[0001] 本发明涉及由生物质制造糖液的方法。

[0002] 近年来，将含纤维素的生物质用酸、热水、碱等进行前处理后，添加纤维素酶而水解，从而制造糖液的方法被广泛研究。然而，作为这样的使用纤维素酶的方法的缺点，存在由于纤维素酶的使用量多、且价格也高，因而糖液制造成本增大这样的课题。

[0003] 作为解决本课题的方法，提出了将在纤维素水解中使用的纤维素酶回收再利用的方法。例如，利用自旋过滤器进行连续固液分离，使所得的糖液通过超滤膜进行过滤，从而回收纤维素酶的方法(专利文献1)；通过在酶糖化的阶段加入表面活性剂来抑制纤维素酶吸附，从而提高回收效率的方法(专利文献2)；将酶糖化后的残渣进行通电处理从而回收纤维素酶成分的方法(专利文献3)等，但都没有根本性地解决课题。

[0004] 现有技术文献

[0005] 专利文献

[0006] 专利文献1:日本特开2006-87319号公报

[0007] 专利文献2:日本特开昭63-87994号公报

[0008] 专利文献3:日本特开2008-206484号公报

[0009] 发明要解决的课题

[0010] 本发明要解决的课题如上所述，在于削减纤维素的水解中使用的纤维素酶的使用量。

[0011] 用于解决课题的方法

[0012] 本发明者为了解决上述课题而进行了深入研究，结果着眼于在纤维素水解物中混合废糖蜜。其结果发现了提高纤维素水解物所含的纤维素酶的回收量，从而完成了本发明。

[0013] 即，本发明具有以下的[1]～[7]的构成。

[0014] [1]糖液的制造方法，包括以下的工序(1)～(3)，

[0015] 工序(1)：在纤维素前处理物中添加来源于丝状菌的纤维素酶，得到水解物的工序，

[0016] 工序(2)：在上述水解物中添加混合废糖蜜，得到混合糖液的工序，[0017] 工序(3)：将上述混合糖液进行固液分离，使所得的溶液成分通过超滤膜而进行过滤，作为非透过液回收来源于丝状菌的纤维素酶，作为透过液得到糖液的工序。

[0018] [2]根据[1]所述的糖液的制造方法，工序(1)的来源于丝状菌的纤维素酶是来源于木霉属的纤维素酶。

[0019] [3]根据[1]或[2]所述的糖液的制造方法，工序(1)的纤维素前处理物是选自水热处理、稀硫酸处理和碱处理中的1种以上的处理物。

[0020] [4]根据[1]～[3]的任一项所述的糖液的制造方法，在工序(2)中，在水解物中添加混合废糖蜜，将混合糖液的糖浓度调制在40～200g/L的范围。

[0021] [5]根据[1]～[4]的任一项所述的糖液的制造方法，在工序(2)中，包括将混合糖液在40～60℃的温度范围保温的工序。

[0022] [6]根据[1]～[5]的任一项所述的糖液的制造方法，包括：使工序(3)的糖液通过纳滤膜和/或反渗透膜而进行过滤，作为透过液除去发酵抑制物质，作为非透过液得到糖浓缩液的工序。

[0023] [7]化学品的制造方法，将具有以[1]～[6]的任一项所述的糖液的制造方法所得的糖液作为发酵原料而生产化学品的能力的微生物进行发酵培养。

[0024] 发明的效果

[0025] 根据本发明，通过提高由纤维素水解物回收来源于丝状菌的纤维素酶的酶回收率，从而可以削减在糖液的制造工序中使用的纤维素酶使用量。另外，在本发明中，通过在纤维素水解物中添加废糖蜜制成混合糖液，从而不仅可以从纤维素中回收糖成分，也可以从废糖蜜中回收糖成分。附图说明

[0026] 图1是本发明的工序概略流程图。

[0027] 图2是用于实施本发明的装置略图。

[0028] 图3是关于浓缩糖液的制造的装置略图。

[0029] 图4是以糖液和/或浓缩糖液作为发酵原料制造化学品的略图。

[0030] 图5是在现有制糖设备旁边建设包含图2的装置的糖液制造设备时的装置构成略图。

[0031] 关于用于实施本发明的方式，对每个工序详细地进行说明。

[0032] [工序(1)]

[0033] 工序(1)中的纤维素前处理物是指进行了用于水解含纤维素的生物质的前处理后的物质。作为含纤维素的生物质的具体例，指甘蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸、稻秸、麦秸等草本系生物质、或树木、废建材等木质系生物质，还指藻类、海草等来源于水生环境的生物质。这样的生物质，除了纤维素和半纤维素(以下作为纤维素与半纤维素的总称，称为“纤维素”)之外，还含有作为芳香族高分子的木质素等。特别是在本发明中，为了提高来源于丝状菌的纤维素酶的生物质水解效率，进行含纤维素的生物质的前处理，将其结果得到的物质称为纤维素前处理物。

[0034] 作为前处理，可列举酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、水热处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理、干燥处理，碱处理、水热处理或稀硫酸处理与其他方法相比，酶糖化效率优异、酶使用量较少即可完成，因而在本发明中优选水热处理、稀硫酸处理或碱处理。

[0035] 水热处理是添加水使得含纤维素的生物质为0.1～50重量％后，在100～400℃的温度处理1秒～60分钟。通过在这样的温度条件进行处理，可以得到易被纤维素酶水解的纤维素前处理物。对处理次数不特别限定，将该处理进行1次以上即可。特别是在将该处理进行2次以上的情况下，可以将第1次和第2次以后的处理在不同条件下实施。

[0036] 稀硫酸处理中硫酸的浓度优选为0.1～15重量％，更优选为0.5～5重量％。反应温度可以在100～300℃的范围内设定，优选在120～250℃设定。反应时间可以在1秒～60分钟的范围设定。对处理次数不特别限定，将上述处理进行1次以上即可。特别是在将上述处理进行2次以上的情况下，可以将第1次和第2次以后的处理在不同条件下实施。通过稀硫酸处理而得到的水解物包含酸，为了进一步进行利用纤维素酶的水解反应，或者为了作为发酵原料使用，需要进行中和。

[0037] 碱处理是对含纤维素的生物质作用选自氢氧化钠、氢氧化钙、氨中的碱的方法。作为碱处理中使用的碱，可以特别优选使用氨。这样的氨处理可以通过日本特开2008-161125号公报、日本特开2008-535664号公报所记载的方法中的手法来实施。例如，使用的氨浓度相对于含纤维素的生物质以0.1～15重量％的范围添加，在4～200℃、优选为90～150℃进行处理。添加的氨可以是液体状态、或气体状态的任一者。进而添加的方式可以是纯氨也可以是氨水溶液的方式。对处理次数不特别限定，将上述处理进行1次以上即可。特别是在将上述处理进行2次以上的情况下，第1次与第2次以后的处理可以在不同条件下实施。为了进一步进行利用酶的水解反应，通过氨处理所得的处理物需要进行氨的中和或氨的除去。中和可以对从水解物通过固液分离而除去固体成分后的氨进行，也可以在含有固体成分的状态下直接进行。对中和所使用的酸试剂不特别限定。氨的除去可以通过将氨处理物保持在减压状态下使氨以气体状态挥发而除去。另外除去的氨可以回收再利用。

