[0001] 本发明涉及一种新的猪支原体肺炎疫苗株，属于兽医生物学技术领域。

[0002] 猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)又称猪喘气病，主要是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种猪的接触性、慢性、非致死性的呼吸道疾病。主要临床症状为咳嗽和气喘，病变特征是肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈“肉样”或“虾肉样”实变。容易继发其他致病菌(如多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等)的感染，使死亡率升高，且严重影响猪的生长发育和饲料转化率，因而给养猪业造成巨大的经济损失。目前猪支原体肺炎的主要防治措施是疫苗和药物，但长期用药易产生耐药性，从而需要大剂量反复用药，又会造成肉品中药物残留等食品安全问题。故进行该病的疫苗研发对本病的预防和控制具有重要的意义。

[0003] 目前，国内自主研发上市的猪支原体肺炎疫苗只有弱毒疫苗，但该疫苗需要胸腔接种，不易于推广普及，而国外兽药公司研发生产的猪支原体肺炎灭活疫苗价格较为昂贵。因此，分离出一株免疫原性好、且可用于制备灭活疫苗的菌株，将填补国内无自主研发猪支原体肺炎灭活疫苗的空白。但猪肺炎支原体体外培养对营养要求高且生长速度缓慢，分离过程中易受猪鼻支原体等的影响，导致猪肺炎支原体分离难度较大。

[0004] 本发明的目的在于提供一种猪支原体肺炎疫苗株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：9909，保藏日期为2014年11月06日，分类命名为猪肺炎支原体Mycoplasma hyopneumoniae，菌株号为CJ，该疫苗株在制备的无9-10
细胞培养基中生长2-3日含菌量即可达到1.0×10 CCU/ml，并具有良好的免疫原性。

[0005] 本发明所述的一种猪支原体肺炎疫苗株，该疫苗株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：9909，保藏日期为2014年11月06日，分类命名为猪肺炎支原体Mycoplasma hyopneumoniae，菌株号为CJ。该疫苗株用于制备猪肺炎支原体感染引发疾病的预防用兽用生物制品或兽药。

[0006] 本发明所述的一种猪支原体肺炎疫苗株中的改良Friis液体培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉
5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合制成；

[0007] 本发明所述的改良Friis固体培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml和琼脂粉10-15.0g，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合制成。

[0008] 本发明所述的一种猪支原体肺炎疫苗株的有益效果：

[0009] (1)新菌株培养时间短：该菌株接种我公司研发的改良Friis液体培养基，培养时9-10
间短，含菌量高，培养2-3日含菌量即可达到1.0×10 CCU/ml，而有报道的其他菌株的培
8-9
养时间为5-10日，含菌量可达到1.0×10 CCU/ml；

[0010] (2)新菌株免疫原性好：本发明的猪支原体肺炎疫苗株是从国内商品猪上分离得到的新菌株，对于商品猪具有良好的免疫原性，保证了疫苗的免疫效力，避开了猪肺炎支原体只对地方品种猪具有易感性的缺陷；

[0011] (3)新菌株生产疫苗简便：该菌株含菌量高，制备疫苗无需浓缩；可用甲醛灭活，且灭活时间短，只需2小时，很大程度上减少了灭活剂对抗原的影响，且甲醛本身是一种防腐剂，用其来灭活兼顾了灭活和防腐，减少了用量以及对动物的不良反应；使用铝盐佐剂(氢氧化铝胶)作为佐剂，安全有效；制备工艺简单，抗原经甲醛灭活后，与铝胶混合1小时即成，没有繁琐的乳化工艺。附图说明

[0012] 图1和图2为本发明PCR鉴定结果图，其中图1M为DL2000；—为阴性对照；+为阳性对照(J株)；1-18为病料样品；图2M为DL2000；—为阴性对照；+为阳性对照(J株)；19-30为病料样品；

[0013] 图3为本发明多重PCR鉴定结果图，其中M为DL2000；—为阴性对照；Mhp为猪肺炎支原体(J株)阳性对照；Mhr为猪鼻支原体阳性对照；Mfl为猪絮状支原体阳性对照；1-19为病料样品；

[0014] 图4和图5为本发明猪肺炎支原体CJ株PCR产物及菌液PCR结果图，其中图4PCR产物M为DL2000；—为阴性对照；J为J株扩增产物；CJ为CJ株扩增产物；图5菌液PCRM为DL2000；—为阴性对照；J为J株扩增产物；CJ为CJ株扩增产物；

