使用单级自动解和具有C5旁路的酶促水解和后水解加工木质纤维生物质的方法

申请号 CN201380040872.4 申请日 2013-08-01 公开(公告)号 CN104540956B 公开(公告)日 2017-07-28
申请人 因比肯公司; 发明人 J·拉森; N·尼尔森波尔森; M·D·杰普森; K·K·莫根森;
摘要 本 发明 总体地涉及将木质 纤维 素 生物 质 加工成可 发酵 糖的方法,并且涉及依赖 水 热预处理的方法。可以通过在单级加压水热预处理中预处理至非常低的强度,接着酶促 水解 以释放保持在固体状态中的木糖来从软 木质 纤维素 生物质 原料获得与使用两级预处理获得的那些相当的木糖 单体 产量。在一些实施方案中,预处理的生物质被分离成固体部分和液体部分,固体部分接受酶促水解,和分离的液体部分随后与水解的固体部分混合。
权利要求

1.一种加工木质纤维生物质的方法,包括:
–提供软木质纤维素生物质原料,
–在单级加压热预处理中以至少35%的DM含量在160-200℃的温度下在3.5-9.0的pH范围内预处理所述原料少于60分钟的保留时间,以使所述预处理的生物质的特征是具有至少10%的木聚糖数,
–将所述预处理的生物质分离成固体部分和液体部分,
–在添加或不添加补充水含量的情况下以至少15%的DM使用由酶混合物催化的酶促水解来水解所述固体部分24-150小时,所述酶混合物包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶、木糖苷酶和乙酰木聚糖酯酶活性,以及
–随后在获得至少50%葡萄糖转化后混合分离的液体部分和水解的固体部分并进一步进行至少6小时后水解,从而所述液体部分中的木糖低聚物在保留在所述水解的固体部分中的酶活性的作用下被降解为木糖单体
2.权利要求1所述的方法,其中所述单级加压水热预处理作为单级加压自动水解预处理进行,其中在预处理过程中由半纤维素水解释放的乙酸进一步催化半纤维素水解。
3.权利要求1或2所述的方法,条件是在所述预处理步骤中硫酸不添加到所述原料中。
4.权利要求1所述的方法,其中所述原料是小麦秸秆、玉米秸秆、甘蔗渣、甜高粱渣或空果串。
5.权利要求1所述的方法,其中所述原料在加压预处理之前被洗涤和/或沥滤。
6.权利要求1所述的方法,其中所述原料在加压预处理之前浸泡于来自预处理的后续步骤的含乙酸液体中。
7.权利要求1所述的方法,其中所述原料的纤维结构在预处理过程中被维持。
8.权利要求1所述的方法,其中加压预处理在至多10巴的压下进行。
9.权利要求1所述的方法,其中所述原料使用水力旋流器系统从加压预处理反应器中去除。
10.权利要求1所述的方法,其中所述原料使用水闸型系统从加压预处理反应器中去除。
11.权利要求1所述的方法,其中所述原料预处理达到使得生物质的特征为具有至少
12%的木聚糖数的强度。
12.权利要求1所述的方法,其中所述固体部分具有至少40%的干物质含量。
13.权利要求1所述的方法,其中后水解之后的单体木糖产量是理论最大产量的至少
60%。
14.权利要求1所述的方法,其中水解之后的单体葡萄糖产量是理论最大产量的至少
60%。
15.权利要求1所述的方法,其中酶促水解使用为木质纤维素生物质转化而优化的以制造商建议范围内的酶剂量水平使用的能够商购获得的纤维素酶制剂进行。
16.权利要求1所述的方法,其中酶促水解进行至少96小时。
17.权利要求1所述的方法,其中酶促水解在15-23%之间的干物质含量下进行。
18.权利要求1所述的方法,其中酶促水解在至少20%的干物质含量下进行。
19.权利要求1所述的方法,其中酶促水解使用包含外切纤维素酶活性(EC 3.2.1.91)、内切纤维素酶活性(EC 3.2.1.4)、β-葡萄糖苷酶活性(EC 3.2.1.21)、β-1,4-内切木聚糖酶活性(EC 3.2.1.8)和乙酰木聚糖酯酶活性(EC 3.1.1.72)的酶混合物进行,且其中所述酶混合物进一步特征在于具有的酶活性相对比例使得对于每1 FPU纤维素酶活性存在至少30 CMC U内切葡聚糖酶活性及至少28 pNPG Uβ-葡萄糖苷酶活性和至少50 ABX U内切木聚糖酶活性。
20.权利要求19所述的方法,其中所述酶混合物进一步包含β-1,3木糖苷酶活性(EC 
3.2.1.72)、β-1,4-木糖苷酶活性(EC 3.2.1.37)、以及α-1,3和/或α-1,5-阿拉伯呋喃糖苷酶活性(EC 3.2.1.23)。
21.权利要求1所述的方法,其进一步的特征在于在所述液体部分的后水解之后回收的合并的C5/C6水解产物用一种或多种改良的酵母菌株直接发酵乙醇
22.权利要求1所述的方法,其中所述固体部分包含不溶性固体物质,其中超过50%的相关的溶解固体物质被去除。
23.权利要求1所述的方法,其中液体部分中存在的至少85%的木糖低聚物在后水解过程中被水解成木糖单体。
24.权利要求15所述的方法,其中所述为木质纤维素生物质转化而优化的能够商购获得的纤维素酶制剂补充有一种或多种另外的酶活性。

说明书全文

使用单级自动解和具有C5旁路的酶促水解和后水解加工木

纤维生物质的方法

[0001] 发明人:Jan Larsen、Niels Poulsen、Kit Mogensen、Martin Jeppesen技术领域
[0002] 本发明总体地涉及将木质纤维素生物质加工成可发酵糖的方法,并且特别涉及依赖水热预处理的方法。

背景技术

[0003] 对石油和其他化石燃料的历史依赖性与大气温室气体水平的急剧和令人警醒的增加相关。国际上正在努减少温室气体的积累,这在许多国家得到正式政策指令支持。这些减排努力的一个中心焦点是发展用可再生的植物生物质取代石油作为燃料和其他化学产品的前体来源的工艺和技术。据估计,地球上植物来源的生物质年生长量大约为每年1x1011公吨干重。参见Lieth和Whittaker(1975)。因此,生物质的利用是发展可持续经济的终极目标。
[0004] 从基于糖和淀粉的植物材料,如甘蔗、根和粮食作物,生产的燃料乙醇已经被广泛使用,目前的全球生产量最高达到每年730亿升。乙醇一直被认为是化石燃料的可接受的替代品,其容易作为混合燃料的添加剂使用或甚至直接作为用于个人汽车的燃料。然而,使用通过这些“第一代”生物乙醇技术生产的乙醇实际上没有实现温室气体排放的大量减少。当总化石燃料输入与最终乙醇输出均计算在内时,与石油相比,净节省仅为约13%。参见Farrell等(2006)。此外,已经对“第一代”生物乙醇市场提出了经济和道德上的反对。这实际上将作物作 为人类食物的需求与用于个人汽车的需求形成直接竞争。事实上,燃料乙醇的需求与已经证明在贫穷的粮食进口国引起麻烦的增长的粮食价格有关。
[0005] 发展不消耗粮食作物的生物质转化系统-所谓的“第二代”生物精炼-引起了极大的兴趣,其中可以从木质纤维素生物质生产生物乙醇和其他产物,所述木质纤维素生物质如作物废料(秸秆、穗轴、核、茎干、壳(shell)、果壳(husk)等…)、草料、稻草、木屑、废纸等。在“第二代”技术中,主要来源于纤维素的可发酵6-(C6)糖和来源于半纤维素的可发酵5-碳(C5)糖通过酶促水解或(在一些情况中)通过纯化学水解从生物质多糖聚合物链释放出来。从“第二代”生物精炼中的生物质转化获得的可发酵糖可以用于生产燃料乙醇,或可选地,生产其他燃料如丁醇或用于合成生物塑料或许多其他产品的乳酸单体
[0006] C5和C6糖的总产量是木质纤维素生物质加工商业化的重点考虑因素。就乙醇生产以及乳酸和其他化学产品的生产而言,将C5和C6糖工艺流结合成一种糖溶液是有利的。现在在乙醇生产中能有效消耗C5和C6糖两者的改良的发酵生物体是可得的。参见例如Madhavan等(2012)、Dumon等(2012)、Hu等(2011)、Kuhad等(2011)、Ghosh等(2011)、Kurian等(2010)、Jojima等(2010)、Sanchez等(2010)、Bettiga等(2009)、Matsushika等(2009)。
[0007] 由于其物理结构的限制,木质纤维素生物质不能在没有经过一定预处理过程的情况下有效地通过酶促水解转化成可发酵糖。已经报道了许多种不同的预处理方案,各自提供了不同的优点和缺点。综述参见Agbor等(2011)、Girio等(2010)、Alvira等(2010)、Taherzadeh和Karimi(2008)。从环境和“可再生性”的度来看,水热预处理是特别有吸引力的。它们利用温度为160-230℃左右的加压蒸汽/液体热水来温和地熔解与纤维素链杂乱缔合的疏水性木质素、溶解半纤维素的主要成分(富含C5糖)和破坏纤维素链,从而提高生产酶结合的可达性。水热预处理可以方便地与现有的燃烧和生物质的发电厂整合来有效地利用汽轮机蒸汽和“过量的”发电能力。
[0008] 在水热预处理的情况下,本领域公知并且已经过广泛讨论的是,预处理必须在相矛盾的目的之间进行优化。一方面,预处理应当理想地保留半纤维素糖含量,以最大化来源于单体半纤维素的糖的最终产量。然而同时,预处理应当充分暴露并预调理(precondition)纤维素链以达到酶促水解的敏感性,使得可以用最少的酶消耗获得来源于单体纤维素的糖的合理产量。酶消耗也是生物质加工商业化的重点考虑因素,其如在当前定义的“全球市场经济”背景下的“经济利润”边缘摇摆。尽管近年来急剧提高,可商购的酶制剂的高成本仍然是生物质转化中最高的运营成本之一。