[0038] 关于所述的纤维素前处理物，在工序(1)中，以通过纤维素酶进行水解而得到水解物为特征。纤维素的水解是指将纤维素低分子量化。另外，在纤维素的水解中，木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖等半纤维素成分也同时被水解。作为水解物所含的单糖成分，为葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖等，主要的单糖成分是作为纤维素的水解物的葡萄糖。另外在水解不充分的情况下，包含纤维二糖、木二糖等2糖、纤维寡糖、木寡糖等。

[0039] 在工序(1)中，用来源于丝状菌的纤维素酶来水解纤维素前处理物。来源于丝状菌的纤维素酶可例示木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、腐质霉属(Humicola)、枝顶孢霉属(Acremonium)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)、平革菌属(Phanerochaete)、白腐菌、褐腐菌等。在这样的来源于丝状菌的纤维素酶中，优选使用纤维素分解活性高的来源于木霉属的纤维素酶。

[0040] 来源于木霉属的纤维素酶是以来源于木霉属微生物的纤维素酶为主成分的酶组合物。对木霉属微生物不特别限定，优选为里氏木霉(Trichoderma reesei)，具体可以例示里氏木霉QM9414(Trichoderma reesei QM9414)、里氏木霉QM9123(Trichoderma reesei QM9123)、里 氏 木 霉RutC-30(Trichoderma reesei Rut C-30)、里 氏 木 霉PC3-7(Trichoderma reesei PC3-7)、里氏木霉CL-847(Trichoderma reeseiCL-847)、里氏木霉MCG77(Trichoderma reesei MCG77)、里氏木霉MCG80(Trichoderma reesei MCG80)、绿色木霉QM9123(Trichoderma viride9123)。另外，还可以是对来源于上述木霉属的微生物通过突变剂或紫外线照射等进行突变处理，从而纤维素酶生产性提高了的突变株。

[0041] 本发明中使用的来源于木霉属的纤维素酶，是包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶等多种酶成分的、具有将纤维素水解并糖化的活性的酶组合物。来源于木霉属的纤维素酶在纤维素分解中，通过多种酶成分的协同效果或互补效果，从而可以进行有效的纤维素的水解。特别是本发明中使用的纤维素酶优选包含来源于木霉属的纤维二糖水解酶和木聚糖酶。

[0042] 纤维二糖水解酶是以从纤维素的末端部分开始水解下去为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.91记载了归属于纤维二糖水解酶的酶群。

[0043] 内切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的中央部分开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.4、EC3.2.1.6、EC3.2.1.39、EC3.2.1.73记载了归属于内切葡聚糖酶的酶群。

[0044] 外切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的末端开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.74、EC3.2.1.58记载了归属于外切葡聚糖酶的酶群。

[0045] β-葡糖苷酶是以作用于纤维寡糖或纤维二糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.21记载了归属于β-葡糖苷酶的酶群。

[0046] 木聚糖酶是以作用于半纤维素或特别作用于木聚糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.8记载了归属于木聚糖酶的酶群。

[0047] 木糖苷酶是以作用于木寡糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.37记载了归属于木糖苷酶的酶群。

[0048] 作为来源于木霉属的纤维素酶，优选使用粗酶物。粗酶物来源于在为了使木霉属的微生物产生纤维素酶而调制的培养基中将该微生物培养任意时间而得的培养上清。对使用的培养基成分不特别限定，为了促进纤维素酶的产生，一般可以使用添加了纤维素的培养基。并且作为粗酶物，优选直接使用培养液，或使用仅除去了木霉属菌体的培养上清。

[0049] 对粗酶物中的各酶成分的重量比不特别限定，例如，来源于里氏木霉的培养液中含有50～95重量％的纤维二糖水解酶，其余成分包含内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶等。另外，木霉属的微生物在培养液中生产强的纤维素酶成分，另一方面关于β-葡糖苷酶，由于保持在细胞内或细胞表层，因而培养液中的β-葡糖苷酶活性低，因此可以在粗酶物中进一步添加异种或同种的β-葡糖苷酶。作为异种的β-葡糖苷酶，可以优选使用来源于曲霉属的β-葡糖苷酶。作为来源于曲霉属的β-葡糖苷酶，可以例示由ノボザイム社市售的Novozyme188等。作为在粗酶物中添加异种或同种的β-葡糖苷酶的方法，可以是培养以在木霉属的微生物导入基因使其在其培养液中产生β-葡糖苷酶的方式进行基因重组而得的木霉属的微生物，分离其培养液的方法。

[0050] 来源于丝状菌的纤维素酶的水解反应温度优选为15～100℃的范围，更优选为40～60℃，最优选为50℃。另外，水解反应时的pH值优选为pH值3～9的范围，更优选为pH值4～5.5，最优选为pH值5。pH值调节中可以以成为目的的pH值的方式添加酸或者碱进行调制。另外，还可以使用适宜缓冲液。

[0051] 此外，在纤维素前处理物的水解中，为了促进纤维素前处理物与丝状菌纤维素酶的接触，另外为了使水解物的糖浓度均匀，优选进行搅拌混合。纤维素前处理物的固体成分浓度更优选为1～25重量％的范围。特别在工序(1)中，优选将纤维素前处理物的固体物浓度设定在2～10重量％的范围的低浓度。这是为了确保用于稀释后段的工序(2)中的废糖蜜的充分的水量。另外，作为其他优点，通过将固体物浓度设定在2～10重量％的低浓度，从而具有纤维素前处理物的水解效率提高这样的效果。这是因为，来源于丝状菌的纤维素酶具有由于作为水解的生成物的葡萄糖、纤维二糖等糖生成物而酶反应被抑制这样的性质。

[0052] 对本发明的工序(1)所得的水解物的糖浓度不特别限定，作为单糖浓度优选为10～100g/L的范围，更优选为20～80g/L。因为如果是该糖浓度范围，则作为后段工序与废糖蜜混合时，可以调整至最适的糖浓度。

[0053] 在本发明中，以在所述工序(1)所得的水解物中添加混合废糖蜜为特征。废糖蜜(Morasess)是从作为制糖用作物的甘蔗、甜菜、糖用甜菜、甜菜、葡萄等的榨汁、或者将它们一次结晶化而得的粗糖的制糖过程中生成的副产物，是指制糖过程中的糖结晶化工序后所残留的包含糖成分的溶液。一般地，糖结晶化工序通常进行多次，像作为进行第1次结晶化而得的结晶成分的1号糖、作为进一步进行1号糖的残液(1号糖蜜)的结晶化而得的结晶成分的2号糖、作为进一步进行2号糖的残液(2号糖蜜)的结晶化而得的3号糖这样，反复进行结晶化，将作为其残液得到的最终阶段的糖蜜称为废糖蜜。作为废糖蜜所含的糖成分，包含蔗糖、葡萄糖、果糖作为主成分，有时还包含若干木糖、半乳糖等其他糖成分。另一方面，已知随着结晶化的次数变多，还具有除糖成分以外的来源于制糖作物的成分在废糖蜜中浓缩这样的特征，作为其结果，也含有较多发酵抑制物质。作为废糖蜜中所含的发酵抑制成分，可以例示乙酸、甲酸、羟基甲基糠醛、糠醛、香草醛、香草酮、愈创木酚、各种无机物(离子)等。但是，关于废糖蜜所含的糖和发酵抑制物质的成分或者量不特别限定。

