一种温度敏感的猪肺炎支原体疫苗株及其应用 |
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| 申请号 | CN201080031403.2 | 申请日 | 2010-05-19 | 公开(公告)号 | CN102458462A | 公开(公告)日 | 2012-05-16 |
| 申请人 | 澳大利亚生物资源公司; 墨尔本大学; | 发明人 | R·尤伟尔; Y·艾博斯艾尔奥斯塔; G·布朗宁; P·马克姆; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种猪 肺 炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae) 疫苗 株，该猪肺炎支原体疫苗株含有在列出的基因中至少一者上的突变，或为保藏于国家计量研究院(澳大利亚)，保藏号为NM04/41259的疫苗株，其中，所述株是减毒以及 温度 敏感的。本发明还涉及含有该株的疫苗及其制备方法和应用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)疫苗株，其特征在于，该猪肺炎支原体疫苗株含有在至少一种列于表1中的基因上的突变。 |
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| 说明书全文 | 一种温度敏感的猪肺炎支原体疫苗株及其应用技术领域[0001] 本发明涉及猪肺炎支原体株，含有该株的疫苗，以及该疫苗在保护猪免患支原体肺炎中的应用。 背景技术[0002] 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是引起猪支原体肺炎(也称为地方性肺炎(EP))的病源因素。这是在全球范围内最为常见，具有经济显著性并且影响到猪生产的呼吸性疾病之一。这种疾病通常会伴随着继发性感染，高发病率，低死亡率以及低饲料转化率，这种疾病所造成的全球经济损失估计为约每年十亿美元。 [0004] 这种疾病具有高传染性，其传播通常是由直接接触感染的呼吸道分泌物所造成，例如打喷嚏或者咳嗽时由口鼻部或嘴喷出的液滴。 [0005] 目前已经研制出一些抗猪肺炎支原体的疫苗，其中大多数疫苗由约十个公司的22个被注册为单价或二价/多价的疫苗商标所提供。所有的疫苗都是灭活或者失活的猪肺炎支原体制剂。 [0006] 全细胞失活的猪肺炎支原体疫苗的实例包括：RESPISURETM和STELLAMUNETM(辉TM TM TM瑞)，SUVAXYN M.HYO (富 道)，HYORESP (梅 里 亚)，M+PAC ( 先 灵 葆 雅)，以 及TM PORCILIS (英特威)。 [0007] 虽然一些疫苗能够减弱EP的严重性，但没有任何一种全细胞灭活或者失活的疫苗能够完全免除猪肺炎支原体的感染，因此，制备更加高效的疫苗正是当务之急。 [0008] 本发明优选实施方式的目的在于提供适用于接种的活猪肺炎支原体株来抑制地方性肺炎。 [0009] 本说明书中引用的全部参考文献，包括任何专利或专利申请，在此一并纳入作为参考。在此明确表示：尽管本文引用了一些现有技术的公开文件，但这些参考文件并不构成对这些文件中的任何内容都构成本领域的部分公知常识的认可。 发明内容[0010] 本发明大体上提供了一种活的减毒(live attenuated)猪肺炎支原体株，该株能够用来生产有效地保护猪免患地方性肺炎的活疫苗。 [0011] 第一方面，提供了一种减毒的猪肺炎支原体株，这种减毒的猪肺炎支原体株含有在至少一个表1中列出的基因上的突变。 [0012] 在一种实施方式中，疫苗株含有在表1中列出的全部基因上的突变。 [0013] 在一种实施方式中，疫苗株是温度敏感的。 [0014] 减毒疫苗通常具有很多优越性，因为他们携带着天然状态下的所有感染剂(infectious agent)的免疫原决定簇并将其带入宿主的免疫系统中，并且由于该试剂在疫苗宿主体内能够增殖，使得免疫剂的使用量相对少。减毒的方法包括：将毒性株传代数次或者暴露于放射线或化学药物。可以猜想到，这些方式会向基因组中引入突变，造成微生物毒性降低但是仍可复制。 [0015] 这些方式的缺陷在于，引入的突变是随机性的，无法在分子水平上表征。筛选减毒的方法，例如伴随温度敏感的筛选，也是非常耗时的，而且会得到错误的结果，因为温度敏感的疫苗株可能未减毒，而减毒株不需要是温度敏感的。这个过程需要不断地尝试和错误。另外，减毒株也可能进一步突变，转化为剧毒的。 [0016] 为了提供抗猪肺炎支原体的活疫苗，发明人用利用化学突变法得到的猪肺炎支原体进行试验，并筛选温度敏感的克隆体。发明人冻干了活的突变体细菌，发现一周之后该细菌能够恢复活性并且连续传代后仍保持活力。这适于用作抗猪肺炎支原体的疫苗株。对疫苗株和原株(master strain)进行测序并比较疫苗株中突变的、序列确认的基因，从而满足减毒株在基因水平上的表征。 [0017] 第二方面，提供一种减毒的猪肺炎支原体疫苗株，该疫苗株是温度敏感和减毒的，已经被保藏于国家计量研究院(澳大利亚)，保藏号为NM04/41259。 [0018] 第二方面所述的疫苗株已显示出具有保护性免疫，并且显示出不会因为连续传代而转化为剧毒的(数据没有示出)。 [0019] 第三方面包括制备第一方面或第二方面的疫苗株的方法，该方法包括使用合适的猪肺炎支原体起始分离株(starting isolate)进行化学突变，以及筛选出在连续传代后仍保持活力的突变体。 [0020] 在一种实施方式中，基于温度敏感性对突变体进行第一次筛选。 [0021] 第四方面提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物含有第一方面或第二方面所述的猪肺炎支原体疫苗株，以及载体，可选的佐剂，和/或可选的至少一种额外添加的感染剂，免疫量内的疫苗能够诱发对于由猪肺炎支原体引起的疾病的保护性免疫。所述感染剂可以是病毒，细菌，真菌或者寄生生物。 [0022] 第五方面提供了一种保护猪类动物免患由猪肺炎支原体引起的疾病的方法，该方法包括给药猪类动物免疫量的第四方面所述的疫苗组合物。 [0023] 第六方面提供了第四方面所述的保护猪类动物免患由猪肺炎支原体引起的疾病的疫苗。 [0024] 第七方面提供了一种制备根据第四方面的疫苗的方法，该方法包括，将所述第一方面或第二方面所述的猪肺炎支原体株与载体，可选的佐剂，和/或可选的至少一种额外添加的感染剂组合在一起。感染剂可以是病毒，细菌，真菌或者寄生生物。 [0025] 第八方面提供了第一方面或第二方面所述的猪肺炎支原体疫苗株在制备保护猪类动物免患由猪肺炎支原体引起的疾病的药物中的应用。 [0027] 图1：高度过量(high overdose)接种疫苗的猪中ts19疫苗株的鼻定植(nasal colonisation)。 [0028] 图2：高度过量接种ts19疫苗株的猪中，接种后(DPV)59天的气管定植(tracheal colonisation)。 [0029] 图3：接种不同剂量ts19疫苗株的猪的鼻定植。 [0030] 图4：研究期间(105天)不同的总体重。 [0031] 图5：ts19最小保护性剂量的确定。 [0032] 图6：基于肺损伤的严重性的减轻，ts19和商品化疫苗的保护性指数。 具体实施方式[0033] 猪肺炎支原体株“LKR”最初从屠宰场样本中分离出来(Lloyd and Etheridge1981，J of Comp Path 91：77-83)。