[0009] 随着水热预处理问题和反应器保留时间的增加,由于化学转化成其他物质(包括糠和缩合反应的产物),较大比例的来源于半纤维素的C5糖无法换回地丧失。然而,需要较高的温度和保留时间以适当地调理(condition)纤维素纤维以高效地酶促水解成单体6碳葡萄糖
[0010] 在现有技术中,水热预处理“强度(severity)”的一个常用参数是“Ro”,其通常是指对数值。Ro反映了根据公式:t*EXP[(T-100)/14.75]的预处理温度和反应器保留时间的复合量度,其中t是以分钟计的保留时间,且T是以摄氏度计的反应温度。我们提出了预处理强度的一种替代量度,“木聚糖数(xylan number)”,其提供了与经典log Ro的负线性相关性,即使是在非常低的“强度”水平下。与作为预处理条件的单纯经验描述的Ro不同,木聚糖数是功能上显著的物理参数。木聚糖数提供了预处理程度的量度,其允许在C5回收率方面比较相异的生物质原料而不管它们经历的Ro强度如何。
[0011] 无论水热预处理强度是以“木聚糖数”表示还是以“Ro”表示,针对任意给定生物质原料的预处理条件的优化本质上需要来自半纤维素的单体C5糖高产量的需求(低强度)和来自纤维素的单体C6糖高产量(高强度)的需求之间的一定折衷。
[0012] 在水热预处理中溶解的源自半纤维素的C5糖通常包括很大一部分的木糖低聚物,其强烈抑制纤维素酶催化作用。参见Shi等(2011)、Quing和Wyman(2011)、Quing等(2010)。预处理的其他可溶性副产物,包括乙酸和源自溶解木质素的酚类化合物,也已知抑制纤维素酶催化作用。参见Kothari和Lee(2011)、Ximenes等(2010)。有效水平的酶抑制剂的存在增加了达到给定水解程度所需的酶消耗量。因此,商业规模生物质转化的“经济利润”更希望最小化来自预处理的可溶性化合物对纤维素酶的抑制。
[0013] 已经报道了用于最大化来自半纤维素和纤维素的糖产量以及最小化纤维素酶催化的木糖低聚物抑制作用的各种不同的水热预处理策略。在一些情况下,加入外源的酸或以催化半纤维素降解(酸、pH<3.5)或木质素溶解(碱、pH>9.0)。在其他情况下,水热预处理只用非常温和的源自木质纤维素本身的乙酸(pH 3.5-9.0)进行。在这些温和pH条件下的水热预处理称为“自动水解”过程,因为从半纤维素酯本身释放的乙酸进一步催化半纤维素水解。
[0014] 酸催化的水热预处理,被称为“稀酸”或“酸浸”处理,通常提供高的C5糖产量,因为在酸催化剂的存在下相当的半纤维素溶解可以在较低温度下发生。在稀酸处理接着酶促水解后的总C5糖产量通常在理论上可以从任意给定生物质原料释放的量的75%左右或更高。参见例如,Baboukaniu等(2012)、Won等(2012)、Lu等(2009)、Jeong等(2010)、Lee等(2008)、Sassner等(2008)、Thomsen等(2006)、Chung等(2005)。
[0015] 相反,自动水解水热预处理通常提供低得多的C5糖产量,因此在没有酸催化剂的情况下需要更高温度的预处理。除了在商业上不现实的低干物质含量下进行的自动水解预处理后,自动水解处理通常提供<40%理论回收率的C5糖产量。参见例如,Diaz等(2010)、Dogaris等 (2009)。已经报道,在使用商业上不现实的反应时间和极高的酶剂量的情况下,自动水解的C5产量高达53%。但是,即使是该非常高的C5产量仍然远低于用稀酸预处理常规获得的水平。参见例如,Lee等(2009)、Ohgren等(2007)。
[0016] 用自动水解获得的低C5产量的结果是,大多数关于商业生物质转化系统中水热预处理的报道聚焦于稀酸工艺。通过使用所谓的“两级”稀酸预处理已经达到85%左右的源自半纤维素的C5糖产量。在两级预处理中,使用较低的初始温度溶解半纤维素,然后分离富含C5的液体部分。在第二个阶段,使用较高的温度调理纤维素链。参见例如,Mesa等(2011)、Kim等(2011)、Chen等(2010)、Jin等(2010)、Monavari等(2009)、Soderstrom等(2005)、Soderstrom等(2004)、Soderstrom等(2003)、Kim等(2001)、Lee等(1997)、Paptheofanous等(1995)。美国国家可再生能源实验室(NREL)报道的一个复杂的“两级”稀酸预处理系统声称用玉米秸秆作为原料已经达到90%左右的C5产量。参见Humbird等(2011)。
[0017] 在稀酸系统中避免了纤维素酶催化的木糖低聚物抑制,因为木糖低聚物到单体木糖的水解是由添加的酸催化的。酸催化的木糖低聚物的水解也在与残留固体物质经酶促水解的工艺流分开的工艺流中发生。
[0018] 尽管它提供较低的C5产量,自动水解在商业规模上继续提供针对稀酸预处理的竞争优势。
[0019] 在自动水解工艺的优势中最值得注意的是与从稀酸工艺中回收的木质素相比,残留的未水解木质素具有极大增强的市场价值。首先,在稀酸预处理中通常使用的硫酸引入了残余硫含量。这使所得的木质素对于倾向于消耗来自自动水解的无硫木质素燃料颗粒作为煤的“绿色”替代品的商业电厂不具有吸引力。第二,在硫酸催化的水热预处理中发生的木质素磺化使其比较亲水,从而增加它的机械持水能力。这种亲水性增加了干燥木质素用于商业用途的成本,也使其不适于室外储存(考虑到它容易吸收水分)。用于木质纤维素生物质转化的NREL 工艺的所谓“技术经济模型”(采用稀酸处理)甚至没有考虑将木质素作为可售商品-仅作为工艺流的内部燃料源。参见Humbird等(2011)。相反,依赖于自动水解的工艺方案的“经济利润”包括来自于清洁干燥的木质素颗粒的稳定销售的显著贡献。因为典型的软木质纤维素生物质原料包含大量木质素,占干物质含量的10-40%,这是尤为重要的。因此,即使在自动水解系统的工艺糖产量可能相对于稀酸系统降低的情况中,总体“利润”可以保持等同或甚至更高。
[0020] 自动水解工艺也避免了稀酸的其他公知的缺点。对硫酸的需求偏离了偏好“绿色”加工的精神取向、引入了以酸作为工艺输入的大量操作成本、并导致了对复杂废水处理系统和昂贵的抗腐蚀设备的需求。
[0021] 自动水解还可以有利地放大到适度的工艺状况。NREL所描述的稀酸工艺如此复杂和精巧以至于它不能现实地在较小规模上建立-仅在每小时100吨左右生物质原料的巨大规模上建立。这样的规模仅适于高度集中的生物质加工状况。参见Humbird等(2011)。高度集中的玉米秸秆生物质加工可能很适合具有以化学增强的大规模生产(hyper-production)种植的丰富基因工程玉米的美国。但这种系统在世界上其他地方不太适合。这种系统对适度的生物质加工状况不适合,例如,在甘蔗或棕榈油高粱地的现场加工、或小麦秸秆的区域加工,它们通常每公顷产生比玉米少得多的生物质,即使有基因工程和化学的增强。
[0022] 与稀酸相反,自动水解系统是真正“绿色”的、容易扩展的,且没有需求复杂废水处理系统的负担。因此提供改进的自动水解系统是有利的,即使在相比于稀酸系统仅在糖产量上可能没有明显的优势的情况下。
[0023] 自动水解的低C5单体产量的问题一般驱使木质纤维素生物质加工技术的提供商寻求其他途径。据报道,设计以提供提高的C5产量的一些“两级”预处理系统带有自动水解预处理。参见WO2010/113129、 US2010/0279361、WO2009/108773、US2009/0308383、US8,057,639、US20130029406。在这些“两级”预处理方案中,较低温度的预处理之后,一些富含C5的液体部分通过固/液分离去除,接着进行固体部分的后续较高温度的预处理。大多数这些公开的专利申请没有报道实际的实验结果。在WO2010/113129的两级自动水解预处理的说明中,Chemtex Italia报道了总共26个使用小麦秸秆的实验实施例,其平均C5糖回收率为52%。这些C5回收率值没有区分C5回收率本身和单体糖产量,所述单体糖是在发酵成乙醇和其他有用的产物中实际消耗的底物。
[0024] 在用于加工木质纤维素生物质的方案中引入第二预处理级导致额外的复杂性和成本。因此,使用简单的单级自动水解系统来实质上获得两级预处理的优势是有利的。
[0025] 我们发现,在单级自动水解预处理以非常低强度进行时,出乎意料地可以在酶促水解后获得60%理论产量或更高的最终C5单体高产量,同时还获得合理的葡萄糖产量。在生物质原料被预处理至木聚糖数10%和更高的情况下,大量的原始木聚糖含量保留在固体部分中。与预期相反,该非常高的残余木聚糖含量可以高回收率被酶促水解为单体木糖,同时只牺牲非常小比例的纤维素至葡萄糖的转化。
[0026] 在这些非常低的强度水平下,影响纤维素酶活性或发酵生物机理的可溶性副产物的产生保持得很低,以至于预处理的材料可以直接用于酶促水解和随后的发酵,通常不需要任何洗涤或其他脱毒步骤。
[0027] 在液体部分中木糖低聚物或其他可溶性产物对纤维素酶催化的抑制在本工艺中可以轻易避免。在预处理之后的固/液分离步骤产生液体部分和固体部分。在酶促水解过程中,富含C5的液体部分在“旁路”中保持与固体部分分离。在固体部分的酶促水解后,将液体部分添加到水解产物中并通过保留活性木聚糖酶进行后水解。只在不再需要纤维素酶活性后,在液体部分的木糖低聚物以这种方式水解为木糖单体。 所得的组合水解产物和后水解产物包含源自于纤维素和半纤维素的C5和C6单体糖可以通过改良的酵母直接发酵成乙醇。
