具有一种或多种增强的产量相关性状的植物和其生产方法 |
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| 申请号 | CN201380028969.3 | 申请日 | 2013-03-15 | 公开(公告)号 | CN104334727A | 公开(公告)日 | 2015-02-04 |
| 申请人 | 巴斯夫植物科学有限公司; | 发明人 | C·勒佐; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及用于在 植物 中增强多种经济上重要的产量相关性状的方法，所述方法通过以特定的方式调节在植物中编码黄素 氧 还蛋白多肽的核酸的表达。本发明还涉及具有表达受特定类型的启动子调节的编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物，所述植物相对于 对照植物 具有增强的产量相关性状。本发明还提供了迄今未知的构建体，可用于实施本发明的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.相对于对照植物在植物中增强一种或多种产量相关性状的方法，所述方法包括增加编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸在植物中的表达，其中所述表达处于与编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸有效连接的启动子序列的控制下，且其中启动子序列包括GOS2启动子的核苷酸序列，优选稻启动子的GOS2启动子；或其功能片段或衍生物。 |
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| 说明书全文 | 具有一种或多种增强的产量相关性状的植物和其生产方法[0001] 本申请要求下列申请的优先权：2012年4月2日提交的EP 12162832.5和2012年4月2日提交的US 61/618861，其均通过引用全文整合到本文中。引用整合的还有作为 WO2003/035881公开的国际专利申请PCT/GB02/04612，具体是第35至45页，特别是其中列 举的黄素氧还蛋白和转运肽；以及EP1532257，和特别地GOS2启动子的修饰的形式，其公开在作为WO2012077020公开的国际专利申请PCT/IB2011/055412中，作为所述申请的SEQ ID NO:14和15以及第6&7页中描述的相关的序列(并入本文)，和公开在作为WO2004/065596 公开的国际申请中的GOS2启动子。 [0002] 发明背景发明领域 [0003] 本发明一般涉及植物分子生物学领域，并且涉及增强一种或多种植物产量相关性状的方法，所述方法通过特定方式增加在植物中编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的表达。本 发明还涉及具有专门增加的编码靶向质体的黄素氧还蛋白多肽的外源核酸表达的植物，所 述植物相对于相应的对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状。本发明还提供了在本 发明方法中有用的构建体、用途、植物、可收获的部分和产物。 [0004] 现有技术说明 [0005] 持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关提高农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特征的植物。但是，此 类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经 常含有异源的遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的受欢迎性状。分子生物学 进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质 (一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。此类技术具有产生具备 多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。 [0006] 一个具有经济意义的性状是提高的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数 目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对提高作物产量有贡献。 [0007] 种子产量是一个重要的性状，因为许多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、卡诺拉油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用 许多类型代谢物的来源。种子含有胚(新枝条和新根的起源)和胚乳(萌发期间及籽苗早 期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为 贮藏大分子以灌满籽粒。 [0008] 对于许多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改进早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在稻 直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的枝条 与萌发势相关。在实施条播(drill-seeding)的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好 出幼苗是重要的。将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)在欧洲大西洋地区 引种玉蜀黍(Zea mayes L.)杂种。 [0009] 又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50％(Wang等、Planta 218， 1-14，2003)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、缺乏营养、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民而言是巨大经济优势并且会 允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。 [0010] 环境胁迫是植物生产力和农作物产量的主要限制因素。暴露于负面环境条件下的植物所经历的许多有害过程是由光合成装置的错误性能在叶绿体中生成的活性氧 (ROS)介导 的(Foyer,C.H.等人，(1994)Plant Cell Environ.17,507-523,Hammond-K osack,K.E. 和 Jones,J.D.G.(1996)Plant Cell 8,1773-1791,Allen,R.(1995)Plant Physiol.10711049-1054)，光合成电子传递链组分的自发氧化导致了形成超氧化物自由基 及其衍生物、过氧化氢和羟基自由基。这些化合物与多种生物分子反应(最明显的，DNA)，导致细胞停滞和死亡。 [0011] 为了处理活性氧(ROS)的伤害效应，好氧生物进化出非常有效的抗氧化防御体系，该体系由酶组件和非酶组件组成。在不同的组织和生物中，抗氧化剂发挥不同的、且通常是互补的保护功能，例如指导被破坏的氧化敏感型生物分子的ROS1替换性拯救和DNA 修复活性(Fridovich 1I.(1997).J.Biol.Chem.272,1851-1857)。抗氧化胁迫的至少一部 分细胞应答是适应性本能，涉及从头合成抗氧化剂屏障的中坚成员。已经在兼性好氧菌大 肠杆菌中识别出多种多基因的应答，包括由soxRS和oxyR调节子调控的(Hidalgo,E.和 Demple,B.(1996).In Regulation of Gene Expression in Escherichia coli,Molecular Biology Intelligence Unit Series(E.C.C.Lin和A.S.Lynch编 著)，第434-452页， Austin,TX:R.G.Landis)。 [0012] soxRS应答似乎经过特定调整，以应对由于细胞暴露在超氧化物自由基或一氧化氮下所产生的问题。已经鉴别了多种不同的应答组分，包括两种可溶性的黄 + 素蛋白：含有FAD的铁氧还蛋白-NADP 还原酶(FNR)，及其电子对底物黄素氧还蛋白 (Liochev等人，(1994)Proc.Natl Acad.Sei.USA 91,1328-1331,Zheng,M.等人，(1999) J.Bacteriol.181,4639-4643)。 [0013] 黄素氧还蛋白是小的单体蛋白质(Mw 18,800)，含有1分子的非共价结合的FMN(Razquin,P.等人，(1988)J.Bacteriol.176,7409-7411)。FNR能够以几乎相似的效率 使用黄素氧还蛋白和铁硫蛋白质铁氧还蛋白作为其NADP(H)氧化还原酶活性的底物。在蓝 细菌中，黄素氧还蛋白是在铁饥饿的条件下不能合成铁氧还蛋白时诱导表达的。 [0014] 作为E.coli的soxRS应答的一部分，在用增加超氧化物的化合物(例如氧化还原循环除草剂甲基vialogen(MV))处理细菌后，FNR和黄素氧还蛋白的水平增加了 20倍以上，而铁氧还蛋白的量则不受影响(Rodriguez,R.E.等人，(1998)Microbiology 144,2375-2376)。与广泛分布在质体、线粒体和细菌中的FNR和铁氧还蛋白不同，黄素 氧还蛋白的存在似乎大部分局限在细菌中。尚未从植物组织中分离出黄素氧还蛋白， 在拟南芥基因组中也尚未识别出任何黄素氧还蛋白同源物(The Arabidopsis Genome Initiative(2000)Nature 408,796-815)。已经描述了当暴露在环境胁迫条件下时，相比未处理过的植物对照，经改造表达黄素蛋白(例如黄素氧还蛋白)的植物表现出增强的耐受 性(参见申请人PLANT BIOSCIENCE LTD于2002年10月10日提交的国际专利申请PCT/ GB02/04612，其作为WO2003/035881公开，下文中按WO 03/035881引用)。 [0015] 作物产量因而可以通过优化前述因素之一而提高。 [0016] 取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应 用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数的提高可能是特别希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对提高种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是提高的种子数目。 [0017] 现在已经发现通过在植物中调节植物中编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的表达来改善植物的多种产量相关性状。 [0018] 发明概述 [0019] 本发明涉及了通过专门增加编码靶向质体的黄素氧还蛋白多肽的核酸在植物中的表达，增强植物的一种或多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有表达特异性增加 的编码质体靶向型黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物，所述植物相比对照植物，具有一种或 多种增强的产量相关性状。本发明还提供了迄今为止未知的包含黄素氧还蛋白编码核酸的 构建体，所述构建体可用于实施本发明的方法。 [0020] 优选的实施方案是用于在植物中相对于对照植物增强一种或多种产量相关性状的方法，包括在植物中以特定的方式增加编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸表达 的步骤，优选通过重组方法，其中表达是处于与编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸有 效连接的特定启动子序列的控制下的，以及生长所述植物。 [0021] 因此，本发明的一个目标是提供表达构建体和载体构建体，所述构建体包含与有利的启动子序列有效连接的编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸。提供了这类遗传构建 体用于制备转基因植物的用途，所述转基因植物相比对照植物，具有一种或多种增强的产 量相关性状，优选增加的生物量和/或种子产量。 [0022] 优选的实施方案还有用本发明的一个或多个表达构建体转化的转基因植物，因而以特定的方式表达编码转运肽和黄素氧还蛋白的核酸，其中所述植物具有一种或多种增强 的产量相关性状。本发明的转基因植物的可收获的部分和源自所述转基因植物的产物及其 可收获部分也是本发明的一部分。 [0023] 特别是还令人惊讶的发现，编码本文定义的转运肽和黄素氧还蛋白的外源核酸在本文定义的GOS2启动子的控制下表达，导致了在标准的和/或非生物的胁迫条件下，包含 与所述GOS2启动子功能性关联的所述外源核酸的组合的植物相比对照植物增加的生物 量、增加的种子产量和/或增加的糖含量。 [0025] 下面将参考以下附图描述本发明，其中： [0026] 图1表示具有保守基序和/或结构域的SEQ ID NO:2的结构域结构。使用软件InterProScan鉴别和可视化所述结构域(参见Zdobnov E.M.和Apweiler R.； "InterProScan-an integration platform for the signature-recognition methods in InterPro."；Bioinformatics,2001,17(9):847-8；InterPro database,release Release 36.0，2012年2月23日)和InterproScan软件4.8版，InterPro数据库release 41，2013 年2月13日(B)。 [0027] 图2表示用于在甘蔗中特异性表达编码与质体转运肽(TP)融合的黄素氧还蛋白(FLD)的核酸的二元载体，以TP::FLD表示，处于GOS2启动子(p GOS2)的控制下。黄素氧 还蛋白、转运肽和GOS2启动子描述在本文中。 [0028] 发明详述 [0029] 定义 [0030] 以下定义将在本申请中自始至终使用。本申请中的章节标题和节标题目的仅在于方便和参考目的并且不应当以任何方式影响本申请的含义或解释。通常向本申请范围内所 用的技术术语和表述给予在植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种的相关领域 中常适用于它们的含义。以下全部术语定义均适用于本申请的完整内容。应理解，如说明 书和权利要求中所使用的，“一”或“一个”可以意指一个或多个，取决于其使用的上下文。 因此，例如，提及“一个细胞”可以意指可利用至少一个细胞。 [0031] 与某属性或值相联系的情况下，术语“基本上”、“约”、“大约”等还分别具体地确切限定该属性或确切限定该值。在给定数值或范围的情况下，术语“约”特别设计处于给予的所述值或范围的20％以内、10％以内或5％以内的值或范围。如本文所用，术语“包含”也包括术语“由……组成”。 [0032] 肽/蛋白质 [0033] 除非本文中另外提到，术语“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指由肽键连接在一起的处于任意长度的聚合形式下的氨基酸。 [0034] 多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列 [0035] 术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且指任意长度聚合无分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者组合。 [0036] 同源物 [0037] 蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与其所源自的非修饰蛋白质具有基本相同的生物学活性和功能活性。基因的“同源物”涵盖了相对于非修饰的所讨论蛋白质具 有核苷酸替换、缺失和/或插入的核酸序列的基因，并且与其所源自的非修饰基因具有基 本相同的生物学活性和/或功能活性，或者编码与非修饰的核酸序列所编码的多肽具有基 本相同的生物学活性和功能活性的多肽。 [0039] 直向同源物和旁系同源物是同源物的两种不同的形式，并且涵盖用来描述基因或蛋白质先祖关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内通过先祖基因或蛋白质复制而起源 的基因或蛋白质；直向同源物是来自不同生物的通过物种形成而起源的基因或蛋白质，并 且也来源于共同的先祖基因或蛋白质。 [0040] “缺失”指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸，或者从核酸中移除一个或多个核苷酸。 [0041] “插入”指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入，或者一个或多个核苷酸在核酸序列中预定位点内的引入。对于蛋白质，插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及单个或多个氨基酸的序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基 端融合或羧基端融合小，约1-10个残基的级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子 包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、 (组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、 -表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白 C表位和VSV表位。 [0042] “取代”指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向)的其它氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins. W.H.Freeman和Company(编著)和下表1)。 [0043] 表1：保守性氨基酸取代的例子 [0044]残基 保守性取代 残基 保守性取代 Ala Ser Leu Ile；Val Arg Lys Lys Arg；Gln Asn Gln；His Met Leu；Ile Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr Gln Asn Ser Thr；Gly Cys Ser Thr Ser；Val Glu Asp Trp Tyr Gly Pro Tyr Trp；Phe His Asn；Gln Val Ile；Leu Ile Leu，Val [0045] 氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而容易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失 变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生取代突变的技术 是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的位点定向 诱变或其它位点定向诱变法(参见Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989，年更新))。 [0046] 衍生物 [0047] 蛋白质或多肽的“衍生物”包括这样的多肽，其中与天然存在形式的蛋白质或多肽(如目的蛋白)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的取代或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质或多肽的“衍生物”也包含这样的多肽，其中与多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的经改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)的氨基酸残基或非天然的经改变的氨基酸残基。 与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价 结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其它配体)，如为促进检测该 衍生物而结合的报道分子，和与天然存在的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然存在的氨 基酸残基。此外，“衍生物”还包括天然存在形式蛋白质与标签肽(如FLAG、HIS6或硫氧 还蛋白)的融合体(标签肽的综述参阅Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533， 2003)。核酸的“衍生物”包括这样的核酸，其中与天然存在形式的核酸的核苷酸序列相比，它们包含非天然存在的核苷酸的缺失、改变或添加。核酸的“衍生物”还包括这样的核酸，其中与天然存在形式的核酸的核苷酸序列相比，它们包含天然存在的改变的核苷酸或非天 然改变的核苷酸。蛋白质或核酸的衍生物仍然提供了基本相同的功能，例如，当分别在植物中表达或抑制时，增强的产量相关性状。 [0048] 功能性片段 [0049] 术语“功能性片段”指仅分别包括全长核酸或去全长蛋白质的一部分的任何核酸或蛋白质，但仍然提供了基本相同的功能，例如，当分别在植物中表达或抑制时，增强的产量相关性状。 [0050] 在过表达所需核酸时，术语“基本相同的功能活性”或“基本相同的功能”意指当在植物中表达时提供了增加的/增强的产量相关性状的任何同源物和/或片段。优选的，基本相同的功能活性或基本相同的功能意指相比由外源表达全长的黄素氧还蛋白核苷酸 序列或黄素氧还蛋白氨基酸序列所提供的功能活性，至少50％、至少60％、至少70％、至少 80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％或更多的增加的/增强的产量相 关性状。 [0051] 结构域/基序/共有序列/特征序列 [0052] 术语“结构域”指依据进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其它位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度 保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通 过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定 任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。 [0053] 术语“基序”或“共有序列”或“特征序列”指在进化相关的氨基酸或核酸序列中的短保守区。对于氨基酸序列，基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。 [0054] 存在用 于鉴定结 构域的 专门数 据库，例如 SMART(Schultz等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95,5857-5864；Letunic 等 (2002)Nucleic Acids Res 30,242-244),InterPro(Mulder 等 ,(2003)Nucl.Acids.Res.31,315-318)， Prosite(Bucher 和 Bairoch(1994),A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation.(In) ISMB-94；Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.,Brutlag D.,Karp P.,Lathrop R.,Searls D.编著，第 53-61 页 ,AAAI Press,Menlo Park；Hulo 等 ,Nucl.Acids.Res.32:D134-D137,(2004) 或者Pfam(Bateman等,Nucleic Acids Research 30(1):276-280(2002))和Pfam蛋白 质家 族数 据库 :R.D.Finn,J.Mistry,J.Tate,P.Coggill,A.Heger,J.E.Pollington,O. L.Gavin,P.Gunesekaran,G.Ceric,K.Forslund,L.Holm,E.L.Sonnhammer,S.R.Eddy,A. Bateman Nucleic Acids Research(2010)Database Issue38:211-222)。 用 于 计 算 机分析蛋白质序列的一组工具可获得自ExPASy蛋白组服务器(Swiss Institute of Bioinformatics(Gasteiger等,ExPASy:the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis,Nucleic Acids Res.31:3784-3788(2003))。还可以使用常规技 术(如通过序列比对)来鉴定结构域或基序。 [0055] 比对序列以进行比较的方法为本领域所众所周知，这些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP利用Needleman和Wunsch((1970)J Mol Biol 48:443-453) 的算法来寻找两序列间使匹配数最高并使空位数最少的全局比对(即在完整序列上)。 BLAST算法(Altschul等(1990)J Mol Biol 215:403-10)在两序列间计算百分比序列同 一性并进行相似性的统计学分析。用于进行BLAST分析的软件在国家生物技术信息中心 (National Centre for Biotechnology Information(NCBI))向公众提供。可以使用例如 默认配对比对参数的ClustalW多重序列比对算法(1.83版)(采用默认配对比对参数) 和百分比评分法来容易地鉴定同源物。也可以使用MatGAT软件包(Campanella等,BMC Bioinformatics.2003Jul10；4:29.MatGAT:an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequence)中提供的方法之一来确定全局的 相似性和同一性百分比。本领域技术人员会意识到，可以进行少量手动编辑以优化保守性 基序之间的比对。此外，还可以使用特定的结构域代替使用全长序列来鉴定同源物。序列 同一性值可以是采用上述程序使用默认参数在完整的核酸或氨基酸序列上或在所选择的 结构域或保守的基序上测定的。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF,Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。 [0056] 交互BLAST [0057] 通常，这包括以查询序列(例如，利用实施例章节表2或3中所列的任一序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST的首次BLAST(即，用目标序列 作为查询序列运行BLAST软件)。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX(利 用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。 BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果的全长序列针对查询 序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次BLAST)。然后比较首次和二次BLAST的结果。 如果首次BLAST中的高排名命中来自查询序列来源的相同物种，然后反向BLAST理想地导 致查询序列处于最高命中之列，则鉴定出旁系同源物；如果首次BLAST中高排名命中不来 自查询序列来源的相同物种，且优选地在反向BLAST时导致查询序列在最高命中之列，则 鉴定出直向同源物。 [0058] 高排名的命中是那些E值低的命中。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了E值之外，还对 比较进行同一性百分比评分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长 度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下可以使用ClustalW，继之以邻接树 来辅助相关基因的聚类可视化，和鉴定直向同源物和旁系同源物。 [0059] 转运肽 [0060] “转运肽”(或转运信号、信号肽、信号序列)是一类短的(3-60个氨基酸长)肽链，其指导蛋白质的运输，优选运送至细胞内的细胞器或某些亚细胞位置，或用于分泌蛋白质。转运肽还可以被称为转运信号、信号肽、信号序列、靶向信号或(亚细胞)定位信号。 [0061] 杂交 [0062] 如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可 以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任何其它树脂的情况下 发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或 通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称 作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双 链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其它二级结构。 [0063] 术语“严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(Tm)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于Tm约20℃，高严 格性条件是此时温度低于Tm约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有 高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上有所偏差但因遗传密码子的简并性而 依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件来鉴定此类核酸分 子。 [0064] Tm是在确定的离子强度及pH下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂 交。从低于Tm约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在杂交溶液中的存在降低 了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交分子形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是 明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解 链温度，每百分比甲酰胺降低0.6至0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30至45℃进行杂 交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并 且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃。取决于杂交分子的类型，Tm可以使用下列等式计算： [0065] 1)DNA-DNA杂交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138:267-284，1984): [0066] Tm＝81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]–500x[Lc]-1–0.61x％甲酰胺 [0067] 2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交分子: [0068] Tm＝79.8℃+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc [0069] 3)oligo-DNA或oligo-RNAd杂交分子: [0070] 对于<20个核苷酸：Tm＝2(ln) [0071] 对于20–35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln) [0072] a或对于其它一价阳离子，但是仅在0.01–0.4M范围内是精确的。 [0073] b仅对于％GC在30％至75％范围内是精确的。 [0074] c L＝双链体的长度(以碱基对计)。 [0075] d oligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。 [0076] 可以使用众多已知技术的任何一种来控制非特异性结合，如例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非 同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行： [0077] (i)逐渐降低退火温度(例如从68℃至42℃)或 [0078] (ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。 [0079] 技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。 [0080] 除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的 离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常， 用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格 或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多 种参数。 [0081] 例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的常见高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗 涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交分子的中等严格性杂交条件的例子包括在50℃ 于4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂 交分子的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴 定本文中所述的保守区而确定杂交分子长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂 交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片 段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。 [0082] 在优选的实施方案中，高严格性杂交条件意指在65℃于含有0.1SDS和任选的5xDenhardt试剂、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠的0.1×SSC中杂交，随后 在65℃于0.3×SSC中洗涤。 [0083] 为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。 [0084] 剪接变体 [0085] 如本文中所用的术语“剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物活性的变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。 此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法 是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex，(2005)BMC Bioinformatics.6：25)。 [0086] 等位变体 [0087] “等位基因”或”等位变体”是给定基因，位于基本相同染色体位置内的替代形式。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)，以及小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通 常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在的多态性株系中序列变体的最 大集合。 [0088] 内源基因 [0089] 本文中提及的“内源”核酸和/或蛋白质指如在植物中发现的以其天然形式(即没有任何人类干预，如重组DNA改造技术)存在的所讨论的核酸和/或蛋白质，还指处于分 离形式随后(再)引入植物中的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例 如，含有这种转基因的转基因植物可以遇到转基因表达大幅降低和/或内源基因表达的大 幅降低。分离的基因可从生物体分离，或可人工制造(例如通过化学合成)。 [0090] 外源 [0091] 术语“外源”(与“内源”相反)核酸或基因指通过重组DNA技术的手段导入到植物中的核酸。“外源”核酸可以是其天然形式不存在于植物中的，而其天然形式与植物中发现的所讨论的核酸不同，或者可以是与植物中发现天然形式的核酸相同，但没有整合到其天然的遗传环境中。“外源”的相应含义用于蛋白质表达的上下文中。例如，当与内源基因的表达相比时，含有转基因(即，外源核酸)的转基因植物可以遇到相应基因或蛋白质总表达 的实质性增加。本发明的转基因植物包括整合在任何基因座中的外源黄素氧还蛋白核酸， 任选的，所述植物还可以在天然的遗传背景中包括内源性基因。 [0092] 基因改组/定向进化 [0093] “基因改组”或“定向进化”由如下构成：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有修饰的生物学活性的蛋白质之核酸或其部分的变体(Castle等，(2004) Science 304(5674):1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。 [0094] 表达盒 [0095] 本文中使用的“表达盒”是能够在宿主细胞或体外表达系统中表达的DNA。优选的，形成表达盒的DNA、部分DNA或遗传元件的排列是人为的。本领域技术人员普遍了解为 了成功的表达，表达盒中必须存在的遗传元件。表达盒包括与本文所述的一个或多个控制 序列(至少是启动子)有效连接的待表达的目标序列。其他的调控元件可以包括转录和翻 译增强子、一个或多个本文所述的NEENA，和/或一个或多个本文所述的RENA。本领域技术 人员可以理解适用于实施本发明的终止子和增强子序列。还可以在5’非翻译区(UTR)或 编码序列中添加内含子序列，以增加在胞质溶胶中积累的成熟信使的量，如用于增加表达/过表达的定义章节所述。其他的控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区以外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。这类序列可以是已知的，或者 可以是本领域技术人员易于获得的。 [0096] 表达盒可以整合到宿主细胞的基因组中，与所述宿主细胞的基因组同时复制。 [0097] 构建体/遗传构建体 [0098] 人工DNA(例如但不限于质粒或病毒DNA)——部分或全部人工的、或所含的遗传元件的排列是人工的——典型的能够通过在宿主细胞中复制，增加或减少目标DNA和/或 蛋白质的表达，并且用于将目的DNA序列引入宿主细胞或宿主生物。复制可以发生在整合 到宿主细胞基因组之后，或者发生在构建体作为载体或人工染色体的一部分存在于宿主细 胞内的过程中。 [0099] 本发明的宿主细胞可以是任何选自下述的细胞：细菌细胞，例如大肠杆菌或农杆菌属物种细胞、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细菌细胞或植物细胞。技术人员熟知为了成功转化、选择和繁殖包含目的序列的宿主细胞而必需存在于遗传构建体上的遗传元件。 [0100] 通常，构建体/遗传构建体是表达构建体，包括一个或多个可以导致过表达(过表达构建体)或降低目标基因表达的表达盒。构建体可以由表达盒组成。目的序列与如本文 所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效连接。其它调节元件可包括转录及翻译 增强子、一个或多个本文所述的NEENA，和/或一个或多个本文所述的RENA。本领域技术人 员会了解适于在实施本发明中使用的终止子和增强子序列。如在增加表达/过表达的定义 部分所述，也可将内含子序列添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列上，以增加在细胞质内 积累的成熟信息的量。其它控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。本领域技术人员会知道或可以容易 地获得此类序列。 [0101] 本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制需要的复制起点序列。一个例子是当需要将遗传构建体在细菌细胞中作为附加型遗传元件(例如质粒 或粘粒分子)维持时。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。 [0102] 为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸序列的转基因植物，使用标记基因(或报告基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包 含选择标记基因。选择标记在本文“定义”部分中有更详细的描述。一旦不再需要，可以从转基因细胞中去除或切除标记基因。用于去除标记基因的技术是本领域已知的，有用的技 术在上文“定义”部分中描述。 [0103] 载体构建体/载体 [0104] DNA(例如但不限于质粒或病毒DNA)——部分或全部人工的、或所含的遗传元件的排列是人工的——能够在宿主细胞中复制，并且用于将目的DNA序列引入宿主细胞或宿主 生物。载体可以是构建体，或者可以包含至少一个构建体。载体可以在不整合到宿主细胞 的基因组的条件下复制，例如细菌宿主细胞中的质粒载体，或者可以将其DNA部分或全部 整合到宿主细胞中，因而导致其DNA的复制和表达。本发明的宿主细胞可以是任何选自下 述的细胞：细菌细胞，例如大肠杆菌或农杆菌属物种细胞、酵母细胞、真菌、藻类或蓝细菌细胞或植物细胞。技术人员熟知为了成功转化、选择和繁殖包含目的序列的宿主细胞而必需 存在于遗传构建体上的遗传元件。载体通常包含至少一个表达盒。一个或多个目的序列与 如本文所述的一个或多个控制序列(至少与启动子)有效连接。其它调节元件可包括转录 及翻译增强子、一个或多个本文所述的NEENA，和/或一个或多个本文所述的RENA。本领域 技术人员会了解适于在实施本发明中使用的终止子和增强子序列。如在定义部分所述，也 可将内含子序列添加至5'非翻译区(UTR)或编码序列上，以增加在细胞质内积累的成熟信 息的量。其它控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。本领域技术人员会知道或可以容易地获得此类序 列。 [0105] 调节元件/控制序列/启动子/启动子序列 [0106] 术语“调节元件”、“控制序列”、“启动子”和“启动子序列”指能够影响与之连接的序列表达的调节性核酸序列。调控元件可以是启动子。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其它蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的 核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的 TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺 激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默 子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括–35盒序列 和/或–10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。 [0107] “植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不一定是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其它“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列的启动子上游可以由一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失而 受到修饰，但不干扰启动子、开放阅读框(ORF)或3'调节区(如终止子)或远离ORF的其 它3'调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因修饰该启动子的序列或由更具活 性的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至合适的启动子或包含合适的启动子，其中所述的启动子在 正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。 [0108] 为了鉴定功能等价启动子，可以分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式，例如通过将该启动子与报告基因有效连接并测定该报告基因在多种植物组织中的表达水 平和模式。合适的公知报告基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。通过测 量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性来测定启动子活性。接着可以将启动子 强度和/或表达模式与参考启动子(如用于本发明方法中的)进行比较。备选地，可以通 过定量mRNA水平或者将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18SrRNA)的 mRNA水平进行比较来测定启动子强度，其中使用本领域众所周知的技术，如通过放射自显 影的光密度测定分析进行的Northern印迹、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996Genome Methods 6:986-994)。通常，“弱启动子”指驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”指每个细胞中约1/10,000的转录物至约1/100,000的转录物至约1/500,0000的转录物的 水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者每个细胞中约1/10的转录物至约 1/100的转录物至约1/1000的转录物的水平。通常，“中等强度启动子”指此类启动子，其驱动编码序列以低于强启动子的水平表达，特别是在所有情况下以低于35S CaMV启动子控 制时获得的水平表达。 [0109] 有效连接 [0110] 如本文中所用的术语“有效连接”或“功能性连接”可互换的使用，指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够指导目的基因转录。 [0111] 涉及调控元件的术语“功能性连接”或“功能性相连的”理解为意指例如调控元件(如启动子)与待表达的核酸序列，恰当的时候与其他调控元件(如，终止子、本文所述的NEENA或本文所述的RENA)的顺序排列是这样的方式，使所述调控元件可以完成其预期的 功能，从而允许、修饰、促进或者影响所述核酸序列的表达。作为同义词，可以使用词语“有效连接”或“有效连接的”。根据核酸序列的排列，表达可以获得正义或反义RNA。为此目的，化学含义上的直接连接不是必需的。遗传控制序列(例如，增强子序列)也可以对远离 所处位置或者实际上位于其他DNA分子上的靶序列发挥功能。优选的排列方式是待表达 的核酸序列重组的位于作为启动子发挥作用的序列之后，使两条序列彼此共价的相连。启 动子序列和待表达的重组核酸序列之间的距离优选小于200碱基对，特别优选小于100碱 基对，非常特别优选小于50碱基对。在优选的实施方案中，待转录的核酸序列以这样的方 式位于启动子之后，使得转录起始与本发明的嵌合RNA的理想起点相同。可以如所述，通 过定制的重组和克隆技术手段生成功能连接和表达构建体(例如，在Maniatis T,Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Silhavy等人，(1984)Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor(NY)；Ausubel等人，(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience；Gelvin等人(编著)，(1990)Plant Molecular Biology Manual；Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,The Netherlands)。然而，在两条序列之间也可以放置其他序列，例如作为接头具有限制性酶的特定切割位点的序列，或作为信号肽的序列。插入的序列还可以导致融合蛋白的表达。优选的，由调控区(例如启动子)和待表达的核酸序列 的连接组成的表达构建体可以以载体-整合形式存在，也可以插入到植物基因组中，例如 通过转化。 [0112] 组成型启动子 [0113] “组成型启动子”指在至少一种细胞、组织或器官中在其大多数(但不一定是全部)生长和发育阶段并在大多数环境条件下有转录活性的启动子。 [0114] _“遍在启动子”在生物的基本上全部组织或细胞中有活性。 [0115] “发育调节性启动子”在某些发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。 [0116] “诱导型启动子”在应答于化学品(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导型”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导型”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。 [0117] “器官特异性”或“组织特异性启动子”是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异性”。“种子特异性启动子”主要在种子组织中有转录活性，但不一定仅在种子组织中有(泄漏表达的情况)。种子特异性启动子可在种子发育和/或萌发过程中有活性。种子特异性启动子可 以是胚乳/糊粉/胚特异性的。 [0118] 如本文中所定义的“绿色组织特异性启动子”是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内允许任 何泄露表达。 [0119] 组织特异性启动子的另一个例子是分生组织特异性启动子，其主要在分生性组织中具有转录活性，在植物的任何其它部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其它部分内 允许任何泄露表达。 [0120] 终止子 [0121] 术语“终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单元末端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并多聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以来自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者来自另一植物基因或较不优选地来自任何其它真核基因。 [0122] 选择标记(基因)/报告基因 [0123] “选择标记”、“选择标记基因”或“报告基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸分子的成功转移。合适的标 记可以选自赋予抗生素抗性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择 标记基因的例子包括赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使 潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin，G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供 抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉 酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作 为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。视觉 标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有 色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍 生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方 法，优选不同的标记。 [0124] 已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择 这些整合子，通常将编码选择标记(如上文所述的那些)的基因连同目的基因一起引入宿 主细胞。这些标记可以例如在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体 中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以引入宿主细胞中，与编码本发明多肽或本发 明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸稳定转染 的细胞可以例如通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其它细胞死 亡)。 [0125] 因为一旦已经成功引入了核酸，则转基因宿主细胞中就不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，因此用于引入核酸的本发明方法有利地使 用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时 用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记基因。高比例的 转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农 杆菌转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合 至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与 转座酶来源植物杂交或转化体与导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些 情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其 它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。 在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于已知的 重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。 Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之间，则在已 经成功发生转化时，通过重组酶表达去除标记基因。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和 REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。 [0126] 转基因的/转基因/重组 [0127] 为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就例如核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、基因构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，所有那些构建均通过重组方法产生，其中 [0128] (a)黄素氧还蛋白核酸的序列或其一部分，或 [0129] (b)与本发明的黄素氧还蛋白核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或[0130] (c)a)和b) [0131] 不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法修饰，例如，通过遗传工程方法人为修饰和/或插入。修饰有可能采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中或存在于基因组文库中的天然基因组基 因座或染色体基因座，或与天然启动子的组合。还连接编码质体靶向的转运肽的核酸序列 与编码本文定义的黄素氧还蛋白的核酸，而生成重组序列，所述编码本文定义的黄素氧还 蛋白的核酸是不与所述转运肽天然相连的。 [0132] 重组核酸、表达盒、遗传构建体或载体构建体优选包括天然基因和天然启动子、天然基因和非天然启动子、非天然基因和天然启动子，或非天然基因和非天然启动子。 [0133] 在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。 [0134] 天然存在的表达盒——例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用蛋白质的对应核酸序列的天然存在的组合，如上文所定义——在这种重组表达盒通过非天然 的合成(“人工”)方法(如例如诱变处理)人为修饰后，变成转基因表达盒。合适方法例 如在US 5,565,350、WO 00/15815或US200405323中描述。此外，天然存在的表达盒——例 如核酸序列的天然启动子与编码可用于本发明方法中的相应核酸序列的天然存在的组合， 如上文定义的——成为重组表达盒，当该表达盒没有整合到天然的遗传环境中，而是在不 同的遗传环境中时。 [0135] 还应该注意到，在本发明的上下文中，术语“分离的核酸”或“分离的蛋白质”在一些情况下可以分别被认为是“重组核酸”或“重组蛋白质”的同义词，分别指不位于其天然遗传环境和细胞环境中的核酸或蛋白质。分离的基因可以是从生物体分离的，或者可以是人造的，例如通过化学合成。在一个实施方案中，分离的核酸序列或分离的核酸分子是不处于其天然的环境或其天然的核酸相邻位置的核酸序列或核酸分子，而在物理上和功能上与 其他核酸序列或核酸分子相关联，并可见是核酸构建体、载体序列或染色体的一部分。 [0136] 如本文中使用的，涉及生物体的术语“转基因”，例如转基因植物，指外源含有本文所述的核酸、构建体、载体或表达盒、或其一部分的生物体，例如植物、植物细胞、原生质体、植物组织或植物部分，优选通过基本上非生物学的方法导入，优选通过农杆菌介导的转化或颗粒轰击导入。为本发明目的，转基因植物因此如上理解为意指本文所述的核酸不存在 于或不来源于所述植物的基因组，或存在于所述植物的基因组但是不位于所述植物基因组 中该核酸的天然遗传环境内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸的天然位置内， 然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到 修饰。转基因优选地理解为意指在植物中天然存在的核酸序列在基因组中的非天然遗传环 境内表达，即发生同源表达或在所述植物中非天然存在的核酸的异源表达。在本文中提到 了优选的转基因植物。 [0137] 调节 [0138] 术语“调节”就表达或基因表达而言意指这样的过程，其中表达水平与对照植物相比因所述基因的表达而改变，表达水平可以是增加或降低。原先未受调节的表达可以是 结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型表达，随后是翻译。出于本发明的目的，原始未 调节的表达也可以是没有任何表达。术语“调节活性”或术语“调节表达”应当意指本发明核酸序列和/或所编码蛋白质的表达的任何变化，这导致植物增加的或减少的产量相关性 状，例如但不限于增加的或减少的种子产量和/或增加的或减少的植物生长。表达可以从 零(没有或不可测的表达)增加至某一量，或可以从某一量减少至不可测的小量或零。 [0139] 表达 [0140] 术语“表达”或“基因表达”指转录一个或多个特定基因或特定的遗传构建体。特别地，术语“表达”或“基因表达”指将一个或多个基因或遗传构建体转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，包括或者不包括后者随后翻译成蛋白质。该过程包括转录DNA和加工所得的mRNA产物。术语“表达”或“基因表达”还可以包括mRNA的翻译及其编码蛋白质的合成，即，蛋白质表达。 [0141] 增加的表达/增强的表达/过表达 [0142] 如本文中所用的术语“增加的表达”、“增强的表达”或“过表达”意指对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。出于本发明的目的，原始野生型表达水平也可能是零，即没有表达或不可测量的表达。本文中提及的“增加的表达”、“增强的表达”或“过表达”意指相对于对照植物，基因表达的增加，和/或涉及多肽时，指增加的多肽水平和/或增加 的多肽活性。与对照植物相比，表达、多肽水平和/或多肽活性的增加按递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或100％，或者甚至更多。与对照植物相比，表达的增加按递增优选顺序可以是至少100％、200％、300％、400％、500％、 600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％或5000％，或者甚至更多。当对照植物仅具有非常低的表达时，所讨论的序列和/或重组基因的多肽水平或多肽序列是处 于强调控元件的控制下的，与对照植物相比，表达、多肽水平或多肽活性的增加可以是至少 100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、5000倍、10000倍、20000倍、50000倍、100000倍，或者甚至更多。 [0143] 在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷 酸的适宜位置(一般是上游)内引入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码 目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或取代而在体内改变(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离引入植物细胞，以便控制基因表达。 [0144] 如果期望表达多肽，一般期望在多核苷酸编码区的3’末端包含多腺苷酸化区。多腺苷酸化区可来自该天然基因，来自多种其它植物基因，或者来自T-DNA。待被加入的3’末端序列可来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者来自另一植物基因，或者较不优选地来自任何其它真核基因。 [0145] 内含子序列也可添加至5'非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在细胞质内积累的成熟信息的量。已经显示可剪接内含子在植物表达构建体和动物 表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000 倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev 1： 1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单元5'端附近时最强烈。使 用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息， 见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。 [0146] 为了获得多肽的增加的表达或过表达，最常见的是按与多聚腺苷酸信号正义的方向过表达编码该多肽的核酸。除了适用于以理想模式驱动表达的启动子以外，还可以使用 内含子或其他的增强元件。