[0054] 作为工序(2)中使用的废糖蜜，优选为经过多次结晶化次数后的糖蜜，具体地，是进行了优选至少2次以上、更优选3次以上结晶化后残余的废糖蜜。另外，优选使用糖浓度为200g/L以上的废糖蜜，更优选使用糖浓度为500g/L以上的废糖蜜。如果废糖蜜中的糖成分浓度低于200g/L，则来源于丝状菌的纤维素酶的回收性不提高，因而不优选。另一方面，对于工序(2)中使用的废糖蜜中的糖成分浓度的上限不特别限定，考虑通常的制糖工序中所得的废糖蜜的上限为800g/L。此外，废糖蜜中的糖浓度可以通过HPLC等的公知的测定方+法来定量。另外废糖蜜除了所述的糖之外，优选包含K离子。在本发明中可以优选使用包+
含K离子的浓度为1g/L以上、更优选为5g/L以上、最优选为10g/L以上的废糖蜜。

[0055] 对工序(1)的水解物添加混合废糖蜜，制成混合糖液。如果混合糖液的糖浓度过高则粘度变得过高，从而有时降低后段的超滤膜处理中的通量，因此混合糖液的糖浓度优选为200g/L以下，更优选为150g/L以下。另一方面，如果混合糖液的糖浓度低于40g/L，则有时最终得到的糖液浓度变低，因此混合糖液的糖浓度优选为40g/L以上，更优选为50g/L以上。即，混合糖液的糖浓度优选以40～200g/L的范围、更优选以50～150g/L的范围混合。另外混合糖液也可以是室温(25℃)，但优选在40～60℃的温度范围保温，进一步优选在50℃的温度范围保温。通过这样，后段能够通过超滤膜回收的酶量增大，因此优选。

[0056] 在使用废糖蜜作为发酵原料的情况下，根据发酵中使用的微生物的种类，存在利用作为废糖蜜的主要糖分的蔗糖作为碳源的效率低的微生物，将这样的微生物用于化学品等的制造中时，优选使用预先将废糖蜜中所含的蔗糖水解成葡萄糖和果糖而得的产物。作为废糖蜜的水解处理，可以在酸性或碱性条件下进行加热处理。另外，还可以进行利用转化酶和/或蔗糖酶的酶处理。转化酶别名称为β-呋喃果糖苷酶，是指将蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。蔗糖酶也是指将蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。在本发明中，关于使用的转化酶不特别限定，来源于酵母的转化酶由日本バイオコン株式会社、三菱化学フーズ株式会社售卖，可以购买使用它们。转化酶处理的处理条件只要是通常有效的作用条件即可。对于使用的蔗糖酶也不特别限定，由和光纯药工业(株)、三菱化学フーズ(株)售卖，可以购买使用它们。蔗糖酶处理条件可以采用通常有效的反应条件。所述的转化酶或者蔗糖酶处理可以单独在废糖蜜中预先添加而实施，也可以在工序(1)的水解物中添加废糖蜜制成混合糖液后实施。如前所述制成混合糖液后，通过在40～60℃的温度范围保温，从而回收酶量增大，因而如果此时添加好转化酶或者蔗糖酶，则还可以实施蔗糖的水解反应。

[0057] [工序(3)]

[0058] 在工序(3)中，首先，将工序(2)所得的混合糖液进行固液分离而回收溶液成分。固液分离可以通过旋转沉降器等离心分离法、加压·吸引过滤等的过滤法、或者精滤等膜过滤法这样的公知的固液分离方法来实施。这样的固液分离可以1种以上的多种方法组合实施，只要是有效地除去固体物的方法就不限定。但是，从抑制后段超滤膜的结垢这样的观点考虑，优选固液分离后的溶液成分中尽量不含有固体物，具体地，优选在通过离心分离法或压滤器等的过滤法进行第1次固液分离后，将所得的溶液成分进一步通过精滤膜进行膜过滤，完全地除去固体物。精滤膜也称为膜过滤，是以压力差作为驱动力，能够从微粒悬浮液中分离除去0.01～10μm左右的粒子的分离膜。精滤膜的表面具有0.01～10μm的范围的细孔，该细孔以上的微粒成分可以在膜侧分离除去。精滤膜的材质可以例示乙酸纤维素、芳香族聚酰胺、聚乙烯醇、聚砜、聚偏1,1-二氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯腈、陶瓷、聚丙烯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(テフロン(注册商标))等，但不特别限定，从耐污性、耐化学性、强度、过滤性等观点考虑，优选为聚偏1,1-二氟乙烯制的精滤膜。

[0059] 接着，将溶液成分进行超滤膜处理。超滤膜一般是指细孔径在1.5纳米至250纳米的范围，可以将分子量1,000～200,000的范围的水溶性高分子作为非透过液阻止的分离膜。超滤膜只要是能够回收来源于丝状菌的纤维素酶的分级分子量即可，优选的分级分子量为1,000～100,000Da、更优选为10,000～30,000Da。作为超滤膜的材料，可以使用聚醚砜(PES)、聚1,1-二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素等材料的膜，但纤维素受到来源于丝状菌的纤维素酶的分解，因而优选使用以PES、PVDF等合成高分子为材料的超滤膜。超滤膜形状可以优选使用管状式、螺旋元件、平膜等。超滤膜的过滤可以列举错流方式、死端过滤方式，在结垢或者通量的方面优选错流过滤方式。

[0060] 使溶液成分通过超滤膜而进行过滤，从而可以作为透过液得到糖液。所得的糖液是混合糖液中本来含有的固体物通过固液分离基本完全被除去而得的液体。另一方面，通过超滤膜进行过滤处理，从而在非透过液侧，混合糖液中的着色物质、水溶性高分子被除去，但水溶性高分子中包含在工序(1)中使用的来源于丝状菌的纤维素酶成分。对回收的来源于丝状菌的纤维素酶成分不特别限定，但在用于水解的来源于丝状菌的纤维素酶成分中，其全部成分或者一部分成分可以作为非透过液回收。此外，非透过液中还包含来源于混合糖液的糖成分，因此为了回收这样的糖成分，可以重复在非透过液加水、进一步通过超滤膜进行过滤的操作。

[0061] 作为工序(3)的结果，看到了与现有技术相比回收酶所含的来源于丝状菌的纤维素酶酶量显著增大的效果，特别是在来源于丝状菌的纤维素酶成分中，纤维二糖水解酶和木聚糖酶以高效率被回收。被回收的来源于丝状菌的纤维素酶通过在纤维素前处理物的水解中再利用，从而可以削减来源于丝状菌的纤维素酶的使用量。被回收的来源于丝状菌的纤维素酶可以单独在水解中再利用，另外也可以与未使用的来源于丝状菌的纤维素酶混合而再利用。另外，根据情况不同，也可以在纤维素的水解以外的用途中有效灵活利用。

[0062] [糖浓缩工序]

[0063] 工序(3)所得的糖液，可以进一步通过作为WO2010/067785号所记载的方法，即使其通过纳滤膜和/或反渗透膜进行过滤，从而可以作为非透过液得到糖成分被浓缩的浓缩糖液。