[0028] 附图简要说明
[0029] 图1示出了随经过自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的预处理强度因子变化的木聚糖数。
[0030] 图2示出了随经过自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的木聚糖数变化的可溶性和不溶性形式的C5回收率。
[0031] 图3示出了随经过自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的木聚糖数变化的总C5回收率。
[0032] 图4示出了随经过自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的木聚糖数变化的乙酸、糠醛和5-HNF的产量。
[0033] 图5示出了对于经过非常低强度自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料,溶解固体物质的去除对纤维素转化的效果。
[0034] 图6示出了来自经过非常低强度自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料的液体部分的HPLC表征。
[0035] 图7示出了随其中固体部分经过酶促水解接着引入液体部分进行后水解的时间变化的C5糖回收率。
[0036] 图8示出了改良酵母菌株使用小麦秸秆进行乙醇发酵的发酵谱(fermentation profile),该小麦秸秆用非常低强度的自动水解进行预处理、酶促水解并作为合并的液体和固体部分使用而没有脱毒以去除发酵抑制剂。
[0037] 图9示出了一个实施方案的工艺方案。
[0038] 实施方案的详述
[0039] 在一些实施方案中,本发明提供加工木质纤维素生物质的方法,包括:
[0040] –提供软木质纤维素生物质原料,
[0041] –在单级加压水热预处理中以非常低的强度在3.5-9.0的pH范围内预处理所述原料,以使所述预处理的生物质特征是具有10%或更高的木聚糖数,
[0042] –将所述预处理的生物质分离成固体部分和液体部分,
[0043] –在添加或不添加补充水含量的情况下使用由酶混合物催化的酶促水解来水解所述固体部分,所述酶混合物包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶、木糖苷酶和乙酰木聚糖酯酶活性,以及
[0044] –随后混合分离的液体部分和水解的固体部分,从而所述液体部分中的木糖低聚物被所述水解的固体部分中残留的酶活性的作用降解为木糖单体。
[0045] 如在此所用,以下术语具有以下含义:
[0046] 如在此所用,关于定量数或范围的“大约”是指相对所指的数或范围而言+/-10%。
[0047] “自动水解”是指其中在预处理过程中由半纤维素水解释放的乙酸进一步催化半纤维素水解的预处理过程,且适用于在pH 3.5-9.0下进行的木质纤维素生物质的任意水热预处理。
[0048] “为木质纤维素生物质转化而优化的可商购的纤维素酶制剂”是指可商购的足够提供预处理的木质纤维素生物质的酶促水解,且包含内切纤维素酶(内切葡聚糖酶)、外切纤维素酶(外切葡聚糖酶)、内切木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、木糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的可商购的酶活性混合物。术语“为木质纤维素生物质转化优化”是指其中为在水解预处理的木质纤维素生物质成可发酵糖中提高水解产率和/或减少酶消耗量的特定目的选择和/或改进酶混合物的产品开发过程。
[0049] “以”一定干物质水平进行预处理是指在加压水热预处理开始时原料的干物质含量。预处理“在”一定pH下进行,其中生物质水性内容 物的pH是加压水热预处理开始时的pH。
[0050] “干物质”,也以DM表示,是指可溶性和不溶性的总固体物质,且实际上是指“非水内容物”。通过在105℃下干燥直到达到恒定重量测量干物质含量。
[0051] “纤维结构”保持在预处理后纤维片段的平均尺寸>750um的程度。
[0052] “水热预处理”是指使用包含高温液体或蒸汽或两者的水(其作为热的液体、蒸汽或加压蒸汽),在120℃或更高温度下“蒸煮”生物质,其中添加或不添加酸或其他化学物质。
[0053] “单级加压水热预处理”是指其中生物质在单个反应器中经过加压水热预处理的预处理,所述反应器配置为以单轮加热生物质,且其中在固/液分离步骤来从经过加压水热预处理的原料中去除液体部分后没有应用进一步的加压水热预处理。
[0054] “固/液分离”是指通过压迫、离心或其他力施加力来使液体与固体分离的主动机械过程。
[0055] “软木质纤维素生物质”是指木材以外的包含纤维素、半纤维素和木质素的植物生物质。
[0056] “固体部分”和“液体部分”是指预处理生物质在固/液分离中的分离部分。分离的液体统称为“液体部分”。包含相当多的不溶性固体含量的残余部分称为“固体部分”。“固体部分”具有干物质含量,且通常也包含相当多的“液体部分”残留。
[0057] “理论产量”是指从聚合纤维素或聚合半纤维素结构(其中构成的单体糖也可以被酯化或以其它方式取代)获得的纯单体糖的摩尔当量质量。作为理论产量的百分比的“C5单体产量”如下测定:在预处理之前,使用Sluiter等(2008)的强酸水解方法,使用HPLC柱和其中半乳糖和甘露糖与木糖共洗脱的洗脱系统分析生物质原料中的糖类。此类系统的实例包括来自Phenomenex的REZEXTM Monossacharide H+ 柱和来自Biorad的AMINEX HPX 87CTM柱。在强酸水解期间,酯和酸不稳定的取代被去除。除非另有说明,认为在未预处理的生物质中测定的“木糖”+阿拉伯糖的总量被认为是100%理论C5单体回收率,其也可以统称为“C5单体回收率”。使用具有纯化的外部标准基于标准曲线的HPLC表征进行单体糖测定。通过直接测量C5单体的样品的HPLC表征来测定实际的C5单体回收率,其然后以理论产量的百分比表示。
[0058] “木聚糖数”是指如下测定的预处理生物质的表征:预处理的生物质经固/液分离以提供液体部分和占约30%总固体物质的固体部分。然后通过按1:3wt:wt的总固体(DM):水比例与70℃水混合而部分洗涤该固体部分。然后将以这种方式洗涤的固体部分压榨至约
30%总固体。使用A.Sluiter等,“Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass”,US National Renewal Energy Laboratory(NREL)Laboratory Analytical Procedure(LAP),发行日2008年4月25日的方法,如Technical Report NREL/TP-510-42618(2008年4月修订)中所述,测定以这种方式洗涤的固体部分的木聚糖含量。使用其中半乳糖和甘露糖与木糖共洗脱的HPLC柱和洗脱系统。此类系统的实例包括来自Phenomenex的REZEXTM Monossacharide H+柱和来自Biorad的AMINEX HPX 87CTM柱。所描述的这种木聚糖含量的测量包括了一些来自在这些条件下没有被从固体部分中洗出的残余液体部分的可溶性物质的贡献。因此,“木聚糖数”提供了不溶性固体物质中残余木聚糖含量和“液体部分”中可溶性木糖和木糖低聚物含量的“加权组合”量度。
[0059] 可以使用任何合适的软木质纤维素生物质,包括如至少小麦秸秆、玉米秸秆、玉米穗轴、空果串、稻秆、燕麦杆、大麦杆、油菜秸秆、黑麦秸秆、高粱、甜高粱、大豆秸、柳枝稷、百慕达草和其他草类、甘蔗渣、甜菜浆、玉米纤维或其任意组合的生物质。木质纤维素生物 质可以包含其他木质纤维素材料,如纸、新闻纸、纸板或其他城市或办公室废物。木质纤维素生物质可以作为源自不同原料的材料混合物来使用,可以是新鲜的、部分干燥的、完全干燥的或其任意组合。在一些实施方案中,使用至少约10kg生物质原料、或至少100kg生物质原料、或至少500kg生物质原料实施本发明的方法。
[0060] 木质纤维素生物质包含插嵌入松散组织化的半纤维素基质内和密封在富含疏水性木质素的环境内的晶体纤维素纤丝。尽管纤维素本身包含长的、直链D-葡萄糖聚合物,但半纤维素是短的、支链糖(包括所有5-碳戊醛糖(C5糖)以及一些6-碳(C6)糖包括葡萄糖和甘露糖的单体)的异质混合物。木质素是高度异质的聚合物,缺少任何特定的初级结构,并且包含疏水性苯丙素(phenylpropanoid)单体。
[0061] 合适的木质纤维素生物质通常包含预处理前为20至50%干物质的量的纤维素,预处理前为10至40%干物质的量的木质素和15至40%的量的半纤维素。
[0062] 在一些实施方案中,生物质原料在水热预处理之前可以经历粒度缩减和/或其他机械加工,如研磨、碾制、切碎、切割或其他方法。在一些实施方案中,如Knudsen等(1998)所述,生物质原料在加压预处理之前可以洗涤和/或沥滤有价值的盐。在一些实施方案中,原料在加压预处理之前可以在高达99℃的温度下浸泡。