[0015] 图6为本发明猪肺炎支原体CJ株与其他菌株P36基因相似度比较图；

[0016] 图7为本发明猪肺炎支原体CJ株与其他菌株P36基因进化树图；

[0017] 图8为本发明猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)制备流程图。

[0018] 通过下列实施例进一步说明本发明，而不限制本发明的范围；

[0019] 本发明所述的一种猪支原体肺炎疫苗株，其分类命名为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)，菌株号为CJ，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO：9909，保藏日期为2014年11月06日；该菌株于2010年2月从新疆昌吉某猪场采集疑似猪肺炎支原体感染的病变肺脏，经无菌处理，接种改良Friis液体培养基筛选鉴定获得一株猪支原体肺炎疫苗株；

[0020] 实施例1：

[0021] 猪肺炎支原体CJ株的分离鉴定：

[0022] 肺组织悬液的制备：将新疆昌吉某猪场采集的30份疑似猪支原体肺炎病变肺组织分别用每毫升含1000个单位的青霉素浸泡后，其病变处使用烫板烫烧表面，无菌手术剪将表面组织去除，并取0.5g肺组织，剪碎置于研钵内，加入5ml改良Friis液体培养基，作成肺组织悬液；

[0023] 肺组织悬液的PCR鉴定：

[0024] 按照Takara核酸提取试剂盒(Takara Code：DV819A)说明书提取肺组织悬液的核酸，进行PCR及多重PCR鉴定；

[0025] PCR鉴定：

[0026] 引物设计与合成：猪肺炎支原体PCR引物按江苏省农业科学院兽医研究所刘茂军等发表的“猪肺炎支原体PCR鉴定方法的建立”文章中的引物序列进行合成：

[0027] P1：5’-TTACAGCGGGAAGACC-3’；

[0028] P2：5’-CGGCGAGAAACTGGATA-3’；

[0029] 预计扩增片段长度约为427bp；

[0030] PCR反应：

[0031] PCR扩增体系为：模板DNA 2μl，10mmol/L dNTP 2μl，10×buffer 2.5μl，10μmol/L引物P10.5μl，10μmol/L引物R20.5μl，Ex Tag聚合酶0.5μl，加入双蒸水
17μl，PCR反应条件为：温度95℃预变性5分钟；温度94℃变性1分钟，温度62℃退火1分钟，温度72℃延伸1分钟，扩增30个循环；温度72℃延伸10分钟；温度2—8℃保存，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳；

[0032] 将收集的肺组织悬液提取的DNA按照上述2.1.2项进行PCR反应，结果有19份肺组织悬液的核酸扩增出约427bp的目的片段(见图1)；

[0033] 多重PCR鉴定：

[0034] 引物设计与合成：多重PCR(猪肺炎支原体、猪絮状支原体和猪鼻支原体)按T.stakenbory等发表的“A multiplex PCR to Identify Porcine Mycoplasma Present in Broth Cultures”文章中的引物进行合成：

[0035] mhp-f：5’-TTCAAAGGAGCCTTCAAGCTTC-3’；

[0036] mhr-f：5’-GGGAAGAAAAAAATTAGGTAGGG-3’；

[0037] mfl-f：5’-CGGGATGTAGCAATACATTCAG-3’；

[0038] m-r：5’-AGAGGCATGATGATTTGACGTC-3’；

[0039] 预计猪肺炎支原体扩增片段长度为1000bp，猪鼻支原体扩增片段长度为1129bp，猪絮状支原体扩增片段长度为754bp；

[0040] 多重PCR反应：PCR扩增体系为：模板DNA 2μl，dNTP 10nmol/L，10×buffer5.0μl，上游引物均为8pmol，下游引物为12pmol，Ex Tag聚合酶0.5μl，加入双蒸水至
50μl；PCR反应条件为：温度95℃预变性5分钟；温度94℃变性30秒，温度55℃退火30秒，温度72℃延伸1分钟，扩增30个循环；温度72℃延伸10分钟；温度2-8℃保存，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳；结果见图2，筛选出6份无猪鼻支原体、猪絮状支原体污染的猪肺炎支原体菌株；

[0041] 菌株的分离与培养：取PCR鉴定为猪肺炎支原体阳性且无猪鼻支原体、猪絮状支原体污染的肺组织悬液上清液接种于含50％猪鼻支原体特异性血清的改良Fri is液体培养基中，置温度37℃恒温振荡培养箱内培养，每间隔5日盲传1次，每日观察培养基pH值变化，前3代均加入50％猪鼻支原体特异性血清，在传至6-8代时，有2个菌株培养基颜色变化时间稳定，将收获的培养物分别取出0.1ml接种于固体培养基平板上，置温度36-38℃5％CO2培养箱培养10日，均可见针尖大小菌落，在显微镜下挑取边缘整齐、外周质地疏松、中央致密的单个菌落，接种改良Friis液体培养基培养，菌种在培养基上生长时间
9-10
稳定在2-3日，含菌量可达1.0×10 CCU/ml，重复三次后保存菌株，并进行如下鉴定；

