用于细菌性植物病原体生物防治的普城沙雷菌（SERRATIAPLYMUTHICA） |
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| 申请号 | CN201280005050.8 | 申请日 | 2012-01-10 | 公开(公告)号 | CN103415613A | 公开(公告)日 | 2013-11-27 |
| 申请人 | 基础服务农业研究院; 科学技术基金会; | 发明人 | 吉恩·马丁·范德沃尔夫; 罗伯特·卢卡什·柴可夫斯基; 约翰尼斯·安东尼·范维恩; | ||||
| 摘要 | 普城沙雷菌（Serratia plymuthica）菌株A30，BCCM保藏号LMGP-26170，其类似菌株或功能上等效的菌株，提供了针对由细菌性病原体造成的 植物 病害，尤其是软腐病，例如黑胫病，的 生物 防治剂（biological control agent）。病原体是Dickeya spp.、果胶杆菌Pectobacterium spp.、和罗尔斯通氏菌Ralstonia spp.；包括Dickeya sp.生物变型3（Dickeya sp.biovar 3）菌株。在农业上或 园艺 上可接受的稀释剂、载体、填料或佐剂中制备保藏的菌株和其变体。含有保藏的菌株的植物或植物部分，尤其是 马 铃薯 块 茎，提供了免受软腐病或黑胫病病害的有益的繁殖材料。 | ||||||
| 权利要求 | 1.普城沙雷菌（Serratia plymuthica）菌株A30，BCCM保藏号LMG P-26170，其类似菌株或其功能上等效的菌株。 |
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| 说明书全文 | 用于细菌性植物病原体生物防治的普城沙雷菌（SERRATIAPLYMUTHICA） [0001] 本发明关注农业和园艺中的生物防治领域。具体地，本发明关注细菌性植物病原体的生物防治，更具体地，该病原体是在马铃薯中造成软腐病、细菌性枯萎病或黑胫病病害的果胶杆菌属（Pectobacterium）、罗尔斯通菌属（Ralstonia）和Dickeya的物种。 [0002] 农作物容易受到各种各样的微生物病原体的影响，其在世界各地造成巨大的生产年度损失和随之而来的经济损失。开发的保护作物免受植物病害的方法包括植物抗性育种、栽培措施、化学剂的应用、及生物防治。 [0003] 植物病害的生物防治通常被定义为通过应用一种或多种对病原体呈现拮抗活性的微生物抑制病原体。起拮抗作用的微生物通常被命名为生物防治剂（biological control agent，BCA）。拮抗作用的原理是基于BCA的多种生物特性。这些包括抗生素化合物的生产、催化病原体细胞成分降解的酶的表达、竞争空间和营养物质、寄生病原体的能力、及植物防御的诱导。 [0005] 尽管充分记载了许多不同的拮抗剂的功效，但只有有限数量的菌株是实际上用于针对植物病原微生物的注册产品。在商业上可用的生防产品中最常用的拮抗剂是真菌哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、多孢木霉（Trichoderma polysporum）及绿粘帚霉（Gliacladium virens），和细菌放射形土壤杆菌（Agrobacterium radiobacter）、荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）及枯草杆菌（Bacillus subtilis）（见Agrios G. N.，第322-328页，于：Plant Pathology，第5版本中，2004，Elsevier，Amsterdam）。那些产品的例子是F-Stop、 GlioGard、Agrosin 84、Dagger G、及Kodiak。 [0006] 可用的BCA产品被报告用于防治广谱的植物病原微生物。然而值得注意是，病原靶标微生物几乎完全属于分类学中的原生生物界和真菌界。在这些靶标生物中是属：腐霉属（Pythium）、疫霉属（Phytophthora）、葡萄孢属（Botrytis）、镰孢菌属（Fusarium）、丝核菌属（Rhizoctonia）、青霉菌（Penicillium）、核盘菌属（Sclerotinia）、丛赤壳属（Nectria）中的多个物种和白粉菌。相比之下，仅有少数细菌性病原体被报告是生防产品的靶标。罕见的例子是导致根癌病（通过例如Agrosin84被防治）的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），及导致水果中火疫病（通过例如 被防治）的梨火疫病菌（Erwinia amylovora）。 [0007] 针对细菌性植物病原体的现有商业技术主要基于化学杀虫剂（通常抗生素）的应用。 [0008] 对有效抑制细菌性植物病原体的微生物拮抗剂的紧要需求通过由果胶杆菌属（Pectobacterium）和Dickeya的物种造成的马铃薯软腐病和黑胫病病害的有问题的管理说明。这些果胶分解细菌影响马铃薯植株和在包括储存的块茎生产的几乎所有阶段的块茎，且在世界范围内对（种用）马铃薯的生产形成持续的威胁。选择抗黑胫病和软腐病的马铃薯栽培品种没有得到免于果胶杆菌属和Dickeya物种的种子批（seed lots）（见Lapwood 和 Harris（1982），Potato Research25,41-50；Lapwood 和 Read(1984),Plant Pathology33,13-20）。物理的（例如热水处理）和化学程序明显只表面地消毒且不影响位于块茎的匍匐枝末端的维管系统内部的果胶分解的果胶杆菌属和Dickeya物种的高密度（见Czajkowski等人，（2009），European Journal of Plant Pathology125，263-275）。 [0009] 由Dickeya和果胶杆菌属物种造成的黑胫病和软腐病病害在欧洲的种用马铃薯的生产中正造成主要损失。Dickeya spp.在马铃薯黑胫病的发病中的作用似乎是提高的。此提高与检测出的Dickeya spp.新的遗传进化枝有关，其未能够被分类到由Samson等人最近描述的六种物种中的一种（2005，IJSEM55：1415-1427）（见Tsror等人（2008），European Journal of Plant Pathology123（3）：311-320；Stawiak等人，（2009），European Journal of Plant Pathology125（2）：245-261）。这个新的进化枝可能构成新的物种且暂时地被称为“D.solani”。许多欧洲国家（即荷兰、芬兰、波兰、德国、比利时、法国、英国、瑞典和西班牙）和以色列报告了在马铃薯中它的出现。 [0010] 在马铃薯中防治Dickeya物种和果胶杆菌属物种的可能性是有限的（见Van der Wolf和De Boer（2007），于：Potato biology and biotechnology,advances and perspectives.595-617页中，Elsevier，Amsterdam）。防治策略包括使用无病原体种子、避免伤害的措施、土壤排水以避免能够损害寄主抗性的块茎的氧气损耗、和卫生措施。然而，这些方法不保障无黑胫病病原体作物的生产。 [0011] 目前在实践中没有用于减少Dickeya和果胶杆菌属物种接种的块茎处理。通常，物理处理和化学防治剂的使用将只对减少存在于块茎的表面的接种物有帮助，但是不能消除位于更深处的接种物而不影响块茎发芽。没有可用的能够杀死内部病原体的系统性的杀细菌剂。 [0012] 作为生物防治剂的微生物的应用通常是对传统的物理和化学的处理的环境友好的替代方案。 [0013] 尽管使用细菌性拮抗剂可获得对植物中一些细菌性病害的有效的防治，如由根癌农杆菌造成的根癌病（见Lopez等人（1987），EPPO Bulletin 17：273-279）及由梨火疫病菌造成的火疫病（见Stockwell等人（1998），Phytopathology88:506-513），但是仅进行了有限的工作以在大田条件下在马铃薯植株中防治果胶分解细菌。没有基于生防剂或它们的混合物的预防黑胫病和软腐病病害的商业产品被引进市场。 [0014] 沙雷菌属是肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的革兰氏阴性、兼性厌氧、杆状细菌的一个属。最常见的物种是粘质沙雷菌（Serratia marcescens）。该属的成员经常产生灵菌红素，其是该属的典型的红色色素。 [0015] 由粘质沙雷菌呈现的针对细菌性植物病原体的拮抗活性较早时已被公开。Jafra S等人（2009，Journal of Applied Microbiology 106：268-277）描述了粘质沙雷菌的菌株能够抑制由鳞茎中软腐病的致病物水稻基腐细菌（Dickeya zeae）造成的浸渍作用。 [0016] 另外的沙雷菌属物种，即普城沙雷菌的菌株经常被用于防治植物的真菌病原体（见Berg,G.(2000)Journal of Applied Microbiology88:952-960；还见Frankowski等人(2001)Archives of Microbiology176:421-426）。关于在真菌的植物病原体防治中使用普城沙雷菌的全面的综述由DeVleesschauwer和 （2007，CAB Reviews：Perspectives in Agriculture，Veterinary Science，Nutrition and Natural Sources2：1-12）提供。 [0017] WO 01/40442A1描述了普城沙雷菌菌株和其代谢物用于杂草和真菌的抑制的用途。该菌株是以登录号40938保藏在NCIMB的A153且它的活性代谢物是haterumalide A、B、E和X。 [0018] 尽管经常使用普城沙雷菌作为针对真菌植物病原体的BCA，迄今为止没有报告此沙雷菌属物种针对细菌性植物病害的实质性拮抗活性。例如，商业上可用于真菌性病害的生防的普城沙雷菌菌株针对Dickeya物种在马铃薯中造成的软腐病和黑胫病病害显示微不足道的活性。在迄今为止描述作为潜在的抗微生物的BCA的普城沙雷菌的许多菌株中，没有报告任何菌株显示针对植物病原性细菌的任何活性（De Vleesschauwer和（2007），CAB Reviews：Perspectives in Agriculture,Veterinary Science,Nutrition and Natural Sources 2:1-12）。 [0019] 本发明人发现了命名为A30的普城沙雷菌的新的菌株。本发明人还发现普城沙雷菌A30是BCA。具体地，普城沙雷菌A30是针对在马铃薯植株中造成黑胫病病害的细菌的BCA。新发现的普城沙雷菌A30已被发现是针对分解果胶的Dickeya spp.、包括生物变型3菌株的BCA。 [0020] 本发明人发现用普城沙雷菌A30作为BCA处理块茎导致保护马铃薯植株免受黑胫病并根除块茎携带的Dickeya sp.的接种物。普城沙雷菌A30还被发现在土壤中存活且从土壤携带的接种物定殖到马铃薯块茎、根和茎上。定殖的普城沙雷菌A30还被发现在马铃薯植株内部持续存在。 [0022] 因此，本发明提供了普城沙雷菌菌株A30，BCCM保藏号LMG P-26170（2010年11月19日保藏）、其类似菌株或功能上等效的菌株。 [0023] BCCM LMG P-26170的保藏者是Wageningen University & Research Centre，Plant Research International，P.O.Box69，6700AB Wageningen，The Netherlands。授权的代表人是具有相同地址的Dr Jan M van der Wolf。保藏者已同意并授权本申请人Stichting Dienst Landbouwkunding Onderzoek和Stichting voor de Technische Wetenschappen在本申请参考该保藏的生物材料。 [0024] 功能上等效的菌株包括具有一个或多个普城沙雷菌菌株A30，BCCM保藏号LMG P-26170，特有的特征的那些菌株。 [0025] 该菌株产生针对Dickeya和果胶杆菌属物种的抗生素、在补充和不补充L-色氨酸下产生生长素、产生生物表面活性剂、是能动的、是不分解果胶的、生长在pH10.0的营养液中和在厌氧条件下的马铃薯葡萄糖培养液中。A30菌株不产生红色色素。 [0026] 优选地普城沙雷菌菌株A30是以分离的形式，尽管其可能与相同或不同属的其它细菌联合存在，不论所述其它细菌是通过人类的手被一起带来且一起培养的，或不论自然界中一起存在的细菌是部分地从和它们一起存在于自然界中的其它细菌中纯化的。 [0027] 在优选的实施方案中，A30菌株是基本上纯的培养物，其意味着细菌菌株的培养物不包括数量上足够干扰培养物复制的或通过常规细菌学技术可检测的其它细菌的物种。 [0028] “分离的”当与本文描述的生物体和培养物在一起使用时，不但意味着基本上纯的培养物，而且意味着不同于在自然界中发现的生长或保持的生物体的任何培养物。 [0029] 本发明的普城沙雷菌菌株A30可以以代谢活跃（metabolically active）的形式，这是说它在液体培养基中和/或在固体培养基上形成生长培养物。代谢活性可通过测量细菌细胞的生长简单地确定或例如可通过测量细胞膜的完整性或诸如DNA酶、酯酶、脂肪酶和/或明胶酶的某些酶的活性确定。可测量其他核心的代谢细菌酶的活性以评价代谢活性。 [0030] 任选地，本发明的普城沙雷菌菌株A30可以固体形式，例如或干燥的或冷冻干燥的培养物制剂。处于这种形式，细菌细胞被认为是基本上无代谢活性的，但是将干燥的制剂溶解到水相环境中后，细菌细胞活性连同可测量的细菌细胞生长和代谢是恢复的。 [0031] 本发明的普城沙雷菌菌株A30的变体、类似菌株或功能上等效的菌株可根据由生物体的基因编码的一个或多个蛋白组分的氨基酸序列而不同。例如，至少单一的氨基酸改变至至少一个蛋白可能发生，无论通过缺失、添加或置换。一个、两个、三个、四个、五个或更多个单一氨基酸改变可沿着一个氨基酸序列的长度不同地或在一个位置同时发生，例如一个、两个、三个、四个、五个或更多个单一氨基酸的缺失。以上述的方式，可改变普城沙雷菌菌株A30中多于一个蛋白以产生变体、类似菌株或功能上等效的菌株。 [0032] 保藏的普城沙雷菌菌株A30可在一个或多个蛋白的氨基酸序列上与其变体、类似菌株或功能上等效的菌株不同，如通过一致性的百分比度测量的。变体、类似菌株或功能上等效的菌株可与保藏的普城沙雷菌菌株A30在至少一个蛋白的氨基酸序列上共享95%的一致性，优选地与其至少96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%的一致性。变体、类似菌株或功能上等效的菌株中所有蛋白的氨基酸序列可与保藏的普城沙雷菌菌株A30跨多个氨基酸序列共享至少95%的一致性，优选地与其至少96%、97%、98%、99%、99.5%、 99.6%、99.7%、99.8%或99.9%的一致性。一致性可跨生物体中基本上所有的氨基酸序列按列举的百分比一致性被共享。 [0033] 与保藏的普城沙雷菌菌株A30相比，本发明的普城沙雷菌菌株A30的变体、类似菌株或功能上等效的菌株可根据至少其基因组的一些的核酸序列而不同。一个或多个基因序列可能不同，不论该基因是用于结构的还是控制的元件。变体、类似菌株或功能上等效的菌株可与保藏的普城沙雷菌菌株A30的核苷酸序列至少95%是一致的，优选地与其至少96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%的一致性。 [0034] 所提到的百分比一致性还包括且涉及保藏的菌株和其变体、类似菌株或功能上等效的菌株之间的百分比同源性。 [0035] 根据DSMZ（German collection of Microorganisms and Cell cultures）将普城沙雷菌分类到危害等级1，意味着预期该物种不会对人类和环境造成风险。迄今为止，没有普城沙雷菌的人类或动物相关的致病因素被描述。 [0036] 本发明还提供了生物培养物，该生物培养物包括如在上文中描述的普城沙雷菌菌株A30，保藏号LMG P-26170，或其变体、类似菌株、或功能上等效的菌株，和固体或液体培养基、或其组分（fraction）。 [0037] 本发明的生物培养物可以是基本上未被其它微生物污染的以至其基本上包括普城沙雷菌A30和/或其变体、类似菌株、或其功能上等效的菌株。该培养物根据细菌细胞组分可是基本上同质的，即至少95%的普城沙雷菌A30和/或其变体、类似菌株、或其功能上等效的菌株；优选地同质性选自至少：96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%中的一个。除了普城沙雷菌A30和/或其变体、类似菌株、或其功能上等效的菌株之外，生物培养物可不包括其他的有适应力的或有活性的细菌细胞。 [0038] 本发明因此还提供了基本上分离的普城沙雷菌A30和/或其变体、类似菌株、或其功能上等效的菌株。 [0039] 本发明还提供了用于植物病害生物防治的组合物，该组合物包括普城沙雷菌菌株A30，保藏号LMG P-26170，或其变体、类似菌株、或功能上等效的菌株，及农业上或园艺上可接受的稀释剂、载体、填料或佐剂。 [0040] 本发明内的组合物可被制备为：水悬浮液；稳定的液体悬浮液；乳油（emulsifiable concentrate）；胶囊；可溶性或可湿性粉末；水性悬浮剂（aqueous flowable）；干悬浮剂（dry flowable）；可湿性颗粒；可湿性分散颗粒；及由本领域技术人员所知的类似物。 [0041] 农业上可接受的或园艺上可接受的稀释剂的实例包括单糖、多糖、糖蜜、树胶、木素磺酸盐、甘油、山梨醇、丙二醇的水溶液，水，植物油和矿物油。载体可包括诸如藻酸珠、硬质小麦粉（淀粉）颗粒、硅石、黏土、黏土矿物（例如绿坡缕石、高岭石、蒙脱石、叶蜡石（pyrophillite）、伊利石）、明胶、纤维素、纤维素衍生物、亚氯酸钙和滑石粉的固体。在一些实施方案中，载体可是多孔固体，例如硅藻土、活性碳、（例如动物骨碳）、泥炭、蛭石、褐煤、木屑和玉米穗轴。 [0043] 优选地，组合物还包括取决于针对病害处理植物、植物组织或植物部分的处理的途径和时间的普城沙雷菌A30和/或其变体、类似菌株、或其功能上等效的菌株的合适量或浓度。优选地应用高于病原体接种物的生防剂。 [0044] 菌株A30的组合物可借助机械（喷雾器）或灌溉系统人工地应用于植物。植物部分诸如块茎可浸在水或液态悬浮液或固体粉末或喷雾中。考虑到由病原性植物细菌造成的病害的发生的不可预测性，可期望本发明的组合物在作物周期期间的多次应用。只要有可能，在病原体暴露之前用本发明的菌株A30接种植物是优选的。 [0045] 根据本发明的应用方法由在种植之前，将马铃薯块茎浸在菌株A30的水性悬浮液6 12 -1 中组成。菌株A30处于10 至10 菌落形成单位（cfu）每毫升（cfu.ml ）的范围的浓度。 8 10 -1 A30菌株优选的浓度范围是10 至10 cfu.ml 。 [0046] 可将A30与有机的和/或无机的肥料共同添加以帮助在叶子、根、和土壤中建立A30菌群。肥料可在A30菌株存在的同时或之前或之后被添加。肥料可被添加至植物和/或至土壤中。 [0047] 在用于大田条件的本发明优选的实施方案中，采用在108至1010cfu.ml-1之间的菌9 -1 株A30的浓度。在更优选的实施方案中，浓度是在0.5至9.5×10cfu.ml 的范围。在大田中，块茎可在种植的时候用少至约1ml的悬浮液处理。 [0048] 在一些实施方案中，在种植之前可将块茎浸到液体中。在优选的实施方案中，在种植的时候用包括本发明的菌株A30的液体组合物将块茎喷雾。喷雾可以以已知的与诸如和穗宁（monceren）的杀真菌剂有关的方式被实施。在优选的实施方案中，当发芽和根形成的时候，普城沙雷菌将直接定殖于植物。 [0049] 本发明的组合物还可包括一种或多种另外的组分，该另外的组分可以是生物防治剂、抗生素、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、植物生长调节剂（plant growth substance）、自然的植物防御的诱导物或肥料。该一种或多种另外的组分可被同时地、单独地或顺序地施用于植物或植物部分。本发明的普城沙雷菌A30和/或其变体、类似菌株、或其功能上等效的菌株可在其他另外的组分之前或之后被施用。 [0050] 当然，由于另外的物质，例如，杀虫剂的潜在的抗细菌活性（除非预先在生物测定中被检测），应该通常避免将它们与本发明菌株A30一起应用。如果将使用杀虫剂，那么优选地在应用杀虫剂一周后再应用本发明的A30菌株。 [0051] 本发明因此包括组分的试剂盒（kit of parts），该试剂盒包括含有普城沙雷菌A30和/或其变体、类似菌株、或其功能上等效的菌株的组合物的第一个容器、及含有农业上或园艺上可接受的稀释剂、载体或佐剂的第二个容器。第二个容器还可包括另外的组分诸如生物防治剂、抗生素、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、植物生长调节剂或肥料。 [0052] 可选地，第二个容器包含农业上或园艺上可接受的稀释剂、载体或佐剂，且还有另外的容器包含另外的组分诸如生物防治剂、抗生素、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、植物生长调节剂或肥料。 [0053] 本发明的试剂盒还可包括打印或电子形式的书面说明。 [0054] 其他的生物防治剂可包括微生物诸如真菌，例如哈茨木霉、多孢木霉和绿粘帚霉，和/或细菌，例如放射形土壤杆菌、荧光假单胞菌及枯草杆菌和/或噬菌体。 [0056] 除草剂作为附加的组合物组分可包括二甲酚草胺（dimethenamid）、EPTC、草甘膦（glyphosphate）、对草快（paraquat）、二甲戊灵（pendimethalin）、稀禾定（sethoxydim）、砜嘧磺隆（rimsulfuron）、异丙甲草胺（metolachlor）或草克净（metrubuzin）。 [0057] 杀 虫 剂 作 为 附 加 的 组 合 物 组 分 可 包 括2,4- 二 氯 苯 氧 乙 酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid（2,4-D））、氯 苯胺灵（chloropropham）、DDT、DDE、狄氏剂（dieldrin）、硫丹（endosulfans）、噻苯咪唑（thiabendazole）、邻苯基苯酚（c-phenylphenol）和甲拌磷（phorate）。 [0058] 杀真菌剂作为附加的组合物组分可包括甲霜灵（metalaxyl）和/或氨基甲酸酯类化合物、霜脲氰（cymoxanil）和代森锰锌（mancozeb）。特别地霜脲氰和代森锰锌的协同组合是有用的。 [0059] 植物生长调节剂作为组合物的附加组分可包括生长素或脱落酸（ABA）。生长素可以是2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）、α-萘乙酸（α-NAA）、2-甲氧基-3,6-二氯苯甲酸（麦草畏（dicamba））、4-氨基-3,5,6-三氯吡啶羧酸（毒莠定或氨氯吡啶酸）或α-(对氯苯氧)异丁酸(PCIB，抗生长素)中的一个或多个。 [0060] 本发明的组合物还可包括生根基质，例如混合肥（compost）、土壤（天然的或人工的）、沙子、和/或诸如蛭石的惰性颗粒生根介质。 [0061] 用本发明的组合物处理的植物、植物组织或植物部分获得普城沙雷菌A30和/或其变体、类似菌株、或其功能上等效的菌株的外源和/或内源的感染。只有单一处理可以是必须的，尽管可能要求两次或多次处理以获得最佳的感染。尽管不希望被任何具体的理论约束，本发明人相信用普城沙雷菌A30和/或其变体、类似菌株、或其功能上等效的菌株的内源的和/或外源的感染导致阻止还可能存在的任何其他细菌物种，尤其是果胶杆菌Pectobacterium spp.和/或Dickeya spp.的生长。本发明人发现菌株A30是内生菌（endophyte），内生菌是定殖于植物的活的、内部的组织的不造成任何直接的、明显的负面效果的微生物。 [0062] 在其他的细菌物种已经感染了植物、植物部分或组织的情况下，用本发明的组合物处理允许感染普城沙雷菌A30和/或其变体、类似菌株、或其功能上等效的菌株以最终超过最初的细菌物种。因此，本发明的组合物可被用于预防或治疗病害，例如植物中的软腐病或黑胫病。 [0063] 本发明因此还包括含有外源的和/或内源的普城沙雷菌菌株A30，保藏号LMG P-26170，或其变体、类似菌株、或功能上类似菌株的植物、植物部分或植物组织。根据本发明的这方面的此类植物的范围被列在下面作为易受根据本发明的方法的处理影响的植物。 [0064] 本发明还包括预防或治疗植物中病害的方法，包括将植物、植物部分或植株组织暴露于普城沙雷菌菌株A30，保藏号LMG P-26170，或其变体、类似菌株、或功能上等效的菌株。相似地，本发明的此类方法包括应用本文中描述的本发明的组合物于植物、植物部分或组织以提供对植物病原性细菌造成的感染的生物防治。A30菌株和其组合物的应用的方法以及用于混合和应用组合物于植物、植物部分及植物器官的装置是普通的技术人员所熟悉的。这些方法的对象可以是种子、幼苗、植物、作物、植物部分、花、果实、植物营养部分（例如种块（seed tuber）和植物扦插（plant cutting））、用于培养植物材料的土壤和人工基质系统。菌株A30和其组合物的生物防治剂的菌株应用可以在收获前或收获后。 [0065] 在植物具有块茎、鳞茎、球茎或根茎情况下，且将根据本发明处理植物，那么本发明的组合物的应用优选地在种植块茎、鳞茎、球茎或根茎之前进行。种子也可在播种之前根据本发明被处理。处理可采取种子包衣的形式，其中本发明的A30菌株被掺入已知的种子包衣混合物中。被包衣的种子可采取丸状形式。 [0066] 可选地或另外地，不论植物是否具有块茎、鳞茎、球茎或根茎，本发明的组合物都可被应用于植物的地上部或地上部的部分。 [0067] 本发明因此包括普城沙雷菌菌株A30，保藏号LMG P-26170，或其变体、类似菌株、或功能上等效的菌株，作为用于植物病害的预防或治疗的生物防治剂。 [0068] 本发明的方法和用途优选地用于预防或治疗由细菌性病害病原体造成的植物病害，具体地马铃薯软腐病或“黑胫病”。被治疗或预防的细菌性病原体优选地是Dickeya spp.和/或果胶杆菌Pectobacterium spp.，优选地是Dickeya spp.生物变型3（Dickeya sp.biovar 3）菌株。 [0069] 大范围的植物易受通过使用本文中描述的发明的方法和组合物的细菌性病害的预防或治疗的影响。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。 [0070] 在易受由Dickeya spp.感染影响的单子叶植物中，该植物可以是天南星科（Araceae）、棕榈科（Arecaceae）、独尾草科（Asphodelaceae）、凤梨科（Bromeliaceae）、风信子科（Hyacinthaceae）、鸢尾科（Iridaceae）、芭蕉科（Musaceae）、兰科（Orchidaceae）、禾本科（Poaceae）、或姜科（Zingiberaceae）的物种成员。 [0071] 易受由Dickeya spp.感染影响的植物可以是来自选自万年青Aglaonema spp.、Aechema spp.、花叶万年青Dieffenbachia spp.、喜林芋Philodendron spp.、合果芋Syngonium spp.、千年芋Xanthosoma spp.、马蹄莲Zantedeschia spp.、海枣Phoenix spp.、芦荟Aloe spp.、凤梨Ananas spp.、鸢尾Iris spp.、芭蕉Musa spp.、蝴蝶兰Phalaenopsis spp.、臂形草Brachiaria spp.、稻Oryza spp.、甘蔗Saccharum spp.、高粱Sorghum spp.、玉蜀黍Zea spp.、或小豆蔻Elettaria spp.的单子叶植物属的物种。优选的物种包括斑叶万年青（Aglaonema pictum）、Aechema fasciata、花叶万年青Dieffenbachia spp.、裂叶喜林芋（Philodendron selloum）、合果芋（Syngonium podophyllum）、Xanthosoma sagittifolia、白花海芋（Zantedeschia aethopica）、海枣（Phoenix dactylifera）、芦荟（Aloe vera）、菠萝（Ananas comosus）、Iris x germanica、甘蕉（Musa paradisiaca）、蝴蝶兰Phalaenopsis spp.