[0063] 在一些实施方案中,原料在水热预处理之前首先在水性溶液中浸泡。在一些实施方案中,如通过引用并入本文中的US8,123,864所述,在预处理中原料浸泡在从后续步骤中获得的包含乙酸的液体中是有利的。如通过引用并入本文中的US12/935,587所述,在最高的可能干物质含量下进行处理是有利的。在高干物质下进行预处理避免了加热不必要的水耗费加工能量。但是,需要一些水含量以从酶促水解获得最佳的最终糖产量。通常,在其固有持水能力上或接近其固有持水能力下预处理生物质原料是有利的。这是给定原料在于过量水中浸泡接着 压制到普通商业螺旋压机的机械极限之后达到的水含量水平-通常30-45%DM。在一些实施方案中,水热预处理在至少35%的DM含量下进行。本领域技术人员容易理解,水热预处理过程中DM含量可能降低,因为在加热过程中加入了一些水含量。在一些实施方案中,原料在至少20%、或至少25%、或至少30%、或至少40%、或40%或更低、或35%或更低、或30%或更低的DM含量下预处理。
[0064] 在一些实施方案中,用水性溶液中浸泡/润湿可以用于在预处理之前调节pH至3.5-9.0的范围,这通常对于自动水解是有利的。容易理解,在预处理过程中pH可以变化,通常变为更高酸性水平,因为乙酸从溶解的半纤维素释放。
[0065] 在一些实施方案中,水热预处理在没有如湿式化预处理所需的补充氧的情况下、或在没有添加如有机溶剂预处理所需的有机溶剂的情况下、或在没有使用如微波预处理所需的微波加热的情况下进行。在一些实施方案中,水热预处理在140℃或更高、或150℃或更高、或160℃或更高、或160-200℃、或170-190℃、或180℃或更低、或170℃或更低的温度下进行。
[0066] 在一些实施方案中,一些C5含量可以在加压预处理之前通过浸泡步骤去除。在一些实施方案中,单一反应器可以配置为加热生物质至单一目标温度。或者,单一反应器可以配置为在该反应器中影响温度梯度,以使得生物质在单轮处理中暴露于多于一个的温度区域。在一些实施方案中,在预处理过程中,在加压反应器内部分地去除一些溶解的生物质组分可能是有利的。
[0067] 合适的水热预处理反应器通常包括纸浆和造纸工业中已知的大多数制浆反应器。在一些实施方案中,水热预处理由反应器中加压至10巴或更低、或12巴或更低、或4巴或更高、或8巴或更高、或8-18巴、或18-20巴的蒸汽施用。在一些实施方案中,预处理反应器配置用于原料的连续流入。
[0068] 在一些实施方案中,湿润的生物质在压力下传输通过反应器一段持续时间或“保留时间”。有利地保持短的保留时间以利于更高的生物质通量。然而,所得的预处理强度由温度及由保留时间确定。有利地保持水热预处理过程中的温度较低,不仅是因为本发明的方法寻求非常低的预处理强度,也因为较低的温度可以使用较低的蒸汽压力完成。在预处理温度可以在180℃或更低的水平且因此饱和的蒸汽压力保持在10巴或更低压力的程度下,出现较低的腐蚀趋势且可以使用更低等级的压力配件和组成,这减少工厂的资本成本。在一些实施方案中,反应器配置为加热生物质至160-200℃、或170-190℃之间的单一目标温度。保留时间在一些实施方案中少于60、或少于30、或少于20、或少于15、或少于14、或少于13、或少于12、或少于10、或少于8、或少于5分钟。
[0069] 生物质原料可以通过各种方式从大气压装载到加压反应器中。在一些实施方案中,可是使用水闸型“颗粒”系统装载生物质原料,例如通过引用并入本文中的US 13/062,522中所述的系统。在一些实施方案中,使用所谓的“螺旋塞”进料机装载预处理反应器是有利的。
[0070] 预处理的生物质可以通过各种方式从加压反应器卸载。在一些实施方案中,预处理的生物质以保存材料的纤维结构的方式卸载。保存预处理生物质的纤维结构是有利的,因为这允许预处理的物质的固体部分在固/液分离中使用普通螺旋压榨设备压制到相当高的干物质水平,并从而避免了增加的隔膜压滤机系统的费用和复杂性。
[0071] 纤维结构可以通过以非爆破性的方式从加压反应器中去除原料来维持。在一些实施方案中,可以使用水闸型系统,如通过引用并入本文中的US13/043,486中所述的系统完成非爆破性去除,从而保持纤维结构。在一些实施方案中,可以使用水利旋流器去除系统,如通过引用并入本文中的US12/996,392中所述的那些完成非爆破性去除,并从而保持纤维结构。
[0072] 在一些实施方案中,预处理的生物质可以使用“蒸汽爆破”(其涉及预处理物质的爆破性释放)从加压预处理反应器中去除。蒸汽爆破的、预处理的生物质没有保持它的纤维金钩,且因此需要更加精细的固/液分离系统以达到与保留纤维结构的预处理生物质使用普通螺旋压机系统可以达到的干物质含量相当的干物质含量。
[0073] 生物质原料以非常低的强度预处理,使得预处理的生物质特征在于具有10%或更高的木聚糖数。在一些实施方案中,生物质被预处理至11%或更高、或12%或更高、或13%或更高、或14%或更高、或15%或更高、或16%或更高、或17%或更高的木聚糖数。参数“木聚糖数”是指反映了不溶性固体物质中保留的木聚糖含量及液体部分中可溶性木糖和木糖低聚物的浓度两者的“加权组合”的复合量度。在较低的Ro强度下,木聚糖数较高。因此,最高的木聚糖数是指最低的预处理强度。木聚糖数甚至在非常低的强度下提供了与传统的强度测量log Ro的负线性相关性,其中不溶性固体物质中的残留木聚糖含量为10%或更高。
[0074] 木聚糖数作为预处理强度的量度特别有用,因为具有等同木聚糖数的不同预处理生物质原料表现出等同的C5单体回收率。相反,常规的Ro强度只是预处理条件的经验描述,其没有提供不同生物质原料之间比较的合理基础。例如,强度log Ro=3.75的单级自动水解提供具有6-7%之间的木聚糖数的预处理甘蔗渣和玉米秸秆,但对于典型的小麦秸秆品种,所得的预处理原料的木聚糖数是大约10%。
[0075] 以非常低的强度预处理生物质原料是有利的,其中预处理的原料的木聚糖数是10%或更高。该非常低的强度水平对应于其中预处理前原料的总半纤维素含量(溶解的或不可逆地失去的)被最小化的过程。在木聚糖数为10%或更高时,对于典型的小麦秸秆、甘蔗渣、甜高粱渣、玉米秸秆和空果串(来自油棕榈)品种,原料的至少60%的原始C5含量可以在单级自动水解预处理后回收,其中固体部分中的木聚糖 及液体部分中的可溶性木糖和木糖低聚物都被计算在内。
[0076] 我们出乎意料的发现,在以非常低的强度单级自动水解预处理的原料的酶促水解后,可以获得至少55%、或至少60%、或至少65%理论值的高的最终C5单体产量而没有C6单体产量的明显损失。在非常低的强度水平下,很大一部分的原料的半纤维素含量在预处理之后保留在固体部分中,其中其随后可以用酶促水解以高回收率水解成C5单体。
[0077] 应当注意的是,关于“木糖回收率”的报道常常不是以与在此报道的木糖回收率相当的术语表示。例如,Ohgren等(2007)和Lee等(2009)报道了高木糖回收率。但这些值只是指来自预处理的生物质的木糖回收率,而不是表示为预处理之前原料的原始半纤维素含量的百分比。或例如,WO2010/113129是指作为预处理之前原料的半纤维素含量百分比的半纤维素回收率,但没有指明单体产量(其始终比总半纤维素回收率小)。
[0078] 以非常低强度水平通过单级自动水解预处理的生物质的另一个起始特征是将用作发酵生物体的抑制剂的预处理副产物的浓度保持在非常低的水平。其结果是,直接在发酵中使用通过本发明的方法获得的水解的生物质而不需要任何洗涤或其他脱毒步骤通常是可能的。
[0079] 如本领域中众所周知的,自动水解水热预处理通常产生多种可溶性副产物,其起到“发酵抑制剂”的作用,因为它们抑制发酵生物体的生长和/或代谢。不同的发酵抑制剂以不同的量产生,取决于木质纤维素原料的性质和预处理的强度。参见Klinke等(2004)。在自动水解预处理中通常形成至少三类发酵抑制剂:(1)作为来自单糖或寡糖的降解产物的呋喃类,主要是2-糠醛和5-HMF(5-羟甲基糠醛);(2)作为木质素结构的降解产物的单体酚类;和(3)源自半纤维素和木质素中的乙酰基团的小有机酸,主要是乙酸。不同抑制剂的混合物已被证实在使用酵母菌株(参见,例如Palmquist等(1999))和使用乙醇大肠杆菌(Escherichia coli)(参见,例如Zaldivar等(1999))的生物乙醇发酵 中协同地发挥作用。
在一些实施方案中,使用本领域熟知的方法预处理的生物质进行闪蒸以降低挥发性抑制剂(最明显的是糠醛)的水平可能是有利的。对预处理至木聚糖数为10%或更高的典型生物质原料品种如小麦秸秆、甜高粱渣、甘蔗渣、玉米秸秆和空果串的自动水解,在我们的经验中只有乙酸和糠醛水平对发酵生物体潜在是抑制性的。当生物质原料以DM 35%或更高进行预处理至木聚糖数10%或更高,且当固体部分以25%或更低的DM(具有添加的水调节DM但没有洗涤步骤)随后酶促水解,水解产物中的糠醛水平通常可以保持低于3g/kg,且乙酸水平低于9g/kg。这些水平对于使用指定菌株的酵母发酵而言通常是可接受的。在酶促水解过程中,一些额外的乙酸从固体部分中半纤维素的降解释放。在一些实施方案中,使用电渗析或本领域已知的其他方法从液体部分和/或水解的固体部分去除一些乙酸含量可能是有利的。