[0064] 纳滤膜也称为纳米过滤膜(nanofilter，NF膜)，是一般被定义为“一价离子透过、阻止二价离子的膜”的膜。是考虑具有数纳米左右的微小空隙的膜，主要用于阻止水中的微小粒子和/或分子、离子、盐类等。

[0065] 反渗透膜也被称为RO膜，是一般被定义为“具有包含一价离子的脱盐功能的膜”的膜。是考虑具有数埃至数纳米左右的超微小空隙的膜，主要用于海水淡水化、超纯水制造等离子成分除去。

[0066] 本发明中使用的纳滤膜或者反渗透膜的材料可以使用乙酸纤维素系聚合物、聚酰胺、聚酯、聚酰亚胺、乙烯基聚合物、聚砜等高分子材料，但不限于由上述1种材料构成的膜，也可以是包含多种膜材料的膜。

[0067] 本发明中使用的纳滤膜优选使用螺旋型的膜元件。作为优选的纳滤膜元件的具体例，可列举例如，作为乙酸纤维素系的纳滤膜元件的GE Osmonics社制GEsepa、以聚酰胺为功能层的アルファラバル社制纳滤膜元件NF99或NF99HF、以交联哌嗪聚酰胺为功能层的フィルムテック社制纳滤膜元件NF-45、NF-90、NF-200、NF-270或NF-400、或者包含以交联哌嗪聚酰胺为主成分的东レ株式会社制纳滤膜UTC60的东レ株式会社制纳滤膜元件SU-210、SU-220、SU-600或SU-610，更优选NF99或NF99HF、NF-45、NF-90、NF-200或NF-400、或者SU-210、SU-220、SU-600或SU-610，进一步优选SU-210、SU-220、SU-600或SU-610。

[0068] 作为本发明中使用的反渗透膜的材料，可列举以乙酸纤维素系的聚合物为功能层的复合膜(以下也称为乙酸纤维素系的反渗透膜)或以聚酰胺为功能层的复合膜(以下也称为聚酰胺系的反渗透膜)。这里，作为乙酸纤维素系的聚合物，可列举使用单独的乙酸纤维素、二乙酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸纤维素等纤维素的有机酸酯或它们的混合物以及混合酯而得的。作为聚酰胺，可列举以脂肪族和/或芳香族的二胺为单体的线状聚合物或交联聚合物。

[0069] 作为本发明中使用的反渗透膜的具体例，可列举例如，作为东レ株式会社制聚酰胺系反渗透膜组件的超低压型的SUL-G10、SUL-G20、低压型的SU-710、SU-720、SU-720F、SU-710L、SU-720L、SU-720LF、SU-720R、SU-710P、SU-720P，以及作为反渗透膜包含UTC80的高压型的SU-810、SU-820、SU-820L、SU-820FA、东レ株式会社乙酸纤维素系反渗透膜SC-L100R、SC-L200R、SC-1100、SC-1200、SC-2100、SC-2200、SC-3100、SC-3200、SC-8100、SC-8200、日东电工株式会社制NTR-759HR、NTR-729HF、NTR-70SWC、ES10-D、ES20-D、ES20-U、ES15-D、ES15-U、LF10-D、アルファラバル制RO98pHt、RO99、HR98PP、CE4040C-30D、GE制GE Sepa、Filmtec 制 BW30-4040、TW30-4040、XLE-4040、LP-4040、LE-4040、SW30-4040、SW30HRLE-4040、KOCH制TFC-HR、TFC-ULP、TRISEP制ACM-1、ACM-2、ACM-4等。

[0070] 作为使用纳滤膜和/或反渗透膜浓缩糖液的效果，具有在提高糖液中的糖浓度的同时，能够作为透过液除去发酵抑制物质这样的优点。这里所说的发酵抑制物质，是指在后段发酵工序中抑制发酵的除糖以外的成分，具体可以例示芳香族化合物、呋喃系化合物、有机酸、1价无机盐等。作为这样的代表性芳香族化合物和呋喃系化合物的例子，可以例示糠醛、羟基甲基糠醛、香草醛、香草酸、丁香酸、松柏醛、香豆酸、阿魏酸等。作为有机酸、无机盐，可以例示乙酸、甲酸、钾、钠等。浓缩糖液的糖浓度可以根据纳滤膜和/或反渗透膜的处理条件在0g/L～400g/L的范围任意设定，根据浓缩糖液的用途等任意设定即可。另外想进一步除去所述的发酵抑制物质的情况下，对糖液或者浓缩糖液加水，用纳滤膜和/或反渗透膜浓缩至目的的糖浓度即可，此时，可以作为透过液除去发酵抑制物质。

[0071] 此外，与反渗透膜相比，在使用纳滤膜的情况下发酵抑制物质的除去效果高，因而优选。使用纳滤膜还是使用反渗透膜，可以根据混合糖液所含的发酵抑制物质的浓度、或者后段发酵中的影响来选择。

[0072] 另外可以将所述的浓缩糖液进一步通过真空式蒸发罐、多重效用罐、冻结干燥、喷雾干燥、热风干燥等进一步浓缩。

[0073] [糖液·浓缩糖液]

[0074] 通过本发明得到的糖液和/或浓缩糖液可以在食用、甜味料、饲料用途、发酵原料等用途中使用。

[0075] [化学品制造工序]

[0076] 通过以本发明所得的糖液和/或浓缩糖液作为发酵原料使具有生产化学品的能力的微生物生长，从而制造各种化学品。这里所说的作为发酵原料使微生物生长，是指利用糖液中所含的糖成分或者氨基源作为微生物的营养素，进行微生物的增殖、生长维持。作为化学品的具体例，可列举醇、有机酸、氨基酸、核酸等在发酵工业中大量生产的物质。这样的化学品以糖液中的糖成分作为碳源，在其代谢过程中向生物体内外作为化学品蓄积生产。作为可以由微生物生产的化学品的具体例，可列举乙醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、丙三醇等醇、乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸等有机酸、肌苷、鸟苷等核苷、肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸、尸胺等胺化合物。进而，本发明的糖液还可以在酶、抗生素、重组蛋白质等的生产中应用。关于在这样的化学品的制造中使用的微生物，只要是能够有效地生产目的化学品的微生物即可，可以使用大肠杆菌、酵母、丝状菌、担子菌等微生物。

[0077] 在将本发明的糖液和/或浓缩糖液在用于化学品制造的发酵原料中使用的情况下，可以根据需要适宜含有氮源、无机盐类、和根据需要的氨基酸、维生素等有机微量营养素。进而根据情况，除了木糖之外，还可以补加葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖类、含有这些糖类的淀粉糖化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高级糖蜜、或者乙酸等有机酸、或者乙醇等醇类、甘油等作为碳源，从而作为发酵原料使用。作为氮源，可使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其他辅助使用的有机氮源、例如油粕类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其他氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉提取物、胨等肽类、各种发酵菌体及其水解物等。作为无机盐类，可以适宜添加磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。

[0078] 微生物的培养方法可以利用分批培养、补料分批培养、连续培养等公知的发酵培养方法。特别是本发明的糖液和/或浓缩糖液具有通过超滤膜等而固体物被完全除去这样的特征，可以将发酵中使用的微生物通过离心分离、膜分离等方法分离回收，进行再利用。这样的微生物的分离回收和再利用可以在培养期间一边添加新的糖液和/或浓缩糖液一边连续地分离回收微生物，另外，也可以在培养结束后分离回收微生物，在下一批的培养中再利用。