该生物从实验性感染的猪中再分离，然后在细胞培养基中传代约10次，得到克隆化分离物(CSIRO，Victoria)。该克隆体随后提交至南澳大利亚阿德莱德大学支原体收藏中心(University of Adelaide Mycoplasma collection)。然后，该LKR分离株由墨尔本大学兽医科学系(支原体组)得到，在该处，该LKR分离株在改良Friss肉汤中进行了3次体外传代并保存，保存的药瓶表示为“LKR P3 29/5/97”。这个克隆体作为亲本株。 [0034] LKR P329/5/97株在体外进行传代，使用先前描述的方法(Nonamura andImada(1982)Avian Diseases 26：763-775)进行NTG突变(200mg/ml)。从琼脂平板上筛选出温度敏感的克隆体(“ts-19”)，于3ml改良Friss肉汤中培养。这个克隆体的传代数目命名为“P0”，随后在体外使用改良Friss肉汤传代四次，每次传代按照1∶4体积比稀释。 最终传代级别命名为“LKR ts-19P4MS”。 [0035] LKR ts-19P4MS在改良Friss肉汤中进行多次体外稀释传代，达到稀释为-21 -21 3.2×10 ，最终的突变克隆体命名为“LKR ts-19 3.2×10 ”。 [0036] 将LKR ts-19 3.2×10-21冻干，提交至澳大利亚政府分析实验室(布达佩斯条约中国际承认的用于专利程序目的生物体的保藏)，保藏号为NM04/41259。 [0037] 支原体具有高度简化的基因组，从而反映出它们有限的生物合成功能，它们依赖于宿主寄生。鉴于他们基因组中有限的冗余，通路特定组分的NTG突变，对于支原体细胞的生存有重要的意义。NTG突变能够导致基因组的随机突变(核苷酸的转换，颠倒，缺失或插入)。这样能够得到一系列的突变基因组，每个突变基因组含有一个或多个的突变。假定因为突变造成一个或多个至关重要的基因丧失功能从而使突变基因组中的大多数不能够存活。如果突变体不引发对生物体生长能力的有害影响，那么这些存活下来的突变体生物体能够进行下一步的筛选(例如：温度筛选)。在ts19的发展过程中，筛选基于该突变株在33℃的温度下生长为高滴度株(titre)的能力以及在39.5℃的生长能力下降。基于猪肺炎支原体疫苗株ts19与亲本株(LKR)的全基因组序列比对，ts19基因组中的一些突变(核苷酸改变)被确认。这些突变包括核苷酸的取代(转换和颠倒)，也有缺失以及插入。 [0038] 这些突变分散于全基因组中，包括一系列表达的基因和假定蛋白以及非编码序列。表1列出了由碱基取代，缺失或插入造成突变的已知基因。这些基因根据它们的主要功能进行了分类，本领域技术人员能够通过确定给定的参考序列(例如YP_278901.1)与减毒株的序列是否具有差别来容易地理解如何检测猪肺炎支原体株是否含有表1中列出的任一基因的突变。Ts19，保藏号为NM04/41259，是一种减毒株，包括表1中列出的所有突变。 [0039] 在一种实施方式中，所述减毒株包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34个或者所有表1中列出的突变体。在一种实施方式中，所述减毒株包括表1中列出的一个或者每个毒性因子(virulence factors)的突变，和/或参与糖代谢的一个或每个基因的突变，和/或参与磷脂代谢的一个或每个基因的突变，和/或参与辅酶代谢的一个或每个基因的突变，和/或参与转录或翻译的一个或每个基因的突变，和/或参与膜运输的一个或每个基因的突变，和/或参与DNA复制、修复或代谢的一个或每个基因的突变，和/或转座酶基因的突变。 [0040] 在一种实施方式中，所述减毒株含有每个毒性因子的突变。 [0041] 表1：猪肺炎支原体疫苗株ts19的基因中的减毒突变。 [0042] [0043] [0044] [0045] YP_号码表示NCBI参考序列 [0046] 本文描述的细菌株是可用于活疫苗的，温度敏感的减毒活菌株。 [0047] 减毒活菌株是指在降低或“减毒”它们的毒性的条件下培养的活细菌株。活疫苗与失活或灭活的微生物相比通常能够引起更持久的免疫应答。 [0048] 根据第一方面提到的疫苗株可以通过对猪肺炎支原体分离株进行化学突变而得到。所述化学突变具体包括通过N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(N-Methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，NTG)处理进行突变(Nonamura and Imada(1982)，Avian Diseases26；763-775)。温度敏感的突变细菌可通过在允许温度(33℃)下能够生长，在非允许温度(39.5℃)下不能生长的条件筛选出。为用于疫苗，温度敏感的突变株进行了连续传代和稀释。 [0049] 根据第一方面提到的支原体细菌疫苗株是有活力的(或活的)。活力通常意味着“存活能力”，更具体地用于表示在偏好的条件下生存、发育或者繁殖的能力。如果能够在适合的肉汤或者琼脂培养基中生长则表示细菌细胞是有活力的。 [0050] 将澳大利亚猪肺炎支原体分离株LKR(由墨尔本大学支原体组从阿德莱德大学支原体收藏中心获得)在体外进行三次(3×)传代(在改良Friss肉汤中，以1∶4体积比)，制得基于布达佩斯条约，保藏号为NM04/41259的细菌株，继而得到了LKR P3。LKR P3分离株随后进行了NTG突变，突变的LKR P3在琼脂平板上，在33℃(允许温度)和39.5℃(非允许温度)下进行生长，筛选在33℃下能生长但在39.5℃下不能生长的突变克隆体。筛选到的克隆体进行几轮体外传代和连续稀释，筛选出的克隆体(ts19)，以冻干培养物的形式保藏于基于布达佩斯条约的国家计量研究院(现在称为澳大利亚政府分析实验室)。样品保存一周后重新复苏发现其仍有活力。 [0051] 术语“体外连续传代”指的是在培养基中对菌株进行重复传代的操作。它包括将活细菌培养物接种到肉汤培养基中，然后在一定的给定时间和适宜的温度下进行孵育。之后将部分孵育的培养物接种至新鲜的灭菌的培养基中，依次在给定的时间内孵育。持续这个循环直到达到期望的传代数。每一轮的生长和重接种定义为一次单独的传代。 [0052] 第三方面提供一种疫苗，该疫苗含有第一方面所述的细菌株和载体(例如：猪肺炎支原体生长培养基，灭菌水或者灭菌的等渗盐水)。 [0053] 疫苗是一种生物制剂，能够表现出或者增强对于特定疾病的免疫性。疫苗可以是预防性的(例如：来抑制或减轻病原体的未来感染效果)，或者是治疗性的(例如治疗该感染)。第二方面提到的疫苗对于由猪肺炎支原体引起的疾病是预防性的。 [0054] 对于本领域的技术人员来说，合适的载体是明显的，而且很大程度上取决于给药途径。所述疫苗可进一步含有一种或者多种的额外组分，包括但不限于悬浮剂，稳定剂或者分散剂。 [0055] 存在于该疫苗中的额外组分也可以是佐剂，防腐剂，化学稳定剂或者其他抗原蛋白。典型地，稳定剂，佐剂和防腐剂均经过优化来确定在靶动物中有效的最佳配方。合适的示例性的防腐剂包括，三氯叔丁醇，山梨酸钾，山梨酸，二氧化硫，醅酸丙脂(propyl gallate)，对羟基苯甲酸酯类(parabens)，乙基香草醛，甘油，酚以及对氯苯酚。合适的可以使用的稳定剂的组分包括：例如，酪蛋白水解物，蔗糖，明胶，酚红，N-Z胺，磷酸二氢钾，乳糖，水解乳蛋白，以及奶粉。传统的佐剂用来吸引白细胞或者增强免疫应答。