[0080] 不同原料可以通过反应器保留时间和温度的多种不同组合使用单级自动水解进行预处理至木聚糖数10%或更高。本领域技术人员容易通过常规实验确定适用于任何给定原料的合适的预处理途径,使用带有任何给定的生物质反应器-装载和反应器-卸载系统的任何给定的反应器。在原料使用由水闸-系统或螺旋塞进料机装载和由“颗粒泵”水闸系统或水力旋流器系统卸载的连续反应器预处理的情况下,使用典型的小麦秸秆或空果串品种,在180℃的温度和24分钟的反应器保留时间保留时间下通常可以达到10%或更高木聚糖数的非常低的强度。对于典型的玉米秸秆、甘蔗渣和甜高粱渣品种,10%或更高木聚糖数的非常低的强度通常可以使用180℃的温度和12分钟的反应器保留时间,或使用175℃的温度和17分钟的反应器保留时间达到。本领域技术人员容易理解,保留时间和温度可以调整以达到相当的Ro强度水平。
[0081] 预处理之后,预处理的生物质通过固/液分离步骤分离为固体部分和液体部分。容易理解,“固体部分”和“液体部分”可以进一步被 细分或加工。在一些实施方案中,在进行固/液分离的同时从预处理反应器中去除生物质。在一些实施方案中,预处理的生物质在从反应器中卸载(通常使用简单和低成本的螺旋压机系统)之后进行固/液分离步骤以产生固体部分和液体部分。纤维素酶活性被液体部分抑制,最显著的是由于木糖低聚物含量,但也可能由于酚含量和/或其他尚未被鉴定的化合物。因此,在固体部分中达到最高实用的干物质含量水平,或者从固体部分中去除最高实用的溶解固体物质量是有利的。在一些实施方案中,固/液分离获得具有至少40%、或至少45%、或至少50%、或至少55%DM含量的固体部分。使用普通的螺旋压机系统的固/液分离通常可以在固体部分中获得高达50%的DM水平,只要生物质原料以保持纤维结构的方式预处理。在一些实施方案中,承担更高的工厂资本支出以获得更有效的固/液分离可能是有利的,例如,使用隔膜压滤机系统。在一些实施方案中,溶解的固体物质可以通过系列洗涤和压榨或通过制浆和造纸领域中已知的置换洗涤技术从固体部分去除。在一些实施方案中,或者直接通过固/液分离,或者通过洗涤和固/液分离的一些结合,固体部分的溶解固体物质含量降低至少50%、或至少55%、或至少60%、或至少65%、或至少70%、或至少75%。
[0082] 预处理至木聚糖数10%或更高的原料的酶促水解通常可以用商业上合理的酶消耗量进行,不需要特定的洗涤或脱毒步骤,其中固体部分被压榨至至少40%DM,或其中固体部分的溶解固体物质含量降低至少50%。
[0083] 在固体部分的酶促水解期间,从固/液分离所得的液体部分与固体部分保持分离。我们命名这个暂时的分离为“C5旁路”。从通过单级自动水解预处理至木聚糖数10%或更高的软木质纤维素生物质原料如典型的小麦秸秆、甘蔗渣、甜高粱渣、玉米秸秆和空果串品种所获得的液体部分通常包含小的C6单体的组分(1x),主要是葡萄糖及一些其他糖的;较大的可溶C6低聚物组分(大约2x-7x);较大的C5单体 组分(大约4x-8x),主要是木糖及一些阿拉伯糖和其他糖;和大得多的可溶性木糖低聚物组分(大约18x-30x)。可溶木糖低聚物通常主要地包括木六糖、木五糖、木四糖、木三糖和木二糖及一些较高级链的低聚物。
[0084] 固体部分使用酶活性的混合物进行酶促水解。本领域技术人员容易理解,适合实施本发明方法的酶混合物的组成可以在相对较宽的范围内变化。合适的酶制剂包括可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂。优化过程中酶混合物的选择和改进可以包括基因工程技术,例如Zhang等(2006)中所描述的那些或本领域已知的其他方法。可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂通常由制造商和/或供应商本身鉴定。这些通常与可商购的用于一般用途或为在制造动物饲料、食品、纺织品洗涤剂或在造纸行业使用而优化的纤维素酶制剂不同。在一些实施方案中,使用的可商购的为木质纤维素TM生物质转化而优化的纤维素酶制剂由GENENCOR 提供且包含从遗传修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)的发酵中分离的外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、内切木聚糖酶、木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和β葡萄糖苷酶,例如在ACCELLERASE TRIOTM商标下出售的商用纤维素酶制剂。在一些实施方案中,使用的可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素TM
酶制剂由NOVOZYMES 提供且包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、内切木聚糖酶、木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶和β葡萄糖苷酶,例如在CELLIC CTEC2TM或CELLIC CTEC3TM商标下出售的商用纤维素酶制剂。
[0085] 详细分析三种可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂中所代TM TM TM表的酶活性。这三种制剂(来自GENENCOR 的ACCELLERASE TRIO 及来自NOVOZYMES 的CELLIC CTEC2TM和CELLIC CTEC3TM)中的每一个以制造商建议范围内的酶剂量水平有效地提供根据本发明的方法制备的组合C5/C6小麦秸秆水解产物,其 中C5单体产量为至少
60%,和纤维素C6转化产率为至少60%。对于这些商用纤维素酶制剂中的每一个,表征12种不同酶活性的水平,并以每克蛋白质表示。实施例8中提供实验细节。结果如表1所示。
[0086] 表1、为木质纤维素生物质转化而优化的商用纤维素酶制剂中选择的活性测量。
[0087]
[0088] 在一些实施方案中,可以使用与表1所述的商用制剂在任何内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β葡萄糖苷酶、内切木聚糖酶、木糖苷酶和/或乙酰木聚糖酯酶活性之间具有相似相对比例的酶制剂。
[0089] 或者可以通过本领域熟知的方法从多种微生物(包括好氧和厌氧细菌、白腐真菌、软腐真菌和厌氧真菌)获得能有效水解木质纤维素生物质的酶混合物。参见例如Singhania等(2010)。产生纤维素酶的生物体通常以合适的比例分泌不同酶的混合物,以适用于木质纤维素底物的水解。可用于木质纤维素生物质转化的优选纤维素酶制剂来源包括真菌如木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、曲霉属(Aspergillus)和白腐真菌属(Phanerochaete)的物种。
[0090] 特别地对一种真菌物质,里氏木霉,进行了广泛的研究。野生型里氏木霉分泌包含两种对纤维素链的还原和非还原末端具有相应特异性的外切纤维素酶(纤维二糖水解酶)、至少五种具有不同纤维素识别位点的不同的内切纤维素酶、两种β葡萄糖苷酶以及多种内切木聚糖酶和外切木糖苷酶的酶混合物。参见Rouvinen,J.等(1990)、Divne,C.等(1994)、Martinez,D.等(2008)。商用纤维素酶制剂通常还包括α-阿拉伯呋喃糖苷酶和乙酰木聚糖酯酶活性。参见例如Vinzant,T.等(2001)。
[0091] 之前已经表明,与野生型生物体天然分泌的混合物中存在的比例不同的相对比例的优化酶活性混合物产生更高的糖产量。参见Rosgaard等(2007)。实际上,已经建议,包括多达16种不同酶蛋白的酶掺混物的优化可以有利地针对经过任何给定预处理的任何给定生物质原料单独地确定。参见Billard,H.等(2012)、Banerjee,G.等(2010)。然而,作为商业实用性,商用酶提供商通常寻求产生最小可行数目的不同酶掺混物,以使在大规模生产中可以获得规模经济。
[0092] 在一些实施方案中,用一种或多种额外的或补充的酶活性补充可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂可能是有利的。在一些实施方案中,简单地增加商用制剂中存在的一种或多 种组分酶的相对比例可能是有利的。在一些实施方案中,引入专的附加活性可能是有利的。例如,在使用任何给定生物质原料实施本发明的方法中,可以鉴定可以有利地通过使用一种或多种补充酶活性水解的特定未水解的糖键。此类未水解的键可以通过使用本领域熟知的方法对可溶性水解产物或不溶性未水解残留物中低聚糖类的表征来鉴定。未水解的键还可以如Nguema-Ona等(2012)所述,使用针对特定糖键的单克隆抗体通过综合微阵列聚合物谱分析来鉴定。在一些实施方案中,用额外的内切木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、甘露聚糖酶、葡糖醛酸苷酶(glucouronidase)、木聚糖酯酶、淀粉酶、木糖苷酶、glucouranyl酯酶或阿拉伯呋喃糖苷酶中任何一种或多种补充可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂可能是有利的。