[0079] [糖液制造装置构成]

[0080] 接下来关于本发明的糖液的制造方法，对于使用的装置，使用略图进行说明。

[0081] 图1是本发明的工序概略流程图，详细如前所述。

[0082] 图2是实施本发明的装置略图。纤维素前处理物和来源于丝状菌的纤维素酶被加入水解反应槽(2)，在这里进行水解。为了有效地进行水解，优选水解槽(2)具备保温装置(1)和混合装置(3)。水解结束后，对水解反应槽(2)添加废糖蜜。考虑到操作的容易性，添加的废糖蜜可以是事先稀释过的。将废糖蜜添加到水解物中之后，优选使用混合装置(3)进行混合。另外，为了提高来源于丝状菌的纤维素酶的回收效率，可以使用保温装置(1)将水解槽温度保持在40～60℃的范围。接着，将水解槽(2)中调制的混合糖液使用送液泵(4)等移液手段加入到固液分离装置(5)中。固液分离装置(5)可以使用离心分离、压滤机、螺旋压榨机、转鼓过滤机、带式过滤机等公知的固液分离装置。优选为使用分离膜的过滤法。使用固液分离装置(5)，所得的溶液成分可以进一步使用精滤膜装置(6)进行过滤。这样作为固液分离工序，通过固液分离装置(5)和精滤膜装置(6)而得的溶液成分被回收至溶液回收槽(7)。溶液回收槽(7)通过超滤膜泵(8)与超滤膜(9)连接，在这里分离成来源于丝状菌的纤维素酶和糖液。超滤膜(9)可以优选使用被加工成螺旋组件等组件状的。
超滤膜(9)所分离的来源于丝状菌的纤维素酶作为非透过液通过溶液回收槽(7)而被回收。另一方面，超滤膜(9)的透过液可以作为糖液回收，在化学品制造等中使用。

[0083] 图3是进一步浓缩本发明的糖液的装置略图。本发明的糖液被保持于糖液回收槽(10)，通过高压泵(11)与纳滤膜和/或反渗透膜(12)连接。本发明的糖成分作为纳滤膜和/或反渗透膜(12)的非透过液被回收，在糖液回收槽(10)中作为浓缩糖液被回收。另外，作为纳滤膜和/或反渗透膜(12)的透过液，发酵抑制物质和剩余水一起被除去。

[0084] 图4是使用本发明的糖液和/或浓缩糖液制造化学品的装置略图。本发明的糖液和/或浓缩糖液被加入具备搅拌装置(15)和保温装置(13)的发酵槽(14)中。可以在微生物被加入发酵槽，通过生长而制造化学品的同时，在培养结束时或者培养过程中通过微生物分离装置(16)而分离微生物和包含化学品的培养液。通过微生物分离装置(16)而分离的微生物被回收至发酵槽(14)。

[0085] 图5是在现有制糖设备旁边建设包含本发明的糖液制造装置的糖液设备时的装置构成略图。作为现有制糖设备，是显示作为制糖原料使用甘蔗时的实施方式的一例的图。制糖设备中包含用于切断甘蔗的撕碎机(切断工序)(17)、用于榨汁甘蔗汁的压榨机(榨汁工序)(18)、储存甘蔗汁的汁罐(19)、浓缩甘蔗汁的效用罐(多重效用罐)(浓缩工序)(20)、使浓缩液所含的糖结晶化的晶析装置(结晶化工序)(21)、分离结晶化后的原料糖的分离装置(22)。本发明中使用的废糖蜜从晶析装置(21)或者分离装置(22)排出。由压榨机(18)排出的甘蔗渣通过输运机等输送装置(23)被输送至糖液设备。甘蔗渣在前处理工序的前阶段被粉碎机(24)粉碎。粉碎机可以使用涂料研磨机、绞磨机、锤磨机等，另外还可以是多种的组合。被粉碎的甘蔗渣用至少具有加热功能的加热装置(25)进行前处理(前处理工序)。前处理如前所述，可以添加酸、碱、稀硫酸、氨、苛性钠等。纤维素前处理物通过所述的图2的装置进行利用来源于丝状菌的纤维素酶的水解(工序1)。然后，将从制糖设备排出的废糖蜜(Molasses)添加到工序(1)的水解物中。废糖蜜用输送线(26)连接至图
2的装置即可。可以在图2的装置之后加入用于糖浓缩的图3的装置。另外，如前所述，本发明的糖液可以在食用、饲料用途、发酵原料等中使用。

[0086] 实施例

[0087] 以下，列举实施例具体地说明本发明。但是，本发明不限于这些。

[0088] (参考例1)纤维素前处理物的调制(水热处理)

[0089] 作为含纤维素的生物质使用甘蔗渣。将上述含纤维素的生物质浸渍在水中，一边搅拌一边在180℃进行20分钟高压釜处理(日东高压株式会社制)。处理后使用离心分离(3000G)进行固液分离为溶液成分和纤维素前处理物。将所得的纤维素前处理物在以下实施例中使用。

[0090] (参考例2)糖浓度的测定

[0091] 糖液中所含的蔗糖、葡萄糖和木糖浓度在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。

[0092] 柱：Luna NH2(Phenomenex社制)

[0093] 移动相：Milli-Q:乙腈＝25:75(流速0.6mL/分钟)

[0094] 反应液：无

[0095] 检测方法：RI(差示折射率)

[0096] 温度：30℃。

[0097] (参考例3)发酵抑制物质的分析

[0098] 芳香族化合物、呋喃系化合物在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。此外各分析样品以3500G进行10分钟离心分离，将其上清成分供于下述分析。

[0099] 柱：Synergi HidroRP4.6mm×250mm(Phenomenex制)

[0100] 移动相：乙腈-0.1％H3PO4(流速1.0mL/分钟)

[0101] 检测方法：UV(283nm)

[0102] 温度：40℃

[0103] 乙酸、甲酸在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。此外各分析样品以3500G进行10分钟离心分离，将其上清成分供于下述分析。

[0104] 柱：Shim-Pack和Shim-Pack SCR101H(株式会社岛津制作所制)的串联[0105] 移动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)

[0106] 反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分钟)[0107] 检测方法：电导率

[0108] 温度：45℃。

[0109] (参考例4)来源于木霉属的纤维素酶的调制

[0110] 来源于木霉属的纤维素酶通过以下的方法调制。

[0111] [前培养]

[0112] 以玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加至蒸馏水中，将100mL加入500mL带挡板的三角烧瓶中，在121℃高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加与其分别在121℃高压釜灭菌15分钟的PE-M和Tween80各0.01％(w/vol)。在该前培养培养基中接种里氏木霉5
PC3-7使其为1×10个/mL，以28℃、72小时、180转/分钟振荡培养，作为前培养(振荡装置：TAITEC社制BIO-SHAKER BR-40LF)。

[0113] [主培养]