这些佐剂包括，MPL.TM.(3-O-脱酰基单磷酰基脂A；RIBI ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.)，矿物油和水，氢氧化铝，爱菲金，阿夫立定(avridine)，L121/角鲨烯，D-丙交酯-聚交酯/配糖体，泊洛尼克普来奥斯(pluronic plyois)，胞壁酰二肽，灭活博代氏杆菌，皂苷类，例如Quil A或者促病毒素.TM.QS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，Mass.)以及霍乱毒素(野生型或者突变型，例如，其中，29氨基酸位的谷氨酸被其他氨基酸(优选为组氨酸)代替，与国际专利申请No.PCT/US99/22520相一致)等等。 [0057] 本发明的第四方面涉及保护以免患由猪肺炎支原体引起的疾病。第三方面中所述的疫苗对于由猪肺炎支原体引起的疾病具有预防性。 [0058] “预防(prophylaxis)”或者“预防性的”或者“预防性”治疗，或者“保护...免患”在这里是指包括使感染不发生或阻止或抵御或保护避免由猪肺炎支原体引起的疾病的发生或严重性，包括阻止、保护或减轻受试者中疾病的症状或特征的严重性，可能在该疾病发生之前(但是并未诊断为患有该疾病)进行预防。同样地，还包括减少感染周期或者症状的发生率，以及减少损伤的规模。 [0059] 在这里使用的“预防”包括全部抑制或者一定程度上减轻疾病的发生或疾病的症状。还指减轻或者抑制猪肺炎支原体的扩散，或者阻止宿主中细菌的立足，保护以避免其他猪肺炎支原体株或者其他感染剂的二次感染。 [0060] 第三方面中所述的疫苗可以如下的形式制备用于给药猪，例如，液体，粉末，气溶胶，片剂，胶囊，肠溶片剂或者胶囊，或栓剂。给药的途径包括但不限于：非肠道给药，腹膜内给药，静脉给药，肌肉给药，皮下给药，皮内给药，口服给药，局部给药，鼻内给药，肺内给药，直肠给药，阴道给药，等等。 [0061] 在一个优选的实施方式中，所述疫苗被制成用于给药至呼吸道，例如通过鼻内给药，气溶胶给药，或者通过口或鼻吸入的方式给药。这种给药途径是优选的，因为对于猪肺炎支原体，保护性免疫的性质可能是局部(肺部)免疫以及细胞介导的免疫过程，从而实现抑制疾病发生的目的，而不仅仅来自于循环的抗体。将这种疫苗引入呼吸道可能会引发局部免疫应答。因此该疫苗的局部给药可能是更有效的。此外，通过将疫苗给药至封闭的容器(barn)或空间(给药粗喷雾颗粒)，并且使猪吸入，会减少为大量动物接种疫苗的劳动力。目前使用的具有商业基础的有效针对特定疾病给家禽接种疫苗的方法是气溶胶接种(或者喷雾接种)，而且在我们实施例中也显示出该方法适合给猪接种疫苗。 [0062] 鼻内给药包括经由鼻通道或口鼻部的任何给药。应用于鼻腔的疫苗可以为溶液，也可以为悬浮液或干粉。例如，移液器，滴管或喷雾器，可选的气雾喷雾器都可以用于溶液和悬浮液的鼻内给药。干粉可以通过吸入的方式进行鼻内给药。 [0063] 气溶胶给药是指将疫苗以在空气中分散为细微固体颗粒或者液滴的方式给药。 [0064] 吸入(也已知称为吸气(inspiration))，是指空气从外界环境，经过气体路径，移动进入肺部的肺泡中。 [0065] 治疗用的疫苗的有效剂量依赖于，例如：治疗目标，给药途径，以及所述猪的情况。 [0066] 所述疫苗的剂量水平通常以大约每剂量每毫升104到108色彩变化单位(CCU)为5 7 标准，优选为大约每剂量每毫升10 到10CCU。 [0067] 然而可以被理解的是，对于任何特定的猪类动物的具体的剂量水平取决于一系列参数，包括：使用的具体化合物的活性，年龄，体重，大体健康状况，性别，饮食状况，给药时间和给药途径。 [0068] 有效剂量的选择，以及向上和向下调整是本领域技术人员已知的。 [0069] 在一个优选的实施方式中，所述疫苗通过气溶胶或者吸入的方式进行鼻内给药。 [0070] 术语“猪”用来代表小猪，母猪，小母猪(gilts)，阉猪，公猪，以及猪科的成员。 [0071] 在本说明书中，除非文中需要，否则，术语“包括”将被理解为表示包括已阐明的元素或整体或者元素或整体的组，但不排除任何其他的元素或整体或者元素或整体的组。 [0072] 还需要指明的是，正如说明书主体所用的，除非文中明确的提到，否则单数形式：一个，一种以及这个包括该方面的复数形式。 [0073] 出于清楚和理解的目的，本发明进行了某些细节的描述，但是对于本领域技术人员来说，在不偏离本方面说明书公开的发明理念的范围的基础上，对本文所描述的实施方式和方法做出的各种修饰以及改变都是非常明显的。 [0074] 下面参考以下实施例对本发明进行更详细的描述。除非文中明确的提到，否则这里提供的实施例仅为示例目的，并不意味着限于此。因此，本发明包括由于本发明提供的教导而变得明显的任何和全部的变化方式。 [0075] 实施例1：疫苗株的准备 [0076] 澳大利亚猪肺炎支原体分离株LKR是一种显示出典型的地方性肺炎疾病(Lloyd and Etheridge(1981)，J.Comp.Path.91：77-83)的猪肺的屠宰样本。该分离株培养和保存于南澳大利亚阿德莱德大学支原体参考培养中心。这种分离株的培养物随后由维多利亚墨尔本大学的支原体组得到。 [0077] 该培养物在体外传代三次后，用200mg/ml的N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(N-Methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG))、使用之前提到的方法(Nonamura and Imada(1982)Avian Diseases 26：763-775)进行突变。简述如下：猪肺炎支原体株LKR的培养物在培养基中生长至晚期对数期，离心得到沉淀。使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，将其暴露于NTG。沉淀所述细胞然后将其重悬于改良Friis培养基中(Friis，N.F.1975)，接下来在33℃下孵育4小时。所述培养物通过0.45μm的滤膜，进行适当的稀释后，分装放于琼脂平板上，于33℃孵育。生长出的克隆体被克隆于3ml肉汤中，然后在33℃孵育，以安瓿瓶保存克隆体并储存于-70℃，确定各个克隆体的温度敏感性。 [0078] ts19的温度敏感性是由二次滴定并于33℃和39.5℃的孵育所确定的。在33℃，8 2 滴定量(titre)通常＞1×10CCU/mL，在39.5℃，滴定量通常＜1×10CCU/mL。 [0079] 所述Ts19株基于布达佩斯条约保藏为NM 04/41259。 [0080] 所述Ts19株以及所述LKR株随后使用标准技术进行测序，因此得到了基因被表征的减毒株。与其亲本株相比，发现所述Ts19株含有一系列基因突变，含有这些突变的基因示于表1中。 [0081] 实施例2：疫苗制备 [0082] 为了制备疫苗，Ts19株的培养物在含有酚红(pH指示剂)的改良Friis培养基中，在33℃下生长，直至观察到酸性颜色改变，使用96孔微量滴定板，将疫苗滴定于改良Friis培养基中。在该微量滴定板的12列的前10个中进行连续十倍的稀释。最后两列保持不接种，作为只加入培养基的(阴性)对照。每次滴定最多使用六个微量滴定板。 [0083] 孵育达三周后，根据颜色变化对平板进行打分，并使用最可能数目(mostprobably number，MPN)确定平均滴定量。最终平均滴定量表达为由每毫升的颜色变化单位(CUU)。 [0084] 所述Ts19疫苗培养物保存成“湿式冻存(wet frozen)”形式的长期存储物，保存于-70℃到-80℃。或者，所述Ts19疫苗株培养物可以冻干并长期保存在-20℃。 [0085] 实施例3：疫苗安全性以及定植研究(colonisation study) [0086] 为了评价所述ts19疫苗株的安全性进行研究，该研究设计中，必须使用来自未感染支原体的猪群中的六周大的猪。这项研究在澳大利亚维多利亚威里比 CSIRO(Commonwealth Serum Industry Research Organisation)制定的PC2生物安全水平的标准下进行。全部的20头猪随机分为两组，每组10头(见表2)。 [0087] 表2：ts19疫苗株的安全性研究 [0088] [0089] 通过鼻内途径递送该疫苗，因此仅仅检测了该疫苗对粘膜的安全性。第1组(未接种的对照)以及第2组(高度过量接种的猪)持续进行了59天临床观察(表2)。 [0090] 在该安全性研究中，对所有的猪每天进行两次监测，包括直肠体温检测，从接种疫苗前一天起，直至接种疫苗后四天，监测所有的猪的呼吸信号，包括咳嗽，打喷嚏，呼吸困难以及呼吸过快。对所有的猪进行了显微镜和肉眼可见的肺损伤的评价。肉眼可见的肺损伤使用Hannan et al，1982的方法进行打分。另外，从鼻，肺部以及气管取得拭子样本(swab sample)作PCR分析之用。 [0091] 在接种后3周，还通过PCR技术检测猪肺炎支原体是否存在于每组中的猪的鼻腔中。最终，监测了猪在研究期间的体重增加情况。 [0092] 结果显示，没有在任何一头猪中发现临床信号。接种疫苗组和非接种疫苗对照组没有检测到明显的温度增加。此外，接种疫苗组和非接种疫苗对照组没有观察到明显的体重差别。在解剖中，高度过量接种组的十头猪中的两头中，每一头产生了微小的肉眼可见的具有地方性肺炎特征的损伤。通过对肺组织的显微镜分析没有观察到其他的损伤。整体上说，温度敏感疫苗株ts19即使在高度过量时也显示出其安全性。 [0093] PCR分析(使用猪肺炎支原体特异性引物)显示出接种疫苗3周后以及8周后的猪鼻腔中存在猪肺炎支原体(见图1)。使用PCR分析的猪肺炎支原体定植研究显示，猪肺炎支原体存在于气管(上区域、中区域和下区域)，而且至少60％接种疫苗的猪的气管都有感染(见图2)。这些结果显示出所述ts19疫苗株定植于鼻和气管通道。 [0094] 实施例4：疫苗效力研究激发模型(Challenge Model)-显示出保护性 [0095] 为了评价所述ts19疫苗株的效力进行了如下研究。这项研究设计中，必须使用来自未感染支原体的猪群中的六周大的猪。这项研究在澳大利亚维多利亚威里比CSIRO(Commonwealth Serum Industry Research Organisation)制定的PC2生物安全水平的标准下进行。全部的56头猪随机分为三组，每个疫苗接种组12头，每个对照组10头(见表3)。 [0096] 表3：ts19株的效力研究 [0097] [0098] 通过鼻内途径递送该疫苗，因此只检验了该疫苗表现出的对粘膜的效力。除去未接种的组和未激发的阴性对照组之外，所有的组在接种疫苗后的第22天通过鼻内给药猪肺炎支原体的澳大利亚野外分离株进行激发。超过3天后，进行剖验(post-mortem)检验(接种后的第57，58和59天)。 [0099] 在这个研究过程中，每天监测所有组的临床信号，包括咳嗽，打喷嚏，呼吸困难以及呼吸过快。在该研究开始和结束时测量体重的变化。 [0100] 在接种后的第22天(并在激发前)，提取鼻拭子用于PCR分析，来确定各个组中猪肺炎支原体的存在。 [0101] 结果显示出，在所有检验组中，没有观察到临床信号以及显著的体重差别。