[0093] 在一些实施方案中,或者如Humbird等(2011)所述,在木质纤维素生物质加工设施现场生产酶可能是有利的。在一些实施方案中,可以在现场生产可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂,有或者没有适合特定生物质原料的特定酶活性的定制补充。
[0094] 在一些实施方案中,不管是否使用可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂,且不管酶是否是在生物质加工工厂处现场生产,本发明的优势可以使用经过采用酶混合物的非常低强度的木聚糖数10%或更高的自动水解预处理的软木质纤维素生物质原料获得,所述酶混合物包含以下:(1)外切纤维素酶(纤维二糖水解酶)活性(EC 3.2.1.91),任选地包括至少两种对纤维素链的还原和非还原末端有特异性的酶;(2)内切纤维素酶活性(EC 3.2.1.4);(3)β葡萄糖苷酶活性(EC 3.2.1.21);(4)β-1,4-内切木聚糖酶活性(EC 3.2.1.8);(5)乙酰木聚糖酯酶活性(EC 3.1.1.72);及任选的(6)β-1,3-木糖苷酶活性(EC 3.2.1.72);和任选的(7)β-1,4木糖苷酶活性(EC 3.2.1.37);和任选的(8)α-1,
3和/或α-1,5-阿拉伯呋喃糖苷酶活性(EC 3.2.1.23)。在一些实施方案中,酶混合物进 一步的特征是具有以下酶活性的相对比例:1FPU纤维素酶活性与至少30CMC U内切葡聚糖酶活性、及与至少28pNPG Uβ葡萄糖苷酶活性和与至少50ABX U内切木聚糖酶活性相关。本领域技术人员容易理解,CMC U是指羧甲基纤维素单元,其中1CMC U活性在50℃和pH 4.8的特定分析条件下1分钟内释放1μmol的还原糖(以葡萄糖当量表示);pNPG U是指pNPG单位,其中1pNPG U活性在50℃和pH 4.8下每分钟从对硝基苯基-B-D-吡喃葡萄糖苷释放1μmol的硝基苯酚;且ABX U是指桦木木聚糖酶单位,其中1ABX U活性在50℃和pH 5.3下1分钟内释放1μmol的木糖还原糖当量。本领域技术人员进一步容易理解,FPU是指提供包括不同纤维素酶的任意混合物的总纤维素酶活性量度的“滤纸单位”。如在此所用,FPU是指通过Adney,B.和Baker,J.,Laboratory Analytical Procedure#006,"Measurement of cellulase activity",August 12,1996,the USA National Renewable Energy Laboratory(NREL)的方法确定的滤纸单位,该文献明确地通过引用并入本文。
[0095] 在一些实施方案中,酶混合物可以进一步包括甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、a-D-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)、a-D-葡萄糖苷酸酶(EC 3.2.1.139)、肉桂酸酯酶(EC 3.1.1.-)或阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)中的任何一种或多种。
[0096] 本领域技术人员通过常规实验很容易确定施用的任何给定酶制剂的合适剂量水平以及酶促水解的合适持续时间。保持较低的酶剂量水平从而最小化酶的成本通常是有利的。在一些实施方案中,使用高酶剂量可能是有利的。在实施本发明的方法时,本领域技术人员可以在考虑包括当地生物质成本、产物流的市场价格、工厂总资本成本和摊销计划及其他因素的相关因素后确定酶剂量的经济优化。在其中使用可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂的实施方案中,可以使用制造商提供的一般剂量范围来确定在其内进行优化的一般范围。在一些实施方案中,水解持续时间为至少48小时、或至少64小时、或至少72小时、或至少96小时、 或24-150小时。
[0097] 本领域中众所周知,当水解在低干物质含量下进行时,纤维素酶催化更加有效。较高的固体物质浓度高度地抑制纤维素酶催化作用,尽管造成该公知效果的具体原因尚未完全明白。参见例如,Kristensen等(2009)。
[0098] 在一些实施方案中,在非常高的DM>20%下进行水解可以是有利的,尽管有一些造成酶消耗量的增加。在最高的实用干物质水平下进行水解以最小化水消耗和废水处理需求通常是有利的。另外,在发酵系统中使用最高的实用糖浓度是有利的。当水解在较高的干物质水平下进行时,产生较高的糖浓度。本领域技术人员通过常规实验容易确定对于任何给定的生物质原料和酶制剂,适合达到指定工艺目标的进行酶促水解的DM水平。在一些实施方案中,固体部分的酶促水解可以在15%DM或更高、或16%DM或更高、或17%DM或更高、或18%DM或更高、或19%DM或更高、或20%DM或更高、或21%DM或更高、或22%DM或更高、或
23%DM或更高、或25%DM或更高、或30%DM或更高、或35%DM或更高下进行。
[0099] 在一些实施方案中,以40%或更高的DM从固/液分离回收固体部分,且添加另外的水含量以使得酶促水解可以在较低DM水平下进行。容易理解,水含量可以以新鲜水、有或者没有添加剂(如任何分子量的聚乙二醇(PEG)或表面活性剂、盐、用于调节pH的化学物质如氢氧化铵、氢氧化或氢氧化钠、抗细菌或抗真菌剂、或其他物质)的浓缩或其他工艺溶液的形式添加。
[0100] 在固体部分被酶促水解至理想的转化程度后,保持在C5旁路中的液体部分与水解产物混合物混合用于后水解。在一些实施方案中,所有回收的液体部分可以一次性加入,而在另外的实施方案中,可以去除液体部分中的某些组分和/或可以逐步添加液体部分。在一些实施方案中,在与液体部分混合之前,固体部分被水解至至少50%、或至少55%、或至少60%纤维素转化,意思是至少获得了葡萄糖单 体的指定理论产量。液体部分中存在的相当大比例的木糖低聚物通常可以被水解产物混合物中保持活性的木聚糖酶和其他酶的作用水解成木糖单体。在一些实施方案中,后水解进行至少6小时,或15-50小时、或至少24小时。
在一些实施方案中,液体部分中存在的木糖低聚物质量的至少60%、或至少65%、或至少
70%、或至少75%、或至少80%、或至少85%、或至少90%在后水解过程中通过水解产物混合物中保持活性的木聚糖酶和其他酶的作用被水解为木糖单体。在一些实施方案中,液体部分直接与水解产物混合而没有进一步添加化学添加剂。在一些实施方案中,液体部分的某些组分如乙酸、糠醛或酚类可以在与水解产物混合之前从液体部分中去除。
[0101] 在一些实施方案中,固体部分的酶促水解和/或液体部分的后水解可以作为同步糖化发酵(SSF)过程进行。本领域中众所周知,当SSF可以在与酶促水解的最佳温度相同的温度下进行时,酶消耗量可以最小化,因为在酶促水解过程中引入的发酵生物体消耗葡萄糖和木糖单体,从而降低酶催化反应的产物抑制。在一些实施方案中,后水解仅在纤维部分被水解(不添加发酵生物体)到至少60%纤维素转化之后进行。
[0102] 在通过单级自动水解在35%或更高的DM下预处理生物质原料如小麦秸秆、甘蔗渣、甜高粱渣、玉米秸秆或空果串到10%或更高的木聚糖数的情况中,在获得的预处理生物质的固体部分具有至少40%DM或去除至少50%溶解固体物质的情况中,在随后使用可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂以15-27%的DM酶促水解固体部分的情况中,在酶促水解进行至少48小时的情况中,在获得至少50%葡萄糖转化后将液体部分添加至固体部分水解产物中的情况中,及在添加的液体部分经至少6小时时间的后水解的情况中,达到合并的C5/C6水解产物中对应于理论最大木糖产量的60%或更高的C5单体产量的C5单体浓度通常是可能的。
[0103] 在一些实施方案中,可以使用一种或多种改良的酵母菌株直接将合并的C5/C6水解产物发酵成乙醇。
[0104] 图9示出了一个实施方案的工艺方案。如图所示,浸泡、洗涤或润湿软木质纤维素生物质至35%或更高的DM。在3.5-9.0范围内的pH下在单级自动水解中使用加压蒸汽预处理生物质至特征是木聚糖数10%或更高的强度。预处理的生物质进行固/液分离以产生液体部分和具有40%或更高DM含量的固体部分。调节固体部分至合适的DM含量,然后在15%或更高的DM含量下进行酶促水解至纤维素酶转化率60%或更高的程度。随后混合分离的液体部分和水解的固体部分,并进行后水解,从而在液体部分中存在的相当大量的木糖低聚物被水解为单体的木糖。在所述的水解和后水解结束后,C5单体的产量通常是至少60%,而纤维素转化也相似地为至少60%。实施例
[0105] 实施例1:作为预处理强度量度的固体部分的“木聚糖数”表征。