与此相反，以反义构建体过表达相同的核酸序列将不导致蛋白 质表达增加，而导致蛋白质表达减少。 [0147] 降低的表达 [0148] 本文中提及的“降低的表达”或者“减少或基本去除”的表达意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物相比，减少或基本去除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％、 96％、97％、98％、99％或更多。 [0149] 转化 [0150] 如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括将外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织 将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括 叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、已有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷 酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。或者，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方 式再生出转化植物。可选地，可以选择不能再生为植物的植物细胞作为宿主细胞，即所得的转化的植物细胞不具有再生为(完整)植物的能力。 [0151] 外来基因转移至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。用 于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物所述的方法可以用于瞬时转化或用于稳定 转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射 至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微注射。转化方法可以选自用于 原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu I等 (1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/ Technol 3，1099-1102)；对植物材料的显微注射(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；包被有DNA或RNA的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature 327：70)、 (非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的 转化法产生。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能 使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使 转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续 培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735–743)。用于农 杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方 法：欧洲专利申请EP 1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等(Plant Mol Biol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)： 13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。 待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 的载体中，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农 杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥 属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物如，例如烟草植物，例如通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌 的转化例如由 和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从 F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。 [0152] 除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的 植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中 获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol Gen Genet.208：1-9；Feldmann K(1992)。在：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。 替代性方法基于反复去掉花序并使莲座中心中的切除部位与转化的农杆菌孵育，因而转化 的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994). Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改进的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold， N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染”法的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂孵育[Clough，SJ和Bent，AF(1998) The Plant J.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有 利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，减少或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)，225-229] 中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至与 叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系 内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究 和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转 化技术商业化进展(Progress towards commercialization of plastid transformation technology).Trends Biotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质 体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生 (Klaus等，2004，Nature Biotechnology 22(2)，225-229)。 [0153] 遗传修饰的植物细胞能够通过技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于上述S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或者 和Willmitzer的出版物。可选地，遗传修 饰的植物细胞不能再生为完整植物。 [0154] 通常在转化以后，选出存在一个或多个标记的植物细胞或细胞群，所述标记由与目的基因共转移的植物可表达基因编码，继之将转化的材料再生成整个植物。为选择转化 的植物，通常将在转化过程中获得的植物材料置于选择性条件下，从而可将转化的植物与 非转化植物区分开来。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并在最初的生长期之后，通过喷雾对其进行合适的选择。另一可能方案是使用合适的选择剂，将种子(适当时在灭菌 之后)种在琼脂板上，从而仅转化的种子能够长成植物。备选地，针对转化的植物筛选选择标记(如本文所述标记)的存在。 [0155] DNA转移和再生之后，还可评价推定转化的植物，例如用Southern分析，评价目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造。备选地或额外地，可用Northern和/或Western分析监测新引入的DNA的表达水平，这两种技术都是本领域普通技术人员所众所周知的。 [0156] 产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，如通过克隆繁殖或经典的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植物可进 一步通过经典育种技术繁殖。产生的转化生物体可以有多种形式。例如，它们可以是转化 细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞经转化含有表达盒)；转化和非 转化组织的嫁接体(例如在植物中，转化的根状茎嫁接到非转化的接穗上)。 [0157] 在本申请中，用构建体转化或可互换地通过构建体转化的或用或通过核酸转化的植物、植物部分、种子或植物细胞被理解为表示携带此类构建体或此类核酸作为转基因 (由于通过生物技术方式导入所述构建体或所述核酸的结果)的植物、植物部分、种子或植 物细胞。植物、植物部分、种子或植物细胞因此包含所述重组构建体或所述重组核酸。在过去导入后不再包含所述重组构建体或所述重组核酸的任何植物、植物部分、种子或植物细 胞被称为无效分离子、无效合子或无效对照，但是不被认为是本申请意义上的用所述构建 体或所述核酸转化的植物、植物部分、种子或植物细胞。 [0158] T-DNA激活标签化 [0159] “T-DNA激活”标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子， 也可以是翻译增强子或内含子)，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新引入的启动子控 制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌 感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的经修饰的表达。因靠近所引入启动子的基因的 经修饰的表达，产生的转基因植物表现显性表型。 [0160] TILLING [0161] 术语“TILLING”是“基因组内定向诱导的局部损伤”的缩写，指用于产生和/或鉴定核酸的诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰的表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方 面或在时间方面经修饰的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由 处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选 方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992) 在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J编辑，Singapore， World Scientific Publishing Co，第16–82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编辑，Arabidopsis.Cold Spring Harb或Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172 页；Lightner J 和Caspar T(1998)在 J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods on Molecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第 91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和退火以允许形成 异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体在汇集物中的存在检测为色谱图之一额外峰； (f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的 (McCallum等，(2000)Nat Biotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2):145-50)。 [0162] 同源重组 [0163] “同源重组”允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内引入。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技 术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等，(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等，(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4； Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)进行了描述，并且不论何种目标 生物，都存在一般可用的方法(Miller等，Nature Biotechnol.25，778-785，2007)。 [0164] 产量相关性状 [0165] “产量相关性状”是与植物产量相关的性状或特征。产量相关性状可以包含一种或多种的下列非限制性的特征列表：早期开花时间、产量、生物量、种子产量、早期萌发势、绿度指数、生长速率、农艺学性状，例如对浸没的耐受性(导致增加的稻产量)如水利用效率(WUE)、氮利用效率(NUE)等。 [0166] 术语“一种或多种产量相关性状”理解为指代一株植物的一种产量相关性状、或两种、或三种、或四种、或五种、或六种、或七种、或八种、或九种、或十种、或10种以上的产量相关性状，与对照植物相比。 [0167] 本文谈及的“增强的产量相关性状”意指相对于对照植物而言，产量相关性状的增加，例如：早期萌发势、完整植物或植物的一个或多个部分的种子产量和/或生物量，所述的部分可以包括(i)地上部分，优选地上可收获部分，和/或(ii)地下部分，优选可收获的地下部分。 [0168] 特别地，这类可收获部分是根例如主根、茎、beet、块茎、叶、花或种子，且本发明方法的实施导致具有相对于对照植物的种子产量增加的种子产量，和/或相对于地上生物量增加的地上生物量，特别是相对于对照植物的茎生物量增加的茎生物量，和/或相对于对 照植物的根生物量增加的根生物量，和/或相对于对照植物的beet生物量增加的beet生 物量的植物。此外，特别理解地上部分(特别是茎(特别是甘蔗植物的茎)中和/或地下 部分(特别是根，包括主根、块茎和/或beet(特别是甜菜中))中的糖含量(特别是蔗糖 含量)相对于对照植物的相应部分中的糖含量(特别是蔗糖含量)增加。 [0169] 在整个本申请中，植物对一种或多种农业化学剂的耐受性和/或抗性(例如，除草剂耐受性)不被认为是本申请该术语含义范围内的产量相关性状。如本申请全文中使用 的，植物对一种或多种农业化学剂改变的耐受性和/或抗性，例如改善的除草剂耐受性，不是“增强的产量相关性状”。 [0170] 在本发明的特定的实施方案中，任何对一种或多种增强的产量相关性状的表述都意在排除了在植物中重建POI多肽的表达和/或活性，当相比原始野生型植物或原始活性 时，所述植物中的POI多肽的表达和/或活性已经是降低的或消除的。例如，在本发明含义 内，在植物的敲除突变体中过表达POI多肽不被认为是增强一种或多种产量相关性状，所 述突变体中已经敲除了所述POI多肽或直系同源物或旁系同源物。 [0171] 产量 [0172] 术语“产量”通常指的是经济价值的可测量结果，通常与特定的作物、与面积并且与时间段有关。基于个体植物部分的数目、大小和/或重量，个体植物部分直接对产量作出贡献，或实际产量是作物一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的产量和评估的产量)除以种植的平方米而确定。 [0173] 术语植物的“产量”和“植物产量”在本文中可互换地使用，并指的是营养体生物量如根和/或枝条生物量，指的是繁殖器官，和/或指的是繁殖体，如该植物的种子。 [0174] 玉米中的花是单性的；雄花序(雄花穗)来自顶生茎，而雌花序(穗)产生自腋芽顶点。雌花序在中心轴(穗轴)表面上产生成对的小穗。每一雌性小穗包裹两朵可育的小 花，一旦受精后，它们中的一朵通常将成熟为玉米核。因此玉米中产量的增加可以表现为以下一项或多项：每平方米已建立的植物数目增加、每株植物的穗数增加、行数、每行核粒数、核粒重、千粒重、穗长度/直径的增加、种子饱满率(其为饱满的小花(即，含有种子的小 花)数除以小花总数并乘以100)增加，及其他。 [0175] 稻植物中的花序被命名为圆锥花序。圆锥花序具有小穗，其是圆锥花序的基本单元，并且由花梗和小花组成。小花生在花梗上并且包括由两片保护性颖片：较大的颖片(外稃)和较短的颖片(内稃)所覆盖的花。因此，以稻为实例，产量增加可以表现为以下一项 或多项的增加：每平方米植物数、每株植物的圆锥花序数、圆锥花序长度、每个圆锥花序的小穗数、每个圆锥花序的花(或小花)数；种子饱满率(其为饱满的小花(即，含有种子的 小花)数除以小花总数并乘以100)增加，千粒重增加等。 [0176] 早期开花时间 [0177] 如本文所用的具有“早期开花时间”的植物是比对照植物更早开始开花的植物。因而，该术语指显示较早开始开花的植物。植物的开花时间可以通过计数播种与第一圆锥花序出现之间的日数(“至开花的时间”)进行评估。可以例如使用如WO 2007/093444中所 述的方法确定植物的“开花时间”。 [0178] 早期萌发势 [0179] “早期萌发势”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期阶段期间，并且可以因植物适应性增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和苗与根之间的分配)。具有早期萌发势的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物 建立，这往往导致高度均匀的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间 上达到发育的各阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期萌发势可以通过多种因子如 千粒重、萌发百分比、出苗百分比、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及枝条生物量和众多其它因素而确定。 [0180] 增加的生长速率 [0181] 增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生 活周期可以视为意指从成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的成熟种子的阶段 所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如发芽的速度、早期萌发势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期之一或多个阶 段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速 率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种 和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率 充分地增加，可以允许再播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并 收获其它稻植物，全部均在一个常规生长时段内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许再播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大 豆、马铃薯或任何其它合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米的年生物量产量的增加(因任何特定 植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生 型对应物而言在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由 栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可 以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可 以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺 寸所花费的时间)，等等。 [0182] 种子产量 [0183] 增加的种子产量可以本身表现为以下一项或多项： [0184] a)种子生物量(总种子重量)的增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米； [0185] b)每株植物增加的花数； [0186] c)增加的种子数； [0187] d)增加的种子饱满率(其表示为饱满小花数除以小花总数之间的比率)； [0188] e)增加的收获指数，其表示为可收获部分(如种子)的产量除以地上的植物部分生物量的比率；和 [0189] f)增加的千粒重(TKW)，其从计数的种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以由增加的种子尺寸和/或种子重量导致，并且也可以由胚尺寸和/或胚乳尺寸增加导致。 [0190] 可认为术语“饱满小花”和“饱满种子”是同义词。 [0191] 种子产量的增加也可以表现为种子尺寸和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加也可以自身表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增 加。 [0192] 绿度指数 [0193] 如本文所用的“绿度指数”根据植物的数字图像计算。对于图像中属于植物目标的每一个像素，计算绿色值相对于红色值(在用于编码颜色的RGB模型中)之比。绿度指 数表达为绿红比超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下、在盐胁迫生长条件下、及在养分利用度减少的生长条件下，测量开花前末次成像时的植物绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，测量干旱后首次成像时的植物绿度指数。 [0194] 生物量 [0195] 如本文中所用的术语“生物量”意图指植物的总重量。在生物量的定义中，在植物的一个或多个部分的生物量之间可以进行区分，所述植物的一个或多个部分可以包括下述的一种或多种： [0196] -地上部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等等； [0197] -地上可收获部分，例如但不限于枝条生物量、种子生物量、叶生物量等等； [0198] -地下部分，例如但不限于根生物量、块茎、鳞茎等等； [0199] -地下可收获部分，例如但不限于根生物量、块茎、鳞茎等等； [0200] -部分低于地面的可收获部分，例如但不限于甜菜根(beet)和植物的其他下胚轴面积、根状茎、匍匐茎或蔓延的根茎； [0201] -营养体生物量例如根生物量、枝条生物量等等； [0202] -繁殖器官，和 [0203] -繁殖体，例如种子。 [0204] 根 [0205] 在本申请全文的优选的实施方案中，任何提及“根”作为生物量或可收获部分或器官的表述，例如增加的糖含量，都理解为对部分插入地面或与地面物理接触的可收获部分的表述，例如但不限于beet和植物的其他下胚轴区域、根状茎、匍匐茎或走茎，以及低于地面的可收获部分，例如但不限于根、主根、块茎或球茎，但不包括叶。 [0206] 胁迫抗性 [0207] 与对照植物相比，无论植物处于非胁迫条件下或无论植物暴露于多种胁迫，发生产量和/或生长速率的增加。植物一般通过生长得更慢而应答暴露于胁迫。在严重胁迫的 情况下，植物甚至可能完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何胁迫，其不导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻度胁迫在本发明的意义下导致受胁迫植物的生长减少小于40％、35％、30％或25％、更优选地小于20％或15％。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，栽培的作物 植物中并不经常遭遇严重胁迫。因此，由轻度胁迫引起的受损生长往往是对农业而言不受 欢迎的特征。非生物胁迫可以因干旱或水过量、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。 [0208] “生物胁迫”理解为是由其他活的生物体对植物的负面影响，例如细菌、病毒、真菌、线虫、昆虫、其他动物或其他植物。“生物胁迫”一般是由病原体如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫，可以导致对植物生长和/或产量的负面作用。 [0209] “非生物胁迫”理解为是在特定环境中，由无生命的因素对活的植物的负面影响。“非生物胁迫”可以是因水胁迫(尤其归因于干旱)、盐胁迫或冷冻胁迫引起的渗透 胁迫。非生物性胁迫也可以是氧化胁迫或寒冷胁迫。“冷冻胁迫”意指归因于冰冻温度 (即，可用水冷冻并变成冰的温度)的胁迫。“寒冷胁迫”，也称作“低温胁迫”意指寒冷温度，例如，10°以下或优选地5℃以下的温度，但是在所述温度上水分子不冻结。如Wang 等人(Planta(2003)218:1-14)中所报道，非生物性胁迫导致一系列不利影响植物生长及 生产力的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的，并且可以通过相似的机制引起生长损害及细胞损害。Rabbani等人(Plant Physiol(2003)133:1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间特别高程度的“串话”。 例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。 氧化胁迫，其经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫，可以造成功能蛋白和结构蛋白变性。 因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋 白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长抑制。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚给定地点的正常土壤条件和气候 条件。伴有最佳生长条件(在非胁迫条件下培育)的植物一般以递增的优选顺序产生该植 物在给定环境中至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、80％、77％或75％的平均产量。平均产量可以基于收获量和/或季节计算。本领域技术人员清楚作物的平均生产产量。 [0210] 增加/改善/增强 [0211] 术语“增加”、“改善”或“增强”在产量相关性状的上下文中是可互换的，并且在本申请的含义下应当指与如本文中定义的对照植物相比，产量相关性状增加至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选地至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多。 [0212] 标记辅助的育种 [0213] 这种育种程序有时需要通过使用例如EMS诱变法对植物作诱变处理而引入等位基因变异；备选地，该程序可以从非故意引起的所谓“自然”起源的等位变体集合开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是用于选择所讨论序列的优选等位变体且 其导致增加的产量的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性 能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其它任选步骤包括将鉴定到有优选等 位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。 [0214] 探针在(遗传作图)中的用途 [0215] 编码目的蛋白质的核酸用于遗传和物理作图，该基因仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。这些核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的 植物基因组DNA的Southern印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)可以用编码目的蛋白质的核酸序列来探测。产生的条带 图谱随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)进行遗 传分析以构建遗传图。此外，该核酸序列可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一 组个体的基因组DNA的Southern印迹，其中所述的一组个体代表具有确定的遗传杂交的亲 代和后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码目的蛋白质的核酸在使用这个群体先 前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。 [0216] 在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的 方法学或其改进方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、近等基因系和其它个体的组可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。 [0217] 所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996，第 319-346页及其中引用的参考文献)。 [0218] 在另一个实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型 克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改进可 以允许使用更短探针进行FISH作图。 [0219] 用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸序列扩增的方法可以使用所述核酸序列而实施。例子包括等位基因特异的扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、 PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等(1993)Genomics 16：325-332)、等位基因特异 性连接(Landegren等(1988)Science241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990) Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等(1997)Nat.Genet.7：22-28)和 Happy作图(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.17：6795-6807)。