以提高信号强度，而且可以 提高信号的可重复性。
与振荡型芯片技术相比，过滤型芯片还可以降低非特异性结合的背景。如前所 述，因为过滤过程可以更有效地洗脱非特异性结合的蛋白，因而可以提高信-噪比。 图15比较过滤型芯片和振荡型芯片上的背景。振荡型芯片上高背景直接导致低的信 噪比及低灵敏度。由图15还可见，过滤型芯片上的微点轮廓比振荡芯片上的要清 晰。
过滤型芯片还表现出更少的交叉反应和更高的特异性。我们在用图4所示的芯 片测试鼠免疫球蛋白对羊抗鼠免疫球蛋白结合的特异性时发现，尽管鼠免疫球蛋白 与抗-人血白蛋白和抗-癌胚抗原均有很轻微的非特异性交叉反应，其信号在短时间 的过滤或振荡反应后均检测不到。当然，此时过滤型芯片上羊抗鼠免疫球蛋白微点 的信号要远远高于振荡型芯片上的信号。然而，如果经过12小时的振荡，使振荡型 芯片上的羊抗鼠免疫球蛋白信号与过滤反应1个小时后的信号相似，我们就可以清 楚地观测到鼠免疫球蛋白与抗-人血白蛋白和抗-癌胚抗原之间的非特异性交叉反应 (图16)
如图17所示，当一组抗-人血白蛋白微点均匀地打印在芯片的直径上时，经过 过滤反应(流速为每秒0.5厘米)，除边缘外，所有微点信号相当近似。因此，过滤 型芯片的信号基本与微点位置无关，表明反应十分均一。
多芯片重叠过滤型芯片系统
在实验研究中，我们认识到高通量与微点面积是一对矛盾。减小微点面积可以 提高通量，但是也降低信号强度。另外一对矛盾是为得到可靠的统计结果时所需的 芯片数目和所需要的样品量。对于有限的样品来说，如果需要进行多个芯片的振荡 反应，每个芯片上的样品体积或浓度就会太低而影响反应效率。
本发明提供一种新颖的多芯片重叠过滤系统以解决这些问题。如图2所示，一 叠纤维素膜重叠在一起，然后样品过滤通过整个芯片集成，同时与所有芯片反应。 我们研究了多个同样芯片叠放时反应的均一性，然后研究了运用多芯片系统检测的 特异性。
在测试多芯片重叠过滤系统反应均一性时，我们做了两个类似的实验，分别 包括6个和8个芯片。每组芯片使用480微升的样品，其中300微升完全过滤通过 所有芯片。流速是每秒0.5厘米。作为对照，四片芯片以传统振荡方法反应(每片 80微升样品)。反应时间均为30分钟。
表4.多芯片过滤系统反应均一性实验所用芯片

在测试多芯片重叠过滤系统检测的特异性时，我们准备了两种不同的芯片， 分别称作“正”芯片和“负”芯片(图20)。正芯片中，第一行微点是抗-人血白蛋白 (1.0毫克/毫升和0.4毫克/毫升)，然后2-6行是羊抗鼠免疫球蛋白(0.4毫克/毫 升)。7、8两行分别是10微克/毫升和2微克/毫升的牛血白蛋白-艾力克萨647。
负芯片第一行为空白，其余均与正芯片相同。
在测试多芯片重叠过滤系统检测特异性时，我们也进行了两次实验。在第一次 实验中，我们把5片芯片叠放在一起，中间一片是正芯片，其余均为负芯片。在第 二次实验中，一片正芯片夹在上下各5片负芯片中间。样品中含有30皮摩尔的人血 白蛋白-艾力克萨647和50皮摩尔的鼠免疫球蛋白-A488。人血白蛋白和鼠免疫球蛋 白分别由两种不同颜色的荧光标记，以便能够同时在不同荧光通道中检测到它们。 除上述反应外，作为对照实验，我们还完成了单芯片的过滤和振荡反应。
图18表明当8芯片重叠反应时，反应的均一性。由图可见，其信号明显高于单 芯片振荡反应的结果(每一芯片所用样品体积与过滤反应中平均到每一芯片上的样品 体积一样)。图19定量比较每种待分析物在各个芯片上的荧光强度，可见各芯片间 的差异很小。此外，图中X轴上的标号是自上至下的芯片顺序，可见荧光强度(直接 反映反应效率)与芯片顺序无关。