[0106] 在以35-50%干物质预处理之前,用0-10g乙酸/kg干物质生物质(pH>4.0)浸泡小麦秸秆(WS)、玉米秸秆(CS)、甜甘蔗渣(SCB)和空果串(EFB)。在170-200℃的温度下预处理约60kg DM/h生物质,保留时间12-18分钟。使用水闸系统将生物质装载至反应器中,并使用水闸系统卸载预处理的材料。加压预处理反应器内的压力对应于所用温度下饱和蒸汽的压力。使用螺旋压榨机对预处理的生物质进行固/液分离,从而产生液体部分和具有约30%干物质的固体部分。固体部分用约3kg水/kg干生物质洗涤,并且再次压榨至约30%干物质。Petersen等(2009)进一步描述了关于预处理反应器和过程的详细内容。
[0107] 根据Sluiter等(2005)和Sluiter等(2008)所述的方法,使用装备来自Phenomenex的Rezex Monossacharide H+柱的Dionex Ultimate 3000HPLC系统分析原始原料中的碳水化合物。在连续预处理三小时后收集液体部分和固体部分的样品,并且在三小时内三次收集样品以确保样品从稳态预处理获得。根据Sluiter等(2008)描述的方法,使用装备Rezex Monossacharide H+单糖柱的来自Dionex的Ultimate 3000HPLC系统分析固体部分的碳水化合物。根据Sluiter等(2006)描述的方法,使用装备Rezex Monossacharide H+单糖柱的来自Dionex的Ultimate 3000HPLC系统分析液体部分的碳水化合物和降解产物。通过在具有5mM硫酸的水中以1:4的比例悬浮固体部分和之后根据Sluiter等(2006)描述的方法,使用装备Rezex Monossacharide H+柱的来自Dionex的Ultimate 3000HPLC系统进行分析来分析固体部分中的降解产物。根据Weiss等(2009)中所述的方法分析干物质含量和悬浮固体物质的量。如Petersen等(2009)所述设置质量平衡并测定纤维素和半纤维素回收率。也定量在预处理每kg干物质中,降解为5-HMF或糠醛的糖的量和从半纤维素释放的醋酸盐的量,虽然由于闪烁导致的糠醛损失没有计算在内。
[0108] 预处理过程的强度通常通过首先由Overend等(1987)提出的强度因子来描述。强度因子通常表示为对数值,以使得log(R0)=t*eksp((T-Tref)/14.75),其中R0是强度因子,t是以分钟计的保留时间,T是温度,而Tref是参照温度,通常为100℃。强度因子是基于半纤维素溶解的动力学,如Belkecemi等(1991)、Jacobsen和Wyman(2000)或Lloyd等(2003)所述。因此预处理的强度与预处理之后固体部分中保留的残余半纤维素含量有关。
[0109] 根据Sluiter等(2008)所述的方法,使用装备来自Phenomenex的Rezex Monossacharide H+柱的Dionex Ultimate 3000HPLC系统分析如所述地制备和洗涤的固体部分的C5含量。当通过水热自动水解预处理时,按照以上所述产生和洗涤的固体部分中的木聚糖含量对于软木质纤维素生物质(例如小麦秸秆、玉米秸秆或EFB)与强度因子线性相关。作为按照以上所述制备和洗涤的固体部分中木聚糖含量的强度定义在预处理设定之间是可转换的。木聚糖数是洗涤的固体部分中测量的木聚糖含量,其包括一些来自可溶性物质的成分。图1示出了对于小麦秸秆、玉米秸秆、甘蔗渣和来自棕榈油加工的空果串的木聚糖数对预处理强度log(Ro)的相关性。
[0110] 如所示的,对于通过单级自动水解预处理的各种测试生物质原 料,在木聚糖数和预处理强度之间存在明显的负线性相关。
[0111] 实施例2.随预处理强度变化的C5回收率
[0112] 如实施例1中所述预处理生物质原料并表征样品。图2示出了通过自动水解预处理小麦秸秆的实验中,随木聚糖数变化的C5回收率(木糖+阿拉伯糖)。C5回收率显示为水不溶性固体物质(WIS)、水溶性固体物质(WSS)和总回收率。如所示的,作为水不溶性和水溶性固体物质的C5回收率均随木聚糖数的增加而提高。随着木聚糖数增加超过10%,作为水溶性固体物质的C5回收率降低,而作为水不溶性固体物质的C5回收率继续提高。
[0113] 测试的典型小麦秸秆品种在预处理之前以干物质计包含约27%的半纤维素。图3示出了预处理之后,对于通过自动水解预处理的小麦秸秆、玉米秸秆、甘蔗渣和EFB随木聚糖数变化的总C5回收率。测试的典型玉米秸秆、甜甘蔗渣和EFB品种在预处理之前以干物质计分别包含约25%、19%和23%的C5含量。如所示的,对于所有原料,预处理之后的总C5回收率取决于如木聚糖数定义的预处理强度。如所示的,在预处理之后回收的90%的C5含量可以被完全水解为C5单体的情况下,当预处理强度特征是产生10%或更高的木聚糖数时,可以预期酶促水解后60%的最终C5单体产量。
[0114] 实施例3.随预处理强度变化的抑制酶和酵母生长的降解产物的产生
[0115] 如实施例1中所述预处理生物质原料,并表征样品。图4示出了通过单级自动水解预处理小麦秸秆的实验中,乙酸释放以及糠醛和5-羟甲基糠醛(5-HMF)的产生对木聚糖数的相关性。如所示的,这些公认的抑制发酵酵母且在某些情况下也抑制纤维素酶的降解产物的产生在木聚糖数小于10%时呈指数增长。在10%或更高木聚糖数下,糠醛和乙酸的水平落入到允许预处理生物质发酵而不需要脱毒步骤的范围内。对于乙酸,其水平在预处理至木聚糖数10%或更高的生物质的酶促水解 过程中进一步提高,尽管通常达到被改造以消耗C5和C6糖两者的酵母良好耐受的水平。
[0116] 实施例4.随固体部分DM%变化的固体部分中保留的物质对纤维素酶的抑制。
[0117] 在基本上按照WO2006/056838中所描述和所用的6-室反应器的原理工作的6-室自由降落反应器中进行实验。6-室水解反应器设计为以高于20%DM的固体浓度进行液化和水解的实验。反应器由分成6个独立的室的水平放置的辊筒组成,每个室24cm宽和50cm高。每个室中安装了具有三个桨叶的水平转轴用于混合/搅拌。1.1kW达用作驱动,并且旋转速度在2.5至16.5rpm范围内可调。旋转的方向经编程为每两分钟在顺时针和逆时针方向之间切换。外部的充水加热夹套使得能够控制高达80℃的温度。
[0118] 实验使用了通过单级自动水解预处理的小麦秸秆。将生物质润湿至DM>35%,并在pH>4.0下用蒸汽预处理至木聚糖数10.5%。在丹麦的Skarbak的Inbicon试验工厂进行预处理。使用水闸系统将生物质装载至预处理反应器中,并使用水闸系统从反应器卸载预处理的生物质。在某些情况下,使用螺旋压榨机使预处理的生物质接受固/液分离,从而产生液体部分和固体部分。固体部分具有大约30%的DM含量,包含大部分的初始纤维素和木质素,部分的半纤维素和总共大约25%的溶解固体物质。
[0119] 将6室反应器的室填充包含所有溶解和未溶解的固体物质的总预处理生物质或包含大约25%总溶解固体物质的压榨固体部分。调节干物质含量至19%DM。使用每克葡聚糖0.08ml来自Novozymes的CTec2TM或每克葡聚糖0.2-0.3ml来自DuPont,Genencor的TM
Accellerase TRIO 在50℃和pH 5.0至5.3下水解预处理的生物质。这些可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂的剂量水平完全是在制造商建议的范围内。在混合速度6rpm下进行酶促水解实验96小时。
[0120] 图5示出了在这些条件下酶促水解之后的纤维素转化,其随酶促水解之前去除的%溶解固体物质而变化。如所示的,在这些酶剂量水平下去除75%溶解固体物质从绝对值来说(in absolute terms)增加纤维素转化10-20%。因此,在酶促水解之前压榨固体部分至DM含量为至少40%或另外地减少溶解固体物质含量至少50%是有利的,因为这将提供提高的酶性能。
[0121] 实施例5.来自预处理至木聚糖数>10%的生物质的糖含量和液体部分的水解[0122] 预处理小麦秸秆、玉米秸秆和甘蔗渣至木聚糖数11.5%(WS)、12.3%(SCB)和15.5%(CS)并进行固/液分离以产生液体部分和固体部分,如实施例5所述。根据(Sluiter,Hames等2005)所述的方法,使用装备Rezex Monossacharide柱的Dionex Ultimate 
3000HPLC系统分析液体部分的碳水化合物和降解产物。表2示出了以DM含量百分比表示的液体部分的糖含量,其划分成低聚物和单体的葡萄糖/葡聚糖、木糖/木聚糖和阿拉伯糖/阿拉伯聚糖的类别中。如所示的,尽管一些葡萄糖含量以单体和低聚物的形式存在,糖含量的主要部分是低聚的木聚糖。注意到使用自动水解获得的液体部分中木聚糖低聚物占优势与使用稀酸预处理获得的液体部分相反。在用稀酸水热预处理法预处理的生物质中,液体部分通常通过酸催化剂的作用水解为单体成分。
[0123] 表2.预处理至木聚糖数>10%的生物质中液体部分的糖含量
[0124]