[0114] 以玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、纤维素(艾维素)10％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14％(w/vol)、磷酸二氢钾0.2%(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加至蒸馏水中，将2.5L加入5L容量的搅拌广口瓶(ABLE社制DPC-2A)容器中，在121℃高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加与其分别在121℃高压釜灭菌15分钟的PE-M和Tween80各0.1％，接种250mL预先通过上述的方法在液体培养基中进行了前培养的里氏木霉PC3-7。然后，以28℃、87小时、300转/分钟、通气量1vvm进行培养，离心分离后，将上清进行膜过滤(Millipore公司制ステリカップ-GV材质：PVDF)。对以该上述条件制备的培养液，将β-葡糖苷酶(Novozyme188)作为蛋白质重量比添加1/100量，将所得产物作为来源于木霉属的纤维素酶在以下实施例中使用。

[0115] (参考例5)来源于丝状菌的纤维素酶的回收酶量的测定方法

[0116] 关于能够在工序(3)中回收的来源于丝状菌的纤维素酶的回收酶量，通过测定1)结晶纤维素分解活性、2)纤维二糖分解活性、3)木聚糖分解活性的3种分解活性(以下称为活性值)来定量。

[0117] 1)结晶纤维素分解活性

[0118] 针对酶液(在规定条件下调制)，添加作为结晶纤维素的艾维素(Avicel)(Merch社制、Cellulose Microcrystalline)至1g/L、乙酸钠缓冲液(pH值5.0)至100mM，在50℃反应24小时。反应液用1mL管调制，一边在上述条件下进行旋转混和一边进行反应。反应后，将管进行离心分离，测定其上清成分的葡萄糖浓度。葡萄糖浓度依据参考例2所记载的方法进行测定。结晶纤维素分解活性使用生成的葡萄糖浓度(g/L)直接作为活性量，在回收酶量的比较中使用。

[0119] 2)纤维二糖分解活性

[0120] 对酶液，添加纤维二糖(和光纯药)至500mg/L，乙酸钠缓冲液(pH值5.0)至100mM，在50℃反应0.5小时。反应液在1mL管中调制，在上述条件下一边旋转混和一边进行反应。反应后，将管进行离心分离，测定其上清成分的葡萄糖浓度。葡萄糖浓度依据参考例2所记载的方法进行测定。纤维二糖分解活性使用生成的葡萄糖浓度(g/L)直接作为活性量，在回收酶量的比较中使用。

[0121] 3)木聚糖分解活性

[0122] 对酶液，添加木聚糖(Birch wood xylan、和光纯药)至10g/L，乙酸钠缓冲液(pH值5.0)至100mM，在50℃反应4小时。反应液在1mL管中调制，在上述条件下一边旋转混和一边进行反应。反应后，将管进行离心分离，测定其上清成分的木糖浓度。木糖浓度依据参考例2所记载的方法进行测定。木糖分解活性使用生成的木糖浓度(g/L)直接作为活性量，在回收酶量的比较中使用。

[0123] (参考例6)无机离子浓度的测定

[0124] 糖液所含的阳离子和阴离子浓度在下述所示的HPLC条件下通过与标准品的比较来定量。

[0125] 1)阳离子分析

[0126] 柱：Ion Pac AS22(DIONEX社制)

[0127] 移动相：4.5mM Na2CO3/1.4mM NaHCO3(流速1.0mL/分钟)

[0128] 反应液：无

[0129] 检测方法：电导率(使用抑制器)

[0130] 温度：30℃

[0131] 2)阴离子分析

[0132] 柱：Ion Pac CS12A(DIONEX社制)

[0133] 移动相：20mM甲磺酸(流速1.0mL/分钟)

[0134] 反应液：无

[0135] 检测方法：电导率(使用抑制器)

[0136] 温度：30℃

[0137] (参考例7)废糖蜜的成分分析

[0138] 作为废糖蜜，使用“废糖蜜(Molasses Agri)”(制造商：オーガニックランド株式会社)。本废糖蜜的原料是来源于甘蔗的粗糖。废糖蜜的糖成分、有机酸、芳香族·呋喃系化合物、无机离子的分析结果示于表1～表4。另外关于上述各成分，将各成分分别累计的浓度示于表5。此外各成分的分析按照参考例2、参考例3、参考例6实施。

[0139] [表1]

[0140] 糖成分

[0141]成分名 葡萄糖 木糖 蔗糖 果糖
浓度(g/L) 148 6 371 164

[0142] [表2]

[0143] 有机酸成分

[0144]成分名 乙酸 甲酸
浓度(g/L) 0.3 0

[0145] [表3]

[0146] 芳香族·呋喃系化合物

[0147]

[0148] [表4]

[0149] 无机离子

[0150]成分名 K+离子 Mg2+离子 Ca2+离子 Na+离子
浓度(g/L) 11.8 0.71 1.3 0.67
成分名 NH4－离子 Cl－离子 PO4－离子 SO4－2离子
浓度(g/L) 0.21 0.2 0 0.23

[0151] [表5]

[0152] 各成分分别累计浓度

[0153]成分名 糖 有机酸 芳香族·呋喃系化合物 无机离子
浓度(g/L) 689 3.3 0.5 15

[0154] (参考例8)乙醇浓度分析

[0155] 乙醇蓄积浓度的测定中通过气相色谱法来定量。使用Shimadzu GC-2010毛细管GC TC-1(GL science)15meter L.＊0.53mm I.D.，df1.5μm，通过氢火焰离子化检测器来检测、计算从而进行评价。

[0156] (比较例1)不在水解物中添加混合废糖蜜的糖液制造

[0157] 工序(1)：

[0158] 在参考例1所调制的纤维素前处理物(0.5g)中加入蒸馏水，添加参考例4所调制的来源于木霉属的纤维素酶0.5mL，进一步添加蒸馏水使得总重量为10g。进一步用稀释硫酸或者稀释苛性钠调整使得本组合物的pH值为4.5～5.3的范围。将调节了pH值的本组合物移至带分枝试管中(东京理化器械株式会社制 30NS14/23、小型机械搅拌机CPS-1000、转换适配器、带三向龙头的添加口、保温装置MG-2200)，在50℃保温并搅拌24小时，得到水解物。

[0159] 工序(2)：

[0160] 由于比较例而未实施。

[0161] 工序(3)：

[0162] 将工序(1)所得的水解物通过离心分离(3000G、10分钟)进行固液分离，分离成溶液成分(6mL)和固体物。另外，溶液成分进一步使用Millex-HV Filter Unit(33mm、PVDF制、细孔径0.45μm)进行过滤。所得的溶液成分的糖浓度(葡萄糖和木糖浓度)通过参考例2记载的方法测定。将测定的糖浓度示于表6。所得的溶液成分用分级分子量10000的超滤膜(Sartorius stedim biotech社制VIVASPIN20材质：PES)进行过滤，以4500G离心至膜级分为1mL。将蒸馏水10mL添加到膜级分中，再次以4500G离心至膜级分为1mL。将该操作再次进行后，将回收酶液从膜级分进行回收。回收酶量依据参考例5通过测定各活性值来定量。此外，将本比较例1所测定的活性值作为“1(基准)”，为了后述比较例2和实施例1的回收酶量的比较而使用(表7)。

[0163] (比较例2)在水解物中添加试剂糖液的糖液制造

[0164] 工序(1)：

[0165] 通过与比较例1的工序(1)相同的步骤实施。

[0166] 工序(2)：

[0167] 将不是废糖蜜的试剂糖液添加混合到工序(1)的水解物中。试剂糖液调制成与参考例7所记载的废糖蜜相同的糖浓度。即，试剂糖液将葡萄糖148g、果糖163g、蔗糖371g完全溶解在RO水1L中而调制，作为试剂糖液。将这样得到的试剂糖液0.5mL添加到工序(1)的水解物中。添加后，室温(25℃)混合5分钟左右至均匀后，将此作为混合糖液。