、臂形草Brachiaria spp.、水稻（Oryza sativa）、甘蔗（Saccharum officinarum）、高粱（Sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）、或豆蔻（Elettaria cardomomum）。 [0072] 在双子叶植物中，易受Dickeya spp.感染影响的植物可以是伞形科（Apiaceae）、菊科（Asteraceae）、秋海棠科（Begoniaceae）、十字花科（Brassicaceae）、石竹科（Caryophyllaceae）、旋花科（Convolvulaceae）、景天科（Crassulaceae）、大戟科（Euphorbiaceae）、豆科（Fabaceae）、牻牛儿科（Geraniaceae）、苦苣苔科（Gesneriaceae）、紫金牛科（Myrsinaceae）或茄科（Solanaceae）中的物种成员。 [0073] 易受由Dickeya spp.感染影响的植物可以是来自选自秘鲁胡萝卜Arracacia spp.、胡萝卜Daucus spp.、菊Chrysanthemum spp.、菊苣Cichorium spp.、菜蓟Cynara spp.、大丽花Dahlia spp.、秋海棠Begonia spp.、石竹Dianthus spp.、番薯Ipomoea spp.、高凉菜Kalanchoe spp.、大戟Euphoribia spp.、向日葵Helianthus spp.、苜蓿Medicago spp.、银胶菊Parthenium spp.、天竺葵Pelargonium spp.、非洲堇Saintpaulia spp.、仙客来Cyclamen spp.、茄Solanum spp.或烟草Nicotiania spp.的双子叶植物属的物种。优选的物种包括Arracacia xanthorrhiza、胡萝卜（Daucus carota）、大滨菊（Chrysthanthemum maximum）、案头菊（Chrysanthemum x morifolium）、菊苣（Cichorium intybus）、刺棘蓟（Cynara cardunculus）、大丽花Dahlia sp.、Begonia bertinii、康乃馨（Dianthus caryophyllus）、甘薯（Ipomoea batatus）、长寿花（Kalanchoe blossfeldiana）、一品红（Euphorbia pulcherrima）、向日葵（Helianthus annuus）、苜蓿（Medicago sativa）、天竺 葵（Pelargonium capitatum）、非 洲紫 罗兰（Saintpaulia ionantha）、仙客 来Cyclamen sp.、番茄（Solanum lycopersicum）、烟草（Nicotiana tabacum）、茄子（Solanum melongena）和马铃薯（Solanum tuberosum）。 [0074] 在易受果胶杆菌Pectobacterium spp.感染影响的单子叶植物中，该植物可以是龙舌兰科（Agavaceae）、葱科（Alliaceae）、天南星科、独尾草科、凤梨科、薯蓣科（Dioscoreaceae）、鸢尾科、百合科（Lilaceae）、兰科、露兜树科（Pandanaceae）、假叶树科（Ruscaceae）或Strelitzaceae的物种成员。 [0075] 易受果胶杆菌Pectobacterium spp.感染影响的植物可以是来自选自龙舌兰Agave spp.、葱Allium spp.、花叶万年青Dieffenbachia spp.、藤芋Scindapsus spp.、彩色海芋Zantedeschia spp.、芦荟Aloe spp.、薯蓣Dioscorea spp.、鸢尾Iris spp.、郁金香Tulipa spp.、卡特兰Cattleya spp.、大花蕙兰Cymbidium spp.、蝴蝶兰Phalaenopsis spp.、露兜树Pandanus spp.、龙血树Dracaena spp.、鹤望兰Strelitzia spp.的单子叶植物属的物种。优选的物种包括龙舌兰（Agave tequilana）、洋葱（Allium cepa）、花叶万年青Dieffenbachia spp.、绿萝（Scindapsus aureus）、马蹄莲（Zantedeschia aethiopica）、黄花马蹄莲（Zantedeschia elliottiana）、红花马蹄莲（Zantedeschia rehmannii）、木立芦荟（Aloe arborescens）、薯蓣Dioscorea spp.、郁金香Tulipa spp.、卡特兰Cattleya spp.、大花蕙兰Cymbidium spp.、蝴蝶兰Phalaenopsis spp.、Pandanus conoideus、富贵竹（Dracaena sanderiana）、鹤望兰（Strelitzia reginae）。 [0076] 在双子叶植物中，易受果胶杆菌Pectobacterium spp.感染影响的植物可以是苋科（Amaranthaceae）、漆树科（Anacardiaceae）、伞形科、菊科、十字花科、仙人掌科（Cactaceae）、景天科、葫芦科（Cucurbitaceae）、大戟科、樟科（Lauraceae）、锦葵科（Malvaceae）、桑科（Moraceae）、紫金牛科、报春花科（Primulaceae）、蔷薇科（Rosaceae）或茄科的物种成员。 [0077] 易受果胶杆菌Pectobacterium spp.感染影响的植物可以来自选自甜菜Beta spp.、菠菜Spinacea spp.、芒果Mangifera spp.、芹菜Apium spp.、秘鲁胡萝卜Arracacia spp.、芫荽Coriandrum spp.、胡萝卜Daucus sp.、牛蒡Arctium spp.、菊苣Cichorium spp.、向日葵Helianthus spp.、莴苣Lactuca spp.、银胶菊Parthenium spp.、万寿菊Tagetes spp.、山嵛Eutrema spp.、芸苔Brassica spp.、萝卜Raphanus spp.、刺萼柱Acanthocereus spp.、巨人柱Carnegiea spp.、强刺球Ferocactus spp.、仙人掌Opumtia spp.、新绿柱Stenocereus spp.、长寿花Kalanchoe spp.的双子叶植物属的物种。优选的物种包括甜菜（Beta vulgaris）、菠菜（Spinacea oleracea）、芒果（Mangifera indica）、芹菜（Apium graveolens）、秘鲁胡萝卜（Arracacia xanthorrhiza）、芫荽（Coriandrum sativum）、胡萝卜（Daucus carota）、小牛蒡（Arctium minus）、菊苣（Cichorium intybus）、向日葵（Helianthus annuus）、莴苣（Lactuca sativa）、银胶菊（Parthenium argentatum）、法国万寿菊（Tagetes patula）、块茎山菜（Eutrema wasabi）、甘蓝（Brassica oleracea）、芜菁（Brassica rapa）、甘蓝型油菜萝卜（Brassica sativus）、萝卜（Raphanus sativus）、五 棱角（Acanthocereus tetragonus）、巨 人 柱莲（Carnegiea giganteum）、金 赤 龙（Ferocactus wislizenii）、印榕仙人掌（Opuntia ficus-indica）、Opuntia fulgida、Opuntia phoeacantha、缩刺仙人掌（Opuntia stricta）、Opuntia violacea、Stenocereus thurberi、Kalanchoe blossfedliana。 [0078] 有利地，本发明提供了对环境低毒影响、病原体发展的抗性的低风险的生物防治剂。还有A30菌株在植物系统中定殖之后，生防效果的相对持久性/长期性。 [0079] 菌株A30的效力相对广泛；例如，相比于拮抗的芽胞杆菌（Bacillus）物种，A30菌株在马铃薯块茎片上具有针对Dickeya和果胶杆菌属二者的物种的强拮抗活性。 [0080] A30菌株的另外一个优势是它是植物根的异常强大的内部的和外部的定殖菌且这有助于它成功作为生物防治剂。菌株A30的这些优势是完全出乎意料的，尤其是作为组合。 [0082] 图1.显示在马铃薯薄片上应用的普城沙雷菌A30针对由生物变型3Dickeya sp.造成的浸渍的保护性效果。在马铃薯薄片试验中评价普城沙雷菌A30的GFP标记菌株针对由Dickeya sp.造成的浸渍保护马铃薯块茎组织的能力。在NB中、于28℃摇动（200rpm），过夜生长A30和Dickeya sp.IP02222。离心（5min，6000×g）细菌并用1/4Ringer缓冲液8 -1 6 -1 洗两次。用无菌水调整A30的密度为约10cfu ml 且Dickeya sp.为约10cfu ml 。用 8 -1 6 -1 50μl含有10cfu ml 的A30和10cfu ml Dickeya sp.的悬浮液填充块茎的孔。源于三个不同块茎的三个马铃薯薄片被用于每一个处理。