[0042] 培养特性及形态学特性：在改良Friis液体培养基中培养2-3日，培养物呈轻度浑浊；用液体培养物涂片，经姬母萨氏染色，在高倍镜下可见环状、短链状和两极状等典型的多形态；在改良Friis固体培养基上培养7-10日，肉眼可见针尖大小的菌落，显微镜下观察为外周质地疏松、中央致密的圆形菌落，表面粗糙带有颗粒状；

[0043] 生长抑制试验：吸取获得的2株菌株各0.5ml，分别涂布于改良Friis固体培养基上，置温度36-38℃使琼脂表面稍干燥，夹取浸猪肺炎支原体抗血清纸片贴于琼脂表面，培养14日后，分离菌株均出现大于2.0mm的抑菌圈；

[0044] 生理、生化试验：分离的2个菌株生化反应和猪肺炎支原体标准菌株(J株)相同，符合支原体生化特性，生化试验鉴定结果见表1：

[0045] 表1 CJ株猪肺炎支原体生化试验鉴定结果

[0046]项目 标准菌株 分离菌株
溶血性 - -
葡萄糖发酵 + +
水解精氨酸 - -
薄膜和斑点形成 - -
红细胞吸附 + +

[0047] 注：“-”表示阴性；“+”表示阳性。

[0048] 毒力试验：将分离株菌液气管注射健康易感仔猪5头，攻毒28日进行剖检，个别仔猪患病，出现猪支原体肺炎肺部病变，在肺脏心叶、尖叶、膈叶前1/3部位以及中间叶，出现“肉样”或“胰样”实质样病变；

[0049] 免疫原性试验：按本发明制成疫苗，肌肉注射3-4周龄健康易感仔猪5头，2ml/头，一免后14日按照相同条件和途径进行二免，二免后14日，连同对照猪5头，各气管注射猪肺炎支原体CJ株肺组织毒，攻毒28日后剖检，1株肺炎病变平均减少71.67％，2株肺炎病变平均减少65.00％，健康对照组猪无肺炎病变，即1株的免疫原性较好，因此，确定1株为制苗用菌株，并命名为猪肺炎支原体CJ株；

[0050] 基因测序：

[0051] 引物：按江苏省农业科学院兽医研究所刘茂军等发表的“猪肺炎支原体PCR鉴定方法的建立”文章中的P36基因的引物序列进行合成；

[0052] P1：5’-TTACAGCGGGAAGACC-3’；

[0053] P2：5’-CGGCGAGAAACTGGATA-3’；

[0054] 预计扩增片段长度约为427bp；

[0055] PCR检测：按照Takara核酸提取试剂盒(Takara Code:DV819A)说明书提取菌液核酸；

[0056] PCR扩增：反应液总体积为25μl，PCR扩增体系为：模板DNA 2μl，10mmol/L dNTP2μl，10×buffer 2.5μl，10μmol/L引物P10.5μl，10μmol/L引物P20.5μl，ExTag聚合酶0.5μl，加入双蒸水17μl；PCR反应条件为：温度95℃预变性5分钟；温度94℃变性1分钟，温度62℃退火1分钟，温度72℃延伸1分钟，扩增30个循环；温度72℃延伸10分钟；温度2-8℃保存，PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳；

[0057] 产物回收及测序：用凝胶回收试剂盒回收目的片段，将其克隆至pMT19-T载体中，构建重组质粒，经PCR鉴定后由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，分离的猪肺炎支原体CJ株P36基因片段通过NCBI BLAST比对后，其与J株、168株、232株、7448株同源性为99.67％，进一步确定CJ株为猪肺炎支原体；

[0058] SEQ 427bp；

[0059] Composition:137A；74C；91G；125T；0OTHER

[0060] Percentage:32.1％A；17.3％C；21.3％G；29.3％T；0.0％OTHER[0061] Molecular Weight(kDa):ssDNA:132.21dsDNA:263.20

[0062] ORIGIN

[0063]

[0064]

[0065] 猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)的制备：

[0066] 菌株：制造本品用菌种为猪肺炎支原体CJ株，检验用菌种为猪肺炎支原体肺组织毒，均由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司分离、鉴定、保管和供应；所述的猪肺炎支原体CJ株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：9909，保藏日期为2014年11月06日；