对于这些方法，使用 核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计 是本领域技术人员众所周知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能必须鉴定在对应 于当前核酸序列的整个区域内作图亲代间的DNA序列差异。然而，这对于作图法而言通常 不是必需的。 [0220] 植物 [0221] 如本文中所用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。 [0222] 对照植物 [0223] 合适的对照植物的选择是实验设计的例行部分，并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物种类或甚至是与待评估植物相同的 品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子(或失效对照植物)是通过 分离而丢失转基因的个体。此外，对照植物在与本发明植物的生长条件等同的生长条件下 (即在本发明植物的附近，并与本发明植物同时)生长。如本文中所用的“对照植物”不仅 指整个植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。 [0224] 繁殖材料 [0225] “繁殖材料”是植物的任何类型的器官、组织或细胞，其能够发育为完整的植物。“繁殖材料”可以基于营养繁殖(也被称为营养扩增、营养扩繁、或营养克隆)或有性繁殖。 因此，繁殖材料可以是种子或非繁殖器官的一部分，如茎或叶。特别的是，对于禾本科，合适的繁殖材料还可以是茎的切片，即，扦插枝(如setts)。 [0226] 秸秆 [0227] “秸秆”是禾本科的茎，也被称为“有效茎(millable cane)”，特别是对于甘蔗属物种，如甘蔗。在禾本科的上下文中，“秸秆”、“茎”、“芽”或“分蘖”可互换的使用。 [0228] Sett [0229] “Sett”是禾本科，特别是甘蔗属物种，如甘蔗，的茎的切片，适合用作繁殖材料。“Sett”的同义表述是“seed-cane”、“扦插枝”、“茎切片”和“插条”。 [0230] 在下文中，表达法“如权利要求/项目X中所定义”意为指导技术人员应用如项目/权利要求X中所公开的定义。例如，应当理解“如项目1中所定义的核酸”使得如项目1 中的核酸的定义应用于核酸。因此术语“如项目中所定义”或“如权利要求中所定义”可以分别用该项目或权利要求的相应的定义替换。 [0231] 发明详述 [0232] 本发明显示了使用特定类型的启动子和质体靶向在植物中增加编码黄素氧还蛋白多肽的黄素氧还蛋白核酸的表达，获得了相对于对照植物，具有一种或多种增强的产量 相关性状的植物。 [0233] 下文中任何关于“可用于本发明方法中的蛋白质”的指代都意味着本文定义的黄素氧还蛋白多肽。下文中任何关于“可用于本发明方法中的核酸”的指代都意味着能够编 码这类具有质体靶向的黄素氧还蛋白多肽的核酸。在一个实施方案中，任何关于“可用于本发明方法中”的蛋白质或核酸被理解为表示“可用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产品中”的蛋白质或核酸。待导入到植物中的核酸(并且因此可用于实施本发明的方 法)是编码目前将描述的蛋白质类型的任何核酸，在下文中也被称为“POI核酸”或“POI基因”或“黄素氧还蛋白核酸”或“黄素氧还蛋白基因”，优选编码所述蛋白质含有植物质体靶向信号。 [0234] 本文中任何关于“特定启动子”的指代都被理解为表示本文定义的GOS2启动子。 [0235] 因此，编码黄素氧还蛋白多肽的黄素氧还蛋白核酸可用于本发明的遗传构建体、方法、植物、可收获部分和产物中。优选的，黄素氧还蛋白核酸是包括选自以下的核酸的分离的核酸分子： [0236] (i)以递增的优先度与SEQ ID NO:1、13或15所示的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、 66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物； [0237] (ii)任一条(i)所述核酸的互补序列； [0238] (iii)编码这样的黄素氧还蛋白多肽的核酸，所述黄素氧还蛋白多肽以递增的优先度与SEQ ID NO:2或16所示的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、 56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、 71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物；优选的，黄素氧还蛋白多肽产生相对于对照植物的一种或多种增强的产量相关性状；和 [0239] (iv)在严格的杂交条件下，与(i)至(iii)的核酸分子杂交的核酸分子。 [0240] 更优选的，分离的黄素氧还蛋白核酸包含选自以下的核酸： [0241] (i)以递增的优先度与SEQ ID NO:1、13或15所示的核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少 99％或至少100％的序列同一性的核酸； [0242] (ii)任一条(i)所述核酸的互补序列； [0243] (iii)编码这样的黄素氧还蛋白多肽的核酸，所述黄素氧还蛋白多肽以递增的优先度与SEQ ID NO:2或16所示的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少 93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性；优选的，所述黄素氧还蛋白多肽产生相对于对照植物的一种或多种增强的产量相 关性状；和 [0244] (iv)在严格的杂交条件下，与(i)至(iii)的核酸分子杂交的核酸分子。 [0245] 核酸的同一性百分比是针对本文具体公开的序列中给出的整个核苷酸区域的。 [0246] 在优选的实施方案中，用于本发明方法、载体构建体、植物、可收获部分和产物中的黄素氧还蛋白核酸编码这样的多肽，所述多肽包含表B中列举的一个或多个结构域和基序，更优选PFAM结构域PF00258，优选当用实施例2所述的InterproScan软件分析时。更 优选的是表B中列举的一个或多个结构域和/或基序在黄素氧还蛋白多肽的多肽序列中的 分布和/或顺序与图1的SEQ ID NO:2所示的序列基本相同。 [0247] 最优选的，分离的黄素氧还蛋白核酸包括SEQ ID NO:1、13或15，所示的序列，或其互补序列，或者包括编码SEQ ID NO:2或16的黄素氧还蛋白多肽的核酸，或者包括在严格的杂交条件下与任一条所述核酸分子或其互补序列杂交的核酸分子，或由所述核酸组成， 所述序列优选编码包含表B中列举的一个或多个结构域或基序的多肽，更优选PFAM结构域 PF00258，优选当用实施例2所述的InterproScan软件分析时。 [0248] 优选的黄素氧还蛋白核酸描述在表2和/或序列表中。在一个实施方案中，黄素氧还蛋白核酸包括表2和/或序列表提及的核酸序列。最优选的黄素氧还蛋白核酸是包含 项圈藻物种(Anabaena)，优选项圈藻PCC7119，或集胞藻物种(Synechocystis sp.)，优选 集胞藻PCC 6803的黄素氧还蛋白基因的核酸序列。最优选的黄素氧还蛋白核酸是包含项 圈藻物种(Anabaena)的黄素氧还蛋白基因的核酸序列，优选项圈藻PCC7119。 [0249] 在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的方法、载体构建体、植物、可收获部分和产物，包括SEQ ID NO:13公开的项圈藻的密码子优化的黄素氧还蛋白基因，其编码SEQID NO:2的黄素氧还蛋白，或其本文所述的功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物，其中所述黄素氧还蛋白多肽、功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物与本文所述的转运肽相连，并与适于在植物中表达的启动子功能相连。除SEQ ID NO:7公开的启动子以外的 合适的启动子是本领域已知的。 [0250] 在一个实施方案中，本发明涉及本文所述的方法、载体构建体、植物、可收获部分和产物，包括SEQ ID NO:15公开的集胞藻PCC 6803的黄素氧还蛋白基因，或编码SEQ IDNO:16的黄素氧还蛋白，或其本文所述的功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物，其中所述黄素氧还蛋白多肽、功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物与本文所述的转运肽相连，并与适于在植物中表达的启动子功能相连。除SEQ ID NO:7公开的启动子以外的合 适的启动子是本领域已知的。编码的多肽序列如SEQ ID NO:16和18所示，分别有或无豌 豆FNR转运肽。 [0251] 其他可用于实践本发明方法的核酸包括编码黄素氧还蛋白多肽的核酸部分、编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的功能片段、与编码黄素氧还蛋白多肽的核酸杂交的核酸、编码 黄素氧还蛋白多肽的核酸的剪切变体、编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的等位变体，和通过 基因改组获得的编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的变体。术语杂交序列、剪切变体、等位变体和基因改组如本文所述。 [0252] 编码黄素氧还蛋白多肽的核酸不必是全长核酸，因为本发明方法的实施不总是依赖于使用全长核酸序列。根据本发明，提供了用于增强植物的一种或多种产量相关性状的 方法，包括在植物中导入和表达表2和/或序列表给出的任一条核酸序列的功能片段，或编 码表2和/或序列表给出的任一条氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸 的一部分。 [0253] 例如，可以通过使核酸产生一个或多个缺失，来制备核酸的片段。部分可以使用分离的形式，或者可以与其他编码(或非编码)序列融合，从而例如生产组合了若干活性的蛋白质。当与其他编码序列融合时，翻译后获得的多肽可以大于预测的蛋白质部分。 [0254] 本文所述的黄素氧还蛋白核酸的片段编码本文定义的黄素氧还蛋白多肽，或其至少一部分，所述部分具有与表2和/或序列表给出的氨基酸序列基本相同的生物学活性。优 选的，部分是表2和/或序列表给出的任一条核酸的一部分，或者是编码表2和/或序列表 给出的任一条氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选的，部分是在 表2和/或序列表给出的任一条核酸序列的长度中，长度为至少约100、至少约200、至少约 300、至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000或更多个核苷酸，优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’至3’端计算。优选的，黄素氧还蛋白核酸包括SEQ ID NO:1、13或15述核酸序列的至少约100、至少约200、至少约300、至少 约400、至少约500个核苷酸，优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’至3’端计算，或者达到所述核酸序列的全长。 [0255] 优选的，黄素氧还蛋白核酸的部分是在表2和/或序列表给出的核酸序列的长度中，约400-425、约425-450、约450-475、约475-500、约500-525、约525-550、约550-575、约575-600、约625-650、约650-675、约675-700、约700-725、约725-750、约750-775、 约775-800、约800-825、约825-850、约850-875、约875-900、约925-950、约950-975、约 975-1000个核苷酸，优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’至3’端计算。优选的，黄素氧还蛋白核酸的部分是SEQ ID NO:1、13或15所述核酸序列的约400-425、约425-450、约450-475、约475-500个核苷酸，优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’至3’端计算，或者达到所述核酸序列的全长。 [0256] 另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下，优选在严格条件下，更优选在高严格条件下，与本文定义的编码黄素氧还蛋白多肽的核酸，或与本文定义的部分或其互补序 列杂交的核酸。 [0257] 杂交序列能够与表2和/或序列表给出的任一核酸的互补序列杂交，或与任何这些序列的一部分杂交，所述部分如本文所定义的，或者杂交序列能够与编码表2和/或序列 表给出的任一条核酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的互补序列杂交。最优选的， 杂交序列能够与SEQ ID NO:1、13或15给出的核酸的互补序列，或与SEQ ID NO:2或16所 示多肽的编码核酸的互补序列，或其部分杂交。在一个实施方案中，杂交条件是本文定义的中等严格的，优选高严格的。 [0258] 优选的，杂交序列编码具有这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含SEQID NO:2或16。 [0259] 优选的剪切变体是SEQ ID NO:1、13或15所示核酸的剪切变体，或编码SEQ IDNO:2或16的旁系同源物或直系同源物的核酸的剪切变体。 [0260] 此外，还可以通过定点诱变获得核酸变体。一些方法可用于实现定点诱变，最常见的是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著)。通过一个或几个氨基酸(取代、插入和/或缺失，如上所定义的)而不同于SEQ ID NO:2或16的 序列的黄素氧还蛋白多肽可等价地用于在本发明的方法和构建体和植物中增加植物产量。 [0261] 编码黄素氧还蛋白多肽的核酸可源自任何天然的或人工的来源。核酸可以是通过特意的人为操作，从组合物和/或基因组环境中的天然形式修饰而来的。优选的，黄素氧还蛋白多肽-编码核酸来自细菌，优选来自蓝细菌(cyanobacterium)，更优选来自项圈藻。 [0262] 在另一个实施方案中，本发明扩展至重组染色体DNA，其包含在本发明方法中有用的核酸序列，其中所述核酸作为重组方法的结果存在于染色体DNA中，但是不在其天然遗传环境中。在另一个实施方案中，本发明的重组染色体DNA包含在植物细胞中。细胞、特别是具有细胞壁的细胞，例如植物细胞，中包含的DNA比裸露的核酸序列被更好地保护免于 降解。对于宿主细胞，例如植物细胞中包含的DNA构建体而言也是如此。 [0263] 在优选的实施方案中，本发明涉及包含本发明的重组染色体DNA和/或本发明的构建体和宿主细胞，优选植物细胞的组合物，其中重组染色体DNA和/或构建体包含在所述 宿主细胞内，优选在植物细胞或具有细胞壁的宿主细胞内。在其他实施方案中，所述组合物包含死亡的宿主细胞、活的宿主细胞或死亡的和活的宿主细胞的混合物，其中本发明的重 组染色体DNA和/或构建体可以位于死亡的宿主细胞和/或活的宿主细胞内。任选的，组 合物可包括不含本发明的重组染色体DNA或本发明的构建体的其他宿主细胞。本发明的组 合物可用于扩增或分配本发明的重组染色体DNA和/或构建体的方法中，或者可选的，用于 保护本发明的重组染色体DNA和/或构建体免受上文所解释的破坏和/或降解。本发明的 重组染色体DNA和/或构建体可用作本发明的组合物的质量标志物，作为原始指标和/或 生产者的指标。 [0264] 本文所述的黄素氧还蛋白多肽可用于本发明的遗传构建体、方法、植物、可收获部分和产物中。优选的，黄素氧还蛋白多肽是细菌的黄素氧还蛋白多肽，例如蓝细菌的黄 素氧还蛋白多肽，如项圈藻PCC7119的黄素氧还蛋白(Fillat M.等人，(1991)Biochem J.280187-191)，或SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:16公开的集胞藻黄素氧还蛋白。其他合适 的黄素氧还蛋白多肽包括来自光合成的不产氧细菌、肠道菌、固氮菌和藻类的黄素氧还蛋 白。表2和/或序列表中示例了适用于本发明的编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的例子。虽 然野生型黄素氧还蛋白多肽是优选的，但黄素氧还蛋白多肽也可以是这类野生型序列的片 段、变体、衍生物、变体或等位基因。 [0265] 合适的片段、变体、衍生物、变体或等位基因是保留了野生型黄素氧还蛋白基因编码的多肽的功能特征的对象，尤其是其作为抗氧化剂发挥作用的能力。为了产生突变体、变体或衍生物，可以通过核酸中的一个或多个核苷酸的一个或多个添加、插入、缺失或替换，导致所编码多肽中的一个或多个氨基酸的添加、插入、缺失或替换，改变序列。当然，对编码的氨基酸序列不产生差异的核酸改变也包括在内。 [0266] 作为黄素氧还蛋白家族的成员或其氨基酸序列变体、等位基因、衍生物或突变体的多肽可以包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与编码表2和/或序列表所示的黄素 氧还蛋白核酸编码的黄素氧还蛋白多肽享有大于约30％序列同一性、大于约35％序列同 一性、大于约40％序列同一性、大于约45％序列同一性、大于约55％序列同一性、大于约 65％序列同一性、大于约70％序列同一性、大于约80％序列同一性、大于约90％序列同一 性、大于约95％序列同一性、大于约96％序列同一性、大于约97％序列同一性、大于约98％序列同一性、或大于约99％序列同一性。 [0267] 作为黄素氧还蛋白家族的成员或其氨基酸序列变体、等位基因、衍生物或突变体的多肽可以包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与项圈藻PCC7119黄素氧还蛋白的氨 基酸序列享有大于约30％序列同一性、大于约35％序列同一性、大于约40％序列同一性、 大于约45％序列同一性、大于约55％序列同一性、大于约65％序列同一性、大于约70％序 列同一性、大于约80％序列同一性、大于约90％序列同一性、大于约95％序列同一性、大于约96％序列同一性、大于约97％序列同一性、大于约98％序列同一性、或大于约99％序列 同一性。 [0268] 在某些实施方案中，黄素氧还蛋白多肽可显示与项圈藻PCC7119黄素氧还蛋白序列(SEQ ID NO:2)或集胞藻黄素氧还蛋白(SEQ ID NO:16)很小的整体同源性，换言之约 20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％，但是其具有基本相同的抗氧化活性。然而，在功能上显著的结构域或区域中，氨基酸同源性可以更高。例如，黄素氧还蛋白多肽包含与黄素氧还蛋白FMN结合结构域(黄素氧还蛋白样结构域)具有高同源性的 FMN-结合结构域。可以使用生物信息学方法，鉴别假定的功能显著的结构域或区域，包括比较序列同源性。在优选的实施方案中，可用于本发明方法、植物、可收获部分和产物的黄素氧还蛋白多肽是包含表B列举的一个或多个结构域和基序的多肽，更优选包含PFAM结构域 PF00258，优选当用实施例2所述的InterproScan软件分析时。更优选的是表B中列举的 一个或多个结构域和/或基序在黄素氧还蛋白多肽的多肽序列中的分布和/或顺序与图1 的SEQ ID NO:2所示的序列基本相同。 [0269] 最优选的作为黄素氧还蛋白多肽的是这样的多肽，所述多肽包括由表2和/或序列表中给出的任一核酸序列编码的黄素氧还蛋白，优选项圈藻物种，优选项圈藻PCC7119，或集胞藻物种，优选集胞藻PCC6803，更优选分别由SEQ ID NO:1、13或15公开的核酸编码 的SEQ ID NO:2或16的多肽，最优选SEQ ID NO:2的多肽，或由上述多肽组成。 [0270] 优选的，黄素氧还蛋白多肽是包含选自以下多肽的多肽： [0271] (i)以递增的优先度与SEQ ID NO:2或16所示的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、 67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％的序列同一性的多肽，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物；优选地，所述黄素氧还蛋白多肽产生相对于对照植物的一种或多种增强的产量相 关性状； [0272] (ii)由这样的核酸编码的多肽，所述核酸以递增的优先度与SEQ ID NO:1、13或15所示的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、 75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物；优选地，所述黄素氧还蛋白多肽产生相对于对照植物的一种或多种增强的产量相关性状。 [0273] 更优选的，黄素氧还蛋白多肽是包含选自以下多肽的多肽： [0274] (i)以递增的优先度与SEQ ID NO:2或16所示的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性的多肽，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物； [0275] (ii)由这样的核酸编码的多肽，所述核酸以递增的优先度与SEQ ID NO:1、13或15所示的核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性的多肽，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物。优选地，所述黄素氧还蛋白多肽产生相对于对照植物的一种或多种增强的产量相关性状，优选的对照植物不表达黄素氧还蛋白多肽。 [0276] 多肽或蛋白质的同一性百分比是针对本文具体公开的完整氨基酸序列的。 [0277] 优选的，黄素氧还蛋白多肽包括SEQ ID NO:2或16所述氨基酸序列的至少约50、至少约75、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约145、至少约 150、至少约155、至少约160、至少约165、或至少约167个氨基酸，优选连续的氨基酸，优选从氨基酸的N端至C端计算，或者达到所述氨基酸序列的全长。优选的，黄素氧还蛋白多肽 具有与SEQ ID NO:2或16基本相同的生物学活性。优选的，黄素氧还蛋白多肽赋予相对于 对照植物的一种或多种增强的产量相关性状，优选相对于不表达黄素氧还蛋白多肽的对照 植物。 [0278] 优选的，黄素氧还蛋白多肽包括由表2和/或序列表所述核酸序列编码的任一氨基酸序列的至少约50、至少约75、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约 140、至少约145、至少约150、至少约155、至少约160、至少约165、或至少约167个氨基酸，优选连续的氨基酸，优选从氨基酸的N端至C端计算，或者达到所述氨基酸序列的全长。优 选的，黄素氧还蛋白多肽具有与表2和/或序列表的相应序列基本相同的生物学活性。优 选的，黄素氧还蛋白多肽赋予相对于对照植物的一种或多种增强的产量相关性状，优选相 对于不表达黄素氧还蛋白多肽的对照植物。 [0279] 优选的，黄素氧还蛋白多肽包括由表2和/或序列表所述核酸序列编码的任一氨基酸序列的约50-75、约75-100、约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约 140-150、约150-160、约160-170个氨基酸，优选连续的氨基酸，优选从氨基酸序列的N端至C端计算，或者达到所述氨基酸序列的全长。优选的，黄素氧还蛋白多肽具有与表2和/或 序列表的相应序列基本相同的生物学活性。优选的，黄素氧还蛋白多肽赋予相对于对照植 物的一种或多种增强的产量相关性状，优选相对于不表达黄素氧还蛋白多肽的对照植物。 [0280] 优选的，黄素氧还蛋白多肽包括SEQ ID NO:2或16所述氨基酸序列的约50-75、约75-100、约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约140-150、约150-160、约 160-170个氨基酸，优选连续的氨基酸，优选从氨基酸序列的N端至C端计算，或者达到所述氨基酸序列的全长。优选的，黄素氧还蛋白多肽具有与SEQ ID NO:2或16基本相同的生物 学活性。优选的，黄素氧还蛋白多肽赋予相对于对照植物的一种或多种增强的产量相关性 状，优选相对于不表达黄素氧还蛋白多肽的对照植物。 [0281] 更优选的，分离的黄素氧还蛋白多肽包括SEQ ID NO:2，或由SEQ ID NO:2组成，或者是由具有SEQ ID NO:1、13或15的核酸编码，优选的黄素氧还蛋白多肽赋予相对于对照植物的一种或多种增强的产量相关性状。 [0282] 由可用于本发明方法中的等位变体编码的多肽具有与SEQ ID NO:2和由表2和/或序列表所述核酸序列编码的任一氨基酸序列基本相同的生物学活性。等位变体是自然存 在的，并且本发明的方法中涵盖了这些天然等位基因的应用。优选的，等位变体是SEQ ID NO:1、13或15的等位变体，或由SEQ ID NO:2或16的旁系同源物或直系同源物编码的核酸 的等位变体。 [0283] 在另一个实施方案中，相比SEQ ID NO:2或16，可用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物的多肽序列具有替换、缺失和/或插入，其中氨基酸替换、插入和/或缺失的范围可以分别是1至10个氨基酸。 [0284] 本发明还提供了包含黄素氧还蛋白核酸的遗传构建体，如表达构建体或表达盒，或载体构建体。优选的，遗传构建体适用于在植物、植物部分或植物细胞中导入和/或表达编码黄素氧还蛋白多肽的核酸。表达构建体可以插入到可商购的载体构建体中，所述载体 适合转化到植物或宿主细胞中，并适合在转化细胞中表达目的基因。本发明还提供了本文 定义的遗传构建体在本发明方法中的用途。因此，本发明的另一个实施方案是包含黄素氧 还蛋白核酸的表达构建体或表达盒。 [0285] 本发明的遗传构建体可以包含在宿主细胞、植物细胞、种子、农业产品或植物或植物部分。用遗传构建体转化植物或宿主细胞，如包含本文所述的任一黄素氧还蛋白核酸的载体构建体或表达构建体。 [0286] 在一个实施方案中，当被导入到所述植物中时，本发明的遗传构建体赋予植物增加的产量或产量相关性状，所述植物表达包含在遗传构建体中的编码黄素氧还蛋白多肽的 核酸。在另一个实施方案中，本发明的遗传构建体赋予包含植物细胞的植物增加的产量或 产量相关性状，所述植物细胞中已经导入了构建体，所述植物细胞表达编码包含在遗传构 建体中的黄素氧还蛋白多肽的核酸。 [0287] 本领域技术人员普遍已知，为了成功的转化、挑选和扩增含有目标序列的宿主细胞，所述遗传元件必须存在于遗传构建体中。 [0288] 更具体而言，本发明提供了这样的表达构建体，其包括： [0289] (a)编码黄素氧还蛋白多肽的黄素氧还蛋白核酸； [0290] (b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列，其中所述控制序列优选是启动子序列；任选的 [0291] (c)转录终止序列。 [0292] 最优选的，本发明提供了这样的表达构建体，其包括： [0293] (a)编码上文定义的黄素氧还蛋白多肽的黄素氧还蛋白核酸； [0294] (b)编码转运肽的转运核酸序列； [0295] (c)与(a)和(b)的核酸有效连接的启动子序列，其中所述启动子序列包括GOS2启动子，优选稻的GOS2启动子，或其功能片段或变体或同源物、直系同源物或旁系同源物； 和任选的 [0296] (d)转录终止序列。 [0297] 优选的，表达构建体的黄素氧还蛋白核酸包括任一本文所述的黄素氧还蛋白核酸，优选如表2和/或序列表所述，或其功能片段或变体或同源物、直系同源物或旁系同源 物。优选的，转运核酸选自编码任一本文所述转运肽的核酸序列，优选如表3所述，或其功能片段或变体或同源物、直系同源物或旁系同源物。 [0298] 优选的，启动子序列包括本文所述的启动子序列，优选GOS2启动子，优选稻的GOS2启动子，或其功能片段或变体或同源物、直系同源物或旁系同源物。 [0299] 在优选的实施方案中，本申请全文任何对GOS2启动子的参考应当理解为指处于其天然遗传环境的启动子控制编码GOS2基因的核酸的表达。优选地所述启动子来自双子 叶或单子叶植物，更优选地来自禾本科植物，甚至更优选地来自稻并且最优选地是具有如 SEQ ID NO:7中公开的序列的启动子，或启动子是其合成修饰的形式，优选地SEQ ID NO:22和23中显示的启动子或其衍生物。 [0300] 优选的，表达构建体的黄素氧还蛋白核酸包括选自以下的核酸： [0301] (i)以递增的优先度与SEQ ID NO:1、13或15所示的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少 99％或至少100％的序列同一性的核酸，其中核酸优选具有与SEQ ID NO:2或16基本相同 的生物学活性，优选的，其中核酸编码赋予相对于对照植物的一种或多种增强的产量相关 性状的黄素氧还蛋白多肽； [0302] (ii)任一条(i)所述核酸的互补序列； [0303] (iii)编码这样的黄素氧还蛋白多肽的核酸，所述黄素氧还蛋白多肽以递增的优先度与SEQ ID NO:2或16所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少 93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性，优选的，所述黄素氧还蛋白多肽产生相对于对照植物的一种或多种增强的产量相 关性状；和 [0304] (iv)在严格的杂交条件下，与(i)至(iii)的核酸分子杂交的核酸分子，其中核酸优选具有与SEQ ID NO:2或16基本相同的生物学活性，优选的，其中核酸编码赋予相对于 对照植物的一种或多种增强的产量相关性状的黄素氧还蛋白多肽。 [0305] 最优选的，表达构建体的黄素氧还蛋白核酸包括以下核酸，或由以下核酸组成，所述核酸是SEQ ID NO:1、13或15，或其互补序列，编码具有SEQ ID NO:2或16的黄素氧还蛋白多肽的核酸，或在严格的杂交条件下与任一这些核酸分子杂交的核酸分子。 [0306] 另一个实施方案涉及可用于本发明方法、载体构建体、植物、可收获部分和产物的遗传构建体，其中遗传构建体包括与本文公开的启动子功能相连的本发明的黄素氧还蛋白核酸，并且还与一个或多个的以下元件功能相连： [0307] 1)表达增强性核酸的核酸(NEENA)： [0308] a)如作为WO2011/023537公开的国际专利申请中的第27-28页的表1和/或SEQID NO:1至19和/或所述国际申请的权利要求1的i)至vi)项中定义所公开的，所述NEENA 通过引用整合到本文中；和/或 [0309] b)如作为WO2011/023539公开的国际专利申请中的第27页的表1和/或SEQ IDNO:1至19和/或所述国际申请的权利要求1的i)至vi)项中定义所公开的，所述NEENA 通过引用整合到本文中；和/或 [0310] c)包含在或公开在 [0311] i)2011年7月6日提交的欧洲优先权申请EP 11172672.5中的第27页的表1和/或SEQ ID NO:1至14937，优选SEQ ID NO:1至5，14936至14937，和/或所述欧洲优先权 申请的权利要求1的i)至v)项中定义的，所述NEENA通过引用整合到本文中；和/或 [0312] ii)2011年7月6日提交的欧洲优先权申请EP 11172825.9中的第27页的表1和/或SEQ ID NO:1至65560，优选SEQ ID NO:1至3，和/或所述欧洲优先权申请的权利要求 1的i)至v)项中定义的，所述NEENA通过引用整合到本文中；和/或 [0313] d)具有基本相同的增强效果的等价物； [0314] 和/或 [0315] 2)与一个或多个可靠性增强核酸(RENA)分子功能相连 [0316] a)包含在或公开在2011年9月15日提交的、作为EP 11181420.8公开的欧洲优先权申请中的第26页的表1和/或SEQ ID NO:1至16或94至116666，优选SEQ ID NO:1 至16，和/或所述欧洲优先权申请的权利要求1的i)至v)项中定义所公开的，所述RENA 分子通过引用整合到本文中；和/或 [0317] b)具有基本相同的增强效果的等价物。 [0318] 本发明的优选的实施方案涉及可用于本发明方法、载体构建体、植物、可收获部分和产物的遗传构建体，包括处于上文所述启动子控制下的编码本发明的黄素氧还蛋白多肽的核酸，其中NEENA、RENA和/或启动子与本发明的黄素氧还蛋白核酸分子是异源的。 [0319] 本文所述的遗传构建体样表达构建体和本文所述的载体构建体可用于本发明方法、载体构建体、植物、可收获部分和产物中。 [0320] 优选的，当其如本文所述稳定的导入到植物中时，产生一种或多种产量相关性状的增加。