当叠放的芯片各不相同时，系统中任一芯片都可以特异性地检测到给定待分析 物。图20示意第一个芯片(“负”)和第六个芯片(“正”)的反应结果。所有芯片均可以 捕获鼠免疫球蛋白-A488，且信号强度类似，表明正负芯片反应效率相似。但是，只 有打印有抗-人血白蛋白微点的正芯片可以特异性地检测到人血白蛋白-艾力克萨 647，且其信号与单独反应的正芯片相同；负芯片上则没有任何人血白蛋白信号。此 外，我们未观察到相邻芯片间有任何相互干扰、污染的现象。
本实验中我们使用了两种不同类型的荧光剂，且分别在两个荧光通道中检测。 这表明过滤型芯片技术可以应用于多色检测。
由以上结果可见，同样的重叠方法可以应用于更高通量的系统。例如，我们使 用25mm直径的芯片，每个芯片上打印1600个微点；然后重叠放置13个负芯片和1 个正芯片，我们同时实现了22,400个微点的反应。因此，重叠反应系统可以大幅度 提高微阵列技术的通量。
多芯片重叠过滤型反应方法还可以减少每一芯片所需的样品体积。为得到可靠 的统计结果，最好能够用多个芯片检测同一个样品，因此在每一个芯片单独反应 时，必须综合考虑单个芯片所能分到的样品量和所希望测试的芯片数目。使用单芯 片振荡反应时，当样品体积小于一定限度时，振荡变得没有任何意义，反应完全受 扩散限制，其反应动力学就变得极其缓慢。相反，使用多芯片重叠过滤技术时，尽 管平均到每个芯片上的样品体积很小，但是样品的总体积大到足以产生通过所有叠 置的芯片的宏观流动，因此反应效率可以大大提高。
利用新型的荧光试剂(藻担体和量子粒)提高检测的灵敏度
我们主要研究了以下两个问题：1.因为这两类荧光物质都比较大，标记后的蛋 白-荧光剂复合物也就很大，有可能影响蛋白的表面物化性质，那么，它们会不会很 难滤过纤维素膜？2.如果它们能够通过纤维素膜，那么过滤反应方法能不能提高由 它们标记了的蛋白与表面捕获分子的结合反应？
我们用生物素标记的蛋白来研究上述问题。具体说，微点1A、1B、2A、2B分别 含有2纳克、0.2纳克、20皮克和2皮克的牛血白蛋白-生物素-硝基多环芳香烃。 对于藻胆体，我们测试了链菌素-1号藻胆体，并用链菌素-艾力克萨647作为对 照。实验中链菌素-1号藻胆体和链菌素-艾力克萨647的浓度分别是2微克/毫升和 20纳克/毫升，这样它们所含的链菌素摩尔浓度一样(大约300皮摩尔)。在量子微粒 实验中，新链霉素与量子微粒-585反应形成一新链霉素-量子微粒复合物。
我们现有的两种仪器(富士胶成像仪和扫描阵列芯片扫描仪)均没有激发1号藻 胆体和量子微粒585的合适的光源。对于1号藻胆体，我们测试了532纳米和633 纳米激发，但是最优选择应该在600纳米左右。量子微粒585的激发光应该是350 纳米，但我们现有条件只能测试488纳米和532纳米。
图21显示了用过滤方法和振荡方法检测1号藻胆体标记的蛋白的巨大差异。激 发光波长是633纳米，其激发强度大约是1号藻胆体和艾力克萨647最佳激发的一 半。在我们所做的四种实验组合中，灵敏度从高到低的顺序是：1号藻胆体过滤，1 号藻胆体振荡，艾力克萨647过滤，艾力克萨647振荡。特别地，过滤反应后1号 藻胆体最低可以检测到含2皮克蛋白的微点，这一灵敏度大约是艾力克萨647振荡 反应的500倍。我们还测试了用532纳米激发的情况，发现艾力克萨647信号大幅 度削减，而1号藻胆体则给出了与633纳米激发类似的结果。
1号藻胆体比传统的有机荧光分子要明亮得多。但是，如图21所示，只有通过 过滤方法消除掉其面临的扩散限制，才能有效地利用其长处。
我们还测试了多芯片重叠技术对基于1号藻胆体的检测的适用性。两片牛血白 蛋白-生物素芯片在重叠后与链菌素-1号藻胆体过滤反应，结果如图22所示。两芯 片反应结果十分一致，证明1号藻胆体标记的蛋白确实可以流过芯片而不至于滞留 或吸附在芯片孔隙中。这实际上就提供了一种新的实验方法：使用多芯片重叠过滤 技术来保证多步检测时的反应均一性，并节省昂贵的检测试剂。