鼻拭子分析结果显示，接种后第22天，60-70％的接种的激发后猪中存在猪肺炎支原体(见图3)。所有假接种的对照组猪在PCR分析中均是猪肺炎支原体阴性的。解剖中，肉眼可见损伤分 6 7 析(Hannan et al.，1982)显示出，假接种对照组和接种了10 和10CCU/mL/剂量的组均没 8 有发现损伤存在。按照10CCU/mL/剂量接种的猪中，十分之一的猪产生了轻微的肉眼可见损伤。十分之四的未经接种但是进行激发的猪，表现出了咳嗽和打喷嚏的临床信号。解剖中，对这四头猪的肺部的检验显示出典型的猪肺炎支原体感染的肉眼可见的肺损伤。 [0102] 总的来说，所述温度敏感疫苗株ts19显示出对保护以避免猪肺炎支原体感染是有效的。 [0103] 实施例5：不同剂量的疫苗的效力以及与商品化灭活的疫苗的比较 [0104] 本实验用于评价所述ts19疫苗株在四个不同剂量的效力。本实验设计必须使用3-4周大的spf猪。本实验在Centro de Nacional de Servicios de Diagnostico en Salud Animal(CENASA)规定的PC2设施(在墨西哥Tecamac的政府试验设施)下进行。全部的70头猪随机分为七组，每组10头(见表4)。 [0105] 表4：最小保护性剂量以及比较效力研究 [0106]a [0107] 疫苗经鼻内喷雾递送b [0108] 疫苗经鼻肌肉内给药递送3 4 5 6 [0109] 四个不同剂量的ts19疫苗(10、10、10、10CCU/mL)通过鼻内途径递送到四组独立的猪中。第五组通过鼻肌肉内途径递送了2ml商品化失活的疫苗。阳性(未接种但激发的)和阴性(未接种也未激发的)组也包括在本次实验中。除去阴性对照组，所有组在两个时间点进行激发。第一次激发在接种后的第22天，通过鼻内给药猪肺炎支原体的美国分离株(IOWA株194)。第二次激发在接种后的第84天，使用的是同样的激发株。在这个研究期间，每天监测所有组的临床信号，包括咳嗽，打喷嚏，呼吸困难以及呼吸过快。研究开始和结束时进行体重的测量。 [0110] 结果显示，在全部的实验期的105天之内，没有观察到临床信号。阳性对照组和5 6 每一个接种组的体重行为的变化分析显示出，剂量在10 和10CCU/mL的ts19疫苗株的组与阳性对照组相比体重明显增加(图4)。接种商品化疫苗的组与阳性对照组相比没有显现出明显的体重增长的差别(图4，表5)。解剖中，每组都进行肉眼可见损伤分析。确定最小保护性剂量的标准是基于相对于肺损伤严重性的减少的保护性指数(protective 4 index)≥70％。Ts19的最小保护性剂量为10CCU/mL，是因为相对于肺损伤严重性的减少， 5 6 70％的保护性指数达到该剂量(图5)。更高剂量的ts19疫苗株(10 和10CCU/mL)也进行了检测，相对于肺损伤严重性的减少，PI分别为83％和88％(图6)。商品化失活的疫苗， 3 其保护性指数仅为37％，比使用最低剂量的ts19(10CCU/mL，保护性指数达到60％)的保护性指数还要低。 [0111] 表5：在DPV-104/105上，与阳性对照组相比，接种疫苗组的平均重量增加的差异分析。 [0112]组别 处理 与阳性对照相比的差异分析(P) 1 阴性对照 0.001 2 ts19 103.0 0.394 3 ts19 104.0 0.175 4 ts19 105.0 0.033 5 ts19 106.0 0.004 6 商品化疫苗 0.315 7 阳性对照 NA [0113] Ts19剂量(ccu/mL)。无显著性差异(P＞0.05)，显著性差异(P＜0.05)。 |
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