优选的，携带了本发明的构建体的植物在非胁迫条件、干旱条件或氮缺陷条件下，更优选在非胁迫条件下，表现出一种或多种产量相关性状的增加。 [0321] 对于本文所述的核酸而言，本文所述的遗传构建体中的启动子可以是天然的，或者可以是非天然的启动子，即，在天然的遗传环境中，不调控所述核酸表达的启动子。 [0322] 有利的是，任何类型的启动子，无论是天然的或合成的，可用于驱动SEQ IDNO:13,14,15或17的核酸序列的表达，但优选地启动子是植物来源的。优选地，启动子是组成型的或遍在的启动子、受发育调控的启动子、诱导型启动子、器官特异性或组织特异性的启动子，优选地根特异性启动子、种子特异性启动子、胚乳特异性启动子、胚特异性启动子、胚特异性启动子、糊粉特异性启动子、绿组织特异性启动子、茎特异性、叶特异性或分生组织特异性启动子。 [0323] 有利的是，本文定义的GOS2启动子导致比任何其他启动子更强的一种或多种产量相关性状的增加，不论是天然的或合成的，如组成型或遍在型启动子、发育调控型启动 子、诱导型启动子、器官特异性或组织特异性启动子，例如根特异性启动子、种子特异性启动子、内胚层特异性启动子、胚特异性启动子、糊粉层特异性启动子、绿色组织特异性启动子、茎特异性启动子、叶特异性启动子或分生组织特异性启动子。 [0324] 在一个实施方案中，GOS2启动子是组成型启动子，与SEQ ID NO:7所示启动子具有基本相同的时间和/或空间表达模式和/或基本相同的表达强度，优选是植物起源的或 合成的。 [0325] 优选地，使用GOS 2启动子，其中GOS 2启动子是中等表达强度的组成型启动子，与SEQ ID NO:7中显示的来自稻的GOS2启动子相关。更优选地，与编码如本文定义的转运 肽和黄素氧还蛋白的核酸有效连接的启动子序列包含GOS2启动子，优选地来自稻的GOS2 启动子或其合成修饰的形式，诸如公开于作为WO2012077020公开的国际专利申请中公开 的SEQ ID NO:22&23中的启动子，作为所述申请的SEQ ID NO:14和15以及第6&7页中描述 的相关的序列(并入本文)，或来自稻的GOS 2启动子的功能性片段或变体或同源物、直向 同源物或旁系同源物。更优选地，启动子序列由GOS2启动子，优选地，来自稻的GOS2启动子(公开于Pater等人,Plant J Nov；2(6):837-44,1992和国际申请WO 2004/065596)，或其 功能性片段或变体或同源物、直向同源物或旁系同源物组成，并且甚至更优选地启动子具 有SEQ IDNO:7,22或23的序列。在一个实施方案中，优选的启动子功能片段或等价物以递 增的优先度与SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7所示的核酸序列具有至少50％、 至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少 99％或者甚至100％的序列同一性。 [0326] 优选的，启动子序列的一部分是SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7的功能部分。优选的，所述部分在长度上是SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7给出的 核酸序列的至少约400、至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1100个或更多个核苷酸，优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’至3’端计 算。 [0327] 优选的，启动子序列的一部分在长度上是SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ IDNO:7给出的核酸序列的约400-425、约425-450、约450-475、约475-500、约500-525、 约525-550、约550-575、约575-600、约625-650、约650-675、约675-700、约700-725、 约725-750、约750-775、约775-800、约800-825、约825-850、约850-875、约875-900、 约925-950、约950-975、约975-1000、约1000-1025、约1025-1100、约1100-1125、约 1125-1150、约1150-1175、约1170-1179个核苷酸，优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’至 3’端计算。 [0328] 优选的启动子序列包括SEQ ID NO:7，或由SEQ ID NO:7组成。 [0329] 由转运核酸编码的转运肽的长度优选是约5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54个，或更多个氨基酸。优选的，转运肽指导蛋白质运输到细胞内的其他细胞器。优选的，转运肽将黄素氧还蛋白多肽靶向到细胞核、线粒体、线粒体基质、内质网、叶绿体、apicoplast、有色体、蓝色小体(cyanelle)、类囊体、淀粉体、过氧化物酶体、乙醛酸循环体和/或氢化酶体。最优选的，转运肽将黄素氧还蛋白多肽靶向到质体，优选叶绿体。 优选的，在运输了多肽之后，从多肽上切割下转运肽，优选通过信号肽酶。在另一个实施方案中，在运输了多肽之后，没有从多肽上切割下转运肽。 [0330] 适用于本发明的某些实施方案的叶绿体转运肽可以是任何将多肽导向植物细胞叶绿体的肽序列。本领域技术人员可以方便的鉴别合适的肽，一些例子显示在表3中。其 他例子是本领域已知的。 [0331] 在一些实施方案中，转运肽可以包括以下肽，或由以下肽组成，所述肽是含有+ FAD的铁氧还蛋白-NADP 还原酶(FNR)的叶绿体转运肽，更优选是豌豆或蓝色奇异硅藻 (Cyanophora paradoxa)的FNR，所述转运肽甚至更优选分别具有SEQ ID NO:4或10所示 的序列。其编码序列优选分别如SEQ ID NO:3、8或9所示。 [0332] 编码上文定义的任何黄素氧还蛋白多肽的核酸可以与任何合适的上文定义的叶绿体转运肽一起用于本发明。优选的，黄素氧还蛋白多肽没有与其天然关联的转运肽融合，即，与异源的转运肽融合。不在植物中的黄素氧还蛋白多肽与叶绿体转运肽不是天然关联 的。 [0333] SEQ ID NO:3、8或9中给出了编码转运肽的优选的转运核酸序列。优选的，转运核酸序列包括以下转运核酸序列，或由以下转运核酸序列组成，所述转运核酸序列是SEQ ID NO:3、8或9中给出的转运核酸序列，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物。优选的功能性转运核酸序列片段或变体以递增的优先度与SEQ ID NO:3、8或9所示的核酸序列，或编码表3所示的转运肽的任何核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、 56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、 71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。 [0334] 在一个实施方案中转运肽与天然连接于表2和/或序列表列出的黄素氧还蛋白的任何转运肽不同。 [0335] 优选的，转运核酸序列的部分在长度上是SEQ ID NO:3、8或9给出的任一核酸序列的至少约15、至少约30、至少约45、至少约60、至少约75、至少约90、至少约120、至少约 135、至少约150或更多个核苷酸，优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’端计算。 [0336] 优选的，转运核酸序列的部分在长度上是SEQ ID NO:3、8或9给出的核酸序列的15至45、约24至60、约60-75、约75-102、约102-126、约126-150个核苷酸，优选连续的核苷酸，优选从核酸的5’端计算。 [0337] SEQ ID NO:4或10给出了优选的转运肽。优选的，转运肽包括以下的肽，或由以下的肽组成，所述肽是SEQ ID NO:4或10给出的转运肽，或其功能片段或变体。优选的功能性转运肽片段或变体以递增的优先度与SEQ ID NO:4所示的核酸序列，或表3所示的任一 转运肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、 75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。 [0338] 优选的，转运肽在长度上包括SEQ ID NO:4或10所述氨基酸序列的至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45或至少约50个氨基酸，优选连续的氨基酸，优选从氨基酸序列的N端计算，或直到所述氨基酸序列的全长。 [0339] 优选的，转运肽包括表3所述任一氨基酸序列的至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45或至少约50个氨基酸，优选连续的氨基酸，优选从氨基酸序列的N端或C端计算，优选从氨基酸序列的N端计算，或直到所述氨基酸序列的全长。 [0340] 优选的，转运肽包括表3所述任一氨基酸序列的5至20、约20-25、约25-30、约30-35、约35-40、约40-45、约45-50个氨基酸，优选连续的氨基酸，优选从氨基酸序列的N端或C端计算，优选从氨基酸序列的N端计算，或直到所述氨基酸序列的全长。 [0341] 其他优选的叶绿体转运肽参考表3。 [0342] 优选的，表达构建体包括选自以下的核酸： [0343] (i)以递增的优先度与SEQ ID NO:5、12、14或17所示的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、 66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物； [0344] (ii)编码以递增的优先度与SEQ ID NO:6、11或18所示的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、 65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列的核酸，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物；和/或 [0345] (iii)(i)或(ii)的任一核酸的互补序列；和任选的本文所述的启动子序列。 [0346] 优选的，编码黄素氧还蛋白多肽和转运肽的核酸的功能部分在长度上包括SEQ ID NO:5、12、14或17给出的核酸序列的至少约100、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500、至少约600或更多个核苷酸，优选连续的核苷酸，优选从核苷酸序列的5’端计算。 [0347] 优选的，编码黄素氧还蛋白多肽和转运肽的核酸的功能部分在长度上包括SEQID NO:5、12、14或17给出的核酸序列的400-425、约425-450、约450-475、约475-500、约 500-525、约525-550、约550-575、约575-600、约625-650、约650-675个核苷酸，优选连续的核苷酸，优选从核苷酸序列的5’或3’端计算，优选从核苷酸序列的5’端计算。 [0348] 更优选的，表达构建体包括SEQ ID NO:5、12、14或17所述的核酸序列。 [0349] 更优选的是包含这样的核酸序列的表达构建体，所述核酸序列编码包含黄素氧还蛋白多肽和转运序列的多肽，所述多肽包含以递增的优先度与SEQ ID NO:6、11或18所示 的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、 61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、 76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物。 [0350] 优选的，包含黄素氧还蛋白多肽和转运序列的多肽包括SEQ ID NO:6、11或18所述氨基酸序列的至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220个氨基酸，优选连续的氨基酸，优选从氨基酸序列的N 端或C端计算，优选从氨基酸序列的N端计算，或直到所述氨基酸序列的全长。 [0351] 优选的，黄素氧还蛋白多肽包括SEQ ID NO:6、11或18所述氨基酸序列的约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约140-150、约150-160、约160-170、约 170-180、约180-190、约190-200、约200-210、约210-220个氨基酸，优选连续的氨基酸，优选从氨基酸序列的N端或C端计算，优选从氨基酸序列的N端计算，或直到所述氨基酸序列 的全长。 [0352] 因此，另一实施方案是由表达构建体编码的黄素氧还蛋白多肽，其包括： [0353] (a)编码本文所述的黄素氧还蛋白多肽的黄素氧还蛋白核酸；和 [0354] (b)编码本文所述的转运肽的转运肽核酸；其中表达构建体包括与包含黄素氧还蛋白核酸序列和转运核酸序列的核酸序列功能相连的启动子序列，其中启动子序列包括 GOS2启动子，优选来自稻的GOS2启动子，或其功能片段或变体或同源物、直系同源物或旁 系同源物。 [0355] 优选的，包含黄素氧还蛋白多肽和转运序列的融合多肽包括这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列以递增的优先度与SEQ ID NO:6、11或18所示的氨基酸序列具有至少 50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、 65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、 80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物。 [0356] 更优选的，包含黄素氧还蛋白多肽和转运序列的多肽包括这样的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:6、11或18，优选SEQ ID NO:6所 述。 [0357] 在一些优选的实施方案中，包含黄素氧还蛋白多肽和叶绿体靶向肽的融合多肽优选包括这样的氨基酸序列，或由这样的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:6、 11或18，优选SEQ ID NO:6所述。编码这样的融合多肽的合适的核酸分子包括这样的序列，或由这样的序列组成，所述序列如SEQ ID NO:5、12、14或17，优选SEQ ID NO:5所述。 [0358] 优选的，表达构建体包括这样的核酸，所述核酸编码含豌豆FAD的铁氧还蛋+ 白-NADP 还原酶(FNR)的转运肽和项圈藻物种(PCC7119)的黄素氧还蛋白和GOS2启动子， 优选稻GOS2启动子，优选地，启动子序列包括SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7 所述的核苷酸序列，或由SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7所述的核苷酸序列组 成。 [0359] 优选的，表达构建体包括选自以下的核酸： [0360] (i)以递增的优先度与SEQ ID NO:5、12、14或17所示的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、 66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、 81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物； [0361] (ii)编码包含黄素氧还蛋白多肽和转运序列的多肽的核酸序列，所述多肽包含以递增的优先度与SEQ ID NO:6、11或18所示的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、 54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、 69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，或其功能片段、衍生物、直系同源物或旁系同源物；和/或 [0362] (iii)(i)或(ii)的任一核酸的互补序列；和任选的与其有效连接的启动子序列，所述启动子序列包括以递增的优先度与SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7所示的 核酸序列具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少 98％、至少99％或者甚至100％的序列同一性。 [0363] 优选的，表达构建体包括这样的核酸，所述核酸编码包含SEQ ID NO:5、12、14或17所述转运肽和黄素氧还蛋白多肽的融合蛋白，和与其有效连接的SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7所示的启动子序列。 [0364] 任选的，一个或多个转录终止子序列可用于导入植物中的构建体中。本领域技术人员了解适用于实施本发明的终止子序列。优选的，构建体包含这样的表达盒，所述表达 盒包含与编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸有效连接的启动子序列，和终止子序列。 优选的，转录终止序列是与黄素氧还蛋白编码序列的3’末端连接的玉米醇溶蛋白终止子 (t-玉米醇溶蛋白(t-zein))。最优选地，表达盒包含与玉米醇溶蛋白终止子(t-玉米醇溶 蛋白)的序列以递增的优先度具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列。 [0365] 此外，本文所述的遗传构建体、载体构建体或表达构建体还可以包括一个或多个编码选择标记的序列。 [0366] 优选的选择标记可选自赋予抗生素抗性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择标记基因的例子包括赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉 素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉 素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin，G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供 抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或 gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如 允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱 氧葡萄糖抗性)。视觉标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或 β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿 色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。 取决于生物和选择方法，优选不同的标记。 [0367] 已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择 这些整合子，通常将编码选择标记(如上文所述的那些)的基因连同目的基因一起引入宿 主细胞。这些标记可以例如在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体 中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以引入宿主细胞中，与编码本发明多肽或本发 明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用引入的核酸稳定转染 的细胞可以例如通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其它细胞死 亡)。 [0368] 本发明的另一实施方案是包含黄素氧还蛋白核酸的载体构建体，包含本文所述的黄素氧还蛋白核酸的表达构建体或表达盒。 [0369] 优选的实施方案是这样的重组载体构建体，所述构建体包含编码本文所述转运序列(优选选自表3)和本文所述黄素氧还蛋白多肽(编码序列优选选自表2和/或序列表) 的核酸序列，和与其有效连接的本文所述的启动子序列(优选SEQ ID NO:7，22或23，优选 地SEQ ID NO:7所述)，其中启动子序列包括GOS2启动子，优选稻GOS2启动子，或其功能片 段或变体或同源物、直系同源物或旁系同源物。 [0370] 另一优选的实施方案是重组载体构建体，包括： [0371] (a)(i)与SEQ ID NO:1、13或15具有至少60％同一性，优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性，或者甚至100％序列同一性的黄素氧还蛋白核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物； [0372] (ii)编码与SEQ ID NO:2或16具有至少60％同一性，优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性，或者甚至100％序列同一性的黄素氧还蛋白的核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物；和/或 [0373] (iii)能够在严格的条件下，与(i)或(ii)的任一核酸或其互补序列杂交的核酸； [0374] 与 [0375] (b)启动子序列，其中启动子序列优选包括GOS2启动子，优选稻GOS2启动子，或其功能片段或变体或同源物、直系同源物或旁系同源物；和优选的 [0376] (c)转录终止序列 [0377] 有效连接。 [0378] 此外，提供了这样的重组载体构建体，包括： [0379] (a)(i)与SEQ ID NO:1、13或15具有至少95％、至少98％、至少99％序列同一性，或者甚至100％序列同一性的黄素氧还蛋白核酸； [0380] (ii)编码与SEQ ID NO:2或16具有至少95％、至少98％、至少99％序列同一性，或者甚至100％序列同一性的黄素氧还蛋白的核酸；和/或 [0381] (iii)能够在严格的条件下，与(i)或(ii)的任一核酸或其互补序列杂交的核酸； [0382] 与 [0383] (b)与(a)的核酸有效连接的启动子序列，优选SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7所示，或其任一功能片段，或其直系同源物或旁系同源物；和优选的 [0384] (c)本发明的另一实施方案的转录终止序列 [0385] 有效连接。 [0386] 另一优选的实施方案是重组载体构建体，包括： [0387] (a)(i)与SEQ ID NO:1、13或15具有至少60％同一性，优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性，或者甚至100％序列同一性的黄素氧还蛋白核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物； [0388] (ii)编码与SEQ ID NO:2或16具有至少60％同一性，优选至少70％序列同一性、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％序列同一性，或者甚至100％序列同一性的黄素氧还蛋白的核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物；和/或 [0389] (iii)能够在严格的条件下，与(i)或(ii)的任一核酸或其互补序列杂交的核酸； [0390] 与 [0391] (b)编码转运肽的转运核酸序列；优选如SEQ ID NO:3、8或9所示； [0392] (c)与(a)和(b)的核酸有效连接的启动子序列，优选SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7所示，或其任一功能片段，或其直系同源物或旁系同源物；和优选的 [0393] (d)转录终止序列 [0394] 有效连接。 [0395] 此外，提供了这样的重组载体构建体，包括： [0396] (a)(i)与SEQ ID NO:1、13或15具有至少95％、至少98％、至少99％序列同一性，或者甚至100％序列同一性的黄素氧还蛋白核酸； [0397] (ii)编码与SEQ ID NO:2或16具有至少95％、至少98％、至少99％序列同一性，或者甚至100％序列同一性的黄素氧还蛋白的核酸；和/或 [0398] (iii)能够在严格的条件下，与(i)或(ii)的任一核酸或其互补序列杂交的核酸； [0399] 与 [0400] (b)编码转运肽的转运核酸序列；优选如SEQ ID NO:3、8或9所示，其中由黄素氧还蛋白核酸编码的转运肽和蛋白质彼此功能相连； [0401] (c)与(a)和(b)的核酸有效连接的启动子序列，优选SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7所示；和优选的 [0402] (d)转录终止序列，其中所述转录终止序列与黄素氧还蛋白核酸功能相连 [0403] 有效连接。 [0404] 本发明的优选的实施方案是包含SEQ ID NO:5、12、14或17的载体构建体。优选地，载体构建体包含SEQ ID NO:5、12、14或17，和与SEQ ID NO:5、12、14或17有效连接的SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7所示的启动子序列。 [0405] 本发明的载体构建体还可以包括复制起点序列，这是在特定细胞类型中维持和/或复制所必需的。一个例子是当需要将遗传构建体在细菌细胞中作为附加型遗传元件(例 如质粒或粘粒分子)维持时。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。 [0406] 为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸序列的转基因植物，使用标记基因(或报告基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包 含选择标记基因。选择标记的例子如本文所述。一旦不再需要，可以从转基因细胞中去除 或切除标记基因。用于去除标记基因的技术是本领域已知的，有用的技术如本文所述。 [0407] 根据另一个实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物，在植物中增强一个或多个产量相关性状的方法，包括增加编码本文定义的黄素氧还蛋白多肽的外源核酸在植物 中的表达，和任选的选择具有一个或多个增强的产量相关性状的植物，其中所述核酸与本 文所述的特定启动子有效连接，且专门使用特定的启动子表达所述黄素氧还蛋白多肽。 [0408] 本发明的另一实施方案是用于相对于对照植物，在植物中增强一个或多个产量相关性状的方法，包括增加编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸在植物中的表达，和 任选的选择具有一个或多个增强的产量相关性状的植物，其中所述核酸与本文所述的特定 启动子有效连接，且专门使用特定的启动子表达所述黄素氧还蛋白多肽并靶向质体。优选 的，外源核酸的表达处于内源或外源启动子序列的控制下。 [0409] 优选的，所述一个或多个增强的产量相关性状包括相对于对照植物，增加的产量相关性状，优选包括相对于对照植物，增加的生物量和/或增加的种子产量，优选包括相对于对照植物，增加的地上生物量、增加的地下生物量、增加的种子产量和/或增加的糖产量(每株植物、每单位鲜重、每单位干重或每单位面积的可收获的糖)。 [0410] 在优选的实施方案中，种子产量是增加的。 [0411] 在另一个优选的实施方案中，地上生物量是增加的。 [0412] 实施本发明的方法使植物相对于对照植物的产量相关性状具有增加的产量相关性状。 [0413] 用于在植物中增强如本文所述的一个或多个产量相关性状的本发明的方法包括在植物中导入(优选通过重组方法)和表达本文定义的核酸和/或更具体，优选还生长所 述植物，和任选的收获所述植物或其部分的步骤。 [0414] 在一个实施方案中，增加的产量相关性状是增加的种子产量，优选增加的收获指数、增加的种子灌浆率、增加的种子总数、增加的种子总重量和改善的开花时间、数量和质量。更优选的，增加的产量相关性状是增加的收获指数、增加的种子灌浆率和/或增加的种子总重量。 [0415] 在一个实施方案中，增加的产量相关性状是增加的生物量，特别是地上生物量，优选相对于对照植物的地上生物量，特别是茎生物量增加的生物量，和/或相对于对照植物的根生物量增加的根生物量，和/或相对于对照植物的beet生物量增加的beet生物量的 植物。此外，特别理解地上部分(特别是茎(特别是甘蔗植物的茎)中和/或地下部分(特 别是根，包括主根、块茎和/或beet(特别是甜菜中))中的糖含量(特别是蔗糖含量)相 对于对照植物的相应部分中的糖含量(特别是蔗糖含量)增加。 [0416] 优选的地上生物量是茎生物量。增强的茎生物量可以表现为茎长度、茎宽度或阔度、茎密度、茎重量、茎直径、节和/或节间的数量、茎维管或维管束、特别是韧皮部和/或木质部的直径或量。此外，茎的树汁含量(sap content)优选是增强的。此外，蔗糖含量，优选茎的蔗糖含量优选是增强的。 [0417] 特别的是，可以在胁迫或非胁迫条件下实施本发明的方法。胁迫条件优选是非生物胁迫条件，更优选干旱、盐碱和/或冷或热的温度和/或由一种或多种养分缺乏造成的养 分利用，如氮缺乏，最优选干旱和/或氮缺乏。 [0418] 在优选的实施方案中，使用需要增加的非生物胁迫耐受性的植物实施本发明的方法，例如耐受干旱、、盐碱和/或冷或热的温度和/或由一种或多种养分缺乏造成的养分利 用，如氮缺乏。 [0419] 在一个例子中，可以在胁迫条件下实施本发明的方法，例如干旱或中度干旱，使植物相对于对照植物具有增加的产量。优选的，当经受干旱胁迫时，转基因植物相对于对照植物具有增加的生物量，优选地上生物量和/或增加的种子产量。 [0420] 在另一个例子中，可以在胁迫条件下实施本发明的方法，例如氮缺乏，使植物相对于对照植物具有增加的产量。氮缺乏可以由缺乏养分造成，如氮、磷和其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼等。优选的，当经受养分缺乏时，转基因植物相对于对照植物具有增加的生物量，优选地上生物量和/或增加的种子产量。 [0421] 在另一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如盐胁迫下实施，以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。术语盐胁迫不限于普通盐(NaCl)，不过可以是NaCl、 KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2等的任意一种或多种。优选的，当经受盐胁迫时，转基因植物相对于对照植物具有增加的生物量，优选地上生物量和/或增加的种子产量。 [0422] 在又一个实例中，本发明的方法可以在胁迫条件如寒冷胁迫或冷冻胁迫下实施以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。优选的，当经受寒冷胁迫时，转基因植物相对于对照植物具有增加的生物量，优选地上生物量和/或增加的种子产量。 [0423] 在另一个优选的实施方案中，本发明的方法是在非胁迫条件下实施。 [0424] 在仍然另一个实施方案中，提供了用于在植物中增强一种或多种产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达一种或多种的表2和/或序列表给出任一外源核酸，或者包 括在植物中导入和表达表2和/或序列表给出任一外源核酸或 [0425] (i)与SEQ ID NO:1、13或15具有至少60％同一性的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物； [0426] (ii)编码与SEQ ID NO:2或16具有至少60％同一性的蛋白质的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物；或 [0427] (iii)能够在严格的条件下，与(i)或(ii)的任一核酸或其互补序列杂交的核酸；或 [0428] (iv)编码具有黄素氧还蛋白或铁氧还蛋白的生物学活性的多肽的外源核酸；或 [0429] (v)编码与上述(i)至(iv)的核酸相同的多肽的外源核酸，但由于遗传密码的简并性而不同于上述(i)至(iv)的核酸；或 [0430] (vi)组合了上述(i)至(iv)的任意两条核酸的特征的外源核酸。 [0431] 优选的，外源核酸还编码表3给出的任一转运肽。 [0432] 用于增加编码黄素氧还蛋白多肽的外源核酸表达的优选方法是在植物中导入和表达编码黄素氧还蛋白多肽的核酸，甚至更优选的其中所述核酸与本文所述的特定启动子 有效连接，且黄素氧还蛋白多肽靶向质体。 [0433] 根据一个实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物改善植物中的本文提供的产量相关性状的方法，包括在植物中增加编码本文定义的黄素氧还蛋白多肽的外源核酸的 表达，其中所述核酸与本文所述的特定启动子有效连接，且黄素氧还蛋白多肽靶向质体。 [0434] 在另一个实施方案中，本发明提供了用于在植物中增强一种或多种产量相关性状的方法，包括在植物中导入和表达表2和/或序列表中给出的一个或多个任意核酸的等位 变体。 [0435] 因此，优选的实施方案是相对于对照植物在植物中增强一种或多种产量相关性状的方法，包括在植物中增加编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸的表达，其中所述 表达是处于与编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸有效连接的启动子序列的控制之下 的。优选的，所述启动子序列包括GOS2启动子，优选稻的GOS2启动子，或其功能片段或衍 生物。GOS2启动子优选包括SEQ ID NO:7，22或23，优选地SEQ ID NO:7的序列。 [0436] 在优选的实施方案中，转运肽将黄素氧还蛋白多肽靶向质体，优选靶向叶绿体。优选的，叶绿体转运肽选自表3列举的转运肽。 [0437] 优选的，黄素氧还蛋白多肽由选自表2和/或序列表的核酸编码。更优选的，黄素氧还蛋白多肽来自项圈藻物种，优选项圈藻PCC7119，或集胞藻物种，优选集胞藻PCC 6803。最优选的，转运肽由以下编码： [0438] (i)与SEQ ID NO:1、13或15具有至少60％同一性的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物； [0439] (ii)编码与SEQ ID NO:2或16具有至少60％同一性的蛋白质的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物；和/或 [0440] (iii)能够在严格的条件下，与(i)或(ii)的任一核酸或其互补序列杂交的核酸。 [0441] 最优选的是黄素氧还蛋白多肽由以下编码： [0442] (i)与SEQ ID NO:1、13或15具有至少60％同一性的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物； [0443] (ii)编码与SEQ ID NO:2或16具有至少60％同一性的蛋白质的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物；和/或 [0444] (iii)能够在严格的条件下，与(i)或(ii)的任一核酸或其互补序列杂交的核酸。 [0445] 用于相对于对照植物，在植物中增强一种或多种产量相关性状的方法，优选包括： [0446] (a)用包含外源核酸的表达盒稳定的转化植物细胞，所述外源核酸编码转运肽并编码黄素氧还蛋白多肽， [0447] 其中黄素氧还蛋白多肽是由与启动子序列功能连接的 [0448] (i)与SEQ ID NO:1、13或15具有至少60％同一性的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物； [0449] (ii)编码与SEQ ID NO:2或16具有至少60％同一性的蛋白质的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物；和/或 [0450] (iii)能够在严格的条件下，与(i)或(ii)的任一核酸或其互补序列杂交的核酸 [0451] 编码的； [0452] (b)从植物细胞再生植物；和 [0453] (c)表达所述外源核酸。 [0454] 优选的，转运肽选自表3所示的转运肽，更优选的由SEQ ID NO:3、8或9的核酸编码，或具有SEQ ID NO:4或10公开的序列。优选的，启动子序列包括SEQ ID NO:7，22或 23，优选地SEQ ID NO:7所示的核酸序列。 [0455] 作为SEQ ID NO:9的核酸的备选方案，可以使用编码SEQ ID NO:10的变体转运肽的SEQ ID NO:8的核酸。 [0456] 优选的，用于本发明方法中的植物是双子叶或单子叶植物。优选的植物是禾本科。更优选的，单子叶植物是甘蔗属(Saccharum)的，优选选自斑茅(Saccharum arundinaceum)、Saccharum bengalense、肉质花穗野生种(Saccharum edule)、Saccharum munja、白甘蔗(Saccharum officinarum)、狭叶斑茅(Saccharum procerum)、沙生蔗 茅(Saccharum ravennae)、大茎野生种(Saccharum robustum)、中国竹蔗(Saccharum sinense)和割手密(Saccharum spontaneum)。 [0457] 实施本发明的方法使植物具有一种或多种增强的产量相关性状。特别的是，实施本发明的方法使植物相对于对照植物具有增加的早期萌发势和/或增加的产量，尤其是增 加的生物量和/或增加的种子产量。本文的“定义”章节中更详细的描述了术语“早期萌发势”、“产量”、“生物量”和“种子产量”。 [0458] 因此，本发明提供了用于相对于对照植物在植物中增强产量相关性状，尤其是生物量和/或种子产量的方法，所述方法包括在植物中增加本文所述的外源核酸的表达。优 选的，外源核酸也编码转运肽，优选叶绿体转运序列。优选的，所述产量相关性状包括相对于对照植物增强的生物量和/或增加的种子产量，优选的包括相对于对照植物增强的地上 生物量和/或增加的种子产量。 [0459] 根据本发明的优选的实施方案，实施本发明的方法使植物相对于对照植物具有增加的生长。因此，根据本发明，提供了用于增加植物生长速率的方法，所述方法包括在植物中增加本文定义的编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的表达。 [0460] 实施本发明的方法使生长在非胁迫条件和/或胁迫条件下的植物相对于在可比较条件下生长的对照植物具有增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在非胁迫条件和/或胁迫条件下的植物的一种或多种产量相关性状的方法，所述方法包 括在植物中增加编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的表达。优选的，方法包括在所述植物中导 入编码黄素氧还蛋白多肽(优选和转运肽)的外源核酸，所述核酸优选处于本文所述的内 源或外源启动子序列的控制下。优选的，所述增强的产量相关性状是在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏下获得的。 [0461] 实施本发明的方法使生长在干旱条件下的植物相对于在可比较条件下生长的对照植物具有增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在干旱条件下的植物的产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中增加编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的 表达，其中所述核酸与本文所述的特定启动子有效连接，且将所述黄素氧还蛋白多肽靶向 质体。 [0462] 实施本发明的方法使生长在养分缺乏条件下，特别是氮缺乏条件下的植物相对于在可比较条件下生长的对照植物具有增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在养分缺乏条件下的植物的产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中增加编 码黄素氧还蛋白多肽的核酸的表达，其中所述核酸与本文所述的特定启动子有效连接，且 将所述黄素氧还蛋白多肽靶向质体。 [0463] 实施本发明的方法使生长在盐胁迫条件下的植物相对于在可比较条件下生长的对照植物具有增加的产量相关性状。因此，根据本发明，提供了用于增加生长在盐胁迫条件下的植物的产量相关性状的方法，所述方法包括在植物中增加编码黄素氧还蛋白多肽的核 酸的表达，其中所述核酸与本文所述的特定启动子有效连接，且将所述黄素氧还蛋白多肽 靶向质体。 [0464] 在本发明的一个实施方案中，种子产量是增加的。 [0465] 在本发明的另一个实施方案中，相比对照植物，地上生物量是增加的，优选茎、秸秆和/或sett生物量，更优选在禾本科中，甚至更优选在甘蔗属物种中，最优选在甘蔗中，任选的地下生物量和/或根生长不是增加的。 [0466] 在另一实施方案中，总的可收获糖，优选葡萄糖、果糖和/或蔗糖是增加的，优选除了增加本文定义的其他产量相关性状外，例如生物量，更优选还除了糖含量，优选葡萄糖、果糖和/或蔗糖含量的增加。 [0467] 用于增加核酸或基因、或基因产物的表达的方法是本领域普遍已知的，且本文提供了实例。 [0468] 如上所述，用于调控编码黄素氧还蛋白多肽的核酸的表达的优选方法是通过在植物中导入和表达编码黄素氧还蛋白多肽的核酸；然而，还可以使用其他普遍已知的技术实 现实施方法的效果，即，增强产量相关性状，包括但不限于T-DNA激活标签化、TILLING、同源重组。定义章节提供了这些技术的描述。 [0469] 因为一旦已经成功引入了核酸，则转基因宿主细胞中就不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素抗性基因和除草剂抗性基因，因此用于引入核酸的本发明方法有利地使 用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时 用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记基因。高比例的 转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农 杆菌转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合 至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与 转座酶来源植物杂交或转化体与导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些 情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其 它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。 在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于已知的 重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。 Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之间，则在已 经成功发生转化时，通过重组酶表达去除标记基因。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和 REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。 [0470] 本发明的优选的实施方案是在方法中使用本文所述的表达构建体或重组表达载体，产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的转基因植物，优选具有增加的生物量 和/或增加的种子产量，更优选相对于对照植物具有增加的地上生物量和/或增加的种子 产量。 [0471] 因此，优选的实施方案是可通过这样的方法获得的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，所述方法用于相对于对照植物在植物中增强一种或多种产量相关性 状，或者通过本文所述的生产转基因植物的方法，其中所述转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞表达处于本文所述的启动子序列控制下的编码转运肽和黄素氧还蛋白多 肽的外源核酸。 [0472] 优选的，用本文所述的表达构建体或重组表达载体转化转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞。 [0473] 在优选的实施方案中，本发明的植物、植物部分、种子、sett或繁殖体在非胁迫条件下和/或在干旱和7或氮缺乏条件下，更优选在非胁迫条件下，具有一种或多种增加的产量相关性状。 [0474] 最优选的，转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞具有相对于对照植物增强的产量相关性状，优选增强的生物量和/或增加的种子产量。 [0475] 本发明还包括含有编码上文定义的黄素氧还蛋白多肽的分离的外源核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是植物细胞、酵母、细菌或真菌。优选的细菌宿主细胞是大肠杆菌或农杆菌。用于本发明方法中的核酸、构建体、表达盒或载体的宿主植物原则上有利的是所有的能够合成用于本发明方法中的多肽的植物。在特定的实施方案中， 本发明的植物细胞过表达本发明的核酸分子。 [0476] 因此，本发明的一个实施方案是包含在宿主细胞中的编码本文所述的转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸，其与启动子序列有效连接，优选GOS2启动子，更优选稻的 GOS2启动子，如本文所述，其中所述宿主细胞选自植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞和哺乳动物细胞，优选植物细胞，更优选禾本科细胞，甚至更优选甘蔗属的细胞，最优选甘蔗细胞。 [0477] 本发明的方法有利的可用于任何植物，特别是本文定义的任何植物。特别可用于本发明方法的植物包括所有属于植物界(Viridiplantae)的植物，特别是单子叶和双子叶 植物，包括饲料或饲料豆类(forage legumes)植物、观赏植物、食物作物、树或灌木。根据本发明的实施方案，植物是作物植物。作物植物的例子包括但不限于菊苣(chicory)、胡萝卜(carrot)、木薯(cassava)、车轴草(trefoil)、大豆(soybean)、甜菜(beet)、糖萝卜(sugar beet)、向日葵(sunflower)、卡诺拉油菜(canola)、苜蓿(alfalfa)、油菜(rapeseed)、亚麻(linseed)、棉花(cotton)、番茄(tomato)、马铃薯(potato)和烟草(tobacco)。根据本发 明的另一个实施方案，植物是单子叶植物。单子叶植物的例子包括甘蔗(sugarcane)。根 据本发明的另一个实施方案，植物是谷类。谷类的例子包括稻(rice)、玉米(maize)、小麦(wheat)、大麦(barley)、黍(millet)、裸麦(rye)、黑小麦(triticale)、高粱(sorghum)、二粒小麦(emmer)、斯佩耳特小麦(spelt)、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、买罗高粱(milo)和燕麦(oat)。在特定的实施方案中，本发明的或本发明方法中使用 的植物选自玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油菜(oilseed rape)(包括卡诺拉油菜)、甘蔗 (sugarcane)、糖萝卜(sugar beet)和苜蓿(alfalfa)。 [0478] 特别有用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股 颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧 洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属物种(Bambusa sp.)、 冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、 芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜(canola)、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、天麻苔草(Carex elata)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、 栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑桔属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧 桐属物种(Cola spp.)、黄麻属物种(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属 物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属 物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属物种(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属 物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、 油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子 (Eleusine coracana)、Eragrostis tef、蔗茅属物种(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属物种(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种 (Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无 花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银 杏(Ginkgo biloba)、大豆属物种(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属 物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、 甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧 豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔 枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、 羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属物种(Lycopersicon spp.) (例如番茄(Lycopersicon esculentum)、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme)、硬皮豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malus spp.)、凹缘金虎尾 (Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯 属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicago sativa)、草木 樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦 瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种 (Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属物种(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、 稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧 防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、芹菜(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、 石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercus spp.)、萝卜 (Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖 麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳 属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物 种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属物种(Solanum spp.)(例如马铃薯 (Solanum tuberosum)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum))、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物 种(Trifolium spp.)、Tripsacum dactyloides、Triticosecale rimpaui、小麦属物种(Triticum spp.)(例如普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小 麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦 (Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticum monococcum) 或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。 [0479] 优选的植物是禾本科。最优选的植物是甘蔗，优选甘蔗属(Saccharum)的。更优选的是选自斑茅(Saccharum arundinaceum)、Saccharum bengalense、肉质花穗野 生种(Saccharum edule)、Saccharum munja、白甘蔗(Saccharum officinarum)、狭叶斑 茅(Saccharum procerum)、沙生蔗茅(Saccharum ravennae)、大茎野生种(Saccharum robustum)、中国竹蔗(Saccharum sinense)和割手密(Saccharum spontaneum)的植物。 [0480] 关于本发明或可用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物的序列，在一个实施方案中，将不源自高等植物的核酸或多肽序列用于本发明方法或可用于本发明方法的表达构建体中。在另一个实施方案中，植物来源的核酸或多肽序列用于本发明的方法、构建体、植物、可收获部分和产物中或本发明的方法中有用的表达构建体中，因为所述核酸和多肽分别具有针对在植物中表达而优化的密码子使用的特征，以及使用在植物中共有的 氨基酸和调节位点的特征。来源的植物可以是任何植物，但是优选地是本文所描述的那些 植物。在仍然另一个实施方案中，不源自高等植物但经人为改变而具有高等植物密码子用 法的核酸序列用于本发明方法中所有的表达构建体中。 [0481] 根据另一个实施方案中，本发明提供了用于生产相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状的植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中增加编码本文所述的 黄素氧还蛋白多肽的核酸的表达，和任选的选择具有一种或多种增强的产量相关性状的植 物。 [0482] 根据另一个实施方案中，本发明提供了用于生产相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状的植物的方法，其中所述方法包括在所述植物中增加编码本文所述的 转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸的表达，其中所述核酸与本文所述的特定启动子有效连 接，和任选的选择具有一种或多种增强的产量相关性状的植物。 [0483] 因此，本发明进一步提供了用本文所述的构建体转化的植物或宿主细胞。特别的是，本发明提供了用本文所述的构建体转化的植物，所述作为具有增加的本文所述的产量 相关性状。 [0484] 因此，优选的实施方案是用于生产具有相对于对照植物增强的产量相关性状的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法，其相对于对照植物具有增加的产量 相关性状，优选增加的生物量和/或种子产量，包括： [0485] (a)在植物、植物部分或植物细胞中引入本文所述的重组载体遗传构 [0486] 建体；和 [0487] (b)从转化的植物、转化的植物部分或转化的植物细胞产生转基因植 [0488] 物、转基因植物部分或转基因植物细胞；和 [0489] (c)表达编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸。 [0490] 因此，优选的实施方案是用于生产具有相对于对照植物增强的产量相关性状的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法，包括收获所述转基因植物的种子、种植种子和使种子生长为植物的步骤，其中种子包括编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源 核酸，且启动子序列与其有效连接。 [0491] 在另一个实施方案中，本发明的方法是用于生产转基因禾本科植物，优选甘蔗属植物、其转基因部分、或其转基因植物细胞的方法，所述植物、部分或细胞具有相对于对照植物增强的产量相关性状，包括收获所述转基因植物的sett、种植sett和使sett生长为植 物的步骤，其中sett包括编码POI多肽和与其有效连接的启动子序列的外源核酸。 [0492] 本发明还提供了用于生产具有相对于对照植物增强的生物量，优选地上生物量和/或增加的种子产量的转基因植物的方法，包括在植物中引入和表达编码本文定义的黄素 氧还蛋白多肽的任何核酸，其中所述核酸与本文所述的特定启动子有效连接，且所述黄素 氧还蛋白多肽被靶向质体。 [0493] 更具体而言，本发明提供了用于生产具有一种或多种增强的产量相关性状，特别是增加的生物量和/或种子产量的转基因植物的方法，所述方法包括： [0494] (i)在植物或植物细胞中引入和表达黄素氧还蛋白多肽编码核酸，或包含黄素氧还蛋白多肽编码核酸的遗传构建体；和 [0495] (ii)在促进植物生长和发育的条件下，优选促进相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状的植物生长和发育的条件下，培养植物细胞。 [0496] (i)的核酸可以是任何能够编码本文所述的黄素氧还蛋白多肽的核酸。优选的，核酸还编码将黄素氧还蛋白靶向质体的转运肽，优选的，所述核酸与本文所述的启动子序列有效连接。 [0497] 在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞可以包括或可以不包括再生和/或生长至成熟。因此，在本发明的一个具体实施方案中，通过本发明方法转化的植物细胞可再生成为转化的植物。在另一个具体实施方案中，通过本发明方法转化的植物细胞不可再 生成为转化的植物，即，细胞是使用本领域已知的细胞培养技术不能够再生成植物的细胞。 尽管植物细胞通常具有全能性特征，但是一些植物细胞不能用来从所述细胞再生或繁殖出 完整植物。在本发明的一个实施方案中，本发明的植物细胞是此类细胞。在另一个实施方 案中，本发明的植物细胞是不以自养方式自我维持的植物细胞。一个实例是不通过光合作 用维持其自身的植物细胞，所述光合作用是通过从无机物例如水、二氧化碳或矿物盐合成 碳水化合物和蛋白质。 [0498] 可以将核酸直接导入植物细胞或导入植物自身中(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，核酸优选地通过转化导入植物或植物细胞中。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。 [0499] 在优选的实施方案中，使用需要增加非生物性胁迫耐受的植物来实施本发明的方法，例如耐受干旱、盐和/或冷或热的温度和/或由于一种或多种养分缺乏造成的养分利 用，如氮缺乏。 [0500] 在一个实施方案中，本发明扩展至通过本文所述任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。 [0501] 本发明涵盖了通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子和/或sett)。植物或植物部分或植物细胞包含了编码如上文定义的黄素氧还蛋白多肽的核酸转基因，优 选地在遗传构建体例如表达盒中。本发明进一步扩展以涵盖已经通过前述任意方法产生的 原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代展示出与本发明方法中由亲代产生的那些相同的基因型和/或表型特征。 [0502] 在另一个实施方案中，本发明延展至外源性包含本发明的表达盒、本发明的遗传构建体，或编码本文所述的 [0503] ●黄素氧还蛋白多肽， [0504] ●和/或黄素氧还蛋白功能片段， [0505] ●其衍生物， [0506] ●直系同源物，和/或 [0507] ●旁系同源物 [0508] 的核酸，且其与本文所述的特定启动子有效连接的种子和/或sett。典型的，由本发明的种子或sett生长的植物还将表现出增强的产量相关性状。 [0509] 本发明还延伸至本发明的转基因植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、sett、根、根状茎、块茎和鳞茎(bulb)，所述可收获部分包含本发明的构建体，和/或与本文所述的特定启动子有效连接的编码黄素氧还蛋白多肽和/或利用特定启动子专 门表达并靶向至质体的本文定义的黄素氧还蛋白多肽的的外源核酸。 [0510] 特别的是，这类可收获部分例如主根、根状茎、果实、茎、sett、beet、块茎、鳞茎、叶、花和/或种子。 [0511] 优选的可收获部分是种子和/或茎切片(如甘蔗的sett，但不限于sett)。 [0512] 在另一个实施方案中，地上部分或地上可收获部分或地上生物量理解为地上营养部分生物量，但不包括种子和/或果实。 [0513] 在另一实施方案中，本发明涉及包含本发明的构建体的转基因花粉粒，和/或本发明的植物细胞的单倍体衍生物。虽然在一个特定的实施方案中，在不添加其他遗传材料 的条件下，本发明的花粉粒不能用于再生完整的植物和/或不能光合成，但所述本发明的 花粉粒可用于将增强的产量相关性状引入到另一株植物中，通过使用活的本发明的花粉粒 使其他植物的卵细胞受精，从受精卵细胞产生种子，并从得到的种子生长植物。此外，花粉粒可用作地理和/或时间起源的标记。 [0514] 本发明还涉及源自或产生自本文所述转基因植物，或自本文所述转基因植物的一个或多个可收获部分的产物，优选直接源自或直接产生自这类转基因植物的可收获部分的 产品。优选的产物是干燥颗粒、压扁的茎秆、sett、粗粉或粉末、纤维、由本发明的植物产生的布料或纸或纸盒的纤维、油、脂肪及脂肪酸、淀粉、碳水化合物——包括由本发明的植物产生的淀粉、纸或纸盒的碳水化合物——树浆、果汁、谷壳或蛋白质。优选的碳水化合物是淀粉、纤维素和/或糖类，优选蔗糖。还优选的产物是残留的干燥纤维，例如茎纤维(如蔗 糖榨汁后的甘蔗的蔗渣)、废蜜或滤饼，优选是甘蔗的，所述产品可以是农业产品。 [0515] 优选的，产品包括本发明的构建体、编码本文所述的黄素氧还蛋白多肽的外源核酸和/或本文所述的外源黄素氧还蛋白多肽，例如作为产品的特定质量的指标，其中所述 核酸与本文所述的特定启动子有效连接，且通过使用特定的启动子，将黄素氧还蛋白多肽 靶向至质体并特异的表达。 [0517] 本发明还包括用于制造产品的方法，包括a)培育本发明的植物并且b)从或借助本发明的植物或其部分(包括茎和/或种子)生产所述产品。在又一个实施方案中，所述 方法包括步骤a)培育本发明的植物，b)从这些植物中取下如本文所述的可收获部分和c) 从或采用本发明的可收获部分生产所述产品。优先的，产物包括本文所述的本发明的遗传 构建体、核酸和/或多肽。更优选的，产物是从转基因植物的种子或茎，优选种子生产的。 [0518] 在一个实施方案中，制造产品的方法包括a)生长本发明的禾本科植物，优选地植物是甘蔗，并且b)从本发明的植物获得茎，和c)将茎切成片，优选切成适合用作繁殖材料 的片，优选一个或多个sett。