过滤型芯片技术也可以提高量子微粒标记的蛋白与表面捕获分子的反应效率。 为例证这一点，我们用牛血白蛋白-生物素-硝基多环芳香烃微阵列与新链霉素-量子 微粒(200μl，新链霉素浓度500纳克/毫升)反应。使用488纳米激光作为激发光，我 们发现与振荡反应相比，过滤反应可以有效地提高牛血白蛋白-生物素微点的信号强 度。
因为与量子微粒585反应时的新链霉素浓度远远高于量子微粒的浓度，每个量 子微粒上可能会结合多个新链霉素分子，但是我们不能确定真实的标记比例。未标 记的新链霉素分子以及偏离最优波长的激发光，都可能影响了本例实验的灵敏度。 但是，这一简单实验还是很清楚地表明了运用过滤方法可提高检测量子微粒标记的 蛋白的效率，有效地利用了量子微粒的优点。
实施例二
双抗体夹心-过滤型芯片技术
本发明表明，与直接标记抗原相比，双抗体夹心法具有更高的特异性和灵敏 度。此外，过滤型双抗体夹心法也比振荡方式下的双抗体夹心法效果更好。结合使 用癌胚抗原双抗体夹心法和过滤型芯片技术，我们可以有效地检测到血液中5纳克/ 毫升的癌胚抗原。
实验方法
蛋白芯片可以实现病人血液中的多抗原联检。本例所选癌胚抗原在临床诊断中 的特征浓度是5-10纳克/毫升，即血液中蛋白总浓度的1/106。用直接标记蛋白的方 法，为了能够特异性地检测到血液中的癌胚抗原，癌胚抗原抗体对癌胚抗原的结合 力，需要至少比其对血液中白蛋白和球蛋白结合能力高6个数量级。实际情况中这 是极为困难的，特别是蛋白经过直接荧光标记后荧光团上的疏水基会增加蛋白间的 非特异疏水相互作用。为避免这些问题，临床诊断中常采用双抗体法来提高检测的 特异性。简单说，捕获抗体微阵列先从样品中结合特异的待分析分子。然后，通过 另一抗体来检测表面上被捕获了的待分析物。实践表明，这一双抗体技术可以有效 地提高免疫反应的特异性。
本例中用双抗体夹心法检测癌胚抗原所用微阵列如下所示。这里人血白蛋白作 为对照分子。
1A：1.0毫克/毫升抗-癌胚抗原_H；1B：0.4毫克/毫升抗-癌胚抗原_H
2A：1.0毫克/毫升抗-癌胚抗原_L；2B：1.0毫克/毫升多抗-癌胚抗原；
3A：1.0毫克/毫升抗-人血白蛋白；3B：牛血白蛋白-艾力克萨647
对应于癌胚抗原和人血白蛋白的检测抗体分别是艾力克萨647标记的抗-癌胚抗 原_L(ACEA_L)和抗-癌胚抗原_克隆11(ACEA_clone11)。在检测中它们的浓度分别是 1.0微克/毫升和1.5微克/毫升。我们共研究了以下三个问题：
(1)比较夹心法与直接标记法；(2)检测正常人血液中癌胚抗原浓度的升高；(3)检测癌 症病人中的癌胚抗原浓度
在例1中，我们比较了过滤型和振荡型芯片的不同。对于检测步骤来说，过滤 方法影响不是很大，但是最好还是重叠第一步中得到的几个芯片以同时检测它们， 因为这样可以减少所需检测抗体。但是，有些待分析物分子可能会在这一步中洗脱 和在各个芯片间重新分配。
用直接标记检测法，我们可以检测到溶解于50微克/毫升的人血白蛋白和30微 克/毫升的HGG中的10纳克/毫升的癌胚抗原。这相当于在没有稀释的血浆中(蛋白 浓度80毫克/毫升)含有10微克/毫升的癌胚抗原。这里癌胚抗原阳性和阴性样品均 通过艾力克萨-488标记，然后分别与芯片反应。尽管该阳性样品中的癌胚抗原浓度 已相当于临床感兴趣浓度的1000倍，振荡方法仍然不能直接检测到其与癌胚抗原- 阴性样品的差别。