对于阴性对照，用50μl无菌水代替 6 -1 细菌悬浮液且对于阳性对照，使用50μl含有10cfu ml 的Dickeya sp.。独立重复实验。 为了病害形成，于28℃在潮湿箱中培养薄片72h。通过比较共接种的孔周围的腐烂的马铃薯组织的平均直径与阳性对照的孔周围的腐烂的马铃薯组织的平均直径测量A30在马铃薯组织上的保护效果。 [0083] 图2.通过测量在28℃潮湿箱中培养72h之后腐烂组织的直径（以mm计）确定凭借普城沙雷菌A30的应用，Dickeya sp.IPO3012浸渍能力的减弱。用50μl的无菌水（阴性对6 -1 照）、50μl含有10cfu ml Dickeya sp.IPO3012的水中细菌悬浮液（阳性对照）或50μl 6 -1 4 5 6 含有10cfu ml Dickeya sp.的IPO3012和不同密度的普城沙雷菌A30（0、10、10、10、 7 8 -1 10 和10cfuml ）的水中细菌悬浮液接种马铃薯薄片的孔。三个马铃薯薄片每个含有3个孔且源自3个不同的块茎被用于每一个处理。独立重复实验一次且对结果进行平均。 [0084] 图3.显示在马铃薯薄片上的GFP标记的普城沙雷菌A30和Dickeya sp.IPO3012的菌群动态。用GFP标记的普城沙雷菌A30（图3A）、DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012（图3B）接种马铃薯薄片或用两种菌株共接种马铃薯薄片（图3C）。条代表标准误差。 [0085] 为评价在马铃薯薄片上的细菌密度，在存在4ml1/4Ringer缓冲液的Universal Bioreba袋子中用锤子压碎独立地收集自每一次处理和每一个时间点的3个随机选择的孔的约2g的马铃薯组织。将100μl未稀释的、1000和10,000倍稀释的提取物进行NA平皿倾注（NA pour plated）。 [0086] 培养基中补充40μg ml-1的四环素。于28℃孵育平板24-48h且用落射荧光立体显微镜筛选DsRed和/或GFP荧光细胞的存在。来自每次处理和每个时间点的自由独立样品的结果被平均。独立重复实验。 [0087] 图4.显示在接种后1、7和28天取样的种块（图4A）、地上部（图4B）、和根（图4C）中GFP标记的普城沙雷菌A30和DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012的菌群动态。植物样品在提取之前被表面消毒。 [0088] 在每个时间点每株的整个种块和总根被取样。在接种后7天，每株的所有地上部被取样作为混合样品且在28天时，取自地平面以上5cm的茎段的混合样品被逐株分析。植物样品在提取细菌之前被表面消毒。植物提取物进行NA平皿倾注且在孵育之后，平板被筛选绿色和/或红色荧光菌落。显示来自每个时间点的十株植株的来自两组实验的平均值。对每个子样品和每个时间点进行统计分析（土壤n=10、总根n=10、茎n=10、种块n=10）。由相同字母紧随的值没有显著差异（P=0.05）。 [0089] 图5.显示在28℃NA琼脂中孵育被嵌入的植株部分1-2天以允许细菌生长之后，通过共聚焦激光扫描显微术分析接种后7天和28天由GFP标记的普城沙雷菌A30（绿色）和DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012（红色）在马铃薯根（图5A）和茎（图5B）的内部的定殖。样品采自用GFP标记的普城沙雷菌A30(A30)接种块茎的植株、从用DsRed标记的Dickeya sp.（IPO3012）真空渗透的块茎培养出的植株和用两种菌株顺序接种（共接种）之后的块茎。 对于对照，用无菌水（水）真空渗透马铃薯块茎。对于植物细胞的复染，使用UV光。 [0090] 图6.显示土壤感染后28天，由GFP标记的普城沙雷菌A30（绿色团簇）在新收集的马铃薯根的表面的定殖。采用共聚焦激光扫描显微术分析在新收集的植株样品上的根。为了这个，收集根，短暂地在无菌自来水中冲洗以去除土壤颗粒并直接处理用于显微镜检查。对于对照，用相同的方式制备并处理水接种的植株的根。对于植物细胞的复染，使用UV光。 [0091] 在由本发明人实施的温室实验中，在临种植之前用GFP标记的普城沙雷菌A30处理块茎导致保护马铃薯块茎/植株免受Dickeya sp.和黑胫病症状。与Dickeya sp.IPO3012接种的对照植株相比，表现块茎腐烂或典型的黑胫病症状的植株的百分数显著减少。 [0092] 用GFP标记的普城沙雷菌A30处理块茎导致马铃薯植株的快速定殖。仅在细菌应用于土壤后7天，马铃薯植株被系统地且内部地定殖。在土壤中接种之后，普城沙雷菌A30能够在马铃薯植株内部向上运动至茎。然后细菌在马铃薯组织中存活。细菌的运动通过根和茎中的维管组织的木质部导管发生。根和茎内的相对低但是稳定的普城沙雷菌A30菌群存在至少28天。普城沙雷菌A30享有在植物内不造成任何病害症状且仅建立小的内部的菌群的典型的内生菌的特征。在多数共接种的植株中，根和茎内的这些小的A30菌群足够保护马铃薯植株免受Dickeya sp.IPO3012的定殖以及表现典型的黑胫病症状。 [0093] 本发明人还发现普城沙雷菌A30还能够定殖在根表面。7天之后细菌已经存在于根的维管组织内部且28天之后我们在根表面观察到庞大的A30菌群。 [0094] 本发明人还观察到普城沙雷菌A30能够有效地定殖在根组织内部，说明该细菌能够通过在根形成过程中引起的自然开口侵入根。 [0095] 实施例1-鉴定拮抗Dickeya solani的细菌 [0096] 从不同块茎（栽培品种Arcade、Konsul、Kondor、Agria）的腐烂的马铃薯块茎组织中通过将腐烂的马铃薯块茎提取物在琼脂培养基TSA、NB、King’s B或R2A上涂板并收集形态学上不同的细菌菌落分离细菌。对649种分离的菌株筛选针对D.solani的抗生作用或铁离子螯合蛋白（铁载体（siderophore））的产生。在这些中，112种分离株产生铁载体、41种产生抗生素且496种是针对D.solani无活性的。 [0097] 选择41种产生抗生素的菌株和41种产生铁载体的菌株在马铃薯薄片试验中检验针对D.solani的拮抗作用。选择能够减少马铃薯块茎组织的腐烂至对照的至少50%的菌株。这些分离株随后通过16S rRNA测序鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、红球菌属（Rhodococcus）、沙雷菌属（Serratia）、肥大杆菌属（Obesumbacterium）或Lysinbascillus的物种。 [0098] 这些分离株中的23种，13种产生抗生素且10种产生铁载体，通过检验菌群感应信号检测（quorum sensing signal detection）、游动性、生物表面活性剂的产生、在低（4.0）和高（10.0）pH下的生长、于10℃在有氧和厌氧条件下的生长及依赖和不依赖于色氨酸的生长素的产生进一步鉴定。 [0099] 采用上述分离株中的12种并在温室的植物中检测。用每一种分离株接种马铃薯块茎。 [0100] 作为温室实验的结果，发现四种拮抗的菌株。 [0101] 这些中的一种是普城沙雷菌A30，其根据布达佩斯条约（Budapest Treaty）以保藏号LMG P-26170保藏在Belgian Co-ordinated collection of Microorganisms（BCCM）。 [0102] 该菌株基于体外产生针对Dickeya sp.的抗生素被选择。A30菌株产生针对Dickeya sp.的抗生素，能够降解酰基高丝氨酸内酯并产生生物表面活性剂。该菌株是游动的且能够在有氧或厌氧条件下生长。A30菌株还产生植物生长刺激性的生长素。 [0103] 实施例2-分析普城沙雷菌A30针对Dickeya sp.IPO2222的浸渍作用保护马铃薯块茎组织的能力 [0104] 在马铃薯薄片试验中评价普城沙雷菌A30针对Dickeya sp.IPO2222的浸渍作用保护马铃薯块茎组织的能力。在NB中、于28℃摇动（200rpm），过夜生长A30和Dickeya sp.IPO2222。离心（5min，6000×g）细菌并用1/4Ringer缓冲液洗涤两次。用无菌水调整8 -1 6 -1 8 A30的密度至约10cfuml 且Dickeya sp.至约10cfu ml 。块茎的孔用50μl含有10cfu -1 6 -1 ml 的A30和10cfu ml Dickeya sp.的悬浮液填充。源于三个不同块茎的三个马铃薯薄片被用于每一个处理。对于阴性对照，用50μl无菌水代替细菌悬浮液且对于阳性对照，使 6 -1 用50μl含有10cfu ml Dickeya sp.。独立重复实验。为了病害形成，于28℃在潮湿箱中培养薄片72h。通过比较共接种的孔周围的腐烂的马铃薯组织的平均直径与阳性对照的孔周围的腐烂的马铃薯组织的平均直径测量A30在马铃薯组织上的保护效果。结果显示普城沙雷菌A30针对Dickeya sp.IPO2222的浸渍作用的明确而有力的保护性效果（见图1）。 [0105] 实施例3-构建用GFP或RFP蛋白标记的标记菌株 [0106] 为了评价对马铃薯植株组织内部的互作和细菌菌群的了解并为了通过显微镜原位包括在植物中（in planta）可视化活的细菌细胞，分别用红色荧光蛋白（DsRed）标记生物变型3Dickeya sp.菌株及用绿色荧光蛋白（GFP）标记普城沙雷菌A30。用GFP和DsRed蛋白的标记使得对两种细菌物种的定位和菌群动态的详细的显微术研究成为可能。 [0107] 用于培养的细菌菌株和培养基 [0108] 普城沙雷菌A30（保藏登录号LMG P-26170）和生物变型3型菌株Dickeya sp.IPO2222（Slawiak等人（2009），European Journal of Plant Pathology125：245-261）在使用之前在胰蛋白酶大豆琼脂（tryptic soya agar，TSA）（Oxoid）或营养琼脂（nutrient agar，NA）（Oxoid）上在28℃生长24-28h。在营养肉汤（nutrient broth，NB）（Oxoid）和/或胰蛋白酶大豆肉汤（tryptic soya broth，TSB）（Oxoid）中于28℃振荡24h（200rpm）制备液体培养物。GFP标记的普城沙雷菌A30菌株和DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012菌-1株生长在补充40μg ml 四环素（Sigma）（NAt、TSAt、NBt、TSBt）的相同的培养基上或中。 -1 当分析植物提取物时，生长培养基另外补充环己酰亚胺（Sigma）至终浓度为200μg ml 以预防可能的真菌生长。 [0109] GFP标记的普城沙雷菌A30菌株和DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012菌株的产生[0110] 分别采用质粒pRZ-T3-gfp和pRZ-T3-dsred产生GFP标记的普城沙雷菌A30（A30GFP）和DsRed标记的生物变型3Dickeya sp.IPO3012（亲代菌株Dickeya sp.IPO2222）。将携带编码荧光蛋白的基因的质粒按照先前的描述（见Czajkowski等人（2010），Phytopathology100：134-142）通过电穿孔（见Calvin和Hanawalt（1988），Journal of Bacteriology170：2796-2801）引入细菌细胞中。简略地，将约50μl的A30或IPO2222的 11 12 -1 -1 感受态细菌细胞的悬浮液（含有约10 -10 cfu.ml ）与100ngμl 质粒DNA混合并在4℃使用Bio-Rad Gene Pulser200/0.2（Biorad，Hercules，CA，USA）在2.5kV下电击1-2sec。 电穿孔之后，细菌细胞在500μl的NB中于28℃振荡复苏1h。将数百微升的转化的细胞在-1 含有40μg ml 四环素的TSA上涂板并在28℃孵育24-48h以选择阳性GFP或DsRed荧光转化株。 [0111] 用pRZ-T3-gfp质粒转化普城沙雷菌A30及用pRZ-T3-dsred质粒转化Dickeya sp.IPO2222分别得到43和29株转化株。收集每种细菌的具有高荧光的菌落。在选择性条件下在琼脂平板上重复转移转化株显示细菌以稳定的方式表达GFP或DsRed。通过质粒DNA纯化和琼脂糖凝胶电泳证明在普城沙雷菌A30-GFP中存在pRZ-T3-gfp和在Dickeya sp.IPO3012中存在pRZ-T3-dsred。 [0112] 用荧光蛋白标记普城沙雷菌A30和Dickeya sp.IPO2222不影响菌株的适应性。转化的菌株和亲本野生型菌株以相同的方式起作用，显示表达GFP和DsRed蛋白没有显著影响重要的生物特征。 [0113] 实施例4-与亲本菌株的生长相比，GFP和DsRed标记的细菌菌株的生长 [0114] 为比较标记的细菌和亲本菌株（Dickeya sp.IPO3012对IPO2222及A30对9 10 -1 A30GFP）在有氧条件下的细菌生长，将NBt中具有约10-10 cfuml 的密度的过夜的细菌培养物在相同的培养基中稀释50倍。细菌生长在28℃，转速为200rpm。通过测量直到24h的一段时间的OD600测定生长速率。 [0115] 通过向30ml在PEB中的细菌悬浮液中添加5ml液体石蜡建立的Dickeyasp.菌株在厌氧条件下的生长（见Perombelon,M.,C,M,和J.M.Van der Wolf(2002).Methods for the detection and quantification of Erwinia carotovora subsp.atroseptica(Pectobacterium carotovorum subsp.atrosepticum)on potatoes:a laboratory manual,Scotish Crop Research Institute），以与有氧条件下生长的描述的相似的方式被测定，例外的是培养物在孵育期间未被摇动。 [0116] 普城沙雷菌A30-GFP和Dickeya sp.IPO3012在液体培养基中分别显示与亲本野生型A30和IPO2222菌株相似的生长特征，显示菌株的生长未被pRZ-T3质粒的存在或表达荧光（GFP或DsRed）蛋白影响。 [0117] 实施例5-DsRed标记的Dickeya sp.的块茎组织浸渍能力 [0118] 在Ringer缓冲液（Merck）中稀释细菌悬浮液至浓度约106cfu ml-1。用流动的自来水冲洗栽培品种Agria（Agrico，The Netherlands）的马铃薯块茎，随后用70%乙醇洗两次，每次5min且用去离子水洗两次，每次1min。块茎用棉纸（tissue paper）擦干并切成0.7cm厚的横向圆状薄片。 [0119] 使用具有直径为5mm的无菌的软木钻孔机制作每个薄片上的三个5mm深的孔。用50μl的细菌悬浮液填充孔。源自三个不同块茎的三个马铃薯薄片被用于每一个处理。为病害形成，于28℃在潮湿箱中培养薄片72h。于28℃培养72h后，测量接种的孔周围的腐烂组织的直径。将结果与野生型菌株的结果及水对照比较。用相同的方案，重复实验两次。 [0120] 在马铃薯薄片试验中，比较Dickeya sp.IPO3012和IPO2222浸渍马铃薯块茎组织的能力。接种的块茎薄片在28℃培养3天之后，腐烂组织的直径与野生型IPO2222菌株无显著不同。 [0121] 在该马铃薯薄片试验中，当以比Dickeya sp.高100倍的密度应用时，GFP标记的普城沙雷菌A30能够完全停止由Dickeya sp.IPO3012造成的马铃薯组织浸渍，且当以比Dickeya sp.高10倍或与Dickeya sp.相等的密度应用时，GFP标记的普城沙雷菌A30能够可观地减少块茎组织的浸渍。 [0122] 实施例6-在叠加平板试验（overlay plate assay）中普城沙雷菌A30-GFP抑制Dickeya sp.生长的能力。 [0123] 在叠加平板试验中用IPO2222作为指示菌株，检测GFP标记的普城沙雷菌A30抑制Dickeya sp.IPO2222生长的能力。将50μl的Dickeya sp.在NB中的过夜培养物（约9 -1 10cfu ml ）与5ml预热至45-50℃的顶层软琼脂（soft top agar）（NB补充0.7%琼脂）混合，并倒在TSA平板上。琼脂凝固之后，将2.5μl的普城沙雷菌A30或GFP标记的普城沙 9 -1 雷菌A30分别在NB和NBt中的过夜培养物（约10cfu ml ）滴在琼脂平板表面。在28℃孵育平板24-48h。测量出现在菌落周围的清晰的‘晕圈’的直径（显示Dickeya sp.IPO2222生长抑制）。 [0124] 共接种的琼脂平板在28℃孵育1-2天之后，GFP标记的A30菌落周围的显示Dickeya sp.生长抑制的清晰的晕圈的直径与野生型A30菌落周围的清晰的晕圈的直径无明显不同。 [0125] 实施例7-普城沙雷菌A30-GFP保护块茎组织免受Dickeya sp.造成的软腐病的能力 [0126] 以按照用于检测DsRed标记的Dickeya sp.的块茎组织浸渍能力的实验的描述的相似的方式，在马铃薯薄片试验中评价GFP标记的普城沙雷菌A30针对由Dickeya sp.IPO2222造成的浸渍保护马铃薯块茎组织的能力。GFP标记的A30和野生型A30及Dickeya sp.IPO2222分别在NBt或NB中，在28℃振荡（200rpm）生长过夜。离心（5min，6000×g）细菌并用1/4Ringer缓冲液洗两次。用无菌水调整GFP标记的A30的密度为约 8 -1 6 -1 8 -1 10cfu ml 且Dickeya sp.为约10cfu ml 。用50μl含有10cfu ml GFP标记的A30和 6 -1 10cfu ml Dickeya sp.IPO3012的悬浮液填充块茎的孔。 [0127] 源于三个不同块茎的三个马铃薯薄片被用于每一个处理。对于阴性对照，用50μl6 -1 无菌水代替细菌悬浮液且对于阳性对照，使用50μl含有10cfu ml Dickeya sp.。独立重复实验。为了病害形成，于28℃在潮湿箱中培养薄片72h。通过比较共同接种的孔周围的腐烂的马铃薯组织的平均直径与阳性对照的孔周围的腐烂的马铃薯组织的平均直径测量A30在马铃薯组织上的保护效果。 [0128] 在马铃薯薄片试验中，比较了GFP标记的普城沙雷菌A30与普城沙雷菌A30的野生型菌株的保护马铃薯块茎组织免受由Dickeya sp.IPO2222造成的浸渍的能力。在28℃培养用GFP标记的普城沙雷菌A30与Dickeya sp.IPO2222共接种的块茎薄片72h之后，腐烂组织的直径无显著不同。 [0129] 实施例8-普城沙雷菌A30-GFP的密度对由Dickeya sp.造成的块茎浸渍的影响[0130] 在马铃薯薄片试验中，检测了GFP标记的普城沙雷菌A30的接种密度对针对由6 -1 Dickeya sp.IPO3012造成的浸渍保护马铃薯块茎组织的能力的影响。用10cfu ml 的 4 8 -1 IPO3012和密度范围从10 至10cfu ml 的A30共接种马铃薯薄片。