[0067] 培养基：改良Friis液体培养基是由基础培养基为PPLO肉汤粉3.0-5.0g、脑心浸液粉2.0-4.0g、去离子水660-740.0ml，辅助培养基为10×汉克氏平衡盐溶液20-40.0ml、酵母浸出液20-40.0ml、青霉素100-300U/ml、杆菌肽粉5-20U/ml、0.25％酚红5-10.0ml和灭活的猪血清100-250.0ml混合制成；

[0068] 生产用菌种的制备：

[0069] 一级种子繁殖及鉴定：从菌种库中取出生产种子，用改良Friis液体培养基溶解，并继代于改良Friis液体培养基中培养48-72小时，待菌液颜色发生改变，pH值降低至6.70-6.80时收取菌液，作为一级种子，按《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹，在温度
2-8℃保存，使用期应不超过7日，继代应不超过5代；

[0070] 二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按3.1项进行，在温度2-8℃保存，使用期应不超过7日；

[0071] 制苗用菌液制备：取二级种子接种改良Friis液体培养基，温度37℃培养2-3日，待培养物变色后进行扩大培养，继代不超过4代，待pH值降为6.70-6.80时收获，按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应无细菌、霉菌污染；并进行含菌量的测定；

[0072] 灭活：按制备菌液总量的0.2％加入甲醛溶液，在温度36-38℃灭活2小时，灭活的菌液置温度2-8℃保存，取灭活的菌液加入改良Friis液体培养基中，置于温度36-38℃恒温振荡培养箱中培养5-7日，培养物均不变色，判为灭活检验合格；

[0073] 配苗：将灭活的菌液与氢氧化铝胶佐剂按体积比5∶1混合，均匀搅拌1小时，置温度2-8℃保存，无菌定量分装后，加盖密封，粘贴标签；

[0074] 成品检验：

[0075] 性状：本品静置后，上层为淡黄色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液；

[0076] 无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长；

[0077] 安全性检验：用3-4周龄健康易感仔猪5头，肌肉注射猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)4ml/头，连续观察14日，均应不出现由接种疫苗引起的不良反应和死亡；

[0078] 效力检验：肌肉注射3-4周龄健康易感猪5头，2ml/头，一免后14日按照相同条件和途径进行二免，二免后14日，连同对照猪5头，各气管注射猪肺炎支原体CJ株肺组织毒，攻毒28日后剖检，按28分评分法对每头猪肺炎病变进行评分；肺炎病变减少率＝(对照猪肺炎算术平均分-免疫猪肺炎算术平均分)/对照猪肺炎算术平均分×100％，按上述公式计算免疫组猪的肺炎病变减少率。免疫组猪肺炎病变减少率不低于65％；

[0079] 甲醛残留量测定：按现行《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用生物制品通则的规定。

[0080] 实施例2：猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)免疫效果观察：

[0081] 疫苗：本发明猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)，对照国外某公司生产的猪支原体肺炎灭活疫苗；

[0082] 检验用菌种：猪肺炎支原体肺组织毒，由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司分离、鉴定、保管和供应；

[0083] 试验动物：3-4周龄健康易感仔猪，购自新疆天康畜牧科技有限公司；

[0084] 试验设计：试验分为三组，第一组和第二组试验动物分别肌肉注射国外某公司生产的猪支原体肺炎灭活疫苗、新疆天康生产的猪支原体肺炎灭活疫苗(CJ株)，2ml/头，第三组为对照组，不做任何处理；一免后14日按照相同条件和途径进行二免，二免后14日，连同对照组，每头猪气管注射猪肺炎支原体肺组织毒；

[0085] 临床症状观察：攻毒后，每组试验动物定时定点连续观察28日，对照组有咳嗽和腹式呼吸等临床症状；除个别猪出现轻微咳嗽和腹式呼吸症状外，试验组(新疆天康和国外某公司)基本未出现典型猪支原体肺炎临床症状；

[0086] 效力对比试验：攻毒28日，将所有试验动物处死并解剖，免疫国外某公司和新疆天康的猪支原体肺炎灭活疫苗的猪肺炎病变减少率分别为75.00％和76.19％，运用Prism5.0统计分析软件进行t检验分析，两者没有显著差异(P﹥0.05)，具体肺炎病变得分见表
2：

[0087] 表2 试验组猪肺炎病变得分

[0088]

[0089] 注：(1)N/A(not Available)为不适用；

[0090] (2)a-b表示每组之间两两比较，字母相同者表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同者表示差异显著(P＜0.05)。