优选的，sett包括本文所述的本发明的构建体、核酸和/或多肽。 [0519] 在另一个实施方案中，制造产品的方法包括a)生长本发明的禾本科植物，优选甘蔗属物种的植物，更优选甘蔗，并且b)从本发明的植物获得茎，和c)榨汁，优选从茎和/或榨汁后剩余的纤维提取甘蔗汁，和任选的d)从茎的汁液中提取糖类，优选蔗糖。 [0520] 在优选的实施方案中，本发明的方法是使用需要增加的非生物胁迫耐受性的植物实施的，例如耐受干旱、盐碱和/或冷或热的温度和/或由一种或多种养分缺乏造成的养分 利用，如氮缺乏。 [0521] 在一个实施方案中，本发明的方法是制造布料的方法，借助于a)生长本发明的植物，实施植物能够生产可用于织布的纤维，如棉花，b)从这些植物中取下如本文所述的可收获部分，和c)从所述可收获部分生产纤维，和d)从c)的纤维生产布料。本发明的另一个 实施方案涉及生产用于生物反应器、发酵方法或生物气体工厂的原材料的方法，包括a)生 长本发明的植物，b)从这些植物中取下如本文所述的可收获部分，和c)生产用于生物反应 器、发酵方法或生物气体工厂的原材料。在优选的实施方案中，本发明的方法是从植物材料生产醇类的方法，包括a)生长本发明的植物，b)从这些植物中取下如本文所述的可收获部 分，和c)任选的生产用于发酵方法的原材料，和d)——在步骤b)或c)之后——从所述原 材料或所述可收获部分生产一种或多种醇类，优选利用微生物，如真菌、藻类、细菌或酵母、或细胞培养物。典型的例子是使用含碳水化合物的可收获部分生产醇类，例如玉米籽粒、甘蔗茎部分或甜菜的beet部分，或使用源自其的产物，例如甘蔗或甜菜的汁液或糖浆，或玉 米淀粉或玉米糖浆。在一个实施方案中，产物是由转基因植物的茎生产的。在另一个实施 方案中，产物是从植物的种子生产的。 [0522] 在另一个实施方案中，本发明的方法是用于生产一种或多种聚合物的方法，包括a)生长本发明的植物，b)从这些植物中取下如本文所述的可收获部分，和c)从所述可收获 部分生产一种或多种单体，任选的涉及中间产物，d)通过反应至少一种所述单体与其他单 体，或使所述单体彼此反应，生产一种或多种聚合物。在另一个实施方案中，本发明的方法是用于生产药物化合物的方法，包括a)生长本发明的植物，b)从这些植物中取下如本文所 述的可收获部分，和c)从所述可收获部分生产一种或多种单体，任选的涉及中间产物，d) 从可收获部分和/或中间产物生产药物化合物。在另一个实施方案中，本发明的方法是用 于生产一种或多种化学品的方法，包括a)生长本发明的植物，b)从这些植物中取下如本文 所述的可收获部分，和c)从所述可收获部分生产一种或多种化学品构件，例如但不限于乙 酸、丙酮酸、乳酸、脂肪酸、糖类、氨基酸、核苷酸、类胡萝卜素、萜类或类固醇，任选的涉及中间产物，d)反应至少一种所述构件与其他构件，或使所述构件彼此反应，生产一种或多种化学品。 [0523] 本发明还涉及由本文所述的生产产物的方法获得的产物。 [0524] 在一个实施方案中，由本发明的所述方法产生的产品是植物产品，如但不限于食品、饲料、食品补充物、饲料补充物、纤维、化妆品或药物。在另一个实施方案中，所述生产方法用来产生农产品，如但不限于纤维、植物提取物、粗粉或滤饼和其他一种或多种提取工艺后的残留材料、面粉、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂肪、油、聚合物、维生素等。优选的碳水化合物是糖类，优选蔗糖。在一个实施方案中，农业产品选自1)纤维、2)木材、3)植物提取物、4)粗粉或滤饼和其他一种或多种提取工艺后的残留材料、5)面粉、6)蛋白质、7)碳水化合物、8)脂肪、9)油、10)聚合物，例如纤维素、淀粉、木质素、木质纤维素，和11)1)至10)的任一项的组合和/或混合。在优选的实施方案中，产品或农业产品一般不包括活的植物细 胞，但包括本文所述的表达盒、遗传构建体、蛋白质和多核苷酸。 [0525] 优选的，产物包括本文所述的本发明的遗传构建体、核酸和/或多肽。 [0526] 在另一个实施方案中，本发明的多核苷酸和/或多肽和/或遗传构建体包含在农业产物中。在特定的实施方案中，本发明的核酸序列和/或蛋白质序列和/或遗传构建体 可用作产物标记，例如在通过本发明方法产生农产品的情况下。这种标志物可以用来鉴定 已经由有利方法产生的产品，其中所述的有利方法不仅导致该方法的更高效率，还导致改 进的产品质量，原因在于该方法中所用的植物材料和可收获部分的品质提高。可以通过本 领域已知的多种方法检测此类标志物，例如但不限于基于PCR的用于核酸检测的方法或基 于抗体的用于蛋白质检测的方法。 [0527] 用于培育的方法/用于植物改善的方法/用于植物品种生产的方法。 [0528] 本发明还涵盖了包含编码本文所述黄素氧还蛋白多肽的核酸并与特定启动子有效连接的构建体的用途，和利用特定启动子专门表达的这些黄素氧还蛋白多肽的用途，用 于在植物中增强任何上述产量相关性状。例如，包含编码本文所述黄素氧还蛋白多肽的核 酸并与特定启动子有效连接的构建体，或利用特定启动子专门表达的这些黄素氧还蛋白多 肽本身，可用于这样的育种程序，在所述程序中，鉴别出可与本文所述的编码黄素氧还蛋白多肽的基因-启动子组合遗传关联的DNA标记。本发明的核酸/基因-启动子组合，或利 用特定启动子专门表达的这些黄素氧还蛋白多肽本身可用于定义分子标记。然后，该DNA 或蛋白质标记可用于育种程序，选择在本发明方法中具有上文定义的增强的产量相关性状 的植物。此外，与本文所述的特定启动子有效连接的编码黄素氧还蛋白多肽的核酸/基因 的等位变体可用于标记辅助的育种程序中。特定启动子和编码黄素氧还蛋白多肽的核酸也 可用作探针，以便对基因进行遗传作图和物理作图，所述探针作为所述基因的一部分，及用作与那些基因及其插入位点关联的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以便开发 具有想要表型的株系。 [0529] 优选的实施方案是用于育种具有一种或多种增强的产量相关性状的植物的方法，包括 [0530] (a)杂交本发明的转基因植物或通过任何本文所述方法可获得的转基因植物，与第二种植物； [0531] (b)从步骤(a)的杂交中获得种子； [0532] (c)种植所述种子并将所述种子生长成植物；和 [0533] (d)从所述植物选择外源表达编码本文所述的黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物，所述核酸优选编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽，其中所述核酸优选与本文所述的启动子序 列功能连接。 [0534] 任选的，用于育种的方法还包括步骤(e)从表达编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物生产繁殖材料，其中繁殖材料包括本发明的遗传构建体和/或载体构建体。 优选的，繁殖材料是茎或种子的切片。 [0535] 另一个优选的实施方案是用于植物改良的方法，包括 [0536] (a)通过任何本发明的方法获得转基因植物； [0537] (b)在一个植物细胞中，组合a)的植物的至少一个植物细胞的遗传材料，与至少一个细胞的一个或多个基因不同于a)的植物的植物细胞的遗传材料，或杂交a)的转基因 植物与第二种植物； [0538] (c)从b)的一个植物细胞或步骤(b)的杂交植物生成的至少一株植物获得种子； [0539] (d)种植所述种子并将所述种子生长成植物；和 [0540] (e)从所述植物中，选择处于本文所述的特定启动子控制下表达的编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物；和任选的 [0541] (f)从表达编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物生产繁殖材料，其中繁殖材料包括本发明的遗传构建体和/或载体构建体。 [0542] 优选的，繁殖材料是茎的切片或种子。 [0543] 在优选的实施方案中，使用需要增加非生物胁迫耐受的植物实施本发明的方法，例如耐受干旱、盐碱和/或冷或热的温度和/或由一种或多种养分缺乏造成的养分利用，如 氮缺乏。 [0544] 在一个实施方案中，相比对照植物和对照植物的相应植物部分，本发明的植物或其部分，特别是作为的可收获部分的总储藏碳水化合物含量是增加的。 [0545] 储藏碳水化合物优选是糖类，例如但不限于蔗糖、果糖和葡萄糖，和多糖，例如但不限于淀粉、葡聚糖和果聚糖。可以以本领域已知的多种方式，测量总储藏碳水化合物含量和单类群或种类的碳水化合物的含量。例如作为WO2006066969公开的国际申请在第【79】至【117】段公开了确定甘蔗的总储藏碳水化合物含量的方法，包括果聚糖含量。 [0546] 用于甘蔗的另一种方法如下： [0547] 将转基因甘蔗在温室或野外生长10至15个月。使用标准条件生长植物。 [0548] 收获10至15月龄并具有10个以上节间的甘蔗植物的秸秆。在去除所有的叶子后，从顶端(＝1)至底部(例如＝36)将秸秆的节间编号。从每个节间的中段切出重量约 1-2g的秸秆块。将3个节间的秸秆块组合，形成一个样品，并冷冻在液氮中。 [0549] 为了提取糖，首先在Waring榨汁机(Waring,New Hartford,Connecticut,USA)中粉碎秸秆块。通过在10mM磷酸钠缓冲液pH 7.0中95℃振荡1小时，提取糖类。之后，通过 30um筛过滤，去除固体。获得的溶液之后用于糖测量(参见下文)。 [0550] 将转基因甘蔗生长10至15个月。在各种情况下，将转基因株系和野生型甘蔗植物的甘蔗秆脱叶，将茎秆分成3个节间的段，在密封的50ml塑料容器中，将这些节间段冷冻在液氮中。确定样品的鲜重。如下所述进行出于测定糖目的的测量。 [0551] 通过NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)向NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的转化，在酶测定中光度测量根据所述糖提取方法获得的提取液中的葡萄糖、果糖和蔗糖含 量。在还原作用的过程中，位于烟酰胺环上的芳香族特征丢失，因而改变了吸附光谱。可以光度计检测吸收光谱的改变。通过己糖激酶和腺苷三磷酸(ATP)，将位于提取物中的葡萄 糖和果糖转化为葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。之后，通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，将葡 + 萄糖-6-磷酸氧化成6-磷酸葡萄糖酸。在该反应中，NAD 被还原成NADH，并光度的确定所 形成的NADH的量。所形成的NADH和位于提取物中的葡萄糖的比例是1:1，因而可以使用 NADH的摩尔消光系数(每mmol和每cm光路为6.31)从NADH的量计算葡萄糖含量。在完 全氧化葡萄糖-6-磷酸后，溶液中同样形成的果糖-6-磷酸被磷酸葡萄糖异构酶转化，生成 葡萄糖-6-磷酸，后者反过来氧化产生6-磷酸葡萄糖酸。果糖和所形成的NADH的量的比 例再次是1:1。之后，通过蔗糖酶(Megazyme)切割位于提取物中的蔗糖，生成葡萄糖和果 + 糖。所释放的葡萄糖和果糖分子之后由上述酶在依赖于NAD 的反应中转化产生6-磷酸葡 萄糖酸。一份子蔗糖转化成6-磷酸葡萄糖酸，获得2分子NADH。同样的光度计确定所形成 的NADH的量，并使用NADH的摩尔消光系数计算蔗糖含量。 [0552] 如上所述，将甘蔗秆按每三个节间分段。从顶端至底部(顶端＝节间1，底端＝节间21)将秸秆的节间编号。 [0553] 此外，可以使用本领域已知的任何方法分析转基因甘蔗植物，例如但不限于： [0554] ·由全宽舱口取样器取样甘蔗；ICUMSA(国际食糖分析统一方法委员会，http://www.icumsa.org/index.php？id＝4)方法GS 5-5(1994)，可获得自Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/) [0555] ·由Corer方法取样甘蔗；ICUMSA方法GS 5-7(1994)，可获得自Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/) [0556] ·通过气相色谱法确定废蜜和工厂产品——官方和甘蔗汁中的蔗糖；ICUMSA方法GS 4/7/8/5-2(2002)，可获得自Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Be rlin(http://www.bartens.com/) [0557] ·通过HPLC确定甘蔗废蜜中的蔗糖、葡萄糖和果糖和甜菜废蜜中的蔗糖；ICUMSA方法GS 7/4/8-23(2011)，可获得自Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,1412 9Berlin(http://www.bartens.com/) [0558] ·通过高性能离子色谱确定甘蔗汁、糖浆和废蜜中的葡萄糖、果糖和蔗糖，和甜菜废蜜中的蔗糖；ICUMSA方法GS 7/8/4-24(2011)，可获得自Verlag Dr.Albert Bartens KG,Lückhoffstr.16,14129Berlin(http://www.bartens.com/)。 [0559] 对于甘蔗以外的作物，类似的方法是本领域已知的，或者易于从另一种作物的已知方法调整。 [0560] 在一个实施方案中，对照植物不含本发明的表达盒，因此不包括编码本文所述的转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸，所述核酸与本文定义的特定启动子有效连接。 [0561] 在另一个实施方案中，对照植物携带了编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸序列，但该核酸序列不与用于本发明的构建体、载体、植物、用途和方法中的启动子功能连接，即，所述核酸序列的表达不处于所述启动子的控制下。 [0562] 此外，本发明涉及下列具体实施方案，其中，表述“如权利要求/项目x所定义的”意思是指导技术人员应用如项目/权利要求X所公开的定义。例如，“如项目1所定义的核酸”应当这样理解，使得如项目1中的核酸定义待被应用于核酸。因此，术语“如项目所定义的”或“如权利要求所定义的”可以被该项目或权利要求的相应定义所分别替换。 具体实施方案： [0563] 1、相对于对照植物在植物中增强一种或多种产量相关性状的方法，所述方法包括增加编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸在植物中的表达，其中所述表达处于与编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸有效连接的启动子序列的控制下，且其中启动子序列 包括GOS2启动子的核苷酸序列，优选稻的GOS2启动子； [0564] 或其功能片段或衍生物。 [0565] 2、根据实施方案1的方法，其中所述GOS2启动子的核苷酸序列包括至少70％的SEQ ID NO:7所示序列。 [0566] 3、根据实施方案1或2的方法，其中所述转运肽将黄素氧还蛋白多肽靶向质体，优选叶绿体。 [0567] 4、根据实施方案3的方法，其中所述叶绿体转运肽选自表4列举的转运肽或其同源物。 [0568] 5、根据实施方案1至4的任一项的方法，其中所述黄素氧还蛋白多肽是由选自表4列举的核酸序列或其同源物的核酸序列编码的。 [0569] 6、根据实施方案1至5的任一项的方法，其中所述黄素氧还蛋白多肽来自项圈藻属物种，优选项圈藻PCC7119。 [0570] 7、根据实施方案1至6的任一项的方法，其中所述黄素氧还蛋白多肽是由 [0571] (i)与SEQ ID NO:1、13或15具有至少60％同一性的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物；或 [0572] (ii)编码与SEQ ID NO:2或16具有至少60％同一性的蛋白质的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物；或 [0573] (iii)能够在严格的条件下，与(i)或(ii)的任一核酸或其互补序列杂交的外源核酸；或 [0574] (iv)编码具有黄素氧还蛋白或铁氧还蛋白的生物学活性的多肽的外源核酸；或 [0575] (v)编码与上述(i)至(iv)的核酸相同的多肽的外源核酸；但由于遗传密码的简并性而不同于上述(i)至(iv)的外源核酸；或 [0576] (vi)组合了上述(i)至(iv)的任意两条核酸的特征的外源核酸。 [0577] 8、根据实施方案1至7的任一项的方法，包括 [0578] (a)用包含外源核酸的表达盒稳定的转化植物细胞，所述外源核酸编码转运肽并编码黄素氧还蛋白多肽， [0579] 其中黄素氧还蛋白多肽是由 [0580] (i)与SEQ ID NO:1、13或15具有至少60％同一性的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物； [0581] (ii)编码与SEQ ID NO:2或16具有至少60％同一性的蛋白质的外源核酸，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物；和/或 [0582] (iii)能够在严格的条件下，与(i)或(ii)的任一核酸或其互补序列杂交的外源核酸 [0583] (iv)编码具有黄素氧还蛋白或铁氧还蛋白的生物学活性的多肽的外源核酸；或 [0584] (v)编码与上述(i)至(iv)的核酸相同的多肽的外源核酸；但由于遗传密码的简并性而不同于上述(i)至(iv)的外源核酸；或 [0585] (vi)组合了上述(i)至(iv)的任意两条核酸的特征的外源核酸 [0586] 编码的；其中外源核酸与启动子序列功能连接的，上述启动子序列包括GOS2启动子的核苷酸序列，优选稻GOS2启动子，或其功能片段、直系同源物或旁系同源物； [0587] (b)从植物细胞再生植物；和 [0588] (c)表达所述外源核酸。 [0589] 10、根据实施方案1至9的任一项的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状是在非胁迫条件下或非生物的胁迫条件下获得的。 [0590] 11、根据实施方案10的方法，其中所述一种或多种增强的产量相关性状是在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏的条件下获得的。 [0591] 12、表达构建体，包括： [0592] (i)编码实施方案3或4的任一项定义的转运肽和实施方案5至8的任一项定义的黄素氧还蛋白多肽的核酸序列； [0593] (ii)能够驱动实施方案1或2定义的(i)的核酸序列表达的启动子序列；和任选的 [0594] (iii)转录终止序列。 [0595] 13、包含实施方案12的表达构建体的重组表达载体。 [0596] 14、实施方案12的表达构建体或实施方案13的重组表达载体的用途，用于制备相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状的转基因植物的方法，优选增加的生物 量，更优选相对于对照植物增加的地上生物量。 [0597] 15、用于生产转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞的方法，所述转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞相对于对照植物具有一种或多种增强的产量相关性状，包括： [0598] (a)在植物、植物部分或植物细胞中导入实施方案13的重组载体构建体； [0599] (b)从转化的植物、转化的植物部分或转化的植物细胞再生转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞；和 [0600] (c)表达编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核酸。 [0601] 16、实施方案15的方法，还包括收获转基因植物的繁殖材料和种植繁殖材料和将繁殖材料生长成植物的步骤，其中繁殖材料包括编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的外源核 酸，和与其有效连接的启动子序列。 [0602] 17、能够通过根据实施方案1至11、15或16的任一项的方法获得的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，所述转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞 表达编码实施方案1-8的任一项定义的所述处于启动子序列控制下的转运肽和黄素氧还 蛋白多肽的外源核酸。 [0603] 18、用实施方案12的表达构建体或实施方案13的重组表达载体转化的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，包括与实施方案1-8的任一项定义的编码转运肽 和黄素氧还蛋白多肽的核酸有效连接的启动子序列。 [0604] 19、实施方案17或18的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，其中转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞相对于对照植物具有一种或多种增强的产量 相关性状，优选增强的生物量。 [0605] 20、根据实施方案17至19的任一项的转基因植物的可收获部分，其中所述可收获部分是地上器官，优选是茎或其部分。 [0606] 21、由根据实施方案17至19的任一项的转基因植物，或由实施方案20的转基因植物的可收获部分生产的产品。 [0607] 22、一种用于生产产品的方法，包括以下步骤：生长根据实施方案17至19的任一项的转基因植物，并从所述植物或部分，优选植物的茎生产所述产品。 [0608] 23、用于植物改良的方法，包括 [0609] a)通过实施方案1至11、15或16的任一项的方法获得转基因植物； [0610] b)在一个植物细胞中，组合a)的植物的至少一个植物细胞的遗传材料，与至少一个细胞的一个或多个基因不同于a)的植物的植物细胞的遗传材料，或杂交a)的转基因植 物与第二种植物； [0611] c)从b)的一个植物细胞生成的至少一株植物或步骤(b)的杂交植物获得种子； [0612] d)种植所述种子并将所述种子生长成植物；和 [0613] e)从所述植物中选择表达编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物；和任选的 [0614] f)从表达编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽的核酸的植物生产繁殖材料。 [0615] 24、实施方案12的表达构建体或包含这样的表达盒的重组染色体DNA，所述表达盒包含实施方案12的项目(ii)定义的启动子，如实施方案12的项目(i)定义的编码与黄 素氧还蛋白连接的转运肽的核酸，和功能连接的转录终止序列，其中构建体或重组染色体 DNA包含在植物细胞中。 [0616] 25、根据实施方案1至11、15、16、22或23的任一项的方法，根据实施方案17至19的任一项的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，或根据实施方案14的用 途，根据实施方案20的可收获部分，或根据实施方案21的产品，或实施方案24的构建体或 重组染色体DNA，其中所述植物细胞来自或所述植物选自菜豆、大豆、豌豆、苜蓿、葛、紫花苜蓿、小菜豆、羽扇豆、野豌豆、花生、稻、小麦、玉米、大麦、拟南芥、小菜豆、香蕉、油菜籽包括蓖麻、棉花、土豆、甘蔗、红花苜蓿、甜菜、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、单粒小麦(einkorn)、埃塞俄比亚画眉草(teff)、买罗高粱(milo)和燕麦(oat)。 [0617] 26、根据实施方案1至11、15、16、22或23的任一项的方法，根据实施方案17至19的任一项的转基因植物、转基因植物部分或转基因植物细胞，或根据实施方案14的用 途，根据实施方案20的可收获部分，或根据实施方案21的产品，或实施方案24的构建体 或重组染色体DNA，其中所述植物细胞来自或所述植物是禾本科，优选甘蔗属，更优选选自斑茅(Saccharum arundinaceum)、Saccharum bengalense、肉质花穗野生种(Saccharum edule)、Saccharum munja、白甘蔗 (Saccharum officinarum)、狭叶斑 茅(Saccharum procerum)、沙生蔗茅(Saccharum ravennae)、大茎野生种(Saccharum robustum)、中国竹蔗(Saccharum sinense)和割手密(Saccharum spontaneum)。 [0618] 实施例 [0619] 现将参考以下仅用于说明的实施例来描述本发明。以下实施例不旨在限定本发明的范围。 [0620] 特别的是，所述实验中使用的植物是出于以下原因使用的，即，拟南芥、烟草、稻和玉米植物是用于测试转基因的模式植物。由于测试相对简便，同时其结果具有向农业中使用的其他植物的良好转用性，因而在本领域中广泛使用，例如但不限于玉米、小麦、稻、大豆、棉花、油菜籽油菜包括卡诺拉油菜、甘蔗、甜菜和苜蓿(alfafa)，或其他的双子叶或单子叶作物。 [0621] 除非另外说明，本发明使用植物生物学、分子生物学、生物信息学和植物育种的常规技术和方法。 [0622] DNA操 作：除 非 另 有 说 明，根 据 (Sambrook(2001)Molecular Cloning:alaboratory manual,第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH,New York)或 Ausubel等(1994),Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols第1 卷和第2卷中所述标准方案进行重组DNA技术。用于植物分子工作的标准材料和方法描述 于BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK) 出版的由R.D.D Croy编著的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中。 [0623] 实施例1：鉴定与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的序列 [0624] 使用数据库序列检索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)在 国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库所维护的那些序列内鉴定到与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2相关的序列(全长cDNA、EST或基因组)。该程序用来通过核酸 序列或多肽序列与序列数据库比较并通过计算匹配的统计学显著性而找到序列间具有局 部相似性的区域。例如，SEQ ID NO:1的核酸所编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认 设置并关闭忽略低复杂度序列的过滤。分析的结果通过配对性比较显示，并根据概率评分 (E-值)排序，其中该评分反映特定比对结果因偶然而发生的概率(E-值越低，命中的显著 性越高)。除了E-值外，比较还通过同一性百分比进行记分。同一性百分比指两个所比较 核酸(或多肽)序列之间在特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)数目。在一些例子 中，可以调整缺省参数以修改检索的严格性。例如可以提高E值以显示较低严格性的匹配。 这样，可以鉴定短的近似精确的匹配。 [0625] 实施例2：鉴定在用于实施本发明方法的多肽序列中包含的结构域 [0626] 蛋白质家族、结构域和位点集成资源(Integrated Resouce of ProteinFamilies，domain and Site，InterPro)数据库是基于文本和序列的检索的通常所用特征 序列数据库的集成界面。InterPro数据库组合了这些数据库，所述的数据库使用不同方法 学和不同程度的有关已充分表征蛋白质的生物学信息以得到蛋白质特征序列。合作数据库 包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAMs。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的，多重序列比对和隐藏的马尔可夫模型(hidden Markov models)的大集合。Pfam由大不列颠联合王国的Sanger研究所的服务器上提供。Interpro 由大不列颠联合王国的欧洲生物信息研究所提供。 [0627] SEQ ID NO:2所示的多肽序列的InterPro扫描(参见Zdobnov E.M.和ApweilerR.；"InterProScan-an integration platform for the signature-recognition methods in InterPro."；Bioinformatics,2001,17(9):847-8；InterPro数据库,release 36.0， 2012年2月23日)的结果示于表B和图1中。 [0628] 表B:由SEQ ID NO:2所示的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)。 [0629] [0630] 使用InterPro扫描软件4.8版，InterPro数据库,2013年2月13日发行版本41的重复分析，给出了表B列举的结构域和基序，表B的最后一列给出了坐标，除结构域和基 序PIRSF038996外，检测到了G3DSA:3.40.50.360、PTHR30112、SSF52218。在一个实施方 案中，黄素氧还蛋白多肽包含与表B的保守结构域具有至少70％、71％、72％、73％、74％、 75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的保守结构域(或基序)。 [0631] 实施例3：编码黄素氧还蛋白的核酸序列的克隆 [0632] 稻转化构建体： [0633] 合成编码转运肽和黄素氧还蛋白多肽(SEQ ID NO:5-或对于高等植物密码子优化的如SEQ ID NO:14中所示)或编码转运肽和集胞藻属黄素氧还蛋白(SEQ ID NO:17) 的核酸，使其包括用于Gateway重组的AttB位点(Life Technologies GmbH,Frankfurter Straβe 129B,64293Darmstadt,Germany)。 [0634] 可选的，通过PCR，对真核细胞使用模板cDNA文库，对原核细胞(如项圈藻)使用基因组DNA，作为模板扩增编码黄素氧还蛋白的核酸序列。在标准条件中使用可商购的高保真Taq DNA聚合酶，使用在50μl PCR混合物中的200ng模板实施PCR。所用的引物包括用 于Gateway重组的AttB位点。还使用标准方法纯化扩增的PCR片段。 [0635] 随后实施Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间PCR片段与pDONR201质粒发生体内重组以产生根据Gateway命名的“进入克隆”，pFLD。质粒pDONR201可作为 技术的部分从Invitrogen购买。 [0636] 还可以如欧洲专利EP 1442127的第8页【0075】和【0076】段所述，生成项圈藻黄素氧还蛋白的编码序列(SEQ ID NO:2)与豌豆FNR转运肽的核酸(SEQ ID NO:3)融合的核酸，所述段落通过引用整合到本文中。得到的核酸序列可以连接attB位点以允许Gateway 重组。 [0637] 随后，在LR反应中，包含与编码SEQ ID NO:5，14和17分别所示转运肽的核酸连接的SEQ ID NO:1，13或15的黄素氧还蛋白编码核酸的进入克隆与一种用于稻转化的目 的载体一起使用。这种载体在T-DNA边界内含有作为功能性元件的：植物可选择标记；可 筛选标记表达盒和意图与已经克隆于所述进入克隆内的目的核酸序列用于LR体内重组的 Gateway盒。用于特定表达的GOS2启动子(SEQ ID NO:7)位于这种Gateway盒的上游。使 用稻的基因组DNA通过PCR扩增所述启动子，或可选的可以合成。 [0638] LR重组步骤之后，将获得的包含SEQ ID NO:7的启动子与SEQ ID NO 3的转运肽核酸和黄素氧还蛋白核酸(分别为SEQ ID NO:1,13或15)的组合(SEQ ID NO:19,20或 21)的表达载体GOS2::TP::黄素氧还蛋白(图2)根据本领域众所周知的方法转化至合适 的农杆菌菌株中。 [0639] 作为备选方案，作为一体的合成GOS2启动子(SEQ ID NO:7)和编码转运肽和项圈藻黄素氧还蛋白(SEQ ID NO:5-或对于高等植物密码子优化的如SEQ ID NO:14中所示) 或编码转运肽和集胞藻属黄素氧还蛋白(SEQ ID NO:17)的核酸，并插入到用于农杆菌介导 的转化的二元载体中，或作为二体或多体的合成，并连接在一起，或装配到一个载体的一个表达盒中，例如二元载体。 [0640] 甘蔗表达构建体 [0641] 为了在GOS2启动子的控制下表达SEQ ID NO:11所示的编码(蓝色奇异硅藻(Cyanophora paradoxa)的转运肽和项圈藻的黄素氧还蛋白的)融合蛋白的核酸，合成 GOS2启动子(SEQ ID NO:7)序列和编码转运肽(SEQ ID NO:10)的SEQ ID NO:9的核酸和 编码SEQ ID NO:2的项圈藻黄素氧还蛋白的SEQ ID NO:1的核酸，并与玉米的醇溶蛋白终 止子序列连接。得到的表达盒如SEQ ID NO:12所示。为了改善转化植物相对于未转化植 物的选择效率，用于颗粒轰击的构建体中包括了选择标记盒，所示选择标记盒包含表达受 玉米泛素启动子控制的nptII选择标记和NOS终止子。通过颗粒轰击，用SEQ ID NO:12所 示的表达盒转化甘蔗植物。 [0642] 所示表达盒还可用于农杆菌介导的甘蔗或其他植物的转化，在其插入到二元载体中并导入农杆菌中之后。 [0643] 需要时，可以从载体分离这样的构建体，所示构建体包含用于转运肽-黄素氧还蛋白表达的表达盒和选择标记盒，并用于下文所述的甘蔗细胞的颗粒轰击。 [0644] 实施例4：植物转化 [0645] 稻转化 [0646] 含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将粳稻栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分钟，随后在次氯酸钠溶液中孵育30分钟至60分 钟、优选地30分钟(取决于污染等级)，随后用无菌蒸馏水洗涤3至6次，优选地4次进行 灭菌。灭菌的种子随后在含有2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在光照下 孵育6日后，将盾片衍生的愈伤组织用如下文所述的农杆菌转化。 [0647] 含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度 (OD600)约1。将愈伤组织在该混悬液内浸泡1至15分钟。愈伤组织随后在滤纸上吸干并转 移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。在洗去农杆菌后，将愈伤组织 在光照下在含有2,4-D的培养基上于28℃-32℃在选择剂存在下培育10至14日(indica 的生长时间：3周)。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织。在这种材料转移至再 生培养基后，胚发生潜力释放并且芽在随后4至6周发育。将芽(shoot)从愈伤组织中切 下并且在含有生长素的培养基上培育2至3周，将芽从所述的培养基上转移至土壤。硬化 的芽在高湿度和短日照下于温室中培育。 [0648] 稻栽培品种indica的转化也可以根据技术人员熟知的技术以上文给出的相似方式进行。 [0649] 对一个构建体而言产生35至90个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐受性 的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3至5月收获。本方法以超过 50％的比率产生单一基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。 [0650] 作为备选方案，可以根据下列方法生成稻植物：使用含有表达载体的农杆菌转化稻植物。将粳稻栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中孵育1分 钟灭菌，随后在0.2％HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次，每次15分钟。灭 菌的种子随后在含有2,4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周 后，切下胚源性、盾片来源的愈伤组织，并在相同培养基上扩增。2周后，通过在相同培养基上再次亚培养2周，扩增或增殖愈伤组织。在共培养前，在新鲜培养基上亚培养胚源性愈伤组织片3天(为了增强细胞分裂活性)。 [0651] 含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度 (OD600)约1。然后，将悬浮液转移到Petri皿中，将愈伤组织在该混悬液内浸泡15分钟。愈伤组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃孵育3日。 将共培养的愈伤组织在黑暗中在含有2,4-D的培养基上于28℃在选择剂存在下培育4周。 在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光照 下孵育后，胚发生潜力释放并且在随后4至5周发育芽。将芽(shoot)从愈伤组织中切下 并且在含有生长素的培养基上培育2至3周，将芽从所述的培养基上转移至土壤。硬化的 芽在高湿度和短日照下于温室中培育。 [0652] 对一个构建体而言产生约35至90个独立的T0稻转化体。原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐 受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植3至5个月后收获。本方法 以超过50％的比率产生单一基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei 等1994)。 [0653] 玉米转化 [0654] 玉米(玉蜀黍)的转化根据Ishida等(1996.Nature Biotech 14(6)：745-50)描述方法的改进方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可适用于转 化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材 料的良好来源，但是其它基因型也可以成功地使用。在授粉后(DAP)大约11日从玉米植物 中收获玉米穗，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农 杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而回收。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随 后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以 使用多种选择标记)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至芽发育。将绿色芽从每 个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的芽移植至温室的 土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。 [0655] 小麦转化 [0656] 小麦的转化用Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6):745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表 达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而回收。在与农杆菌孵育后，胚 在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选 择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周， 或直至芽发育。将绿色芽从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。 将生根的芽移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植 物中产生T1种子。 [0657] 大豆转化 [0658] 根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改进方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可 获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根 和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有 表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将 再生的芽切下并置于芽伸长培养基上。将长度不超过1cm的芽置于生根培养基上直至根发 育。将生根的芽移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的 植物中产生T1种子。 [0659] 油菜/卡诺拉油菜(rapeseed/canola)转化 [0660] 使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培育的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17:183-188)转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其它品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体 外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并通过叶柄外植体的切口端浸 入细菌混悬液而接种(含有表达载体的)农杆菌。外植体随后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、 0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农 杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美 汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀 和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至芽再生。当芽具有5–10mm长度时，将芽切下并转 移至芽伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的芽转移至用于根诱 导的生根培养基(MS0)。将生根的芽移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单 拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。 [0661] 苜蓿转化 [0662] 紫苜蓿(Medicago sativa)的再生性克隆使用(McKersie等，1999Plant Physiol119:839–847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再 生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种 Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Organ Culture4:111-112)描述的任何其它商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威 斯康星大学(University of Wisconsin))已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978Am J Bot 65:654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie 等，1999Plant Physiol 119:839–847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑 暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH 诱导培养基上共培育3天。外植体在半强度(half-strength)Murashige-Skoog培养基 (Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合 适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生 长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半强度 Murashige-Skoog培养基上发芽。将生根的幼苗移植至花盆内并且在温室中培育。从表现 选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。 [0663] 棉花转化 [0664] 根据US 5,159,135中所述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。将棉花种子在3％次氯酸钠溶液中表面灭菌20分钟，并以含有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水洗涤。接着将种子 转移至含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基中进行发芽。取下4至6日龄幼苗的下胚轴，剪 8 成0.5cm的片并置于0.8％琼脂上。用农杆菌悬液(约10 个细胞/ml，从转化有目的基因 和适当选择标记的过夜培养物稀释而成)接种下胚轴外植体。室温光照3天后，将组织转移 至固体培养基(1.6g/l Gelrite)，其带有包含B5维生素的Murashige和Skoog盐(Gamborg 等,Exp.Cell Res.50:151-158(1968)),0.1mg/l 2,4-D,0.1mg/l6-糠胺嘌呤和750μg/ml MgCL2,并含有50至100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄青霉素以杀死残余细菌。2 至3个月(每4至6周继代培养)后分离单个细胞系，并在选择培养基上进一步培养进行 组织扩增(30℃，16小时光周期)。接着在非选择培养基上将转化组织再培养2至3个月， 以产生体细胞胚。将至少4mm长的表观健康的胚转移至管中，其中含有细蛭石中的SH培养 基，并补充有0.1mg/l吲哚乙酸、6糠胺嘌呤和赤霉酸。以16小时光周期在30℃下培养胚， 并将2至3叶期的小植株转移至含有蛭石和养分的盆中。植物变硬并接着移至温室中进一 步培养。 [0665] 糖萝卜转化 [0666] 将糖萝卜(甜菜(Beta vulgaris L.))的种子在70％乙醇中消毒1分钟，随后在20％次氯酸盐漂白粉(例如 常规漂白粉(从Clorox,1221Broadway,Oakland,CA 94612,USA可商业获得))中摇动20分钟。将种子用无菌水漂洗并且风干，随后铺种到萌发 培养基(基于Murashige和Skoog(MS)的培养基(Murashige,T.和Skoog,1962.Physiol. Plant,第15卷,473-497)上，所述培养基包含B5维生素(Gamborg等人；Exp.Cell Res., 第50卷,151-8)，补充有10g/l蔗糖和0.8％琼脂)。根据Hussey和Hepher，将下胚轴组 织基本上用于芽培养的启动(Hussey,G.和Hepher,A.,1978.Annals of Botany,42,477-9) 并且在pH 5.8的基于MS的培养基上在23-25℃以16小时光周期维持，所述培养基补充有 30g/l蔗糖外加0.25mg/L苄氨基嘌呤和0.75％琼脂。在转化实验中使用携带双元质粒的 根癌农杆菌菌株，所述双元质粒载有选择标记基因例如nptII。在转化之前1日，将包含抗 生素的液体LB培养物在摇床上培育(28℃,150转/分钟)直至600nm处的光密度(O.D.) 达到约1。将过夜培育的细菌培养物离心并且重悬于pH 5.5的包含乙酰丁香酮的接种培养 基(O.D.约1)中。将芽基组织切成小片(大约1.0cm x 1.0cm x 2.0mm)。将组织浸入细 菌液体接种培养基中30秒。通过滤纸吸干除去多余的液体。在含有30g/l蔗糖的基于MS 的培养基上共培育24-72小时，随后是一个无选择时期，包括在含有30g/l蔗糖的基于MS 的培养基上孵育，所述培养基含有诱导芽发育的1mg/L BAP和用于消除农杆菌的头孢噻肟。 在3-10日后，将外植体转移至含有例如卡那霉素或G418(依赖基因型，50-100mg/L)的相 似选择培养基。将组织每2-3周转移至新鲜培养基以维持选择压力。非常快的芽启动(在 3-4日后)表示现存分生组织的再生，而非新发育的转基因分生组织的器官发生。在几轮 传代培养后，将小芽转移至含有5mg/L NAA和卡那霉素或G418的根诱导培养基。采取额外 的步骤以减少产生嵌合(部分转基因的)转化植物的可能性。来自再生芽的组织样品用于 DNA分析。用于糖萝卜的其他转化方法是本领域已知的，例如Linsey和Gallois的那些方 法(Linsey,K.和Gallois,P.,1990.Journal of Experimental Botany；第41卷,第226 期；529-36)或在作为WO9623891A公开的国际申请中所公布的方法。 [0667] 甘蔗转化 [0668] 从田间培育的6月龄甘蔗植物分离纺锤体(Spindle)(见Arencibia等人,1998.Transgenic Research, 第 7 卷 ,213-22；Enriquez-Obregon 等 人 ,1998.Planta, 第206卷,20-27)。通过在20％次氯酸盐漂白粉(例如 常规漂白粉(从 Clorox,1221Broadway,Oakland,CA 94612,USA可商业获得))中浸泡，将材料消毒。将约 0.5cm的横断切片以顶朝上的方向置于培养基上。将植物材料在基于MS(Murashige,T.和 Skoog,1962.Physiol.Plant,第15卷,473-497)的培养基上在23℃于黑暗下培育4周，所 述培养基包含B5维生素(Gamborg,O.等人,1968,Exp.Cell Res,第50卷,151-8)，补充 有20g/l蔗糖、500mg/L酪蛋白水解物、0.8％琼脂和5mg/L 2,4-D。在4周后，将培养物转 移到相同的新鲜培养基上。在转化实验中使用携带双元质粒的根癌农杆菌菌株，所述双元 质粒载有选择标记基因，例如hpt。在转化之前1日，将包含抗生素的液体LB培养物在摇床 上培育(28℃，150转/分钟)直至600nm处的光密度(O.D.)达到约0.6。将过夜培育的细 菌培养物离心并且重悬于pH 5.5的包含乙酰丁香酮的基于MS的接种培养基(O.D.约0.4) 中。基于形态学特征如致密结构和黄颜色，将甘蔗胚发生性愈伤组织片(2-4mm)分离并且 在层流罩(flow hood)干燥20分钟，随后浸入细菌接种液体培养基中10-20分钟。通过滤 纸吸干除去多余的液体。于黑暗下在滤纸上共培育3-5日，其中所述滤纸置于包含B5维生 素的含有1mg/L 2,4-D的基于MS的培养基顶部。在共培育后，愈伤组织用无菌水洗涤，接 着是在相似培养基上的一个无选择培养时期，所述相似培养基含有500mg/l头孢噻肟以消 除剩余的农杆菌细胞。在3-10日后，将外植体转移至包含B5维生素的基于MS的选择培养 基持续另外3周，所述选择培养基含有1mg/L2,4-D，载有25mg/L潮霉素(依赖于基因型)。 全部处理在23℃在黑暗条件下进行。抗性愈伤组织进一步在缺少2,4-D的包含1mg/L BA 和25mg/L潮霉素的培养基上以16小时光周期培育，导致芽结构的发育。将芽分离并且在 选择性生根培养基(基于MS，包含20g/l蔗糖、20mg/L潮霉素和500mg/L头孢噻肟)上培 育。来自再生芽的组织样品用于DNA分析。用于甘蔗的其他转化方法是本领域已知的，例 如来自作为WO2010/151634A公布的国际申请和授权的欧洲专利EP1831378。 [0669] 为了通过颗粒轰击转化，可以通过Snyman等人的方法进行愈伤组织导入和甘蔗转化(Snyman等人，1996,S.Afr.J.Bot 62,151-154)。可以用表达处于pEmu启动子(Last 等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81,581-588)控制下的nptII基因(Beck等人，Gene 19,1982,327-336；Gen-Bank登录号V00618)的载体pEmuKN共转化构建体。通过Snyman等 人2001的方法再生植物(Acta Horticulturae 560,(2001),105-108)。 [0670] 实施例5：表型评价方法 [0671] 稻植物 [0672] 5.1评价建立 [0673] 产生35个至90个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以种植并收获T1种子。保留9个事件，其中所述事件的T1后代以3:1对所述转基因的存 在/不存在分离。对于这些事件中的每一个，通过监测可视标记表达选择大约6株含有该 转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和大约6株缺少该转基因的T1幼苗(失效合子)。 以随机位置并排种植转基因植物和相应的失效合子。温室条件是短日照(12小时光照)，光 照下28℃和黑暗下22℃，和70％相对湿度。以规律的间隔期对在非胁迫条件下生长的植物 浇水，以确保水和养分不是限制性的并且满足植物完成生长和发育的需要，除非它们用于 胁迫筛选中。 [0674] 使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。 [0675] 可根据如用于T1代的相同评价方法，例如利用较少的事件和/或每个事件较多的个体在T2代中进一步评价T1事件。 [0676] 干旱筛选 [0677] 早期干旱筛选 [0678] 在正常条件下播种T1或T2植物，并转移到正常的盆栽土壤中。在将植物移盆到盆中之后，将它们转移至“干燥”段，其中不予灌溉。将土壤湿度探针插入随机选择的盆内，以监测土壤含水量(SWC)。当SWC低于某些阈值时，自动对所述植物连续再浇水直至再次 达到正常水平。然后将植物再次转移至正常条件。在营养生长阶段的过程中，重复干旱循 环2次，其中第2次循环开始于结束第1次干旱循环后的重新浇水后不久。在每个干旱循 环的前后对植物拍照。 [0679] 剩余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下生长的植物相同。如对正常条件下生长所详述的记录生长和产量参数。 [0680] 繁殖期干旱筛选 [0681] 在正常条件下在盆栽土壤中栽种T1或T2植物，直到它们达到抽穗期。然后，将它们转移至“干燥”段，其中不予灌溉。将土壤湿度探针插入随机选择的盆内，以监测土壤含水量(SWC)。当SWC低于某些阈值时，自动对所述植物连续再浇水直至再次达到正常水平。 然后将植物再次转移至正常条件。剩余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫 条件下生长的植物相同。如对正常条件下生长所详述的记录生长和产量参数。 [0682] 氮使用效率筛选 [0683] 在除营养液之外的正常条件下在盆栽土壤中种植T1或T2植物。从移植至成熟期间用含有降低的、通常减少了7至8倍之间的N氮(N)含量的特定营养液浇灌所述盆。剩 余的培养(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫下生长的植物相同。如对正常条件下 生长所详述的记录生长和产量参数。 [0684] 盐胁迫筛选 [0685] T1或T2植物种植在椰子纤维和烘烤粘土颗粒(Argex)(3:1比例)组成的基质上。在将小植物移植到温室中后，在头两周期间使用正常营养液。在头两周后，添加25mM 盐(NaCl)至所述营养液，直至收获植物。如对正常条件下的生长所详述的记录生长和产量 参数。 [0686] 甘蔗 [0687] 5.2.1在温室或野外栽种如实施例4所述生成的表达与转运肽融合的黄素氧还蛋白基因的转基因甘蔗植物10至15个月。使用用于植物生长的标准条件。 [0688] 5.2.2糖提取方法 [0689] 使用标准方法提取糖，例如上文所述。 [0690] 5.2.3鲜重和生物量 [0691] 使用标准方法测量鲜重和绿色生物量，例如上文所述。 [0692] 5.2.4糖测定(葡萄糖、果糖和蔗糖) [0693] 通过一种标准方法，确定根据上述糖提取方法获得的提取物中的葡萄糖、果糖和蔗糖含量，例如上文所述。 [0694] 5.3稻植物实验数据的统计分析：F-检验 [0695] 将两因子ANOVA(方差分析)用作总体评价植物表型特征的统计模型。对用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部测量参数进行F检验。实施F检验以检查该基因 对全部转化事件的影响并验证该基因的整体效应(又称作总体基因效应)。对于F检验，将 真实总体基因效应的显著性的阈值设在5％概率水平上。显著性F检验值指出基因效应，这 意味不是仅基因的存在或位置才引起表型上的差异。 [0696] 5.4在稻中测量参数 [0697] 使植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。如WO2010/031780中描述的在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜 色)。这些测量用于确定不同参数。 [0698] 生物量相关的参数测量 [0699] 植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自地上的植物部分的数字图像上与背景区别的像素总数而确定。这个值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并 且通过校正换算成以平方mm表述的物理表面值(physical surface value)。实验显示以 这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是在植物 已经实现其最大叶生物量的时间点上所测量的面积(AreaMax)。 [0700] 根生物量的增加表述为根总生物量增加(度量为在植物生命期间观察到的最大根生物量)；或表述为根/枝条(root/shoot)指数增加，度量为根和枝条的活跃生长时期 中根质量与枝条质量之间的比例。换言之，该根/枝条指数定义为根和枝条活跃生长期中 根生长速度与枝条生长速度的比例。根生物量可使用如WO 2006/029987中描述的方法进 行测定。 [0702] 与发育时间相关的参数 [0703] 早期萌发势(EmVg)是早期植物生长的指标。它是在将已建立的幼苗从其发芽盘重新移盆至最终盆栽的一周后，植物的地上生物量。它是在成像时被叶生物量覆盖的面积 2 (按mm)。通过计数来自地上植物部分中与背景区别的像素总数确定早期萌发势。这个值 对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且通过校正换算成以平方mm表述的 物理表面值(physical surface value)。 [0704] 植物的“至开花时间”可使用如WO 2007/093444中描述的方法进行测定。 [0705] 参数“第一圆锥花序”给出了第一萌蘖枝中的圆锥花序总数。 [0706] 参数“每圆锥花序的花数”是计算的参数，估算了植物的每个圆锥花序的小花的平均数。用种子总数除以第一圆锥花序的参数值来计算。 [0707] 开花前的绿色是植物在开花前的绿色的指标。它是在开花前的最后一次照相中的绿色和深绿色像素的部分(用％表示)。 [0708] 种子相关的参数测量值 [0709] 将成熟的主要圆锥花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37℃干燥3日。随后将所述圆锥花序脱粒，并且收集和计数全部种子。种子一般被干燥的 外罩(外壳)所覆盖。使用鼓风装置，将饱满粒(filled husk)(本文中也命名为饱满小花) 与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。饱满粒在分析天平上称重。 [0710] 通过计数分离步骤后仍留下的饱满粒数目确定种子总数。通过称量从植物收获的全部饱满粒测得总种子重量。 [0711] 通过计数从植物收获的粒(无论饱满与否)的数目确定每株植物的种子(或小花)总数。 [0712] 从计数的种子数及它们的总重量外推出千粒重(TKW)。 [0713] 本发明中的收获指数(HI)定义为总种子重量与地上部分面积(mm2)之间的比率，6 乘以系数10。 [0714] 如本发明中定义的每一圆锥花序花的数量是种子总数与成熟初级圆锥花序数之间的比例。 [0715] “种子饱满率”或“灌浆率”是饱满种子数(即含有种子的小花)对种子总数(即小花总数)的比例(表示为％)。换言之，种子饱满率是填充了种子的小花的百分比。 [0716] 实施例6：转基因植物的表型评价结果 [0717] 6.1稻植物 [0718] 实验1:在标准条件和可重复的干旱条件下测试的三种黄素氧还蛋白基因 [0719] 使用SEQ ID NO:7的GOS2启动子和编码豌豆FNR转运肽的SEQ ID NO:3的核酸，在如上所述生成的转基因水稻植物中表达三种黄素氧还蛋白核酸基因(SEQ ID NO:1、13和 15)，并在标准条件和干旱条件下测试(参见实施例5)。这三种核酸序列是 [0720] 念珠藻属物种PCC 7119项圈藻物种野生型黄素氧还蛋白序列(SEQ ID NO:1), [0721] 集胞藻属物种PCC 6803野生型黄素氧还蛋白序列(SEQ ID NO:15),和 [0722] 对于植物密码子使用优化的念珠藻属项圈藻黄素氧还蛋白(SEQ ID NO:13)。 [0723] 表Ia:标准条件下三种黄素氧还蛋白的结果 [0724] [0725] 表Ib:可复制的干旱条件下三种黄素氧还蛋白的结果 [0726] [0727] TWS总种子重量；TTF到开花的时间 [0728] 实验2:在可复制的干旱条件下的念珠藻属项圈藻黄素氧还蛋白 [0729] 再次在可复制的干旱条件下测试携带构建体的稻植物并测试额外的参数，所述构建体包含与SEQ ID NO:7的GOS2启动子连接的念珠藻属项圈藻黄素氧还蛋白的核酸(SEQ ID NO:1)和编码转运肽的SEQ ID NO:3的核酸。 [0730] 表II::在可复制的干旱条件下的念珠藻属项圈藻黄素氧还蛋白的结果 [0731] [0732] TWS总种子重量；TTF到开花的时间；ArMx AreaMax；HI收获指数；EmVg萌发生长势 [0733] 实验3:在标准、早期干旱和低氮条件下的念珠藻属项圈藻黄素氧还蛋白 [0734] 在标准条件、早期干旱条件和低氮条件下测试携带构建体的稻植物，所述构建体包含与SEQ ID NO:7的GOS2启动子连接的念珠藻属项圈藻黄素氧还蛋白的核酸(SEQ ID NO:1)和编码转运肽的SEQ ID NO:3的核酸。测试额外的参数。 [0735] 表III:三种条件下的种子产量和生物量产量参数 [0736] a)标准条件 [0737] [0738] b)早期干旱 [0739] [0740] c)低氮 [0741] [0742] TWS总种子重量；TTF到开花的时间；ArMx AreaMax；HI收获指数；EmVg萌发生长势 [0743] 在全部实验中，使用未携带用于过表达黄素氧还蛋白的构建体的对照植物。 [0744] 6.1.2多次实验的结果总结 [0745] 种子的总重量： [0746] 表4总结了在不同测试条件下表达在GOS2启动子控制下的念珠藻属项圈藻野生型黄素氧还蛋白的稻植物的种子重量。 [0747] 表IV:多次实验的种子重量总结 [0748] [0749] 全部实验中种子的总重量和稻植物的填充增加。 [0750] 在环境胁迫如在繁殖阶段的干旱或氮限制的条件下和在非胁迫条件下，植物的地上生物量增加，如植物的AreaMax值所提示的。 [0751] 测量的，但未显示在上表中的其他参数的总结： [0752] 种子的总数量和第一花序值在标准条件下增加，而在干旱条件下增加的程度较低。每个花序的花，根冠比，开花前未成熟，根生物量和千粒重似乎大部分在全部条件下未受影响。 [0753] 6.1.3总结 [0754] 在不同条件下在转基因稻植物中表达的GOS2-转运肽-黄素氧还蛋白构建体导致增加的种子产量以及地上生物量的参数。 [0755] 在全部实验条件中，较之未携带此构建体的对照植物之一，表达在GOS2启动子控制下并且连接转运肽的如本文所述的念珠藻属项圈藻野生型黄素氧还蛋白的稻植物的总 种子重量增加了13.5％。较之对照植物，在测试的全部条件下，种子的总重量和转基因稻植物的填充增加。在大多数测试的条件下，作为生物量产量的提示，地上生物量的最大面积增加。 [0756] 表2WO 03/035881的第35-38页所述的黄素氧还蛋白核酸的例子 [0757] [0758] [0759] [0760] [0761] 表3WO 03/035881的第39-45页所述的叶绿体转运肽的例子 [0762] [0763] [0764] [0765] [0766] [0767] [0768] |
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