在双抗体夹心法中，癌胚抗原检测抗体用艾力克萨647预先标记。然后，将第 一步中的4片芯片(过滤癌胚抗原-阳性，过滤癌胚抗原-阴性，振荡癌胚抗原-阳 性，振荡癌胚抗原阴性)重叠，与癌胚抗原检测抗体过滤反应。结果表明，不论第一 步反应中用什么方法，夹心法均大幅度提高了检测的灵敏度，但还是第一步采用过 滤时得到的最终信号更高。因此，过滤方法可以提高第一步中的捕获效率，以及方 便第二步的检测反应。图23给出定量后的荧光强度。
在证明双抗体夹心-过滤型芯片技术具有直接标记-过滤型芯片技术和振荡方法 所不具备的优点后，我们进一步展示用这一方法可以检测人血浆中的低浓度蛋白。 在一健康人血浆中加入纯化的癌胚抗原，使最终加入的癌胚抗原浓度为5纳克/毫 升，然后将样品稀释10倍后与芯片反应。为了比较不同芯片上的信号，我们同时检 测每一样品中的人血白蛋白浓度。与癌胚抗原阴性样品比较，癌胚抗原阳性样品的 人血白蛋白信号与之类似；但是，其抗-癌胚抗原微点的信号要比阴性样品的高得 多。这显示了双抗体夹心-过滤型芯片可以可靠地检测正常人血液中5纳克/毫升的 癌胚抗原浓度变化(图24)。我们发现，第二步检测中使用重叠反应方法没有导致不 同芯片上的癌胚抗原样品的重新分配，因为各芯片上的信号与每一芯片单独振荡检 测时得到的信号相似。
图25显示胰腺癌病人血液中的癌胚抗原的检测结果。对照取自两个正常人，而 癌症样品是三个。依据对所有微点的非配对-t统计，正常人和癌症病人血液样品的 信号强度之间的差别十分显著。
实施例3.用过滤型适合体芯片检测凝血酶
适合体(Aptamer)是一族经过筛选后可以结合不同分子的单链寡聚核酸。其可 结合的对象包括有机小分子，肽和蛋白，与抗体相比，适合体比较容易合成。人们 已经开发了多种适合体，其中一种对凝血酶有很高的结合力。本研究中，我们使用 这种对凝血酶有特异性的适合体作为模型系统，表明了过滤型适合体芯片可以检测 荧光标记了的凝血酶。我们特别研究了该技术的特异性、灵敏度和动力范围，并且 比较了过滤型适合体芯片与振荡型适合体芯片的反应动力学。
材料和方法
对凝血酶特异的适合体预先由生物素标记(5’-生物素-6碳-GGTTGGTGTGGTTGG， 购自集成基因公司)，然后与新链霉素蛋白混合反应后打印在纤维素膜(Nitrobind， 奥斯莫尼克斯公司，Osmonics；13毫米直径，0.45微米孔径)表面上，形成一很小 的阵列。由于适合体与纤维素膜不能紧密的结合，而且其结合也影响适合体的构象 和功能，我们使用新链霉素间接地将适合体固定到纤维素膜上。这里的6-碳链可以 给适合体更多的自由度，以便使其形成正确的结构。在溶液中的适合体构像由圆二 色谱法得到(CD)，并与文献的结果相比较，以验证其正确性。
新链霉素-适合体的复合物的制备如下：将新链霉素和与生物素结合的适合体 (40μM)以相同浓度混合，反应30分钟。因为新链霉素与生物素的结合非常紧密，这 一反应应该十分彻底。混合物然后稀释到合适的打印浓度，用点样仪打印微阵列。
本例所用7×4微阵列的设计如图26所示。具体说，第一行到第三行是新链霉 素-适合体的复合物，第五行和第六行分别是单独的新链霉素和适合体。最后两行是 牛血白蛋白-艾力克萨647标准。
我们将人类的α-凝血酶(血液技术公司)用艾力克萨647标记。简单说，凝血酶 在碳酸钠缓冲液(pH9.0)中溶解至6毫克/毫升，然后加入三倍浓度的艾力克萨 647。室温下反应1.5小时后，混合物用离心过滤器(30,000分子量)除去多余的艾 力克萨647。回收的凝血酶和标记上的艾力克萨647的浓度由下式得出。
C凝血酶＝(A280-0.03*A650)/(ε凝血酶*MW凝血酶)(M)，and C艾力克萨647＝A650/239000(M). 这里A280和A650分别是凝血酶-艾力克萨647在280nm和647nm的吸收。ε凝血酶是凝 血酶在280nm的吸光系数，等于1.83/(cm*毫克/毫升).MW凝血酶是凝血酶的分子量 (36700)。最后，每个凝血酶分子上的荧光团数目由C艾力克萨647/C凝血酶计算。