[0125] 进一步通过使用Thermo Scientific Dionex CarboPacTM PA200柱使用模化的Dionex ICS-5000色谱系统的HPLC分析表征来自预处理的小麦秸秆的液体部分。使用NaOH/NaOAc-梯度条件分离分析物,并通过使用金电极的积分和脉冲安培检测(IPAD)测量。图6 示出了描述液体部分的洗脱谱的HPLC色谱图,其中木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)、木五糖(X5)和木六糖(X6)标准品的洗脱图作为较高的迹线重叠在较低的迹线上。如所示的,自动水解的生物质的液体部分包括包含少量的木糖单体和相当大量的木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)、木五糖(X5)和木六糖(X6)以及其他物质的混合物。
[0126] 实施例6.固体部分的酶促水解和在纤维水解后来自预处理至木聚糖数>10%并压榨至>40%DM的生物质的液体部分的添加接着后水解
[0127] 如实施例4所述的在6-室自由降落反应器中进行了实验。实验使用通过单级自动水解预处理至木聚糖数11.5至15.6%的小麦秸秆、玉米秸秆或甘蔗渣。将生物质切割并润湿至DM>35%,并在170-190℃下用蒸汽预处理12分钟。在丹麦的Skarbak的Inbicon试验工厂进行预处理。使用螺旋压榨机使预处理的生物质接受固/液分离以产生具有>40%DM的固体部分。
[0128] 将6室反应器的室填充大约10kg的压缩预处理生物质,并通过加水调节至19-22%DM。使用来自GENENCOR-DuPONT的ACCELLERASE TRIOTM在50℃和pH 5.0至5.3下水解预处理的生物质。混合速度是6rpm。运行水解实验96小时,且然后在加入从预处理后的固体部分压榨出来的液体部分,并在50℃和pH 5.0至5.3下运行后水解48小时。
[0129] 每天取样HPLC样品以跟踪纤维素和半纤维素的转化,并使用装备Rezex Monossacharide柱的Ultimate 3000HPLC系统通过使用外部标准的定量分析葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。
[0130] 图7示出了使用预处理至木聚糖数12.3%并用每克葡聚糖0.3 ml Accellerase TrioTM(Genencor)水解的甘蔗渣,在固体部分水解96小时后加入液体部分的半纤维素转化的水解数据。所示的是典型的水解谱图。C5单体回收率以来自水解反应中存在的物质的理论产 量的百分比表示。固体部分中的大多数半纤维素在固体部分水解的前24小时内被转化成单体糖。96小时后液体部分的加入提高了理论潜在产量,这解释了刚加入液体部分之后观察到的C5转化的下降。在前24小时内,大多数来自液体部分的C5被转化成单体。将恰在液体部分加入之前的C5转化与水解结束时相比较,计算液体部分的C5转化为使用在这些条件下的甘蔗渣的90%是可能的。
[0131] 表3示出了在不同环境下预处理且使用不同剂量水平的可商购的为木质纤维素生TM物质转化而优化的纤维素酶制剂(Accellerase Trio (Genencor))水解的不同生物质的水解数据。使用的所有酶剂量水平均在制造商建议的范围内。如所示的,使用单级自动水解以及具有C5旁路的酶促水解和后水解,用制造商建议的可商购的为木质纤维素生物质转化而优化的纤维素酶制剂的剂量可以达到60%或更高的C5单体产量,同时仍然达到60%或更高的纤维素转化。
[0132] 表3.具有C5旁路的使用非常低强度的单级自动水解和后水解的水解产量[0133]
[0134] 实施例7.合并水解产物中C5和C6糖通过改变的酵母共发酵为乙醇
[0135] 作为使用通过单级自动水解预处理至木聚糖数>10%制备的从软木质纤维素生物质(在这里是小麦秸秆)产生的水解产物的实例,图8示出了在用能够转化C5和C6糖两者的GMO酵母(来自TERRANOL TM的菌株V1)发酵之前,在没有脱毒或任何其他处理步骤的情况下进行发酵的数据。在发酵前用KOH颗粒调节水解产物至pH 5.5,并补充3g/L尿素。发酵以分批发酵进行。反应器中的初始细胞浓度是0.75g dw/L。使用自动添加10%NH3控制发酵在pH 5.5。保持温度在30℃,且搅拌速度为300rpm。如所示的,葡萄糖和木糖容易消耗且乙醇容易产生,尽管存在通常在较高预处理强度水平下证明为抑制性的乙酸、糠醛和其他化合物。
[0136] 实施例8.商用纤维素酶制剂活性水平的实验测定
[0137] 稀释商用制剂来自GENENCORTM的ACCELLERASE TRIOTM以及来自NOVOZYMESTM的CELLIC CTEC2TM和CELLIC CTEC3TM,以使得测试的样品制剂中的蛋白质浓度基本等同。加入等体积的稀释酶制剂,且试验测定一式两份或三份地进行。
[0138] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中,在25℃下进行CBHI(外切纤维素酶)活性分析25分钟。通过跟踪从模式底物4-甲基伞形基-β-纤维二糖苷的4-甲基伞形酮释放(Abs:347nm)的连续速率一式三份地测定活性。活性单位是1μmole MeUmb当量/分钟。CTEC3、AC Trio和CTEC2分析中蛋白质浓度分别为0.16、0.14、0.17mg/ml。底物浓度是0.5mg/ml。
[0139] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中,在50℃下进行内切-1,4-β-葡聚糖酶活性分析60分钟。通过跟踪与模式底物Avicel PH-101的还原末端产生相关的吸光度变化一式三份地测定活性。活性单位是1μmole葡萄糖当量/分钟。CTEC3、AC Trio和CTEC2分析中蛋白质浓度分别为0.80、0.67、0.79mg/ml。底物浓度是80mg/ml。
[0140] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中,在50℃下进行β-葡萄糖苷 酶活性分析20分钟。通过跟踪从模式底物纤维二糖的葡萄糖释放相关的吸光度变化一式三份地测定活性。活性单位是2μmole葡萄糖/分钟。CTEC3、AC Trio和CTEC2分析中蛋白质浓度分别为0.1、0.12、0.12mg/ml。底物浓度是1.7mg/ml。
[0141] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中,在50℃下进行内切-1,4-β-木聚糖酶活性分析60分钟。通过跟踪与模式底物水可提取的阿拉伯糖基木聚糖的还原末端产生相关的吸光度变化一式三份地测定活性。活性单位是1μmole葡萄糖当量/分钟。CTEC3、AC Trio和CTEC2分析中蛋白质浓度分别为1.12、0.97、1.12mg/ml。底物浓度是10mg/ml。
[0142] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中,在50℃下进行β-木糖苷酶活性分析60分钟。通过跟踪与模式底物水可提取阿拉伯糖基木聚糖的水解相关的木糖释放一式两份地测定活性。活性单位是1μmol木糖/分钟。CTEC3、AC Trio和CTEC2分析中蛋白质浓度分别为1.12、0.97、1.12mg/ml。底物浓度是10mg/ml。
[0143] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中,在50℃下进行β-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性分析60分钟。通过跟踪与模式底物水可提取阿拉伯糖基木聚糖的水解相关的阿拉伯糖释放一式三份地测定活性。活性单位是1μmole阿拉伯糖/分钟。CTEC3、AC Trio和CTEC2分析中蛋白质浓度分别为1.12、0.97、1.12mg/ml。底物浓度是10mg/ml。
[0144] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中,在50℃下进行淀粉葡萄糖苷酶(AMG)活性分析80分钟。通过跟踪与模式底物可溶性玉米淀粉的葡萄糖释放相关的吸光度变化一式三份地测定活性。活性单位是1μmole葡萄糖/分钟。CTEC3、AC Trio和CTEC2分析中蛋白质浓度分别为1.12、0.97、1.12mg/ml。底物浓度是10mg/ml。
[0145] 在50mM NaOAC缓冲液pH 5中,在50℃下进行α-淀粉酶活性分析60分钟。通过跟踪与模式底物可溶性玉米淀粉的还原末端产生相关的吸光度变化一式三份地测定活性。活性单位是1μmole葡萄糖当量/分钟。CTEC3、AC Trio和CTEC2分析中蛋白质浓度分别为 1.12、0.97、1.12mg/ml。底物浓度是10mg/ml。
[0146] 在100mM琥珀酸盐缓冲液pH 5中,在25℃下进行乙酰木聚糖酯酶活性分析25分钟。通过跟踪从模式底物4,4-硝基苯基乙酸酯的4-硝基苯基释放(Abs:410nm)的连续速率一式三份地测定活性。活性单位是1μmole pNP当量/分钟。CTEC3、AC Trio和CTEC2分析中蛋白质浓度分别为0.48、0.42、0.51mg/ml。底物浓度是10mg/ml。
[0147] 活性测定的结果如表1所示。
[0148] 实施方案和实施例的描述只是说明性的,并且不意图用来限制权利要求的范围。本文中引用的各参考文献在此明确通过引用全文并入。
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