在配备高压光学照相汞灯（mercury high pressure photo-optic lamp）（Leica Hg50W/AC）和GFP及RFP加滤光片（GFP and RFP plus filter）的落射荧光立体显微镜（Leica Wild M32FL4）下计数GFP和DsRed标记的菌落。 [0131] 图2显示由Dickeya造成的马铃薯组织的浸渍在108cfu ml-1的A30的最小密度7 -1 6 -1 下完全停止。在10cfu ml 和10cfu ml 的较低密度下，A30显著减少马铃薯组织的浸渍 4 -1 但仍观察到马铃薯薄片的腐烂。在10cfu ml 密度下，A30没有减少组织浸渍（见图2）[0132] 实施例9-普城沙雷菌A30和Dickeya sp.在马铃薯块茎薄片上的菌群动态[0133] 使用倾注平皿法（pour plating）研究了3天时间段中普城沙雷菌A30-GFP和DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012在（共）接种的马铃薯薄片后的菌群动态。 [0134] 该实验与实施例7和8中描述的类似。用50μl含有1010cfu ml-1的A30和108cfu -1ml Dickeya sp.IPO3012的悬浮液填充块茎的孔。制备好的马铃薯薄片于28℃在潮湿箱中培养以形成腐烂。独立重复试验。为评价A30和IPO3012在马铃薯薄片上的密度，每日收集来自每一个处理和每一个时间点中3个随机选择的孔的约2g的块茎组织并在存在4ml1/4强度的Ringer缓冲液的Universal Extraction Bag（BIOREBA）中用锤子压碎。将100μl的未稀释的和1000倍及10000倍稀释的块茎提取物与预热至48℃且补充四环素至终浓度-1 为40μg ml 的NA（NAt）混合并倒入24-孔平板（Greiner）的孔中。在琼脂凝固之后，用石蜡膜（parafilm）覆盖平板并在28℃孵育24-48h用于细菌菌落生长。在配备高压光学照相汞灯（Leica Hg 50W/AC）和GFP及RFP加滤光片的落射荧光立体显微镜（Leica Wild M32FL4）下计数GFP和DsRed标记的菌落。 [0135] 图3A显示在三天时间段期间，GFP标记的普城沙雷菌A30的密度从在接种后0天7 8 -1 1 2 -1 -1 的10-10cfu g 快速降低至接种后2天的10-10cfu g 及接种后3天的0cfu g 。在实验进程期间没有观察到马铃薯薄片的腐烂，尽管3天后发现与水对照相似的块茎组织的浅棕色变色。 [0136] 图3B显示在三天时间段期间，Dickeya sp.IPO3012的密度从平均107cfu g-1增加11 -1 至10 cfu g 。这一大幅度的增加伴随有马铃薯薄片的逐渐腐烂。 [0137] 图3C显示在三天时间段期间，用GFP标记的A30菌株和PO3012共接种的马铃薯块茎薄片导致两种菌株的密度同时降低。在接种3天后，没有从接种的马铃薯薄片中回收到GFP或DsRed标记的细菌。 [0138] 在用GFP标记的普城沙雷菌A30和DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012共接种的马铃薯薄片上的菌群动态的研究显示生防剂仅在应用2天后便能够大量减少马铃薯薄片中Dickeya sp.的菌群且在72h之后从人工接种的块茎上完全根除Dickeya sp.。通过普城沙雷菌A30防治生物变型3Dickeya sp.在近距离下是最有效的，可能通过细胞-到-细胞接触。 [0139] 实施例10-通过土壤处理、使用由Dickeya和普城沙雷菌A30处理的块茎的温室实验 [0140] 用DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012接种马铃薯块茎并用GFP标记的普城沙雷菌A30接种土壤 [0141] 温室实验在六月-七月和九月-十月中进行。在无菌去离子水中制备DsRed标记6 -1 的Dickeya sp.IPO3012的悬浮液以获得10cfu ml 的密度。使用无Dickeya spp.的栽培品种Kondor（Dutch Plant Inspection Service for agricultural seeds and seed potatoes（NAK），Emmeloord，The Netherlands）的微型薯。将微型薯浸入悬浮液中并在干燥器（exicator）中在-800mBar下真空渗透10min随后在大气压力下孵育10min。仅用无菌去离子水渗透的微型薯，用作阴性对照。在接种之后，块茎在超净工作台（flow cabinet）中过夜干燥且第二天将它们种到5L的塑料花盆中的收集自Wageningen，The Netherlands的马铃薯大田的富含沙子的马铃薯土壤（2.9%有机质，0.2%CaCO3，pH6.4）中。 [0142] 在无菌的去离子水中制备GFP标记的普城沙雷菌A30的悬浮液至密度为10 11 -1 10 -10 cfu ml 。在接种前1h，用自来水给种植的块茎浇水。在埋起来之前，使用直接应 10 11 -1 用于块茎的50ml的10 -10 cfu ml 的GFP标记的普城沙雷菌A30接种阴性对照块茎或Dickeya sp.IPO3012接种的块茎。在处理后的24h，保持花盆脱水。在块茎种植之后将花盆放在温室中4周（28天），处于16/8h光周期、70%相对湿度及28℃条件下。为了排除生长环境的偏差效应，应用花盆的完全随机区组设计（3个区组包含每个处理的10个花盆-每区组总共40个花盆）。在每个实验中，使用30个Kondor微型薯于每一个处理。使用总共 120株植株：每一个重复和每一个时间点，我们使用Dickeya sp.IPO3012接种的10株植株（阳性对照）、用无菌水接种的10株植株（阴性对照）、用Dickeya sp.IPO3012和GFP标记的普城沙雷菌A30共接种的10株植株、及用GFP标记的普城沙雷菌A30接种的10株植株。 [0143] 在种植之后且临用土壤覆盖块茎之前将GFP标记的普城沙雷菌A30的悬浮液应用在事先用DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012渗透的块茎的表面以模拟在大田中种植的应用。研究了菌株在块茎处理之后定殖马铃薯植株的可能性，以确定用于在植物组织内部防治Dickeya的拮抗剂的潜力。 [0144] 在此研究中，将温室实验的条件调整为对病原体是最佳的且对生防剂不是最佳的。本发明人旨在研究在最糟糕的可能场景下普城沙雷菌A30保护马铃薯植株免受黑胫病的能力。为这个目的，使用易患黑胫病的马铃薯栽培品种Kondor且直接应用高的Dickeya sp.接种体于马铃薯块茎以确保高的黑胫病发生。使用生物变型3Dickeya sp.型菌株因为其是高度致病性的且要求相对高的温度和高湿度条件以促进感染过程。实验中使用的土壤收集自马铃薯大田以模拟自然的大田条件。然而，普城沙雷菌A30能够显著减少黑胫病并影响Dickeya sp.在接种的植株中的密度。 [0145] 植物中的症状发展 [0146] 每周目视检查植物症状的发展，即评价植物未萌发（non-emergence）、叶片萎蔫及变色、茎基部黑腐病、茎腐病、茎秆干燥（haulm desiccation）及植物死亡。在重复的温室实验中，在通过真空渗透顺序地接种块茎之后，菌株A30减少由Dickeya表现的症状100%及由生物变型3Dickeya sp.的茎的定殖97%。表1显示三个组的10株植物的累计结果，分别在接种后的1、7和28天时破坏性地分析。 [0147] 表1.在温室实验中，顺序地用Dickeya sp.和/或普城沙雷菌接种的马铃薯植株及水接种的对照植株的病害发生率。数字代表在每一个处理每一个时间点（即接种后1、7和28天）的三个组的10株植物中监测的累计发生率。 [0148] [0149] a在种植期间，用DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012通过真空渗透和/或用GFP标记的普城沙雷菌A30的悬浮液处理块茎接种块茎。用水接种的块茎作为阴性对照。 [0150] b植株筛选的总数 [0151] c表现病害症状的植株的总数（即萌发前块茎腐烂、叶片变色和萎蔫、典型的黑胫病、植株死亡） [0152] 在用Dickeya sp.IPO3012接种的植株中，最初症状出现在接种后7天，当地上部约5-7cm且根约8-12cm时。用Dickeya sp.IPO3012的感染严重影响处理的植株的开花和发育。首次实验中用Dickeya sp.感染的植株的60%及在第二次实验中植株的20%显示萌发前块茎腐烂、地上部和根的生长恶化且最初典型的黑胫病症状在接种后7天的幼芽上开始形成（即叶片的萎蔫和变色、茎表面水损害）。在接种后28天，在实验1和2中60%和50%的用Dickeya sp.IPO3012接种的植株，分别显示在靠近茎基部的典型的变黑和软腐。在GFP标记的A30和DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012菌株共接种的植株中显著减少发芽前腐烂和黑胫病症状形成。在第一个实验中在接种后7天，只有10%的共接种植株显示萌发前的块茎腐烂和地上部生长的恶化，然而在共接种的植株中在接种后28天，没有观察到病害症状。在第二个实验中，在整个实验过程期间，没有共接种的植株显示萌发前块茎腐烂和黑胫病症状。 [0153] 在两个实验的整个过程期间，水接种的对照植株显示无症状（数据未显示）。 [0154] 根据落射荧光立体显微镜检查的DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012和GFP标记的普城沙雷菌A30对马铃薯植株的定殖 [0155] 为获取对根和茎内部的定殖的认识，还使用落射荧光立体显微术筛选植株部分。为此，收集接种后28天时的植物样品。从每个接种的及水接种的对照植株中随机切割8个至少5-10cm长的根和6个地上部（茎）。在显微观察之前，按照用于NAt倾注平皿法的描述冲洗并消毒所有样品。将每一个根切成2-3cm且每一个茎切成0.5cm长的片段。将片段植-1 -1 入培养皿中含有40μg ml 四环素及200μg ml 环己酰亚胺的冷却至48℃的NA中。在培养基凝固之后，用石蜡膜密封平板并在28℃孵育1-2天。在配备高压光学照相汞灯（Leica Hg50W/AC）和GFP及RFP加滤光的落射荧光立体显微镜（Leica Wild M32FL4）下计数具有绿色和/或红色荧光信号的植物部分。记录显示典型的绿色和/或红色荧光的植物样品数量作为阳性且计算每一个处理的阳性样品比例（见表2）。当共接种时，普城沙雷菌A30能够减少Dickeya sp.在根和茎中定殖的发生率或甚至从接种的植株中根除病原体。 [0156] 表2.马铃薯根和茎的定殖发生率：GFP标记的普城沙雷菌A30和/或DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012，接种后28天。 [0157] [0158] a用DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012通过真空渗透、用GFP标记的普城沙雷菌A30通过土壤感染接种的或用两种菌株共接种的马铃薯植株，阴性对照是生长在无感染的土壤中的用水接种的植株 [0159] b单独分析每一个植株和每一个时间点的八个根和六个茎的切段 [0160] c每种处理分析的植株的总数（n=10） [0161] d GFP或DsRed信号阳性的植株部分的数目 [0162] 马铃薯组织中DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012和GFP标记的普城沙雷菌A30通过倾注平皿法的定量 [0163] 通过NA倾注平皿法在不同时间点检查GFP标记的普城沙雷菌A30和DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012在土壤和植株部分（及块茎、地上部和根）的菌群动态。 [0164] 植株在接种后1、7和28天被取样。在每一个时间点，每个处理的10株植株被取样。样品随机收集自每一个花盆且单独悬浮在2ml的补充0.02%二乙基二硫代氨基甲酸（DIECA）作为氧化剂的1/4Ringer缓冲液中。将100μl的未稀释的和10倍及100倍稀释-1的样品与预热至48℃、补充四环素至终浓度为40μg ml 的NA（NAt）混合并倒入24-孔平板（Greiner）的孔中。在琼脂凝固之后，用石蜡膜覆盖平板并在28℃孵育24-48h用于细菌菌落形成。用落射荧光立体显微镜，以与用于GFP标记的普城沙雷菌A30和Dickeya sp.IPO3012在马铃薯薄片上的相互作用进行的相同的方式筛选平板中GFP和/或DsRed阳性菌落。 [0165] 单独收集并处理每一个植株的种块。用自来水冲洗块茎以去除土壤颗粒，在70%乙醇中灭菌1min，用水洗三次、每次1min，在1%次氯酸钠（商业漂白剂）中孵育4min且最后用水冲洗三次、每次4min。每一个块茎在Universal Extraction Bag（BIOREAB）中用锤子压碎。按照用于土壤样品的描述将提取物稀释并倾注平皿。 [0166] 收集并处理每一个植株的所有地上部作为混合样品。处理每一个植株的总根系。在表面冲洗并消毒茎（地上部）样品和总根系两者之后，以与用于种块的描述的相同的方式制备提取物并倾注平皿。 [0167] 块茎中的细菌菌群（见图4A）. [0168] 在接种后1天检测到种块内部的A30的相对低的菌群（平均约101cfug-1）。菌群在2 3 -1 7天中增加至10-10cfu g 且稳定在这个水平直到接种后28天。在共接种植株中，接种 3 -1 2 后1天块茎中的普城沙雷菌A30菌群平均为10cfu g 但是菌群在28天时下降至10cfu -1 4 -1 g 。在块茎真空渗透之后，在接种后1天检测到10cfu g 的相对高的Dickeya sp.菌群。 3 -1 在接种后28天，菌群少量下降至平均10cfu g 。在共接种的植株中，Dickeya sp.菌群从 4 -1 -1 接种后1天的10cfu g 显著下降至接种后28天时的平均1cfu g 或更少。 [0169] 根中的细菌菌群（见图4B）. [0170] 仅在接种后7天和28天分析了根中的细菌菌群，因为接种后1天时还没有根形2 -1 成。在接种后7天，普城沙雷菌A30以10cfu g 的密度存在于根内。在在接种后28天，菌 3 4 -1 群增加至10-10cfu g 。在共接种的植株中，A30的菌群动态遵循相同的趋势。在Dickeya 1 sp.IPO3012接种的植株中，在接种后7天发现根内低的Dickeya sp.菌群（平均少于10cfu -1 1 2 -1 g ）。菌群在接种后28天时少量增加至10-10cfu g 。在共接种的植株中，接种后7天时-1 在根中没有检测到Dickeya sp.。在接种后28天，仅检测到平均1cfu g 的非常低的菌群。 [0171] 地上部中的细菌菌群（见图4C）. [0172] 仅在接种后7天和28天分析了地上部中的细菌菌群，因为接种后1天时还没有地2 -1 上部形成。在接种后7天，普城沙雷菌A30已经以10cfu g 的密度存在于地上部内。在在接种后28天，菌群增加至10倍。在共接种的植株中，A30的菌群动态遵循相同的趋势。接种-1 后7天，在共接种的植株中检测到地上部内5-10cfu g 的低的Dickeya sp.IPO3012密度。 2 3 -1 菌群在接种后28天增加至10-10cfu g 的密度。在共接种的植株中，接种后7天存在平-1 均少于10cfu g 的Dickeya sp.且在接种后28天，茎中没有检测到Dickeya sp.IPO3012。 [0173] 用于共聚焦激光扫描显微术（CLSM）以显示细菌定殖的马铃薯植株的取样[0174] 为了显微镜检查，在与NA倾注平皿的相同时间点收集植物样品；即接种后1、7和28天。从每一个接种的植株上随机切割八个至少5-10cm长的根和3个地上部（茎）。在显微观察之前，按照用于NA倾注平皿法的描述冲洗并消毒所有样品。 [0175] 将每一个根切成2-3cm且每个茎切成0.5cm长的段。将片段植入冷却至48℃的含-1 -1有40μg ml 四环素及200μg ml 环己酰亚胺的NA的培养皿中。在培养基凝固之后，用石蜡膜密封平板并在28℃孵育1-2天。在此时间之后，从琼脂平板中收集植物样品，短暂地在无菌去离子水中冲洗并在CLSM显微镜下检查。为监测根表面的细菌菌群，处理每个植株的4个根而不进行表面消毒和植入。 [0176] 为了可视化植物细胞，使用405nm（激发光）紫外激光器和450nm的发射滤光片。为了激发细菌细胞中的GFP和DsRed，分别使用了495nm和532nm的蓝色和绿色激光。分别使用对于GFP的505nm的滤光片和对于DsRed的610nm的滤光片。用Leica Digital System（Leica）联合使用10x和63x的水浸物镜的CLSM显微镜采集照片。 [0177] 用CLSM在640倍和1000倍放大下，分析在接种后7天和28天的植株部分。关于GFP标记的普城沙雷菌A30和DsRed标记的Dickeya sp.IPO3012的定位的详细研究显示，在接种后7天两种细菌物种都存在于根维管组织内的髓中（在髓质和皮质中）的细胞内和细胞间（见图5A）。在茎中，发现荧光细菌在维管组织内部及在木质部导管和原生木质部细胞之间（图5B）。 [0178] 在接种后28天，Dickeya sp.接种的植株中，DsRed标记的细菌存在于根的髓细胞的内部和之间以及茎的木质部导管之间（见图5A和5B）。 [0179] 在普城沙雷菌A30接种的植株中，GFP标记的细菌存在于在根的薄壁细胞内部和之间及在茎的木质部导管中（见图5A和5B）。 [0180] 在种块、根及茎的内部组织中，A30显示超过Dickeya。在接种后7天Dickeya存在于植物组织中但是接种后28天便不存在。 [0181] 根据CLSM检查的GFP标记的普城沙雷菌A30的根表面的定殖 [0182] 通过使用CLSM分析从接种后28天的普城沙雷菌A30接种的植株中随机选择的根，检测了GFP标记的普城沙雷菌A30定殖马铃薯植株根的能力。A30接种的块茎长出的植株的所有根被GFP标记的普城沙雷菌A30表面定殖（见图6）。GFP标记的细菌出现在存在于根的表面在根的纵轴上的块（clump）和斑块（patch）中，由细菌不存在或仅低密度存在的区域点缀（见图6）。在小的和/或大的和/或侧根和主根的表面定殖中没有观察到不同（见图6）。 [0183] 没有检测到在水对照植株中根的表面的GFP标记的细菌（见图6）。 [0184] 显微镜检查结果显示菌株A30是内生菌且是根际的定殖菌。在接种后7天发现该菌株在根（见图5A）和茎（见图5B）两者中。建立相对低但是稳定的A30的菌群。普城沙雷菌A30可能通过根进入植物组织，尽管不能够排除细菌还可能通过芽或受伤的块茎周皮进入。本发明人已经注意到A30和Dickeya二者在维管组织中的运输。 |
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