[0168] 工序(3)：

[0169] 使用工序(2)所得的混合糖液，通过与比较例1的工序(3)相同的步骤进行固液分离和超滤膜处理。所得的糖浓度示于表6。另外将测定的活性值除以比较例1的活性值而得的值作为比较例2的回收酶量而示于表7。

[0170] (实施例1)在纤维素水解物中添加混合废糖蜜的糖液的制造方法

[0171] 工序(1)：

[0172] 通过与比较例1的工序(1)相同的步骤实施。

[0173] 工序(2)：

[0174] 对工序(1)所得的水解物(10mL)添加废糖蜜(参考例7：糖浓度689g/L)0.5g。添加后，在室温(25℃)混合5分钟左右至均匀后，将此作为混合糖液。

[0175] 工序(3)：

[0176] 使用工序(2)所得的混合糖液，通过与比较例1的工序(3)相同的步骤进行固液分离和超滤膜处理。将所得的糖浓度示于表6。另外将测定的活性值除以比较例1的活性值而得的值作为实施例1的回收酶量示于表7。

[0177] 将比较例1、比较例2、实施例1进行比较，结果在实施例1中，与比较例1相比回收酶量增大，因而提示废糖蜜成分中含有使回收酶量增加的成分。另外比较例2的回收酶量与比较例1基本为相同程度，因而提示废糖蜜所含的糖成分(蔗糖、葡萄糖、果糖)不会影响回收酶量，除此以外的成分与酶回收增加相关。

[0178] 【表6】

[0179] 糖浓度

[0180]

[0181] 【表7】

[0182] 回收酶量(相对值)

[0183]

[0184] (实施例2)废糖蜜的添加量和回收酶量的关系

[0185] 在实施例1的工序(2)中，比较分别添加废糖蜜的添加量0.1g(实施例1)、0.5g、1g、2g、5g时，能够回收的来源于丝状菌的纤维素酶的回收酶量。将由各实验区的回收酶的活性值除以比较例1的活性值而得的值作为回收酶量(相对值)示于表8。其结果判明了，随着废糖蜜的添加量增大，回收酶量、特别是与结晶纤维素分解活性相关的酶量增大。

[0186] 【表8】

[0187] 废糖蜜添加量与回收酶量(相对值)的关系

[0188]

[0189] (比较例3)试剂糖添加量和回收酶量的关系

[0190] 在比较例2的工序(2)中，将试剂糖液的添加量设定为0.1g(比较例2)、0.5g、1g、2g、5g，将添加这些量时回收的来源于丝状菌的纤维素酶的酶量进行比较，如表9所示，与实施例2的结果不同，判明了即使试剂糖的添加量增加，回收酶量也均不增大。即，判明了废糖蜜所含的除糖以外的成分与回收酶量的增大相关。

[0191] 【表9】

[0192] 试剂糖添加量与回收酶量的关系

[0193]

[0194] (实施例3)混合糖液的保温温度与回收酶量的关系

[0195] 在实施例1的工序(2)中，添加废糖蜜的添加量0.5g制成混合糖液后，将保温的温度设定为25℃(实施例1)、40℃、50℃、60℃、70℃，通过测定回收酶的活性值来比较各实验区的回收酶量(表10)。其结果判明了，通过将混合糖液在40～60℃的温度范围保温，回收酶量进一步增大。

[0196] 【表10】

[0197] 混合糖液的保温温度与回收酶量的关系

[0198]

[0199] (实施例4)使用纳滤膜或反渗透膜得到浓缩糖液的工序

[0200] [糖液的调制]

[0201] 在以下条件下调制糖液(1L)。

[0202] 工序(1)：

[0203] 在参考例1所得的纤维素前处理物(400g)中添加来源于木霉属的纤维素酶4g，并添加蒸馏水至总重量为8kg。进而用稀释苛性钠调制使得本组合物的pH值为4.5～5.3的范围。在将该液以液温保持45～50℃的方式进行保温的同时，并且添加稀释硫酸、稀释苛性钠使得pH值保持4.5～5.3的范围保温24小时，得到水解物8kg。

[0204] 工序(2)：

[0205] 在工序(1)所得的水解物8kg中添加废糖蜜0.4kg。添加后，混合5分钟至均匀后，将此作为混合糖液。

[0206] 工序(3)：

[0207] 将工序(2)所得的混合糖液进行固液分离和超滤膜处理。固液分离使用小型压滤器装置(薮田产业株式会社制压滤器MO-4)进行。滤布使用聚酯制机织布(薮田产业株式会社制T2731C)。将混合糖液8L加入小型罐中一边从下部用压缩空气进行曝气一边打开液加入口用空气泵(タイヨーインタナショナル制66053-3EB)缓缓向过滤室内加入浆液。接着使安设在过滤室中的隔膜片膨胀而进行压榨工序。缓缓使压榨压力上升，从上升至0.5MPa开始放置约30分钟，作为滤液回收溶液成分。所得的溶液成分的总量为6L。残存的液成分由于装置死体积而损失。接着将固液分离的溶液成分使用精滤膜进行过滤。精滤使用ステリカップHV1000mL(ミリポア社制、PVDF、平均细孔径0.45μm)来实施，得到5L的滤液。所得的滤液(溶液成分)使用设有分级分子量10000的超滤膜(GE制SEPA PW系列功能面材质：聚醚砜)平膜的小型平膜过滤装置(GE制Sepa(注册商标)CF II Med/High Foulant System)来实施。一边控制操作压力使得原水侧流速恒定为2.5L/分钟、膜通量恒定为0.1m/D，一边过滤5L中的4L，得到糖液。

[0208] [糖液的纳滤膜或反渗透膜处理]

[0209] 使用上述工序(1)～(3)中制造的糖液1L实施纳滤膜浓缩或反渗透膜浓缩。纳滤膜使用“DESAL-5L”(デザリネーション社制)，反渗透膜使用交联全芳香族系反渗透膜“UTC80”(东レ株式会社制)，将各个膜安设在小型平膜过滤装置(GE制“Sepa”(注册商标)CF II Med/High Foulant System)中，以原水温度为25℃、高压泵的压力为3MPa进行过滤处理。通过该处理，得到0.5L的纳滤膜浓缩液浓缩液和0.5L的透过液(2倍浓缩)。将使用纳滤膜得到的浓缩糖液示于表11，将使用反渗透膜得到的浓缩糖液示于表12。如表
11和表12所示，判明了虽然糖成分的浓缩可以用纳滤膜、反渗透膜的一种膜来实施，但在用纳滤膜进行浓缩的情况下，能够除去作为发酵抑制物质的HMF、糠醛、乙酸、钾离子等的效果高。

[0210] 【表11】

[0211] 利用纳滤膜的浓缩糖液

[0212]

[0213] 【表12】

[0214] 利用反渗透膜的浓缩糖液

[0215]