人血白蛋白(人血白蛋白，购自皮尔斯公司，Pierce)作为实验中的对照。人血 白蛋白的标记过程和标记程度的计算类似于凝血酶，不同处在于ε人血白蛋白＝0.6/(cm*毫 克/毫升)，MW人血白蛋白大约为67000。
打印后，适合体芯片用含10毫克/毫升的牛血白蛋白的A缓冲液振荡封闭30分 钟或过滤封闭10分钟。然后凝血酶-艾力克萨647用反应液(含1毫克/毫升的牛血 白蛋白的A缓冲液)稀释到合适浓度，用过滤方法反应(每分钟2毫升)。对于振荡反 应，芯片放入96孔板内以每分钟200转振荡反应。在动力学研究中，每个样品采取 不同的反应时间以绘出反应动力曲线。对于其它研究，反应时间是十分钟。
在反应后，芯片用反应缓冲液清洗20秒以减少非特异性结合。然后用富士胶成 像仪或扫描阵列4000微阵列扫描仪成像。未反应过的芯片作为成像的对照，依据其 上预先打印的荧光标准来避免仪器波动带来的实验误差，并且帮助比较不同图像间 的亮度和对比度。
实验结果
蛋白的标记效率很大程度上取决于蛋白表面裸露赖氨酸的数目，因此在不同蛋 白间有较大差别。本例中，凝血酶和白蛋白的标记效率分别为0.9和4.0。
为验证适合体芯片的特异性，我们将新链霉素(每毫升0.5毫克)打印到芯片上 作为对照。反应十分钟后的结果表明，新链霉素与凝血酶-艾力克萨647只有微弱的 交叉反应(如图27a所示)。根据粗略估计，这些微点中新链霉素的表面浓度大约是 第三行微点中新链霉素-适合体浓度的10倍，而其信号仅为后者的20％。新链霉素 与凝血酶之间的相互作用可以被0.05％的吐恩20所消除，证明其结合具有非特异性 的疏水作用。我们发现直接打印适合体不能检测到样品中的凝血酶，主要是因为适 合体不能与纤维素膜很好的结合。我们还发现新链霉素-适合体的微点不与人血白蛋 白-艾力克萨647反应，证明其与凝血酶的反应是特异的。
我们比较过滤方法与振荡方法的反应动力学。所使用的凝血酶-艾力克萨647浓 度是每毫升10纳克。图28表明标准化后的信号强度和时间的关系。经过10分钟的 反应后的芯片图像见图29。可见，对于所有三个新链霉素-适合体浓度，过滤型芯 片的反应速度要比振荡型芯片快得多。在20和60分钟时两种芯片的信号比值如表 5所列。可见，为达到比较高的灵敏度，需要在表面上放置更多的适合体，但这也 导致了更严重的扩散限制。当凝血酶的浓度很低时，振荡方法中边界层内的凝血酶 的消耗也就更快，因此扩散限制也就更严重。
表5.过滤型和振荡型适合体芯片的信号比

为测试过滤型适合体芯片的动力范围，我们采用10纳克/毫升到1微克/毫升的 凝血酶样品进行了10分钟的过滤反应，然后用富士胶成像仪得到信号。经标准化 后，信号强度如图30所示。可见在过滤型芯片上，大多数微点有超过两个数量级的 线性动力范围。唯一例外是1μM的适合体微点在0.01微克/毫升的凝血酶浓度处， 其结果不太线性，高于期望值。这一误差是因为低浓度时荧光检测不是太可靠。总 的来说，适合体芯片的动力范围从10纳克/毫升到大约1微克/毫升。我们没有研究 超过1微克/毫升的凝血酶浓度，因为其在临床诊断所需要的高灵敏度实验中没有太 大的意义。
本申请中我们援引了众多的参考文献以便更好地说明本发明的内容。对于已熟 悉本发明技术的人们来说，可能依据本发明的核心思想还可以有很多具体技术上的 修改与变化。本文中的具体实例只是本发明所能完成的功能的例解。不难认识到， 依据本发明所发展的方法，不需要很大的改进，人们就可以实施很多等同于本发明 的实验设计。以下专利权利要求覆盖这些等同的实验设计。