[0216] (实施例5)以糖液为发酵原料的乙醇发酵试验

[0217] 使用实施例4的糖液调制工序(实施工序(1)～(3))中得到的糖液，使用酵母(酿酒酵母(Saccharomycecs cerevisiae)OC-2：红酒酵母)进行乙醇发酵试验。为了比较，将进行实施例4的糖液调制工序中的工序(1)～(2)而得的混合糖液也作为发酵原料使用。将所述酵母在YPD培养基(2％葡萄糖、1％酵母提取物(Bacto Yeast Extract/BD社)、2％多聚蛋白胨(日本制药株式会社制)中、在25℃进行前培养1天。接着，将所得的培养液对糖液和混合糖液(糖浓度57g/L)添加至1％(20mL)。添加微生物后，在25℃孵育2天。将该操作所得的培养液通过参考例8的步骤分析乙醇蓄积浓度。如表13所示，判明了在仅混合了纤维素水解物和废糖蜜的混合糖液的状态下，乙醇蓄积浓度低。预想这是由于，本来应在工序(3)中被除去的物质作为发酵抑制原因而发挥作用。

[0218] 【表13】

[0219] 乙醇发酵试验

[0220]发酵原料 乙醇蓄积浓度(g/L)
混合糖液：实施至工序(1)～(2) 9g/L
糖液:实施至工序(3) 13g/L

[0221] (实施例6)以浓缩糖液为发酵原料的乙醇发酵试验

[0222] 通过与实施例5相同的步骤，使用将实施例4所得的利用纳滤膜的浓缩糖液和利用反渗透膜的浓缩糖液用RO水稀释2倍而得的物质作为发酵培养基。其结果如表14所示，判明了任一浓缩糖液均取得了超越实施例5的发酵成绩，特别是利用纳滤膜的浓缩糖液作为发酵培养基优异。

[0223] 【表14】

[0224] 乙醇发酵试验

[0225]发酵原料 乙醇蓄积浓度(g/L)
纳滤膜浓缩糖液 19g/L
反渗透膜浓缩糖液 15g/L

[0226] (实施例7)混合糖液的转化酶处理

[0227] 对实施例1的工序(2)的水解物(10mL)添加废糖蜜(参考例7：糖浓度689g/L)0.5g。添加后。在室温(50℃)混合5分钟左右至均匀后，将此作为混合糖液。然后，添加来源于酵母的转化酶1g(Invertasesolution,from yeast、和光纯药工业)，进一步放置1小时。

[0228] 工序(3)：

[0229] 使用工序(2)所得的混合糖液，通过与比较例1的工序(3)相同的步骤进行固液分离和超滤膜处理。所得的糖浓度示于表15。

[0230] 【表15】

[0231] 糖浓度

[0232]

[0233] 如表15所示，判明了与实施例1的糖浓度相比较，通过蔗糖的水解，葡萄糖和果糖的糖浓度增加。

[0234] (实施例8)利用转化酶处理后的糖液的L-乳酸生产

[0235] 将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)JCM7638株接种于实施例7的糖液5mL中，在37℃的温度下静置培养24小时。在以下条件下分析培养液所含的L-乳酸浓度。

[0236] 柱：Shim-Pack SPR-H(株式会社岛津制作所制)

[0237] 移动相：5mM对甲苯磺酸(流速0.8mL/分钟)

[0238] 反应液：5mM对甲苯磺酸、20mM Bis-Tris、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分钟)[0239] 检测方法：电导率

[0240] 温度：45℃

[0241] 分析的结果确认了L-乳酸以26g/L蓄积，从而可以确认通过本发明的糖液能够生产乳酸。

[0242] (比较例4)利用试剂糖液的L-乳酸生产

[0243] 为了比较，以表15记载的糖浓度调制混合有葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖的试剂糖液5mL。将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)JCM7638株接种于所述试剂糖液中，在37℃的温度下静置培养24小时，没有确认生长。认为其原因是，实施例8的糖液中含有用于乳酸菌生长的氨基酸、维生素等，与此相对，试剂糖液中不含有。

[0244] (参考例9)

[0245] 作为含纤维素的生物质使用甘蔗渣。将上述含纤维素的生物质浸渍在硫酸1％水溶液中，在150℃进行30分钟高压釜处理(日东高压株式会社制)。处理后进行固液分离，分离成硫酸水溶液(以下称为稀硫酸处理液)和纤维素前处理物(稀硫酸)。

[0246] (比较例5)不在水解物中添加混合废糖蜜的糖液制造

[0247] 使用参考例9所调制的纤维素前处理物(稀硫酸)，通过与比较例1相同的步骤将回收酶液进行回收。回收酶量依据参考例5通过测定各活性值来定量。此外，将本比较例5中测定的活性值作为“1(基准)”，用于后述比较例6和实施例9的回收酶量的比较(表
16)。

[0248] (比较例6)在水解物中添加试剂糖液的糖液制造

[0249] 工序(1)：

[0250] 通过与比较例1的工序(1)相同的步骤来实施。

[0251] 工序(2)：

[0252] 通过与比较例2相同的步骤来实施。

[0253] 工序(3)：

[0254] 使用工序(2)所得的混合糖液，通过与比较例1的工序(3)相同的步骤来进行固液分离和超滤膜处理。将测定的活性值除以比较例5的活性值而得的值作为比较例6的回收酶量示于表16。

[0255] (实施例9)在纤维素水解物中添加混合废糖蜜的糖液的制造方法

[0256] 工序(1)：

[0257] 通过与比较例1的工序(1)相同的步骤实施。

[0258] 工序(2)：

[0259] 通过与实施例1相同的步骤实施。

[0260] 工序(3)：

[0261] 使用工序(2)所得的混合糖液，通过与比较例1的工序(3)相同的步骤进行固液分离和超滤膜处理。将测定的活性值除以比较例5的活性值而得的值作为实施例9的回收酶量示于表16。

[0262] 将比较例5、比较例6、实施例9进行比较，结果在实施例9中，与比较例5相比回收酶量增大，因而提示，废糖蜜成分中含有使回收酶量增加的成分。另外比较例6的回收酶量与比较例5基本为相同程度，因而提示，废糖蜜所含的糖成分(蔗糖、葡萄糖、果糖)不影响回收酶量，除此以外的成分与酶回收增加相关。本结果是显示与纤维素前处理无关地、通过废糖蜜而回收酶活性增大的结果。

[0263] 【表16】

[0264] 回收酶量2(相对值)

[0265]

[0266] 产业可利用性

[0267] 通过本发明，可以由含纤维素的生物质制造成为用于发酵制造各种化学品的发酵原料的糖液。

[0268] 符号说明

[0269] 1 保温装置

[0270] 2 水解槽

[0271] 3 混合装置

[0272] 4 送液泵

[0273] 5 固液分离装置

[0274] 6 精滤膜装置

[0275] 7 溶液回收槽

[0276] 8 超滤膜泵

[0277] 9 超滤膜

[0278] 10 糖液回收槽

[0279] 11 高压泵

[0280] 12 纳滤膜和/或反渗透膜

[0281] 13 保温装置

[0282] 14 发酵槽

[0283] 15 搅拌装置

[0284] 16 微生物分离装置

[0285] 17 撕碎机

[0286] 18 压榨机

[0287] 19 汁罐

[0288] 20 效用罐

[0289] 21 晶析装置

[0290] 22 分离装置

[0291] 23 输送装置

[0292] 24 粉碎机

[0293] 25 加热装置

[0294] 26 输送线